Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria Monocytogenes

Ермолаева, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria Monocytogenes
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria Monocytogenes"

На правах рукописи

Ермолаева Светлана Александровна

РОЛЬ СИСТЕМНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ В ВИ РУЛ ЕНТНОСТИ LISTERIA MONOCYTOGENES

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

03.00.07 - микробиология 03.00.15-генетика

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научные консультанты: доктор биологических наук,

проф. И.С. Тартаковский доктор биологических наук Ю.М. Романова

Официальные оппоненты:

академик РАМН, член-корр. РАН, д.м.н., проф. О.В. Бухарин академик РАМН, д.б.н., проф. В.В.Зверев член-корр. РАМН, д.б.н., проф. Г.Б. Смирнов

Ведущая организация: ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится "_" октября 2004 г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.007.01 при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул. Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан "_" сентября 2004 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Е.В. Русакова

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Среди бактерий, способных к внутриклеточной пролиферации, особняком стоит группа факультативных внутриклеточных паразитов, эффективно размножающихся как внутри эукариотической клетки, так и в объектах окружающей среды. Представители этой группы, распространенные практически повсеместно, отличаются экологической пластичностью и высокими адаптационными способностями, позволяющими им использовать разнообразные ресурсы и быстро перестраивать свой метаболизм в соответствии с изменением внешних условий. Последнее привело к развитию у представителей группы факультативных внутриклеточных паразитов сложных генетических систем регуляции, позволяющих включать и выключать экспрессию определенных групп генов, в том числе генов патогенности, в ответ на внешние сигналы. Изучение этих регуляторных систем представляет как фундаментальный, так и несомненный практический интерес, так как является основой разработки принципиально новых подходов контроля и лечения бактериальных инфекций (Воробьев, 1999; Бухарин, 1999; Воробьев и др., 2000; Alksne 2002; Projan, 2002).

За последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в области изучения взаимоотношений внутриклеточных бактериальных паразитов и эукариотических клеток, выступающих в роли хозяев. На стыке микробиологии, молекулярной биологии и клеточной биологии возникло две новые науки: молекулярная микробиология и клеточная микробиология. Молекулярно-биологические методы, которые ранее использовались преимущественно для изучения лабораторных моделей, таких как Escherichia coli и Bacilus subtilis, активно применяются для изучения патогенных бактерий. Их изучение показало, что адаптация бактерий к внутриклеточному размножению основана на общих принципах, включающих координацию экспрессии факторов патогенности, эксплуатацию механизмов эукариотической клетки для собственных нужд, использование внутриклеточных ресурсов для размножения, однако j

? о г", l ».1 т1 I

принципов происходит по специфическим для каждого возбудителя механизмам (Гинзбург и др. 1999; Prosseda et al., 2002; Cossart et al., 2002; Titball et al., 2003)..

Типичным представителем группы факультативных внутриклеточных паразитов и удобной моделью для изучения внутриклеточного паразитизма является грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes. С L. monocytogenes связано развитие тяжелых заболеваний человека и домашних животных. Основной путь распространения листериозной инфекции -пищевой. Вспышки заболевания, связанного с употреблением контаминированных продуктов, в последние годы приобретают характер эпидемий, включая десятки а, в отдельных случаях - сотни заболевших, при этом летальность может достигать 30-35 % (Бакулов и Васильев, 1991; Карликанова и др., 1999; Farber and Peterkin, 1992).

Попадая в организм человека оральным путем, листерии, в отличие от большинства возбудителей пищевых инфекций, быстро проникают в клетки кишечника и затем распространяются по кровяному руслу и размножаются во внутренних органах (печени и селезенке). Если иммунный ответ макроорганизма ослаблен, листерии распространяются далее, в частности, могут преодолевать церебральный и плацентарный барьеры, приводя к возникновению менингитов, менингоэнцефалитов и абортов. Вирулентность L. monocytogenes тесно связана с ее способностью паразитировать внутри эукариотических клеток (Vazquez-Boland et al., 2001; Cossart, 2002).

Внутриклеточные паразиты попадают в клетку в результате фагоцитоза, общего процесса, который приводит к деградации содержимого фагосомы, если только фагоцитированная бактерия активно не изменяет его течение (Desjardins et al., 1994). Характерной чертой процесса внутриклеточной инфекции L. monocytogenes является быстрое разрушение фагосомы в результате активности мембрано-литических ферментов, порообразующего токсина листериолизина О и фосфолипаз. Успешный выход из фагосомы является ключевым событием, после которого L- monocytogenes попадет в цитоплазму, где она эффективно

размножается и перемещается. Аналогичную стратегию внутриклеточного размножения используют Shigellaflexneri и облигатные паразиты, относящиеся к роду Rickettsia (Kocks С. et-al., 1995; Goldberg & Sansonetti., 1993). Для внутриклеточного перемещения эти бактерии используют схожий механизм, эксплуатирующий фрагменты эукариотического цитоскелета, полимеризация которых является движущей силой, позволяющей не только перемещаться внутри клетки, но и проникать в соседние. В процессе инфекции L monocytogenes и другие бактерии со схожим внутриклеточным циклом, способны распространяться по тканям и органам макроорганизма, не покидая внутриклеточное пространство.

За последние 20 лет были идентифицированы продуцируемые L. monocytogenes белковые факторы, необходимые на разных стадиях процесса взаимодействия с клеткой хозяина (Leimeister-Wachter. & Chakraborty, 1989; Mengaud et al., 1991a; Mengaud et al., 1991b; Vazquez-Boland et al., 1992; Portnoy et al., 1992). Гены, их кодирующие, образуют на хромосоме L. monocytogenes несколько островков патогенности (Cossart et al., 1994; Glaser et al., 2001; Vazquez-Boland et al., 2001b).. Координация экспрессии генов, кодирующих факторы патогенности, достигается благодаря активности положительного регулятора транскрипции белка PrfA (Mengaud et al., 1991; Kathariou et al., 1990; Freitag et al., 1993). Наблюдения регуляторных событий, связанных с присутствием источников углерода, шоковыми событиями, стадией роста культуры, свидетельствовали о связи регуляции факторов патогенности с процессами общего метаболизма (Leimeister-Wachter et al., 1992; Dramsi et al., 1993, Bohne et al.,1996, Milenbach et al., 1997). Однако на момент начала работы генетические механизмы, лежащие в основе наблюдаемых явлений, оставались неизвестными. Отсутствовали сведения о механизмах, влияющих на транскрипционную активность PrfA, его концентрацию и функциональный статус. Недоказанными являлись предположения о ведущей роли PrlA в модулировании уровня экспрессии факторов патогенности в ответ на изменение внешних условий. Невыясненными оставались сигналы внешней

среды, влияющие на уровень экспрессии факторов патогенности, и механизмы, передающие эти сигналы на транскрипционную машину. Все вышесказанное определило направление исследований, предпринятых в данной работе, которые посвящены идентификации молекулярно-генетических механизмов, регулирующих экспрессию генов патогенности листерий.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: установление сигнальных и регуляторных путей, контролирующих экспрессию генов факторов патогенности у факультативных внутриклеточных бактериальных паразитов, на модели Listeria monocytogenes.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

исследовать влияние условий культивирования на экспрессию факторов патогенности L. monocytogenes; выявить механизмы, связывающие изменения в составе среды культивирования с модулированием уровня экспрессии факторов патогенности;

получить коллекцию мутантных штаммов L. monocytogenes с нарушениями в системе контроля экспрессии факторов патогенности;

выявить замены в последовательности PrtA, влияющие на системный контроль экспрессии факторов патогенности; установить механизмы, влияющие на функциональную активность PrtA и его внутриклеточную концентрацию;

изучить влияние мутаций в системе контроля экспрессии факторов патогенности на вирулентность;

изучить возможность практического применения полученных данных о регуляции экспрессии факторов патогенности у L. monocytogenes. Научная новизна

Доказан вклад фактора транскрипции PrtA в координацию экспрессии факторов патогенности L. monocytogenes в зависимости от внешних условий.

Установлены условия культивирования, позволяющие in vitro добиться активизации PrfA и экспрессии генов патогенности у L. monocytogenes. Изолированы мутантные штаммы с нарушениями в системе регуляции экспрессии генов факторов патогенности. Идентифицированы аминокислотные замены, приводящие к устойчивым изменениям в уровне активности PrfA -положительного регулятора генов патогенности L. monocytogenes. Установлены структурно-функциональные, характеристики этого белка, играющего решающую роль в вирулентности L. monocytogenes.

Впервые у L. monocytogenes обнаружены и исследованы генетические регуляторные системы типа "quorum sensing" и изучена их роль в вирулентности возбудителя листериоза. На модели Listeria monocytogenes у бактериальных внутриклеточных паразитов впервые выявлен феномен отрицательной регуляции экспрессии факторов патогенности в присутствии автопродуцируемых низкомолекулярных веществ. Установлено, что механизмы, негативно регулирующие уровень активности генов патогенности, функционируют через подавление активности PrfA.

На различных биологических моделях, включающих культуры эукариотических клеток, куриные эмбрионы, морских свинок и линейных мышей, впервые продемонстрировано, что нарушение функционирования механизма отрицательной регуляции влияет на вирулентность L. monocytogenes, увеличивая инвазивные свойства этого вида бактерий и изменяя динамику инфекционного процесса. Сформулирована гипотеза о необходимости отрицательной регуляции продукции факторов патогенности как механизма, направленного на предохранение целостности эукариотической клетки - репликативной ниши внутриклеточных паразитов. Практическая значимость и внедрение.

Разработан метод дифференциации патогенных и непатогенных листерий, основанный на индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля, (патент РФ № 2196827). Метод адаптирован к использованию отечественных сред, апробирован в ряде практических

лабораторий и включен в ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые: Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» и методические указания МЗ, посвященные идентификации листерий в продуктах питания. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ, в том числе 1 монография, 14 статей.

Научные программы. Работа автора была поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 02-04-49506), Региональным Общественным Фондом Содействия Общественной Медицине (2002-2003 гг.), International Association for the Promotion of Co-operation with scientists from NIS of the former Soviet Union (INTAS) (грант № .2000-0471), European Molecular Biology Organization.

Личный вклад соискателя. Вклад автора состоял в планировании и

проведении экспериментальных исследований и обобщении результатов в форме публикаций. Часть исследований была проведена в соавторстве с лабораториями Prof. J.A. Vazquez-Boland, Университет Комплутенсе, Мадрид, Испания, и Prof. P. Miketova, Университет Аризоны, США. Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на Международной конференции «Микробное разнообразие», Пермь, 1996; конференции NATO ASI "Molecular Microbiology", Birmingham, UK, 1997; 3-ей Международной Энгельгардтовской конференции, Волга, 1997; VII и VIII съездах Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, Москва, 1997 и 2002; Международном симпозиуме «Листериоз на рубеже тысячелетий», Покров, 1999; Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфелдта-Якоба и другие прионные болезги; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена», Покров, 2001; IV Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия», Москва, 2001; IV Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов», Оренбург, 2003; XIX конференции EWGLI, 2004, Chamonix, France;

Совместном заседании Проблемных комиссий «Медицинская микробиология» и «Генетика и молекулярная биология» 5 декабря 2002 г..

Апробация диссертации состоялась на объединенной научной конференции отделов Медицинской Микробиологии и Генетики и Молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи 11.03.04. Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе были использованы штаммы L. monocytogenes и других Listeria spp, а также Е. coli из коллекции лаборатории легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, а также любезно предоставленные Dr. W. Goebel, Унив. Вюрзбурга, Германия, Dr. J.A. Vazquez-Boland, Унив. Бристоля, Великобритания.

Условия культивирования. Для рутинного культивирования Listeria spp. использовали агаризованную или жидкую среду Brain Heart Infusion (BHI «Difco», США). Е. coli культивировали в среде LB («Sigma-Aldrich», США). Для определения влияния адсорбентов их добавляли непосредственно перед автоклавированием, если не указано другое, до концентрации 0.2% (активированный уголь или 1% (остальные адсорбенты).Стандартные условия включали культивирование бактерий в жидкой среде при 37°С с аэрацией (ротация при 185 об/мин).

Получение мутантных клонов путем химического мутагенеза. Для химического мутагенеза использовали N-метил-К -нитро-К-нитрозогуанидин. Мутагенез проводили как описано (Миллер и др., 1888)

Получение сайт-специфических мутантов. Делегирование гена Ыо 1288 (гомолог гена luxS) из хромосомы штамма Р14 L. monocytogenes осуществили с помощью плазмиды pLSVl, имеющий термочувствительный сайт инициации репликации как описано в (Suarez et al., 2002).

Выделение плазмидной и хромосомной ДНК осуществлялось с помощью наборов фирмы «Promega» (США). Ферменты рестрикции, лигирования и модификации ДНК были получены от фирм «Fermentas» (Литва), «Promega» (США) и «Amersham» (США).

Выделение РНК из L. monocytogenes осуществляли с помощью наборов Crack Reagent ™ и RNAwiz™ («Ambion», Великобритания) согласно инструкции производителя.

Электрофорез нуклеиновых кислот осуществляли в соответствии с (Маниатис и др. 1984). Выделение фрагментов ДНК из геля осуществляли с помощью набора фирмы «Promega» (США).

Для Нозерн-блоттинга были использованы зонды, синтезированные в ПЦР с праймерами Hlyl: 5' - GCATCTGCATTCAATAAAGA; Н1у2: 5' -

GTCACTGCATCTCCGTGGT; Plcl: 5' - AGGGGGCCATTTGTATAAG; Р1с2: 5' -ATCGTTGCTGTTTTGCGCGT. Зонды метили радиоактивным изотопом фосфора Р32 с помощью набора фирмы «Araersham». Гибридизацию проводили стандартными методами как описано (Маниатис и др., 1984)

Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью набора фирмы «Amersham». Определение нуклеотидной последовательности осуществляли в центре коллективного пользования «Геном». Сравнение последовательностей и анализ наличия сайтов рестрикции осуществляли с помощью программ PCGene и Clone. Исходная последовательность исследуемого фрагмента хромосомы штамма L. monocytogenes EGD была получена из базы данных, находящейся в институте Пастера (http://vww.pasteur.fr) Плазмиды pL4082/pL602/pL5105 были получены путем клонирования фрагмента, полученного в ПЦР с праймерами Lmpl (5' - TTCTTGGCGGCACATTTGTCAC); Lmp2 (5'-CCAGTTCTTTCAGGTCCGGC) в векторе pTRKL2, любезно предоставленном Dr. T.R. Klaenhammer (O'Sullivan & Klaenhammer, 1993). ПЦР проводили на ДНК штаммов L monocytogenes NCTC 10527, NG 602, NG 5105, соответственно.

ПлазмидаpAct-luc была получена на основе вектора pUC19 и гена luc, кодирующего люциферазу светлячка Photinus pyralis, находящегося на векторе pGem-luc («Promega»). Промотор гена actA PactA был амплифицирован в ПЦР на ДНК штамма NCTC 10527. Полученная плазмида, обозначенная pAct-luc, содержала ген luc под контролем промотора PactA

Трансформация плазмидной ДНК. Электропорацию плазмид в Е. coli осуществляли на электропораторе фирмы «BioRad» в соответствии с инструкциями к прибору. Электропорацию в Listeria spp осуществляли на том же приборе в целом как описано в (Park & Stewart, 1990).

Определение гемолитической и лецитиназной активности осуществляли по лизису 5% взвеси эритроцитов человека в 0.15М NaCl, и гидролизу 0,7 % эмульсии

фосфатидилхолина (ICN) в буфере, содержащем 2 % дезоксихолат натрия, 0.15 М NaCl и 1мМ ZnCh, соответственно.

Разделение бактериальных белков в системе Лэммли и их идентификацию с помощью иммуноблотинга осуществляли стандартными методами (Маниатис и др. 1984). Специфические антисыворотки к факторам патогенности L. monocytogenes были получены от Др. Ю.Ф. Белого, Dr. J.A. Vazquez-Boland и лично автором (Ермолаева, 1994).

Определение вирулентности L. monocytogenes на модели заражения культуры эукариотических клеток. Монослой клеток заражали экспоненциальной культурой с множителем 1:100 (клетка/бактерия), после периода, необходимого для инвазии бактерий, в среду вводили гентамицин (100 мкг/мл) для устранения экстраклеточных бактерий и проводили инкубацию зараженных клеток в течение указанного времени (для оценки инвазивности - 1 час), затем клетки лизировали в присутствии 1% Triton Х-100 и делали высевы на питательный агар 10-кратных последовательных разведений с целью подсчета КОЕ.

Определение вирулентности на модели внутрибрюшинного заражения мышей. Мышей линии BALB/c весом 14-16 г. заражали внутрибрюшинно суспензией клеток L. monocytogenes в дозах 104 - 108 КОЕ/мышь. Наблюдение проводилось в течение 14 дней. Расчет 50% эффективной дозы летального заражения LD5o проводили по методу (Reed and Munich, 1938). Для определения динамики размножения во внутренних органах группа мышей была инфицирована суспензией клеток L monocytogenes в сублетальной концентрации 4x104 КОЕ/мышь. В день заражения, а также через 1,4,5,7 и 10 суток группы из 3-4 мышей усыпляли с помощью эфира, готовили суспензии печени и селезенки асептически вскрытых животных и делали высевы полученных суспензий в последовательных 10-кратных разведениях на питательный агар для подсчета КОЕ.

Результаты исследований

Координация экспрессии факторов патогенности на уровне регуляции транскрипции

Влияние условий культивирования на уровень продукции факторов патогенности L. monocytogenes.

Ранее было показано что при добавлении в среду культивирования неспецифического адсорбента активированного угля увеличивается экспрессия листериолизина О (Geoffrey et al., 1987). В данной работе мы демонстрируем, что активированный уголь приводит к увеличению экспрессии и других факторов вирулентности. Эффект, аналогичный активированному углю, оказывают полимерные неполярные адсорбенты, но не ионно-обменные смолы. С целью определения уровня экспрессии факторов вирулентности в присутствии активированного угля мы провели иммуноблотинг белков культуральной жидкости L.monocytogenes со специфическими антисыворотками к ЛЛО, PC-PLC (лецитиназе), PI-PLC (фосфатидил-инозитол специфичной фосфолипазе) и белку ActA. В присутствии угля значительно увеличивался уровень продукции всех протестированных факторов патогенности (рис.1). Спектр секретируемых белков приобретал при этом характерные изменения, вызванные увеличенной продукцией факторов патогенности.

Ряд полимерных сорбентов был протестирован нами с целью определения их эффекта на экспрессию факторов патогенности L. monocytogenes. В том числе инообменные смолы, специфичные либо к положительно (Amberlite IRA-904) либо отрицательно (Amberlite IRC-50) заряженным молекулам; а также неполярные матроретикулярные адсорбенты Amberlite XAD-4 и Diaion XP-20, наиболее близкие по своим свойствам к активированному углю.

В отсутствии адсорбентов лецитиназная активность в культуральной жидкости штамма L. monocytogenes NCTC 10527, выращенного в бульоне ВШ, не выявлялась (Рис.2). Появление лецитиназной активности наблюдалось в присутствии неполярных адсорбентов, специфичных для ароматических и гидрофобных соединений, к числу которых относятся активированный уголь, Amberlite XAD-4 и Diaion HP-20. Полярные адсорбенты, специфичные как для анионов, так и катионов, не вызывали изменений в продукции лецитиназы. Нарастание лецитиназной активности коррелировало с увеличением экспрессии других факторов патогенности, т.к. анализ белков культуральной жидкости бактерий достигших стационарной фазы, выявлял в присутствии неполярных адсорбентов характерные изменения, связанные с накоплением секретируемых факторов патогенности. Полученные данные свидетельствовали о том, что к увеличению продукции факторов патогенности приводит устранение из культуральной жидкости некоего вещества, связываемого неполярными адсорбентами.

г 25

г го

1 15

; ю

г 5 г о

ж (X И О

Рис.2. Влияние адсорбентов с различной специфичностью на продукцию лещтшазы. Адсорбенты добавляли к среде ВН1 в концентрации 1% (за исключением угля, который был добавлен в концентрации 0,2%). Лецитиназную активность измеряли в стационарной фазе роста культуры (16 часов роста).

В присутствии активированного угля происходит увеличение уровня транскрипции факторов вирулентности

Для того, чтобы выяснить, на каком уровне - транскрипционном или посттранскрипционном - происходит увеличение продукции факторов вирулентности в присутствии адсорбентов, мы с помощью Нозерн блоттинга определили уровень транскрипции генов Ыу и р1сА, кодирующих, соответственно, ЛЛО и PI-PLC (рис. 3). При выращивании в среде BHI без активированного угля был выявлен низкий уровень транскрипции Ыу и не выявлена транскрипцияр1сА. Этот факт коррелирует с низким уровнем ЛЛО и отсутствием PI-PLC в культуральной жидкости (см. рис.1). В присутствии активированного угля наблюдается резкое увеличение транскрипции гена Ыу в виде моноцистронного транскрипта и гена plcA в составе двух транскриптов с массами около 1 и 2,2 тыс н.п. По-видимому, меньший транскрипт является моноцистронным, а второй кодирует помимо PI-PLC регуляторный белок Рг1А. Таким образом, наблюдаемое в присутствие угля увеличение продукции факторов патогенности связано с усилением их транскрипции. Поскольку белок Рг1А является единственным известным в настоящее время транскрипционным фактором, контролирующим экспрессию геновр1сА и Ыу, кодирующих PI-PLC и ЛЛО, мы предположили, что в присутствии активированного угля происходит

существенное усиление транскрипции генов патогенности, подверженных контролю со стороны белка РГЕА.

уголь

hly

pIcA

Рис. 3. Влияние активированного угля на транскрипцию факторов патогенности: Нозерн блоттинг РНК, выделенной из экспоненциальной культуры L monocytogenes NCTC 10527, выращенной в среде BHI, дополненной или нет углем, с зондами к генам hly (кодирует ЛЛО) и plcA (кодирует PI-PLC)

Структурно-функциональные характеристики центрального регулятора генов патогенности L. monocytogenes PrfA.

С целью изучения генетических механизмов, которые регулируют экспрессию факторов патогенности у Listeria monocytogenes; нами был осуществлен химический мутагенез клеток штамма L. monocytogenes NCTC 10527. В качестве мутагена был использован нитрозогуанидин. Скрининг мутантных клонов проводили путем отбора колоний с увеличенной продукцией, лецитиназы. Кодирующий лецитиназу ген plcB расположен на островке патогенности LIPI-1, и его экспрессия находится под строгим контролем белка PrfA и координируется с другими генами патогенности.

Последовательность гена prfA, кодирующего регулятор транскрипции PrfA, была определена в исходном родительском штамме NCTC 10527 и в восьми мутантных клонах, демонстрирующих существенно увеличенную лецитиназную активность на агаризованной среде и полученных в независимых экспериментах. У шести мутантных штаммов были обнаружены единичные нуклеотидные замены в последовательности рг[А, которые приводили к аминокислотным заменам в последовательности белка. Все замены

представляли собой транзиции GC->AT. Четыре мутанта, изолированные в независимых экспериментах, имели одинаковую мутацию, приводящую к замене Leul140Phe. Из них для дальнейших исследований был использован штамм NG 602. Два штамма имели отличающиеся замены: Asp33Asn в штамме NG22 и Ala94Val в штамме NG 608. Штаммы NG515 и NG408 не имели изменений в последовательности генаprfA, и наблюдаемый у них фенотип, по-видимому, был связан с мутациями в других областях, что, указывает на существование других, помимо гена prfA, локусов на хромосоме L. monocytogenesy необходимых для регуляции экспрессии факторов патогенности.

Мутантные prfA аллели из штаммов NG 602, NG 22 и NG 608 были клонированы в низкокопийном векторе pTRKL2 в штамм L. monocytogenes с делецией хромосомной копии гена prfA (штамм Р14 AprfA). В качестве контроля был клонирован prfA дикого типа из родительского штамма NCTC 10527. Кроме того, был клонирован ген prfA из штамма NCTC 5105. Штамм NCTC 5105, полученный, нами из типовой коллекции, также гиперэкспрессировал факторы патогенности и имел замену Gly 145 Ser в PrfA.

Рис. 4. Схема клонированных фрагментов, несущих ген рг/»..Тонкие горизонтальные стрелки обозначают транскрипты, толстые - гены

Моноцистрокный фрагмент, клонированный в составе плазмнды рНР9::ргГА

Бианстронный фрагмент, клонированный в составе ллазмкд -pL4082,pL602,pL5105

ГенprfA может экспрессироваться как с собственного промотора, так и с промотора гена plcA, ему предшествующего. Для того чтобы сохранить этот регуляторный аспект, ген prfA был клонирован в составе ПЦР-фрагмента размером 2679 н.п., содержащего межгенную область, разделяющую prfA и plcA, а также целиком ген plcA и его промотор, включая сайт связывания PrfA (рис.4).

Штаммы, несущие плазмиды pL22 и pL608, кодирующие PrfA с заменами Asp33Asn и Ala94Val, соответственно, не демонстрировали изменения уровня продукции факторов патогенности по сравнению со штаммом, несущим плазмиду pL4082 (prfA дикого типа). Возможно, штаммы NG22 и NG608, из которых было проведено клонирование, несли дополнительные мутации, либо в генетическом материале штамма Р14, использованного в качестве реципиента при клонировании, существовали различия по сравнению со штаммом NCTC 10527, использованном для мутагенеза. Напротив, штаммы несущие плазмиды pL602 и pL5105, кодирующие PrfA с заменами Leul40Phe и Glyl45Ser, соответственно, демонстрировали увеличение продукции всех изученных факторов патогенности (рис.5).

Анализ уровня транскрипции генов патогенности показал, что увеличение продукции в штаммах с аминокислотными заменами LeuHOPhe и Glyl45Ser в последовательности белка PrfA связано с увеличением их транскрипции, что указывает на увеличенную транскрипционную активность PrfA, основного регулятора генов патогенности листерий. Мы предположили, что данные замены переводят PrfA в конститутивно активную форму. Аналогичные результаты были параллельно получены в лаборатории проф. Vazquez-Boland: конститутивное увеличение транскрипции факторов патогенности в штамме L. monocytogenes P14A было обусловлено спонтанно возникшей заменой Glyl45Ser, идентичной мутации в использованном нами штамме NCTC 5105 (Ripio et al., 1997). Таким образом, результаты, полученные независимо в двух лабораториях, продемонстрировали, что центральный

регуляторный элемент контроля экспрессии факторов патогенности PrfA может быть переведен в активную форму в результате единичной аминокислотной замены.

Наличие гомологии между PrfA и CRP, и продемонстрированное их функциональное сходство, дало возможность предложить обозначение PrfA* для мутантных вариантов PrfA с конститутивно увеличенной активностью (Vega et.l, 1998), аналогично соответствующему обозначению используемого для конститутивно активных вариантов CRP (CRP*).

«3 ^ г~~

3 15;

5_____

О--'—-—'—-—

wt Leu40Phe Gly145Ser

wt L140F G145S

Ix 5x 25x lx 5x 25x lx 5x 25x

Рис. 5. Уровень продукции лецитиназы (А) и ЛЛО и PI-PLC (Б) рекомбинантными штаммами

L. monocytogenes, несущими следукяциеплазмиды:

Wt - pL4082 (PrfA дикого типа, клонирован из штамма NCTC 10527)

L140F - pL602 (PrfA LeuMOPhe, клонирован из штамма NG 602)

G145S - pL5105 (PrfA Glyl45Ser, клонирован из штамма NCTC 5105)

Конститутивная активность PrfA* был подтверждена: при сравнении активности PrfA. дикого типа и PrfA* в отношении гена plcA в непатогенном виде L.innocua, куда были введены плазмиды pL4082 {prfA дикого типа) и pL602 (prfA*). Уровень продукции PI-PLC, кодируемого геном plcA, в L. innocua в присутствии мутантного PrfA (LeuHOPhe) по крайней мере в 25 раз превышал уровень. Интересно отметить, что в более отдаленном филогенетически виде Е. coli активность PrfA дикого типа и PrfA* не

различалась в отношении промотора гена plcA, и лишь незначительно различалась в отношении промотора PactA, контролирующего экспрессию 1ис гена (рис. 7). На основании этих данных было возможно сделать два предположения: либо активность PrfA* в Е. coli падает до уровня дикого типа; либо, напротив, активность PrfA дикого типа увеличивается до уровня, демонстрируемого PrfA*. Наши дальнейшие исследования продемонстрировали, что, действительно, активность PrfA дикого типа регулируется. В присутствии неполярных адсорбентов L. monocytogenes дикого типа демонстрирует активность PrfA., достигающую уровня, демонстрируемого белками PrfA*c конститутивной активностью.

2 5 х 5 х 1 X

wt prfA* wt plfA* «I prfA *

Рис. 6. Уровень продукции PI-PLC в L. innocua под контролем PrfA дикого типа (wt) и конститутивно активного (PrfA*). В качестве контроля количества нанесенного белка использован белок Р60, продукция которого не зависит от PrfA (Portnoy et al., 1992).

wt PrfA.«

nona pL40S2 pL602

Рис. 7. Продукция PI-PLC и люциферазы в рекомбинатном

штамме Е coli, содержащем плазмиду pAct-luc и одну из двух совместимых с pAct-luc плазмид: pL4082 (prfA дикого типа) или pL602 (prfA*).А - иммуноблот с антителами к PI-

PLC (кодирующий ген plcA). Б - люциферазная активность (показания люминометра, измеренные в течение 1 сек/оптическую плотность 0D600 культуры). None - штамм содержит только плазмиду pAct-luc.

В присутствии адсорбентов происходит переключение активности центрального регулятора генов патогенности PrfA

Экспрессия гена prfA может инициироваться как с двух промоторов, непосредственно предшествующих этому гену, так и с промотора гена plcA, кодирующего PI-PLC (Sheehan et al., 1996) (см. рис. 4). Увеличение уровня транскрипции гена prfA в присутствии адсорбентов в составе бицистронного транскрипта за счет активации промотора PplcA, продемонстрированное выше (см. рис.3), должно было приводить к увеличению уровня продукции PrfA. Чтобы доказать это предположение, мы сравнили внутриклеточную концентрацию PrfA в штамме L. monocytogenes P14, выращенном в присутствии и в отсутствии активированного угля. Внутриклеточная концентрация PrfA была определена на средне-экпоненциальной фазе роста. В присутствии активированного угля наблюдалось существенное увеличение количества белка PrfA (рис. 8).

Рис. 8. Внутриклеточная концентрация PrfA, определенная методом иммуноблотинга, увеличивается в присутствии активированного угля в штамме L. monocytogenes дикого типа. Р14

уголь _ 4-

Однако и без адсорбента внутриклеточный уровень Рг£А был достаточно высок, что противоречило данным о чрезвычайно низком, вплоть до невыявляемого, уровне продукции Рг1А-регулируемых факторов патогенности (см. рис.1, рис.3 и рис. 8). Было предположено, что в отсутствии адсорбента внутри клетки имеется пул неактивного Рг1А. При добавлении адсорбента происходит активация, этого уже имеющегося пула Рг1А, и вторичным

эффектом является увеличение внутриклеточной концентрации Рг1А в результате активации промотора РркА

Для доказательства этого предположения был использован штамм Р14ДргГА, комплементированный плазмидой рНР89::р1А. Эта плазмида включала ген рг[А и предшествующую ему промоторную область, но не содержала гена р1сА и промотора Рр!сА (см. рис.4). Внутриклеточная концентрация Рг1А была определена на разных стадиях роста штамма Р14ДргГА (рНР89::р1А) (рис.9). В те же моменты времени уровень активности промотора

Рас

инициирующего транскрипцию гена, кодирующего лецитиназу, был

измерен с помощью реакции ОТ-ПЦР (рис. 10). Как видно из рис. 10, активность промотора практически не зависит от присутствия

активированного угля на ранней стадии логарифмического роста, но на средней и поздней стадиях логарифмического роста в присутствии активированного угля активность существенно выше. Внутриклеточная же концентрация Рг1А не зависит от присутствия адсорбента. Эти данные подтверждают, что присутствие адсорбента приводит к активации регуляторного белка Рг1А, что и является причиной увеличения уровня экспрессии факторов патогенности. В штаммах же дикого типа присутствие в среде культивирования адсорбентов приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Рг1А. в результате увеличения его экспрессии в составе бицистронного транскрипта с промотора

рР1сл (см. рис.8). + * +

уголь

С/э

Стац

Рис. 9. Внутриклеточная концентрация РйА в штамме Р14ДргГА (рНР89::рНА), определенная с помощью иммуноблотинга (С/э - средне-экспоненциальная фаза роста; Стац -стационарная)

Р/э С/э Стац.

¡ар

Р/э С/э Стац

угол»

top

...BaL, OBHIC

зо

25 ?0 15 10

BHI OBHIC

□

fft- ff} iV

« ; ■

Гт

о ; р/э —Lcbl-.-fftin

Рис. 10. Анализ экспрессии генов actA и iap (кодирует белок Р60) в зависимости от присутствия активированного угля. Анализ осуществлен на разных стадиях роста методом ОТ-ПЦР.В верхней части - результаты типичного эксперимента. В нижней части -усредненные данные трех экспериментов, полученные путем определения плотности соответствующих полос: Обозначения: Р/э - ранняя экспоненциальная фаза роста, С/э -средне экспоненциальная, Стац - стационарная,

Другими словами, существование ауторегуляторной петли в штамме дикого типа, амплифицирует эффект активации PrfA. Предположение о наличии ауторегуляторной петли было впервые высказано в работах группы Dr. Vazquez-Boland (Ripio et al., 1997). Приведенные данные, полученные автором в соавторстве с этой группой, доказывают это предположение.

Наблюдаемая репрессия генов патогенности на средне- и поздне-логарифмических стадиях роста в отсутствии адсорбента привела нас к предположению о том, что роль адсорбента может заключаться в устранении из среды культивирования накапливающегося по мере роста культуры продукта, который прямо или косвенно репрессирует активность PrfA.

Вклад аутокринных механизмов в регуляцию экспрессии факторов патогенности факультативных внутриклеточных паразитов на модели L. monocytogenes

Определение условий, при которых происходит активация PrfA и последующая индукция регулона патогенности, (культивирование в присутствии адсорбента) явилось ключевым моментом для дальнейшего

изучения механизмов, контролирующих экспрессию генов патогенности у L. monocytogenes. Два возможных механизма взаимодействия бактерий с адсорбентом может быть представлено: (i) прямое взаимодействие бактерий с частицами адсорбента; (ii) сорбция адсорбентом диффундирующих молекул, имеющихся в среде культивирования, либо продуцируемых самими бактериями. Для того, чтобы выяснить, какой из этих двух механизмов имеет место в нашем случае, были проведены следующие эксперименты.

Разделаюший слой агара -уголь

Рис. II. Ген оя итяческал активность ¿. топосуговепи ЫСТ выращенной па крованои агаре, в присутствии (+) или отсутствии (-) активированного угла.

Во-первых, эффект присутствия адсорбента был определен в условиях, когда частицы адсорбента (угля) были физически отделены от бактериальных клеток. Для отделения бактерий от среды, содержащей субстрат (кровь для выявления ЛЛО, или желток - для определения лецитиназной активности) и предотвращения прямых контактов с частицами угля, культуру высевали на мембрану (МПИроге, 0, 1 ит) или на тонкий (1-2 мм) слой агара (Рис. 11). Присутствие активированного угля: приводило к увеличению продукции факторов патогенности независимо от того, были бактерии в прямом контакте с частицами угля или не были. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что активация в присутствии адсорбента достигается благодаря сорбции диффундирующего вещества, а не прямому контакту между частицами адсорбента и бактериями.

Для подтверждения того, что наблюдаемый эффект усиления активности генов патогенности связан с сорбционными свойствами добавляемого к среде адсорбента (в частности, активированного угля), мы определили зависимость уровня экспрессии факторов патогенности от его концентрации. Уровень

гемолитической и лецитиназной активности, демонстрируемой изучаемой культурой L. monocytogenes, штамм NCTC10527, возрастал с увеличением концентрации активированного угля от 0 до 0,2%(рис.12). Дальнейшее увеличение концентрации угля до 1% приводило к уменьшению наблюдаемой ферментативной активности, что может быть следствием сорбции углем продуктов реакции.

Однако, оставалось неясным, является ли это вещество компонентом среды или продуцируется самими бактериями в ходе роста культуры. Для определения того, является ли репрессорная субстанция компонентом среды или продуктом листерий, бульон ВШ был обработан в течение 1 часа 1% активированного угля, после чего уголь был удален путем фильтрования. К обработанной среде был добавлен активированный уголь из стерильной суспензии (рис.12, заштрихованные колонки). Предварительная: обработка среды не приводила к заметному увеличению лецитиназной и гемолитической активностей в супернатанте в отсутствии активированногоу угля. Однако рабочая концентрация угля, необходимая для максимального увеличения продукции факторов патогенности, была меньше в обработанной среде - 0,02% против 0,2% в необработанном бульоне ВШ. Мы предположили, что репрессируцющий эффект определяется веществлм, которое продуцируется листериями в ходе роста культуры. Компоненты же среды, адсорбируемые углем, уменьшают его эффективную адсорбционную емкость.

Таким образом показано, что активация генов патогенности связана в концентрационно-зависимой манере с присутствием адсорбента в среде во время культивирования. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что клетки L. monocytogenes продуцируеют вещество, появление которого в среде культивирования приводит к репрессии генов патогенности. В предыдущей главе было показано, что механизм репрессии связан с переводом регуляторного белка PrfA в неактивную форму. Таким образом, присутствие в среде культивирования диффундирующей субстанции, которая продуцируется клетками растущей культуры L. monocytogenes, приводит к уменьшению

активности регуляторного белка PrtA, что, в свою очередь, является причиной репрессии генов патогенности.

50 40 30 20 10 0

Г"*1 п 1' т \ >

п,

кЪЪцеЩц ВД^002* 0

1% ,0.2% 0.02% 0002% 0 Концентрация угля

Рис. 26. Зависимость гемолитической и лецитиназной активности от концентрации активированного угля, а - ВН1; б - ВН1, обработанный 1% углем, который был удален перед добавлением свежего угля в указанных концентрациях и засевом бактерий

L. monocytogenes обладает по крайней мере тремя генетическими системами типа quorum sensing

Феномен, регуляции активности групп: генов путем восприятия химического сигнала, поступающего извне, но секретируемого вовне самими бактериями, активно изучается в настоящее время и получил в англоязычной литературе название "quorum sensing", т.е. «чувство кворума». Суть функционирования систем quorum sensing сводится к следующему. Бактерии секретируют низкомолекулярное вещество, которое накапливается в окружающей среде по мере роста культуры. У грам-отрицательных бактерий это чаще всего молекула класса гомо-серин лактонов, хотя были также выявлены фторхинолоны и дикетопиперазины, у грам-положительных - это модифицированные олигопептиды. Традиционно сигнальные вещества систем quorum sensing называют автоиндукторами, т.к. накопление этих веществ во внешней: среде до критической концентрации приводит к активации соответствующих регуляторных белков, что в свою очередь приводит к

активации регулируемых ими генов и, соответственно, экспрессии кодируемых ими факторов. Таким образом, основными компонентами системы quorum sensing являются сигнальное низкомолекулярное вещество и белок регулятор, активность которого зависит от концентрации этого вещества.

Как было продемонстрировано на модели регуляции генов патогенности у S. aureus, компетентности у В. subtilis, а также ряде других моделей, механизм quorum sensing у грам-положительных бактерий во многих случаях базируется на сигнальном олигопептиде, присутствие которого в среде культивирования распознается-сенсорными элементами так называемых двух-компонентных передающих сигнал систем. Двух-компонентные сигнальные системы обычно включают транс-мембранную гистидин-киназу, которая взаимодействует с внешними сигналами через сенсорный домен, и регулярный белок, который является регулятором транскрипции, активируемым соответствующей гистидин-киназой через реакцию фосфорилирования. Такая система представлялась возможным кандидатом на роль механизма, опосредующего репрессию факторов патогенности.

Аминокислотные последовательности ряда регуляторов транскрипции (AgrA S. aureus, ComA, PhoP, ResD, CheY, DegU B. subtilis, VanRB E. faecalis) были использованы для поиска гомологичных последовательностей в находящейся, в Институте Пастера (Франция) базе данных генома L. monocytogenes. с помощью программы BLAST. Было идентифицировано 17 последовательностей, которые имели по крайней мере 40% гомологии хотя бы с одним из вышеперечисленных белков.

Наиболее выраженную гомологию с ранее описанными системами quorum sensing имел оперон из четырех открытых рамок считывания lmo0048-lmo0051. Данный локус включал пару регулятор транскрипции/ гистидинкиназа (Imo0051/lmo0050), которые имели 64% и 52%, соответственно, гомологии с парой AgrA/AgrC, двухкомпонентной системы, которая контролирует, экспрессии ряда важных факторов патогенности у S. aureus. Кроме того, белок 1то0048 имел существенную гомологию (57%) с белком из того же локуса S

aureus, что и названная пара, AgrB, которые вовлечен в процессинг и секрецию феромона, кодируемого геном agrD. Листериозный оперон включал маленькую ОРС lmo0049; которая могла бы кодировать секретируемый феромон. Организация обнаруженного листериозного локуса в точности напоминала agr локус у S. aureus. Локус Imo0048-lmo0051, таким образом, представлялся потенциальным кандидатом на роль аутокринного регулятора у факторов патогенности у L. monocytogenes.

Второй мишенью, использованной для поиска гомологии в базе данных L. monocytogenes, был белок LuxS, кодирующий синтазу сигнальной молекулы AI-2 (фуранозилдиэфир бора) второй сигнальной системы V. harveyi. Ген luxS был найден у широкого круга бактерий, а у ряда из них было продемонстрировано участие сигнальных систем, основанных на AI-2,. в регуляции различных процессов (биолюминесценции, патогенности и ряда других функций) (0htani. et.al., 2002; Stroeher et ah, 2003; Lyon et al., 2001). Поиск гомологичных последовательностей с помощью программы. BLAST выявил присутствие в геноме L. monocytogenes. открытой рамки считывания /то 1288, кодирующей белок с 58% гомологией к LuxS из V. harveyi.

Локус 1гао0048-1то0051 и ген lmo1288 были делетированы из хромосомы штамма EGDe L. monocytogenes, как описано в разделе Материалы и методы. Делеция гена 1то1288 не приводила ни к изменениям в росте, ни к нарушениям в регуляции экспрессии факторов патогенности in vitro. Эффект мутации в гене 1то1288 на вирулентность был определен по инвазивности EGDe и EGDeAlmol288 на культуре макрофагоподобных клеток J774. Эффективность первоначальных этапов инфекции ни была изменена в мутантном штамме ни в какой мере. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали в пользу того, что продукт LuxS-подобного белка не влияет существенно ни на рост, ни на вирулентность L. monocytogenes.

Локус lmo0048-lmo0051 в соответствии с его гомологией с agr-опероном S. aureus был обозначен agl (agr локус Listeria). В противоположность luxS, делеция agr-подобного локуса приводила к заметным изменениям, как в

скорости роста, так и продукции основных факторов патогенности (рис. 13). Штамм EGDeAag/ демонстрировал замедленный рост в экспоненциальной фазе и достигал большей оптической плотности в стационарной фазе по сравнению со штаммом дикого типа EGDe. В среде BHI мутация Aagl не приводила к увеличению уровня продукции факторов патогенности, как было отмечено по уровню лецитиназной активности (ниже порога чувствительности метода), а также по отсутствию изменений в белковом спектре культуральной жидкости. Анализ динамики появления лецитиназной активности в присутствии активированного угля, однако, выявил различия в продукции лецитиназы в мутантном штамме и штамме дикого типа. Делеция оперона agl приводила к задержке начала продукции лецитиназы. По-видимому, agl локус не связан с отрицательной регуляцией генов патогенности, однако может быть вовлечен в положительную регуляцию экспрессии факторов патогенности.

cnwt, BHIC МЛ agl. BHIC BBHWt, BHI

& agl, BHI —♦—Wt, OD6OO -*-Д agl, OD6OO

Время, часы

Рис. 12. Влияние оперона Imo0048-lmo0051 (aglABCD) на рост и продукцию факторов патогенности L. monocytogenes

Таким образом, помимо описанной выше системы негативной авторегуляции, с помощью генетического подхода мы идентифицировали две дополнительные системы quorum sensing, кодирующие сигнальные молекулы. Одна из них (agl) участвует в модулировании уровня экспрессии факторов патогенности L. monocytogenes. Роль локуса agl в регуляции генов патогенности была недавно подтверждена независимыми исследованиями группы из Франции (Autret et al., 2003). Вторая система включала ген, кодирующий

гомолог LuxS, фермента, синтезирующего содержащую бор сигнальную молекулу, найденную у широкого спектра бактерий. Однако, согласно полученным результатам эта система не вносит: вклада в регуляцию генов патогенности у L. monocytogenes.

Роль отрицательной регуляции экспрессии генов факторов патогенности в вирулентности L. monocytogenes

Ряд биологических моделей был использован для исследования влияния мутаций, устраняющих отрицательную регуляцию и приводящих к конститутивной экспрессии факторов патогенности, на вирулентность. В качестве моделей были использованы культура эпителиальных клеток, куриные эмбрионы,. морские свинки и мыши. Клетки кишечного эпителия являются первым барьером при взаимодействии организма с возбудителем листериоза Таким образом, критическим этапом листериозной инфекции является инвазия листерий в эпителиальные клетки. Для анализа различий в инвазивности, связанных с устранением отрицательной; регуляции экспрессии факторов патогенности, мы использовали культуру эпителиальных клеток СаСо-2. Штамм дикого типа Р14 и спонтанный мутант РИА, конститутивно продуцирующий факторы патогенности в результате замены Glyl45Ser в последовательности PrfA, были использованы для заражения культуры в условиях, описанных в разделе Материалы и Методы. Индекс инвазивности определялся как отношение, числа бактерий, высеянных из 105 клеток после одного часа инкубирования с гентамицином, к числу бактерий, внесенных, для заражения 105 клеток. По результатам двух независимых экспериментов, отношение индекса инвазивности штамма с устраненной отрицательной регуляцией и штамма дикого типа составило 20,2±0,3- Т.е. конститутивная активность генов патогенности увеличивала инвазивность L. monocytogenes.

Аналогичное увеличение вирулентности было обнаружено при использовании в качестве модели куриных эмбрионов. Пятидесятипроцентная

доза летального заражения LD50 составила для штамма дикого типа 56 КОЕ, а для штамма конститутивно продуцирующего факторы патогенности 10 КОЕ.

На моделях взрослых животных разница в вирулентности между штаммами дикого типа и конститутивно продуцирующими факторы патогенности была менее заметна, практически не выявляясь при таких методах, как определение результатов конъюнктивальной пробы и определение 50 % летальной дозы LD50 Качественная конъюнктивальная проба, проведенная на морских свинках со штаммами дикого типа L4082 и мутантным L5105, не выявила различий в вирулентности. 50% летальную

— Р14, 10в -«—Р14, 10'. -*— Р14, 10е -•— Р14, 105

-Р14, 10«

-О- Р14А, 108 -О-- Р14А, 107 -Д - Р14А, 10е -О-- Р14А, 105 Р14А. 104

Рис. 14. Динамика смертности мышей, зараженных экспоненциальной культурой L. monocytogenes дикого типа'(штамм Р14) и с конститутивной экспрессией факторов патогенности (штамм Р14А). Дозы заражения от 104 до 108 КОЕ/мышь.

дозу LD50 определяли на модели внутрибрюшинного заражения лабораторных мышей. Была использована пара изогенных штаммов L. monocytogenes P14 -РИА. Расчет LD50 по методу Reed и Muench показал, что для штамма дикого типа Р14 она составляла 105,2 (1,6x105) КОЕ/мышъ, а для штамма с конститутивной экспрессией факторов патогенности 104,8 (6x104) КОЕ/мышь, т.е. приблизительно в 3 раза меньше. Вместе с тем, скорость развития инфекционного процесса у штамма, конститутивно экспрессирующего факторы патогенности, была заметно выше (рис. 14).

Для получения большей информации о характере инфекционного процесса было проведено определение скорости размножения штаммов L. monocytogenes Р14 (дикий тип) и Р14А (конститутивный продуцент) во внутренних органах мыши при заражении сублетальными дозами. Существенное отличие в динамике инфекционного процесса двух штаммов было отмечено в первые сутки (рис. 15 А). Количество бактерий штамма с конститутивной экспрессией Р14А во внутренних органах было существенно выше, чем бактерий штамма дикого типа, в селезенке эта разница составляла почти 30 раз, а в печени 14 раз. Полученные данные предполагают, что конститутивная экспрессия факторов позволяет бактериям более эффективно проникать во внутренние органы на начальных этапах инфекции. Спустя трое суток, к концу четвертого дня после заражения, количество бактерий обоих штаммов во внутренних органах практически сравнивалось. Однако на поздних стадиях заражения для штамма Р14А наблюдалась более быстрая элиминация, возбудителя. Если в печени мышей, зараженных штаммом дикого типа, Р14, в течение 4-7х суток выявлялось стабильное количество бактерий, порядка 5х10б КОЕ, то число бактерий штамма Р14А в печени зараженных животных уменьшалось, начиная с 5-х суток, а полная элиминация достигалась уже на 10е сутки.

Таким образом, конститутивная продукция факторов патогенности приводит к существенно более быстрому распространению L. monocytogenes по внутренним органам на начальных этапах инфекции. Это явление, возможно, связано с более высокой инвазивностью этих штаммов. В то же время конститутивная экспрессия факторов патогенности приводит к более ранней.элиминации возбудителя из внутренних органов на поздних стадиях инфекции.. Одно из возможных объяснений наблюдаемого явления, это повышенная цитотоксичность, которая была описана у штаммов L. monocytogenes с конститутивной экспрессией факторов патогенности (Shetron-Rama et al, 2002).

Способность к внутриклеточному и межклеточному перемещению позволяет листериям размножаться внутри эукариотических тканей, переходя непосредственно из одной клетки-хозяина в другую, что, по-видимому, связано с ролью эукариотической клетки как оптимальной экологической ниши для L. monocytogenes в макроорганизме. В эукариотической клетке L. monocytogenes, с одной стороны, имеет условия для размножения в цитоплазме, а с. другой, защищена от гуморального иммунного ответа. Быстрое разрушение клетки-хозяина приводит к выходу L. monocytogenes во внеклеточное пространство, где она, по-видимому, не может размножаться и подвергается быстрому уничтожению элементами иммунной системы. Ранее был описан ряд механизмов, используемых L. monocytogenes для предохранения от разрушения клетку-хозяин (Beauregard et al., 1997; Marquis et.al., 1995; Jones et al., 1996). Большинство из них направлены на уменьшение цитотоксичности основных мембрано-разрушающих факторов листерий, листериолизина О (ЛЛО) и фосфолипаз. В изучаемой нами системе, однако, оба штамма обладали полным набором одинаковых мембрано-разрушающих ферментов, и, следовательно, все наблюдаемые различия в развитии инфекционного процесса были связаны только с различиями в регуляции экспрессии факторов патогенности. В этой работе в экспериментах in vitro нами было продемонстрировано, что экспрессия факторов патогенности L. monocytogenes подвергается отрицательной авторегуляции. Мы предполагаем, что этот механизм функционирует и in vivo, выключая продукцию факторов, в том числе мембрано-разрушающих ЛЛО, PI-PLC и PC-PLC, при увеличении концентрации внутриклеточных бактерий. Другими словами, негативная регуляция активности PrfA, «отключенная» у штамма с мутацией Glyl45Ser, направлена на предохранение целостности клетки-хозяина, тем самым обеспечивая более длительное сохранение бактерий в органах хозяина. Мы предполагаем, что обнаруженный нами феномен отрицательной авторегуляции служит основным регуляторным механизмом, модулирующим активность PrfA в процессе инфекции, и возможно, является основой для длительной персистенции возбудителя в макроорганизме.

Разработка новых подходов к идентификации и дифференциации L monocytogenes, основанных на изучении регуляторных элементов, контролирующихэкспрессию факторов патогенности

Разработка метода идентификации L. monocytogenes, основанного на индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля

Впервые описанный нами феномен увеличения продукции факторов патогенности в присутствии неполярных адсорбентов был использован для разработки принципиально нового метода дифференциации L.monocytogenes от непатогенных листерий. Метод основан на сравнении лецитиназной активности на среде, содержащей желток куриного яйца в качестве источника лецитина, в присутствии и отсутствии активированного угля. Нами был проверена индукция лецитиназной активности у 42 штаммов L. monocytogenes при выращивании на агаризованной среде ВШ (Difco), содержащей желток куриного яйца, в присутствии от 0,2% до 1% активированного угля. Все штаммы дикого типа не показывали активности в отношении лецитина куриного яйца на среде без угля, но демонстрировали четко выраженную активность, если среда содержала 0,5% активированного угля (рис. 16).

Важным вопросом было поведение других видов листерий в присутствии активированного угля. Только два вида листерий, отличных от L.monocytogenes, имеют в своем геноме ген, кодирующий лецитиназу (Glaser et al., 2001). Это патогенный вид Livanovii, и непатогенный L.seeligeri. На среде с желтком исследованные нами штаммы Livanovii демонстрировали лецитиназную активность как при отсутствии активированного угля, так и в присутствии (рис.16). Непатогенные виды листерий, включая L.seeligeri, не обладали лецитиназной активностью независимо от присутствия угля. Таким образом, индукция лецитиназной активности характерна только для L.monocytogenes, но не для других видов листерий.

А Б

Рис. 16. Индукция лецитиназной активности в присутствии активированного угля, А -без угля; Б - в присутствии 0,5% активированного угля. 1 - Lmonocytogenes NCTC10527; 2 -Lwelshimeri SLCC 5334; 3 - Linnocua АТСС 33090; 4 - Livanovii ATCC19119; 5 - L.seeligeri SLCC5921; 6 - Lgrayi 17

Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности

Как показывают результаты многих авторов и данные, представленные в настоящей работе, важнейшую роль в вирулентности листерий играет белок PrfA, который необходим для экспрессии всех остальных факторов патогенности. Область генаprfA была выбрана с целью оценки возможности ее использования для дифференциации штаммов L. monocytogenes методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Проведенное исследование показывает существование штаммоспецифического полиморфизма участка хромосомы L. monocytogenes, содержащего гены prfA и plcA. Рестрикционный анализ полученного в ПЦР фрагмента, содержащего эти гены, позволил нам разбить проанализированные штаммы на две группы, которые мы обозначили А и В. Штаммы, относящиеся к группе А, обладали рестрикционным спектром, аналогичным таковому у типового штамма EGD, геномная последовательность которого полностью определена.

В А

В В! А

3000

2000 1500

900 700 500

.-.73 3

С la I

Hind III.

Hlndlil

HindllC la I

С la I

—|~Г862 Ctal

Clal Hindlll A530G A728G G 806A

dial H

(HiJdliqlal (С 1448A )

Рис. 17. Штаммоспецифический полиморфизм фрагмента Lmp3 - Lmp4 при рестрикции Clal и Hindm. В нижней части показана схема расположения Clal и Hindlll сайтов рестрикции в зависимости от принадлежности к группе А (сайты указаны над чертой) или к группе В (сайты указаны под чертой). В нижней части указаны нуклеотидные замены у штаммов * группы В, приводящие к изменению положения сайтов рестрикции.

Штаммы группы В отличались наличием дополнительного сайта узнавания для рестриктазы С1а I, и появлением нового Hind III сайта, сопровождаемого исчезновением другого (рис. 17). Все эти изменения были связаны с «молчащими» единичными нуклеотидными заменами в последовательности гена prfA, не приводящими к аминокислотным заменам в белковом продукте. Таким образом, несмотря на выраженный полиморфизм фрагмента хромосомы, кодирующего PrfA, сам белок является консервативным для вида. L monocytogenes. Механизм контроля активности PrfA, который был изучен в данной работе преимущественно на материале трех штаммов из международных коллекций (штаммы NCTC 10527, EGD и Р14), по-видимому, также является консервативным. Последнее утверждение подтверждается наблюдениями того, что индукция продукции лецитиназы в присутствии активированного угля: характерна для всех штаммов L. monocytogenes, изолированных при скрининге продуктов питания в лаборатории легионеллеза

ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМИ, а также в целом ряде практических микробиологических лабораторий.

Выводы.

1. На модели Listeria monocytogenes доказана системная регуляция экспрессии факторов патогенности у факультативных внутриклеточных паразитов. Показано, что координация экспрессии генов патогенности осуществляется на уровне инициации транскрипции по принципу регулона..

2. Продемонстрировано, что эффективность инициации транскрипции регулона патогенности определяется функциональной активностью и внутриклеточной концентрацией регулятора транскрипции белка PrfA. Инициация транскрипции гена prM осуществляется с собственных промоторов и с промотора гена plcA, который контролируется белком PrfA.

3. Впервые установлено, что внутриклеточная концентрация PrfA увеличивается при переходе PrfA в активную форму вследствие экспрессии гепарг/А в составе бицистронного транскрипта с промотора гена plcA .

4. Продемонстрировано, что функциональная активность PrfA меняется в зависимости от внешних условий или в результате мутационных событий, приводящих к определенным аминокислотным заменам.

5. Установлен вклад генетических систем, функционирующих по типу «quorum sensing», в регуляцию экспрессии факторов патогенности у факультативных внутриклеточных паразитов.

6. Впервые показано, что метаболизирующие клетки L. monocytogenes продуцируют диффундирующий авторепрессор, который отрицательно регулирует экспрессию генов патогенности. Присутствие в среде культивирования неполярных адсорбентов приводит к связыванию авторепрессора и активации генов патогенности.

7. Установлено, что отрицательная регуляция генов патогенности осуществляется через снижение функциональной активности PrlA. Мутационные события, приводящие к конститутивной активации PrlA, нарушают функционирование механизма отрицательной регуляции.

8. Продемонстрировано, что нарушение механизма отрицательной регуляции изменяет вирулентные свойства L. monocytogenes:

- увеличивает инвазивность бактерий;

- приводит к существенному возрастанию вирулентности на модели = заражения куриных эмбрионов;

- меняет динамику инфекционного процесса на модели внутрибрюшинного заражения мышей, приводя к более быстрой диссеминации возбудителя на начальных этапах инфекции и к более ранней элиминации возбудителя из внутренних органов на поздних.

9. Предложена модель, в которой роль системы отрицательной регуляции, функционирующей по типу "quorum sensing", состоит в предохранении целостности эукариотической клетки, являющейся экологической нишей внутриклеточного паразита в организме теплокровного хозяина.

10.На основе предложенной модели регуляции экспрессии факторов патогенности разработан и внедрен в практику принципиально новый метод идентификации возбудителя листериоза L. monocytogenes. Метод основан на определении изменений в уровне лецитиназной активности в присутствии активированного угля, характерных только для L. monocytogenes, но не для других Listeria spp.

11.Установлено наличие дивергенции последовательности гена prfA у разных клональных линий вида L. monocytogenes при сохранении консервативной аминокислотной последовательности кодируемого им белка PrfA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ермолаева СА, Белый Ю.Ф., Маракуша Б.И, Тартаковский И.С., Прозоровский СВ. Факторы патогенности Listeria monocytogenes и их диагностическое значение. // Тез.Международного симпозиума по пищевым зоонозам. Москва. - 1995:- С. 1 Об

2. Варфоломеева НА, Ермолаева СА, Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Получение и характеристика мутантных штаммов Listeria monocytogenes, гиперпродуцирующих факторы патогенности. // Тез.Междунар. конференции Микробное разнообразие. Пермь-1996.-С. 19

3. Диденко Л.В., Константинова НД., Ермолаева С А., Варфоломеева НА, Тартаковский И.С. Ультраструктурное и иммуноцитохимическое исследование Listeria monocytogenes с разным уровнем продукции фосфатидилинозитол специфичной фосфолипазы С // Тез. Междунар. конференции Микробное разнообразие. Пермь - 1996. - С. 32

4. Варфоломеева НА, Ермолаева СА, Белый Ю.Ф., Диденко Л.В. и др. Получение и характеристика штамма Listeria monocytogenes, гиперпродуцирующего факторы вирулентности. // Тез. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. - 1997. - С. 186-187

5. Ermolaeva SA, Belyi Yu.F., Tartakovskii I.S. Effect of activation charcoal on expression of virulence factors by Listeria monocytogenes. II NATO ASI course "Molecular Microbiology". Birmingham, UK. - 1997 - p. 12.

6. Didenko L.V., Zavalishina L.E., Ermolaeva SA, Konstantinova N.D., Varfolomeeva N.A., Tartakovskii I A. Localization ofphosphatidyl-inositol specific phospholipase С and adenylate cyclase in wild type and mutant strains of Listeria monocytogenes IIXXXIX symposium ofthe Hystochemistry society. Jena, Germany. - 1997. - p.32

7. Ermolaeva SA, Varfolomeeva NA, Belyi Yu.F.,Tartakovskii I.S. Isolation and characterization. of a Listeria monocytogenes mutant strain hyperproducing virulence factors. // FEMS Microbiol. Lett. -1997. - V. 150. - p. 189-195.

8. Диденко Л.В., Ермолаева СА, Константинова Н.Д., Варфоломеева НА, Тартаковский И.С. Ультраструктурное и иммунноцитохимическое изучение штаммов Listeria monocytogenes с различными и уровнями продукции факторов патогенности. // Мол. Генет.МикробиолБирусол. -1998. - № 6. - С. 18-22

9. Ермолаева СА, Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов патогенности Listeria monocytogenes при выращивании на искусственных питательных средах. // Мат. Международного симпозиума «Листериоз на рубеже тысячелетий». - Покров. - 1999. - С. 143-144

10. Ermolaeva S.A., Belyi Yu.F., Tartakovskii IS. Characteristics of induction of virulence factor expression by activated charcoal in Listeria monocytogenes. II FEMS Microbiol. Lett.-1999- V.174.-p.l37-141

П.Ермолаева СА, Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Авторегуляция, экспрессии секретируемых белков у Listeria monocytogenes//ЖМЭИ. - 2000. - №5. - С.3-6

12. Ермолаева СА., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов патогенности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий. // Мол.Ген.Микробиол.Вирусол. 2000.-С. 17-19

13. Ермолаева С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes II Генетика. - 2001. - Т.37. - С. 286-293

14. Ермолаева СА., Тартаковский И.С. Регуляции экспрессии факторов патогенности у Listeria monocytogenesИЖМЭИ. - 2001. - №3. - С.106-110

15. Карпова Т.И, Ермолаева СА., Лопырев И.В, Бродинова Н.С., Тартаковский И.С, Васкез-Боланд ХА. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes II Клин. МикрАнгимикр.Хим. 2001. - Т.З. - С. 266-273

16. Тартаковский И.С, Шевелева СА., Карпова Т.И., Шустрова Н.М., Ермолаева СА. и др. Методические подходы к выделению и идентифи калии листерий в продуктах питания. // Сб. Профилактическая медицина - практическому здравоохранению. Вып. 1.ч.1 М.,2001.-С.92-94

17. Ермолаева С.А., Карпова Т.И., Тартаковский И.С Метод дифференциации возбудителя листериоза. // Тез. IV Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» Москва. - 2001. - С. 13

18. Ермолаева СА., Тартаковский И.С. Негативная регуляция экспрессии факторов патогенности у Listeria monocytogenes. // Мат. Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфеддта-Якоба и другие прионные болезги; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена». Покров. - 2001. - С. 127-129

19. Тартаковский И.С, Малеев В.В., Ермолаева СА Листерий: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // Медицина для всех. М.2002.195 с.

20. Карпова Т.И., Ермолаева СА, Тартаковский И.С., Салова НЛ., Голованова Т.И., Шестиперова Т.И. Новый метод идентификации Listeria monocytogenes, оенгованный на определении гидролиза лецитина в присутствии активированного угля // Тез. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва.-2002.-С 283

21. Тартаковский И.С., Карпова Т.Н., Попова ТА, Сыпченко А.Я., Шустрова Н.М., Снегирева А.Е., Ермолаева СА Оценка эффективности новых методов идентификации листерий при исследовании продуктов питания в Тульской области. // Мат. Научно-практических конференций, посвященных 55-летию сотрудничества ММА им.И.М. Сеченова и здравоохранения Тульской области. Тула. 2002. - С. 300

22. Государственный стандарт Российской Федерации Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeha monocytogenes. Госстандарт России. Москва. 2002.17 стр.

23. Методические указания МУК 4.2.1122-02. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. Минздрав России. Москва. 2002.31стр.

24. Тартаковский И.С., Ермолаева С А, Малеев В.В. Факторы патогенности Listeria monocytogenes и их роль в патогенезе и лабораторной диагностике. // ЖМЭИ. 2003. -№4.-С.31-37

25. Ермолаева СА, Карпова Т.И., Тартаковский И.С., Васзкез-Боланд ХА Метод дифференциации Listeria monocytogenes. Патент РФ N 2196827. 2003.

26. Карпова Т.Н., Фирсова Т.Е., Родина Л.В., Котляров В.М., Тартаковский И.С., Ермолаева СА Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности. // КлинМикрАнтимикр.Хим. 2003. - Т.5. - С. 251-258

27. Ermolaeva,. S., Karpova, Т., Novella, S., Scortti, M., Wagner, M.r Tartakovskii, I., Vazquez-Boland, J.A. A simple method for the rapid identification of Listeria monocytogenes based on the induction of lecithinase activity by charcoal. // IntJ.Food Microbiol. 2003. - V. 82. - p. 87-94

28. Сапенко Т.П., Ермолаева СА. Использование метода конформационного полиморфизма одиночных цепей ДНК для дифференциации Listeria- spp. // Сб. Профилактическая медицина - практическому здравоохранению. Вып.2, М. 2003. -С.364-368

29. Ermolaeva S., Karpova Т., Tartakovskiy I. Role of quorum sensing in regulation of virulence genes in intracellular parasites. // Abstr. EWGLIXIX. Chamonix, France - 2004. -P.89

30. Ermolaeva S., Novella S., Vega Y., Ripio M.T., Scortti M., Vazquez-Boland J.A. Negative control of Listeria monocytogenes virulence genes by a diffusible autorepressor. // Mol. Microbiol. 2004.-V. 52.-p. 601-611

Подписано в печать 8.07.2004 г. Формагг 60x90,1/16. Объем 2,75 пл. Тираж 100 экз. Заказ №250

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г Москва, ул. Русаковская, д. 1. т. 264-30-73 ■№^жЪ1ок01 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.

i 1674 S

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ермолаева, Светлана Александровна

1.1. Современные представления о механизме вирулентности Listeria monocytogenes..—.

1.1.1. Эпидемиология L. monocytogenes.

1.1.2. Таксономия и экология листерий.

1.1.3. Взаимодействие L. monocytogenes с макроорганизмом.

1.1.4. Роль бактериальных факторов патогенности во взаимодействии L. monocytogenes с клетками млекопитающих.

1.1.6. Регуляция экспрессии факторов патогенности.

1.2. Аутокринные механизмы регуляции экспрессии генов у патогенных бактерий

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования.

2.2. Конструирование плазмид.

2.4. Методы работы с нуклеиновыми кислотами.

2.5. Методы анализа экспрессии белков.

2.6. Методы анализа компонентов культуральной жидкости.

2.7. Методы, использованные для определения вирулентности на биологических моделях.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Координация экспрессии факторов патогенности на уровне регуляции транскрипции.^

3.1.1. Влияние условий культивирования на уровень продукции факторов патогенности L. monocytogenes.

3.1.2. В присутствии адсорбентов происходит увеличение уровня транскрипции генов PrfA-регулона.

3.1.3. Структурно-функциональные характеристики центрального регулятора генов патогенности L. monocytogenes PrfA.

3.1.4. В присутствии адсорбентов происходит переключение активности центрального регулятора генов патогенности PrfA.

3.2. Вклад аутокринных механизмов в регуляцию экспрессии факторов патогенности факультативных внутриклеточных паразитов на модели L. monocytogenes

3.2.1. L. monocytogenes продуцирует ауторепрессорную субстанцию, накопление которой приводит к репрессии PrfA-регулона.

3.2.2. L. monocytogenes обладает по крайней мере тремя генетическими системами типа quorum sensing.

33. Роль отрицательной регуляции экспрессии генов факторов патогенности в вирулентности L. monocytogenes.

3.4. Разработка новых подходов к идентификации и дифференциации L. monocytogenes, основанных на изучении регуляторных элементов, контролирующих экспрессию факторов патогенности.—.

3.4.1. Разработка метода идентификации L. monocytogenes, основанного на индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля.

3.4.2. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенносги.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria Monocytogenes"

Среди бактерий, способных к внутриклеточной пролиферации, особняком стоит группа факультативных внутриклеточных шфазитов, эффективно размножающихся как внутри эукариотической клетки, так и в объектах окружающей среды. Представители этой группы, распространенные практически повсеместно, отличаются экологической пластичностью и высокими адаптационными способностями, позволяющими им использовать разнообразные ресурсы и быстро перестраивать свой метаболизм в соответствии с изменением внешних условий. Последнее привело к развитию у представителей группы факультативных внутриклеточных паразитов сложных генетических систем регуляции, позволяющих включать и выключать экспрессию определенных групп генов, в том числе генов патогенности, в ответ на внеппше сигналы. Изучение этих регуляторных систем, помимо фундаментального, представляет несомненный практический интерес, так как является основой разработки принципиально новых подходов контроля и борьбы с бактериальными инфекциями (Воробьев, 1999; Бухарин, 1999; Воробьев и др., 2000; Alksne 2002; Projan, 2002). За последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в области изучения взаимоотношений внутриклеточных бактериальных пазитов и эукиотических клеток, выступаюпщх в роли хозяев. На стыке мшфобиологии, молекулярной биологии и клеточной биологии возникло две новые науки: молекулярная мшфобиология и клеточная мшфобиология. Молекулярно-биологические методы, которые ранее использовались преимущественно для изучения лабораторных моделей, таких как Escherichia coli и Bacilus subtilis, активно применяются для изучения патогенных бактерий. Их изучение показало, что адаптация на общих бактерий к внутриклеточному включающих размножению основана принципах, патогенности, координащпо экспрессии факторов эксплуатацию механизмов эукариотической клетки для собственных нужд, использование внутриклеточных ресурсов для размножения, однако осуществление этих принципов щ)оисходит по множеству оригинальных механизмов, специфических для каждого возбудителя (Гинзбург и др. 1999; Prosseda et al., 2002; Cossart et al., 2002; Titball et al., 2003). Типичным представителем группы факультативных внутриклеточных паразитов и удобной моделью для изучения внутриклеточного паразитизма является грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes. С L. monocytogenes связано возникновение тяжелых заболеваний человека и домашних животных. Основной путь распространения листериозной инфекции пищевой. Вспыпши заболевания, связанного с употреблением контаминированных продуктов, в последние годы приобретают характер эпидемий, включая десятки и, в отдельных случаях, сотни заболевших, причем уровень летальных исходов достигает 30-35 (Бакулов и Васильев, 1991;Карликановаидр., 1999;FarberandPeterkm, 1992). Попадая в организм человека оральным путем, листерии, в отличие от большинства возбудителей пищевых инфекций, быстро проникают в клетки кишечника и затем по кровяному руслу рапространяются и размножаются во внутренних органах, печени селезенке. Если иммунный ответ макроорганизма ослаблен, листерии распространяются далее, в частности, могут достигнуть и пересечь церебральный и плацентный бьеры, приводя к менингитам, менингоэнцефалитам и абортам. Вирулентность L. monocytogenes тесно связана с ее способностями паразипгировать внутри эукариотических клеток (для обзора см. Vazquez-Boland et al., 2001; Cossart 2000). Внутриклеточные паразиты попадают в клетку в результате фагоцитоза, общего процесса, который приводит к деградации содержимого фагосомы, если только фагоцитированная бактерия активно не изменяет его течение (Desjardins et al., 1994). Характерной чертой процесса инфекции L. monocytogenes является быстрое разрушение фагосомы в результате активности мембрано-литических ферментов, порообразующего токсина листериолизина О и фосфолипаз (для обзора см [Dramsi S.et al.,1996; Vazquez-Boland et al.,2001]). Успешный выход из разрушенной фагосомы является ключевым событием, после которого L. monocytogenes находится в цитоплазме, Аналогичную где она эффективно размножается и перемещается. используют стратегию внутриклеточного размножения Shigella flexneri и облигатные параз1ггы, относящиеся к роду biickettsia (Kocks et al., 1995., Goldberg Sansonetti., 1993.). Для внутриклеточного перемещения эти бактерии используют схожий механизм, эксплуатирующий фрагменты эукариотического цигоскелета, полимеризация которых является движущей силой, позволяющей не только перемещаться внутри клетки, но и проникать в соседние. Перемещение из одной клетки в другую происходит, когда бактерия, достигнув щггоплазматической мембраны, продолжает движение, формируя ламеллопоидное выпячивание мембраны. Бели рядом находится другая клетка, то содержащее бактерию выпячивание может быть захвачено ею (Cossart Kocks, 1994; Cossart, 2003). Этот хфоцесс заканчивается образованием двойной фагосомы, внутренняя мембрана которой принадлежит старой клетке-хозяину, а внешняя новой. Лизис двойной мембраны начинает новый Щ1кл инфекции (для обзора см. [Cossart et al., 1994, 2000; Vazquez-Boland et al., 2001]). Таким образом, L. monocytogenes и другие бактерии со схожим внутриклеточным циклом, способны распространяться по тканям и органам макроорганизма, не покидая внутриклеточное пространство. За последние 20 лет были идентифицированы продуцируемые L. monocytogenes белковые факторы, необходимые на разных стадиях процесса взаимодействия с клеткой хозяина (Leimeister-Wachter Chakraborty, 1989; Mengaud et al., 1991a; Mengaud et al., 1991b; Vazquez-Boland et al., 1992; Portnoy et al., 1992). Гены, их кодирующие, образуют на хромосоме L. monocytogenes несколько островков патогенности (Cossart et al,,1994; Glaser et al., 2001; Vazquez-Boland et al., 2001b). Координация экспрессии генов, кодирующих факторы патогенности, достигается благод)я активности положительного регулятора транскрипции белка PrfA. (Mengaud et al., 1991; Kathariou et al., 1990; Freitag et al., 1993). Наблюдения регуляторных событий, связанных с присутствием источников углерода, щоковыми

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ермолаева, Светлана Александровна

Выводы.

2. Продемонстрировано, что эффективность инициации транскрипции регулона патогенности определяется функциональной активностью и внутриклеточной концентрацией регулятора транскрипции белка PrfA. Инициация транскрипции гена prfA осуществляется с собственных промоторов и с промотора гена pic А, который контролируется белком PrfA.

3. Впервые установлено, что внутриклеточная концентрация PrfA увеличивается при переходе PrfA в активную форму вследствие экспрессии гена prfA в составе бицистронного транскрипта с промотора гена plcA .

7. Установлено, что отрицательная регуляция генов патогенности осуществляется через снижение функциональной активности PrfA. Мутационные события, приводящие к конститутивной активации PrfA, нарушают функционирование механизма отрицательной регуляции.

- увеличивает инвазивность бактерий;

- приводит к существенному возрастанию вирулентности на модели заражения куриных эмбрионов;

- меняет динамику инфекционного процесса на модели внутрибрюшинного заражения мышей, приводя к более быстрой диссеминации возбуд ителя на начальных этапах инфекции и к более ранней элиминации возбудителя из внутренних органов на поздних.

Ю.На основе предложенной модели регуляции экспрессии факторов патогенности разработан и внедрен в практику принципиально новый метод идентификации возбудителя листериоза L. monocytogenes. Метод основан на определении изменений в уровне лецитиназной активности в присутствии активированного угля, характерных только для L. monocytogenes, но не для других Listeria spp.

11 .Установлено наличие дивергенции последовательности гена prfA у разных клональных линий вида L. monocytogenes при сохранении консервативной аминокислотной последовательности кодируемого им бежа PrfA.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ермолаева, Светлана Александровна, Москва

1. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросы диагностики и профилактики. Учебное пособие. Ульяновск, 1991.

2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М. Медицина; Екатеринбург: УрОРАН. 1999.

3. Воробьев А. А. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов. 1999. ЖМЭИ. № 5. 16-21

4. Воробьев А. А., Гинцбург А.Л., Бондаренко В.М. Мир микробов. 2000. Веста. РАМЫ №11. 11-14

5. Гинцбург А.Л., Зигангирова Н.А., Романова Ю.М. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии. 1999. ЖМЭИ. № 5. 22-32

6. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. "Quorum sensing@ или социальное поведение бактерий. 2003. ЖМЭИ. №5: 86-93

7. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В. Клонирование и экспрессия гена фосфатидилинозитолспецифичной фосфолипазы С Listeria monocytogenes. 1994. Мол. Ген.Микробиол.Вирусол. №6:310

8. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова Н.С. Листерии в молоке и молочных продуктах. 1999. Москва Углич.

9. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.С. Листерии критерий безопасности мясных продуктов. 1997. Мясн. Индустр. 3:23-24

10. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г. А., Дьяков Ю.Т. Патогенные листерии в почве и ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. 1997. ЖМЭИ №3: 3-10

11. Alksne L. Е. Virulence as a target for antimicrobial chemotherapy. Expert Opin Investig Drugs. 2002. 11:1149-1159

12. Beauregard K.E., Lee K., Collier R.J., Swanson J.A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by Listeriolysin О from Listeria monocytogenes. J.Exp.Med. 1997. 186: 1159-1163

13. Bierne H. A role for cofilin and LIM kinase in Listeria-induced phagocytosis. 2001. J. Cell. Biol. 155:101-112

14. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganisms. 1996. Springer-Verlag GmbH&Co.KG

15. Bockman R., Dickneite C., Goebel W., Bohne J. PrfA mediates specific binding to RNA polymerase of Listeria monocytogenes to PrfA-dependent virulence gene promoters resulting in a transcriptionally active complex. 2000. Mol. Microbiol. 36:487-497

16. Bohne J., Kestler H., Uebele C. et al., Differential regulation of the virulence genes of Listeria monocytogenes by the transcriptional regulator PrfA. Mol. Microbiol. 1996. V. 20, p. 1189-1198

17. Braun L., Dr amsi S., Dehoux P., Bierne H., Lindahl G., Cossart P. InlB: an invasion protein of Listeria monocytogenes with a novel type of surface assotiation. 1997. Mol.Microbiol. 25: 285-294

18. Braun L., Ohayon H., Cossart P. The InlB protein of Listeria monocytogenes is sufficient to promote entry into mammalian cells. 1998. Mol. Microbiol. 27:1077-1087

19. Braun L., Ghebrehiwet В., Cossart P. gClq-R/p32, a Clq-binding protein is a receptor for the InlB invasion protein of Listeria monocytogenes. 2000. EMBO J. 19:1458-1466

20. Brehm K., Ripio M.T., Kreft J., Vazquez-Boland J.A. The bvr locus of Listeria monocytogenes mediates virulence gene repression by (3glucosides. 1999. J. Bacterid. 181: 5024-5032

21. Bubert a., Sokolovic Z., Chun S.K. et al. Differential expression of Listeria monocytogenes virulence gennes in mammalian cells. 1999.Mol. Gen. Genet. 261: 323336

22. Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P. Auto, a surface associated autolysin of Listeria monocytogenes required for entry into eucaryotic cells and virulence. 2004. Mol. Micrbiol. 51:1601-1614

23. Camilli A., Goldfine H., Portnoy D. Listeria monocytogenes mutants lacking phosphatidylinositol-specific phospholipase С are avirulent. 1991. J. Exp. Med. 173:751754

24. Camilli A., Tilney G., Portnoy D. Dual role ofplcA in Listeria monocytogenes pathogenesis. 1993. Mol. Microbiol. 8: 143-157

25. Chen X., Schauder S., Potier N., Van Dorsselaer A., Pelczer I., Bassler B.L., Hugson F.M. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 2002 415:545-549

26. Collins M.D., Wallbanks S., Lane D.J., Shah J., Nietupski R., Smida J., Dorsch M., Stackebrandt E. Phylogenetic analysis of the genus Listeria based on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:240-246

27. Conlan J.C., Narth R.J. Neutrophil-mediated dissolution of infected host cells as a defecnce strategy against a facultative intracellular bacterium. 1991. J.Exp.Med. 174:741-744

28. Cossart P. Actin-based bacterial motility. 1995. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 94-101

29. Cossaral P. Actin-bsed motility of pathogens: the Arp2/3 complex is a central player. 2000. Cell.Microbiol. 2:195-205

30. Cossart P. Molecular and cellular basis of the infection by Listeria monocytogenes: an overview. Int J Med Microbiol. 2002 291:401-409

31. Cossart P., Dramsi T. Intacellular pathogensand the actin cytosceleton. 1998. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 14:137-166

32. Cossart P., Lecuit M, Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. 1998. EMBO J. 17: 3797-3806

33. Cossart P.,Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. 1994. Molecular Microbiol.,13:395-402

34. Desjardins M., Huber L.S., Parton R.G., Griffiths G. Biogenesis of phagolysosomes proceeds through a sequential series of interactions with the endocytic apparatus. J. Cell Biol. 1994. Vol. 124. P. 677-688

35. Dickneite C., Bockmann R., Spory A., Goebel W., Sokolovic Z. Differential interaction of the transcription factor PrfA and the PrfA-activating factor (Paf) of Listeria monocytogenes with targets sequences. 1998. Mol. Microbiol. 27:915-928

36. Dramsi S., Koks C., Forestier C., Cossart P. Internalin-mediated invasioin of epthalial cells by Listeria monocytogenes is regulated by the bacterial state, temperature and the pleiotropic activator PrfA. 1993. Mol. Microbiol. 9:931-941

37. Dramsi S., Lebrun M., Cossart P. // Curr. Top. Microbiol. Immun. 1996. - Vol. 209. -P. 61-77

38. Dufor P., Jarraud S., Vandenesch F., Greenland Т., Novick P.R., Bes M., Etienne J., Lina G. High genetic variability of the agr locus in Staphylococcus species. J Bacterid. 2002 Feb; 184(4): 1180-6

39. Dumont J. & Cotoni L. Bacille semblable к celui du rouget du pore rencontre dans le L.C.R. d'un mdningitique. 1921. Ann. Inst. Pasteur 35: 625-633

40. Dunny G.M., Leonard B.A.B. Cell-cell communication in gram-positive bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1997. 51:527-564

41. Engelbrecht J., Silverman M. Nucleotide sequence of the regulatory locus controlling expression of bacterial genes for bioluminescence.Nucleic Acids Res. 1987. 15(24): 10455-67

42. Farber J.M., & Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne patyhogen. 1991. Microbiol. Rev 55: 476-511

43. Fischetti V.A., Pancholi V., Schneewind O. Conservation of a hexapeptide sequence in the ancor region of surface proteins fron gram-positive cocci. 1990. Mol. Microbiol. 4:1603-1605

44. Freitag N.E., & Jakobs K.E. Examination of Listeria monocytogenes intracellular gene expression by using the green fluorescent protein of Aequorea victoria. 1999. Infect. Immun. 67: 1844-1852

45. Freitag N.E., Rong L., Portnoy D. Regulation of prfA transcriptional activator of Listeria monocytogenes: multiple promoter elements contribute to intracellular growth and cell-to-cell spread. 1993. Infect. Immun.61: 2537-2544

46. Freitag N., Portnoy D. Dual promoters of Listeria monocytogenes prfA transcriptional activator appear essential in vitro but are redundant in vivo. 1994. Mol. Microbiol. 12:845-853

47. Gaillard J.L., AloufJ.E., Berche P., 1989. Production of thiol-dependent haemolysins by Listeria monocytogenes and related species. J.Gen.Microbiol. 135:481-487

48. Gaillard J.L., Berche P., Frehel et al. Entry of Listeria monocytogenes into cells is mediated by intemalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. 1991. Cell. 65: 1127-1141

49. Geffroy. C., Gaillard, J.-L., Alouf, J. and Berche, P. Purification, characterization and toxicity of the sulfhydryl-activated hemolysin listeriolysin 0 from Lisleriii monocytogenes. 1987. Infect. Immun. 55,1641-1646

50. Gilson L., Kuo A., Dunlap P.V. AinS and a new family of autoinducer synthesis proteins. J Bacteriol. 1995.177:6946-51

51. Glaser P., Frangeul L., Buchrieser C., et al. Comparative genomics of Listeria species. 2001. Science. 294:849-852

52. Goldberg M.B., Sansonetti. P.J. Shigella subversion of the cellular cytosceleton: a strategy for epithelial colonization. Infect Immun. 1993. Vol. 61. P.4941-4946

53. Goldfine H., Knob C. Purification and characterization of Listeria monocytogenes phospahtidylinositol-specific phospholipase C. 1992. Infect. Immun. 60:4059-4067

54. Goldfine H., Johnston C., Knob C. Non-specific phopsholipase С of Listeria monocytogenes: activity on phospholipids in Triton Х-100-mixed micelles and in biological membranes. 1993. J. Bacteriol. 175:4298-4306

55. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect Immun 1994; 62:3550-355

56. Greene S.L., Freitag N. Negative regulation of PrfA, the key activator of Listeria monocytogenes virulence gene expression, is dispensable for bacterial pathogenesis. 2003. Microbiology, 149: 111-120

57. Hitchins A.D. FDA Bacteriological Analytical Manual, Listeria monocytogenes. 8th edition, 1995.

58. Holden I., Swift I., Williams P. New signal molecules on the quorum-sensing block.Trends Microbiol. 2000 Mar;8(3): 101-4

59. Ireton K., A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. 1996. Science. 274:780-782

60. Ireton K.,Cossart P. Host-pathogen interactions during entry and actin-based movement of Listeria monocytogenes. 1997. Annu.Rev.Genet. 31:113-138

61. Ireton K., The Listeria monocytogenes protein InlB is aqn agonis of mammalian phosphoinositide 3-lrinase.l999. J. Biol. Chem. 274:17025-17032

62. Ji G., Beavis R., Novick P.R. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants. Science. 1997 Jun 27;276(5321):2027-30

63. Johansson J., Mandin P., Renzoni A., Chiaruttini C., Springer M., Cossart P. An RnNA thermosensor controls expression of virulence genes in Listeria monocytogenes. 2002. Cell. 110: P. 551-561

64. Jones S., Preiter K., Portnoy D. A. Conversion of an extracellular cytolysin into a phagosome-specific lysine which supports the growth of an intracellular pathogen 1996. Mol. Microbiol. 21:1219-1225

65. Jonquieres R., Synergy between the N- abd C-terminaJ domains of InlB for efficient invasion of non-phagocyting cells by Listeria monocytogenes. 2001. Mol. Microbiol. 42:955-965

66. Kaplan H.B., Greenberg E.P. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. JBacteriol. 1985 Sep; 163(3): 1210-4

67. Karunasagar I., Senghaas В., Krohne G., Goebel W. Ultrastructural study of Listeria monocytogenes entry into cultured human colonic epithelial cells. 1994. Inf. Immun. 62: 3554-3558

68. Kathariou S., Pine L., George V., Carlone G.M., Holloway B.P. Nonhemolytic Listeria monocytogenes mutants that are also noninvasive for mammalian cells: evidence for coordinate regulation of virulence. 1990. Infect. Immun 58: 3988-3995

69. Kocks C., Gouin E., Tabouret M., Berche P., Phayon H., Cossart P. Listeria-induced actin-assembly requires the actA gene product, a surface protein. 1992. Cell. 62:521-531

70. Kreft J., Vazquez-Boland J.A., Ng. E., Goebel W. p. 219-232. In. J. Kaper, and J. Hacker (ed.) Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. 1999. ASM, Washington D.C.

71. Lecuit M, Ohayon H., Braun L., Mengaud J., Cossart P. Internalin of Listeria monocytogenes with an intact leucine-rich repeat region is sufficient to promote internalization. 1997. Inf. Immun. 65: 5201-5319

72. Lecuit et al. A role for a- and p-catenins in bacterial uptake. 2000. PNAS/ 97:1000810013

73. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. Detection of a gene encoding of phosphatidyl-inositol-specificphospholipase С that is coordinately expressed with listeriolysin in Listeria monocytogenes. 1991. Mol. Microbiol. 5:361-366

74. Leimeister-Wachter M., Chakraborty T.Detection of listeriolysin, the thiol-dependent hemolysin in Listeria monocytogenes, Listeria ivnovii and Listeria seeliogeri. 1989.1nf. Immun. 57:2350-2357

75. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated. 1992. J. Bacteriol. 174: 947-952

76. Lupas A Prediction and Analysis of Coiled-Coil Structures. Methods in Enzymology, 1996. 266, 513-525,

77. Lyon W.R., Madden J.C., Levin J.C., Stein J.L., Caparon M.G. Mutation of luxS affects growth and virulence factor expression in Streptococcus pyogenes.

78. Mol Microbiol. 2001.42.145-57

79. Makrides S. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. 1996. Microbiol.Rev. 60:512-538

80. Marco A.J., Altimira J., PratzN., Lopez S., Dominguez L., Domingo M., Briones V. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. 1997. Microb. Pathog. 23:255-263

81. Marco A.J., Pratz N., Ramos J.A., Briones V., Blanco M., Dominguez L., Domingo M. A microbioal, histopathological and immunohistological study of the intragstric inoculation of Listeria monocytogenes i mice. 1992. J.Comp.Pathol. 107:1-9

82. Marino M. et al. Structure of InlB leucine-rich repeats, a domain that trigger host cell invasion by bacterial pathogen Listeria monocytogenes. 1999. Mol. Cell. 4:1063-1072

83. Marquis H., Doshi V., Portnoy D. A. The broad-range phospholipase С and a metalloprotease mediate listeriolysin O-independent escape of Listeria monocytogenes from a primary vacuole in human epithelial cells. 1995. Inf. Immun. 63:4531-4534

84. Marquis H., Hager E. pH-regulated activation and release of a bacetria-assotiated phopsholipase С during intracellular infection by Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 2000. 35:289-298

85. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa.

86. J Bacteriol. 2000. 182:2702-8

87. M ekalanos J.J. Environmental signals controlling expression of virulence determinants in bacteria. 1992. J. Bacteriol. 174: 1-7

88. Mengaud J., Braun-Breton C., Cossart P. Identification of phoaphatidylinositol-specific phopsholipase С in Listeria monocytogenes: a novel type of virulence factor? 1991a. Mol. Microbiol. 5.367-372

89. Mengaud J., Dramsi S., Gouin E., Vazuqez-Boland J.A., Milon G., Cossart P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. 1991b. Mol. Microbiol. 5: 2273-2283

90. Mengaud J., Ohayon H., Gounon P., Mege R. Cossart P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of Listeria monocytogenes into epithelial cells. 1996. Cell. 84:923-932

91. Milenbachs A.A., Brown D.P., Moors M., Youngman P. Carbon source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. 1997. Mol. Microbiol. 23:10751085

92. MilohanicE., Jonquiere R., Cossart P., Berche P., Gaillard J.L. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eucaryotic cells via its cell wall anchor. 2001. Mol. Microbiol. 39: 1212-1224

93. Moors M., Levit В., Youngman P., Portnoy D. Expression of listeriolysin О and ActA by intracellular Listeria monocytogenes. 1999. Infect Immun. 67: 131-139

94. Montes L.R., Goni F., Johnston N., Goldfine H., Alonso A. Membrane fusion induced by the catalytic activity of a phospholipase C/sphingomyelinase from Listeria monocytogenes. 2004. Biochemistry, 43:3688-3695

95. Morfeldt E., Tegmark K., Arvidson S. Transcriptional control of the agr-dependent virulence gene regulator, RNAIII, in Staphylococcus aureus.

96. Mol Microbiol. 1996.21:1227-37

97. O'Sullivan D.J.O., Klaenhammer T.R. High- and low-copy number Lactococcus shuttle cloning vectors with features for clone screening. 1993. Gene. 137:227-231

98. Ohtani K., Hayashi H., Shimizu T. The luxS gene is involved in cell-cell signalling for toxin production in Clostridium perfringens.

99. Mol Microbiol. 2002. 44:171-9

100. Park S.F., & Kroll R.G. Expression of listeriolysin and phosphatidyl-inositol specific phospholipase С is repressed by the plant-derived molecule cellobiose in Listeria monocytogenes. 1993. Mol. Microbiol. 8: 653-661

101. Park S.F., Stewart G.S. High-efficiency transformation of Listeria monocytogenes by electroporation of pemcillintreted cells. Gene. 1990. 94. 129-132

102. Pine L., Weaver R.E, Carlone G.M., et al. Listeria monocytogenes ATCC35152 and NCTC7973 contain a nonhemolytic, nonvirulent variant. J Clin Microbiol 1987; 25:2247-2251

103. Portnoy D., Chakraborty Т., Goebel W., Cossart P. Molecular determinatnts of Listeria monocytogenes pathogenesis. 1992. Inf. Immun. 60:1263-1267

104. Portnoy D., Jacks P.S., Hinrich D.J. Role of hemolysin for intracellular growth of Listeria monocytogenes. 1988. J. Exp. med. 167: 1459-1471

105. Portnoy D., Tweten R.K., Kehoe M., Bieleki. Capacity of listeriolysin O, streptolysin О and prefringolysin О to mediate growth of Bacillus subtilis within mammalian cells. Inf. Immun. 1992. 60. 2710-2717

106. Portnoy D.A. Innate immunity to a facultative intracellular bacterial pathogen. 1992. Curr. Opn. Immunol. 4: 20-24

107. Projan S. J. New (and not so new) antibacterial targets from where and when will the novel drugs come? Curr Opin Pharmacol. 2002. 2:513-522

108. Prosseda G., Falconi M., Nicoleti M, CasalinoM., Micheli G., ColonnaB. Histone-like proteins and the Shigella invasivity regulon. Res Microbiol. 2002. 153: 461468

109. Racz P., Tenner К., Mero E. Experimental Listeria enteritis. An electron microscopic study of the epitherlial phase in experimental Listeria infection. 1972. Lab. Invest. 26: 694-700

110. Reed L.J., Muench L. // Am.J.Hyg. 1938. - Vol.27. - P. 493497

111. Renzoni A., Cossart P., Dramsi S. PrfA, the transcriptional regulator of virulence genes, is upregulated during interaction of Listeria monocytogenes with mammalian cells and in eucaryotic cell extracts. 1999. Mol. Microbiol. 34:552-561

112. Renzoni A., Klarsfeld A., Dramsi S., Cossart P. Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present buit inactive. 1997. Infect. Immun. 65: 1515-1518

113. Robbins J.R., Barth A.I., Marquis H., de Hostos E.L., Nelson W., Theriot J. Listeria monocytogenes exploits normal host cell processes to spead from cell to cell. 1999. J. Cell Biol. 146: 1333-1349

114. Rost B. PROF: predicting one-dimensional protein structure by profile based neural networks, unpublished, 2000

115. Sapenko Т., Ermolaeva S. 2004. Abstract ISOPOL XV. Uppsala, Sweeden.

116. Schneewind O., Fowler A., Faull К/F/ Structure of the cell wall anchor of of surface protein of Staphylococcus aureus/1995. Science . 268:103-106

117. Schuchat A., Deaver K.A., Wenger J.D. et al. Role of foods in sporadic listeriosis. I. Case-control study of dietary risk factors. 1992. JAMA. 267:20412045

118. Schwartz В., Hexter D., Broome C.V. et al. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections. 1989. J. Infect Dis. 159: 680-685

119. Seeliger H.P.R. Listerioses 1958. Springer-Verlag KG, Berlin

120. Seeliger H.P.R. Listeriosis history and actual development 1988. Infection. 16: S80-S84

121. Sheehan В., Klarsfeld A., Msadek Т., Cossart P. Differential activation of virulence gene expression by PrfA, s Listeria monocytogenes virulence gene regulator. 1995. J. Bacterid. 177:6469-6476

122. Sheehan В., Klarsfeld A., Ebright R, Cossart P. A single substitution in the putative helix-turn-helix motiv of the pleiotropic activator PrfA attenuates Listeria monocytogenes virulence. 1996. Mol. Microbiol. 20: 785-797

123. Sheehan B.,Kocks QDramsi S.,Gouin E.JGarsfeld A.D.,Mengaud J.,Cossart P. Molecular and Genetic Determinantss of the Listeria monocytogenes infectious process. 1994.,Current Topics in microbiology and immunology.,192:187-216

124. Shetron-Rama L.M., Mueller K., Bravo J.M., Bouwer H., Way S., Freitag N. Isolation of Listeria monocytogenes mutants with high-level in vitro expression of host cytosol-induced gene products. 2003. Mol. Microbiol. 48:1537-1551

125. Showalter R.E., Martin M.O., Silverman M.R. Cloning and nucleotide sequence of luxR, a regulatory gene controlling bioluminescence in Vibrio harveyi.

126. J Bacteriol. 1990 .172. 2946-54.

127. Smith G.A., Marquis H., Jones S., Johnston N.C., Portnoy D.A., Goldfine H. The two distinct phospholipase С of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. 1995. Infect. Immun. 63: 4231-4237

128. Smith R.S., Iglewski B.H. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence. CurrOpin Microbiol. 2003. 6:56-60.

129. Sneath P.H. A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of Systematic bacteriology. 9th Ed. Vol.2. 1986 Williams and Wilkins, Co., Baltimore. MD

130. Stroeher U.H., Paton A.W., Ogunniyi A.D., Paton J.C. Mutation of luxS of Streptococcus pneumoniae affects virulence in a mouse model.1.fect Immun. 2003. 71:3206-12

131. Surette M., Miller M., Bassler B. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 96:1639-44

132. Suzuki Т., Miki H., Takenawa Т., Sasakawa C. Neural Wiscott-Aldrich syndrome protein is implicated in the actin-based motility of Shigella flexneri. 1998. EMBO J. 17:2767-2776

133. Titball R.W., Johansson A., Foreman M. Will the enigma of Francisella tularensis virulence soon be solved? Trends Microbiol. 2003. 11:118-123.

134. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty Т., Dominguez-Bernal G., Goebel W., Gonzalez-Zorn В., Wehland J., Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. 2001. Clin. Microbiol. Rev. 14: 584-640

135. Vazquez-Boland J.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn В., Kreft J., Goebel W. Pathogenicity islands and virulence evolution in Listeria. 2001b. Microb. Inf. 3: 571584

136. Vazquez-Boland J.A., Kocks C., Dramsi S., Ohayin H., Geoffroy C., Mengaud J., Cossart P. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread. 1992. Inf. Immun. 60 219-230

137. Weis J. & Seeliger H.P.R. Incidence of Listeria monocytogenes in nature. 1975. Appl. Microbiol. 30:29-32

138. Williams J., Thayyullathil C., Freitag N. Sequence variations within Рт£А DNA binding sites and effects on Listeria monocytogenes virulence gene expression. 2000. J. Bacterid. 182:837-841

139. Winzer K., Williams P. Quorum sensing and the regulation of virulence gene expression in pathogenic bacteria. Int J Med Microbiol. 2001 May;291(2):131-43

Информация о работе

Ермолаева, Светлана Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria Monocytogenes - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы