Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка лабораторных методов выявления ареала распространения листерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка лабораторных методов выявления ареала распространения листерий"

На правах рукописи

Меркулов Анатолий Викторович

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ АРЕАЛА РАСПРОСТРАНЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ НА ПРИМЕРЕ УЛЬЯНОВСКОЙ ОБЛАСТИ

03. 00.07 - микробиология

Автореферат диссертация на соискание учёной степени

Саратов - 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии

Научные руководители доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Щербаков Анатолий Анисимович кандидат биологических наук, доцент Шарафутдинов Азат Минсеитович

Ведущая организация: Ульяновский государственный универсикч

е(?

Защита диссертации состоится « » ц2004 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государс I венном

»

2004 года в

часов на

образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу 410005. г Саратов, ул. Соколовая, 335.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Листерии широко распространены в окружающей среде Они выделяются из почвенных и водных экосистем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме диких, домашних, с/х животных и вызывая развитие листериоза у них и человека (Бакудов, Васильев, 1995). В связи с этим закономерно то пристальное внимание, которое в последнее десятилетие привлечено к листериозной инфекции Вместе с тем до настоящего времени в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости лис терновом, ни ее структура и динамика (Тартаковский, 2002). Это объясняется, с одной стороны, отсутствием ряда нормативных документов в ветеринарной и медицинской службе по индикации листерий и контролыо за листериозом, с другой - несовершенством существующих методов индикации.

Цель исследования. Разработка и сравнительная оценка методов выявления листерий по показателям их индикации в объектах внешней среды, пищевых продуктах

Задачи исследования. В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи:

1 Выявить ареалы распространения листерий в Ульяновской области

2. Определить и использовать оптимальные методы индикации листерий пля изучения распространения данного микроорганизма, включающие бактериочогические методы, реакцию нарастания фага, полимеразную цепную реакцию

3. Определить эффективность предложенной тест-системы «Листер» но сравнению с другими методами исследования на выявление возбудителя листериозной инфекции. чк> позволит рекомендовать ее в качестве метода индикации листерий и диагностическою метода на листериоз.

Научная новизна

Впервые проведен анализ распространения на территории Ульяновской области листериозной инфекции и выявлены ареалы нахождения листерий за последние 20 лет

Апробирована схема бактериологического исследования материала, позволяющая в короткие сроки с минимальными затратами получить данные но контаминации листериями объектов окружающей среды, пищевых продуктов.

Рекомендовано для целей индикации листерий использовать смесь фагов Ь 2А и I 4А

Доказана высокая сохранность 1ена гемолизина листерий, что явтяется основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени .лля скринингового исследования материалов из окружающей среды на наличие листерий

Получены данные, свидетельс!

гивности ПЦР для индикации

листерий по сравнению с бактериологическими методами исследования РИФ что позволяет рекомендовать ее и в качестве диагностического метода исследования

Практическая значимость работы.

1. Разработана тест-система «Листер» и подготовлены Н1'Д ГУ 9188 01400008064-99 на указанную тест-систему «для выявления и идентификации l.i\lenu monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и наставление но применению указанной тест-системы, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ РФ 7 июля 1999 года Чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в 1 мл и предназначена для выявления фрагмента ДНК Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, объектах внешней среды, патологическом материале от сельскохозяйсшешгых животных, не иммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, d ыкжс oi диких животных, грызунов, птиц, клешей.

2 Создан кадастр по листеряозу Ульяновской области, на основании которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии и Ульяновском) государственном} центру санитарно - эпидемиологического надзора по профилактике данной инфекции

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1 Установление ареала тистерий на территории Ульяновской области

2 Оптимальная схема бактериологической индикации листерий

3 Использование РНФ со смешанными группами фагов для индикации листерий

4 Сохранность гена гемолизина листерий. что явилось основанием испотыоваиия гена гемолизина Listeria monocytogenes в качестве миюени для скрининпжот исследования материала на наличие фрагмента ДНК листерий

5. Эффективность ПЦР по сравнению с бактериологическими методами исследования и РНФ.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, в соответствии с плановыми темами научно-исследовательской работы кафедры: «Разработка методов индикации малоизученных пишевых зооантропонозов» и «Создание кадастров природно-очшовых, юоантропонозных инфекций на территории Ульяновской области»

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава УГСХА за 1995-2003 год межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИГТИ (Омск, 2001), Всероссийской научной конференции ВГНКИ (Москва. 2001); в

двух комиссионных испытаниях проведённых по заданию Департамента ветеринарии МСХ РФ и утверждёны директором ВНИИЗЖ в декабре 1998 года и апреле 1999 года, а также в комиссионных испытаниях в УГСХА, утверждённые ректором в 2002 i Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 публикаций Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и включает' введение, обзор литературы, материалы и методы результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, пракшческие пред южения и список литературы (204 источников, в юм числе 68 отечественных) Работа иллюстрирована 17 таблицами 15 рисунками и дополнена приложениями

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Штаммы: В работе были использованы референс - штаммы Listeria monocytogenes из коллекции кафедры микробиологи УГСХА. проф ГЗеелигера (ФР1 ). Дороти Джонс (Великобритания), которые в соответствии с паспортными данными, об икали типичными для бактерий этого рода и вила морфологическими, культуральными, биохимическими и антигенными свойствами. Лисгериозные фаги L 2А и L 4 А из коллекции ВНИИВВиМ

Реактивы, питательные среды. При выполнении отдельных панов paóon.i использовали натрий хлористый (ГОСТ4233-77), мочевину (ГОСТ6691-77). формации (ГОСТ 1625-75), кислоту борную (ГОСТ 9656-75). трихлоруксусную кислогу (чда). мертиолат натрия (Serva), аурамин (Serva).B работе использовали среды Гисса. которые готовили согласно "Сборник} инструкций по общим методам контроля медицинских иммунобиологических препараюв", утвержденные приказом МЗ СССР № 31 от 31 01 83 Для бактериологического метода исследования использовали питательные среды и схемы посевов, изложенные в инструкциях МСХ (Лабораторная диагностика листериои животных и людей, меры борьбы и профилактики (Инструктивные документы) Госагропром СССР, Министерство здравоохранения СССР, Москва. 1987) и МЗ РФ (Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах 4.2 Методы контроля Биологические и микробиологические факторы (Методические указания МУК 4.2.1122-02 Министерство России. 2002: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002); Эпидемиология и профилактика листериоза 3 1 7. Профилактика инфекционных заболеваний. Инфекции, общие для человека и животных (Меютические указания МУ 3.3 7 1104-02 Минздрав России. Москва, 2002). Необходимые материалы для проведения исследований по гипированию

штаммов Listeriu monocytogenes готовились по рекомендациям И А Бакулова, Д А Васильева(1991)

Оборудование. Центрифуга (не менее 5000 g); термостатируемая водяная баня, термостаты (на +22 28°С и +37°С); холодильники бытовые, мерная лабораторная посуда-стандарт мутности бактериальный взвесей ГИСК им Л А Тарасевича, оборудование используемое для проведения ПЦР указано в соответствующей главе

Методы. Морфологию листерий всех серовариантов проверяли микроскопией мазков, окрашенных по Граму Мазки готовили из 18-24 часовых бульонных и агаровых культур Культуральные свойсчва листерий изучали после получения культуры методом посева на жидкие и твёрдые питательные среды Биохимические свойства первоначально определяли по методике, рекомендованной И А Бакуловым. ДА Васильевым (1991) которую при необходимости дополняли изучением сахаролитической ак1ивносги на средах Гисса, а также НТД, указанных выше Бактериологические методы исследования и методы постановки ПЦР описаны в результатах собственных исследований. РНФ ставити по методике рекомендуемой И А Бакуловым, В М.Котляровым ( 1987)

Статистическую обработку полученного материала проводили по Стьюдет \ и ПК с помощью программы Microsoft Excel (версия 7.0)

Результаты исследований и их обсуждение Распространение листериошой инфекции на территории Ульяновской об нас i и ¡а

1985-2002 гг.

Постоянная регистрация вспышек листериоза сельскохо5яйо венных животных в области появилась в 80-х годах (таблица 1).

Это данные по количественным показателям листериозной инфекции на территории Ульяновской области

Из 35 населённых пункгов Ульяновской области, входящих в ареал нахождения листерий, в одном населённом пункте (Моисеевка) листериоз на протяжении изучаемых ¡8 лет встречается 6 раз, в другом (Слобода Выходцева) - 4 раза В двух пунктах (Мордово Озеро и Новая Малыкла) - по 3 раза. В семи - (Старое Погорелово. Ховрино. Русские Горенки, Филиповка. Аллагулово, Степная Васильевка, Александрова) по 2 раза В остальных 24 пункюх за 18 1ет листериоз регистрировался по одном) pasy Однако и некоторых из этих хозяйстп, например в хозяйстве «Теленское». >.а год было зарегистрировано 2 случая листериоза крупного рогатого скота И таких очагов, где в течение года регистрация листериоза прошла неоднократно насчитывается до 9 населенных пунктов.

Таблица 1

Количество зарегистрированных случаев листериоза с/х животных

в административных районах Ульяновской области (1985-2002 гг )

Веш-кайм-ский Карсун-ский Майн-ский Мелекесс кий Новомал ыклински й Сенгилеевс кий Ульянове кий Всего

1985 1 1

1986 3 3

1987 1 2 2 1 1 7

1988 2 7 1 10

1989 1 1 2

1990 1 1 5 7

1991 1 3 3 1 8

1992 1 3 1 5

1993 1 1 2

1994 2 2

1995 1 1

1996 -

1997 -

1998 -

1999 2 2

2000 1 1

2001 1 1

2002 1 1_

Всего 6 8 1 26 7 2 3 53

Все эти показатели подтверждают вывод о том, что на территории Ульяновской

области листериоз не случайная инфекция, а закономерная имеющая природно-очаговый характер.

Анализ распространения листерий по Ульяновской области показывает, чго в основном листериоз распространён в двух степных районах левобережья - Мелекесском и Новомалыклинском, а также в центральной части правобережья - Каре) иском Веипсаймском, Ульяновском, Сенгилеевском. Майнском административных районах которые непосредственно граничат друг с другом. Территории этих двух зон (районов) можно оценивать как территории эпизоотически неблагополучные по листериозу

Как вывод по этим данным, и на указанных зонах необходимо проводить профилактические мероприятия по предупреждению распространения листериоза По нашим данным, наибольшее количество случаев листериоза в Ульяновской области приходится на период марта-апреля. Из 63 случаев листериоза показа1е.ш сезонное 1и по месяцам распределяются следующим образом: январь-7, февраль-6, март-15, апрель-8, май-7, июнь-2, июль-3, август-2, сентябрь - ни одного случая листериоза, октябрь-3. ноябрь-6, декабрь-4 (рис1) Данная закономерность практически соотетвуе* общепринятой тенденции сезонности листериоза.

Рис.1. Сезонные изменения интенсивности эпизоогологического процесса по листериозу в Ульяновской области

Достаточно традиционно выглядит видовой состав сельскохозяйственных животных, поражённый листериозом на территории области (рис 2).

12

II

— — Оещл

Рис.2. Сравнительные показатели числа неблагополучных пунктов по листериозу крупного рогатого скота, овец, свиней в Ульяновской области за1985-2002 гг

В перв\ю очередь это меткий рогатый скот 39 случаев ш что составтясг 01 вссю пораженного пою ювья крупный рогатый скот - 16 с |\>иев ко и с рр и и 8 случаев -13% Данные цифры подтверждают общую тенденцию дтя указанной инфекции в первую очередь поражается мелкий рогатый скот погам уже крупный рогатый ско! свиньи если это не особый ,лучай, наименее чувавитетьные к тистериоз\ Выше приведенный анализ позволяет еде 1ать заключение, что данная инфекция, яв [яюныяся природио-очатояой инфекцией в обозримом б> 1ущем не исчезнет с указанно] о региона

Потученные данные основыватись на показателях распространения болезни (речи поголовья сельскохозяйс Iвенных животных и проводились по чиа1 ностике дшного заболевания с вы ;е1ением и типированием чистой ку [ьтуры Д>>я цепей изучения ареата распространения бактерий испочъзчют в первую опереть метопы сани I арной микробиологии с испо (ыованием экспресс метотов тонирования выделенной к\ >ы методы индикации с помощью фагов и в последние юты успешно зарскомепдоь.иллии себя метод ПЦР Поэтому нами и начаты были разработки по указанным направлениям р индикации листерий

Разработка ускоренной схемы бактериологического исследовании по индикация листерий

За период 1994-97 года нами была разработана, апробирована, предложена и доложена на ряде конференций, следующая ускоренная схема выделения и типирования листерий из тканевого материала и объекюв окружающей среды Данная схема исследования позволяет испотьзовать её при проведении мониторинга листериочиой инфекции.

Методику проведения исследований, выбор оптимальных схем отрабатывали на следующих тест объектах В качестве образца для исследования брали- патожн ический материал (печень), землю, сточные воды, свежескошенную траву Образцы (изучаемый субстрат) контаминировали культурой листерий штаммом 766 в дозе 5x10 2 КОЯ/мл Далее исследования проводили по оптимальной схеме Изучаемый субстрат независимо от ею вида измельчали и смешивали со средой накопления в соо!ношении 18 (1 часть продукта и 8 частей среды) встряхивали в течение 1 минуты и культивировали при 28" С 24 - 48 часов Через указанные сроки 1мл полученной бактериальной суспензии смешивали с 5 мл 0,1 - 0,3 % раствора КОН (растворенного в 5% №С1), встряхивали и через минуту высевали на селективный агар в двух повторах и через 24 - 48 часов культивирования при температуре 22° и 37° С и учитывали результат Затем проводили идентификацию выросших колоний Оптимальным решением является постановка на исследование не

одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб Первый май исследования с использованием среды накопления позволяв! выделил листериозпую культуру в 80-92% исследуемых проб, при 100% контаминации исходного материала Второй этап - обработка щелочным раствором КОН с последующим культивированием при 22е и 37°С позволяет к концу первых - вторых суток получить положительные результаты до 87-90% проб Различные температурные режимы культивирования обусловлены биологическими особенностями листерий К концу первых суток при культивировании при 37°С можно обнаружить листериозные культуры в 70-80 % проб Культивирование при 22°С позволяет к концу 2-х суток идентифицировать до 90% проб Используя данную двухступенчатую температурную схему мы сокращали сроки культивирования на 24 часа и только в сомнительных случаях режим в 22° С потребовался для продолжения исследований.

Важным элементом в указанной схеме является среда для накопления листерий Мы не могли, в силу объективных причин, использовать рекомендуемые среды накопления зарубежных фирм и поэтому разработали и конструировали собственную срезу накопления Для этого были проведены серии экспериментов, позволившие выбрать наиболее результативную пропись, включающую достаточно дешёвые и доступные составляющие Состав среды накопления- в 1000 мл дистиллированной воды разводили 16 г питательного бульона, 5г Д глюкозы, 2,5, г динатрий фосфата, 5 г хлористого натрия. 15 i хлористого лития. Доводили pH раствора до 7,3 - 7,4 стерилизовали автоклавиронанисм при +120°С - 15 минут Охлаждали и добавляли раствор полимиксина «В» в 10 мл физиологического раствора Компоненты с 2 по 5 необходимы для поддержания жизнедеятельности листерий, компоненты 6 и 7 составляют систему, замедляющую рос i посторонней микрофлоры. В экспериментах среда накопления давала до 100% рост листерий

Однако для культивирования листерий необходимо было использовать и твёрдые питательные среды. Стандартный МПА и аналогичные среды не позволяли проводить дифференциацию листерий от бактерий других видов, поэтому возникла необходимость в использовании элективной среды Как и в предыдущем случае, мы не могли, в силу объективных причин, использовать рекомендуемые селективные среды зарубежных фирм и поэтому разработали и конструировали собственную селективную среду Для тюго провели серию экспериментов и определили элективную среду для выделения листерий из дешевых, доступных по составу и давшую наилучшие покаители по следующей рецептуре.

1. Агар «Д» - 30,0 г. 2 Хлористый натрий - 5,0 г.

3 Д - глюкоза - 5,0 г. 4. Глицин - 2,0 г.

5 Хлористый литий -15,0 г 6. Полимиксин «В» - 5001 ыс ед

7. Дистиллированная вода - 1000мл. Компоненты с 1 по 5 растворяют в дистиллированной воде доводя рП до 7 3 - 7.4. стерилизовали автоклавировапием при +121°С - 15 минут. Охлаждали до -50 С и добавляли раствор полимиксина в 10 мл физраствора. Элективными а!сшами являкися компоненты с 4 по 6 номер Хлористый литий и глицин ингибировали poci этеробакгерий и бактерий семейства Pseudomonas Полимиксин подавлял рост энтерококков.

Экспериментальные исследования по разработке быстрого и дешевого метода выделения листерий с использованием отечественных реактивов и рекомендуемых сред накопления и элективной, свидетельствует, что он. позволяет решить эту задачу в 2-3 раза быстрее, чем это предлагается инструкцией по диагностике дистериоза (МСХ, 1987) Указанная схема, так же позволяет использовать её как для целей индикации так и при мониторинге изучаемой инфекции, выявлении ареалов распространения листерий

Разработка схемы по индикация листерий методом РНФ с помощью смеси фагов

L 2А и L 4А

Разработанный в ВНИИВВиМ метод индикации листерий с помощью РНФ показал свою эффективность В наших исследова ниях мы использовали не монофаги L 2А и I 4А, а их смесь. Интересен был вопрос о взаимодействии фагов при их смешивании Исходя из того, что указанные фаги L 2А и L 4А строго специфичны, можно было ожидать, чю они не будут интерферировать, и результаты получаемые при использовании смеси 6\:iyi аналогичны использованию монофага В качестве тест - объекта для отраГники меюлов исследования использовали МПБ, контаминированный листериями. В иб.шце 2 приведены результаты предварительного титрования фагов и их смеси на референс штаммах листерий.

Таблица 2

Титры листериозных фагов при использовании их в моноварианте и смеси

Фаг Гитры фага на (кол в 1 мл) на референс штаммах

Шт. 9-127(1 с г) И1т 9-72(11 с г)

L2A 4х 10® 0

L4A 0 4x109

Смесь L 2А + L

4А 2x109 2x10*

Из данных исследований следует, что при титровании смеси фагов каждый чопофл выявлялся на гомологичной культуре листерий Фаг 1.2А взаимодействовал с кулыурой

Рис 3 Фотографии негативных колоний смеси листериозных фагов L2A И L4A

листерий 1 серогруппы, фаг L 4А - с культурой листерий второй серогруппы и их i итр составлял 4x109 (рис 3) Так как исходное число фаговых корпускул в смеси у каждою фага было практически в 2 рай меньше го и результаты титрования смеси показа™ по каждому референс штамму двухкратное уменьшение - 2x104 , хотя в абсолниных числах этот показатель являлся диагностическим - 2 ООО ООО ООО корпускул при исходной концентрации фага 104. Таким образом, на референс - штаммах установлена возможность использования смеси листериозных фагов для целей индикации. Необходимо было проверить использование смеси фагов в исследованиях на наличие листерий в пищевых продуктах и объектах внешней среды Для изучения этой возможности в экспериментах использовалась смесь фагов и монофаги в одинаковых титрах 104 на мл Схема not. i ановки реакция заключалась в следующем Исследуемый субстра! (до 5 г), кошаминиронашши лнетериозным штаммом 766, в дозе 104 мт, измельчали, вносили в колбу и добавляли МПБ до 50 мл Суспензию ресуспендировали и 9 мл переносили в пробирку №1 (опы i ная) В пробирку №2 (контроль смеси) вносили 9 мл МГТБ Затем в обе пробирки юбавлячи по 1 мл смеси фагов и инкубировали при температуре 28" С в течение 24 часов По окончанию инкубации в них добавляли по 1 мл хлороформа и оставляли при комнатной ¡смиературе на 30-40 минут Хлороформ оседал на дно, надосадочную жидкость подвергали дальнейшему исследованию. В последующем из опытной и контрольных пробирок брали

по 0,2 мл и переносили по 0.1 мл в две пробирки содержащие но 0.9 мл МПБ (одна для обнаружения фага L 2А другая для обнаружения фа!a I. 4А) и готовили еще одно десятикратное разведение Затем в первые ряды пробирок опытной и контроля титра фага добавляли по 0,1 мл 1-миллиардной взвеси индикаторного штамма 9-127 для иыявления фага L 2А, а во вторые ряды - индикаторного штамма 9-72 для обнаружения фага L 4а Затем во все пробирки добавляли по 2,5 мл 0,7% -ного МПА Всё быстро и тщательно перемешивали и выливали в чашки Петри, содержащие 1.5%-ный МПА Учёт резулыатв проводили через 12 -16 часов инкубирования при температуре 28° С

Результаты, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют, что исполыование смеси листериозных фагов в РНФ для индикации листерий в пищевых продуктах и объектах внешней среды позволяет получить объективные данные, отражающие реальную картину, что в свою очередь позволяет использовать этот метод в качестве инструмента для мониторинга листериозной инфекции и для санитарной оценки продуктов шиапия

Определение чувствительности ПЦР-анализа на культуре L.monocytogenes, в клиническом материале, объектах окружающей среды для изучения ареала распространения листерий

На основании литературных данных для цели выбора генов, кодирующих факторы вирулентности L monocytogenes, и традиционно используемых в качестве мишеней для ПЦР диагностики. На основании литературных данных для этой цели были исио.чьюваны гены гемолизина LLO, PI-PLC'. PC-PLC. Выбраны последовательности олигонуклеотидных праймеров для каждого гена-мишени Был проведен поиск нуклеотидных последовательностей генома L monocytogenes по базам данных Entrez (Национальный институт здоровья. США), GeneBank, EMBL (Европейская молекулярно-биоло! ическая библиотека) и Японской базой данных нуклеотидных последовательностей - DDBJ Далее на втором этапе были "выравнены" ДНК-последовательности выбранных генов L monocytogenes при помощи компьютерной программы Clasta W Multi Sequence Alignment с целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков необходимых для выбора праймера.

На третьем этапе проверялась работоспособность выбранных пар праймеров на музейных штаммах L monocytogenes с целью исследования распрос граненное™ исследуемых генов и чувствительности в отношении микроорганизмов роча / islci ш Изучение специфичности предложенных праймеров было проведено с помощью компьютерных программ FASTA BLASTA on line. В результате этой работы быпа показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с генами гемолшина LLO. PI-

PLC, PC-PLC и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других групп вирусов, бактерий или последовательностями эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчётов, обладали 100% специфичностью

На следующем этапе работы производился подбор оптимальных условий для проведения ПЦР. С целью оптимизации условий протекания ПЦР мы изучили эффективность реакции при различных концентрациях Mg2+ и при разной температуре отжига Дальнейшие эксперименты, проводились при температуре отжига 65°С и реакционной смеси 9 пкмоль, Mg2+-3,0 мМ/мл.

Разработанная тест-система предназначена для выявления фрагментов ДНК L monocytogenes в биологическом материале от сельскохозяйственных животных, не иммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, а также от диких животных, грызунов, птиц, клещей, пищевых продуктов и объектов внешней среды

Результаты ПДР-анализа в населённых пунктах Ульяновской области.

Дня исследования были использованьг а - сточные воды - 34 пробы б - образцы почвы - 34 пробы, из ранее установленных сел. Образцы взяты из следующих населенных пунктов Ульяновской области- Вешкаймский район Старое Погорелово. Ховрино, Блекмигцево, Березовка Карс> некий район Сосновка, Русские Горенки, Большие Поселки. Урено-Карлинское, Сухой Карсун, Беловодье; Майнский район. Карлинское Мелекесский район: Филиповка, Аллагулово, Степная Васильевка, Александровка, Мордово Озеро, Слобода Выходцева. Ерыкли некое, Мулловка, Новая Майна, Лебяжье, Моисеевка. Новосёлки. Теленское; Новомалыклинский район Новая Бесовка. Новая Малыкта Александровка, Старая Бесовка, Абдреево; Сенгилеевский район- Бекетовка. Шиловка: Ульяновский район' Зелёная Роща, Салмановка, Красноармейск.

Результаты исследований представлены на электрофореграмме ПЦР-анализа (рис 4)

26 126 16а 166 17а 176 22а 226 26а 266 34а 346 М

» *

ZL ~ г . - 5S 5 «в ~ ввь

ШШШШк+т ~

Рис. 4. Электрофореграмма ПЦР образцов ДНК листерий в хозяйствах Ульяновской области 26, 126, 16а, 166, 17а, 176,22а, 226, 26а, 266, 34а, 346 - положительная реакция М - маркер длины

На основании полученных результатов были сделаны выводы во-первых, - о распространенное!и гена гемо шзина L monocytogenes и его сохранности, во-втрых. - о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скрининговою исследования материалов окружающей среды и клинического материала Опираясь на полученные данные но исследованию проб с объектов внешней среды хозяйсш Ульяновской области можно прийти к выводу, что из 68 образцов, взятых на иссдедокание методом ПЦР, из 34 населённых пунктов в которых на протяжении последних 18 лет диагностировался чистериоз, в 12 образцах (7 населённых пунктов), было обнар>жено наличие фрагментов ДНК / monocytogenes. В двух случаях была положительная индикация только в образцах почвы (п Ховрино и Филяповка) и в пяш случаях н обоих образцах из одного населённого пункта - вода и почва (п Мордово Озеро Слобода Выходцева. Моисеевка, Новая Малыкла, Красноармейск)

Сравнение различных методов исследования по индикации лисчерий

Обработав и изучив данные, которые показывали высокую чувствитетьноси. тест-системы для идентификации L monocytogenes методом ПЦР. мы решите провести исследование материалов (пищевых продуктов) для индикации возбудителя листериоза бактериологическим методом, реакцией нарастания титра фага и ПЦР Всего исследовали 68 проб, контаминированно из них листериями - 35 Контаминацию промочили путем инъекции листериозной культуры цпаммами 9-72 и 9-127 в дозе 1 ООО баюернальных ю , в мл и .экспозицией выдержки при комнатной температуре не менее 12 часов В целом полученные результаты предоставлены на рисунке 5

Рис.5 Результаты исследования продуктов питания различными Meiодами

Из вышеизложенных материалов, очевидно, что бактериологический метол выделения микроорганизма вида L monocytogenes выявляет юлько 59 % контаминированных образцов, метод РНФ - до 82 %, наиболее эффективен меюл ПЦР который выявляв! 100 % контаминированных образцов пищевых продуктов

ВЫВОДЫ

1 Выявлен ареал распространения листерий в Ульяновской обласш. включающий 35 населенных пунктов в двух степных районах левобережья Мелекесском и Новомалыклинском, а также в центральной части правобережья - в Карсунском Вешкаймском, Ульяновском. Сенгилеевском, Майнском районах. коюрые непосредственно граничат друм с другом Территории этих двух зон можно оценивать как территории эпизоотически небг1агополучные но листериозу

2 Установлено, что в Ульяновской области листериоз имеет природно-очаювьтй и носит сезонный характер и пик заболеваемости приходится на период марта - апреля Видовой cociae заболевших традиционен мелкий рогатый скот - 62% от всего поражённого поголовья, крупный poi атый скот - 25% и свиньи 8 -13%

3 Разработана схема выделения листерий. накопительная и элеюинная среды ню позволяет выделить листерии в 3-5 раз быстрее, по сравнению с бактериологическим методом, рекомендуемым инструкцией по диагностике листериоза

4 Доказано, чю использование смеси листериозных фшов L 2А L 4Л, в РИФ дтя индикации листерий в пищевых продуктах (мясные, рыбные, молочные, консервы) позволяет получать положительные чанные по контаминации их листериями на 23% превышающие результаты бак криологического исследования

5 Установлена высокая стабильность у листерий генов гемолизина LLO. 1'i-PLC. PC-PLC (не менее 10 лет), что позволяет использовать разработанную тест система «Листер», для индикации Listeria monocytogenes в объектах окружающей среды и мониторинга листериозной инфекции

6 Изучена эффективность тест-системы «Листер» по индикации ДПК Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, которая выявляет 100% контаминированных образцов мясных, рыбных, молочных, консервированных пищевых продую ов

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Разработана тест-сииема «Листер» и подготовлены НТД - ГУ 9388-03400008064-99 на указанную iсст-систему «для выявления и идентификации Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и нааавление по применению

указанной тест-сисгемы, у]верждённые Департаментом ве1еринарии МСХ РФ Чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в I мп и предназначена для выявления фрагмента ДНК Listeria monocytogene<i в биологическом материале от сельскохозяйственных животных, неиммуптированных живыми прошволистериозньши вакцинами, а гакже 01 диких животных, |рызунов щиц клещей в пищевых продуктах и объектах внешней среды

2 Создан кадастр терри юрии по листериозу в Ульяновской области на основании которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии по профилактике данной инфекции

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Васильев Д А . Меркулов А В , Батраков В В Определение степени чувствительности L-фагов для ВСЭ продуктов. // Тсчисы международной конференции '•Актуальные проб гемы ветсан.контроляс/х продукции"' М - 1995 -С 19.

2. Васильев Д А , Меркулов А В . Батраков В В Определение специфичное i и Ь-фаюв л ¡я проведения ВСЭ // Тезисы международной конференции "Актуальные проб icmli вет сан.контроля с/х продукции" -М.- 1995 - С 20

3 Васильев Д А . Батраков В В Меркулов А В Экологические факторы способс гвуюшие распостраненто листериоза // Проблемы экологии Ульяновской области Сборник научных трудов - Ульяновск - 1996 . - С 20

4 Васильев Д.А. Батраков ВВ. Меркулов А В Факторы способствующие распространению пищевого листериоза // Актуальные проблемы ветеринарию -санитарного контроля с-х продукции Сборник научных трудов - М - 1997 - С 165

5 Меркулов АВ, Васильев ДА.. Нафеев А А Организационные основы эпидемиологического и зии ¡оотологическо! о надзора за зоонозами // Вопросы микробиологии, эпизооюлогии и ВСЭ Сборник научных фудов - Ульяновск - 1998 С.21-27.

6 Бакулов И.А . Кольпикова Т И.. Васильев Д А . Меркулов А В Коттяров В М Практическое применение лис (ериозных фагов //Учебное пособие - Ульяновск - 1998 -68 с.

7 Обухов И.Л , Шипулин Г.А. Сорокина М Ю , Меркулов А В., Васильев Д А Разрабо i ка ЛЦР-тест системы для диагностики и идентификации L monocytogenes ' Актуальные аспекты природно очаговых бо 1езней - Омск -2001 - 154с

8 Листериоз в Ульяновской об тети // Кадастр - Ульяновск - 2004 - 85 с

Подписано в печать 2 7 /<?. с, Формат б0х84>/|« Бумага типогр. № I Гарнитура Тип-Тайме Усл. печ. л. ? (? Заказ ¿г? Тираж

Ризограф УГСХА

432601, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1

i

!f i

РЫБ Русский фонд

2006-4 19477

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меркулов, Анатолий Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Общая характеристика болезни.

1.2. Общая характеристика возбудителя болезни.

1.3. Эпидемиология листериоза.

1.4. Некоторые особенности эпизоотологии листериоза.

1.5. Диагностика листериоза.

1.6. Фагоиндикация бактерий и фаготипирование.

1.7. Генетические методы идентификации.

И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Распространение листериозной инфекции на территории Ульяновской области за 1985-2002 гг.

2.2.2. Анализ эпизоотологических показателей листериозной инфекции по Ульяновской области.

2.2.3. Разработка ускоренной схемы бактериологического исследования по индикации листерий

2.2.4. Разработка схемы индикации листерий методом РНФ с помощью смеси фагов L 2А и L 4А

2.2.5. Определение чувствительности ПЦР - анализа на культуре L.monocytogenes, в клиническом материале, объектах окружающей среды для изучения ареала распространения листерий.

2.2.6. Результаты ПЦР - анализа в населенных пунктах Ульяновской области.

2.2.7. Сравнение различных методов исследования по индикации листерий.

2.3. Обсуждение.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ

ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка лабораторных методов выявления ареала распространения листерий"

Актуальность работы

Листерии широко распространены в окружающей среде. Они выделяются из почвенных и водных экосистем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме диких, домашних, сельскохозяйственных животных и вызывают развитие листериоза у них и человека (Бакулов, Васильев, 1995). В связи с этим закономерно то пристальное внимание, которое в последнее десятилетие привлечено к листериозной инфекции. Вместе с тем до настоящего времени в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости листе-риозом, ни ее структура и динамика (Тартаковский, 2002). Это объясняется, с одной стороны, отсутствием ряда нормативных документов в ветеринарной и медицинской службе по индикации микроорганизма и контролем за листе-риозом, с другой - несовершенством существующих методов индикации и их обилием, не прошедшим аттестацию и рекомендацию для применения.

Цель исследования. Разработка и сравнительная оценка методов выявления листерий по показателям их индикации в объектах внешней среды, пищевых продуктах.

Задачи исследования:

1. Выявить ареалы распространения листерий в Ульяновской области .

2. Определить и использовать оптимальные методы индикации листерий для изучения распространения данного микроорганизма, включающие бактериологические методы, реакцию нарастания фага, полимеразную цепную реакцию.

3. Определить эффективность предложенной тест-системы «Листер» по сравнению с другими методами исследования на выявление возбудителя листериозной инфекции, что позволит рекомендовать ее в качестве метода индикации листерий и диагностического метода на листериоз.

Научная новизна

Впервые проведен анализ распространения на территории Ульяновской области листериозной инфекции и выявлены ареалы нахождения листерий за последние 20 лет.

Апробирована схема бактериологического исследования материала, позволяющая в короткие сроки с минимальными затратами получить данные по контаминации листериями объектов окружающей среды, пищевых продуктов.

Рекомендовано для целей индикации листерий использовать смесь фагов L 2А и L 4А.

Доказана высокая сохранность гена гемолизина листерий, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования материалов из окружающей среды на наличие листерий. Получены данные, свидетельствующие о высокой эффективности ПЦР для индикации листерий по сравнению с бактериологическими методами исследования, РНФ, что позволяет рекомендовать ее и в качестве диагностического метода исследования.

Практическая значимость работы

1. Разработана тест-система «Листер» и подготовлены НТД - ТУ 9388034-00008064-99 на указанную тест-систему «для выявления и идентификации Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и наставление по применению указанной тест-системы, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ РФ 7 июля 1999 года. Чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в 1 мл и предназначена для выявления фрагмента ДНК Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, объектах внешней среды, патологическом материале от сельскохозяйственных животных, не иммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, а также от диких животных, грызунов, птиц, клещей.

2. Создан кадастр по листериозу Ульяновской области, на основании которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии и Ульяновскому государственному центру санитарно - эпидемиологического надзора по профилактике данной инфекции.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Установление ареала листерий на территории Ульяновской области.

2. Оптимальная схема бактериологической индикации листерий.

3. Использование РНФ со смешанными группами фагов для индикации листерий.

4.Сохранность гена гемолизина листерий, что явилось основанием использования гена гемолизина Listeria monocytogenes в качестве мишени для скринингового исследования материала на наличие фрагмента ДНК листерий.

5. Эффективность ПЦР по сравнению с бактериологическими методами исследования и РНФ.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава УГСХА за 1995-2003 год; межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); Всероссийской научной конференции ВГНКИ (Москва, 2001); в двух комиссионных испытаниях проведённых по заданию Департамента ветеринарии МСХ РФ и утверждёны директором ВНИИЗЖ в декабре 1998 года и апреле 1999 года, а также в комиссионных испытаниях в УГСХА, утверждённые ректором в 2002 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, в соответствии с плановыми темами научно-исследовательской работы кафедры: «Разработка методов индикации малоизученных пищевых зооантропонозов» и «Создание кадастров природ-но-очаговых, зооантропонозных инфекций на территории Ульяновской области».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 публикаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (204 источников, в том числе 68 отечественных). Работа иллюстрирована 17 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Меркулов, Анатолий Викторович

106 выводы

1. Выявлен ареал распространения листерий в Ульяновской области, включающий 35 населенных пунктов: в двух степных районах левобережья -Мелекесском и Новомалыклинском, а также в центральной части правобережья - в Карсунском, Вешкаймском, Ульяновском, Сенгилеевском, Майнском районах, которые непосредственно граничат друг с другом. Территории этих двух зон можно оценивать как территории эпизоотически неблагополучные по листериозу.

2. Установлено, что в Ульяновской области листериоз имеет природно-очаговый и носит сезонный характер и пик заболеваемости приходится на период марта — апреля. Видовой состав заболевших традиционен: мелкий рогатый скот — 62% от всего поражённого поголовья, крупный рогатый скот -25% и свиньи 8 -13%.

3. Разработана схема выделения листерий, накопительная и элективная среды, что позволяет выделить листерии в 3-5 раз быстрее, по сравнению с бактериологическим методом, рекомендуемым инструкцией по диагностике листериоза.

4. Доказано, что использование смеси листериозных фагов L 2А L 4А, в РНФ для индикации листерий в пищевых продуктах (мясные, рыбные, молочные, консервы) позволяет получать положительные данные по контаминации их листериями на 23% превышающие результаты бактериологического исследования.

5. Установлена высокая стабильность у листерий генов гемолизина LLO, PI-PLC, PC-PLC (не менее 10 лет), что позволяет использовать разработанную тест система «Листер», для индикации Listeria monocytogenes в объектах окружающей среды и мониторинга листериозной инфекции.

6. Изучена эффективность тест-системы «Листер» по индикации ДНК Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, которая выявляет 100% контаминированных образцов мясных, рыбных, молочных, консервированных пищевых продуктов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана тест-система «Листер» и подготовлены НТД - ТУ 9388034-00008064-99 на указанную тест-систему «для выявления и идентификации Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и наставление по применению указанной тест-системы, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в 1 мл и предназначена для выявления фрагмента ДНК Listeria monocytogenes в биологическом материале от сельскохозяйственных животных, неиммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, а также от диких животных, грызунов, птиц, клещей, в пищевых продуктах и объектах внешней среды.

2. Создан кадастр территории по листериозу в Ульяновской области, на основании которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии по профилактике данной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меркулов, Анатолий Викторович, Саратов

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. // Молекулярная генетика. 1993. - № 4.

2. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустрова Н.М. и др. // Журн. микро-биол. -1995.-№2.-С.80-84.

3. Андельсом Л. И., Гуторова Л.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение. // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ин-та. Л., -1958,-С. 6-7.

4. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров. // Ветеринария. 1966, - № 3, - С. 27.

5. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров: Автореферат канд. дисс. М., - 1970.

6. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. М., - 1967.

7. Бакулов И.А. Листериоз. // Вет. энциклопедия. 1972. - №. 3. - С. 948

8. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. / Вопросы диагностики и профилактики. Ульяновск. - 1991. - С. 27-38.

9. Бакулов И.А., Котляров В.М. Непрямой метод флюоресцирующих антител при диагностике листериоза. // Ветеринария. 1968. - № 8. — С. 19-21.

10. Беденашвили Г.Г., Гогилашвили И.Ф., Иониди П.Н. О злокачественной катаральной горячке и листереллезе крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1960. - №8. -С. 26-27.

11. Вендров А.А. Листереллез свиней. // Ветеринария. 1954. - № 8. - С.

12. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата,- С.3-8.957.32.34.1981.1. V/

13. Гинцбург A.JI., Романова Ю.М. Листериоз сельскохозяйственных животных. 1997. - № 3. - С.78-80.

14. Гордина Р.В. Фаготипиравание паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов.: Автореферат докт. дисс., М., - 1954.

15. Гришина Т.Д., Шагинян И.А, Пузанов В.А. и др.// Молекул, генет. -1995.-№1.-С. 36-39.

16. Губкин С.М., Сухотина В.П. Выживаемость листерий в почвах. / На-учн. тр. Омского с.-х. ин-та. 1972. - С. 98-169.

17. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки. // ЖМЭИ. — 1958. -№ 12.-С. 53-55.

18. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S. typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. Киев. -1972.-в. 5.-С. 41.

19. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование Бреславской палочки.//ЖМЭИ. 1958. - № 12.-С. 53-55.

20. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации.: Автореферат канд. дисс., М., - 1967.

21. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага. // Симпозиум «Профилактика и меры борьбы с леп-тоспирозом и листериозом с/х животных». Новочеркасск. - 1972. -С. 76-78.

22. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемическое значение. // ЖМЭИ. — 1947.- № 8. С. 312-315.

23. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллезных культур с помощью 0- бактериофага. // Тез. докл. конф. Таллин, научн.-иссл. ин-та эпидемиол., мик-робиол. и гигиены. Таллин. — 1960. - С. 5.

24. Кривисский А.С. Вирусы против микробов. М., - 1962.

25. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий. // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию НИИВС. Тбилиси. - 1974. - С. 276-280.

26. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий. // В кн.: Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М., - 1961. - С. 220.

27. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий, типа gravis. // ЖМЭИ. 1970. - № 12. -С. 16-22.

28. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М., - 1963. — с

29. Кузнецова В.Н. Фаготипирование бактерий Зонне. // В кн.: Дизентерия. М., Медгиз. - 1956. - С. 29.

30. Ларионова О.С. Роль молока и мяса в передаче листериозной инфекции. Автореф.дисс.канд.биол.наук. Саратов. - 2003. ^

31. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага. // Ветеринария. 1984. -№ 7. - С. 32.

32. Малахов Ю.А. О методике исследования биосубстратов при лиоте-риозе. // Лабор. дело. 1962.- № I. - С. 45-49.

33. Меньшикова З.Н. Злектромикроскопическое изучение морфологии листерий и эризипелотриксов: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Покров. -1971.

34. Мещеряков АЛ. Изоляция сибиреязвенного бактериофага и испытание его для дифференциальной диагностики Bac.cereus. Тр. Всесоюзн. ин-та эксперим. ветеринарии. - 1962. -С. 46-49.

35. Наурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями. // Материалы 10 научн. сесс. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата. — 1978. - С. 55-57.

36. Нестеренко JI.H., Аксенов М.Ю., Гришина Т.Д. и др. // Пробл. туб. -1994.-№4.-С. 29-32.

37. Никитюк Н.М. Фаготипирование S. typhimurium, выделенных на различных территориях СССР. // ЖМЭИ. 1970. -№ 1. - С. 53.

38. Николаенко Н.И., Тутов И.К. Изучение активности бактериофага Salm. abortus ovis после длительного хранения его. Диагностика лечение и профилактика заболеваний с/х животных. Тр. Ставропольск. с/х инт-та. 1970. - Т. XXXIII, - С. 221-224.

39. Николайчул Л.Ф., Саввэ В.Р. Сравнительная оценка методов дифференцирования микро- и макроглобулинов в сыворотках животных иммунизированных листериями». // Вопросы вет.вирус.микробиол. 1973. -С. 82-84.

40. Огнева Н.С. Об эпизоотологии листериоза. // Зоологический журнал. -1964. №9.-С. 1373-1381.

41. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа при помощи vi фага. // ЖМЭИ. - 1951. - № 2. - С. 37-40.

42. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологические свойства фагов Bac.antracis и Bas.cereus. // ЖЭМИ. 1971. - № 7. - С. 147.

43. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от коров. // ЖМЭИ. 1967. -№ 5. - С. 128.

44. Поманская Л.А. Длительность сохранения листерий в объектах внешней среды. // Ветеринария. 1961. - № 12. - С.21.

45. Поманская Л.А. О размножении листерий в почве. // ЖЭМИ. -1963. -№6.-С. 99-101.

46. Попов В.И. Эпизоотология и клиника листереллеза у свиней: Авто-реф. дисс. на соиск. учен, степени канд. вет. наук. М.-Кузьминки. - 1960. - 24 с.

47. Попов И.А. Значение серологических исследований в эпизоотологии листереллеза некоторых видов сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс. на соиск. учен, степени канд. вет. наук. Волгоград. - 1958. - 16 с.

48. Попхадзэ М.З. Использование бруцеллезного фага для дифференциации бруцелл. // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119-124.

49. Пушкарева В.И., Емельяненко Е. Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г.А., Дьяков Ю.Т. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. // Журн. микробиол. 1997. - № 3. - С. 3-10.

50. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней. // Ветеринария. 1970. - № 6.-С. 99.

51. Савельева л.В. Усовершенствование лабораторных методов диагностики листериоза. Автореф.дисс.канд.биол.наук. Саратов. - 1999.

52. Сергиенко Ф.С. Новый метод бактерюлопчно д1агностики за допомо-гою бактерюфага. // Мжробюл. журн. АН УССР. 1936. - № 1. - С. 85-112.

53. Скрипкин Ю.К., Кубанова А.А., Аковбян В.Н. и др. // Антибиотики. -1996.-№2.-С. 5-8.

54. Сливко В.В. Листериоз сельскохозяйственных животных. 1959.

55. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотерапия. 2000. - № 2. - С. 20-30.

56. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. -Москва. -2002. „ & ^

57. Тимаков в.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага /РНФ/ -М., 1962. t- U

58. Триполитова А.А., Борисова Г.В. Листериоз. Томск. - 1965. S

59. Халимбеков М.М. Клинические симптомы листериоза овец и коз. -Труды Азербайдж. н.- и. вет. опытной станции. 1957. -т.6. - С.10-16.

60. Цветков К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл. // Ветеринария. 1941.- № 6. - С. 4-6.

61. Чирокадзе Л.Г., Чанишвили Т.Г. Типирование S. typhimurium при помощи селекционированных фагов. // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 72-78.

62. Шагинян А.И., Гинцбург А.Л. // Генетика. 1995. - Т.31. - №5. - С. 600-610.

63. Шлыгина К.Н. Сравнительное изучение лабораторных методов диагностики листериоза: Автореферат канд.дисс., М., - 1970. с.

64. Юрков Г.Г. Эпизоотология листериоза сельскохозяйственных животных в Луганской области и меры борьбы с ним: Автореферат, дисс. канд.вет.наук. 1962. ^

65. Allerbergen F. et. al. Listeriosis in Austria. // Acta microbiol. hung.- 1989. -V. 36.-№2-3.-P. 149-152.

66. Al-Sould W.A., Jonsson L., Radstrom P. Identification and characterization of immunoglobulin О in blood as a major inhibitor of dignostic PCR. // J. Clin. Microbiol. 2000. - № 38. - P. 345-350.

67. Atkinson E. Meningitis associated with gram-positive bacilli of diphtheroid type. // Med. J. Australia. 1917. - V.l. - P. 115-118.

68. Audurier A,. & Martin C. Phage typing of Listeria monocytogenes. // Int. J. Food Microbiol. 1989. - № 8. - P. 251-257.

69. Backman A., Lantz P., Radstrom P. Evaluation of an extended diagnostic PCR assay for detection and verification of the common causes of bacterial meningitis in CSF and other biological samples. // Mol. Cell Probes. 1999. - № 13. - P. 4960.

70. Balsech J. E. Bacteriologia у serologia de la infection listeria. //Acta bi-onim atinoamer. 1981. -V. 15. - № 4. - P. 565-569.

71. Beams R. The effect of pasteurization on L. monocytogenes . // Can. J. Microbiol. 1958. - V. 4. - № I. - P. 55-61.

72. Beerens H. , Tahon-Gastel M. Milieu a hacide nali- dixicue pour ITiso-lenient des streptocoques, D. pneunoniae, Listeria, Erysipelothrix. // Ann. Inst. Pasteur. 1966. - P. 90-95.

73. Bockemuhl J., Feindt E., Hohne K., Beeliger H.P.R. Acridinfarbstoffe in Selektivnahrboden zur Isolierung von Listeria monocytogenes. // Med. Microbiolo Immunol. 1971. -№ 159. - P. 289-299.

74. Bockemuhl J., Seeliger H.P.R., Kathke R. Acridinfarbstotte in Selektivnahrboden zur Isolierung von Listeria monocytogenes. // Med. Microbiol. Immunol. -1971.-P. 84-95.

75. Bockemuhl J., Seeliger H.P.R., Kathke R. Acridinfarbstotte in Selektivnahrboden zur Isolierung von Listeria monocytogenes. // Med. Microbiol. Immunol. -1971.-V.157.-P. 84-95.

76. Bowie D. et. al. Ataxia in L. monocytogenes nfections of the central nervous sys. tem. // South. Med. J. 1983. - V. 76. - № 5. - P.567-570.

77. Braveny I., Grote H. Selektivsuostrat sur Isolierung von Listeria monocytogenes. // Exparientia . -1971. № 29. - P. 1555-1555.

78. Breer C. The occurrence of Listeria in cheese. // Inst.vet. Med.- Berl. -1986.-P. 230-233.

79. Buchrieser C., Weagant S. D. and Kaspar C. W. Molecular characterisation of Yersinia enterocolitica by pulsed-field gel electrophoresis and hybridisation of DNA fragments to ail and pYY probes. // Appl. Environ. Microbiol.- 1994. № 60. -P. 4371-4379.

80. Bauvet E. S. et. al. Severe meningitis dne to L. monocyrogenes. // Scand. J. xntec. Diseases. 1982. - V. 14. - № 4. - P. 267-270

81. C.James, et al. Listeriosis outbreak associated with Mexican-Style cheese. California. // Vjrb. Mortal Week. Rep. 1985. - V. 34. - P. 357-359.

82. Campbell D. Listeriosis in Scotland. // Lancet. -1989. № 8636. - P. 492.

83. Cherubin C. et. al. Listeria and gram-negativ bactllars aenlasitis. // Amar. J.

84. Med. 1981. - V. 71. - № 8. - P. 199-209,

85. Christensen, S. G. Co-ordination of a nation-wide survey on the presence of Yersinia enterocolitica 0:3 in the environment of butcher shops. // Contr. Microbiol. Immunol. 1987. - № 9. - P. 26-29.

86. Cintra L. et. al. Isolaraonto de L. monocytogenes. // Rev. microbiolog. -1983. -V. 14. № 4. - P. 290-291.

87. Comi G. Listeria spp. in formagg en d insaccati crudi. // Ind. Alim 1987. -V. 26.-№3.-P. 216-218.

88. Csontos j., Pesti L., Ronivary J. Adatok a sertesek Listeriosis ahoz. // Magyar fllatorv. Laoja. 1956. - V. 11. - № 6. - P. 204-209.

89. De Boer E. and Nouws J. F. M. Slaughter pigs and pork as a source of human pathogenic Yersinia enterocolitica. // Int. J. Food Microbiol. 1991. - № 12. - P. 375-378.

90. Dedie K. Beitrag zur Epizootologie der ListeroseiT. // Arch. Exptl. Vet-erinaermed. 1955. - P. 231-264.

91. Dedie K. et. al. Die Hitzeresistanz von L. nonocytogenes in Milch. // BMTW. 1958 - V. 70. - № 10. - P. 231-232.

92. Despierres. M. Isolation de Listeria полосуоозэпез dans un milieu defa-vorable a Streptococcus faecalis. // Ann. Last. Pasteur. — 1971. V. 121. P. 493-501.

93. Donker-Voet J. Listeriosis in animals. // BOIE. -1965. -V. 64. №1. - P. 757-764.

94. Doyle M.P., Schoeni J.L. Comparison of procedures for"isolating Listeria monocytogenes in soft, surface-ripened cheese. // J.Food Protect. 1987. -V. 50. - P. 4-6.

95. Doyle M.P., Schoeni J.L. Selective ernichment procedure for isolation of Listeria monocytogenes from fecal and biologic specimens. Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51. - P.27-29.

96. Dumont J., Cotoni L. Bacille semblable a celui du rouget du rencontrii dans le L.C.R. d un muningitigue. // Fnn. Inst.Pasteur. 1921. - № 35. - P. 625-633.

97. Dumont J., Cotoni L. Bacille semblable au bacille du rouget du porerencontre, dans le liguide cephalo-rachidien d un meningitigue. // Ann. Inst. Pasteur. -1921.-V. 35. -P. 625-633.

98. Elischerova K. Some ecological aspect, of. L. monocytogenes in meat industry. // Probl. in Listeriosis. 1979. - P. 148-155.

99. Epizootiology of vibriosis and listeriosis of sheep and cattle. // Aut: D.F.Eveleth, A.Y.Goldsby, F.M. Bolin et al. / Vet. Med. 1953. - V. 48. - № 8. - P. 321-323.

100. Farben J. et. al. The presence of Listeria in raw milk. //Can. J. Microbiol.1988. -V. 54. № 2. - P. 95-100

101. Farber J.M., & Peterkin PJI. Listeria monocytogenes, a food-borne paty-hogen. // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - P. 476-511.

102. Fenlon D. The in ciolence of. L.m. in raw milk. // J. Appl. Bacteriol.1989.-№66.-P. 191-196.

103. Fenwick S. G. and Murray A. Detection of pathogenic Yersinia enteroco-litica by polymerase chain reaction. // Lancet. -1991. V.337. - P. 496-497.

104. Forray A. Vjabb. adatok a szarvasmarha-listerio-dulasarol kulonos tekin-tettel abakteriologia i husvizsgalatra. // Maggar allatorv. 1969. — V. 24. - № 2. -P. 585-587.

105. Fukushima H., Hoshina K., Itowa H. and Gomyoda M. Introduction into Japan of pathogenic Yersinia through imported pork beef and fowl. // Int. J. Food Microbiol. 1997. -V. 35. - P. 205- 212.

106. Garagrabel J. L. monocytogenes dans le lait pastenrisc. // Can. J. Microb. 1986.- V. 52. - № 2. - P. I4I-I50.

107. Gellin B.G., Broome С.Ч., Bibb W.F., Weaver R.E., Gaventa S., Mascola L. The Epidemiology of listeriosis in the United States. // Am. J. Epidemiol. —1991. -V. 1133.-P. 392-401.

108. Gledol J. С hygiene du lait cru. // Ioanniv. CEPIL. 1987. - P. 213-221.

109. Gonlet. et. al. La listeriose en. franee en 1966. // Pathol.-biol. 1989. V. 37.-№3.-P. 206-211.

110. Graigie J., Felix A. Typing of typhoid bacilli with Vi bacteriophag, suggestions for ist standartisation. // Lancet. -1947. №14. - P. 823.

111. Graigie J., Yen C. Demonstracion of types of В typhosus by means of preparacions of typs II/ Vi page/. // Canad. Publ. Hlth. J. - 1938. V. 29. - № 9. - P. 448.

112. Gray M.L., Stafseth H.J., Thorp F. Jr., Sholl L.B., Riley W. F. Jr. A new technique for isolating Listerellae from bovine brain. //J. Bacteriol. 1948. - V. 55. -P. 471-476.

113. Gray M.L., Singh C., Thorp F. Abortion, stillbirth, early death of young mbbits by Listeria monocytogenes. II. Oral exposure. // Ptoc. Soc. Exp. Biol. Med. -1955. V. 89. - P.169-175.

114. Haues J. Isolation. Of. from raw milk. // Appl. And Envirol Microbiol. -1986. V. 51. - № 2. - P. 43 8-440.

115. Hayes P. Jsolation. of L. monocytogenes from raw milk. //Appl. and Envirol Microbiol. 1986. - V. 51. - № 2. - P. 438-440.

116. Herrero J. et. al. L. monocytogenes infection in renal tranplant. //Transl. and Glin. Immunol. 1980. - V. 20. - P. 214

117. Hill W. E. and Keasler S. P. Identification of foodborne pathogens by nu-cleid acid hybridization. // Int. J. Food Microbiol. 1991. - V. 12. - P. 67-76.

118. Iteman, I., Baril, C., Girons, I. S. and Carniel, E. Pulsed-field gel v. electrophoresis of the chromosome of pathogenic Yersiniae. // Contr. Microbiol. Immunol. 1991. - V. 12. - P. 198-202.

119. James.C., et al. Listeriosis outbreak associated with Mexican-Stylecheese. I I California. Vjrb. Mortal Week. Rep. 1985. - V. 34. - P. 357-359.

120. Jaton K., Sahli R., Bille J. Development of polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in clinical cerebrospinal fluid samples. // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - P. 1931-1936.

121. Jay J.M. A new selective medium for the recovery of Listeria spp. from foods. // Abstr. Annu. Mtg. Amer. Soc. Microbiol. 1987. - V.87. - P. 278.

122. Johannessen G. S., Kappemd G. and Kruse H. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in Norwegian pork products determined by a PCR method and a traditional culturing method. //Int. J. Food Microbiol. 2000. - V.54. - P. 75-80.

123. Johnson J., et. al. Fate of L. monocytogenes in hard salami. // Appl. and Environ. Microbiol. -1988. V. 54. - № 2. - P. 497-501.

124. Kampelmacher E. Listeriosis in humans and animals in the ITetner-lanasll. // Zbl. Bakteriol. 1980. - № 2. - P. 211-227.

125. Karib H. and Seeger H. Vorkommen von Yersinien- und Campylobacter-Arten in Lebensmitteln. (Presence of Yersinia and Campylobacter spp. in foods.) // Fleischwirtschaft. 1994. - V. 74. - P. 1104-1106.

126. Katznelson H., Sutton M. Rapid Phag plaque count method for the detek-tion of bacteria as appliedto the demonstration of internalug bone bacterial infection of seed. //J. Bact., -1951.-V. 61. № I.-P. 689.

127. Khain M.A., Seaman A., Woodbine M. Differential media in the isolation of Listeria monocytogenes. // Zbl. Bakt. Hyg , I. .-ibt. Orig. 1973. - V. 224. - P. 362-375.

128. King T. Phagocytosis and Killing L. monocytogenes by alveolar macrophages. // J. Infec. Diseases. 1958. - № 6. - P. 1309-1316.

129. Kotilainen P., Jalava J., Meurman O., et al. Diagnosis of meningococcal meningitis by broad-range bacterial PCR with cerebrospinal fluid. // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 2205-2209.

130. Kulz J. Zum Problem der Listeriose. // Z.arg. Forthild. 1990. - V. 84. -№ 3. P. 8-84.

131. Kwaga J., Iversen J. O. and Misra V. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction and Digoxigenin labelled polynucleotide probes. // J. Clin. Microbiol.- 1992. V. 30. - P. 2668-2673.

132. Kwantes W. Listeria infection in west Glamorgan. // Probl. in Listeriosis. 1971.-P. II2-II4. ^ « г

133. Landegren U., Kaiser R., Casley C.T. Hood L. // Science. 1988. - V. 242. - № 4876. - P.229-237.

134. Larsson S., et. al. L. monocytogenes causin hospitalacquirea. // Bri Med. J. 1979.-V. 6135.- №6.-P. 473-474.

135. Larsson S., Welder M.H., Gronberg G.N., Forsgren A.B., Bioestrup I. Antimicrobial susceptibilities of Listeria monocytogenes strains isolated from 1958 in Sweden Antimicrob. // Agents Chemother. 1985. - V. 28. - P. 12- 14.

136. Lehnert G.H. Bakteriologische, serologische und tierexperimentelle Un-tersuciiungen zur Patuogenese Epizootologie und Prophylaxe der Listeriose. // Arch. Exp. Vet. Med. 1964. - V. 18. - P. 64-86. , ^ /

137. Lindblom В., Holmlund G. // Gene Anal. Techn. 1988. - V.5. - P.97.

138. Loessner M.J., & Busse M. Bacteriophage typing of Listeria species. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 54. - P. 1912-1918.

139. Lorber B. Listeriosis. // Clin Infect. Dis. 1997. - V. 24. - P. 1-11.

140. Lovett J., Francis D. W., Hunt J.L. Listeria monocyto-senes in raw milk: Detection, incidence, and pathogenicity. // J. Food. Protection. 1987. - V. 50. - P. 188-192.

141. MacKaness O.B. Resistance to intracellular infection. // J. Infect. Dis. -1971.-V. 123.-P. 439-445.71.-V. 123.-P. 439-445.

142. Mavrothalassitis P. A method for the rapid isolation of Listeria monocytogenes from infected material. // J. Appl. Bacteriol. 1977. - V. 43. - P. 47-52.

143. Mcbride M. E., Girard K.F. A selective method for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations. // J. Lab. Clin.Med. 1960. -V. 55. - № l.-P. 153-157.

144. McLauchlin J,. Audurier A, Taylor A.G. The evaluation of a phage-typing system for L. monocytogenes for use in epidemiological studies. // J. Med. Microbiol. 1986.-V. 22.-P. 357-365.

145. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L.F., Bresee J.S., Simpiro C., Griffin P.M., Tauxe R.4. Food-related illness and death in the Unites States. // Emerg. Infect. Dis. 1999. - № 5. - P. 607-625.

146. Miller V. L., Farmer III J. J., Hill W. E. and Falkow S. The ail locus is found uniquely in Yersinia enterocolitica serotypes commonly associated with disease. // Infect Immun. 1989. - V. 57. - P. 121-131.

147. Morel A. et. al. La listeriose dans la region de Rouen. // Sem. hop. Paris. -1989. V. 55. -№ 9-10. - P. 506-510.

148. Murray E., Webb R., Swann M. A disease frabbits characterised by a large mononuclear leucocytes caused by nitherto unciescribed bacillus. Bacterium monocytogenes. // J. Path. Bact. 1926. - V. 29.- P. 407 - 39.

149. Najdenski, H., Iteman, I. and Carniel, E. Efficient subtyping of pathogenic Yersinia enterocolitica strains by pulsed-field gel electrophoresis. // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32. - P. 2913-2920.

150. Nesbakken, T. and Kapperud, G. Yersinia enterocolitica and Yersinia en-terocolitica-like bacteria in Norwegian slaughter pigs. // Int. J. Food Microbiol. -1985.-V.I.-P. 301-309.

151. Nicolas J. et al. Contribution a 1 etude des Listeria presentes dans les den-rees d origine onimale. // Rec. Med. Vet. 1986. - № 163. - P. 283-285.

152. Nielsen, B. and Wegener, H. C. Public health and pork and pork products: regional perspectives of Denmark. // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1997. - V. 16. -P. 513-524.

153. Pini P. et. al. The occurrence in the V.K. of Listeria in raw chickens. // Int. J. Food. Microb. 1988. - V. 6. - № 4. - P.317-326.

154. Pirie J.H. A new disease of veld rodentstiger river disease. // Publ. Afr. Inst. Med. Res. 1927.- V. 3. - № 20. - P. 163-186.

155. Potel J., R.Alex. Geburtsh ifliche Erfahrungen nach Listeria infection Ge-burtsh. // Franenheiek. 1955. - № 16. - P.1002-1008.

156. Quaglio F. et. al. Considerazioni sulla epidemiologia e profilassi delle in-fezioni da L. monocytogenes. //Teen, sanit. 1979. - V. 17. - № 4. - P. 375-397.

157. Ralovich B. Listeriosis research. // Budapest. 1984.

158. Ralovich В., Forray A., Mero E., Malovics H„ Szazados I. New selective medium for isolation of L, monocytogenes. //Zbl. Bakt. , I. Abt. Orig. 1970. — V. 216.-P. 88-91.

159. Ramires. E. et. al. Meningite por L. monocytogenes. //Rev, Inst. A, Latz. 1978. - V. 38. - № I. - P. 37-41.

160. Rasmussen H. N., Olsen J. E. and Rasmussen O. F. RAPD analysis of Yersinia enterocolitica. // Lett. Appl. Microbiol. 1994. - V. 19. - P. 359-362.

161. Rocourt J. & Jacket C. Surveillance epidimiologigue de la listeriose hu-manie en France: role du center national de reference. // Med. Mai. Infect. 1995. -V.25.-P. 177-183.

162. Rocourt J. Listeria monocytogenes: the state of the art. // Dairy Food Environ. Sanitation 1994. - V. 14. - P. 70-82.

163. Rolle M., Mayer H. Zur Pathogenese der Listeriose. // Zbl. Bacterid. 1. Orig. 1956. - V. 166. - № 6. - P.479-483.

164. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. Т., Mullis K. and Erlich H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. //Science. 1988. - V. 239. - P. 487-492.

165. Saken E., Roggenkamp A., Aleksic S. and Heesemann. Characterisation of pathogenic Yersinia enterocolitica serogroups by pulsed-field gel electrophoresis of genomic NotI restriction fragments. // J. Med. Microbiol. 1994. - V. 41. - P. 329-338.

166. Scancher. C. et al. La Listeriosis del udulto. // Med. din. 1983. - V. 80. -№5.-P. 196-200.

167. Schlech W.F. et al. Epidemic Listeriosis. Evidence for transmission dy food. // New. Engl. J. Med. 1983. - V. 308. - P. 203-206.

168. Schonberg. A. Serovars of L.m. and L.in. from Eoodff. // Acta. Microb. Himgar. 1988. - V. 36 . - P. 249-253.

169. Schtmidt. U. Verh.alten von L.m vaku umverpacktem. // Fleishwirtschiaft. 1988. - V. 70. - № 3. - P. 239-240.

170. Sctilech. W. F. et. al. Epidemic listeriosis. Evidence for transmission by food. // New. Engl. J. Med. 1983. - V.308. - P. 203-206.

171. Seeliger H., Bockemiho G. Kritische Untersuchungen zur Frage einer Kapselbildung bei Listeria monocytogenos. // Zbl. Bakteriol. I. Orig. 1968. - V. 206.-№2.-P. 216-227.

172. Seeliger H.P.H., Jones D. Genus Listeria Pirie. In: Sneath Р.Я.А., Mair U.S., Sharpe M.E., Holt J.G. (eds.)s. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. // Williams & ilkins, Baltimore 1988. - V.2. - P. I235-I24-5.

173. Seeliger H.P.R. Listeriosist 2nd ed. // Hafner Publishing Co., Inc. New York. 1961.

174. Seeliger. H. History and Actual Developments. // Infection. -1988. V. 16.-P. 80-84.

175. Seeliger. H. Problem der Listoriose simposion 1968. 1969. P. 14-23.

176. Shimizu К., Otsuka G., Oka M. Guanofiiracin media for isolstion of L.monocytogenes and its practical application. // Japn. J. Vet.Res. 1954. - № 2. - P. 3-10.

177. Siragusa G. Persistence of L. monocytogenes in yogurt as. determined by plating and enrichment metods. // Inter. J. Food microb. 1988. - V. 7. — P. 147-160.

178. Skjerve E., Lium В., Nielsen B. and Nesbakken T. Control of Yersinia enterocolitica in pigs at herd level. // Int. J. Food Microbiol. 1998. - V. 45. - P. 195-203.

179. Skovgard N. Detection of Listeria spp. in faeus from animals in feeds and raw foods of. animal origin. // Int. J. Food. Microb. 1987. - V. 6. - P. 229-242.

180. Smith V. S, Metzger J.E. Demonstration of capsular structure on Listeria monocytogenes. // Path, et Microbiol. 1962. - V. 25. - № 4. - P. 499-506.

181. Tauxe J., R. V., Wauters G., Goossens V., van Noyen R., Vandepitte J., Martin S. M., de Moel P. and Tiers G. Yersinia enterocolitica infections and pork: the missing link. // Lancet, -1987. P. 1129-1132.

182. Tsai S. J. and Chen, L. H. Occurrence of Yersinia enterocolitica in pork products from Northern Taiwan. // Contr. Microbiol. Immunol. 1991. - V. 12. - P. 56-62.

183. Veber A. Nachveis von L. monocytogenes und L. innocua in Kase. // Beret Munch vschr. 1988.- V. 101. - № II. - P. 373-375.

184. Vittu I. et. al. Listerios neo-natales. // J. Sci. med. Lille. 1980. - V. 98. -№9.-P. 147-148, 150-152.

185. Vries S. Strinwerda. R. Ein. Fell. Klinischer Enterlisteriose. // Zbl. Bacterid. I. Orig. 1956. - V. 107. - № 3. - P. 229-232.

186. Wang, R. F., Cao, W. W. and Cerniglia, С. E. A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods. // J. Appl. Microbiol. -1997.-V.83. -P. 727-736.

187. Wauters G., Goossens V., Janssens M. and Vandepitte J. New enrichment method for isolation of pathogenic Yersinia enterocolitica serogroup 0:3 from pork. // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - P. 851-854.

188. Weis j., Seeliger H.P.R. Insidence of Listeria monocytogenes in nature. // Apl. Vicrobiol. 1975. - № 30. - P. 29-32.

189. Welshimer HJ. The genus Listeria and related organisms. In: Starr Mo, Stolp H., Truper E.G., Balows A., Schla-gel H.G.(eds.); // The Prokaryotes. Springer-Verlag, Berlin . 1981. - P. 1680-1687.

190. Welshimer H.J. The genus Listeria and related organisms. In: Starr Mo, Stolp H., Truper E.G., Balows A., Schla-gel H.G.(eds.). // The Prokaryotes. Springer-Verlag, Berlin . 1981. - P. 1680-1687.

191. Wren, В. T. and Tabaqchali, S. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by the polymerase chain reaction. // Lancet. 1990. — V. 336. - P. 693.

192. Yersin B. et. al. Infection a Listeria monocytogenes chez J'aduete. // Scweiz. med. Wochenschr. 1981. - V. III. - № 43. - P. 1596-1602.

193. Zheng X. B. and Xie, C. Isolation, characterisation and epidemiology of Yersinia enterocolitica from humans and animals. // J. Appl. Bacteriol. 1996. - V. 81.-P. 681-684.