Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу

Юров, Дмитрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу"

На правах рукописи

Юров Дмитрий Сергеевич

Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 200$ 2 ДЕК 2008

003456804

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Ермолаева Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович доктор медицинских наук Белый Юрий Федорович

Ведущая организация:

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава

Защита диссертации состоится " ¡9 " декабря 2008 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан " ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Актуальность работы

Размножение патогенных бактерий внутри макроорганизма требует от них способности адаптироваться к условиям существования, кардинально отличающимся от внешней среды. Далеко не все эти факторы благоприятны для существования микроорганизма, и даже в целом к благоприятным факторам требуются эффективная адаптация. Внимание исследователей, работающих в области медицинской микробиологии, в течение многих лет было приковано к изучению продуцируемых бактериями факторов патогенности, влияющих на структуры и функции макроорганизма, исследованию молекулярных механизмов их активности и роли в развитии инфекционного процесса. Результаты многочисленных экспериментов доказывают, что, помимо продукции специфических факторов патогенности, существование внутри организма требует от бактерий существенных перестроек общего метаболизма (Chico-Calero et al., 2002; Lucchini et al., 2005; O'Riordan et al., 2003).

Изучение механизмов адаптации к условиям размножения в ходе инфекционного процесса, связанных с изменениями общего метаболизма бактерий, имеет фундаментальный интерес как само по себе, так и для понимания механизмов становления патогенности как явления. Вместе с тем, изучение перестроек метаболизма, необходимых для эффективного размножения in vivo, имеет и большое практическое значение как подход к созданию аттенуированных штаммов, обладающих высокой иммуногенностью при сохранении антигенных детерминант, но не способных индуцировать инфекционный процесс.

Грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes вызывает листериоз - тяжелое заболевание людей и животных, связанное с поражением центральной нервной системы и/или плода у беременных (Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский И.С. и др., 2002). В связи с широким распространением и высокой летальностью (до 30%) листериоз является серьезной проблемой для медицины (Тартаковский И.С. и др., 2002; Зайцева Е.А. и др., 2007). Кроме

того, листериоз является важной проблемой для ветеринарии, вызывая эпизоотии среди мелкого и крупного рогатого скота (Бакулов И.А. и др., 1994; Czuprynski, 2005).

L. monocytogenes относится к числу факультативных внутриклеточных паразитов. В процессе инфекции L. monocytogenes проникает в эукариотические клетки путем естественного или индуцированного (в случае непрофессиональных фагоцитов) фагоцитоза. Попавшая в фагосому бактерия разрушает фагосомальную мембрану и выходит в цитоплазму, где размножается с высокой эффективностью (Portnoy et al., 1992; Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский И.С. и др. 2002).

Помимо факторов патогенности, влияющих на функции эукариотической клетки, таких как листериолизин О, фосфолипазы, фактор полимеризации актина ActA и др., в ходе инфекции L. monocytogenes продуцирует некоторые белки общего метаболизма, необходимые для ее адаптации к размножению внутри макроорганизма. Например, для участвующего в импорте глюкозо-1-фосфата белка Hpt доказана роль в адаптации к размножению внутри цитоплазмы и в вирулентности (Chico-Calero et al., 2002). Однако до настоящего времени роль в инфекционном процессе белков общего метаболизма изучена недостаточно, равно как и адаптационные механизмы, позволяющие бактериям колонизировать макроорганизм, эффективно используя его ресурсы и приспосабливаясь к микроокружению.

Цель работы - выявление и идентификация белков, обеспечивающих адаптацию L. monocytogenes к размножению в макроорганизме, и оценка возможности аттенуации L. monocytogenes путем делеции кодирующих их генов.

Для постижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать критерии для проведения биоинформационного анализа и провести анализ базы данных, содержащей последовательность генома L. monocytogenes, с целью идентификации открытых рамок считывания

(ОРС), продукты которых могут быть вовлечены в процесс адаптации к размножению в макроорганизме:

- провести инсерционпый мутагенез кандндатных ОРС для выявления мутации, приводящих к уменьшению вирулентности L. monocytogenes, на модели экспериментального лпетерноза у лабораторных мышей;

- получить и охарактеризовать мутантные штаммы L. monocytogenes с делением генов, инсерции в которых приводят к снижению вирулентности;

- оценить вирулентность н способность к внутриклеточному размножению штаммов L. monocytogenes, с делениями генов, идентифицированных в ходе данной работы.

Научная новизна н практическая значимость.

- Разработаны критерии бпоинформационного поиска, позволившие выявить ОРС. нарушение целостности которых в результате инсерции приводит к изменениям вирулентности L. monocytogenes. Впервые на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей показано, что инсерции в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе у лабораторных мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то()961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

- Установлено, что инсерция в опероне 1то2075 - 1то2078 приводит к увеличению вирулентности мутантпых бактерий in vivo, но снижает способность L. monocytogenes расти in vitro в аэробных условиях, которая восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.

- Показано, что мутации в гене !то()028, кодирующем L,D-карбокенпептидазу, приводят к появлению удлиненных (до 10 раз по сравнению с бактериями дикого типа) бактериальных клеток при выращивании листсрий in vitro на твердых питательных средах, но не в бульоне.

- Показано, что удлинение бактериальных клеток, мутантных по гену 1то0028, коррелирует с увеличением количества генетического материала,

содержащегося в одной колониеобразующей единице, что свидетельствует о присутствии нескольких копий генома в одной бактериальной клетке. Таким образом, впервые для грам-положительных бактерий доказано участие ЦБ-карбоксипептидазы в процессе расхождения бактериальных клеток после деления.

- Показано, что мутация в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, нарушает процесс бактериального деления при размножении листерий внутри цитоплазмы эпителиальных клеток.

- Показано, что инактивация гена 1то0028 приводит к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у мышей линии BALB/c. При этом аттенуация не связана с изменением уровня продукции основных факторов патогенности (LLO и PlcA) и/или цитотоксичности, и, по-видимому, связана с ролью кодируемой геном 1то0028 ЬДЗ-карбоксипептидазы в бактериальном делении в процессе внутриклеточного размножения.

Полученные результаты могут быть использованы для получения аттенуированных штаммов других видов бактерий путем введения сайт-специфических мутаций в гены, кодирующие Ь,0-карбоксипептидазы, как предложено в методических рекомендациях «Получение аттенуированных штаммов бактерий в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего Ь,0-карбоксипептидазу», утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН «27» октября 2008 г.

Материалы диссертации представлены на IV-м Московском Международном Конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития« (Москва, 2007). на TI-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», (Рязань, 2007).

Материалы диссертации отмечены медалью Конгресса на конкурсе молодых ученых на IV-м Московском Международном Конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела природноочаговых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 19 июня 2008 года.

Публикации

По данной теме опубликовано 5 печатных работ. 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (28 отечественных и 155 зарубежных источников). Работа изложена на 119 страницах, проиллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы

Биоинформацпоннын анализ применяли для поиска предполагаемых пептидаз L. monocytogenes. Для поиска пептидаз в базе данных, содержащей геном L. monocytogenes, использовали программу BLAST. Отбирались ОРС L. monocytogenes, для которых оценка гомологии с белками рода Staphylococcus была не более 10° (e-value<10"3). Предсказание трансмембранных доменов и расположения молекулы белка относительно плазматической мембраны определяли с помощью web-приложения PredictProtein (http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/).Наличие регуляторной области, характерной для генов, кодирующих факторы патогенности L. monocytogenes (PrfA-box) определяли по (Glaser et al., 2001).

В работе использовали штаммы L. monocytogenes: EGDe (дикий тип), любезно предоставленный профессором J.A.Vazquez-Boland, University

Complutence, Испания; производные штамма EGDe: GIM0028, GIM0961, GIM1493 и GIM2077 с инсерцией в генах 1то0028,1то09б1,1то1493 и 1то2077 соответственно; штамм GIMd0028 - производный штамма EGDe с делецией гена 1т0028. В качестве промежуточного хозяина при создании генно-инженерных конструкций использовали штамм Escherichia coli JM 109. В работе были использованы плазмиды: pGEM®-T Easy Vector (вектор, несущий ген устойчивости к амппициллину), pTRKL2 (шаттл-вектор, содержащий ген устойчивости к эритромицину), pLSVl (шаттл-вектор, содержащий ген устойчивости к эритромицину), pL0028 (pTRKL2::lmo0028).

Listeria spp. выращивали в среде Brain-Heart Infusion (BHI) (BD, США), E. coli - в среде LB (BD, США) при 37°C с шутелированием. Рекомбинантные штаммы, содержащие плазмиды pTRKL2 и pLSVl, культивировали в присутствии эритромицина (300 мкг/мл для Е. coli и 10 мкг/мл для L. monocytogenes).

Штаммы Е, coli, содержащие плазмиду pGEM®-T Easy, культивировали в присутствии ампициллина 200 мкг/мл.

Трансформация Е. coli и L. monocytogenes осуществлялась методом электропорации как описано в руководстве, приложенном к прибору фирмы BioRad.

Выделение хромосомной ДНК L. monocytogenes осуществлялось на твёрдый носитель с помощью набора Wizard®Genomic DNA PURIFICATION KIT (Promega).

Выделение плазмидной ДНК Е. coli и L. monocytogenes осуществлялось методом щелочного лизиса с помощью набора WizardOPlus SV Minipreps DNA Purification System (Promega).

Полимеразная ценная реакция.

Амплификацию проводили в термоциклере Терцик (ДНК-технология) по программе точного регулирования: 1-й цикл - 94°С, 2 мин, количество циклов -1; 2-ой цикл - 94°С, 55°С, 72°С, по 5 сек, количество циклов - 5; 3-ий цикл -94°С, 55°С, 72°С, по 1 сек, количество циклов - 25; 4-ый цикл - 94°С и 55°С по

20 сек, 72°С - 10 мин, количество циклов - 1. Для постановки ПЦР использовали праймеры, представленные в таблице 1.

Продукт амплификации выявляли методом гель-электрофореза. Использовали 1% агарознып гель, приготовленный на основе трис-ацетатного буфера, с добавлением бромистого этидия до 0,5 мкг/мл.

Таблица 1.

Праймеры, использованные в ПЦР

Название Последовательность 5' -> 3'

0028-Р лтттоттоттстсдтсотссо

0028-11 ТССТССААТААСТТССССАСС

0961-Р ТТССТСОАСАСаАТТТСССАС

0961-Я ССАСААСТСТССССАСААССО

1493-Р АТ0ТТТСССАСТС с а Ататсс

1493-11 ТТСААААСТСССТООСОААС

2077-Р ААТОАССОТСТСОТТАТСССС

2077-Я ССбСТСАССААСОАСТТССО

0028-Рт ААСАССТТССССАетААСТТС

0028-Кт САСАТАТСАОССААССТТСОС

09б1-Р!п ССОАТСАТСТСАААТАСССаО

0961-Ят ССЛСОССАССОСОАТАТАСО

1493-Р1П ОСООСТСТОААСААТТАСААС

1493-Шп аСОАСТСТАССТССАОССС

2077-Рт ОТСАаСОТСОТТОЛАТСССС

2077-Шп ССАТТТАСТСТССССТТСГОС

0028ё-1 ТСАССССААТТСТСОТСОСТАО

0028с1-2 ТСССАСТСОАТССССТТТТАСТАОС

0028с3-3 аТАОАТССССАТССАТССПААТТСО

0028(1-4 ТТССОАТТСТАСААСТАССТССТС

0028с1-5 ТСАТСССТСОАСТТССААТСТТСО

0028с1-6 ТССААТАСССАСТОСССССС

0028(1-7 ТСТТТСТАТССТТТСТТСССАТССС

Полимеразную цеппую реакцию в реальном времени проводили на анализаторе нуклеиновых кислот "АНК-32" (ИАП РАН, Санкт-Петербург) по

программе: 1-й цикл - 95°С, 300 сек, количество циклов - 1; 2-ой цикл - 62°С по 50 сек, 95°С по 20 сек, количество циклов - 50. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали праймеры и зонды, представленные в таблице 2.

Таблица 2.

Праймеры, использованные в ПЦР в реальном времени

Название Последовательность 5' - > 3'

Acrl AAAGATGCGGGGAAATGGO

Асг2 TGGTGTCTCTGGCAAAGCA

Pb-act FAM-ATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTA-BIIQ1

где FAM - флуоресцентный краситель, BHQ1 - гаситель флуоресценции Рестрикционный анализ, дефосфолирирование, лигирование ДНК и электрофорез в агарозном геле проводили как описано Maniatis et al., 1978.

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора GFXtm PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham). Получение инсерционных мутантов L. monocytogenes.

Общая схема получения инсерционных мутаций представлена на рисунке 1. Для мутагенеза использовали челночный вектор pLSVj.

Рис. 1. Схема получения инсерционных мутантных штаммов. 1 - открытая рамка считывания; 2 -фланкирующая последовательность гена; 3 -последовательность, содержащая внутреннюю часть гена; 4 - гомологичная рекомбинация; а и b - праймеры для проверки рекомбинации.

Амплификация внутренних фрагментов выбранных генов проводилась с использованием ПЦР на хромосомной ДНК L. monocytogenes EGDe с праймерами lmo0028F, lmo0028R, lmo0961F, lmo0961R, lmol493F, lmol493R, lmo2077F, lmo2077R. Продукты ПЦР были клонированы в промежуточный вектор pGEM®-T Easy, а затем в вектор pLSV, в Е. coli. Полученные плазмиды

были трансформированы в L. monocytogenes. Эритромицин-устойчивые колонии L. monocytogenes, содержащие илазмнду, были отобраны при 30°С. Отбор ннссрционных мутантов проводился путем выращивания плазмпдо-содержащих бактерий при нснсрмисснвной температуре (42°С) на среде, содержащей эритромицин. Наличие вставки было подтверждено с помощью ПЦР с праймерами lmo0028Fin, lmo0028Rin, lmo096IFin, lmo0961Rin, lmol493Fin, lmol493Rin, lmo2077Fin, Imo2077 Rin, расположенными за пределами фрагмента, встроенного в вектор pLSV^ Наличие вставки поддерживали кулыированисм бактерий в присутствии эритромицина.

Получение делеционного ила.чма L. monocytogenes GI.\ld0028.

Общая схема получения штамма GIMd0028 представлена на рисунке 2.

Рис. 2 Схема получения штамма 01М(10028. 1 -огкрьпая рамка считывания; 2 - фланкирующая последовательность гена; 3 -пос.тедовагельносп,, содержащая 5' и 3' концы гена, 4 -гомологичная рекомбинация; а, Ь п с - праймеры для проверки рекомбинации.

Для мутагенеза использовали челночный вектор pLSVl. Амплификация фрагментов гена 1то0028 проводилась с использованием ПЦР на хромосомной ДНК L. monocytogenes F.GDe с праймерами 0028d-l, 0028d-2, 0028d-3 и 0028d-4. Продукты ПЦР были рестрицированы по сайту BamHi и лигированы. Продукт лигирования был амгтлифицирован по праймерам 0028d-l 0028d-4. Полученный продукт был клонирован в промежуточный вектор, pGEM®-T Easy, а затем в вектор pLSV], После накопления в E.coli, плазмиды были выделены и затем трансформированы в L. monocytogenes EGDe. Эритромицин-устойчивые колонии, содержащие плазмнду, были отобраны при 30°С.

Отбор инсерционных мутантов проводился путем выращивания плазмидо-содержащпх бактерий при непермиссивной температуре (42°С) на

среде, содержащей эритромицин. Наличие вставки было подтверждено с помощью ПЦР с праймерами, 0028d-5, 0028d-6. Для делегирования гена 1то0028 путем гомологичной рекомбинации полученный рекомбинантный штамм культивировали в бульоне BHI без эритромицина при 37°С, пересевая каждые 24 часа в течение 12 дней. Отбор колоний, утративших вставку в результате гомологичной рекомбинации, осуществляли по неспособности расти в присутствии антибиотика. Отбор делеционных вариантов проводили среди эритромицин-чувствительных колоний с помощью ПЦР с праймерами 0028d-5 и 0028d-7.

Комплементирование делеции гена 1то0028 в штамме GIMd0028.

С помощью ПЦР на хромосомной ДНК L. monocytogenes с праймерами 0028d-5 и 0028d-7 был получен фрагмент, который был встроен в вектор pGEM®-T Easy (Promega), а затем в вектор pTRKL2, далее pL0028. pL0028 была трансформирована в L. monocytogenes штамм GIMd0028.

Скорость роста культуры L. monocytogenes определяли по изменению оптической плотности на спектрофотометре СФ-26 («ЛОМО») при длине волны 600 нм.

Морфологию бактериальных клеток изучали методом микроскопирования (увеличение 12x100) окрашенных по Граму мазков.

Биохимические свойства лнстерин определяли с помощью тест-системы API Listeria (bioMerieux).

Разделение белков культуралыюй жидкости и белков клеточной стенки L. monocytogenes методом электрофореза в системе Лэммли (SDS-PAGE): освобождённые белки L. monocytogenes выделяли из культуральной жидкости методом осаждения ТХУ как описано (Ermolaeva et al.,2004).

Белки клеточной стенки были получены методом обработки целых бактериальных клеток детергентом, как описано (Ermolaeva et al.,2004). Разделение проводили в 12%-ном полиакриламидном геле при токе 8 мА в течение 3-х часов на приборе для минигелей (Bio-Rad), окрашивали Coomassie Brilliant Blue R-250 с последующей отмывкой в 7% уксусной кислоте.

Определение белков L. monocytogenes с помощью иммупоблоттинга (Western-blot): белки листернй, разделенные но методу SDS-PAGE, переносили с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану как оиисано (Burnette, 1981) и использовали антитела против листериозных белков LLO и PIcA.

Определение вирулентности, штаммов L. monocytogenes проводилось на мышах линии BALB/c (9, 14-16 грамм). Для инфекции использовали бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста. Перед заражением выравнивали титры бактериальных клеток разных штаммов. Для заражения бактериальную суспензию в соответствующей концентрации вводили в хвостовую вену в объеме 100 мкл.

Скрнннпговое определение вирулентности иисерцнонных мутаптных штаммов L. monocytogenes проводилось на группах из пяти животных, которым вводили бактериальную суспензию из расчета Ю4 КОЕ/мышь. Забой и вскрытие производили спустя 72 часа после заражения. Степень поражения внутренних органов оценивали визуально (изменение размеров, наличие зон некроза).

Подсчет числа бактерий в печени и селезенке мышей осуществляли спустя 72 часа после заражения (максимум для штамма дикого типа при заражении сублетальными дозами) для групп из 5 животных. Внутренние органы гомогеиезировали, разводили в 1 мл физиологического раствора, на агаризованную среду высевали серийные разведения в дубликате.

Для определения LD50 для штаммов L. monocytogenes серийные разведения бактериальной суспензии в объеме 100 мкл вводили в хвостовую вену мышам. Максимальная доза заражения составляла 10s КОЕ/мышь, минимальная - 102 КОЕ/мышь. Наблюдения проводили в течение 14 дней. Определяли LD50 по формуле:

Lg(LD,a) = Lg(Dmm) - А - 0.5),

'A .»i

где, Dm„ - наибольшая из испытанных доз (разведений); Lg(-

логарифм отношения каждой последующей дозы (п+1) к предыдущей (п); — -

отношение числа погибших от данной дозы животных к общему количеству

"' В в

животных, которым была введена эта доза; У(—) - сумма всех значений (—)

^ А А

для всех испытанных доз (т).

Цитоксичность L. monocytogenes определяли по влиянию стационарной культуры L. monocytogenes на вегетативные клетки реснитчатого простейшего Telrahymena pyrlformis как описано в работе (Пушкарева В.И., 1994).

Эффективность инвазии в эпителиальные клетки линии НТ29 определяли следующим образом. Заражение проводили экспоненциальной культурой из расчета 100 бактериальных клеток на 1 эукариотическую. После внесения бактерий, клетки инкубировали 1 час при 37°С в присутствии 5% СОг-Затем в среду добавляли гентамицин (100мкг/мл) для устранения невошедших бактерий. После инкубации в присутствии гентамицина в течение 1 часа клетки лизировали 1% Triton Х-100, Число внутриклеточных бактерий подсчитывали на основании высевов серийных разведений клеточных лизатов. Эффективность инвазии определяли как отношение числа внутриклеточных бактерий к числу бактерий, использованных для заражения.

Эффективность внутриклеточного размножения л истерий изучали таким же методом, как и эффективность инвазии листерий, но подсчет числа внутриклеточных бактерий проводили через 3, 5 и 7 часов после внесения гентамицина.

Результаты и обсуждение

IsiiGiiiiif/GpAiii i^ttOUii ulii ¡10 ИСК Kflli(/ii()(iiililulX vCJli\OG> y-KicaioyiGii^ii^c s адаптации листерий к росту in vivo.

Первая задача состояла в выявлении кандидатных белков, которые могли бы влиять на возможность адаптации листерий к условиям, характерным для инфекции, не затрагивая при этом способность бактерии размножаться in vitro,

Мы выбрали для исследования с помощью биоинформационного поиска один класс белков, а именно, пептидазы.

Выбор пептидаз в качестве мишени биоинформационного анализа объясняется рядом соображений. Функционально важные для вирулентности пептидазы патогенных бактерий могут не только сами являться токсинами, но и участвовать в процессинге других факторов патогенности, как было продемонстрировано ранее в нашей лаборатории (Сапенко, 2006), а также быть задействованы в перестройке метаболизма бактерий во время инфекции, что представляло интерес с точки зрения целей диссертации.

Другой важной особенностью пептидаз, которая послужила причиной для выбора этих белков в качестве мишени биоинформационного анализа, является высокая степень изученности структурных особенностей данного класса белков. Пептидазы имеют консервативную структуру, так что на основании первичной последовательности можно судить о функциях и структуре активного центра неисследованных белков.

Наконец, выбор именно пептидаз в качестве кандидатных белков был связан со значительностью числа пептидаз в бактериальном геноме, определяющей ту важную роль, которую пептидазы играют в жизнедеятельности всех живых организмов.

В геноме L. monocytogenes нами было выявлено 59 ОРС, кодирующих полипептиды, которые на основании первичной последовательности можно отнести к пептидазам. Это составляет около 2 % от 2853 ОРС, выявленных в геноме L. monocytogenes (Glaser et al., 2001).

Среди отобранных ОРС были выбраны те, продукты которых предположительно находятся на бактериальной поверхности и, таким образом, могут участвовать в процессинге поверхностных белков, а также клеточной стенки бактерий. Нами было выявлено 10 ОРС, соответствующих вышеописанным критериям.

Важным критерием потенциальной вовлеченности кандидатных белков в процесс инфекции было наличие в промоторной области генов сайтов

связывания регуляторпых белков, активизирующихся в процессе инфекции. Среди 10 отобранных мишеней, только ген imo()028 имел в нромоторной области сайт связывания регулятора генов патогенностн PrfA. Этот ген стал первым кандидатом для дальнейшего исследования. Однако не все гены, продукты которых необходимы в процессе вирулентности, находятся под контролем PrfA. Поэтому для расширения дальнейшего анализа были взяты еще три гена мишени, 1то0961, ¡то 1493 и 1то2077.

Методом сайт-специфического мутагенеза на основе типового штамма EGDe дикого гипа было получены муташные штаммы GIM0028, GIM0961, GIM1493, GIM2077, несущие инсерции в выбранных генах-мишенях.

Оценка степени поражения органов инфицированных животных при заражении мышеи мупшипшыми штаммами L. monocytogenes.

Для оценки возможных изменений в вирулентности штаммов вследствие введенных мутаций мы оценили степень поражения внутренних органов мышей линии BALB/c через 72 часа после внутривенного заражения одинаковыми дозами изучаемых штаммов и штамма дикого типа. Известно, что третьи сутки являются пиком инфекционного процесса для нашей модели.

Визуальный осмотр внутренних органов в группах из пяти животных выявил гиперплазию тканей селезенки и печени при инфицировании всеми штаммами (рис. 3). Было выявлено практически полное отсутствие некротических изменений внутренних органов при заражении штаммами GIM0028 и GIM1493. Напротив, степень поражения внутренних органов у мышей, зараженных штаммами G1M0961 и GIM2077, по количеству и размеру некротических пятен превышала изменения, наблюдаемые у животных, зараженных штаммом дикого типа EGDe.

Рис. 3. Изменения в селезенках мышеи через 72 ч после внутривенного заражения штаммами L. monocytogenes 1 - шпактная селеченка, 2 - родительский штамм дикого типа F.GDe, 3 - GIM0028, 4 - GIM0961, 5 -

GlМ1493, б - GIM2077. Представлены типичные поражения, выявленные на группах нз пяти животных.

Таким образом, мутации в генах 1то0028 и 1то1493 уменьшали степень поражения органов инфицированных животных, а мутации в генах 1то0961 и 1то2077, напротив, увеличивали.

Для дальнейшего изучения мы выбрали две мишени. Ген 1то0028 стал основной мишенью на основании того, что продукт данного гена соответствовал всем критериям отбора кандидатных белков, и штамм с мутацией в данном гене мог иметь сниженную вирулентность. Ген !то2077 был подвергнут дальнейшему анализу, поскольку его продукт мог быть вовлечен в адаптацию L. monocytogenes к росту in vivo, т.к. наблюдаемое увеличение поражения внутренних органов при инсерции в этом гене сопровождалось заметным снижением скорости роста in vitro.

Влияние инсерции в опероне 1шо2075-1то2078 на биохимические, морфологические и кулыпуральные свойства и вирулентность L. monocytogenes.

Анализ биохимических, культуральных и морфологических свойств штамма L. monocytogenes GIM2077, проведенный как описано в Материалах и Методах, не выявил отличий относительно штамма дикого типа, за исключением сниженной скорости роста. Низкая скорость роста штамма in vitro сохранялась в разных средах, в том числе LB и Brain Heart Infusion (BHI) (Рис. 4).

Рис. 4. Скорость роста 61М2077 в питательных средах ЬВ и ВН1. А) в ЬВ; Б) в ВН1. дт - штамм дикого типа, 2077 - штамм С1М2077.

Добавление глюкозы к жидкой питательной среде увеличивало плотность культуры в стационарной

фазе, что было характерно и для штамма дикого типа, однако не влияло на скорость роста мутантного штамма в логарифмической фазе.

Рост мутантного штамма заметно ускорялся и становился сопоставим с ростом штамма дикого типа в микроаэробных условиях (рис. 5).

Рис. 5. Бактериальный рост на агаризованиой среде BHI при различных В условиях культивирования через 24 часа. I 11 " ~ штамм monocytogenes EGDe при стандартных условиях культивирования и при культивировании в анаэростате соответственно; 3 и 4 - мутантный штамм L. monocytogenes GJM2077 при стандартных условиях культивирования и при культивировании в анаэростате соответственно.

Относительную эффективность размножения штамма GIN42077 in vivo мы определили путем сравнения количества бактерий в печени мышей линии BALB/c на третьи сутки после заражения. Количество бактерий в печени мышей, зараженных штаммом GIM2077. превышало количество бактерий, зараженных штаммов дикого типа, в 85 раз (р<0,05) (Рис. 6).

10'

10" е ю5 ^ ' 1 ю" а ю' SlO= 10 А. ♦ ...............А-_______ ЧГ

1 wt G1M2077

Рис. 6. Количество бактерий, выделенных на 3-ий день из печени инфицированных мышей. - родительский штамм дикого типа ЕСОе, С1М2077 - штамм С1М2077. Прямоугольник - среднее количество бактерий.

При этом изменение вирулентности не было связано с изменением продукции факторов патогенное™, что подтверждает спектр поверхностных и секретируемых белков, иммуноблоттинг с антителами против белков LLO и PlcA (рис. 7), а также определение цитотоксичности на модели простейших Tetrahymena руг ¡form is.

Таким образом, инсерция в гене 1то2077 уменьшала скорость роста L. monocytogenes in vitro в обычных условиях культивирования, но приводила к

увеличению скорости накопления бактерий in vivo. Интересно, что в микроаэробных условиях in vitro рост мутантных по гену 1то2077 бактерий становился сопоставимым с ростом бактерий дикого типа.

12 12

LL0 ^ Рис. 7. Иммупоблотпнг поверхностных белков GIM2077 с

р]сА , антителами против PlcA и LLO А) белки клеточной стенки, Б)

секретнруемые белки, 1 - штамм дикого типа, 2 - штамм G1M2077.

А) Б)

Белок, кодируемый геном !то2077, относится к семейству эндопептидаз, специфичных в отношении О-сиалогликозированных белков (Mellors and Sutherland, 1994). В оперон, включающий 1то2077, входит ген 1то2075, кодирующий пептидазу того же семейства. О-сиалогликозилирование характерно для белков высших эукариот, в том числе млекопитающих животных и человека. Например, рецепторы клеток иммунной системы CD34, CD43, CD44 и CD45 практически всегда модифицированы О-сиалогликозированием (Mellors and Sutherland, 1994). На основании этого можно предположить, что продукт гена 1то2077 может влиять на вирулентность L. monocytogenes, хотя несколько трудно объяснить, почему наблюдается увеличение, а не уменьшение вирулентности. Тем не менее, специфичность в отношении О-сиалогликозированных белков не объясняет негативный эффект мутации на рост самих бактерий, т.к. у L. monocytogenes нет такой формы модификации белков.

Известно, что наблюдаемый в результате инсерционной мутации эффект может быть следствием как нарушения функции гена мишени, так и полярным эффектом на нижележащие гены оперона. В результате инсерции в гене 1то2077 полярный эффект сказывается на вышеописанном гене 1то2075 и гене \mo2076.

Продукт гена 1то207б имеет высокую гомологию с SlS-N-аланин-ацетилтрансферазой, специфичной в отношении рибосомального белка S18, из Bacillus cereus (51 % идентичных остатков) и других бактерий. Роль этого белка в биологии бактерий практически не изучалась. Однако, по аналогии с другими

аналогичными белками, например, 85-М-аланин-ацетилтрансферазой, можно предположить, что мутация, связанная с модификацией рибосомальных белков, может иметь плейотропный эффект, т.к. такие мутации часто связаны с эффективностью трансляции широкого спектра мРНК (White-Ziegler et al., 2002).

Таким образом, наблюдаемый эффект от инсерции в гене 1то2077 может быть связан с нарушением функций эндопептидаз Lmo2077 и Lmo2075, специфичных в отношении О-сиалогликозированных белков, и/или с нарушением N-аланин-ацетилирования рибосомального белка S18. Учитывая плейотропный эффект мутации, включающий резкое ухудшение роста в аэробных, но не в анаэробных, условиях in vitro и увеличение вирулентности, мы считаем перспективным дальнейшее изучение роли оперона 1то2075-2078 в инфекционном процессе. Однако в рамках данной работы, мы приняли решение не продолжать исследования в этом направлении, а перейти к изучению мутации в гене !то0028, приводящей к снижению вирулентности.

Получение и характеристика мушашпиого штамма L. monocytogenes с делецией гена Imo0028 (GIMd0028).

Продукт гена 1то0028 имеет гомологию (22% идентичных и 41% гомологичных аминокислотных остатков) с белком LdcA из Е. coli, который относится к семейству эндопептидаз с узкой субстратной специфичностью в отношении тетрапептидов муреина, обычно называемых L,D-карбоксипептидазами. Три аминокислотных остатка, составляющих активный центр Ь,0-карбоксипептидаз - серии, глутаминовая кислота и гистидин (Korza and Botchler, 2005), расположены у него в соответствующих местах, что подтверждает, что продукт гена 1то0028 принадлежит к этому семейству.

У iрам-oiрицагельных бамерий Ь,0-карбйксипешидаза играет важную роль в размножении, будучи необходимой на заключительных этапах формирования дочерних клеток. Так, нарушение функции L,D-карбоксипептидазы у Е. coli препятствует формированию межклеточной перегородки (септы), что проявляется в удлинении бактериальных клеток. Для

грам-положительных бактерий сведений о роли LD-карбоксипептидаз в делении бактерий не было.

Делеционные мутации являются более стабильными по сравнению с инсерционными, что облегчает работу с ними. Поэтому нами был сконструирован делеционный мутант по гену 1то0028 методом сайт-специфического мутагенеза. Делеция была подтверждена с помощью ПЦР (рис. 8).

Рис. 8. Выявление делеции в гене 1то0028 с помощью ПЦР. Слева на рисунке - маркерная ДНК. wt - продукт ПЦР на ДНК родительского штамма дикого типа EGDe; GIMd0028 - продукт ПЦР на ДНК штамма GlMd0028.

Скорость роста и биохимические свойства полученного мутантного штамма изменены не были. Продукция факторов патогенности штамма L. monocytogenes GIMd0028 не была изменена, что было видно по спектру поверхностных и секретированных белков, иммуноблоттингу с антителами против белков LLO и PlcA (рис. 9), а также по реакции

цитотоксичности на модели простейших Tetrahymena pyriformis.

12 12

«—и Рис. 9. Иммуноблотинг поверхностных белков GIMd0028 с

-- —---антителами против PlcA и LLO. А) белки клеточной стенки, Б)

секретнруемые белки, 1 - дикий тип, 2-GIMd0028.

А) Б)

Мы наблюдали изменение морфологии окрашенных по Граму бактериальных клеток мутантного штамма GlMd0028, выращенных на твердом питательном агаре BHI, (рис. 10Б) по сравнению с клетками штамма дикого типа (рис. ЮГ): было выявлено увеличение продольных размеров бактериальных клеток GIMd0028 в среднем в 3 раза. Однако культивируемые в бульоне ВН1 бактерии мутантного штамма GIMd0028 изменений формы клеток не проявляли (рис. 10А). Комплементация делеции в штамме GlMd0028 плазмидой, несущей ген 1то0028, восстанавливал исходный фенотип при выращивании бактерий на питательном агаре (рис. 10Д).

Рис. 10. Изменения в морфологии окрашенных по Грамму бактерий прн культивировании в различных средах. А) - штамм L. monocytogenes GIMd0028, выращенный в бульоне ВН1, Б) -штамм L. monocytogenes GlMd0028, выращенный на агаре BHI, В) - штамм L. monocytogenes EGDe дикого типа, выращенный в бульоне ВН1, Г) - штамм L. monocytogenes EGDe дикого типа, выращенный на агаре ВН1, Д) штамм L. monocytogenes В)GIMd0028 с плазмидой pTRK.L2, несущей ген 1то0028, выращенный на

агаре. Увеличение в 1200 раз.

Таким образом, изменение морфологии клеток

Д)

GIMd0028 связано именно с мутацией в гене 1то0028, но наблюдается только при определенных условиях (например, при выращивании на твердых питательных средах).

Важным был вопрос о влиянии внутриклеточных условий на фенотип бактерий с мутацией в гене 1то0028. Мы наблюдали выраженное удлинение бактериальных клеток штамма GIMd0028 при размножении в цитоплазме эпителиальных клеток линии НТ29. С течением времени внутриклеточного размножения длина бактериальных клеток возрастала. Через 6 часов длина внутриклеточных бактерий штамма GlMd0028 превышала длину бактерий дикого типа до 10 раз (рис. 11)

Рис 11. Изменения в морфологии окрашенных по Грамму бактерий при размножении в цитоплазме эукариотических клеток. А) - штамм L. monocytogenes GlMd0028, Б) - штамм L. monocytogenes EGDe дикого типа.

Мы предположили, что наблюдаемое удлинение клеток штамма GIMd0028 связано с нерасхождением клеток при делении. Для проверки этого предположения мы определили количество ДНК на одну колониеобразующую единицу (КОЕ) у штамма GlMd0028 и штамма дикого типа. Полученные с помощью ПЦР в реальном времени резудбтаты показывают, что мы показали,

А)

г*' V — •! i t АV , •= if»*- , У УгГ .wf.

¡¡»у

■УГ i-

что количество ДНК на одну КОЕ для штамма GIMd0028, выращенного на твердой питательной среде, превышает в 8,5 раза количество ДНК на одну КОЕ для штамма дикого типа (рис. 12).

Рис. 12. Количество ДНК, содержащееся в 10' КОЕ бактерий. На диаграмме показаны средние значения количества ДНК и доверительные интервалы (р<0,05). Вертикальной линией над столбцами обозначена стандартная ошибка определения количества ДНК. wt -штамм L. monocytogenes EGDe дикого типа, GIMd0028 -штамм L. monocytogenes GIMd0028.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что мутация в гене 1то0028 приводит к нарушению расхождения после деления бактериальных клеток, растущих на питательном агаре, так что одна колониеобразующая единица содержит приблизительно 23 копий геномов.

Влияние делеции гена 1то0028 на вирулентность L. monocytogenes.

Вирулентность штамма GIMd0028 и родительского штамма дикого типа была определена на модели инфекции путем внутривенного заражения мышей линии BALB/c по эффективной дозе летального заражения LD50, по динамике падежа мышей при различных дозах заражения, по накоплению листерий в печени, и на модели эпителиальных клеток НТ29 по эффективности инвазии и внутриклеточного размножения.

LD50 для штамма GlMd0028 с делецией гена 1то0028 была приблизительно в 10 раз выше, чем для родительского штамма дикого типа EGDe, и составляла, соответственно, 1х105и 1х104 КОЕ/мышь.

Рис. 13. Динамика численности мышей после заражения.

*—wt 10*7 ■—wt 10*6 А—wt 5x10*4 •—wt 5x10*3 » GIM002S 10л7 ■ GIM0028 10*6 A--- GIM0028 5x10*4 ь GIM0028 5x10*3

Деления гена 1то0028 также заметно изменяла динамику численности мышей в ходе эксперимента (рис. 13). При одинаковых дозах заражения мутантные бактерии вызывали падеж на более поздних сроках.

Для определения эффективности размножения бактерий in vivo было определено накопление бактерий в печени мышей через трое суток после внутривенного заражения мышей линии BALB/c сублетальной дозой заражения (Рис. 14). Количество мутантных бактерий в печени к этому сроку было приблизительно на два порядка меньше, чем бактерий дикого типа.

Рис. 14. Количество бактерий во внутренних органах мышей на третьи сутки после заражения, wt - штамм дикого типа, GJMd0028 - штамм GIMd0028. Закрашенные прямоугольники - среднее количество бактерий.

При определении эффективности инвазии в эпителиальные клетки линии НТ29 было установлено, что коэффициент инвазии для штамма GIMd0028 в два раза ниже, чем для штамма дикого типа (рис. 15).

Рис. 15. Эффективность инвазии /.. monocytogenes в клетки НТ29. Коэффициент инвазии определяется отношением числа бактерий, использованных для заражения клеточного монослоя, к числу бактерий, успешно вошедших в клетки в течение часовой инкубации. Показаны средние величины и доверительные интервалы (р<0,05).

Эффективность внутриклеточного

размножения была определена на основании высевов бактерий, находящихся в цитоплазме эпителиальных клеток, на питательный агар как описано в Материалах и Методах. Количество внутриклеточных бактерий дикого типа экспоненциально возрастало на протяжении 7 часов после инфицирования клеток (рис. 16).

0,0035

0,003

5 0.0025

а:

1 0.002

= 0,0015

-9- 0,001

0,0005

Напротив, количество высеянных клеток штамма 01МсЮ028 изменялось очень незначительно. Сопоставляя эти данные с результатами изучения морфологии внутриклеточных бактерий (см. рис. 11), мы предполагаем, что замедление увеличения числа бактерий штамма С1Мс10028 связано с нарушением формирования дочерних клеток при внутриклеточном размножении.

3600000 3000000 2400000 О 1800000 1200000 600000 о

/ wt — GIMd002S

012345678 время, ч

Рис. 16. Динамика размножения листерин в цитоплазме эпителиальных клеток линии НТ29. Стрелкой отмечено добавление гентамицина.

Выводы

1. Показано, что инсерционные мутации в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени

поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе у мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то0961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

2. Установлено, что инсерционная мутация в опероне 1то2075 - 1то2077, увеличивает вирулентность L. monocytogenes, но ухудшает эффективность роста на искусственных питательных средах. Эффективность роста in vitro восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.

3. Показано, что нарушение функции гена 1то0028, кодирующего L,D-карбоксипептидазу, приводит к нарушению процесса расхождения бактериальных клеток после деления при культивировании на агаризованных питательных средах.

4. Показано, что делеция гена !то0028 снижает эффективность инвазии в эпителиальные клетки линии НТ29 в 2 раза и нарушает формирование дочерних бактериальных клеток при размножении листерий в цитоплазме.

5. Показано, что мутации в гене 1то0028 приводят к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Юров Д.С. Биоинформационный поиск пептидаз, вовлеченных в вирулентность Listeria monocytogenes II Мат-лы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. - с. 410.

2. Сапенко Т.П., Юров Д.С., Ермолаева С.А. Применение метода MALDI-TOF-MS для определения сайта процессинга белков // Мат-лы II научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань, 2007.-е. 134-136.

3. Юров Д.С., Пушкарева В.И., Ермолаева С.А. Применение биоинформационного метода для выявления структур патогенных бактерий, вовлеченных в их вирулентность // Мат-лы II научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань, 2007.-е. 140-141.

4. Ермолаева С.А., Юров Д.С., Варфоломеев А.Ф., Сапенко Т.П., Кибардин А.А., Ларин С.С. Перспективы создания антираковых вакцин на основе аттенуированных штаммов Listeria monocytogenes //Мат-лы IX съезда Всеросс. научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2007. т. I - с. 60-61.

5. Юров Д.С., Пушкарева В.И., Ермолаева С.А. Идентификация белков, влияющих на вирулентность Listeria monocytogenes, с помощью

л,.«.,,,4,„„..„,.,.„._________ //мг_____ ____ ______ _______________

uriunm.jjupiviaur<unnui w апшш^а пл\ууп. шил. l^nci., 1\'шлриикшл., опросил.

2008, №1 - с. 8-14.

Заказ № 157/11/08 Подписано в печать 17.11 2008 Тираж 100 экз Уел п.л. 1,5

/ ч\ ООО "Цпфровпчок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 'ч^'у, \vw\v. с/г. ги ; е-таИ: т/о@с/г. т

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Юров, Дмитрий Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений

I. Введение.

II. Обзор литературы.

2.1. Listeria monocytogenes: место в инфекционной патологии.

2.2. Листерии как возбудители сапрозоонозной инфекции.

2.2.1. Листерии как возбудители пищевой инфекции.

2.2.2. Листериоз у животных.

2.3. Внутриклеточный паразитизм листерий.

2.4. Факторы, необходимые L. monocytogenes при переходе во внутриклеточное пространство.

2.4.1. Белки, необходимые в процессе инвазии.

2.4.2. Белки, необходимые для выхода из фагосомы.

2.4.3. Белки, необходимые в процессе внутриклеточного размножения и межклеточного распространения.

2.4.4. Координация экспрессии факторов патогенности.

2.5. Метаболические аспекты адаптации бактерий к внутриклеточному паразитизму.

2.5.1. Ионы металлов, влияющие на рост бактерий в организме хозяина.

2.5.2. Углеводы, доступные во внутриклеточном пространстве.

2.5.3. Шапероны.

2.5.4. Значение липоевой кислоты в росте и вирулентности.

2.5.5. Другие механизмы адаптации, активирующиеся в процессе инфекции.

2.6. Разработка вакцинных штаммов патогенных бактерий на основе мутаций в генах общего метаболизма.

2.6.1. Мутации в системе метилирования ДНК (Уши-мутации).

2.6.2. Мутации в генах метаболизма ароматических аминокислот (алу-мутации).

2.6.3. Мутации, связанные с антибиотикоустойчивостью.

III. Материалы и методы.

3.1. Биоинформационный анализ.

3.2. Использованные штаммы и плазмиды.

3.3. Микробиологические методы.

3.3.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания.

3.3.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli.

3.3.3. Приготовление и трансформация компетентных клеток L. monocytogenes.

3.4. Молекулярно - генетические методы.

3.4.1. Выделение хромосомной ДНК L. monocytogenes.

3.4.2. Приготовление лизатов Listeria spp. из колоний.

3.4.3. Выделение плазмидной ДНК E.coli.

3.4.4. Выделение плазмидной ДНК L. monocytogenes.

3.4.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3.4.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

3.4.7. Праймеры, использованные в работе.

3.4.8. Рестрикционный анализ, дефософолирирование, лигирование ДНК.

3.4.9. Электрофорез в агарозном геле.

3.4.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

3.4.11. Получение инсерционных мутантов L. monocytogenes.

3.4.12. Получение делеционного штамма L. monocytogenes GIMd0028.

3.4.13. Комплементирование делеции гена 1то0028 в штамме GIMd0028.

3.5. Биохимические методы.

3.5.1. Разделение освобождённых белков и белков клеточной стенки L. monocytogenes методом электрофореза в системе Лэммли (SDS-PAGE).

3.5.2. Определение биохимических свойств листерий.

3.6. Иммунологические методы.

Определение белков L. monocytogenes с помощью иммуноблоттинга (Western-blot).

3.7. Биологические методы.

3.7.1. Измерение скорости роста бактерий.

3.7.2. Изучение морфологии клеток.

3.7.3. Определение эффективности инвазии штаммов L. monocytogenes в эпителиальные клетки.

3.7.4. Определение эффективности внутриклеточного размножения штаммов L. monocytogenes.

3.7.5. Определение вирулентности и LD50 штаммов L. monocytogenes.

3.7.6. Определение цитотоксичности L. monocytogenes.

IV. Результаты.

4.1. Биоинформационный анализ.

4.2. Скриниговый анализ вовлеченности кандидатных белков в вирулентность L. monocytogenes.

4.3. Влияние инсерции в гене 1шо2077 на биохимические, морфологические и культуральные свойства и вирулентность L. monocytogenes.

4.4. Получение и характеристика мутантного штамма L. monocytogenes с делецией гена lmo0028 (GIMd0028).

4.4.1. Получение мутантного штамма с делецией гена 1то0028.

4.4.2. Влияние делеции гена 1то0028 на свойства бактерии при выращивании L. monocytogenes in vitro.

4.4.3. Влияние делеции гена 1то0028 на вирулентность L. monocytogenes.

V. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу"

В 1934 г. академик Е.Н.Павловский писал «.на земле существуют три великие среды обитания: вода, суша и воздух, и организм» (Павловский, 1934). Внимание исследователей, работающих в области медицинской микробиологии, в течение многих лет было приковано к изучению продуцируемых бактериями факторов патогенности, влияющих на структуры и функции макроорганизма, исследованию молекулярных механизмов их активности и роли в развитии инфекционного процесса. Существуют, однако, многочисленные экспериментальные доказательства того, что, помимо продукции специфических факторов патогенности, существование внутри организма требует от бактерий существенных перестроек общего метаболизма. Размножение патогенных бактерий внутри макроорганизма требует от них способности адаптироваться к условиям существования, кардинально отличающимся от внешней среды. Далеко не все эти факторы благоприятны для существования микроорганизма, и даже в целом к благоприятным факторам требуются эффективная адаптация. Так, более высокая, чем во внешней среде, температура не только ускоряет химические реакции и, как следствие обменные процессы, но и увеличивает количество неправильно структурированных белков и является фактором стресса для бактерии; питательные вещества, хотя и присутствующие в избытке, находятся в составе нехарактерных для внешней среды соединений; отсутствие атмосферного кислорода требует от бактерии эффективного переключения метаболизма с аэробного на анаэробный и т.д.

Изучение механизмов адаптации к условиям размножения в ходе процесса инфекции, связанных с изменениями общего метаболизма бактерий, имеет существенный фундаментальный интерес как само по себе, так и для понимания механизмов становления патогенности как явления. Вместе с тем, изучение перестроек метаболизма, необходимых для эффективного размножения внутри организма, имеет и большое практическое значение как подход к созданию аттенуированных штаммов, обладающих высокой иммуногенностью благодаря сохранению антигенных детерминант, в том числе являющихся факторами патогенности, но не способных индуцировать инфекционный процесс. Несмотря на активные разработки субъединичных и генно-инженерных вакцин, живые вакцины до настоящего времени не потеряли своего значения, что хорошо видно на примере вакцины БЦЖ, которая продолжает надежно защищать население, по крайней мере, до 15-летнего возраста. Более того, в настоящее время проводятся значительные исследования возможности использования аттенуированных штаммов бактерий, способных размножаться внутри эукариотической клетки, для разработки векторных систем для доставки в антигенпрезентирующие клетки рекомбинантных антигенов, в том числе опухолевых (бактериофекция). Основной моделью для разработки систем бактериофекции является грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes (Goossens et al., 1995; Paterson and Masiag, 2005).

L. monocytogenes вызывает листериоз, тяжелое заболевание людей и животных, связанное с поражением центральной нервной системы и/или плода у беременных (Шлыгина, 1970, Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский и др., 2002). В связи с высокой летальностью (до 30% от числа госпитализированных больных с диагнозом листериоз) листериоз является серьезной проблемой для медицины (Тартаковский и др., 2002; Зайцева и др., 2007). Кроме того, листериоз является важной проблемой для ветеринарии, что связано с убикитарностью листерий, активно размножающихся во внешней среде, характерной для агропромышленного комплекса, например, в силосе, и приводящих к развитию эпидемий среди мелкого и крупного рогатого скота (Бакулов и др., 1994; Czuprynski, 2005).

Гены факторов патогенности, необходимые для процесса внутриклеточного размножения, координировано регулируются фактором транскрипции PrfA (Ермолаева, 2001; Vazquez-Boland and Kreft, 2001). Транскриптомный анализ экспрессии генов L. monocytogenes в присутствии активного и неактивного PrfA показал, что активность более 150 генов увеличивается и около 100 генов уменьшается в зависимости от активности PrfA (Milohanic et al., 2003). Помимо генов уже изученных факторов патогенности, таких как листериолизин О, фосфолипазы, фактор полимеризации актина ActA и т.д., гены, положительно регулируемые PrfA, кодируют белки с неизвестными функциями и белки общего метаболизма. Для некоторых из последних, например, для участвующего в импорте глюкозо-1-фосфата белка Hpt, продукта гена hpt, доказана роль в адаптации к размножению внутри цитоплазмы и в вирулентности (Chico-Calero et al., 2002). Однако, в большинстве своем, роль в инфекционном процессе кодируемых этими генами белков общего метаболизма не изучалась. В целом, адаптационные механизмы, позволяющие бактериям колонизировать макроорганизм, эффективно используя его ресурсы и приспосабливаясь к встречающемуся в процессе инфекции микроокружению, во многом остаются неизученными.

Целью данной работы явилась выявление и идентификация белков, обеспечивающих адаптацию L. monocytogenes к размножению в макроорганизме, и оценка возможности аттенуации L. monocytogenes путем делеции кодирующих их генов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать критерии для проведения биоинформационного анализа и провести анализ базы данных, содержащей последовательность генома L. monocytogenes, с целью идентификации открытых рамок считывания (ОРС), продукты которых могут быть вовлечены в процесс адаптации к размножению в макроорганизме;

• провести инсерционный мутагенез кандидатных ОРС для выявления мутаций, приводящих к уменьшению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей;

• получить и охарактеризовать мутантные штаммы L. monocytogenes с делецией генов, инсерции в которых приводят к уменьшению вирулентности;

• оценить вирулентность и способность к внутриклеточному размножению штаммов L. monocytogenes, с делециями генов, идентифицированных в ходе данной работы.

Научная новизна.

Разработаны критерии биоинформационного поиска, позволившие выявить ОРС, нарушение целостности которых в результате инсерции приводит к изменениям вирулентности L. monocytogenes. Впервые на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей показано, что инсерции в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе лабораторных мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то0961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

Установлено, что инсерция в опероне 1то2075 - 1то2078 приводит к увеличению вирулентности мутантных бактерий in vivo, но снижает способность L. monocytogenes расти in vitro в аэробных условиях, которая восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.

Показано, что мутации в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, приводят к появлению удлиненных (до 10 раз по сравнению с бактериями дикого типа) бактериальных клеток при выращивании листерий in vitro на твердых питательных средах, но не в бульоне.

Показано, что удлинение бактериальных клеток, мутантных по гену 1то0028, коррелирует с увеличением количества генетического материала, содержащегося в одной колониеобразующей единице, что свидетельствует о присутствии нескольких копий генома в одной бактериальной клетке. Таким образом, впервые для грам-положительных бактерий доказано участие L,D-карбоксипептидазы в процессе расхождения бактериальных клеток после деления.

Показано, что мутация в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, нарушает процесс бактериального деления при размножении листерий внутри цитоплазмы эпителиальных клеток.

Показано, что инактивация гена 1то0028 приводит к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза мышей линии BALB/c. При этом аттенуация не связана с изменением уровня продукции основных факторов патогенности (LLO и PlcA) и/или цитотоксичности, и, по-видимому, связана с ролью кодируемой геном 1то0028 ЬД>карбоксипептидазы в бактериальном делении в процессе внутриклеточного размножения.

Практическая значимость.

И. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Юров, Дмитрий Сергеевич

VII. Выводы

1. Показано, что инсерционные мутации в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе у мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то0961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

4. Показано, что делеция гена 1то0028 снижает эффективность инвазии в эпителиальные клетки линии НТ29 в 2 раза и нарушает формирование дочерних бактериальных клеток при размножении листерий в цитоплазме.

VI. Заключение

В работе, на основании разработанных критериев биоинформационного анализа, были выбраны четыре гена-мишени, продукты которых потенциально могут быть вовлечены в обеспечение вирулентности L. monocytogenes. Сделанное предположение было подтверждено экспериментально, в результате сайт-специфического мутагенеза генов-мишеней вирулентность L. monocytogenes в отношении чувствительных мышей линии BALB/c изменилась. Было показано, что инсерция в опероне 1то2075-2077, включающем ОРС, имеющие гомологию с N-аланин-ацетилтрансферазой, модифицирующей рибосомальный белок S18, и гомологичными пептидазами, активными в отношении О-сиалогликозилированных белков, ухудшает способность листерий расти в аэробных условиях in vitro, но увеличивает вирулентность. Было показано, что нарушение функции гена 1то0028, кодирующего Ь,В-карбоксипептидазу, напротив, не влияет на эффективность роста в питательном бульоне, но снижает эффективность инвазии и внутриклеточного размножения в эпителиальных клетках, что, по-видимому, является причиной сниженной вирулентности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Юров, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. Москва. «Колос», 1967.

2. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросы диагностики и профилактики. Учебное пособие. Ульяновск, 1991.

3. Бакулов И. А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза. Журн микробиол. 1994. 5: 100-105.

4. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата, 1981.

5. Езепчук Ю.В., Патогенность как функция биомолекул. Москва.1985.

6. Ермолаева С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. Генетика. 2001. 37: 286-293.

7. Ермолаева С.А. Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 2001. 3: 106-110.

8. Ермолаева С.А., Белый Ю., Тартаковский И.С. ЖМЭИ. 2000. 5: 3-6.

9. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В. Клонирование и экспрессия фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С L. monocytogenes. Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 1995. 1: 3-10.

10. Ермолаева С.А. Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria monocytogenes. Дисс. докт. биол. наук. Москва. 2004. 189.

11. Карпова JI.A., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Очистка и характеристика листериолизина О Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 1994. 4:3-7.

12. Книзе А.В., Бузун А.И. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 118-122.

13. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 48-52.

14. Маракуша Б.И., Принципы аттенуации патогенных бактерий на модели сальмонелл. Дис. Докт. мед. наук. Москва. 1996. 302.

15. Мешкова Р.Я. Иммунопрофилактика. Руководство для врачей. Смоленск. Русич, 1999.

16. Павловский Е.Н. Курс паразитологии человека (с учением о переносчиках инфекций и инвазий). Изд. 2. Гос. изд. биол. и мед. лит. 1934. 592.

17. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах. Дис. докт. биол. наук. Москва. 1994. 210.

18. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г.А., Дьяков Ю.Т. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. Журн. микробиол. 1997. 3: 3-10.

19. Родина Л.В. МаненковаГ.М. Степанова Н.В. Тимошков В.В. Салова Н.Я. ШестепероваТ.И. Состояние эпиднадзора за листериозом в г. Москве. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 129-131.

20. Салова Н.Я., Голованова В.П., Шестеперова Т.И., Маненкова Г.М., Степанова Н.В. Современное состояние лабораторной диагностики листериозав санэпидслужбе г. Москвы. В.сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 68-71.

21. Сапенко Т.П. Механизмы и роль освобождения поверхностного белка ActA во взаимодействии Listeria monocytogenes с эпителиальными клетками. Дис. канд. мед. наук. Москва. 2006. 102.

22. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листереллезная инфекция. Медгиз.1959.

23. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. Москва. Вузовская книга, 2000.

24. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. Медицина для всех, 2002.

25. Тартаковский И.С., Палей О.С., Опочинский Э.Ф., Лукина З.А., Прозоровский С.В. «Листерии в инфекционной патологии человека -современная концепция». ЗниСО, 1994. 1-4.

26. Шлыгина К.Н. Сравнительное изучение лабораторных методов диагностики листериоза. Дис. канд. биол. наук. Москва. 1970. 345.

27. Beck B.D., Park J.T. Activity of three murein hydrolases during the cell division cycle of Escherichia coli K-12 as measured in toluene-treated cells. J Bacteriol. 1976. 126: 1250-1260.

28. Beck B.D., Park J.T. Basis for the observed fluctuation of carboxypeptidase II activity during the cell cycle in BUG 6, a temperature-sensitive division mutant of Escherichia coli. J Bacteriol. 1977. 130: 1292-1302.

29. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganisms. Springer-Verlag GmbH&Co.KG. 1996.

30. Bi E., Zigmond S.H. Actin polymerization: Where the WASP stings. Curr. Biol. 1999. 9: R160-R163.

31. Bjorn M. J., Iglewski В. H., Ives S. K., Sadoff J. C., Vasil M. L. Effect of iron on yields of exotoxin A in cultures of Pseudomonas aeruginosa PA-103. Infect. Immun. 1978. 19: 785-791.

32. Bonnemain C., Raynaud C., Reglier-Poupet H., Dubail I., Frehel C., Lety M.A., Berche P., Charbit A. Differential roles of multiple signal peptidases in the virulence of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2004. 51: 1251-1266.

33. Brookfield D.E., Green J., Ali S.T., Machado R.S., Guest J.R. Evidence for two protein-lipoylation activities in Escherichia coli. FEBS Lett. 1991. 295: 1316.

34. Burnette WN."Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981. 112: 195-203.

35. Buzzola F.R., Barbagelata M.Sol, Caccuri R.L., Sordelli D.O. Attenuation and Persistence of and Ability to Induce Protective Immunity to a Staphylococcus aureus aroA Mutant in Mice Infect Immun. 2006. 74: 3498-3506.

36. Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P. Auto, a surface associated autolysin of Listeria monocytogenes required for entry into eukaryotic cells and virulence. Mol Microbiol. 2004. 51: 1601-14.

37. Chamberlain L.M., Strugnell R., Dougan G., Hormaeche С. E., Demarco de Hormaeche R. Neisseria gonorrhoeae strain MS 11 harbouring a mutation in gene aroA is attenuated and immunogenic. Microb. Pathog. 1993. 15: 51-63.

38. Conte M.P., Longhi C., Polidoro M., Petrone G., Buonfiglio V., Santo S.D., Papi E., Seganti L., Visca P., Valenti P. Iron Availability Affects Entry of Listeria monocytogenes into the Enterocytelike Cell Line Caco-2, Inf. Imm. 1996. 64: 3925-3929.

39. Cossart P., Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. Molecular Microbiol. 1994. 13: 395402.

40. Cossart P., Sansonetti P.J. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science. 2004. 5668: 242-248.

41. Cowart R. E., Foster B. G. Differential effects of iron on the growth of L. monocytogenes: minimum requirements and mechanism of acquisition. J. Infect. Dis. 1985. 151:721-730.

42. Cowart R. E., Foster B. G. The role of iron in the production of haemolysin by L. monocytogenes. Curr. Microbiol. 1981. 6: 287-290.

43. Crosa J. H. A plasmid associated with virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum specifies an ironsequestering system. Nature. 1980. 284: 566-568.

44. Czuprynski С.J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 2005. 6: 211-7.

45. Dubos R. J., Geiger J. W. Preparation and properties of shiga toxin and toxoid. J. Exp. Med. 1946. 84: 143-156.

46. Engel J.N., Pollack J., Perara E., Ganem D. Heat shock response of murine Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 1990. 172: 6959-6972.

47. Ermolaeva S., Novella S., Vega Y., Ripio M.T., Scortti M., Vazquez-Boland J.A. Negative control of Listeria monocytogenes virulence genes by a diffusible autorepressor. Mol Microbiol. 2004. 52: 601-611.

48. Ermolaeva S., Varfolomeeva N., Belyi Y., Tartakovskii I. Isolation and characterization of a Listeria monocytogenes mutant strain hyperproducing virulence factors. FEMS Microbiol Lett. 1997. 150: 189-195.

49. Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne patyhogen. Microbiol. Rev 2005. 55: 476-511.

50. Fisher S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la difference! Mol. Microbiol. 1999. 32: 223-232.

51. Gaillot O., Pellegrini E., Bregenholt S., Nair S., Berche P. The ClpP serine protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2000. 35: 1286-1294.

52. Gao H., Jiang X., Pogliano K., Aronson A.I. The El beta and E2 subunits of the Bacillus subtilis pyruvate dehydrogenase complex are involved in regulation of sporulation. J Bacteriol. 2002. 184: 2780-2788.

53. Garcia-del-Portillo F., Pucciarelli M. G., Casadesus J. DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium are deficient in protein secretion, cellinvasion and M cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96: 1158411588.

54. Gellin B.G., Broome C.V. Listeriosis. JAMA. 1989. 261: 1313-1320.

55. Gilbreth S.E., Benson A.K., Hutkins R.W. Catabolite repression and virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Curr Microbiol. 2004. 49: 9598.

56. Glickman В., van den Elsen P. Radman M. Induced mutagenesis in dam2 mutants of Escherichia coli: a role for 6-methyladenine residues in mutation avoidance. Mol Gen Genet. 1978. 163: 307-312.

57. Goebel W., Krefit J. Cytolysins and the intracellular life of bacteria. Trends Microbiol. 1997. 5: 86-88.

58. Goossens P.L., Milon G., Cossart P., Saron M.F. Attenuated Listeria monocytogenes as a live vector for induction of CD8+ T cells in vivo: a study with the nucleoprotein of the lymphocytic choriomeningitis virus. Int Immunol. 1995. 7: 797-805.

59. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol Rev. 1992. 56: 592-621.

60. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and in Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect. Immun. 1994. 62: 3550-3553.

61. Guinand M., Vacheron M.J., Michel G., Tipper D.J. Location of peptidoglycan lytic enzymes in Bacillus sphaericus. J Bacteriol. 1979. 138: 126-132.

62. Guinn K.M., Hickey M.J., Mathur S.K., Zakel K.L., Grotzke J.E., Lewinsohn D.M., Smith S., Sherman D.R. Individual RD1-region genes are requiredfor export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microb. 2004. 51: 359-370.

63. Hanawa Т., Yamamoto Т., Kamiya S. Listeria monocytogenes can grow in macrophages without the aid of proteins induced by environmental stresses. Infect Immun. 1995. 63: 4595-4599.

64. Heithoff D.M., Enioutina E.I., Daynes R.A., Sinsheimer R.L., Low D.A., Mahan M. J. Salmonella DNA adenine methylase mutants confer cross-protective immunity. Infect. Immun. 2001. 69: 6725-6730.

65. Heithoff, D., Sinsheimer R. L., Low D. A., Mahan M. J. An essential role for DNA adenine methylation in bacterial virulence. Science. 1999. 284: 967970.

66. Helms S. D., Oliver J. D., Travis J. C. Role of heme compounds and haptoglobin in Vibrio vulnificus pathogenicity. Infect. Immun. 1984. 45: 345-349.

67. Isono K., Isono S. Ribosomal protein modification in Escherichia coli. II. Studies of a mutant lacking the N-terminal acetylation of protein SI8. Mol Gen Genet. 1980. 177: 645-651.

68. Kazmierczak M.J., Mithoe S.C., Boor K.J., Wiedmann M. Listeria monocytogenes sigma В regulates stress response and virulence functions. J Bacteriol. 2003. 185: 5722-5734.

69. Kazmierczak M.J., Wiedmann M., Boor K.J. Contributions of Listeria monocytogenes sigmaB and PrfA to expression of virulence and stress response genes during extra- and intracellular growth. Microbiology. 2006. 152: 1827-1838.

70. Kim H., Boor K.J., Marquis H. Listeria monocytogenes sigmaB contributes to invasion of human intestinal epithelial cells. Infect Immun. 2004. 72: 7374-7378.

71. Kim H., Marquis H., Boor K.J. SigmaB contributes to Listeria monocytogenes invasion by controlling expression of inlA and inlB. Microbiology. 2005. 151: 3215-3222.

72. Kim J., Adhya S., Garges S. Allosteric changes in the camp receptor protein of Escherichia coli; hinge reorientation. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1992. 89: 9700-9704.

73. Klose K.E., Mekalanos J. J. Simultaneous prevention of glutamine synthesis and high-affinity transport attenuates Salmonella typhimurium virulence. Infect. Immun. 1997. 65: 587-596.

74. Kocks C., Gouin E., Tabouret M., Berche P., Ohayon H., Cossart P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 1992. 68: 521-531.

75. Korza H.J., Bochtler M. Pseudomonas aeruginosa LD-carboxypeptidase, a serine peptidase with a Ser-His-Glu triad and a nucleophilic elbow. J Biol Chem. 2005.280: 40802-40812.

76. Kreft J., Vazquez-Boland J.A. Regulation of virulence genes in Listeria. Int J Med Microbiol. 2001.291: 145-157.

77. Lasa I., David V., Gouin E., Marchand J.B., Cossart P. The amino-terminal part of ActA is critical for the actin-based motility of Listeria monocytogenes; the central proline-rich region acts as a stimulator. Mol. Microbiol. 1995. 18:425-436.

78. Laurent V., Loisel T.P., Harbeck В., Wehman A., Grobe L., Jockusch B.M., Wehland J., Gertler F.B., Carlier M.F. Role of proteins of the Ena/VASP family in actin-based motility of Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 1999. 144: 1245-1258.

79. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated. J Bacteriol. 1992. 174: 947-52.

80. Lenz L.L., Mohammadi S., Geissler A., Portnoy D.A. SecA2-dependent secretion of autolytic enzymes promotes Listeria monocytogenes pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100: 12432-12437.

81. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A., Sherman D.R. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis Mimics Bacille Calmette-Guerin Attenuation. JID. 2003. 187: 117-123.

82. Litwin C.M., Calderwood S.B. Role of Iron in Regulation of Virulence Genes. Clinical Microbiology Reviews. 1993. 6: 137-149.

83. Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudira P., Darnell J. Transport across cell membranes. In Molecular cell biology. Scientific American Books, New York, N.Y. 1995. 633-668.

84. Lucht J. M., Bremer E. Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: osmoregulation of the high-affinity glycine betaine transport system proU. FEMS Microbiol. Rev. 1994. 14: 3-20.

85. Machesky L.M., Atkinson S.J., Ampe C., Vandekerckhove J., Pollard T.D. Purification of a cortical complex containing two unconventional actins from Acanthamoeba by affinity chromatography on profilin-agarose. J Cell Biol. 1994. 127: 107-115.

86. Machesky L.M., Insall R.H. Scarl and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex. Cuit. Biol. 1998. 8: 1347-1356.

87. Magnusson I., Rothman D. L., Jucker В., Cline G. W., Shulman R. G., Shulman G. I. Liver glycogen turnover in fed and fasted humans. Am. J. Physiol. 1994. 266: E796-E803.

88. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular Analysis of Genetic Differences between Mycobacterium bovis BCG and Virulent M. bovis. J.Bact. 1996. 178: 1274-1282.

89. Marquis H., Hager E. J. pH-regulated activation and release of a bacteria-associated phospholipase С during intracellular infection by Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2000. 35: 289-98.

90. Massillon D., Bollen M., Wulf H. De, Overloop K., Vanstapel F., Van Hecke P., Stalmans W. Demonstration of a glycogen/glucose-1-phosphate cycle in hepatocytes from fasted rats. J. Biol. Chem. 1995. 270: 19351-19356.

91. Masuda N., Church G. M. Escherichia coli gene expression responsive to levels of the response regulator EvgA. J. Bacteriol. 2002. 184: 6225-6234.

92. May R.C., Caron E., Hall A., Machesky L.M. Involvement of the Arp2/3 complex in phagocytosis mediated by FcgammaR or CR3. Nat. Cell Biol. 2000. 2: 246-248.

93. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L.F., Bresee J.S., Shapiro C., Griffin P.M., Tauxe R.V. Food-related illness and death in the Unites States. Emerg. Infect. Dis. 1999. 5: 607-625.

94. Mellors A., Sutherland D.R. Tools to cleave glycoproteins. Trends Biotechnol. 1994. 12: 15-8.

95. Mengaud J., Dramsi S., Gouin E., Vazquez-Bo land J.A., Milon G., Cossart P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Mol Microbiol. 1991. 9: 2273-2283.

96. Mickelsen P. A., Sparling P. F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neissena meningitidis, and commensal Neissena species to obtain iron from transferrin and iron compounds. Infect. Immun. 1981. 33: 555-564.

97. Milenbachs A., Brown D. P., Moors M., Youngman P. Carbon-source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 1997. 23: 1075-1085.

98. Milohanic E., Jonquieres R., Cossart P., Berche P., Gaillard J.L. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells via its cell wall anchor. Mol Microbiol. 2001. 39: 1212-1224.

99. Morris T.W., Reed K.E., Cronan J.E. Jr. Lipoic acid metabolism in Escherichia coli: the IplA and lipB genes define redundant pathways for ligation of lipoyl groups to apoprotein. JBacteriol. 1995. 177: 1-10.

100. Neilands, J. B. Evolution of biological iron binding centers. Struct. Bond. 1972. 11: 145-170.

101. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annu. Rev. Microbiol. 1982. 36: 285-309.

102. Neilands, J. B. Microbial iron compounds. Annu. Rev.Biochem. 1981. 50: 715-731.

103. Nyfelt A. Etiologie de la mononucleose infectieuse. C. R. Soc. Biol. 1929. 101: 590-591.

104. Offner F. F. Ion flow through membranes and the resting potential of cells. J. Membr. Biol. 1991. 123: 171-182.

105. Packer L., Witt E.H., Tritschler H.J. alpha-Lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic Biol Med. 1995. 19: 227-250.

106. Pappenheimer A. M., Jr., Johnson S. J. Studies in diphtheria toxin production. I. The effect of iron and copper. Br. J. Exp. Pathol. 1936. 17: 335-341.

107. Parish Т., Stoker N. G. The common aromatic amino acid biosynthesis pathway is essential in Mycobacterium tuberculosis. Microbiology. 2002. 148: 30693077.

108. Paterson Y., Maciag P.C. Listeria-based vaccines for cancer treatment. Curr Opin Mol Ther. 2005. 7: 454-460.

109. Perham R.N. Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions. Annu Rev Biochem. 2000. 69: 961-1004.

110. Perry R. D., Brubaker R. R. Accumulation of iron by Yersiniae. J. Bacteriol. 1979. 137: 1290-1298.

111. Peters C., Domann E., Darbouche A., Chakraborty Т., Mielke M.E. Tailoring host immune responses to Listeria by manipulation of virulence genes the interface between innate and acquired immunity. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003.35:243-253.

112. Pilgrim S., Kolb-Maurer A., Gentschev I., Goebel W., Kuhn M. Deletion of the gene encoding p60 in Listeria monocytogenes leads to abnormal cell division and loss of actin-based motility. Infect Immun. 2003. 71: 3473-3484.

113. Pistor S., Chakraborty Т., Walter U., Wehland J. The bacterial actin nucleator protein ActA of Listeria monocytogenes contains multiple binding sites for host microfilament proteins. Curr. Biol. 1995. 5: 517-525.

114. Porankiewicz J., Wang J., Clarke A.K. New insights into the ATP-dependent Clp protease: Escherichia coli and beyond. Mol Microbiol. 1999. 32: 44958.

115. Portnoy D.A., Chakraborty Т., Goebel W., Cossart P. Molecular determinants of Listeria monocytogenes pathogenesis. Infect Immun. 1992. 60: 12637.

116. Premaratne R.J., Lin W.J., Johnson E.A. Development of an improved chemically defined minimal medium for Listeria monocytogenes. Appl Environ Microbiol. 1991. 57:3046-8.

117. Prieto A.I., Ramos-Morales F., Casadesus J. Bile-induced DNA damage in Salmonella enterica. Genetics. 2004. 168: 1787-1794.

118. Pucciarelli M.G., Prieto A.I., Casadesus J., Garcia-del-Portillo F. Envelope instability in DNA adenine methylase mutants of Salmonella enterica. Microb. 2002. 148: 1171-1182.

119. Pym A.S., Brodin P., Brosch R., Huerre M., Cole S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. Mol. Microb. 2002. 46: 709-717.

120. Reed K.E, Cronan J.E. Jr. Lipoic acid metabolism in Escherichia coli: sequencing and functional characterization of the lipA and lipB genes. J Bacteriol. 1993. 175: 1325-1336.

121. Reglier-Poupet H., Frehel C., Dubail I., Beretti J.L., Berche P., Charbit A., Raynaud C. Maturation of lipoproteins by type II signal peptidase is required for phagosomal escape of Listeria monocytogenes. J Biol Chem. 2003. 278: 4946949477.

122. Reinhard M., Giehl K., Abel K., Haffner C., Jarchau Т., Hoppe V., Jockusch В. M., Walter and U. The proline-rich focal adhesion and microfilament protein VASP is a ligand for profilins. Embo J. 1995. 14: 1583-1589.

123. Renzoni A., Klarsfeld A., Dramsi S., Cossart P. Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present but inactive. Infect Immun. 1997. 65: 1515-1518.

124. Ripio M.T., Brehm K., Lara M., Sua'rez M., Va'zquez-Boland J.A. Glucose-1-Phosphate Utilization by Listeria monocytogenes Is PrfA Dependent and Coordinately Expressed with Virulence Factors. Journal of Bacteriology. 1997. 179: 7174-7180.

125. Ritchie L.J., Hall R.M., Podger D.M. Mutant of Salmonella typhimurium LT2 deficient in DNA adenine methylation. J Bacteriol. 1986. 167: 420^122.

126. Romick T.L., Fleming H.P., McFeeters R.F. Aerobic and anaerobic metabolism of Listeria monocytogenes in defined glucose medium. Appl. Environ. Microbiol. 1996. 62: 304-307.

127. Rouquette C., Ripio M.T., Pellegrini E., Bolla J.M., Tascon R.I., Vazquez-Boland J.A., Berche P. Identification of a ClpC ATPase required for stress tolerance and in vivo survival of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 1996. 21: 977-987.

128. Rozelle A.L., Machesky L.M., Yamamoto M., Driessens M.H., Insall R.H., Roth M.G., Luby-Phelps K., Marriott G., Hall A., Yin H.L.

129. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate induces actin-based movement of raft-enriched vesicles through WASP-Arp2/3. Curr. Biol. 2000., 10: 311-320.

130. Runyen-Janecky L. J., Reeves S.A., Gonzales E.G., Payne S.M. Contribution of the Shigella flexneri Sit, Iuc, and Feo iron acquisition systems to iron acquisition in vitro and in cultured cells. Infect. Immun. 2003. 71: 1919-1928.

131. Schuchat A., Swaminathan В., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. Clin. Microbiol. Rev. 1991. 4: 169-183.

132. Seeliger H.P.R. Listeriosen. Springer-Verlag KG, 1958.

133. Sheehan В., Klarsfeld A., Msadek Т., Cossart P. Differential activation of virulence gene expression by PrfA, the Listeria monocytogenes virulence regulator. J Bacteriol. 1995. 177: 6469-76.

134. Sheehan В., Kocks C., Dramsi S., Gouin E., Klarsfeld A.D., Mengaud J., Cossart P. Molecular and Genetic Determinants of the Listeria monocytogenes infectious process. Current Topics in microbiology and immunology. 1994. 192: 187216.

135. Skoble J., Portnoy D.A., Welch M.D. Three regions within ActA promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility. J. Cell Biol. 2000. 150: 527-538.

136. Smith R.L., Maguire M.E. Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity. Mol. Microbiol. 1998. 28: 217-226.

137. Stritzker J., Janda J., Schoen C., Taupp M., Pilgrim S., Gentschev I., Schreier P., Geginat G., Goebel W. Growth, virulence, and immunogenicity of Listeria monocytogenes aro mutants. Infect. Immun. 2004. 72: 5622-5629.

138. Stull T. L. Protein sources of heme for Haemophilus influenzae. Infect. Immun. 1987. 55: 148-153.

139. Taylor V.L., Titball R.W., Oyston P.C.F. Oral immunization with a dam mutant of Yersinia pseudotuberculosis protects against plague. Microbiology. 2005. 151: 1919-1926.

140. Templin M.F., Ursinus A., Holtje J.V. A defect in cell wall recycling triggers autolysis during the stationary growth phase of Escherichia coli. EMBO J. 1999. 18:4108-4117.

141. Tullius M.V., Harth G., Horwitz M. A. Glutamine synthetase GlnAl is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in human THP-1 macrophages and guinea pigs. Infect. Immun. 2003. 71: 3927-3936.

142. Ursinus A., Steinhaus H., Holtje J.V. Purification of a nocardicin A-sensitive LD-carboxypeptidase from Escherichia coli by affinity chromatography. J Bacteriol. 1992. 174: 441-446.

143. Van Heyningen W. E., Gladstone G. P. The neurotoxin of Shigella shigae. 3. The effect of iron on production of the toxin. Br. J. Exp. Pathol. 1953. 34: 221-229.

144. Vazquez-Boland J.A, Kocks C., Dramsi S., Ohayon H., Geoffroy C., Mengaud J., Cossart P. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread. Infect Immun. 1992. 60:219-230.

145. Vazquez-Boland J.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn В., Krefl J., Goebel W. Pathogenicity islands and virulence evolution in Listeria. Microb. Inf. 2001. 3: 571-584.

146. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty Т., Dominguez-Bernal G., Goebel W., Gonzalez-Zorn В., Wehland J., Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 2001. 14: 584-640.

147. Vijh S., Pamer E.G. Immunodominant and subdominant CTL responses to Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 1997, 158: 3366-71.

148. Villar-Palasf C., Guinovart J.J. The role of glucose 6-phosphate in the control of glycogen synthase. FASEB J. 1997. 11: 544-58.

149. Walker J.C., Verma N.K. Cloning and characterization of the aroA and aroD genes of Shigella dysenteriae type 1. Microbiol. Immunol. 1997. 41: 809-813.

150. Welch M.D., Iwamatsu A., Mitchison T.J. Actin polymerization is induced by Arp2/3 protein complex at the surface of Listeria monocytogenes. Nature. 1997. 385: 265-269.

151. Welch M.D., Rosenblatt J., Skoble J., Portnoy D.A., Mitchison and T.J. Interaction of human Arp2/3 complex and the Listeria monocytogenes ActA protein in actin filament nucleation. Science. 1998. 281: 105-108.

152. Wesley I.V. Listeriosis in animals, p.39-73. In: E.T.Ryser and E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. 1999. Marcel Dekker Inc. New York, NY.

153. White-Ziegler C.A., Black A.M., Eliades S.H., Young S., Porter K. The N-acetyltransferase RimJ responds to environmental stimuli to repress pap fimbrial transcription in Escherichia coli. J Bacteriol. 2002. 184: 4334-4342.

154. White-Ziegler C.A., Low D.A. Thermoregulation of the pap operon: evidence for the involvement of RimJ, the N-terminal acetylase of ribosomal protein S5. J Bacteriol. 1992. 174: 7003-7012.

155. Wiedmann M., Bruce J.L., Keating C., Johnson A.E., McDonough P.L., Batt C.A. Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeriamonocytogenes lineages with differences in pathogenic potential. Infect. Immun. 1997. 65:2707-2716.

156. Yoshikawa A., Isono S., Sheback A., Isono K. Cloning and nucleotide sequencing of the genes riml and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteins S18 and S5 of Escherichia coli K12. Mol Gen Genet. 1987. 209: 481-488.

157. Zalevsky J., Grigorova I.I., Mullins R.D. Activation of the Arp2/3 complex by the Listeria ActA protein: ActA binds two actin monomers and three subunits of the Arp2/3 complex. J. Biol. Chem. 2001. 276: 3468-3475.

Информация о работе

Юров, Дмитрий Сергеевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы