Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль молока и мяса в передаче листериозной инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль молока и мяса в передаче листериозной инфекции"

На правах рукописи

Ларионова Ольга Сергеевна

РОЛЬ МОЛОКА И МЯСА В ПЕРЕДАЧЕ ЛИСТЕРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

Специальность 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2003

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Зыкин Леонид Федорович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАЕН, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Самойлова Любовь Владимировна

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоите

2003 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Л.В. Карпунина

2ро5-А

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Официальная регистрация лис-териоза в нашей стране проводится с 1956 года у животных, и с 1992 г. - у людей.

До 1960 г. листериоз рассматривался как ветеринарная проблема. Однако с 60 гг. постепенно стало ясно, что листериоз у человека встречается гораздо чаще, чем было принято считать. Люди заражаются не только при уходе за больными животными, но и алиментарным путем, а сама инфекция должна рассматриваться не как зооноз, а как зооантропоноз или как пищевой зооноз. С 80 годов XX века начался этап изучения листериоза как пищевой инфекции. Этому способствовали многочисленные вспышки листериоза вследствие употребления в пищу продуктов животного и растительного происхождения в ряде стран Европы, а также в США и Канаде (Бакулов, 1999).

Листерии изолируются из разнообразных пищевых продуктов: преимущественно из молока и продуктов его переработки, мяса и мясных полуфабрикатов, рыбы, морепродуктов и овощей, а также из кормов и силоса.

Так, например, крупная вспышка листериоза (279 случаев) произошла во Франции в 1992 году в результате употребления в пищу заливного из свиных языков (Jacquet et al., 1995).

В Швейцарии в период с 1983 по 1987 год зарегистрировано 122 случая пищевого листериоза с летальностью 27 % вследствие употребления в пищу сырого молока и сыра (Bille, 1990).

Пастеризованное шоколадное молоко стало причиной вспышки листериоза (45 случаев) в США в 1997 году (Dalton et al., 1997).

Доминирующим проявлением инфекционного состояния при листериозе является здоровое носительство (Котляров, Бакулов, Макеева, 1999). Бессимптомное кишечное носительство листерий установлено по разным источникам у животных и людей в 5-60 % случаев (Бакулов, 1993). Стресс, угнетение иммунного статуса или другие неблагоприш пыс ^л^торы спо-

1 i библиотека

С.Петербург ,

ОЭ W>3"&LJ

собствуют манифестации инфекции различными клиническими признаками.

В Саратовской области согласно государственной статистической отчетности при бактериологическом исследовании на листериоз в 1989-93 гг. было обследовано 5282 овцы и выделено 87 культур, серологически в РСК за этот период исследовано 543285 овец и получено 1288 положительных результатов (Отчеты ветеринарного управления Саратовской области). Более поздними данными по этой проблеме мы не располагаем.

По материалам лаборатории клинической вирусологии и микробиологии МУ клинической больницы №8 в Заволжье при сплошном скрининге у взрослых людей здоровое носи-тельство было отмечено в 18 % случаев, у новорожденных листерии выделены из мекония в 22 % (Гасанова, 2003).

Предпосылкой к выполнению нашей работы было сообщение J1.B. Савельевой (1999), которая при исследовании рыночного молока в г.г. Саратове и Энгельсе обнаружила в 1,97 % проб Listeria monocytogenes; в 0,98 % листерии оказались патогенными в коньюнктивальной пробе на морских свинках. До этого в Саратовской области масштабные исследования по обнаружению Listeria monocytogenes в животноводческой продукции не проводились.

Приоритетным направлением в этой проблеме является строгий контроль уровня контаминации пищевых продуктов листериями.

До недавнего времени в России не было нормативных законодательных актов о бактериологическом контроле пищевых продуктов на L. monocytogenes.

Утвержденное Минздравом России дополнение № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96 регламентирует уровень контаминации пищевых продуктов листериями - нормой считается отсутствие Listeria monocytogenes в 25 г различных пищевых продуктов.

Основанием для выбора темы диссертации явилось отсутствие данных о значении животноводческой продукции как фактора передачи листериозной инфекции в Саратовской об-

ласти на фоне роста заболеваемости листериозом в Российской Федерации.

Цель диссертационной работы - выяснение роли молока и мяса в передаче листериозной инфекции на территории Саратовской области.

Задачи исследования:

1. Провести исследование молока и молочных продуктов в хозяйствах области и объектах розничной торговли г. Саратова на L. monocytogenes.

2. Провести, исследование мяса и продуктов переработки мяса в хозяйствах области и магазинах г. Саратова на L. monocytogenes.

3. Изучить динамику размножения листерий в некоторых сортах сыра и мясном фарше.

4. Применить ПЦР при исследовании молочных и мясных продуктов на наличие листерий.

Научная новизна

1. Доказано наличие L. monocytogenes в молоке коров из различных хозяйств Саратовской области в 4,26 %.

2. Установлено присутствие L. monocytogenes в 14,28 % образцах мяса и мясопродуктов с рынков г. Саратова и ряда хозяйств области. Часть изолированных штаммов (3,57 %) были вирулентными.

3. Продемонстрирована высокая эффективность полиме-разной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с бактериологическим методом при индикации L. monocytogenes в животноводческой продукции.

Практическая значимость

Показано, что мясо, мясные полуфабрикаты, молоко и молочные продукты из хозяйств и рынков Саратовской области, а также из сети розничной торговли довольно часто инфицированы листериями (4,26-27,77 %), т.е. могут являться вероятными причинами листериозной инфекции.

В Татищевском районе выявлено хозяйство ГСП «Колог-ривовское», стойко неблагополучное по листериозу.

Изучены свойства других видов листерий (L. monocytogenes серовары 7, 1/2а, l/2b, 1/2с, 3b, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е;

L. ivanovii серовар 5; L.murray; L. innocua серовары 6a и 6b; L. grayi).

Установлено, что сроки выживания L. monocytogenes в сырах мягких сортов и мясном фарше колеблются от 7 до 17 дней.

ПЦР является высокоточным методом индикации листерий в молоке и мясе и может быть использована для быстрого обнаружения L. monocytogenes в этих продуктах.

Полученные результаты работы дают полное основание для углубленного изучения распространения листериоза у животных на территории Саратовской области, а также для налаживания контроля пищевых продуктов на наличие листерий согласно Утвержденному Минздравом России дополнению № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96.

По результатам исследований подготовлены «Методические рекомендации по применению полимеразной цепной реакции для индикации листерий в продуктах животноводства», утвержденные УМС ИВМиБ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 54 от 03.09.03).

Материалы диссертации нашли применение при чтении лекций и проведении практических занятий по теме листериоз на кафедре микробиологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показана значительная обсемененность L. monocytogenes животноводческой продукции {А,26-21,11 %) из различных хозяйств и объектов розничной торговли Саратовской области.

2. В ГСП «Кологиривовское» Татищевского района выявлен стойкий очаг листериоза свиней и КРС, требующий санации.

3. Сроки выживаемости листерий в животноводческой продукции (сыры мягких сортов, мясной фарш) колеблются от 7 до 17 дней и зависят от вида продукта и температуры хранения.

4. ПЦР рекомендуется как экспресс метод для индикации L. monocytogenes в молоке и мясе.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на «Научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ по итогам научно-исследовательской ра-

боты за 2001-2002 гг., на Юбилейной научной конференции СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2003 г., а также на международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов», Покров, 2003 г.

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации «Аграрное образование и наука» за 2001-2002 гг.

Публикации

1 Основное содержание работы отражено в 6 работах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Работа изложена на 107 страницах, иллюстрирована 8 рисунками и содержит 12 таблиц. Список использованных литературных источников включает 152 наименования, в том числе 60 зарубежных.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсан-экспертизы института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» в соответствии с плановой тематикой:

1. «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерсинио-за, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2001).

2. «Роль сельскохозяйственных животных в распространении некоторых бактериальных и вирусных инфекций в Саратовской области» (2002).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы

1 Обзор литературы включает 4 раздела, посвященных роли

пищевых продуктов и кормов в эпидемиологии и эпизоотологии листериоза и методам диагностики этой инфекции.

Собственные исследования

Материалы и методы

В работе было использовано 7 штаммов L. monocytogenes: "Бурынь", "Тернополь", "Почва", "А", "546", "19", "АУФ"; из которых 4 были патогенными и 3 - непатогенными (музей кафедры микробиологии и ВСЭ СГАУ им. Н.И. Вавилова), а также 17 штаммов листерий полученных из Ульяновской сельскохозяйственной академии от профессора Васильева Д.А. в 2000 году. Набор полученных штаммов включал основные серовары: 1/2а, 1/2Ь, 1/2с.

Для серологического исследования (РА) применяли полученные нами моновалентные поликлональные листериозные сыворотки. Для иммунизации использовали 8 кроликов (самцов) в возрасте 2 месяцев, живой массой 2-2,5 кг.

Кролики №№1-2 были иммунизированы убитой 0,5 % раствором формалина взвесью L.monocytogenes ser. 1/2а; №№3-4 — L. monocytogenes ser. 1/2с; №№5-6 — ¿.monocytogenes ser. 4a; №№7-8 - L.monocytogenes ser. 4b. В результате были получены сыворотки к различным серовариантам с максимальными титрами 1:400- 1:6400.

Люминесцентную микроскопию проводили с иммуноглобулинами диагностическими листериозными не адсорбированными люминесцирующими сухими (производство Ставропольского НИ противочумного института). При определении чувствительности листерий к бактериофагам использовали набор сухих бактериофагов для идентификации листерий и постановки реакции нарастания титра фага (производство ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН).

Для изоляции листерий применяли следующие среды: эритрит- агар, ГРМ- агар, ГРМ- бульон, Oxoid бульон, Oxoid агар с селективными добавками.

Бактериологическое исследование пищевых продуктов проводили согласно:

1. «Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике листериоза животных и людей» (Москва, 1987).

2. «Методическим рекомендациям по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листерий» (Ульяновск, 1992).

3. Методическим рекомендациям (№11) комитета здравоохранения г. Москвы, «Листериоз», 2001.

4. Методическим указаниям «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» (Москва, 2002).

Вирулентность штаммов определяли в кератоконьюнкти-вальной пробе на морских свинках.

Изучение динамики размножения листерий осуществляли с образцами сыра мягких сортов и мясного фарша. С этой целью подвергали искусственной контаминации 1 г исследуемых продуктов свежеприготовленной взвесью листерий в дозе

1-103 и 1-104 КОЕ/мл. Затем образцы пищевых продуктов инкубировали при температуре: +4 °С и +20 °С. Ежедневно производили высевы по следующей схеме: 1 г исследуемых продуктов растирали в ступке с физиологическим раствором (для мясного фарша дополнительно использовали стерильный стеклянный порошок в соотношении 1:50) и засевали в объеме 0,25 мл на чашки Петри с агаром, к которому добавляли 1 % р-

р теллурита калия. Посевы инкубировали при 26 °С; через 72 ч отмечали рост мелких колоний черного цвета; достоверность опыта контролировали постановкой РА на стекле и микроскопией. Каждый опыт проводили в пятикратной повторности.

Для проведения ПЦР была использована тест-система "Листериомоноампли-тест" производства ЗАО "НиармедикП-люс" с праймерами комплементарными фрагменту гена листе-риолизина hly-A, размер 174 п.н.. Этот раздел исследований был выполнен на базе лаборатории диагностики инфекционных болезней Российского НИ противочумного института «Микроб» (Зав. лабораторией проф. Куличенко А.Н., которому автор приносит свою благодарность).

При исследовании пищевых продуктов методом ПЦР предварительно проводили холодовое обогащение образцов.

Молоко или мясной экстракт засевали на питательный бульон Oxoid с селективной добавкой для культивирования листерий

в соотношении 1: 9 и инкубировали при +4°С.

Перед проведением исследований ставили контроль чувствительности и специфичности ПЦР.

Методом ПЦР было исследовано 54 образца мясных продуктов с параллельным проведением бактериологического исследования.

ПЦР ставили согласно прилагаемой инструкции по применению тест-системы для определения ДНК L. monocytogenes.

Сравнительное исследование свойств различных видов листерий

Изучение других видов листерий, помимо L. monocytogenes, имеет очень важное практическое значение, поскольку они мало известны практическим ветеринарным работникам, в связи, с чем нами были изучены эталонные штаммы и описаны их свойства.

Были изучены 17 штаммов Listeria:L. monocytogenes серо-вары 1/2а, l/2b, 1/2с, 3b, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е, 7; L. ivanovii серовар 5; L.murray; L. innocua серовары 6а и 6b; L. grayi.

При посеве уколом на ПЖА дают рост вдоль укола, т.е. обладают активной подвижностью, кроме L. ivanovii ser.5. Разлагали с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу; лактозу за исключением L. ivanovii ser.5; сахарозу ферментировали все штаммы кроме L. ivanovii ser.5, L.grayi, L. murray; не разлагали маннит все штаммы за исключением L.grayi, L. murray. Все изученные культуры были каталазоположитель-ными. Гемолитической активностью обладали все штаммы за исключением L. murray, L. innocua ser. 6а и 6b. При определении чувствительности листерий к бактериофагам установлено, что листериозные бактериофаги L2A и L4A не лизировали культуры L. murray, L. grayi. Лизис был отмечен только с бактериофагом L4A и культурами L. monocytogenes, L. ivanovii

ser.5, L. innocua ser. 6a и 6b; с бактериофагом L2A лизиса не было отмечено.

Таким образом, главными отличиями L. monocytogenes от других представителей рода Listeria были следующие: L. murray, L. grayi разлагали с образованием кислоты без газа маннит, но не ферментировали сахарозу. L. murray, L. innocua ser. 6а и 6b не обладали гемолитической активностью.

При определении чувствительности листерий к бактериофагам установлено, что листериозные бактериофаги L2A и L4A не лизировали культуры L. murray, L. grayi. Лизис был отмечен только L. innocua ser. 6а и 6b с бактериофагом L4A.

Обследование молочно-товарных ферм Саратовской области

Было исследовано 211 проб молока из следующих хозяйств Саратовской области: Агрофирма «Волга» Марксовско-го района- 40 проб, с.-х. Чапаево хоз-ва «Ново-Захаркино» Петровского р-на - 40 образцов, хозяйств ПТФ "Елшанская" с. Сторожовка - 80 проб и ГСП «Кологривовское» Татищевского района - 51 образец.

В результате было изолировано 9 штаммов Listeria monocytogenes серовара 1/2а и один штамм серовара 1/2с, что составило 4,73%. Из которых 9 культур было выделено из хозяйств ПТФ "Елшанская" с. Сторожовка и ГСП «Кологривовское» Татищевского района.

Предпосылкой к исследованию молока в хозяйстве Ел-шанской ПТФ с. Сторожовка Татищевского района явилось выделение культуры L. monocytogenes из мозга павшей коровы. В ходе дальнейшего исследования листерии довольно часто удавалось выделять из молока коров в этом хозяйстве. Так, было изолировано 5 штаммов Listeria monocytogenes. В результате серотипирования установлено, что штаммы 16 (1), 31, 32(3), 40 и 169 относятся к серотипу 1/2а, а штамм 25 к серо-типу 1/2с. Все штаммы были каталазоактивными, за исключением штамма 32(3). Штаммы 16(1), 32(3), 40 и 169 обладали

гемолитической активностью. После окраски мазков люми-несцирующей листериозной сывороткой отмечали специфическое свечение с оценкой три и четыре креста.

Затем было проведено исследование молока, полученного от коров ГСП "Кологривовское" Татищевского района Саратовской области, стабильно неблагополучного по листериозу.

Ранее в этом хозяйстве были зафиксированы случаи заболевания свиней листериозом, характеризовавшиеся сверхострым течением и высокой летальностью. В момент проведения исследований среди коров регистрировались случаи абортов, эндометритов и маститов.

Пробы молока были отобраны у 51 коровы, как у клинически здоровых животных, так и у животных с различными проявлениями болезни.

Из 40 проб молока после холодового обогащения было выделено 3 штамма L. monocytogenes, что составило 7,5 % случаев. Все штаммы отнесены к серовару 1/2а. Штамм №1 выделен от коровы с диагнозом "эндометрит", №9 - от коровы с геморрагическим маститом и №40 - от клинически здорового животного.

Все штаммы были каталазоположительными и обладали активной подвижностью при 26°С . При проведении люминесцентной микроскопии после обработки мазков люминесци-рующей листериозной сывороткой отмечали специфическое свечение интенсивностью на четыре креста. При изучении гемолитической активности более значительная зона гемолиза была отмечена у штамма №40, слабый гемолиз давали штаммы №1 и №9.

Отмечена однородность свойств выделенных изолятов из мяса свиней и молока коров, что дает основания предполагать о наличии стационарного очага инфекции в этом хозяйстве.

Этому способствует постоянная циркуляция листерий в хозяйстве. Молоко от больных коров и здоровых носителей в качестве обрата скармливается поросятам без предварительного кипячения или пастеризации. Среди молодняка свиней отмечалась высокая летальность, трупы поросят скармливались

собакам, птицы также способствовали распространению этой инфекции, при этом круг инфицированных животных постоянно расширялся.

Изучение эпизоотической обстановки и выяснение причин многочисленных случаев падежа позволяют предположить наличие стойких и длительных очагов листериоза среди сельскохозяйственных животных в ГСП «Кологривовское» Тати-щевского района.

При исследовании молока коров из с.-х. Чапаево хоз-ва «Ново-Захаркино» Петровского р-на была выделена одна культура L. monocytogenes ser. 1/2а (штамм №5763).

Таким образом, нам удалось показать, что из молока коров Татшцевского и Петровского районов Саратовской области изолируются штаммы L. monocytogenes эпидемически значимого серовара 1/2а, т.е. это молоко представляет опасность.

Наши данные подтверждают исследования ряда авторов о важной роли молока как фактора передачи листериозной инфекции (Бакулов, Васильев, 1991; Bemrah et al., 1998).

Исследование мяса, фарша мясного, отобранных

из хозяйств, с рынков и магазинов г. Саратова

Всего было исследовано 54 пробы мяса, полученных как из хозяйств области, так и из магазинов и рынков города Саратова. Было выделено восемь штаммов листерий, что составило 14,28 %.

При исследовании 18 проб свинины, полученных из ГСП "Кологривовское" Татищевского района Саратовской области было выделено 4 штамма/,, monocytogenes (№/№ 5,6,15,16).

Проведены исследования 22 проб свинины и говядины, 14 образцов мясного фарша, изъятых из объектов розничной торговли г. Саратова. Изолирован один штамм L.monocytogenes -26 из мяса, поступившего для проведения ветсанэкспертизы на один из рынков города из СХ ПК «Сысоевский» Алтайского района и 3 штамма из фарша - 22, 25, 31.

Все выделенные из мяса культуры были отнесены к серо-вару 1/2а. Обладали каталазной активностью и подвижностью при посеве уколом на ПЖА давали равномерный рост. Все культуры обладали Р-гемолитической активностью, в большей степени штамм- 15. Два изолята оказались вирулентными в кератоконьюнктивальной пробе на морских свинках. Штамм №31 выделен из мясного фарша, изъятого в одном из магазинов города; №15 был изолирован из мяса свинины в ГСП «Ко-логривовское» Татищевского района.

На основании полученных данных можно заключить, что мясо и мясные продукты из хозяйств Саратовской области поступающие в розничную торговлю нередко были контамини-рованы листериями и могли являться вероятными причинами пищевого листериоза. Это подтверждается в частности тем, что все изолированные штаммы L.monocytogenes относились к эпидемиологически значимому серовару 1/2а, а некоторые оказались вирулентными.

Изучение динамики размножения листерий в различных пищевых продуктах

Сыры

Использовали сыры мягких сортов: «Альметге» с живой культурой йогурта и «Дуо». Сыр «Альметте» обсеменяли L.

monocytogenes ser. 1/2а в дозе ЫО3 КОЕ/мл. Размножения листерий в продукте не наблюдалось, и к 7 суткам инкубации происходило полное отмирание листерий в продукте возможно из-за антагонистического воздействия молочнокислых микроорганизмов йогурта.

Сыр «Дуо» контаминировали культурой листерий в дозе 1 • Ю4К0Е/мл. В первые сутки отмечали нарастание количества колоний листерий и наибольшее их количество наблюдали на 4-5 день как при +4 °С так и при +20 °С. Далее наблюдали процесс постепенного отмирания клеток листерий, который заканчивался на 12 день при выдержке исследуемых образцов при +20 °С и на 17 день при культивировании при +4 °С (рис. 1).

Время, сутки

Рис. 1. Динамика размножения лисгерий в сыре "Дуо"

Примечание:

▼ — ▼ Сыр «Дуо» + 4 0 С

♦—♦—♦ Сыр «Дуо» +20 0 С

Мясной фарш

Мясной фарш обсеменяли взвесью L. monocytogenes serl/2 а в дозе 1-104 КОЕ/мл. В первые дни происходило интенсивное размножение листерий. Наибольшей концентрации листе-рии достигали при культивировании +4 °С и +20 °С на 4 день. Полное отмирание листерий в продукте происходило на 10 день при культивировании при +20 °С и на 17 день +4 °С (рис. 2).

Анализируя данные, полученные при изучении динамики размножения листерий в пищевых продуктах можно заключить, что мясной фарш является наиболее благоприятной средой, в которой происходит интенсивное размножение листерий, особенно при температуре холодильника, что объясняется психрофильностью этих микроорганизмов.

Ранее вспышки листериоза связывали в основном с употреблением молочных продуктов, однако в настоящее время доказано, что мясные продукты играют весьма существенную роль в передаче листериозной инфекции.

Примечание:

▼—•»—▼ Мясной фарш I + 4 0 С

♦—♦—♦Мясной фарш г +20 0 С

Исследование пищевых продуктов методом ПЦР

Методом ПЦР было исследовано 54 пробы мяса и мясного фарша. Из 18 проб свинины из ГСП "Кологривовское" Тати-щевского района было получено 7 положительных результатов (№№ 4, 5, 6, 9, 13, 15, 16). При исследовании 22 проб свинины и говядины и 14 образцов мясного фарша, изъятых из объектов розничной торговли г. Саратова, выявлено 8 положительных образцов. Семь из которых (№№ 18, 19, 22, 25, 27,

31, 40) изолировано из мясного фарша и один (№26) из мяса говядины поступившего для проведения ветсанэкспертизы на один из рынков города из СХ ПК «Сысоевский» Алтайского района.

Всего с помощью ПЦР удалось выявить 15 положительных результатов (27,77%) с совпадением результатов с бактериологическим исследованием во всех случаях (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность ПЦР и бактериологического метода при индикации листерий в продуктах

№№ проб Метод исследования №№ проб Метод исследования

Бактериологический ПЦР Бактериологический ПЦР

1 - - 28 - -

2 - - 29 - -

3 - - 30 - -

4 - + 31 + +

5 + + 32 - -

6 + + 33 - -

7 - - 34 - -

8 - - 35 - -

9 - + 36 - -

10 - - 37 - -

11 - - 38 - -

12 - - 39 - -

13 - + 40 - +

14 - - 41 - -

15 + + 42 - -

16 + + 43 - -

17 - - 44 - -

18 - + 45 - -

19 - + 46 - -

20 - - 47 - -

21 - - 48 - -

22 + + 49 - -

23 - - 50 - -

24 - - 51 - -

25 + + 52 - -

26 + + 53 - -

27 - + 54 - -

Примечание: + положительный результат; - отрицательный результат

Чувствительность ПЦР превышает бактериологический метод почти в два раза. Неоспоримыми преимуществами ПЦР также являются высокая производительность (возможность параллельного анализа большого количества образцов) и строгая специфичность. Немаловажное значение имеет продолжительность ПЦР - анализа - не более одного рабочего дня.

Все вышеперечисленные характеристики позволяют рекомендовать ПЦР для экспресс-анализа в практических лабораториях, что весьма актуально при исследовании пищевых продуктов.

Наши результаты о большой ценности метода ПЦР для индикации листерий в животноводческой продукции подтверждают данные многих исследователей Strom, 1997; Wang, Hong, 1998 и др.

Заключение

Основанием для нашей работы послужили многочисленные литературные сведения о важной роли пищевых продуктов в передаче листериозной инфекции. А также работа JI.B. Савельевой (1999), в которой было показано то, что L. monocytogenes постоянно обнаруживается в образцах рыночного молока г. Саратова. Известно что, эпидемиологическая и эпизо-отологическая ситуации по листериозу в Саратовской области неблагоприятны.

Всего исследовано 211 проб молока, полученных с четырех молочнотоварных ферм области, и изолировано 9 штаммов Listeria monocytogenes ser.l/2a (4,26%), один штамм ser.l/2c (0,47%), обладавших типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Отмечено, что причиной большинства «молочных вспышек» листериоза у людей являются штаммы Listeria monocytogenes серовара 1/2а, выделенные как от животных так из товарного молока. Это согласуется с данными наших исследований (da-Silva et al., 1998).

Можно утверждать, что выделенные нами на территории Саратовской области «молочные штаммы» L. monocytogenes

относились к эпидемиологически значимому серовару и, следовательно, это молоко представляет опасность.

Показано, что в хозяйстве «Кологривовское» Татищевско-го района листерии часто выделяются с молоком от коров не только с различными заболеваниями (эндометриты, маститы), но и от клинически здоровых животных.

Не менее важные результаты были получены при исследовании мяса и мясопродуктов из хозяйств и объектов розничной торговли г. Саратова. Всего было исследовано 54 образца мяса и мясопродуктов и изолировано 8 культур L. monocytogenes, что составило 14,81%. Культуры выделенные из мяса были получены из Татищевского и Алтайского районов.

Все они также относились к эпидемиологически и эпизо-отологически значимому серовару 1/2а и, что особенно важно, - два штамма оказались вирулентными при кератоконьюнкти-вальной пробе на морских свинках.

Это штамм 15, изолированный из свинины ГСП «Кологривовское», штамм 31 - из мясного фарша, изъятого на одном из объектов розничной торговли г. Саратова.

Наши сведения о роли мяса как одного из важных факторов передачи листериоза полностью подтверждаются данными литературы: Jacquet et al., 1995; Fantelli, Stephan, 2001.

Поскольку бактериологический метод обнаружения листе-рий в продуктах питания весьма трудоемок, а при использовании холодового обогащения - весьма продолжителен, было целесообразным применить для этой цели - ПЦР. Всего было исследовано 54 образца мяса и мясопродуктов: 18 проб свинины из ГСП «Кологривовское», 22 пробы свинины и говядины и 14 образцов мясного фарша из объектов розничной торговли г. Саратова. Параллельно образцы мяса исследовались бактериологически.

В ПЦР было выявлено 27,77 % положительных результатов, бактериологически - 14,81%. Все пробы, подтвержденные бактериологическим методом, оказались положительными в ПЦР.

Важно подчеркнуть, что ПЦР в 7,4 % была положительной с образцами мяса и мясопродуктов из объектов розничной торговли, то есть с мясом, прошедшим предварительную вет-санэкспертизу общепринятыми методами.

Это позволяет нам заключить, что ПЦР особенно ценна для быстрой экспертизы мяса на L. monocytogenes в соответствии с последними требованиями (дополнение № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96).

Полученные нами результаты заставляют присоединиться к мнению И.Л. Обухова и К.Н. Груздева (1995) о большой ценности ПЦР для экспресс-анализа продуктов на наличие листерий.

Изучение свойств других видов листерий имеет большое значение для практических ветеринарных и медицинских работников, поскольку наряду с L. monocytogenes другие виды листерий довольно часто изолируют из пищевых продуктов, но не все из них являются патогенными для человека и животных.

Представленные материалы дают основание рекомендовать следующую схему исследования пищевых продуктов на листерии.

Взятие материала Ф Холодовое обогащение + Бактериологическое исследование ^Постановка ПЦР ФЛюминисцентная микроскопия

Выводы

1. Изучены свойства 17 штаммов листерий (L. monocytogenes сероваров 1/2а, l/2b, 1/2с, 3b, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е, 7; L. ivanovii серовара 5; L .murray; L. innocua сероваров 6а и 6Ь; L. gray);,из которых патогенными являются только два: L. monocytogenes - для человека и животных, a L. ivanovii - для животных.

Непатогенные листерии отличаются от L. monocytogenes некоторыми нижеперечисленными свойствами.

- L. murray, L. grayi разлагают с образованием кислоты без газа маннит, но не ферментируют сахарозу.

- Штаммы L. murray, L. innocua ser. 6а и 6b не обладают гемолитической активностью.

При определении чувствительности листерий к бактериофагам установлено, что листериозные бактериофаги L2A и L4A не лизировали культуры L. murray, L. grayi. Лизис был отмечен только у L. innocua ser. 6а yi 6b с бактериофагом L4A.

2. При обследовании 211 проб молока из следующих хозяйств Саратовской области было изолировано 9 штаммов L. monocytogenes (3,79 %) и один штамм был выделен из мозга павшей коровы. По результатам серотипирования 9 культур было отнесено к серовару 1/2а и одна - к серовару 1/2с. Все изоляты обладали типичными морфологическими, культу-ральными и биохимическими свойствами.

3. При исследовании 54 образцов мяса и мясопродуктов: 18 проб свинины, полученных из ГСП "Кологривовское" Та-тищевского района; 22 пробы свинины и говядины и 14 проб мясного фарша, изъятых из объектов розничной торговли города Саратова было выделено 8 штаммов L.monocytogenes се-ровара 1/2а (14,81 %), часть из которых (3,7 %) оказались вирулентными.

4. Показано, что в некоторых сырах мягких сортов в течение первых 4-5 суток происходит интенсивное размножение и накопление листерий, особенно при 4°С. В мясном фарше максимальное количество листерий также обнаруживается на 4 сутки при 4°С.

5. ПЦР является высокоспецифичным методом индикации L. monocytogenes и превосходит по чувствительности бактериологический анализ почти в два раза, поэтому может быть рекомендован для исследования пищевых продуктов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ларионова О.С., Зыкин Л.Ф. Эпидемиологическая значимость и основные свойства некоторых штаммов рода Listeria И Сб. эколого-медицинского науч.-практ. общества. Саратов: Изд-во "С. Казнова", 2001. -Вып. 3. - С. 7-8.

2. Ларионова О.С., Зыкин Л.Ф., Савельева Л.В. Роль некоторых видов листерий в патологии сельскохозяйственных животных и человека // Матер, научн.-практ. конф. ИВМиБ. - Саратов, 2001. - Вып. 2. - С. 67-69.

3. Ларионова О.С., Зыкин Л.Ф. Выделение листерий из молока // Вопр. ветер, и ветер, биол.: Сб. науч. тр.- Моск. Гос. акад. вет. мед. и биотехн. им. К.И. Скрябина. - Москва, 2001. - Вып. 2. - С. 15-16.

4. Ларионова О.С., Зыкин Л.Ф., Тыртышный К.Н. Изучение штаммов Listeria monocytogenes, изолированных из молока коров в Саратовской области // Сб.: Иммунологические, технологические, экономические факторы повышения производства продукции сельского хозяйства. - Уфа: БГАУ, 2002.-С. 176-180.

5. Ларионова О.С., Зыкин Л.Ф., Ивашенцева Л.М. Индикация листерий в продуктах животноводства методом ПЦР // Практик. - 2003. - №7-8. - С. 14-16.

6. Ларионова О.С., Ивашенцева Л.М. Применение ПЦР для индикации L. monocytogenes в пищевых продуктах // Труды международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооан-тропонозов». - Покров, 2003. Ч. 1. - С. 282-286.

Подписано в печать 8.10 03. Формат 60x84'/и Пен. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 534/572. Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова». 410600, Саратов, Театральная пл., 1.

2-соз -А

15758 :

Р 1 5 7 5 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ларионова, Ольга Сергеевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные свойства бактерий рода Listeria.

1.2. Пищевые продукты, как факторы передачи листериозной инфекции.

1.2.1. Овощи.

1.2.2. Рыба и морепродукты.

1.2.3. Мясо и мясопродукты.

1.2.4. Молоко и молокопродукты.

1.3. Корма, как основной источник заражения животных листериозом.

1.4. Методы индикации листерий в пищевых продуктах.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Штаммы. Сыворотки.

2.1.2. Среды.

2.1.3. Бактериофаги. Определение вирулентности.

2.1.4. Пищевые продукты.

2.1.5. Техника обработки патологического материала.

2.1.6. Получение листериозных сывороток для типирования листерий, выделенных из пищевых продуктов.

2.2. Сравнительное исследование свойств различных видов листерий.

2.3. Исследование продуктов животноводства на наличие листерий.

2.3.1. Молоко с молочно-товарных ферм Саратовской области.

2.3.2. Мясо, фарш мясной, отобранные из хозяйств, с рынков и магазинов г. Саратова.

2.4. Изучение динамики размножения листерий в различных пищевых продуктах.

2.4.1. Сыры.

2.4.2. Мясной фарш.

2.5. ПНР - экспресс метод для индикации листерий в пищевых продуктах.

2.5.1. Методика применения ПЦР для исследования пищевых продуктов.

2.5.2. Результаты исследования пищевых продуктов методом ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль молока и мяса в передаче листериозной инфекции"

Актуальность работы

До 1960 года листериоз рассматривался в основном как ветеринарная проблема. Однако с 60 гг. постепенно стало ясно, что листериоз встречается гораздо чаще, чем было принято считать. Люди заражаются не только при уходе за больными животными, но и алиментарным путём, а сама инфекция должна рассматриваться не как зооноз, а как 'зооантропоноз или пищевой зооноз. В последнее время её трактуют как сапроноз. С 1960 по 1982 годы только в медицинской литературе было описано более чем 10000 случаев листериоза, и тысячи публикаций ежегодно свидетельствуют об актуальности данной проблемы (Rocourt, Jacquet, Reilly, 2000).

Листериоз - антропозооноз, характеризующийся полиморфизмом клинических проявлений, однако чаще всего он протекает с признаками поражения центральной нервной системы, органов размножения, септицемии, а также в форме бессимптомного носительства.

По данным Международной классификации болезней 10 пересмотра, принятой 43 Всемирной Ассамблеей Здравоохранения в рубрику A32 "Листериоз" была включена подрубрика "Листериозная пищевая инфекция" с доминированием алиментарного механизма заражения (Intern, statist, classif., 1992).

Следовательно, и роль листерий в инфекционной патологии человека претерпела значительные изменения. Во-первых, этому способствовал прогресс в области лабораторной и клинической диагностики, а во-вторых -антропогенная трансформация окружающей среды, влияющая на условия репродукции возбудителя, пути передачи инфекции и на восприимчивость различных групп риска, прежде всего связанных с различными видами иммунодефицитов (Опочинский и др., 1999).

Сегодня листериоз - это одна из важнейших пищевых инфекций, которая зарегистрирована в 82 странах мира, в том числе и в России. Ежегодно •позоареал листериоза охватывает до 40 стран в мире, причём в Европе в среднем 20 стран, в Азии - 6, Австралии и Океании - 3, Северной Америке — 6, Южной Америке - 3, в Африке - 4 страны (Книзе, Бузун, Шарма, 1999).

Важным аспектом в рассматриваемой проблеме является разнообразие клинических проявлений данной инфекции, а также высокая летальность при ней. Листериоз является болезнью с высоким процентом гибели — до 62% .

У животных листериоз характеризуется энцефалитами, абортами, маститами, септицемией.

Листериоз у людей проявляется в следующих клинических формах: аборты и мертворождения у беременных женщин; септицемия и менингоэнцефалиты у новорождённых детей; глазо - железистая и ангинозно -железистая формы у подростков; листериозный сепсис у новорождённых; ангины; менингоэнцефалиты, урогенитальная патология у взрослых.

Доминирующим проявлением инфекционного состояния при листериозе является здоровое носительство (Котляров и др., 1999). Бессимптомное кишечное носительство листерий установлено по разным источникам у животных и людей в 5-60 % случаев (Бакулов, 1993). Стресс, угнетение иммунного статуса или другие неблагоприятные факторы способствуют манифестации инфекции различными клиническими признаками (Котляров, 1999).

Одним из основных принципов профилактики листериоза у людей и животных является постоянный контроль качества продуктов питания и кормов. До недавнего времени в России не было нормативных законодательных актов, о необходимости бактериологического контроля пищевых продуктов на этот микроорганизм.

Утверждённое Минздравом России дополнение № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96 регламентирует уровень контаминации пищевых продуктов листериями, нормой считается отсутствие Listeria monocytogenes в 25 г различных пищевых продуктов. В Саратовской области до последнего времени пищевые продукты на L. monocytogenes не исследовались.

Предпосылкой к выполнению нашей работы было сообщение JI.B. Савельевой (Савельева, 1999), которая при исследовании рыночного молока в Саратове и Энгельсе обнаружила в 1,97% проб Listeria monocytogenes; в 0,98% листерии оказались вирулентными в коньюнктивальной пробе на морских свинках.

Цель диссертационной работы - выяснение роли молока и мяса в передаче листериозной инфекции на территории Саратовской области.

Задачи исследования:

1. Провести исследование молока и молочных продуктов в хозяйствах области и объектах розничной торговли г. Саратова на L. monocytogenes.

2. Провести исследование мяса и продуктов переработки мяса в хозяйствах области и магазинах г. Саратова на L. monocytogenes.

3. Применить ПЦР при исследовании молочных и мясных продуктов на наличие листерий.

Научная новизна

1. Доказано наличие L. monocytogenes в молоке коров из различных хозяйств Саратовской области в 4,26%.

2. Установлено присутствие L. monocytogenes в 14,28 % образцах мяса и мясопродуктов с рынков г. Саратова и ряда хозяйств области. Часть изолированных штаммов (3,57 %) были вирулентными.

3. Продемонстрирована высокая эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с бактериологическим методом при индикации L. monocytogenes в животноводческой продукции.

Практическая значимость

Показано, что мясо, мясные полуфабрикаты, молоко и молочные продукты из хозяйств и рынков Саратовской области, а также из сети розничной торговли довольно часто инфицированы листериями (4,26 - 27,77%), т.е. могут являться вероятными причинами листериозной инфекции.

В Татищевском районе выявлено хозяйство ГСП «Кологривовское», стойко неблагополучное по листериозу.

Изучены свойства других видов листерий (L. monocytogenes серовары 7, 1/2а, l/2b, 1/2с, 3b, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е; L. ivanovii серовар 5; L.murray; L. innocua серовары 6а и 6b; L. grayi).

Установлено, что сроки выживания L. monocytogenes в сырах мягких сортов и мясном фарше колеблются от 7 до 17 дней.

ПНР является высокоточным методом индикации листерий в молоке и мясе и может быть использована для быстрого обнаружения L. monocytogenes в этих продуктах.

Полученные результаты работы дают полное основание для углубленного изучения распространения листериоза у животных на территории Саратовской области, а также для налаживания контроля пищевых продуктов на наличие листерий согласно Утверждённому Минздравом России дополнению № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96.

По результатам исследований подготовлены «Методические рекомендации по применению полимеразной цепной реакции для индикации листерий в продуктах животноводства», утвержденные УМС ИВМиБ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 54 от 03.09.03).

Материалы диссертации нашли применение при чтении лекций и проведении практических занятий по теме листериоз на кафедре микробиологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Основные положения, выносимые на защипу

1. Показана значительная обсемененность L. monocytogenes животноводческой продукции из различных хозяйств и объектов розничной торговли Саратовской области.

2. В ГСП «Кологиривовское» Татищевского района выявлен стойкий очаг листериоза свиней и КРС, требующий санации.

3. Сроки выживаемости листерий в животноводческой продукции (сыры мягких сортов, мясной фарш) колеблются от 7 до 17 дней и зависят от вида продукта и температуры хранения.

4. ПЦР рекомендуется как экспресс метод для индикации L. monocytogenes в молоке и мясе.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на «Научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ по итогам научно-исследовательской работы за 2001-2002 гг., на Юбилейной научной конференции СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2003г., а' также на Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» Покров, 2003г.

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2001-2003 гг.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 6 работах. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Работа

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ларионова, Ольга Сергеевна

Выводы

1. Изучены свойства 16 штаммов листерий (Listeria monocytogenes сероваров 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, ЗЬ, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е, 7; L. ivanovii серовара 5; L .тиггау; L. innocua сероваров 6а и 6b; L. gray);,из которых патогенными являются только два: L. monocytogenes - для человека и животных, a L. ivanovii

- для животных.

Непатогенные листерии отличаются от L. monocytogenes некоторыми нижеперечисленными свойствами.

- L. murray, L. grayi разлагают с образованием кислоты без газа маннит, но не ферментируют сахарозу.

- Штаммы L. тиггау, L. innocua ser. 6а и 6Ь не обладают гемолитической активностью.

- При определении чувствительности листерий к бактериофагам установлено, что листериозные бактериофаги L2A и L4A не лизировали культуры штаммов L. тиггау, L. grayi. Лизис был отмечен только у L. innocua ser. 6а и 6Ь бактериофагом L4A.

2. При обследовании 211 проб молока из следующих хозяйств Саратовской области: Агрофирма «Волга» Марксовского района - 40 проб, с.-х. Чапаево хоз-ва «Ново-Захаркино» Петровского р-на - 40 проб, хозяйств ПТФ "Елшанская" с. Сторожовкаи - 80 проб и ГСП «Кологривовское» Татищевского района - 51 проба было изолировано 9 штаммов Listeria monocytogenes (4,26%) и один штамм был выделен из мозга павшей коровы. По результатам серотипирования 9 штаммов было отнесено к серовару 1/2а и один штамм к серовару 1/2с. Все изоляты обладали типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

3. При исследовании 54 образцов мяса и мясопродуктов: 18 проб свинины, полученных из ГСП "Кологривовское" Татищевского района; 22 пробы свинины и говядины и 14 проб мясного фарша, изъятых из объектов розничной торговли города Саратова, было выделено 8 штаммов L.monocytogenes ser. 1/2а (14,81 %) , часть из которых (3,7 %) оказались вирулентными.

4. Показано, что в сыре сорта «Альметте» с живыми культурами йогурта (L. bulgaricus, Str. thermophilus), массивного размножения листерий не происходит, возможно, из-за антагонистического воздействия молочнокислых микроорганизмов йогурта. Совершенно противоположные результаты были получены при исследовании аналогичных показателей в сыре мягкого сорта «Дуо» и мясном фарше. В этих продуктах было отмечено интенсивное размножение листерий, особенно при

4 °С и максимальное накопление микроорганизмов отмечали на 4-5 сутки.

5. ПЦР является высокоспецифичным методом индикации Listeria monocytogenes и превосходит по чувствительности бактериологический анализ почти в два раза, поэтому может быть рекомендован для исследования пищевых продуктов.

Заключение

В России учет заболеваемости листериозом проводится с 1956 года у животных и с 1992 года у людей.

По данным официальной статистики заболеваемость животных листериозом в России растёт с каждым годом. Например, за 1999 год в РФ выявлено 39 неблагополучных пунктов, а в 2000 году — 47 (Котляров, Бакулов, Макеева, 1999). На территории бывшего Советского Союза Россия занимала первое место по количеству неблагополучных по листериозу пунктов — 56,8%, заболевших - 64,58 % и павших - 65,77% от этой болезни животных. Летальность в среднем по всем видам животных - 33,15%, у овец этот показатель был выше и составил 45,21% (Бакулов, Васильев, 1992).

В настоящее время в России количество животных больных листериозом продолжает расти из года в год.

В Саратовской области согласно государственной статистической отчетности бактериологически исследовано на листериоз в 1989-93гг. 5282 овцы и выделено 87 культур, серологически в РСК за этот период исследовано 543285 овец и получено 1288 положительных результатов (Савельева, 1999). Более поздними данными по области мы не располагаем.

Не меньшую обеспокоенность вызывают участившиеся случаи заболевания листериозом людей. Эта инфекция регистрируется лишь в ограниченном числе субъектов Российской Федерации, что связано со сложностью клинической диагностики и недостаточным объемом лабораторных исследований. Лабораторную диагностику листериоза проводят центры Госсанэпиднадзора в 45-65% субъектах Российской Федерации (Опочинский, Малеев, Ермолаева, 2002). С каждым годом в Москве увеличивается количество больных листериозом людей. Так в 1996 году было зарегистрировано 12 случаев (10 из них у детей), а в 1999 году 23 случая (12 у детей) (Заикин, Малышев, 2001).

За 1997 год в перинатальном центре г. Энгельса Саратовской области при обследовании 125 новорожденных и 38 рожениц была выделена 31 подтвержденная культура L. monocytogenes (Савельева, 1999).

Лабораторией клинической вирусологии и микробиологии МУ клинической больницы №8 в Саратовском Заволжье при сплошном скрининге у взрослых людей здоровое носительство было отмечено в 18% случаев, у новорождённых листерии выделены из мекония в 22% (Гасанова, 2003).

Тенденция ежегодного роста заболеваемости может быть обусловлена, как широким распространением этой инфекции, так и увеличением объёма лабораторных исследований и всё же уровень регистрируемой заболеваемости значительно меньше истинного.

До 80 годов XX века листериоз рассматривали как профессиональную болезнь работников животноводства и мясопереработки, а также связывали его с контактом с инфицированными грызунами.

В настоящее время листериоз трактуется как пищевая инфекция с доминированием алиментарного механизма заражения. Наиболее частым фактором передачи этой инфекции по современным воззрениям являются продукты животноводства (молоко, мясо), рыба, растительные продукты.

Наряду с этим возбудитель листериоза можно обнаружить в разнообразных объектах окружающей среды: в почве, воде, сточной жидкости, гниющих овощах, в продуктах животного происхождения, а также у бессимптомных носителей: животных, птиц и человека. Листериоз типичный сапроноз, основным местом обитания возбудителя является почва, в которой количество бактерий этого вида может варьировать в зависимости от условий окружающей среды.

Согласно последним данным отечественных и зарубежных исследователей можно сделать вывод об исключительно широких адаптивных возможностях листерий, позволяющих им размножаться в сапрофитической среде в различных природных субстратах (почвенных, растительных, водных). Высокая метаболическая пластичность листерий обусловливает возможность перехода их от сапрофитической фазы к паразитической и наоборот. Эти обстоятельства, наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными животными, позволяют рассматривать листериоз как типичный сапрозооноз (Литвин, Емельяненко, Пушкарева, 1996; Бузолева и др., 1999; Тартаковский, Малеев, Ермолаева, 2002).

По последним данным большинство крупных эпидемических вспышек листериоза с высоким процентом летальных исходов обусловлено употреблением инфицированных пищевых продуктов.

В свете этих фактов весьма важным является изучение эпизоотологической обстановки по листериозу в Саратовской области и роли пищевых продуктов, преимущественно молочных и мясных в распространении листериозной инфекции.

Цель работы заключалась в выяснении роли молока и мяса в передаче листериозной инфекции на территории Саратовской области.

Предпосылкой послужила работа Л.В. Савельевой (1999), которая обнаружила L. monocytogenes в 1,97% проб молока с рынков и из хозяйств Саратовской области, причем часть штаммов оказались вирулентными.

Всего было исследовано 211 проб молока полученных с четырёх молочнотоварных ферм области и изолировано 9 штаммов Listeria monocytogenes серовара 1/2а и один штамм серовара 1/2с, обладавших типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами, что составило 4,73%.

При сопоставлении наших данных с литературными источниками выясняется, что в большинстве «молочных вспышек» листериоза от больных людей, животных, а также из молока были изолированы штаммы Listeria monocytogenes серовара l/2a (da-Silva, Hofer, Tibana, 1998).

Это позволяет утверждать, что изолированные нами на территории Саратовской области «молочные штаммы» L. monocytogenes относились к эпидемиологически значимому серовару и, следовательно, это молоко опасно.

У большинства коров, из молока которых были выделены культуры L. monocytogenes отмечались признаки клинического и субклинического мастита, а также аборты, эндометриты.

Такие случаи на фоне падежа свиней и КРС имели место в ГСП «Кологривовское» Татищевского района, что позволяет рассматривать это хозяйство как стойко неблагополучное по листериозу.

Листерии также были изолированы из молока коров хозяйства Елшанской ПТФ Татищевского района, из с.-х. «Чапаево» хозяйства «Ново-Захаркино» Петровского района.

Все эти находки требуют пристального внимания ветеринарной службы и углубленного обследования этих хозяйств.

Не менее важные результаты были получены при исследовании на листерии мяса и мясопродуктов из хозяйств и объектов розничной торговли г. Саратова. Всего было исследовано 54 образца мяса и мясопродуктов и изолировано 8 культур L. monocytogenes, что составило 14,81%. Культуры, изолированные из мяса, были получены из Татищевского и Алтайского районов.

Все они также относились к эпидемиологически и эпизоотологически значимому серовару 1/2а и, что особенно важно, - два штамма оказались вирулентными при кератоконьюнктивальной пробе на морских свинках. Штамм 15 изолирован из свинины ГСП «Кологривовское», о котором речь шла выше, а штамм 31- из мясного фарша, отобранного на одном из объектов розничной торговли г. Саратова.

Наши сведения о роли мяса как частого фактора передачи при листериозе полностью подтверждаются данными литературы: Jacquet et al., 1995; Fantelli,

Stephan, 2001.

Немаловажным обстоятельством в изучении эпизоотологии листериоза является психрофильная природа листерий. Нами была изучена динамика выживаемости листерий в сырах мягких сортов и мясном фарше при следующих температурных режимах - +4 °С и +20 °С.

В сыре мягкого сорта «Дуо» немецкого производства листерии активно размножались и максимальное их количество наблюдали на 4-5 день при +4 °С и на 4 день при +20 °С. Наиболее интенсивное размножение листерий было отмечено при +4 °С, что объясняется психрофильностью листерий. Этот факт также подтверждают многочисленные вспышки листериоза связанные с употреблением в пищу молочных продуктов, хранящихся в холодильниках.

Аналогичные результаты были получены при изучении динамики размножения листерий в мясном фарше. На 4 сутки инкубации при +4 °С количество листерий увеличивалось в 12 раз. Полное отмирание листерий в продукте происходило на 10 день при культивировании при +20 °С и на 17 день

4 °С. Таким образом, было показано что мясной фарш является благоприятной средой для размножения листерий и вероятным фактором передачи листериозной инфекции.

Поскольку бактериологический метод обнаружения листерий в продуктах питания весьма трудоемок, а при использовании холодового обогащения -весьма продолжителен, было решено применить новый метод индикации- ПЦР. Перед проведением исследований ставили контроль чувствительности и специфичности ПЦР. Чувствительность этого метода составила в молоке 1 • 104, а в физиологическом растворе 1 • 103 КОЕ/мл.

Для изучения специфичности использовали физиологический раствор и молоко, искусственно контаминированные L. grayi и L.innocua ser. 6а и 6b в концентрации 1 • 105-реакция была отрицательной во всех случаях.

Всего было исследовано 54 образца мяса и мясопродуктов: 18 проб свинины из ГСП «Кологривовское», 22 пробы свинины и говядины и 14 образцов мясного фарша из объектов розничной торговли г. Саратова. Параллельно образцы мяса исследовались бактериологически.

В ПЦР выявлено 27,77% положительных результатов, бактериологически -14,81%. Все пробы, подтвержденные бактериологическим методом, были положительными в ПЦР.

Важно подчеркнуть, что ПЦР в ряде случаев (7,4%) была положительной с образцами мяса и мясопродуктов из объектов розничной торговли, то есть с мясом, прошедшим предварительную ветсанэкспертизу общепринятыми методами.

Это позволяет нам заключить, что ПЦР особенно ценна для быстрой экспертизы мяса на L. monocytogenes в соответствии с последними требованиями (дополнение № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.56096).

Полученные нами результаты заставляют присоединиться к мнению И.Л. Обухова и К.Н. Груздева (1995) о большой ценности ПЦР для экспресс-анализа продуктов на наличие листерий.

Изучение свойств других видов листерий имеет большое значение для практических ветеринарных и медицинских работников, поскольку наряду с L. monocytogenes другие виды листерий довольно часто изолируют из пищевых продуктов, но не все из них являются патогенными для человека и животных.

Представленные материалы дают основание рекомендовать следующую схему исследования пищевых продуктов на листерии.

Взятие материала Холодовое обогащение Бактериологическое исследование ■►Постановка ПЦР 4Люм и ни сце нтиая микроскопия

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ларионова, Ольга Сергеевна, Саратов

1. Афанасьев Е.Н., Егшатян Т.И., Тюменцева И.С., Жарникова И.В. К вопросу люминесцентно-серологической идентификации возбудителей листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. Покров, 1999. -С. 90-91.

2. Бакулов И.А. Современное состояние учения о листериозе // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Научно-производственная конференция. -Покров, 1993. С. 5-8.

3. Бакулов И.А. Экология листерий в биологической системе почва растение - животное — человек // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Научно-производственная конференция. - Покров,1993. - С. 25-26.

4. Бакулов И.А. Основные вехи истории изучения листериоза животных и людей // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. -Покров, 1999. С. 43-47.

5. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция // Вопросы диагностики и профилактики. Ульяновск, 1991. - С. 7-54.

6. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Методические рекомендации по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листерий. -Ульяновск, 1992. С. 4-6.

7. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Пищевой листериоз новое проявление известной болезни // Вестник РАСХН, 1995. - С. 69-72.

8. Бакулов И.А., Котляров В.М. Листериоз животных в РФ за 35-летний период // Матер, науч. конф. ВНИИВВ и М., 1992. С. 40-43.

9. Бакулов И.А., Котляров В.М. Новая страница в изучении листериоза // Вестник РАСХН. 1999. - №1. - С. 14-15.

10. Бакулов И.А., Котляров В.М., Белоусов В.Е. К вопросу таксономии бактерий рода Listeria //Ветеринария. 1983. - №7. - С. 30-35.

11. Бакулов И.А., Котляров В.М., Душко Т.И. Листериоз пищевая инфекция,масштабы опасности, методы индикации и меры борьбы // Ветеринария. 1991. - №4. - С. 32-36.

12. Бакулов И.А., Котляров В.М., Шестипёрова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза// ЖМЭИ. 1994. -№ 5. - С. 101-105.

13. Беленева И.А., Быстрова А.Н. Выделение патогенной бактерии Listeria monocytogenes из гидробионтов залива Петра Великого Японского моря // Биол. моря. 1997. - №5. - С. 293-297.

14. Белоусова А.Р., Таршис М.Г. Русско-английский англо-русский ветеринарный словарь,- Москва, 2000. 238с.

15. Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Терехова В.Е., Сомов Г.П. Биохимические механизмы адаптации Listeria monocytogenes к факторам окружающей среды // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. -С. 91-93.

16. Васильев Д. А. Биологические свойства изолированных клеточных компонентов листерий // Автореферат Дисс. . докт. биол. наук. Покров. 1983. -44с.

17. Васильев Д.А. Анализ факторов способствующих распространению пищевого листериоза // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Сборник научных работ. Ульяновск, 1998. - С. 28-35.

18. Васильев Д.А. Методы, сокращающие сроки бактериологического контроля пищевых продуктов на наличие листерий // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Научно-производственная конференция. Покров, 1993. - С. 3334.

19. Васильев Д.А. Диагностика листериоза иммуноферментным методом // Краевая патология и терапия животных и птиц. Сб. науч. тр. - Барнаул, 1990.-С. 70-80.

20. Васильев Д.А. Разработка основных направлений в профилактике пищевого листериоза // Монография. — Ульяновск, 1996. — С. 17-19.

21. Васильев Д.А. Роль пищевых продуктов в распространении листериоза. Ветеринария // 1992. №4. - С. 46-48.

22. Васильев Д.А. Устойчивость листерий к физико-химическим факторам // Ветеринария. 1992.- №3. - С. 52.

23. Васильев Д.А. Экология листерий // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: Сб. науч. работ. — Ульяновск, 1990. С.48-51.

24. Васильев Д.А., Барышников П.И., Белоусов В.Е. О серологической диагностике листериоза: Литературный обзор // Ветеринария. 1988. - №10. -С. 64-65.

25. Васильев Д.А., Микишина Н.И. Листериоз как новая пищевая инфекция // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: Сб. науч. работ. Ульяновск, 1990. - С.52-59.

26. Гапьцева Г.В., Брудный Р.А., Невенчанная Л.В., Юничева Ю.В. Некоторые аспекты диагностики листериоза в Краснодарском крае // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. Покров, 1999. - С. 80-82.

27. Гальцева Г.В., Цепко И.Н., Маевский М.П., Костюковский В.М., Ус З.И., Корсунская С.А. Методические подходы к лабораторной диагностике листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. -Покров, 1999. С. 73-76.

28. Гершун В.И. Действие молочно-кислых бактерий силоса на листерии // Вестник с.-х. науки Казахстана. 1973. - №11. - С. 59-63.

29. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных// Алма-Ата, 1981.

30. Гершун В.И. Сравнительная оценка элективных сред для выделения листерий // Ветеринария. 1972. - №4. - С. 101-102.

31. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге //-94В сб.: Экология возбудителей сапронозов. Москва, 1988. - С. 80-85.

32. Гершун В.И., Туякова Р.К. Пути инфицирования молока листериями в Северном Казахстане // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. Покров, 1999. - С. 134-135.

33. Гуславский И.И., Павлова М.П. Оценка специфичности серологических реакций при листериозе // Вестник с.-х. науки Казахстана.- 1979.- №8.- С. 71-73.

34. Гуславский И.И. Эпизоотология листериоза в Алтайском крае// "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001. - С. 113-115.

35. Жак Лемиус, Оксана Мурзак, Котляров В.М., Колпикова Т.И., Грохалевич О.О., Раджеш Шарма. Экспресс-контроль продуктов для обнаружения листерий // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. Покров, 1999. -С. 71-73.

36. Заикин В.Л., Малышев Н.А. Лабораторная диагностика листериоза в медицинской и ветеринарной практике // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001. - С. 135-140.

37. Зыкин Л.Ф., Савельева Л.В., Касьян И.А. Современные методы лабораторной диагностики листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. Покров, 1999. - С. 78-80.

38. Калишин Н.М., Воробьев В.В., Лугин Г.Л., Велик В.В. Особенности течениялистериоза у крупного рогатого скота // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Науч.-произв. конф. Покров, 1993. - С. 22-23.

39. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова Н.С. Листерии в молоке и молочных продуктах. Москва-Углич, 1999. - 28с.

40. Карпова Л.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Очистка и характеристика листериолизина О Listeria monocytogenes II Микробиол. журн. 1994.-№4.-С. 3-7.

41. Карпова Т.И., Ермолаева С.А., Лопырев И.В., Бродинова Н.С., Тартаковский И.С., Васкез-Боланд Х.А. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes II Клин, микобиол. антимикроб, химиотер.- 2001. С.266-273.

42. Карпова Т.Н., Шустрова Н.М., Снегирёва А.Е., Шевелёва С.А., Куваева И.Б., Тартаковский И.С. Размножение листерий в молочных продуктах // Микробиол. журн. 2001. - №1. - С. 80-81.

43. Касюк В.И., Панин А.Н. Международная конференция «Листерии и безопасность продуктов питания» // Ветеринария. 1992. - №1. - С. 62-64.

44. Книзе А.В., Бузун А.И., Шарма Р.К. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Междунар. симп. Покров, 1999.-С. 118-123.

45. Кольпикова Т.Н., Бакулов И.А., Котляров В.М. Использование листериозных бактериофагов при диагностике и индикации листерий // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Междунар. симп. Покров, 1999. - С. 6467.

46. Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Шагова Т.С. Разработка комплекса сухих микробиологических питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001.-С. 147-149.

47. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. - С. 48-52.

48. Котляров В.М. Таксономические признаки листерий // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Науч.-произв. конф. Покров, 1993. - С. 2628.

49. Котляров В.М., Бакулов И.А. Листериоз нейроинфекция животных и людей // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2001.-С. 105-113.

50. Котляров В.М., Бакулов И.А., Макеева Л.В. Обнаружение комплементсвязывающих антител при листериозе // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. - С. 88-89.

51. Котляров В.М., Чевелева С.С. Люминесцентный метод в диагностике листериоза // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001.-С. 123-124.

52. Красовский В.В., Васильев Н.В., Деркач С.А., Похил С.И. Итоги пятилетнего изучения листериоза на Украине // Микробиол. журн. — 2000. -№3.-С. 80-85.

53. Красовский В.В., Надтока В. Л., Похил С.И. Листериозное бактерионосительство: метод санации // Микробиол. журн. 2000. - №3. - С.-9718-20.

54. Краткий определитель Берги / Под ред. Дж. Хоулта.: Мир, 1980. 496с.

55. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактика//Госагропром, МЗ СССР. Москва, 1987. - 67с.

56. Листериоз // Методические рекомендации (№11) комитета здравоохранения г. Москвы, 2001.- Юс.

57. Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты // Микробиол. журн. — 1996. № 2. - С. 101-104.

58. Минаева Н.Э., Ладный В.И. Микробиологические аспекты эпидемиологии листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер. Междунар. симп. -Покров, 1999.-С. 137-139.

59. Обухов И.Л., Груздев К.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи ПЦР И Сборник науч. трудов ВГНКИ. Москва, 1995. - Т.57. - С. 36-44.

60. Обухов И.Л., Панин А.Н. Применение полимеразной цепной реакции в ветеринарии // Журн. Аграрная Россия. 2002. - №2. - С. 62-64.

61. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Патол. физиол. эксперим. терапия. — 1960. -№4. С. 76-89.

62. Омарова С.М., Меджидов Ш.М. Питательные среды для выделения и накопления листерий // ЖМЭИ. 2000. - №1. - С. 45.

63. Опочинский Э.Ф. Анализ деятельности центров Госсанэпиднадзора Российской Федерации по лабораторной диагностике листериоза в 1991-2000 годах // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001.-С. 125-127.

64. Опочинский Э.Ф., Мохов Ю.В., Лукина З.А. К вопросу лабораторной диагностики листериоза // Матер. 8 съезда ВОЭМП. Москва, 2002. - С. 308309.

65. Опочинский Э.Ф., Мохов Ю.В., Лукина З.А., Ясинский А.А. Анализдеятельности центров Госсанэпиднадзора Российской Федерации по лабораторной диагностике листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Междунар. симп. Покров, 1999. - С. 61-64.

66. Опочинский Э.Ф., Сыскова Т.Г., Палей О.С., Лукина З.А. Состояние заболеваемости и лабораторной диагностики листериоза по данным статистической отчётности РФ // "Медико-ветеринарные аспекты листериоза": Науч.-произв. конф. Покров, 1993. - С. 13-14.

67. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах // Методические указания. — Москва: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. 31с.

68. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. Москва: ГЭОТАР Медицина, 1999.- 1183с.

69. Прозоровский С.В., Тартаковский И.С. Листерии в инфекционнойпатологии человека современная концепция // "Медико-ветеринарные |аспекты листериоза": Науч.-произв. конф. Покров, 1993. - С. 8-9. Iч '

70. Пушкарёва В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш j Е.В., Белякова Г.А. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с ! водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние // j Микробиоло. журн. 1997. - №3. - С. 3-6. |

71. Радчук Н.А. Возбудитель листериоза // В кн. Ветеринарная микробиология и иммунология. Москва, 1991, С. 202-203.

72. Радчук Н.А., Морозов Т.И., Лорутина В.В. О выделении листерий при эндометритах у коров // Сб. научн. трудов Лен. вет. ин-та. — 1990. С. 107-109.

73. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Степанова Н.В., Тимошков В.В., Салова Н.Я., Шестеперова Т.Н. Состояние эпиднадзора за листериозом в г. Москве // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. -С. 129-131.

74. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Тимошко В.В., Цвиль Л.А., Салова Н.Я., Голованова В.П., Шестипёрова Т.И. Состояние заболеваемости и мерыпрофилактике листериоза в г. Москве // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2001. - С. 117-120.

75. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов / Под ред. Бутко М.П., Костенко Ю.Г. Москва, 1994. -С. 31-35.

76. Савельева JI.B. Усовершенствование методов лабораторной диагностики листериоза// Автореферат Дисс. канд. биол. наук. Саратов. 1999. — 17с.

77. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. - №2. - С. 20-30.

78. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика //Медицина для всех. Москва, 2002. - 173с.

79. Фирсова Т.Е., Котляров В.М. Перспектива использования латексных диагностикумов при листериозе // "Нейроинфекции": Матер. Междунар. научн.- практ. конф. Покров, 2001. - С. 141-142.

80. Цыбанов С.Ж., Котляров В.М. Использование методов анализа генома для идентификации патогенных листерий // "Листериоз на-рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. - С. 83-84.

81. Чевелёв С.Ф., Бакулов И.А. Новое в патогенезе листериоза животных. -Актуальные проблемы патологоанатомической диагностики болезней животных. Л., 1982. - 207с.

82. Чевелёв С.Ф., Бакулов И.А., Котляров В.М. Патогенетическая сущность листериоза // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп.

83. Покров, 1999.- С. 116-118.

84. Чевелева Т.С., Цыбанова Л.Я., Котляров В.М., Цыбанов С.Ж. Генотипирование хромосомной ДНК различных штаммов листерий с помощью ПЦР // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999.-С. 84-86.

85. Шарма Р.К. Обнаружение листерий в продуктах морей и океанов // "Листериоз на рубеже тысячелетий": Матер, междунар. симп. Покров, 1999. -С. 97-99.

86. Ana Maria Cordano , Joselyne Rocourt. Occurrence of Listeria monocytogenes in food in Chile // Intern. J. Food Microbiol. 2001. - V. 70(1-2). - P. 175-178.

87. Anonymous Multistate outbreak of listeriosis-United States, 2000 // MMWR Morb. Mortal. Wkly-Rep. 2000. - V. 49(50). - P. 1129-30.

88. Bemrah N.; Sanaa M.; Cassin M. H., Griffiths M. W., Cerf O. Quantitative risk assessment of human listeriosis from consumption of soft cheese made from raw milk //Prev. Vet. Med. 1998.-V. 37(1-4).-P. 129-145.

89. Bille J. Epidemiology of human listeriosis in Europe, with special reference to the Swiss outbreak. In: A.J. Miller, J.L. Smith, and G.A. Somkuti (ed.) Foodborne listeriosis // Elsevier, New York. 1990. - P. 71-74.

90. Brackett R. et al. Appl. And Environ. Microbiol. 1990. № 5. - P. 56.

91. Bula C.J., Bille J., Glauser M. P. An epidemic of food-borne listeriosis in Western Switzerland: description of 57 cases involving adults // Clin. Infect. Dis. -1995.-P. 66-72.

92. Curtis G.D., Mitchell R., King A., Griffmg J. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes II Lett. Appl. and Environ. Microbiol. -1989.-P. 95-98.

93. De Buyser M.L., Dufour В., Maire M., Lafarge V. Implication of milk and milk products in food-bome diseases in France and in different countries // Int. J. Food Microbiol.-2001.-P. 1-17.

94. Gilot P., Hermans C., Yde M., Gigi J., Janssens M., Genicot A., Andre P., Wauters G. Sporadic case of listeriosis associated with the consumption of a Listeria monocytogenes contaminated 'Camembert' cheese // J. Infect. Dis. - 1997. — P. 195197.

95. Fantelli K., Stephan R. Prevalence and characteristics of Shigatoxin-producing Escherichia coli and Listeria monocytogenes strains isolated from minced meat in Switzerland // Int. J. Food Microbiol. 2001. - V. 70. - P. 63-69.

96. Farber J.M. Present situation in Canada regarding Listeria monocytogenes and ready-to-eat seafood products // Int. J. Food Microbiol. 2000. - V. 62(3). P. 247251.

97. Farber, J.M., Sanders G.W., Johnston M.A. A survey of various food for the presence of Listeria species И J. Food Prot. 1989. - V. 52. - P. 456-458.

98. Farber J.M., Warburton D.W., Gour L., Tittiger F. Surveillance raw-fermented (dry-cured) sausages for the presence of Listeria spp. 11 Can. Inst. Food Sci. Technol. J.- 1988.-V. 21.-P. 430-434.

99. Fuchs R.S., Surendran P.K. Incidence of Listeria in tropical fish and fishery products // Lett. Appl. and Environ. Microbiol. 1989. - V. 9. - P. 49-51.

100. Genigergious C.A., Oanca P., Dutulescu D. Prevalence of Listeria spp. In turkey meat at the supermarket and slaughterhouse // J. Food Prot. -1990. V. 53. - P. 282

101. Hayes P.S., Feeley J.C., Graves L.M., Ajello G.W., Fleming D.W. Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk // Appl. and Environ. Microbiol. 1986. -V. 51.-P. 438-440.

102. Ho J.L., Shands K.N., Friedland G., Eckind P. and Fraser D.W. An outbreak of type 4b Listeria monocytogenes infection involving patients from eight Boston hospitals // Arch. Intern. Med. 1986. - V. 146. -P. 520-524.

103. International statistics classification of diseases and related health problems. V. 1.- 10 revision.- WHO, Geneva, 1992.

104. ISO- standarts Microbiological examination for dairy purposes. Section 3.15. Detection of Listeria monocytogenes, 1993. P. 1-7.

105. James C. California. Morb. Mortal. Week. Rep. 1985. - V. 34.

106. Jensen A., Frederiksen W., Gerner-Smidt P. Risk factors for listeriosis in Denmark 1989-1990 // Scand. J. Infect. Dis. 1994. -V. 26(2). - P. 171-178.

107. Klapwijk P.M., Jouve J.L., Stringer M.F. Microbiological risk assessment in Europe: the next decade // International Journal of Food Microbiology. 1985. -V. 58 (3). - P. 223-230.

108. Loncarevic S. Listeria monocytogenes with Special Reference to Food Products and Human Listeriosis // Veterinaria. 1998. - V. 31. - P. 10-25.

109. Loncarevic S., Danielsson-Tham M.L., Martensson L., Ringner A., Runehagen A., Tham W. A case of foodborne listeriosis in Sweden // Lett, and Appl. Microbiol. 1997.-V. 24(1). -P. 65-68.

110. Lovett J., Wesley I.V., Vandermaaten M.J., Bradshaw J.G., Francis D.W., Grawford R.G., Donelly C.W., Messer. J.W. High-temperature short-time pasteurization inactivates Listeria monocytogenes // J. Food Protect. 1990. - V. 53. - P. 734-738.

111. Lowry, P.D., Tiong, I.- The incidence of Listeria monocytogenes in meat and meat products factors affecting distribution // Proc. 34th Int.Cong. Meat Sci. and Technol., Part B. - Australia, 1988. P. 528-530.

112. Manzano M., Cocolinb L., Cantoni C., Comi G. detection and identification of L. monocytogenes in food by PCR and oligonucleotide-specific capture plate hybridization // Food Microbiol. 1998. - № 6. - P. 651-657.

113. Nicolas J.A., Vadoud N. Investigations on the presence of Listeria in food of animal origin destines for human consumption // Rec. med. vet. 1987/ - Vol. 163. -№2.-P. 283-285.

114. Pinner R.W., Schuchat A., Swaminathan В., Hayes P.S., Deaver K.A., Weaver R.E., Plikaytis B.D., Reeves M., Broome С. V., Wenger J.D. Role of foods in sporadic listeriosis // JAMA. 1992. - V. 267 (15). - P. 2046-2050.

115. Ralovich В., Domjan-Kovacs H. Occurrence of Listeria and listeriosis in Hungary // Acta Vet. Hung. 1996. - V. 44(3). - P. 277-285.

116. Rudol M., Scherer S. High incidence of Listeria monocytogenes in European red smear cheese // Int. J. Food Microbiol. 2001. - V. 63(1-2). - P. 91-98.

117. Seaston C.V. Pathogenic organisms of the genus Listerella I I J. exp. Med., 1937.

118. Seeliger H.P. Listeria and Law in "Listeria 1992 // IZOPOZ XI". Copenhagen 1992. P. 1-6.

119. Seeliger H.P.R. Listeriosis History and Actual Development // Infection. 1988. -V. 16.-P. 80-84.

120. Seeliger H.P.R., Finger V. Analitical serology of Listeria I I In "Analitical serology of microorganisms". New-York, 1969. - P. 549-608.

121. Srivastava N.C, Gypta S.K., Uppal P.K. Listeria monocytogenes infection in infertile cows // Indian. Veter. J., 1985. P. 11-16.

122. Rocourt, J., Brosch, R., 1992. Human listeriosis, 1990. WHO/HPP/FOS/92.3, World Health Organization, Geneva, Switzerland.

123. Rocourt, J., Jacquet, Ch., Bille, J., 1997. Human listeriosis, 1991/1992. WHO/FNU/FOS/97.1, World Health Organization, Geneva, Switzerland.

124. Rocourt J., Jacquet C., Reilly A. Epidemiology of human listeriosis and seafoods // Intern. J. Food Microbiol. 2000. - 62 (3). - P. 197-209.

125. Rouquette C., Berche P. The pathogenesis of infection by Listeria monocytogenes II Microbiologia. 1996. V. 12(2). - P. 245-258.

126. Rudol M., Scherer S. High incidence of Listeria monocytogenes in European red smear cheese // Int. J. Food Microbiol. 2001. - V. 63(1-2). P. 91-98.

127. Tauxe R.V. Emerging foodborne pathogens // Intern. J. Food Microbiol. 2002. -V. 78(1-2).-P. 31-41.

128. Tratt D.I., Robertson I.D., Hampson D.I. Genetic characterization of isolates of Listeria monocytogenes from man, animals and food // J. Med. Microbiol. 1993. -V.38.-P. 122-128.

129. Vazquez-Salinas Carlos, Rodas-Suarez Oscar, Quinones-Ramirez Elsa Irma. Occurrence of Listeria species in raw milk in farms on the outskirts of Mexico city // Food Microbiol.-2000.-P. 177-181.

130. Wimpfheimer L., Altman N.S., Hotchkiss J.H. Growth of Listeria monocytogenes and competitive spoilage organisms in raw chicken packaged under modified atmosphere and in air // Int. J. Food Microbiol. 1990. - V. 11. - P. 205214.