Вителлогении полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata как биомаркер эстрогенного загрязнения

Швед, Никита Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вителлогении полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata как биомаркер эстрогенного загрязнения
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Вителлогении полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata как биомаркер эстрогенного загрязнения"

005006040

Швед Никита Александрович

Вителлогенин полосатой камбалы Ыоряеиар^ти/аьаа/п как биомаркер эстрогенного загрязнения

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 ДЕК 2011

Владивосток - 2011

005006040

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Спсина Иранда Гермогеновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Жадан Петр Михайлович

доктор биологических наук Ламаш Нина Евгеньевна

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится 27 декабря в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

Телефон: (423)2310905, факс: (423)2310900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН (690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.)

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан

ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

М.А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы резко возрос интерес биологов к проблеме действия ксенобиотиков -химических веществ, загрязняющих окружающую среду вследствие хозяйственной деятельности человека, - на физиологические функции организма, регулирующиеся гормонами. Многие синтетические химические соединения могут имитировать или блокировать действие естественных гормонов, изменять уровень гормонов в крови и тканевых жидкостях. Эти вещества, разрушающие эндокринную систему (endocrine disruptors - EDs), приводят к появлению аномалий развития и нарушению репродуктивной функции человека и животных (Arukwe et al., 2003). Основное внимание уделяется выявлению EDs с эстрогенными свойствами (White et al., 1994; Sonnenschein, Soto, 1998), поскольку их действие приводит к "феминизации" мужских особей - явлению, наиболее часто регистрируемому у морских и пресноводных рыб.

На молекулярном уровне феминизация самцов рыб проявляется в индукции синтеза специфических белков, имеющих особое значение для организма самок, таких как вителлогенин (Vtg). Вителлогенин - димерный гликофосфолипопротеид высокой молекулярной массы (300-600 кДа), предшественник яичного желтка, синтезируется в печени самок рыб под воздействием эстрогенных гормонов (Bieberstein et al., 1999) и транспортируется с кровью в яичники, где поглощается ооцитами в процессе вителлогенеза. Аномальный синтез Vtg у самцов и неполовозрелых рыб может приводить к появлению интерсексов и индуцировать патологические изменения в семенниках, печени и почках.

Для Амурского залива очень актуальной является проблема загрязнения бытовыми и промышленными сточными водами. Спектр загрязняющих воды Амурского залива веществ широк, поэтому постоянно регистрируются новые эффекты загрязнения, в том числе отнесенные к воздействию EDs. Получены результаты о появлении в заливе интерсексуальных особей среди морских безпозвоночных, таких как приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis (Сясина и др., 1996) и морской еж Strongylocentrotiis intermedins (Сясина, Ващенко, 2007).

Вителлогенины разных видов рыб отличаются по молекулярной массе и аминокислотному составу. В связи с этим возникла задача оптимизации существующих методов определения Vtg для выбранного нами вида камбал (L. pinnifasciata). Наиболее точным, специфическим и используемым методом количественного определения Vtg в плазме крови является иммуноферментный анализ (ИФА).

Цели и задачи работы

Цель данной работы - разработка специфической иммуноферментной тест-системы для определения Vtg полосатой камбалы L. pinnifasciata и проведение мониторинговых исследований по выявлению эстрогенных эффектов загрязнения Амурского залива (зап. Петра Великого Японского моря). Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1) выделить и очистить вителлогенин полосатой камбалы, подтвердив принадлежность полученного белка к вителлогенинам;

2) получить специфичные поликлонапьные антитела к вителлогенину полосатой камбалы и разработать высокочувствительную тест-систему для его определения на основе оптимизации существующих методов ИФА;

3) определить концентрации вителлогенина в плазме крови самок, самцов и ювенильных особей полосатой камбалы из умеренно загрязненной акватории Амурского залива;

4) исследовать печень и гонады полосатой камбалы из Амурского залива на наличие патологических изменений; определить встречаемость различных типов изменений печени у половозрелых самок и самцов с разным уровнем вителлогенина в плазме крови;

5) оценить эстрогенную активность гексэстрола и смеси полихлорированных бифенилов "Совол" для морских рыб посредством определения содержания вителлогенина в плазме крови и выявления гистопатологических изменений в печени и гонадах камбал при воздействии этих веществ.

Научная иовизна

Выделен и очищен Vtg полосатой камбалы L. pinnifasciata. Установлено, что аминокислотный состав данного белка сходен с аминокислотным составом вителлогенинов других представителей камбалообразных - белокорого палтуса Hippoglossus hippoglossus и вераспера Мозера Verasper moserí. Разработана специфическая и высокочувствительная иммуноферментная тест-система для определения концентраций Vtg в плазме крови L. pinnifasciata. Определено содержание Vtg в плазме самок полосатой камбалы в разное время года и на разных стадиях зрелости гонад. Установлено, что в ответ на эстрогенную стимуляцию самцы L. pinnifasciata могут синтезировать Vtg в тех же количествах, что и самки. Показано, что ювенильные особи и самцы полосатой камбалы из Амурского залива (зал. Петра Великого Японского моря) синтезируют Vtg, уровень которого в плазме крови может достигать 1 мг/мл, что свидетельствует о наличии в водах залива загрязняющих веществ с эстрогенной активностью. Впервые для камбал из загрязненных акваторий показана корреляция между содержанием Vtg в плазме крови и наличием патологических изменений в печени, при этом встречаемость некроза и кариопикноза гепатоцитов выше у самцов с высокой и у самок с низкой концентрацией Vtg в плазме. Впервые проведена оценка воздействия гексэстрола и смеси полихлорированных бифенилов "Совол" на синтез Vtg у рыб. Показано, что гексэстрол обладает очень высокой эстрогенной активностью, тогда как совол - отсутствием таковой.

Теоретическое и практическое значение работы

Представленные в работе данные подтверждают наличие нескольких типов Vtg у камбаловых рыб, в том числе и у полосатой камбалы L. pinnifasciata. Функциональное значение каждого типа Vtg только предстоит изучить. Разработанная иммуноферментная тест-система для количественного определения Vtg в плазме крови полосатой камбалы открывает новые возможности экспериментального выявления эстрогенных свойств у различных химических веществ. У самцов и ювенильных особей L. pinnifasciata из Амурского залива выявлены достаточно высокие концентрации Vtg, что свидетельствует о влиянии веществ, обладающих эстрогенной активностью, на эндокринную систему рыб. Впервые для России произведена оценка загрязнения водной среды эстрогенными веществами посредством определения Vtg в плазме крови рыб. Практическое значение работы также связано с возможностью проведения регулярного мониторинга загрязнения прибрежных вод Дальневосточного региона веществами, обладающими эстрогенной активностью, используя широко распространенный вид - полосатую камбалу L. pinnifasciata. Результаты работы указываюь на наличие нескольких типов Vtg и их дифференцированном синтезе у костистых рыб и могут быть включены в программу курсов по клеточной и молекулярной биологии, ихтиопатологии для высших учебных заведений.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции "Экологические проблемы использования прибрежных морских акваторий" (Владивосток, 2006), XI Международной молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2007), научной конференции, посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008), Международной научной конференции и международной школе для молодых ученых "Проблемы экологии: Чтения памяти проф. М.М. Кожова" (Иркутск, 2010), годичных научных конференциях Института биологии моря имени A.B. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2009, 2010, 2011), X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России "Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах печатного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 10 таблицами. Список литературы включает 13 отечественных и 219 иностранных источников.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН 10-III-B-06-132, 11-III-B-06-048 и 09-1П16-04.

Благодарности

Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность своему научному руководителю Сясиной Ираиде Гермогеновне за внимательное, деятельное и конструктивное руководство. Автор выражает благодарность н.с. ИБМ ДВО РАН Кумейко В.В. за неоценимую помощь при освоении методов биохимии. Автор благодарит коллектив лабораторий цитофизиологии и фармакологии ИБМ ДВО РАН за моральную поддержку и создание рабочей атмосферы.

МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ

Объект п район исследования. Исследования проводились на полосатой камбале L. pinnifasciata (Kner, 1870). Для выделения Vtg использовали 14 рыб, выловленных в ноябре 2007 г., которых содержали в аквариумах. Содержание Vtg было определено у 104 камбал, выловленных в загрязненной части Амурского залива в ноябре 2008 (N=20), октябре 2009 (N=46) и 2010 (N=29), мае 2011 (N=9) годов. Кроме этого, концентрация Vtg определена у опытных камбал, подвергнутых воздействию EDs (N=33). Во всех случаях отбор крови производили в течение 2 ч после отлова рыб.

Биохимические методы. Для получения необходимого количества Vtg его синтез у опытных рыб стимулировали внутрибрюшной инъекцией гексэстрола 0.5 мг на 100 г массы. Плазму гексэстрол обработанных рыб освободили от неорганических ионов посредством колоночной хроматографии на носителе Sephadex G 25 coarse. Очистку Vtg проводили методом ионообменной хроматографии на носителе Q-Sepharose с последующей тонкой очисткой Vtg методом гель-фильтрации на носителе Sephadex G 200. Содержание белка в элюате на всех этапах хроматографической очистки Vtg регистрировали на спектрофотометре Shimatzu UV-2550 по оптической плотности растворов. Определение гомогенности Vtg и молекулярной массы его полипептидов определяли методами нативного (Maltais, Roy, 2009) и денатурирующего электрофореза (Laemmli, 1970). Проверку специфичности антител проводили методом вестерн-блоттинга (Towbin, 1984). Идентификацию Vtg осуществили методом масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF MS (анализ проведен в ЗАО "Постгеномные и нанотехнологические инновации" (Москва, Россия)). Поиск первичных аминокислотных последовательностей проведен посредством поискового сервиса Mascot Search в базе данных NCBI.

Для выявления эстрогенной активности двух чужеродных для рыб соединений, гексэстрола и смеси полихлорированных бифенилов, проведены два эксперимента. Особям L. pinnifasciata, произвели внутрибрюшинные инъекции; в двух подопытных и двух контрольных группах. В первом эксперименте рыбам вводили раствор гексэстрола на оливковом масле с концентрацией 5 мг/мл в дозе 5 мг вещества на кг массы. Во втором эксперименте использовали смесь полихлорированных бифенилов "Совол". Раствор ПХБ на ФБС с концентрацией 250 нг/мл вводили рыбам из расчета 250 нг ПХБ на кг массы. В обоих экспериментах кровь подопытных и контрольных камбал для определения Vtg в плазме брали через 7 сут после инъекции, одновременно фиксировали образцы тканей печени и гонад в 4% параформальдегиде для последующего гистологического анализа.

Иммунохпмические методы. Для получения антисыворотки к Vtg проводили иммунизацию кроликов. Титр антисыворотки определяли методом иммуноферментного анализа (Егоров и др., 1991). Фракцию иммуноглобулинов получали осаждением сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на носителе DEAE-Sepharose. Конъюгацию пероксидазы хрена с IgG проводили периодатным методом (Егоров и др., 1991).

Концентрацию Vtg определяли в плазме крови рыб сэндвич-методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Аликвоту крови 1.5 мл отбирали из жаберной артерии рыб в микропробирки, содержащие 1/10 часть гепарина (активность 5000 ME/мл), после чего получали плазму.

Планшет сенсибилизировали IgG кролика к Vtg камбалы в течение. В каждую лунку вносили по 200 мкл раствора IgG с концентрацией 30 мкг/мл в фосфатном буфере, pH 7.4, на 0,9% NaCl с 0.05% твин 20 (ФБС-твин 20). Планшет отмывали от несвязавшихся IgG после

чего возможные свободные сайты сорбции блокировали раствором БСА с концентрацией 5 мг/мл в течение 1 ч при 37°С. Плазму самок L. pinnifasciata предварительно разбавляли ФБС-твин 20 в 1500 раз (плазму самцов - от 2 до 50 раз), и далее на отдельном планшете с низкой сорбционной емкостью приготавливали серии разведений до конечного разведения в 192000 раз (плазму самцов раститровывали в 256-64000 раз). Для построения калибровочной кривой использовали серии разведений очищенного Vtg- от 10 мкг/мл до 78.1 нг/мл. Данные серии разведений переносили на планшет с иммобилизированными против Vtg IgG кролика и инкубировали 1 ч при 37°С, после чего производили отмывку планшета Для оценки связавшегося Vtg на следующем этапе планшет инкубировали 1 ч при 37°С с раствором IgG кролика, конъюгированных с ПХ. Для визуализации результатов анализа добавляли раствор субстрата - ОФДА в фосфат-цитратном буфере, pH 5.0. Реакцию останавливали 5% H2S04 после приобретения раствором стабильной окраски. Измерение оптической плотности проводили на универсальном фотометре для микропланшетов ELx800uv (Bio-Tek Instruments, USA) при длине волны 495 нм.

Для выполнения процедур калибровки метода строили график зависимости оптической плотности продуктов реакции при >.=495 нм от концентрации Vtg в серии стандартных образцов. Основную часть графика преобразовали в линейную форму проведением десятичного логарифмирования данных по осям абсцисс и ординат. Концентрацию Vtg рассчитывали по формуле:

С = (10х)хп,

где С - концентрация Vtg, мкг/мл; п - степень разведения плазмы; х = (y-b)/a, (Ь и а -коэффициенты линейной регрессии, у = LgD495). Значениям у соответствовали линейные участки графика зависимости Lg оптической плотности продуктов реакции от Lg концентрации стандартов

Гистологический п морфометрический анализ. У выловленных рыб брали кусочки органов и фиксировали их в жидкости Буэна или 4% параформальдегиде. Далее материал заливали по стандартной методике (Роскин, Левинсон, 1957). Срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином-эозином. Полученные препараты исследовали под световым микроскопом OLYMPUS (Япония), фотографировали с помощью цифровой камеры той же фирмы. Патология печени полосатой камбалы была изучена в соответствии с рекомендациями Международного совета по изучению моря (International Council for the Exploration of the Sea, ICES) (Feist et al., 2004). В печени рыб определяли встречаемость гистопатологических изменений, которые в настоящее время приняты как биомаркеры токсического воздействия поллютантов. Повреждения печени классифицировали на основе диагностических критериев, предложенных Хинтоном с соавторами (Hinton et al., 1992; Hinton, 1996). Стадии зрелости гонад камбал определяли на гистологических препаратах на основании признаков, предложенных А. П. Ивановым (1988).

Для морфометрического анализа ооцитов на гистологических препаратах посредством программного обеспечения Тест-Размер 5.0 были измерены площади 50 ооцитов у каждой самки в контрольной (п=5) и опытной (п=6) группах. Диаметр клеток определяли по формуле:

DC/3.14,

где С - длина окружности ооцита; D - диамерт клетки.

Статистическая обработка дапиых. После разработки ИФА для определения концентрации Vtg в плазме крови полосатой камбалы, произвели вычисление внутри- и межэкспериментальной дисперсии. Для расчета внутриэкспериментапьной дисперсии на одном 96-луночном микропланшете измерили концентрацию Vtg в 10 сериях разведения очищенного стандарта Vtg в диапазоне концентраций от 152 нг/мл до 2.5 мкг/мл (концентрацию Vtg измеряли для одной степени разведения, концентрация Vtg в которой соответствовала 1.4 мкг/мл). Внутриэкспериментальная дисперсия вычислялась по формуле:

%CV=(SD/M)*100,

где %CV - внутриэкспериментальная дисперсия в %, SD - стандартное отклонение, M -средняя концентрация Vtg, вычисленная в 10 сериях разведения.

Для расчета межэкспериментальной дисперсии на восьми 96-луночных микропланшетах в разные дни измерили концентрацию Vtg в 1 серии разведения очищенного стандарта Vtg в

диапазоне концентраций от 152 нг/мл до 2.5 мкг/мл (концентрацию Vtg измеряли для одной степени разведения, концентрация Vtg в которой соответствовала 1.4 мкг/мл). Межэкспериментальная дисперсия вычислялась по формуле:

%CV=(SD/M)*100,

где %CV - межэксперементальная дисперсия в %, SD - стандартное отклонение, M -средняя концентрация Vtg, вычисленная в 10 сериях разведения.

Параллельность кривых разведения стандарта Vtg и образцов плазмы была измерена посредством анализа ковариации (ANCOVA) с помощью программного обеспечения Microsoft office excel 2003. Значения концентраций Vtg в плазме крови рыб были подвергнуты десятичному логарифмированию и сопоставлены между собой посредством программного обеспечения STAT1STICA 6. Данные морфометрического анализа обработаны, используя пакет программ GraphPad Prizm методом Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика вителлогенина полосатой камбалы Liopsetta pinnifascintn и разработка иимуноферментной тест-системы для его количественного определении в плазме крови. Для получения очищенного Vtg его выделяли из плазмы крови самок полосатой камбалы, предварительно стимулированных синтетическим эстрогеном -гексэстролом. По данным нашего исследования концентрация белка в плазме крови полосатой камбалы L. pinnifasciata увеличилась с 15 до 35.5 мг/мл через 10 сут после инъекции гексэстрола, что отражает закономерности, установленные другими исследователями (Norberg, 1995; Maltais, Roy, 2009; Heppell, Sullivan, 1999).

Профиль элюции ионообменной хроматографии отразил несколько пиков выхода белков (рис. I А), элюция Vtg происходила в диапазоне концентраций NaCl 0.35-0.5 M, что в целом соответствует результатам Брайна с соавторами (Brion et al., 2000). При разработке методов выделения Vtg было показано, что элюция белка может начинаться при концентрациях NaCl 0.2-0.4 M (Brion et al., 2000; Hiramatsu et al., 2002; Maltais, Roy, 2009); последний пик профиля элюции при градиенте NaCl от 0-0.05 M до 0.5-0.55 M соответствует Vtg.

Для гель-фильтрации можно использовать Superdex 200 HR (Maltais, Roy, 2009), который является аналогом Sephadex G200, использованного в нашей работе. По окончании гель-фильтрации получен профиль элюции (рис. 1 Б), отразивший один пик выхода Vtg и невысокое плато выхода примесей, что соответствует результататам Брайна с соавторами (Brion et al., 2000).

Рис. 1. Хроматографическая очистка Vtg полосатой камбалы Порами ртт/азсМа. А - Профиль элюции раствора белков плазмы крови полосатой камбалы на носителе (З-Зерйагозе. О'28о - оптическая плотность элюата при л = 280 нм, См.,а, М - концентрация ИаО, М. Б - Профиль элюции раствора белков плазмы крови полосатой камбалы на носителе 8ер1^ех в 200. Пик выхода вителлогенина находится между 9000 и 13500 с, плато различных примесей - в диапазоне от 13500 до 20000 с.

Картина электрофоретического разделения Vtg разных видов рыб различается как по массе полипептидов, так и по их количеству. При денатурирующем электрофорезе в присутствии ДДС в восстанавливающих условиях Vtg радужной форели О. mykiss распадается на четыре полипептида массой 240, 170, 90 и 30 кДа (Brion et al., 2000). У палтуса Я. hippoglossus и морского окуня M. microlepis при тех же условиях преобладает одна полоса Vtg массой 160 кДа (Norberg, 1995) и 183 кДа (Heppell, Sullivan, 1999) соответственно. Вителлогенин полосатой камбалы L. pinnifasciata в присутствии ДДС разделился на несколько полипептидов, масса которых соответствует 180, 98, 70, 52, 41 и 37 кДа (рис. 2). В условиях нативного электрофореза подтверждена гомогенность Vtg. Таким образом, мы установили, что все полипептиды полосатой камбалы, идентифицируемые при денатурирующем электрофорезе, представляют собой единый белковый комплекс, характерный для Vtg.

Молекулярная масса самого тяжелого полипептида Vtg полосатой камбалы (180 кДа) приблизительно соответствует таковой, установленной для других видов камбаловых рыб (от 160 до 205 кДа); наиболее близкие значения выявлены у зимней камбалы Pleuronectes americanus (175 кДа) и камбалы-тюрбо Scophlhalmus maximus (185 кДа), а наиболее значимые отличия - у чилийской камбалы Paralichlhys adspersus (205 кДа).

Рис. 2. Картина электрофоретического разделения в денатурирующих (ДДС-ПААГ), нативных (Нативн. ПААГ) условиях и вестерн-блоттинга (ВБ) очищенного вителлогеиина (Vtg), плазмы крови самцов (М4) и самок (F4) полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata и амассина (Ams) морского ежа Strong)>locenlrotus rtudus. Стд - белки-маркеры молекулярных масс. Отсутствие

иммунореакции с плазмой крови самцов и амассином морского ежа указывает на специфичность полученных антител.

ДДС-ПАЛГ ВБ ДДС-ПАЛГ BE ВС Нации. ПЛАТ ОБ ЦБ

Два самых крупных полипептида Vtg с молекулярными массами 180 (Vtg 180 кДа) и 98 кДа (Vtg 98 кДа) были вырезаны из геля и обработаны трипсином для проведения масс-спектрометрического анализа (MALDI TOF MS). В результате анализа трипсинизированных пептидов получены величины отношений массы этих пептидов к заряду (m/z). Величины m/z были использованы для идентификации пептидов и поиска их первичных аминокислотных последовательностей посредством поискового сервиса Mascot Search. По результатам поиска в базе данных NCBI установлено, что наибольшим сходством с Vtg полосатой камбалы обладает Vtg белокорого палтуса Я. hippoglossus и вераспера Мозера V. moseri (табл 1,2).

Сходство Vtg полосатой камбалы с Vtg белокорого палтуса и вераспера Мозера можно объяснить большой филогенетической близостью подсемейства Hippoglossinae (в которое входят Я. hippoglossus и V. moseri) и подсемейства Pleuronectinae (к которому относится L. pinnifasciata), что было установлено на основании молекулярно-филогенетического исследования камбалообразных рыб по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома В и цитохромоксидазы 1 (Шарина, Картавцев, 2010). Известно, что Vtg палтуса и вераспера очень сходны по аминокислотному составу. Так, VtgAa и VtgAb вераспера обладают наибольшим сходством с VtgAa и VtgAb палтуса, что было установлено по данным секвенирования этих белков (Reading et al, 2009).

В составе Vtg Я. hippoglossus присутствуют 17 пептидов с величинами m/z, близкими к таковым, полученным для Vtg 180 кДа и 15 пептидов с m/z величинами, полученным для Vtg 98 кДа L. pinnifasciata (табл. 1).

кДа Ста VlB Vlg F4 М4 F4 М4 Vit Ams Vlg /Uns

На втором месте по сходству с Vtg L. pirmifascita располагаются Vtg вераспера Мозера V. moseri. (табл. 2). В базе данных NCBI идентифицированы 26 пептидов Vtg вераспера Мозера, значения m/z которых близки с полученными нами в результате MALD1 TOF MS для полосатой камбалы. Причем пептиды Vtg L. pinnifascita идентифицированные в полипептиде 180 кДа наиболее характерны для Vtg В V. moseri, тогда как пептиды Vtg L. pinnifascita идентифицированные в полипептиде 98 кДа наиболее характерны для Vtg А V. moseri (рис. 3).

Для проверки результатов MALDI-TOF анализа четыре пептида Vtg L. pinnifascita были подвергнуты секвенированию de novo. Пептиды IANLDVDMYPR, ALSDWR и YEALLLSGLPEEGLAR, FLELIQVLR были обнаружены в полипептидах Vtg массой 180 и 98 кДа соответственно. Данные четыре пептида исследуемого белка полосатой камбалы ранее были установлены для Vtg А и В типов вераспера Мозера.

Таблица I. Сравнительный анализ величины m/z пептидов, полученных после трипсинизации вителлогенинов белокорого палтуса (Vtg Hippoglossus hippogtossus) (данные из http.V/www. matrixscience.com') и полосатой камбалы (Vtg 180 и 98 кДа Liopsettapinnifasciata)

Величина m/z (экспериментальная)

L. pinnifasciata VtB 180 кДа Vtg Н. hippoglossus Пептиды Vtg Н. hippogtossus

747.4091 746.4018 K.ALSDWR.A*

821.4510 820.4437 K.VVDWMR.G

835.5339 834.5266 K.ALHPELR.M

1057.6847 1056.6774 R.AEG VQ EAFLK.I

1190.7181 1189.7108 K..THYVISEDVK.A

1223.8428 1222.8355 K.LQLLPVQGIDK.I

1363.8797 1362.8724 K.IASAIVETYAVAR.N

1402.8160 1401.8087 K.VQGYQIAAYFDK.A

1431.7882 1430.7809 R.DQSQEQNEINVK.I

1474.8932 1473.8859 R.ANPTSQPLGSLYVK.F

1506.8564 1505.8491 K.LENQMTLLGQESK.C

1523.8785 1522.8712 K.MIQDIAIQLFMGK.A

1697.0050 1695.9977 R.TYLAGAYADVLEVTGVR.A

1720.9711 1719.9639 K.YEAVLMCGLPEEGLAR.A

1729.8981 1728.8909 K.STDVQEEAEAHLACR.C

1755.0312 1754.0239 R.LQVIVANLAENDHYR.I

1977.0663 1976.0590 K.TQNVYELQEPGVQGICK.T

Vtg 98 кДа

747.3497 746.3425 K.ALSDWR.A*

795.4910 794.4838 K.IPVEPIK.A

835.4720 834.4647 K.ALFIPELRM

850.5750 849.5677 R.VHTIVPGK.I

1009.5527 1008.5455 K.DIGLAYTEK.C

1057.6053 1056.5980 R.AEGVQEAILK.I

1092.5239 1091.5166 K.DCPLYAIIGK.H

1223.7768 1222.7696 K.LQLLPVQGIDK.I

1363.8040 1362.7967 K.IASAIVETYAVAR.N

1490.7239 1489.7166 K.LENQMTLLGQESK.C

1496.8911 1495.8838 K.LLPGFGSAAANLPLR.V

1523.7984 1522.7911 K.MIQDIAIQLFMGK.A

1720.8843 1719.8771 K.YEAVLMGGLPEEGLARA

1792.9485 1791.9412 K.LVDPEIFEYSG1WPK.D

2614.3777 2613.3704 K.DEGIALHAPNHGLOEVFLDLNALK.V

* Неспецифические пептиды, обнаруженные в составе обоих полипептидов вителлогенина полосатой камбалы с молекулярной массой 180 и 98 кДа, выделены жирным шрифтом.

Таблица 2. Сравнительный анализ величины m/z пептидов, полученных после трипсинизации вителлогенинов вераспера Мозера (Vtg Verasper moseri) (данные из hnvv.//ww\Y.matrixscieiTCexom'i и полосатой камбалы (Vtg 180 и 98 кДа Liopseua pinnifasciaia)

Величина miz (экспериментальная)

L. pinnifasciata Пептиды Vtg В V. moseri

Vtg 180 кДа Vtg Vtg V, moseri

747.4091 746.4018 K.ALSDWR.A

821.4510 820.4437 K.VVDWMR.G

835.5339 834.5266 K.ALHPELR.M*

1057.6847 1056.6774 R.AEGVQEAILK.I

1223.8428 1222.8355 K.LQLLPVQG1DK.V

1322.7592 1321.7519 K.IANLDVDMYPR.D

1402.8160 1401.8087 K.VQGYQIAAYFDK..A

1431.7882 1430.7809 R.DQSQEQNEINVK.I

1474.8932 1473.8859 R.ANPTSQPLGSLYVK.F

1523.8785 1522.8712 K.MIQDIA1QLFMGK.A

1697.0050 1695.9977 R.TYLAGAYADVLEVTGVR.A

1720.9711 1719.9639 К. YEAVLMGGLPEEGLAR. А

1977.0663 1976.0590 K.TQNVYELQEPGVQGICK.T

Vtg 98 кДа

835.4720 834.4647 K.AL1IPELRM

850.5750 849.5677 R.IVPUPAK.L

881.5643 880.5570 K.ILNPVLGR.L

1009.5527 1008.5455 K.DIGLAYTEK.C

1101.6333 1100.6260 R.TEGLQEALLK.N

1130.7249 1129.7177 K.FLELIQVLR.A

1157.6234 1156.6162 R.IMQALSHWR.S

1159.6590 1158.6517 K.LEMEIQVTGPK.A

1182.6358 1181.6285 K.TLYAITEDEK.A

1563.9046 1562.8973 K.SSNQLSATLIATSDR.E

1672.9285 1671.9212 K.AGAFLAGAAADVVEVTGVR.T

1730.9611 1729.9538 K.YEALLLSGLPEEGLAR.A

1792.9485 1791.9412 K..LVEPELFEYSGVWPK.D

* Пептиды, присутствующие в обоих полипептидах полосатой камбалы, выделены жирным шрифтом.

Таким образом, с помощью MALD1-TOF MS анализа, подтверждена принадлежность очищенного белкового препарата, полученного из плазмы крови L. pinnifasciata к Vtg.

Перед процедурой определения концентрации Vtg в плазме крови камбал, проведена калибровка иммуноферментного анализа. Трансформирование значений концентраций Vtg и оптической плотности раствора с помощью десятичного логарифмирования позволило получить линейную форму зависимости оптической плотности продуктов реакции от концентрации Vtg в диапазоне от 156 нг/мл до 2.5 мкг/мл. Типичный вид калибровочного графика представлен на рис. 4. Предел определения Vtg составил 156 нг/мл, что вполне соответствует чувствительности подобных методов, разработанных для других видов рыб: 15 нг/мл - для гладкой камбалы Р. putnami (Roy et al., 2004) и 100 нг/мл - для золотистых бычков Acanthogobius flavimanus (Ohkubo et al., 2003) и кумжи Salmo trutta (Bjerregaard et al., 2006). Больший предел чувствительности полученный для данного метода в некоторых работах объясняется дополнительным уровнем сэндвича из первичных антител, что увеличивает чувствительность метода. Внутри- и межэкспериментальная дисперсия ИФА для определения Vtg в плазме крови L. pinnifasciata составила 10 и 18% соответственно. Данный показатель соответствует таковым в сходных методах количественного определения Vtg в плазме крови: 10 и 20% соответственно (Sumpter, 1985), от 2.4 до 14% для внутриэкспериментальной дисперсии (Li et al., 2006), в пределах 10% для внутри- и межэкспериментальной дисперсии (Anderson et al., 1996; Mills et al., 2001; Scott et al., 2006).

VtgB

VtgA

1 KKVIVLALAV 31 GLKV5SKVLI 101 AQLLTPIXTZ 131 TELQEP6VQ6

201 TEKCVECE3R 251 NGAAQMEAKQ 301 LRI3NAEAQI 331 LBTOFKARPD 401 ASVHUVTADL 431 PVCPAILVRP 501 PGFGSAAANL 331 mUVSAIVLrr

631 VNDAATLHPR 701 VbRITKHKQV 731 UELATGPAL 001 E1.STYTAAVA B31 HTYAVKGVWT 901 WDKVASA1V 951 V33ErrS<3tP 1001 KbCPLYAIIG 1031 EEEEILEDKS »01 JOfVKTSXKLW 1131 OHAVSTARAN 1201 ОЯЦААХПК 1231 ECKOYETEIT 1301 REACVSLAKV 1331 LPVGETAVEL 1401 EHPHSCYOTL 1451 NAIWKVNCV 1301 LNALKVKW» 1531 UPGKSCRDAS 1601 RTTJVTVCFH 1631 A

МТЖЬТЗАЬА OLNIKKTCHV KinKDICLAT F3PFDEIINGA LQNPLQLIKI 0FEDLEHI.U3 EAAQALIA3V SKYCAEKTVC KPITKHLPXH ПОЖЖИОН HTKSM3AIQI AAASAPYIND NPAWDSADR DKALIOOVIS

XRPSVAVNTF LEVLPVSAPE KHSSSA.AAS3 CVKVATENAA JUEXLIXOJM SSSSSASSLA SATPSKSKS SVYLDKPTAR YDTK1TAETG IQAKDEKSS* KGLTPFDDAA VLAOOCTDEL BEIPISNLPY DUKKGOTCGL TicRinarsv HCOPADSAVT

Рис. 3. Аминокислотная последовательность В и А вераспера Мозера V. тохеп (данные по: http://www.matrixscience.com'). Жирным выделены пептиды, идентифицированные в полипептидах полосатой камбалы массой 180 кДа (У^ В) и 98 кДа А).

у = 0.2674х + 2.7457 R2 = 0.9928

-1.5

-1 -0.5

LgC (мкг/мл)

- стандарт -образец I

- образец 2

- образец 3

- образец 4

- образец 5

- образец 6

-БСА

■Linear (стандарт)

Рис. 4. Калибровочный график для определения концентрации вителлогенина в плазме крови полосатой камбалы L. pinnifasciata сэндвич-методом твердофазного иммуноферментного анализа. Линейный участок графика (Linear (стандарт)) соответствует интервалу концентраций вителлогенина от 156 до 2500 нг/мл. Условные обозначения: образец 1-6 - кривые, полученные для разведенных образцов плазмы крови камбал; БСА - кривая разведения бычьего сывороточного альбумина; LgD495 - десятичный логарифм величины оптической плотности при X = 495 нм; LgC (мкг/мл) - десятичный логарифм концентрации вителлогенина, нг/мл.

Статистически значимого различия между коэффициентами наклона калибровочной кривой и наклона кривой разведенных образцов плазмы крови выявлено не было (ANCOVA, FWb Р>0.05). Таким образом, следует считать, что линии регрессии параллельны. Коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) для калибровочной кривой составил 0.99.

Содержание вителлогенина в плазме крови и гистопатологические изменения печепи камбал из умеренно загрязненной акватории Амурского залива (зал. Петра Великого Японского моря). Концентрация Vtg в плазме крови полосатой камбалы из кутовой части Амурского залива варьирует в течение года и зависит от пола особи, стадии

зрелости гонад и времени года. Так, концентрация в плазме самок, выловленных в ноябре 2008 г., изменялась от 5.29 до 28.36 мг/мл и составила в среднем 16.38±6.73 мг/мл. Гистологический анализ показал, что все исследованные самки в ноябре находились на IV стадии зрелости гонад (Р4). В выборке октября 2009 г. присутствовали как неполовозрелые (Р2), так и половозрелые самки. Концентрация в плазме самок Р4 в октябре изменялась от 2.21 до 13.43 мг/мл. В это время года уровень Vtg в плазме самок VI был достоверно ниже, чем у Р4 самок и изменялся от 0.002 до 0.789 мг/мл. Наименьшая концентрация Vtg у взрослых самок (от уровня, находящегося за пределами детекции, до 0.029 мкг/л) зарегистрирована в мае у отнерестившихся рыб (табл. 3). Средняя концентрация Vtg у половозрелых самок, выловленных в ноябре 2008 г. достоверно отличалась от средней концентрацией Vtg в плазме крови самок, выловленных октябре 2009, 2010 и мае 2011 гг. При этом не выявлено достоверных отличий между средней концентрацией ^ ювенильных (Р2) и отнерестившихся (Р6) самок, выловленных в октябре 2009 и мае 2011 гг. соответственно (рис. 5).

Рис. 5. Уровни вителлогенина в плазме крови полосатой камбалы Цор.к11а рЬии/сас/аиг из Амурского залива. По оси асцисс - выборки самок (К) и самцов (М) с разной степенью зрелости гонад, по оси ординат - десятичный логарифм средних концентраций Vtg±cтaндapтнoe отклонение.

Таблица 3. Средние (М±80), максимальные (Мах±8Р) и минимальные (Мт±80) концентрации в плазме самок (р) и самцов (М) полосатой камбалы ЦораеЯа р'тп$а$аа1а из Амурского залива,

Пол и стадия зрелости гонад Показатель Концентрация Vtg, мг/мл

ноябрь, 2008 октябрь, 2009 октябрь, 2010 май,2011

Р4 M±SD Min±SD Max±SD 16.38±6.73 5.295±0.7 28.367±2.8 6.57±2.83 2.212±0.26 13.43±0.64 4.99±3.32 0.40±0.049 14.00±1.54 -

МЗ+4 M±SD Min±SD Max±SD 0.29±0.42 НО 0.957*0.017 0.026±0.057 НО 0.244±0.027 0.037±0.077 0.18±0.026 0.294±0.031 -

VI M±SD Min±SD MaxiSD - 0.090±0.232 0.002±0.00056 0.789±0.056 - 0.002±0.004 НО 0.008±0.0009

М2 M±SD MiittSD Max±SD - - - НО НО НО

Р6 M±SD MiittSD MaxiSD - - - 0.029±0.003 НО 0.029±0.003

Мб M±SD Min±SD Max±SD - - - 0.008±0.0008 0.0007±0.00009 0.0027±0.0002

Примечание. НО - концентрация У1§ находилась за пределами детекции, отсутствовали рыбы, находящиеся на данной стадии зрелости.

- в выборке

Вителлогенин также обнаружен и в плазме крови самцов полосатой камбалы из Амурского залива. В ноябре 2008 г. концентрация в плазме крови самцов М4 изменялась от уровня, находящегося за пределами определения (<156 нг/мл) до 0.957 мг/мл.

В октябре 2009 г. наибольший уровень у самцов составил 0.244 мг/мл. Стадии зрелости гонад исследованных самцов несколько различались. Так у самцов М4 в семенниках присутствовали только сперматозоиды, тогда как у менее зрелых самцов (МЗ+4) в ацинусах семенников наряду со сперматозоидами находились и сперматиды. Концентрации в плазме крови самцов, выловленных в октябре 2009 г., в ноябре 2008 г. и в октябре 2009 г. и находящихся на стадиях зрелости гонад МЗ+4 и М4, достоверно не различались. В октябре 2010 г. обнаружен у всех исследованных самцов, его концентрация изменялась от 0.18 до 294 мкг/мл. Концентрация в плазме крови самок в этот период варьировала от 0.40 до 14.00 мг/мл.

Сравнение концентраций у неполовозрелых самок и половозрелых самцов не выявило достоверных отличий (рис. 5). Более того, некоторые индивидуальные значения концентраций у самцов (0.957, 0.932 и 0.432 мг/мл) были выше, чем у неполовозрелых самок.

У камбал, использованных для определения в плазме крови, изучена встречаемость четырех наиболее распространенных гистологических изменений в печени: вакуолизации гепатоцитов, наличия базофильных включений в цитоплазме гепатоцитов, кариопикноза и некроза гепатоцитов (рис. 6).

Рис. 6. Основные типы гистологических изменений печени полосатой камбалы ЫорхеЧа ршп1/а.чЫа1а из кутовой части Амурского залива: А - вакуолизация гепатоцитов (стрелки); Б - некроз гепатоцитов, узкие стрелки указывают на пикноз ядер гепатоцитов, широкие стрелки на очаги некроза; В - пикнотизированные (узкие стрелки) и нормальные (широкие стрелки) ядра гепатоцитов; Г - базофильное включение в гепатоците (широкая стрелка), узкая стрелка указывает на ядро гепатоцита. Масштабный отрезок А, Б, В - 100 мкм, Г - 50 мкм

Вакуолизация гегтатоцитов найдена у 21% рыб с высоким содержанием Vtg (от 7 до 15 мг/мл) в ноябре 2009 г., и у 75% самок с концентрацией Vtg от 15 до 30 мг/мл в 2008 г. Базофильные включения в цитоплазме гепатоцитов, кариопикноз и некроз гепатоцитов чаще выявляли у самок с низким уровнем Vtg: от 5.5 до 15 мг/мл в 2008 г. и от 2 до 7 мг/мл в 2009 г. (табл. 4). Напротив, частота встречаемости кариопикноза и некроза гепатоцитов была выше у самцов камбал с высокими концентрациями Vtg в плазме.

Таблица 4. Встречаемость (%) гистопатологических изменений печени у самцов (М) и самок (F) полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciala из Амурского залива с разным уровнем вителлогенина (Vtg) в плазме крови

Гистопатологические

2008

2009

Концентрация Vtg в плазме, мг/мл

5.515 0.005 -0.1

0-0.05 0.05 - 1 15-30 0.005 2-7 15

Вакуолизация гепатоцитов 25 12 16 75 5.5 5.5 18 21

Некроз гепатоцитов 0 37 16 0 И 17 7 0

Пикноз ядер гепатоцитов 0 37 16 0 16 28 7 3

Базофильные включения в 0 0 0 0 0 0 10 0

гепатоцитах

Концентрация Vtg в плазме крови рыб зависит от нескольких факторов, таких как стадия зрелости гонад и сезон отлова (Aida et al., 1973; Carnevali et al., 1999), режим и состав питания (Davis et al., 2009), температура воды (Hiramatsu et al., 2002; Kirby et al., 2004).

Содержание Vtg в плазме рыб, выловленных в относительно чистых районах, характеризуется следующей закономерностью: концентрация Vtg у половозрелых самок (VtgmF) > концентрации Vtg у неполовозрелых самок (Vtg,r) > концентрации Vtg у самцов (VtgmM). Такое соотношение концентраций Vtg в зависимости от пола и зрелости рыб установлено для нескольких видов карповых. Концентрация Vtg в плазме половозрелых самок С. carpio изменялась от сотен до тысяч мкг/мл, у неполовозрелых самок она не превышала 200 нг/мл, а в плазме самцов всегда оставалась ниже 20 нг/мл (Tyler et al., 1996). Для полярной камбалы P. putnami из эстуария р. Святого Лаврентия (Канада) характерна несколько иная картина распределения концентраций: VtgmF > Vtg.p > Vtg„,lM (Roy et al., 2004).

У больных или инъецированных гормонами рыб данная схема может быть даже такой: VtgmM ^ VtgmF. Так, у самцов радужной форели О. mykiss, подвергнутых воздействию ксенобиотиков с эстрогенными свойствами, концентрация Vtg была выше (100 мг/мл), чем в норме у половозрелых самок (Purdom et al., 1994).

Для рыб, обитающих в загрязненных водах, немаловажным фактором, влияющим на уровень Vtg, является природа загрязнения, наличие в воде веществ, обладающих эстрогенной активностью, таких как натуральные и синтетические гормоны и их метаболиты (Dube, MacLatchy, 2000; Filby et al., 2006). Помимо этого, y рыб из загрязненных районов отмечены также индивидуальные и сезонные вариации концентраций Vtg в плазме (Jobling et al., 1998; Folmar et al., 2001; Fukada et al., 2001).

Увеличение концентрации Vtg обнаружено в плазме крови самцов рыб, выловленных ниже по течению или в непосредственной близости от водоочистных сооружений (Soie et al., 2001; Bjerregaard и et al., 2006; Desforges et al., 2010). В то же время было показано, что концентрации Vtg в плазме самцов камбаловых рыб не зависят от глубины вылова животных, стадии зрелости гонад или возраста (Scott et al., 2007).

В настоящей работе отлов камбал £. ртт/азсшШ осуществляли нз умеренно загрязненного района Амурского залива и соотношение концентраций в их плазме можно характеризовать следующей последовательностью: У!^ > £ У1§тм- Однако в условиях эксперимента при воздействии гексэстрола распределение концентраций выглядело следующим образом: \^„,м ^ У18шр.

Влияние некоторых ксенобиотиков на синтез витсллогенина у самцов полосатой камбалы. Инъекция раствора гексэстрола - синтетического аналога женского полового гормона - в дозе 5 мг/кг привела к значительному увеличению концентраций в плазме крови у опытных камбал обоих полов.

Средняя концентрация в плазме самцов контрольной группы составила 0.038±0.053 мг/мл, у самок - 1.00±0.78 мг/мл. Через 7 сут после инъекции гексэстрола средняя концентрация составила 28.51±15.24 мг/мл у самцов и 27.595±6.20 мг/мл у самок. Концентрация в плазме рыб опытной группы по сравнению с рыбами из контрольной группы увеличилась в несколько раз, при этом достоверных отличий этого показателя у самок и самцов из опытной группы не выявлено (р>0.05) (рис. 7).

'я а

И 14 О О g g g Й Й Й !& ""ч "t

М Ьч Ь. Ь

Рис. 7. Уровень вителлогенина в плаз»!е крови полосатой камбалы Цорэеиа ртт[а^с1а1а. По оси абсцисс - группы контрольных (К) и опытных (О) рыб при воздействии гексэстрола (гекс) и смеси полихлорированных бифенилов (ПХБ), по оси абсцисс - десятичный логарифм средних концентраций ''^¿стандартное отклонение.

В результате анализа картины электрофоретического разделения белков плазмы крови экспериментальных рыб установлено, что увеличение количества у самок и самцов опытной группы обусловлено появлением (или значительным увеличением концентрации) полипептида массой 98 кДа (рис. 8), соответствующего А типа вераспера Мозера.

кДа стл 250 . 150 100

75 w

50 37

25 .,„, 20 .„»

5 6 7 8 стд кДа

250

• 150 100 <~» 75

Рис. 8. Индукция синтеза вителлогенина у полосатой камбалы Liopselta pinmfasciata гексэстролом. В плазме крови избирательно накапливается полипептид с молекулярной массой 98 кДа (соответствует вителлогенину А типа); полипептид массой 180 кДа (соответствует вителлогенину В типа) отсутствует или сохраняется на прежнем уровне. Условные обозначения: стд - маркеры молекулярной массы. 1,2 - плазма крови самцов опытной группы; 3,4 - плазма самок опытной группы; 5,6 - плазма крови самок контрольной группы; 7,8 - плазма крови самцов контрольной группы.

Увеличение количества Vtg у полосатой камбалы под действием гексэстрола произошло за счет преимущественного накопления белка, который в условиях денатурирующего электрофореза дает полипептид массой 98 кДа и, как отмечено ранее, обладает большим сходством с Vtg А вераспера Мозера. Таким образом, полученные результаты позволяют говорить об избирательном синтезе, а следовательно, и об избирательной экспрессии лишь одного из генов Vtg в ответ на эстроген. При условиях и дозах, использованных в настоящей работе, у самок и самцов полосатой камбалы синтезировался Vtg А типа. Дифференцированный синтез Vtg разных типов ранее был обнаружен у некоторых видов рыб в природных условиях. Например, у самок вераспера Мозера количественное соотношение Vtg А и Vtg В в плазме составляет 2 : 3 (Matsubara, Коуа, 1997). Количественные соотношения между типами Vtg можгут меняться в зависимости от стадии зрелости гонад. Так, у самок японской медаки Oryzias ¡atipes соотношение Vtg А/В и Vtg С меняется в процессе созревания гонад от 2 : 1 на начальной стадии до 8 : 1 на конечных стадиях вителлогенеза (Matsubara, Коуа, 1997)

В гонадах самок камбал, подвергнутых воздействию гексэстрола, выявлены гистопатологические изменения, которые отсутствовали у контрольных рыб. Ооциты контрольных рыб были заполнены желточными гранулами, четко просматривались яйцевые оболочки (рис. 9 А). У всех опытных рыб наблюдалось разрушение отдельных ооцитов, вызванное фрагментацией яйцевых оболочек и выходом желточных гранул за пределы ооцитов (рис. 9 Б).

Таким образом, в результате однократного воздействия гексэстрола отмечено достоверное увеличение концентрации Vtg в плазме камбал опытной группы. Установлено, что самцы полосатой камбалы синтезируют Vtg в тех же количествах, что и самки. Показано разрушение ооцитов камбал, подвергнутых воздействию гексэстрола.

В эксперименте со смесью ПХБ "Совол" использованы рыбы с разной степенью зрелости половых желез. В состав контрольной и опытной групп входили как уже отнерестившиеся, так и молодые созревающие особи, находящиеся на VI и II стадиях зрелости соответственно. В семенниках некоторых самцов наряду со сперматоцистами. обнаружены невыметанные сперматозоиды, стадия зрелости этих камбал определена как Мб.

Концентрация Vtg в плазме крови самок контрольной группы, находящихся на VI стадии зрелости, достигала 29.58 мкг/мл, на II стадии зрелости - 8.25 мкг/мл. Средняя концентрация Vtg в плазме самок F2 составила 2.06±4.1 мкг/мл.

Через 7 сут после инъекции смеси ПХБ концентрация Vtg в плазме самок F6 варьировала от 13.18 до 15.80 мкг/мл, что в среднем составило 14.90Ы.85 мкг/мл. Концентрации Vtg в плазме самок F6 опытной и контрольной групп достоверно не отличались, возможно, из-за ограниченного числа исследованных особей. Концентрация Vtg в плазме самок F2 опытной группы варьировала от необнаруживаемого уровня до 1.74 мкг/мл, средняя концентрация составила 0.65±0.83 мкг/мл. Достоверных отличий содержания Vtg у самок F2 контрольной и опытной групп также не выявлено (рис. 7).

Средняя концентрация Vtg в плазме самцов Мб опытной группы составила 0.34±0.33 мкг/мл (концентрация изменялась от уровня, находящегося за пределами детекции, до 0.66 мкг/мл), что достоверно не отличается от концентрации Vtg в плазме самцов такой же стадии зрелости в контрольной группе (1.65±0.98 мкг/мл, диапазон от 0.89 до 2.72 мкг/мл). Содержание Vtg у самцов М2 опытной и контрольной групп также не отличалось (рис. 7).

В гонадах контрольных самок более 50% половых клеток приходилось на долю мелких ооцитов протоплазматического роста диаметром от 15 до 75 мкм, что соответствует состоянию яичника полосатой камбалы в этомо время года. У самок, подвергнутых воздействию совола, выявлено изменение соотношения клеток разных размерных групп с увеличением доли более крупных ооцитов диаметром 105-195 мкм (рис. 10) Средние размеры ооцитов в яичниках ПХБ камбал, подвергнутых действию совола достоверно увеличились (р<0.05) (рис. 11).

Рис. 9. Морфология ооцитов полосатой камбалы Шр&еиа ртпфвсШа. А - ооциты камбал из контрольной группы, Б - разрушение ооцитов рыб, получивших инъекцию гексэстрола в дозе 5 мг/кг. Стрелками указаны желточные гранулы, головками стрелок - яйцевые оболочки. Масштабный отрезок - 50 мкм.

Рис. 10. Диаметр ооцитов в гонадах полосатой камбалы Ыорзеиа ртт{анааш (поперечная линия - среднее значение, нижняя и верхняя границы прямоугольника - 25 и 75% выборки соответственно, вертикальные линии - минимальное и максимальное значения) при воздействии совола (опыт) и в контроле. 'Различия достоверны при Р<0.05.

Й 250-

0 200-

1 15»-

о.

ш 100500- -

Контроль

В печени камбал, подвергнутых воздействию ПХБ, выявлены гистопатологические изменения, которые отсутствовали у контрольных рыб. Наиболее значимым было повреждение кровеносного русла, которое выражалось в виде отдельных кровоизлияний вблизи крупных сосудов или же в разрушении капиллярной сети (рис. 12 А, Б), при этом наблюдали деградацю эритроцитов и прилегающей паренхимной ткани печени. Выявлены нарушения в организации печеночных балок, в этих случаях гепатоциты теряли четкие границы (рис. 12 В). У большинства отравленных камбал в ядрах гепатоцитов происходила конденсация и маргинация хроматина (рис. 12 Г).

& & ,сч® .»*> ,<й> .<*> > .<«>

Диаметр ооцитоэ, мкм

Рис. 11. Изменение соотношения клеток разных размерных групп с увеличением доли более крупных ооцитов диаметром 105-195 мкм в гонадах полосатой камбалы ИорхеНа ртт/шаа1а при воздействии совола (опыт) по сравнению с контролем.

\ / 7 Ш Б* -шсж

жКМ 'Ч < - / - 'й / . >

Рис. 12. Патологические изменения печени полосатой камбалы Иорхепа ртт}а$сШа при воздействии смеси ПХБ "Совол": А - кровоизлияние, стрелками обозначена стенка кровеносного сосуда, головками стрелок - участок разрушенной печеночной паренхимы; Б - разрушение капиллярной сети, стрелки указывают на поврежденные кровеносные капилляры; В - потеря четкой структуры у печеночных трубочек (стрелки); Г - конденсация и маргинация хроматина в ядрах гепатоцитов. Масштабный отрезок: А, Б, В - 100 мкм, Г - 50 мкм.

Полихлорированные бифенилы являются стойкими хлороргаиичсскими соединениями технического назначения. В нашей работе по выявлению эстрогенной активности ПХБ был использован совол (смесь ПХБ, в состав которой входит около 20% тетрахлорбифенилов, свыше 50% пентахлорбифенилов, около 20% гексахлорбифенилов) - наиболее распространенный жидкий диэлектрик, используемый в производстве конденсаторов и трансформаторов в Российской Федерации (Мышкип, Бакиров, 2009). При однократном введении совола камбалам в низкой дозе не отмечено изменения концентраций Vtg в плазме крови ни у самок, ни у самцов, что свидетельствует о низкой эстрогенной активности исследованной смеси полихлорированных бифепилов. В настоящее время накоплены противоречивые данные о действии ПХБ на синтез Vtg. Так воздействие ПХБ вызвало экспрессию Vtg у ювенильных особей королевской дорады S. aurata (Calo et al., 2010), но не оказало явного эстрогенного эффекта у половозрелых особей белого лаврака Morone americana (Monosson et al., 1994).

Таким образом, однократное введение смеси ПХБ "Совол" в достаточно низкой дозе не вызвало достоверного изменения (по сравнению с контролем) концентраций Vtg в плазме крови самок и самцов полосатой камбалы. Выявлено достоверное увеличение размеров ооцитов лротоплазматического роста в гонадах опытных самок, что связано с увеличением числа ооцитов диаметром 105-195 мкм. Смесь ПХБ "Совол" оказывает негативное воздействие на состояние печени камбал обоих полов, выражающиеся в виде повреждения кровеносного русла и гепатоцитов, а также нарушения организации печеночных трубочек.

выводы

1. Выделен и очищен из плазмы крови полосатой камбалы белок для которого установлена принадлежность к Vtg. В полиакриламидном геле в присутствии ДЦС Vtg распадается на полипептиды с молекулярной массой ISO, 9S, 70, 52,41 и 37 кДа.

2. Вителлогенин полосатой камбалы обладает наибольшим сходством с Vtg палтуса белокорого и вераспера Мозера. Показано, что пептиды полипептида Vtg полосатой камбалы массой 180 кДа характерны для Vtg В, а пептиды полипептида Vtg полосатой камбалы массой 98 кДа характерны для Vtg А вераспера Мозера.

3. Получены специфичные поликлональные антитела к Vtg полосатой камбалы, на основе которых разработана высокочувствительная иммуноферментная тест-система для его определения в плазме крови в диапазоне концентраций от 156 до 25000 нг/мл.

4. Концентрация Vtg в плазме крови самок полосатой камбалы варьирует в зависимости от стадии зрелости гонад. Наименьшая концентрация Vtg обнаружена у самок, находящихся на посленерестовой стадии репродуктивного цикла, наибольшая - у самок, находящихся на четвертой стадии зрелости гонады (до 30 мг/мл). Ювенильные самки и половозрелые самцы из загрязненной части Амурского залива синтезируется Vtg, его концентрация в плазме крови достигает 1 мг/мл.

5. Встречаемость таких гистопатологических изменений печени, как пикноз ядер и некроз гепатоцитов, выше у самцов с высокими концентрациями Vtg в плазме крови, чем у самцов с более низкими концентрациями Vtg. В противоположность этому у самок с низкими концентрациями Vtg в плазме крови встречаемость кариопикноза и некроза гепатоцитов выше, чем у самок с более высокими концентрациями Vtg.

6. Воздействие гексэстрола вызывает достоверное увеличение концентраций Vtg в плазме крови рыб, обусловленное синтезом полипептида Vtg массой 98 кДа. Самцы полосатой камбалы синтезируют Vtg в тех же количествах, что и самки. Введение гексэстрола вызывает разрушение ооцитов в яичниках.

7. Смесь ПХБ "Совол" не влияет на уровень Vtg ни у самок, ни у самцов полосатой камбалы, но вызывает увеличение диаметра ооцитов и доли более крупных ооцитов, в гонадах самок опытной группы, что предполагает стимулирующее действие ПХБ на яичники на ранних стадиях зрелости. Кроме того, смесь "Совол" оказывает негативное воздействие на печень камбал, проявляющееся в виде повреждения кровеносного русла, гепатоцитов и нарушения организации печеночных трубочек камбал, не зависимо от пола.

Список работ по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах из списка ВАК:

1. Швед H.A., Сяснна И. Г., Кумейко В.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения вителлогенина в плазме крови полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata // Биология моря. 2011. Т. 37, № 3. С. 214-221.

2. Shved N., Kumeiko V., Syasina 1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) measurement of vitellogenin in plasma and liver histopathology in barfin plaice Liopsetta pinnifasciata from Amursky Bay, Sea of Japan// Fish Physiol. Biochem. 2011. Vol. 37, № 4. P. 781-799.

Работы, опубликованные в материалах региональной, всероссийских и международных научных конференций:

3. Сясина И.Г., Высоцкая В.Г., Швед H.A. Гистопатологические изменения в печени и гонадах полосатой камбалы Pleuronectes pinnifasciatus из Амурского залива // Экологические проблемы использования прибрежных морских акваторий: Материалы международной научно-практической конференции. Владивосток: ДВГУ. 2006. С. 188-191.

4. Сясина И.Г., Швед H.A. Гистологические изменения в печени камбал Pleuronrctes pinnifasciatus из Амурского залива // XI Международная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток: ДВО РАН. 2007. С. 39.

5. Сясина И.Г., Чернова E.H., Кумейко В В., Табакова Е.В., Зюмченко Н Е., Швед H.A., Щеблыкина A.B., Высоцкая В.Г. Комплексный биомониторинг состояния камбал и моллюсков из охраняемых и загрязненных районов залива Петра Великого и бухты Киевка (Японское море) // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов - 2: Расширенные материалы Международной научно-практической конференции. Москва: Россельхозакадемия. 2007. С. 419-423.

6. Швед H.A., Сясина И.Г. Характеристика гистопатологических изменений в печени камбал из районов с разным уровнем антропогенного загрязнения // Современное состояние водных биоресурсов: Материалы научной конференции, посвященной 70-летию С.М. Коновалова. Владивосток: ТИНРО-центр. 2008. С. 686-689.

7. Швед H.A., Сясина И.Г. Определение вителлогенина в плазме крови и выявление гистологических изменений в печени полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata из Амурского залива // Проблемы экологии: Чтения памяти проф. М.М. Кожова: тезисы докладов Международной научной конференции и международной школы для молодых ученых. Иркутск: Изд-во Иркутск, гос. ун-та 2010. С. 484.

8. Швед H.A., Сясина И.Г., Кумейко B.B. MALDI-TOF анализ полипептидов вителлогенина полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata II Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии: Материалы X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток: Издательство Дальневосточного университета. 2011. С. 295-300.

Швед Никита Александрович

ВИТЕЛЛОГЕНИН ПОЛОСАТОЙ КАМБАЛЫ НОРБЕТТА РШМРАЯаАТА КАК БИОМАРКЕР ЭСТРОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 21.11.2011 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,27 Уч-изд. 1,18 Тираж 100 экз. Заказ 739 Отпечатано в Типографии №2 ИПК ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Швед, Никита Александрович

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эстрогенное воздействие веществ, загрязняющих водную среду.

1.1.1. Биоиндикация эстрогенных эффектов загрязнения водной среды

1.2. Вителлогенин рыб как биомаркер эстрогенного воздействия загрязнения водной среды.

1.2Л. Характеристика вителлогенинов костистых рыб.

1.2.2. Вителлогенез и физиологическая роль различных типов вителлогенинов у костистых рыб.21.

1.2:3. Методы определения вителлогенинов.рыб.

1.2:4: Экспериментальные работы по выявлению эстрогенных свойств^ некоторых загрязняющих веществ.

13. Морфологические и. гистопатологические маркеры эстрогенного воздействия загрязнения водной среды.32'

1.3.1. Интерсекс.

1.3.2. Патологические изменения в органах рыб как следствие избыточного синтеза вителлогенина.1.34'

1.4. Мониторинг эстрогенной активности загрязнения водной среды в разных странах.

1.4.1. Европа.^.

1.4:2. США и Канада.

1.4.3. Восточная и Северная Азия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.:.

2.1. Объект и район исследования.

2.2. Выделение вителлогенина.

2.2.1. Стимуляция рыб.

2.2.2. Обессоливание.

2.2.3. Ионообменная хроматография.

2.2.4. Определение концентрации белка микробиуретовым методом

2.2.5. Ультрафильтрация.

2.2.6. Гель-фильтрация.

2.2.7. Электрофорез.48'

2.3. Получение поликлональных антител кролика против вителлогенина полосатой камбалы.

2.3.1. Выделение иммуноглобулинов.

2.3.2. Вестерн-блоттинг.50!

2.4. Иммуноферментный анализ.51>

2.4.1. Определение титра антисыворотки.51"

2.4.2. Определение концентрации вителлогенина в плазме крови камбал .52'

2.5. Индукция синтеза» вителлогенина у самцов полосатой камбалы некоторыми ксенобиотиками;.532.6. Гистологическими морфометрический анализ.

2.7. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3:1. Характеристика, вителлогенина полосатой камбалы L. pinnifasciata и разработка v иммуноферментной тест-системы для его количественного^ определения>в плазме крови.59'

3.2. Содержание вителлогенина в плазме крови и гистопатологические изменения печени; камбал из. умеренно загрязненной акватории- Амурского залива (зал. Петра Великого Японского моря).70*

3.3. Влияние некоторых ксенобиотиков на синтез вителлогенина у самцов полосатой камбалы.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Сравнение методик выделения вителлогенинов.90<

4.2. Анализ полипептидов Vtg полосатой камбалы с молекулярной массой 180 и 98 кДа.

4.3. Анализ концентрации Vtg в плазме крови и выявление гистопатологических изменений у рыб из природных водоемов.

4.4. Воздействие некоторых ксенобиотиков на синтез и гистопатологические изменения органов рыб в экспериментальных условиях.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вителлогении полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata как биомаркер эстрогенного загрязнения"

Актуальность

В последние годы резко возрос интерес биологов к проблеме действия ксенобиотиков - химических веществ, загрязняющих окружающую среду вследствие хозяйственной деятельности человека, — на физиологические функции организма, регулирующиеся гормонами. Многие синтетические химические соединения могут имитировать или блокировать действие естественных гормонов, изменять уровень гормонов в крови и тканевых жидкостях. Эти вещества, разрушающие эндокринную систему (endocrine disruptors - EDs), приводят к появлению аномалий развития и нарушению репродуктивной функции человека и животных (Arukwe et al., 2003).

Исследования влияния EDs на репродуктивную функцию рыб получили особенно бурное развитие (Jobling et al., 1998; Tyler et al., 1998; Vethaak et al., 2002; Scott et al., 2006). Интерес к проблеме объясняется тем, что большая, часть загрязняющих веществ в составе промышленных и бытовых сточных .вод попадает именно в водную среду, и рыбы-подвергаются воздействию EDs на протяжении всей своей жизни, хотя, как правило, концентрации этих веществ в среде незначительны; Химический анализ сточных вод выявляет наличие в них широкого спектра веществ; нарушающих эндокринную регуляцию (Khanal et al., 2006; Liu et al., 2008; Kang, Price,

2009; Kumar et al-.; 2011; Rujiralai et al., 2011).

4 1 ?

Основное внимание уделяется.-выявлению EDs с эстрогенными . свойствами* (White et al., 1994; Sonnenschein, Soto, 1998), поскольку их действие приводит к "феминизации" мужских особей - явленшо, наиболее часто- регистрируемому у морских и пресноводных рыб. Хорошо, известными примерами- нарушения эндокринной регуляции у рыб и некоторых беспозвоночных in situ является состояние интерсекса. Феномен интерсекса - наличие у одного и того же индивидуума как мужских, так и женских гонад одновременно, смешанных гонад (овотестисов) или семенников, в которых развиваются немногочисленные женские половые клетки (тестикулярные ооциты) — интенсивно исследуется во всем мире (Jobling et al., 1998; Allen et al., 1999; Hashimoto et al., 2000; Kirby et al., 2004; Bjerregaard et al., 2006; Woodling et al., 2006; Hinck et al., 2009; Aoki et al., 2010; Soyano et al., 2010). Полученные данные свидетельствуют о том, что частота встречаемости интерсекса связана с поступлением эстрогенных веществ в водную среду, поэтому данная патология рассматривается как маркер на воздействие этих ксенобиотиков. На молекулярном уровне феминизация самцов рыб проявляется в индукции синтеза специфических белков, имеющих особое значение для организма самок, таких как вителлогенин (Vtg) (Allen et al., 1999) и белки желточной оболочки яиц (Arukwe et al., 1997; Celius, Walther, 1998). Некоторые эффекты, в настоящее время отнесенные к воздействию EDs, известны довольно давно (Dodds et al., 1937). Тем не менее, интерес к нарушениям эндокринной регуляции у многих живых организмов значительно возрос в последнее время в связи с тем, что стали известны факты, что EDs могут действовать при очень низких концентрациях (нанограммы на литр), а некоторые эффекты (интерсекс), индуцируемые в течение зародышевого или личиночного развития, могут быть выявлены только в процессе полового созревания рыб или в последующих поколениях (Kavlock et al., 1996).

Вителлогенин - димерный. гликофосфолипопротеид высокой молекулярной массы (300-600 кДа), предшественник яичного желтка, синтезируется в печени самок рыб под воздействием эстрогенных гормонов (Bieberstein et al., 1999) и транспортируется с кровью в яичники, где поглощается ооцитами в процессе вителлогенеза. Аномальный синтез Vtg у самцов и неполовозрелых рыб может приводить к появлению интерсексов и индуцировать патологические изменения в семенниках, печени и почках. Экспериментально доказан синтез Vtg у самцов» рыб* в ответ на воздействие многих загрязняющих веществ, обладающих эстрогенной активностью (ВОЭА) (Christiansen et al., 1998; Mills et al., 2001; Nagae et al., 2005; Mikula et al., 2009). В настоящее время накоплено значительное количество данных^ о встречаемости интерсекса у морских и пресноводных костистых рыб в разных странах (Hashimoto et al., 2000; Vethaak et al., 2002; Kirby et al., 2004), а определение Vtg у самцов рыб предлагают как биомаркер на чужеродные эстрогены и загрязняющие ВОЭА (Denslow, 1999; Sole et al., 2000; Scott et al., 2006; Leonardi et al., 2009). Причины столь широкого распространения данной аномалии у рыб окончательно не установлены, но показано, что концентрация Vtg в плазме крови самцов костистых рыб во многих реках коррелирует с численностью населения расположенной выше по течению (Desforges et al., 2010). Российские публикации на эту тему, отсутствуют.

Амурский залив представляет собой северо-западную часть зал. Петра: Великого Японского моря; Для данного района очень актуальной является проблема загрязнения бытовыми и промышленными сточными водами. Развитие хозяйственной деятельности на побережье Амурского залива не сопровождалось строительством достаточно мощных и эффективных очистных сооружений, что привело к использованию вод залива в качестве приемника большого количества неочищенных стоков, до 58815.8'тыс. м3 в год (Огородникова и др., 1997; Нигматулина, 2008). В конце 1980-х гг. состояние Амурского залива, и в особенности его кутовой части, можно было квалифицировать, как острокритическое, что позволяет отнести этот район к числу проблемных ареалов национального ранга (Ильичев, Каракин, 1988). Спектр загрязняющих воды; Амурского залива веществ широк, поэтому постоянно регистрируются^ новые эффектьт загрязнения,. в том числе отнесенные к, воздействию ЕБб;. Получены-результаты о появлении в заливе интерсексуальных особей среди: морских безпозвоночных, таких как приморский гребешок М1гикореЫеп уезБоетгй! (Сясина и др., 1996) и морской еж 81гоп^у1осеп1гоШ8 ШегтесИт (Сясина, Ващенко, 2007):

Камбал Амурского залива успешно используют для мониторинга загрязнения в течение последних 15 лет. Особое внимание уделено изучению- местного вида; -полосатой; камбалы Ыорзейа ртт/аяЫМа, которая« была выбрана4 в качестве: вида-индикатора (Сясина, Ващенко, 2007; Буаята, Бигкта;. 2008); Различные; типы гистологических изменений печени и гонад выявлены* у рыб, обитающих в загрязненной« части залива ¡(УаэсЬепко* е! аГ., 2005; Сясина и др;, 2006), в том-: числе; резорбцияюоцитов в преднерестовый .период (Дуркина, 2003). Причины резорбции не установлены, но; существует предположение, что возможно они связаны с нарушением синтеза Л^ и недостаточным накоплением желточных белков (Дуркина^ 2003). В настоящее время отсутствуют данные по содержанию у камбал из этого района.

С другой стороны, в течение многих лет проводится контроль уровня загрязнения Амурского залива, существуют данные химического анализа о наличии в водах залива различных загрязняющих веществ, включая тяжелые металлы, хлорорганические пестициды, полихлорированные бифенилы (МошгкЬ е1 а1., 2003; Петрова, Черняев, 2008), однако, биологические последствия загрязнения изучены недостаточно. Так, имеются лишь косвенные доказательства нарушения эндокринной регуляции у некоторых видов морских организмов. Получение новой информации об ответных реакциях рыб на существующее комплексное загрязнение морской среды и развитии у них различных патологических состояний важно и с точки зрения экологии человека, поскольку он живет в той же среде, и у него развиваются схожие патологические состояния. Рыбы могут быть использованы в качестве модели для изучения различных патологических состояний при воздействии естественных или синтетических гормонов, гормоноподобных веществ игдругих ксенобиотиков.

Вителлогенины разных видов рыб отличаются по молекулярной массе и аминокислотному составу, поэтому не существует единой методики выделения, очистки и определения этих белков. В связи с этим возникла1 задача оптимизации существующих методов определения для выбранного нами вида камбал (Ь. ртт/сксгШа). Наиболее точным, специфическим и используемым методом количественного определения в плазме крови является иммуноферментный анализ (ИФА).

Цель данной работы - разработка специфической иммуноферментной тест-системы для определения полосатой камбалы. Ь. ртт/аэЫМа и проведение мониторинговых исследований по выявлению эстрогенных эффектов загрязнения Амурского залива' (зал. Петра Великого Японского моря). Для выполнения поставленной.цели были поставлены следующие задачи:

2) получить специфичные поликлональные антитела к вителлогенину полосатой камбалы и разработать высокочувствительную тест-систему для его определения на основе оптимизации существующих методов ИФА;

Научная новизна

Выделен и очищен полосатой камбалы Ь. ртт/аяЫ&а. Установлено, что аминокислотный состав данного белка сходен с аминокислотным составом вителлогенинов других представителей камбалообразных - белокорого палтуса Щрро$*1о88и8 hippoglossus и вераспера Мозера Уегаярег тозеп. Разработана специфическая и высокочувствительная иммуноферментная тест-система для определения- концентраций в плазме крови Ь. ртт/аяЫМа. Определено содержание в плазме самок полосатой камбалы.в разное времятода и на разных стадиях зрелости гонад. Установлено, что в ответ на эстрогенную стимуляцию самцы Ь. ртт/аяЫага могут синтезировать в тех же количествах, что и самки. Показано, что ювенильные особи и самцы полосатой камбалы из Амурского залива (зал. Петра» Великого Японского моря) синтезируют "У^, уровень которого в плазме крови может достигать 1 мг/мл, что свидетельствует о наличии в водах залива загрязняющих веществ с эстрогенной активностью. Впервые для камбал из загрязненных акваторий показана корреляция между содержанием в плазме крови . и» наличием патологических изменений в печени, при этом встречаемость некроза и кариопикноза гепатоцитов выше у самцов с высокой и у самок с низкой концентрацией в плазме. Впервые проведена оценка воздействия гексэстрола и смеси полихлорированных бифенилов "Совол" на-. синтез *Ч\% у рыб. Показано, что гексэстрол обладает очень высокой эстрогенной активностью, тогда как, совол -отсутствием таковой.

Теоретическое и практическое значение работы

Представленные в работе данные подтверждают наличие нескольких типов у камбаловых рыб, в том числе и у полосатой камбалы Ь. ртт/аяЫМа. Функциональное значение каждого типа только предстоит изучить.

Разработанная иммуноферментная тест-система для количественного определения в плазме крови полосатой камбалы открывает новые возможности экспериментального выявления эстрогенных свойств у различных химических веществ. У самцов и ювенильных особей Ь. ртт/азЫсНа из Амурского залива выявлены достаточно высокие концентрации что свидетельствует о влиянии веществ, обладающих эстрогенной активностью, на эндокринную систему рыб. Впервые, для России произведена оценка загрязнения водной среды эстрогенными веществами' посредством определения' в плазме крови рыб. Практическое значение работы, также связано с возможностью проведения регулярного мониторинга загрязнения прибрежных вод Дальневосточного региона веществами, обладающими эстрогенной активностью, используя широко распространенный вид — полосатую камбалу Ь. ртт/сюЫМа. Результаты работы* указывают на наличие нескольких типов У^ и их дифференцированном; синтезе у костистых рыб и могут быть включены; в программу курсов по« клеточной? и? молекулярной? биологии, ихтиопагологии для высших учебных заведений.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований; были представлены- на Международной научно-практической конференции- "Экологические проблемы; использования прибрежных морских акваторий" (Владивосток, 2006), XI Международной молодёжной? школе-конференции по актуальным проблемам: химии, и: биологии- (МЭС ТИБОХ, 2007), научной конференции, посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008), Международной научной конференции и международной школе для молодых ученых "Проблемы экологии:: Чтенияшамяташроф. М.М. Кожова" (Иркутск, 2010), годичных научных конференциях Института биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2009, 2010, 2011), X региональной конференции студентов, аспирантов» вузов и научных организаций' Дальнего Востока России "Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии". (Владивосток, 2011).

По материалам диссертации, опубликовано 8 работ, из них 2 статьи» в: рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных: ВАК для публикации материалов диссертаций.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций:

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Швед, Никита Александрович

выводы

1. Выделен и очищен из плазмы крови полосатой камбалы белок для которого установлена принадлежность к Vtg. В полиакриламидном геле в присутствии ДДС Vtg распадается на полипептиды с молекулярной массой 180, 98; 70, 52, 41 и 37 кДа.

2. Вителлогенин полосатой камбалы, обладает наибольшим сходством с Vtg палтуса белокорого и вераспера Мозера. Показано, что пептиды полипептида Vtg полосатой камбалы массой 180 кДа характерны для Vtg В, а пептиды полипептида Vtg полосатой камбалы массой 98 кДа характерны для Vtg А вераспера Мозера.

3. Получены специфичные поликлональные антитела к. Vtg полосатой камбалы, на основе которых разработана высокочувствительная, иммуноферментная тест-система для его определения в плазме крови в диапазоне концентраций от 156 до 2500 нг/мл. • .'

4. Концентрация Vtg в плазме крови самок, полосатой камбалы- варьирует в зависимости от стадии зрелости гонад. Наименьшая концентрация Vtg, обнаружена у самок, находящихся на посленерестовой стадии-репродуктивного цикла, наибольшая - у самок; находящихся: на, четвертой стадии- зрелости; гонады (до 30 мг/мл). Ювенильные самки и половозрелые самцы из:загрязненной;части Амурского залива синтезируется Vtg, его концентрация в плазме.крови достигает 1 мг/мл.

5: Встречаемость таких гистопатологических изменений печени, как пикноз ядер и некроз гепатоцитов; выше у самцов: с высокими, концентрациями Vtg в плазме крови,, чем.у самцов с более низкими* концентрациями Vtg. В: противоположность этому у самок с низкими концентрациями. Vtg в плазме крови? встречаемость кариопикноза и некроза, гепатоцитов вышё, чем у самок с более высокими концентрациями Vtg.

6. Воздействие гексэстрола вызывает достоверное увеличение концентраций?Vtg в плазме крови рыб, обусловленное синтезом полипептида Vtg массой 98' кДа. Самцы полосатой камбалы синтезируют Vtg в тех же количествах, что и самки. Введение гексэстрола вызывает разрушение ооцитов в яичниках.

7. Смесь ПХБ "Совол" не влияет на уровень Vtg ни у самок, ни у самцов полосатой камбалы, но вызывает увеличение диаметра ооцитов и доли более крупных ооцитов, в гонадах самок опытной группы, что предполагает стимулирующее действие ПХБ на яичники на ранних стадиях зрелости. Кроме того смесь "Совол" оказывает негативное воздействие на печень камбал, проявляющееся в виде повреждения кровеносного русла, гепатоцитов и нарушения организации печеночных трубочек камбал, не зависимо от пола.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Швед, Никита Александрович, Владивосток

1. Дуркина В.Б. Массовое разрушение овариальных фолликулов и его особенности у полосатой камбалы Pleuronectes pinnifasciatus из Амурского залива Японского // Вопр. ихтиологии. 2003. Т. 43, № 2. С. 286-288.

2. Иванов А.П. Рыбоводство в естественных водоемах. Москва: Агропромиздат. 1992. С. 206.

3. Ильичев В. В., Каракин В.П. Оценка остроты экологических проблем Дальневосточного региона // Вестн. АН СССР. 1988. №11. С. 84-88.

4. Мышкин В.А., Бакиров A.B. Полихлорированные бифенилы и новые модели патологии печени // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2009. № 1. С. 255-259.

5. Новиков Н.П., Соколовский A.C., Соколовская■ Т.Г., Яковлев Ю.М. Рыбы Приморья. Владивосток: Дальрыбвтуз, 2002. 552 с.

6. ОгородниковаА. А., Вейдеман> Е. А., Силина Э. И., Нигматулина Л. В. Воздействие береговых источников загрязнения на биоресурсы залива Петра Великого-(Японское море) //Изв: ТИНРО. 1997. Т. 122. С. 430-450.

7. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. Москва: Советская наука. 1957. 467 с.

8. Сясина И.Г., Ващенко М.А., Жадан П.М., Карасева Е.М. Состояние гонад и развитие потомства гребешка Mizuhopecten yessoensis из загрязненных районов залива Петра Великого Японского моря // Биол. моря. 1996. Т. 22, № 4. С. 255-262.

9. Сясина И.Г. Хлорорганические пестициды в рыбах и моллюсках из нижнего течения реки Туманной и прилежащей части залива Петра Великого (Японское море) // Биол. моря. 2003. Т. 29, № 1. С. 34-40.

10. Шарина С.Н., Картавцев Ю.Ф. Филогенетический анализ камбал (Teleostei, Pleuronectiformes) основанный на исследовании нуклеотидных последовательностей гена цитохромоксидазы 1 (Со-1) // Генетика. 2010. Т. 46, № 3. С. 401-407.

11. Aerni Н., Kobler В., Rutishauser B.'V., Wettstein F.E., Fischer R., Giger W. Combined: biological1 and chemical assessment of estrogenic activities in wastewater treatment plant effluents. Anal. Bioanal. Chem. 2007.Vol. 378. P. 688- 696.

12. Aida K., Ngan P:V., HibiyaT. Physiological studies of gonadal maturation» offishes. I. Sexual differences in- composition^:plasma-protein: of аушin?relation to: gonadal maturation //Bull: Jpn: Soc. Sci. Fish: 1973. Vol: 39KP. 1107-11151

13. Allen Y., Matthiessen P., Scott A.P., Haworth S., Feist S., Thain J. E. The extent of oestrogenic contamination in the UK estuarine, marine environments further. surveys of flounder// Sci. Total Environ. 1999. Vol. 233. P. 5-20.

14. Alvarez D.A., Cranor W.L., Perkins S.D., Schroeder V:L., Iwanowicz L.R., Clark R. C., Guyi

15. C.P.,.Pinkney A.E., Blazer V.S., Mullican J.E. Reproductive health of Bass in the Potomac, USA, Drainage: part 2: Seasonal occurrence of persistent and emerging organic contaminants//Environ. Toxicol. Chem. 2009. Vol. 28; P: 1084-1095.

16. Aravindakshan J., Paquet V., Gregory M., Dufresne J., Fournier M., Marcogliese D.J., Cyr D.G. Consequences of xenoestrogen exposure on male reproductive function in spottail shiners (Notropis hudsonius) II Toxicol. Sci. 2004. Vol. 78. P. 156-165.

17. Arukwe A., Goksoyr A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption // Comp. Hepatol. 2003. Vol. 2. P. 1-21.

18. Arukwe A., Knudsen F.R., Gokseyr A. Fish zona radiate (eggshell) proteins: a sensitive biomarker for environmental estrogens // Environ. Health Perspect. 1997. Vol. 105. P. 418^22.

19. Arukwe A., Thibaut R., Ingebrigtsen K., Celius T., Goksoyr A., Cravedi J.P. In v/voand in vitro metabolism and organ distribution-of nonylphenol in Atlantic salmon (Salmo salar) II Aquat. Toxicol. 2000. Vol. 49. P. 289-304.

20. Atkinson S.K. The persistence of steroidal estrogens in the aquatic environment. Ottawa: University of Ottawa, 2009. 169 p.

21. Batty J., Lim R. Morphological, reproductive characteristics of male mosquito fish (Gambusia afinnis holbrooki) inhabiting sewage-contaminated waters in New South

22. Wales // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1999. Vol. 36. P. 301-307.*

23. Berg A.H., Westerlund L., Olsson P.E. Regulation of Arctic char (Salvelinus alpinus) egg shell proteins, vitellogenin during reproduction, in response to 17beta.-estradiol, Cortisol // Gen. Comp. Endocrinol. 2004. Vol. 135. P. 276-285.

24. Bieberstein U., Berbner 71, Islinger M., Braunbeck T. Immunohistochemical localization of vitellogenin in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes using immunofluorescence // Sci. Total Environ. 1999. Vol. 233. P. 67-75.

25. Bjerregaard L.B., Madsen A.H., Korsgaard B., Bjerregaard P. Gonad histology, vitellogenin concentrations in brown trout (Salmo trutta) from danish streams impacted by sewage effluent // Ecotoxicology. 2006. Vol. 15. P. 315-327.

26. Carnevali 0., Mosconi G., Cambi A., Ridlji S., Zanui S„ Polzonetti-Magni A.M. Changes of lysosomal enzyme activities in sea bass Dicentrarchus labrax egg, developing embryo // Aquaculture. 2001. Vol. 202. P. 249-256.

27. Celius T., Walther B.T. Differential sensitivity of zonagenesis, vitellogenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) to DDT pesticides // J. Exp. Zool. 1998. Vol. 281. P. 346353.

28. Christiansen T., Korsgaard B„ Jespersen A. Effects of nonylphenol, 17p-oestradiol on vitellogenin synthesis, testicular structure, cytology in male eelpout Zoarces viviparous H J. Exp. Biol. 1997. Vol. 201. P. 179-192.

29. Christiansen T., Korsgaard B., Jespersen A. Induction of vitellogenin synthesis by nonylphenol, 17p-estradiol, effects on the testicular structure in the eelpout Zoarces viviparous II Mar. Environ: Res. 1998. Vol. 46. P. 141-144.

30. Christensen L.J., Korsgaard B., Bjerregaard P. The effect of 4-nonylphenol on the synthesis of vitellogenin'in the flounder Platichthys flesus I I Aquat. Toxicol. 1999. Vol. 46. P: 211-219?

31. Davis L.K., Fox B.K., Lim C., Hiramatsu N. Sullivan C. V., Hirano T., Grau E. G. Induction of vitellogenin production in male tilapia (Oreochromis mossambicus) by commercial fish diets // Comp. Biochem. Physiol. 2009. Vol. 154. P. 249-254.

32. Denslow N.D. Vitellogenin as a biomarker of exposure for estrogen or estrogen mimics // Ecotoxicology. 1999. Vol. 8. P. 385-398.

33. Desforges J.P.W., Peachey B.D.L., Sanderson P.M., White P.A., Blais J.M. Plasma vitellogenin in male teleost fish from 43 rivers worldwide is correlated with upstream human population size // Environ. Poll. 2010. Vol. 158, № 10. P. 3279-3284.

34. Dodds E.C., Lawson W. Oestrogenic activity of phydroxypropenyl benzene (anol) // Nature. 1937. Vol. 139. P. 1068-1069.

35. Dodds E.C., Goldberg L., Lawson W., Robinson R. Oestrogenic activity of certain synthetic compounds //Nature. 1938. Vol. 141. P. 247-248.

36. Dube M., MacLatchy D. Endocrine responses of Fundulus heteroclitus to effluent from a bleached-kraft pulp mill before, after installation of reverse osmosis treatment of a waste stream // Environ. Toxicol. Chem. 2000. Vol. 19. P. 2788-2796.

37. Emmersen B.K., Petersen I.M. Natural occurrence, experimental induction by estradiol-17b, of a lipophosphoprotein (vitellogenin) in flounder {Platichthys flesus, L.) // Comp. Biochem. Physiol. 1976. Vol. 54. P. 443-446.

38. Fagotto F. Regulation of yolk degradation, or how to make sleepy lysosomes // J. Cell Sci. 1995. Vol. 108. P. 3645-3647.

39. Filby A.L., Thorpe K.L., Tyler C.R. Multiple molecular effect pathways of an environmental oestrogen in fish //J. Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 37. P: 121-134;

40. Flouriot G., Pakdel F., Valotaire Y. Transcriptional; posttranscriptional regulation of rainbow trout estrogen; receptor; vitellogenin gene? expression-v II Moll Cell; Endocrinol. 1996. Vol. 124. P. 173-183. / '

41. Foster A., Breton B. Binding of sreroids by plasma* of teleosts: the rainbow trout Salmo gairdnerii II J. Steroid. Biochem. 1975. Vol. 6. P. 345-351.

42. Fujiwara Y„ Fukada H., Shimizu M., Hara A. Purification of two lipovitellins and development of immunoassays for two forms of their precursors (vitellogenins) in medaka (Oryzias latipes) // Gen. Comp. Endocrinol. 2005. Vol. 143. P. 267-277.

43. Fukada H., Haga A., Fujita T., Hiramatsu N., Sullivan C.V., Hara A. Development, validation of chemi-luminescent immunoassay for vitellogenin in five salmonid species // Comp. Biochem. Physiol. 2001. Vol. 130. P. 163-170.

44. Gronen S.N., Denslow S., Manning S.B., Barnes D., Brouwer M. Serum vitellogenin levels, reproductive impairment of male Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to 4-tert-octylphenol // Environ: Health Perspect. 1999. Vol. 107, № 5. P. 385-390.

45. Gercken J., Sordyl H. Intersex in feral marine, freshwater fish from north-eastern Germany // Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 54. P. 651-655.

46. Gurava S.S. The cell and molecular biology of fish oogenesis // Monogr. Dev. Biol. 1986. Vol. 18. P. 1-223.

47. Guyer R.B., Grunder A.A., Buss E.G., Clagett C.O. Calcium-binding proteins in serum of chickens: vitellogenin, albumin // Poultry Sci. 1980. Vol. 59. P. 874-879.

48. Hartling R.C., Kunkel J.G. Developmental fate of the yolk protein lipovitellin in embryos, larvae of winter flounder, Pleuronectes americanus II J. Exp. Zool. 1999. Vol. 284. P. 686-695.

49. Hartling R.C., Pereira J .J., Kunkel J.G. Characterization of a heat-stable fraction of lipovitellin, development of an immunoassay for, vitellogenin, yolk protein in winter flounder (Pleuronectes americanus) // J. Exp. Zool. 1997. Vol. 278. P. 156-166.

50. Hashimoto S., Bessho H., Hara A. Nakamura M., Iguchi T., Fujita K. Elevated serum vitellogenin levels, gonadal abnormalities in. wild male flounder {Pleuronectes yokohamae) fromTokyo Bay, Japan I I Mar. Environ. Res. 2000. Vol. 49. P. 37-53.

51. Hecker M., Tyler C.R., Hoffmann M., Maddix S., Karbe L. Plasma biomarkers in fish provide evidence for endocrine modulation in the Elbe River, Germany // Environ; Sci. Technol. 2002. Vol. 36. P. 2311-2321.

52. Heppell S.A., Jackson L.F.,, Weber G.M., Sullivan- G. V. Enzyme-linked! immunosorbent assay (ELISA) of vitellogenin in temperate basses (Genus Morone): plasma, in vitro analysis //Trans. Am: Fish. Soc: 1999i Vol: 128i P.,532-541.

53. Herman R.L., Kincaid H.L. Pathological, effects of orally administered estradiol to rainbow trout // Aquaculture. 1988. VoL 72. P. 165-172.

54. Hinck J.E., Blazer V.S., Schmitt C.J., Papoulias D.M., Tillitt D.E. Widespread occurrence of intersex in black basses (Micropterus spp.) from US rivers, 1995-2004 // Aquat. Toxicol. 2009. Vol. 95. P. 60-70.

55. Hinton D.E. Pollutant responses in marine organisms (PRIMO 8) // Mar. Environ. Res. 1996. Vol. 42. P. R3-R4.

56. Hiramatsu N., Jchikawa N., Fukada H., Fujita T., Sullivan C. V., Hara A. Identification, characterization of proteases involved in specific proteolysis of vitellogenin, yolk proteins in salmonids // J. Exp. Zooh 2002. Vol. 292. P. 11-25.

57. Hiramatsu N., Matsubara T., Weber G.M., Sullivan C. V., Hara A. Vitellogenesis in aquatic animals // Fish Sci. 2002. Vol. 68. P. 694-699.1. T t

58. Hiramatsu N., Cheek A.O., Sullivan C.V., Matsubara T., Hara A. Vitellogenesis, endocrine disruption. // Biochemistry and molecular biology of fishes. Amsterdam: Elsevier. 2005. Vol: 6. P. 562.

59. Hiramatsu N., Inoue M., Ideuchi H., Fujita T., Amano H., Matsubara T., Sullivan C. V., Hara A. Differential production and uptake of dual vitellogenins in Japanese medaka {Oryzias latipes) // CYBIUM Int. J. Ichthyol. 2008. Vol. 32. P. 260.

60. Hiramatsu N., Matsubara T., Fujita T., Sullivan C.V., Hara A. Multiple piscine vitellogenins: biomarkers of fish exposure to, estrogenic endocrine disruptors in aquatic environments // Mar. Biol. 2006. Vol. 149, № 1. 35-47.

61. Jeffries KM., Nelson E.R. Jackson L.J., Habibi H.R. Basin-wide impacts of compounds with estrogen-like activity on longnose dace {Rhinichtys cataractae) in'two prairie rivers of Albreta, Canada. Environ. Toxicol. Chem. 2008. Vol. 27. P. 2042-2052

62. Jobling S., Nolan M., Tyler C.R., Brighty G., Sumpter J.P. Widespread sexual disruption in wild fish//Mar. Environ. Res. 1998. Vol. 15. P. 194-202.

63. Kagawa H„ Young G., Adachi S., Nagahama Y. Estradiol-170 production in amago salmon (Oncorhynchus rhodurus) ovarian follicles: role of the thecal and granulosa cells. // Gen. Comp. Endocrinol. 1982. Vol. 47. P. 440-448.

64. Kang J.G., Price W.E. Occurrence of phytoestrogens, in municipal wastewater and surface waters // J. Environ. Monit. 2009. Vol. 11, № 8. P. 1477-1483.

65. Khanal S.K., Xie B., Thompson MX., Sung S., Say-Kee O.N.G., Leeuwen J. Fate, transport, and biodegradation of natural estrogens in the environment and;engineered systems //. Environ. Sci; TechnoK 2006; Vol; 40, № 21. PI 6537-6546.

66. Kholkutea S.D., Rodrigueza J„ Dukelow W.R. Reproductive toxicity of Aroclor-1254: Effects on oocyte, spermatozoa, in v/iraTeitilization;: and; embryo development in< the: mouse:// Reprod. Toxicoli Vol; 8, № 6; P^-487-49^; :.

67. Kleinkauf A:, Connor L., Swarbreck D., Levene C., Walker P., Johnson P.J., Leaha R. T. General condition biomarkers in relation to contaminant burden-in European flounder ■ (Platichthys flesus) // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2004. Vol. 58. P. 335-355.

68. Kleinkauf A., Macfarlane C., Yeates S:,. Simpson M.G., Leah R.T. A biomarker approach to endocrine disruption in flounder-estrogen receptors, hepatocyte proliferation; sperm motility // Ecotoxicol: Environ; Saf. 2004: Vol;.58i P. 324—334;

69. Kleinkauf A,, Scott A.P„ Stewart C., SimpsomMiGy^LeahRj.T Abnormally elevated VTG 'concentrations in flounder (Platichthys Jlesus) from thQ Mersey Estuary (UBC)-a continuihg-probliem-:// Ecotoxicol: Environ- .Saf;?2004i.Vol? 58i- P!.356-3'64;.

70. Korsgaard B., Pedersen K.L. Vitellogenin in Zoarces viviparus: purification, quantification by ELISA and induction by estradiol-17b and ,4-nonylphenol // Comp. Biochem. Physiol. C. 1998. Vol. 120. P.159-166. .

71. Menn F. Some aspects of vitellogenesis in a teleostean fish: Gobius niger L. // Comp.i

72. Magalhaes, Ledrich M.L., Pihan J.C., Falla J. One-step, non-denaturing purification method for carp (Cyprinus carpio) vitellogenin // J. Chromatogr. B. 2004. Vol. 799. P. 87-93.

73. Maitre J.L., Mercier L., Dole L., Valotaire Y. Characterization of estradiol specific receptors, induction of vitellogenin mRNA in the rainbow trout liver (Salmo gairdneri) II Biochemie. 1985. Vol. 67. P. 215-225.

74. Martin E., Taborsky M: 1997. Alternative male mating acttics in a cichlid, Pelvicachromis. pulcher: a comparison of reproductive effort, success // Behav. Ecol. Sociobiol. Vol. 41. P. 311-319.

75. Matsubara T., Koya Y. Course of proteolytic cleavage in three classes of yolk proteins, during oocyte maturation in barfin flounder (Verasper moseri) II J. Exp: Zool. 1997. Vol. 272. P. 34-45.

76. Matsubara T., Nagae M., Ohkubo N., Andoh T., SawagiichiS., Hiramatsu N., Sullivan C. V, Hara A. Multiple vitellogenins, their unique roles in marine teleosts // Fish Physiol. Biochem. 2003. Vol. 28. P. 295-299.

77. McMaster M.E., Van Der Kraak G.J., Munkittrick K.R. An epidemiological evaluation- of the biochemical basis for steroid hormonal depressions in fish exposed to industrial wastes // J. Gt. Lakes Res. 1996. Vol. 22. P. 153-171.

78. Mikula P., Kruzikova K., Dobsikova R., Harustiakova D., Svobodova Z. Influence of propylparaben on vitellogenesis, sex ratio in juvenile zebrafish (Danio rerio) // Acta Vet. Brno. 2009. Vol. 78. P. 319-326. . ,

79. Minier C., Levy .F, RabeL D., Bocquene G., Godefroy DBurgeot T., Leboulenger F. Flounder health status in the Seine Bay. A multibiomarker study // Mar. Environ. Res. 2000. Vol. 50. P. 373-377.

80. Nakada N., Nyunoya H., Nakamura M„ Hara A., Iguchi T., Takada H. Identification of estrogenic compounds in wastewater effluent // Environ. Toxicol. Chem. 2004. Vol. 23. P. 2807-2815.

81. Patino R., Sullivan C. V. Ovarian follicle growth, maturation, ovulation in teleost fish // Fish Physiol. Biochem. 2002. Vol. 26. P. 57-70.

82. Parrott J.L. Blunt B.R. Life-cycle exposure of fathead minnows (Pimephales promelas) to an ethinylestradiol concentration below 1 ng/L reduces egg fertilization success, demasculinizes males // Environ. Toxicol. 2005. Vol. 20. P. 131-141.

83. Peter R.E., Yu K.L. Neuroendocrine regulation^ of ovulation in fishes: basic and applied' aspects // Rev. Fish Biol. Fiher. 1997. Vol. 7. P: 173-197.

84. Petra P.H., Stanczyk F.Z., Namkung P. C., Fritz M.A., Novy M.J. Direct effect of sex steroid-binding protein (SBP) of plasma on the metabolic clearance rate of testosterone in the rhesus macaque // J. Steroid. Biohem. 1985. Vol. 22. P: 739-46.

85. Plack P.A., Pritchard D.J., Fraser N. W. Egg proteins in' cod serum: natural occurrence, induction by injections of oestradiol 3-benzoate // Biochem. J. 1971. Vol. 121. P. 847-856.

86. Polzonetti-Magni A.M., Mosconi G., Soverchia- L., Kikuyama' S., Carnevali O: Multihormonal control of vitellogenesis in lower vertebrates // Int. Rev. Cytol. 2004. Vol. 239. P. 1-46.

87. Purdom C.E., Hardiman P.A., Bye V.J., Eno N.C., Tyler C.R., Sumpter J.P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works // Chem. Ecol. 1994. Vol. 8. P. 275-285.

88. Quillet E., Aubard G., Queau I. Mutation in a sex-determining gene in rainbow trout: detection and genetic analysis // J. Hered. Vol. 93. 2002. P. 97-99.

89. Reith M., Munholland J., Kelly J., Finn R.N., Fyhn H.J. Lipovitellins derived from two forms of vitellogenin are differentially processed during oocyte maturation in haddock (Melanogrammus aeglefinus) 11 J. Exp. Zool. 2001. Vol. 291, № 1. P. 5867.

90. Rodriguez N.J., GeffardK.O.M., Le Menn F. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for sole (.Soles vulgaris) vitellogenin // Comp. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 92B. P. 741-746.

91. Romano M., Rosanova P., Anteo C., Limatola E. Vertebrate yolk proteins: a review // Mol. Reprod. Dev. 2004. Vol. 69. P. 109-118. , .

92. Roubal W.T., Lomax D.P., Maryjean L., Lyndal L.J. Purification and partial characterizationtof English sole Pleuronectes vetulus vitellogenin // Comp. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 118B. P. 613-622.

93. Roy R.L., Morin Y., Courtenay S.C., Robichaud P. Purification of vitellogenin from smooth flounder (Pleuronectes putnami), measurement in plasma by homologous ELISA // Comp. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 139B. P. 235-244:

94. Rujiralai T„ Bull I.D., Llewellyn N. Evershed R.P. In sitw polar organic chemical integrative sampling (POCIS) of steroidal estrogens in sewage treatment works discharge and river water // J. Environ. Monit. 2011. Vol. 13, № 5. P. 1427-1434.

95. Salaberria L, Hansen B.H., Asensio V., Olsvik P.A. Andersen R.A., Jenssen B.M. Effects of atrazine on hepatic metabolism, endocrine homeostasis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) II Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. Vol. 234. P. 98-106.

96. Scholz S., Gutzeit H.O. 17alpha-ethinylestradiol affects reproduction, sexual differentiation, aromatase gene expression of the medaka (Oryzias latipes) II Aquat. Toxicol. 2000. Vol. 50. P. 363-373.

97. Selman K., Wallace R.A., Cerda J. Bafilomycin Al inhibits proteolytic cleavage and hydration but not yolk crystal disassembly or meiosis during maturation of sea bass oocytes // J. Exp. Zool. 2001. Vol. 290. P. 265-278.

98. Shao J., Shi G., Liu J., Jiang G. A rapid two-step chromatographic method for the quantitative determination of vitellogenin in-fish'plasma // Anal. Bioanal. Chem. 2004. Vol. 378. P. 615-620:

99. Silversand C., Haux C. Isolation of turbot (<Scophthalmus maximus) vitellogenin by high* iperformance anion exchange chromatography // J. Ghromatogr. 1989. Vol. 478. P: 378-397.

100. Solé M., López de Alba M.J., Castillo M., Porte C., Ladegaard-Pedersen K., Braceló D. Estrogenicity determination in sewage treatment plants, surface waters from the Catalonian Area (NE Spain) // Environ. Sci. Technol. 2000.Vol. 34. P. 5076-5083.

101. Solé M., Porte D., Barceló D. Vitellogenin induction and other biochemical responses in carp, Cyprinus carpió, after experimentally injection with 17 alpha-ethynylestradiol // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2000. Vol: 38. P.494-500.

102. Solé M., Porte C., Barceló D. Analysis of the estrogenic activity of sewage treatment works and receiving waters using vitellogenin induction in fish as biomarker // Trends Anal. Chem. 2001. Vol. 20. P. 518-525.

103. Song: W.T., Lu G.H., Wang C., Zhang H.Z., Xu S., Qin J. Study on environmental estrogen pollution in Yangtze River (Nanjing section) by an in vzvo bioassay// Bull. Environ; Gontam. ToxicoU 2010. Vol. 84, № 4. P. 406-412.

104. Sonnenschein C., Soto A.M. An updated review of environmental estrogen/and androgen mimics, antagonists II J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998: Vol. 65. P. 143-150.

105. Soy ano K., Aoki J., Itashiki Y., Park C., Nagae M., Takao Y., Lee Y., Yeo I., Zhong J. Contaminations by endocrine disrupting, chemicals in coastal waters of the- East China Seat.Nagasaki:Nagasaki University. 2010PI 215-226.

106. Specker J.L., Anderson T.R: Developing anELISA for á model protein-vitellogenin // Biochemistry and molecular, biology of fishes:. Analytical techniques. Amsterdam: Elsevier. 1994. Vol. 3 P. 567 578. ■ '

107. Specker J.L., Sullivan G. V. Vitellogenesis in- fishes: status, perspectives; // Perspectives, in comparative:endocrinology. Ottawa: National;Research'Gouncil;T994; Pi 304-315;

108. Stifani Si, Le Ménn F., Rodriguez J.N., Schneider J^X Regulation ofoogenesis: the piscine receptor;for;vitellogenin // Biochem: Biophys: Acta. J990. Vol. 1045; P;,271-279:.

109. Sugimoto Z.L., Yoshitome S:SiL, Hashimoto E. Mass-spectrometricidentification of binding proteins of Mr 25,000 protein; a part of vitellogenin^ Bl>, detected^ in- particulate fraction of Xenopws laevis oocytes II Protein J.'2004. Vol; 23; P. 467-473;

110. Sumpter J.P. The purification, radioimmunoassay,, plasma levels of vitellogenin from: the rainbowtrout(Salmo gairdneri) II Hong Kong: Hong Kong University Press. 1985. P. 355-357.

111. Sumpter J.P., Jobling S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination in the aquatic environment // Environ. Health Perspect. 1995. Vol. 103. P. 173-178.

112. SunB., Pankhurst N.W., Watts M. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for vitellogenin measurement in greenback flounder Rhombosolea tapirina II Fish Physiol. Biochem. 2003. Vol. 29. P. 13-21.

113. Biochem. 1993. Vol. 12. P. 31-46. >

114. Tyler C.R:, van der Eerden В., Jobling S., Panter G., Sumpter J.P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to estrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish //J. Comp. Physiol. B. 1996. Vol: 166; P; 418-426.

115. Utarabhand P., Bunlipatanon P. Plasma vitellogenin of grouper {Epinephelus malabaricus):iisolation and properties // Comp. Biochem. Physiol. 1996. Vol. 115C. P. 101-110.

116. Van-Bohemen C.G., Lambert J.G.D., van Oordt P.G.W.J. Vitellogenin induction by estradiol in estrone-primed rainbow trout, Salmo gairdneri II Gen. Comp. Endocrinol. 1982. Vol. 46. P. 136-139.

117. Van den Heuval M., Ellis R. Timing of exposure to a pulp, paper effluent influences the manifestation of reproductive effects in rainbow trout // Environ. Toxicol. Chem. 2002. Vol. 21. P. 2338-2347.

118. Vashchenko M.A., Syasina I.G., Zhadan P.M. DDT, hexachlorocyclohexane in bottom sediments, the liver of barfin plaice Pleuronectes pinnifasciatus from Amur Bay (Peter the Great Bay, the Sea of Japan) // Rus. J. Ecol. 2005. Vol. 36, № 1. P. 57-61.

119. Vetillard A., Atteke C., Saligaut C., Jego P., Bailhache T. Differential regulation of tyrosine hydroxylase, estradiol receptor expression in the rainbow trout brain // Mol. Cell Endocrinol: 2003. Vol. 199. P. 37^7.

120. Vethaak A.D., LarhJ., Kuiper R.V., Grinwis J.C.M., Rankouhi T.R., Giesy J.P., Gerritsen A. Estrogenic effects in fish in The Netherlands: some preliminary results // Toxicology. 2002. Vol. 181-182. P. 147-150.

121. Wallace R.A. Vitellogenesis and oocyte growth'in nonmammalian vertebrates. New York: Plenum Press. 1985. Vol. 1. P. 127-177.

122. Wang H., Yan T., Tan J.T.T., Gong Z.A. Zebrafish vitellogenin gene (Vtg3) encodes a novel vitellogenin without a phosvitin domain, may represent a primitive vertebrate vitellogenin gene // Gene. 2000. Vol. 256. P. 303-310.

123. White R., Jobling S., Hoarse S.A., Sumpter J.P., Parker M.G. Environmentally persistent alkyphenolic compounds are estrogenic // Endocrinology. 1994. Vol. 135. P. 175182.

124. Woodling J.D., Lopez E.M., Maldonado T.A., Norris D.O., Vajda A.M. Intersex, other reproductive disruption of fish in wastewater effluent dominated Colorado streams //

125. Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 2006. Vol. 144. P. 1015.

Информация о работе

Швед, Никита Александрович
кандидата биологических наук
Владивосток, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Вителлогении полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata как биомаркер эстрогенного загрязнения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы