Устойчивые свободно-радикальные реакции в водных растворах бикарбонатов

До Минь Ха

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Устойчивые свободно-радикальные реакции в водных растворах бикарбонатов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Устойчивые свободно-радикальные реакции в водных растворах бикарбонатов"

На правах рукописи

ХЛОЙ-

До Минь Ха

УСТОЙЧИВЫЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ БИКАРБОНАТОВ

03.01.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

МОСКВА 2011

4848962

Работа выполнена на кафедре биоорганической химии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Воейков Владимир Леонидович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

Пальмина Надежда Павловна

Доктор биологических наук, профессор

Тамбиев Александр Хапачевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт элеменгоорганических (¡единений им. А.Н. Несмеянова РАН.

Защита диссертации состоится «22» июня 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан V $мая 2011 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химических наук

Мазалецкая Л.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Углекислый газ и образующиеся при реакции С02 с водой угольная кислота, бикарбонаты и карбонаты, которые в совокупности именуются углекислотой, присутствуют в разных соотношениях практически во всех природных водных системах. Все биологические жидкости, включая цитоплазму живых клеток и внеклеточные среды, являются бикарбонатными водными системами. Углекислота, образующаяся в организме при окислении органических соединений, играет важную роль в регуляции разнообразных биологических процессов. Так, при дефиците в организме углекислоты, подавляется дыхание как на уровне целого организма [Haidane J., 1927 and Henderson Y., 1938; Агаджанян H.A. и др., 1995], так и на клеточном уровне [Bicz W., 1960; Palet A. et al., 1991]. Углекислота влияет на активность многих ферментов, экспрессию генов, систему кровообращения, иммунные реакции [Коган А.Х. и др., 2006]. Биологические эффекты углекислоты столь многообразны, что представителей семейства углекислоты можно считать универсальными регуляторами метаболизма.

Механизмы действия углекислоты на клеточном и молекулярном уровнях изучены в настоящее время недостаточно. Углекислота играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного баланса в биологических системах, но механизм ее действия не сводится только к этому фактору. Лишь в последнее время стали появляться работы, свидетельствующие о существенном влиянии углекислоты, в частности, бикарбоната на процессы с участием активных форм кислорода (АФК). Коганом А.Х. с соавт. [1995] было обнаружено, что углекислота служит универсальным регулятором свободнорадикального гомеостаза клеток и тканей у живых организмов. Она влияет на активность супероксиддисмутаз, ксантиноксидазы и других ферментов, участвующих в процессах обмена АФК [Fridovich I. et al., 1976, 2004], на неферментативные окислительные процессы, протекающие в водных системах in vitro и in vivo [Medinas D.B. et al., 2007]. Влияние представителей семейства углекислоты на свободнорадикальные процессы обусловлено тем, что они реагируют с АФК и превращаются в относительно долгоживущие и селективно действующие на свои мишени карбонатные радикалы и пероксикарбонаты [Augusto О. et al., 2002]. Появляется все больше доказательств того, что как АФК, так и свободнорадикальные реакции с их участием служат универсальными регуляторами процессов жизнедеятельности на разных уровнях организации живых систем, а патогенное действие АФК связано с нарушениями регуляции их обмена [Ramasarma Т., 1990; Thannickal V.J. and Fanburg B.L., 2000; Droge W„ 2002; Voeikov V.L., 2001, 2007]. Поэтому изучение модулирующей роли углекислоты в действии АФК весьма актуально.

Каждая форма углекислоты имеет свои физико-химические свойства, и одним из важных факторов, обеспечивающих многообразие биологических эффектов, служит изменение их соотношения за счет изменения рН водной среды. Однако вода может и непосредственно участвовать в реализации модулирующего действия углекислоты на процессы с участием АФК. В настоящее время появились как экспериментальные [Pollack G., 2003-2010], так и теоретические [Del Giudice Е. and Preparaia G., 1995] обоснования возможности расщепления воды на радикалы в мягких условиях, что должно сопровождаться развитием в ней окислительно-восстановительных процессов. Действительно, при действии на воду факторов весьма низкой интенсивности (звук, механическое перемешивание воды, замораживание-оттаивание, воздействие низкочастотными электромагнитными полями) вода служит источником АФК [Домрачев и др., 1992; Воейков В.Л. и др. 1996; Ikeda S. et al., 1999; Брусков В.И. и др. 2001; Wentworth P., Jr. et al., 2001; BelovolovaL. V. et al., 2009]. Учитывая чрезвычайно важную роль, которую играет углекислота как в биологических, так и в других природных водных системах, изучение реакций с участием АФК в водных растворах бикарбонатов может открыть дополнительные возможности для понимания механизмов влияния углекислоты на широкий спектр биологических процессов, что позволит эффективно управлять ими.

Цель данной работы заключалась в исследовании свойств и динамики свободно-радикальных реакций, непрерывно протекающих в водных растворах бикарбонатов, а также влияния разных физико-химических факторов на эти реакции.

Основными задачами исследования являлись:

Выявление присутствия супероксидных радикалов в растворах бикарбонатов с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спинового зонда тайрона (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты) и изучение зависимости сигнала ЭПР от концентрации бикарбонатов, рН, влияния физических (освещение) и химических факторов.

Изучение продукции АФК хемилюминесцентным методом в бикарбонатных растворах в ответ на внесение в них солей двухвалентного железа в присутствии и в отсутствие люминесцентного зонда люминола (JIM).

Исследование хемилюминесцентным методом с использованием АФК-зондов ЛМ и люцигенина (ЛЦ) продукции АФК в бикарбонатных и других буферных водных растворах, активированных внесением в них перекиси водорода в низких концентрациях.

Изучение влияния различных факторов (температуры, рН и др.), про- и антиоксидантов и слабых воздействий (космо-физические факторы, гидратированные фуллерены в малых и сверхмалых концентрациях) на параметры сопровождающихся

хемилюминесцснцией (ХЛ) свободнорадикальных процессов в бикарбонатных водных растворах.

Основные положения, выносимые на защиту:

В водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала, стационарный уровень которого возрастает с увеличением концентрации бикарбоната от 5 до 100 мМ. Интенсивность сигнала тайрона (ЭПР-зонда на супероксидный радикал) возрастает при освещении раствора белым и синим (?.=455 нм) светом и максимальна при рН около 9,0. Сигнал отсутствует в дистиллированной воде и в растворах Ва(ОН)2 в этом диапазоне рН, что свидетельствует о специфической роли бикарбоната в продукции супероксидного радикала в воде.

При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Ре(И) или К3[Ре(СН)6] в микромолярных концентрациях регистрируется вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии люминесцентного зонда на АФК - ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна при значениях рН водных растворов 8,8-9,0. Интенсивность ХЛ снижается в присутствии тайрона — ловушки супероксидных радикалов и при добавлении каталазы, что свидетельствует о продукции супероксидного радикала и перекиси водорода в водных растворах бикарбонатов.

При внесении в водные растворы бикарбонатов Н202 в субмиллимолярных концентрациях в присутствии ЛМ они становятся длительными источниками ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев. Интенсивность ХЛ возрастает при внесении в реакционные смеси Ре804 в микромолярных концентрациях или пероксидазы и подавляется в присутствии каталазы и тайрона, что свидетельствует об участии Н2О2 и супероксидного радикала в процессах, сопровождающихся ХЛ. В присутствии ЛЦ интенсивность ХЛ ниже, чем в присутствии ЛМ, и она затухает быстрее, но ее интенсивность вновь возрастает при повторном внесении ЛЦ в «затухший» раствор.

Гидратированные фуллерены (НуРл) в концентрациях выше 10 нМ снижают интенсивность вспышки ХЛ, индуцированной внесением Ре(И) в водные растворы бикарбонатов, а в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ. В водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, НуРп в диапазоне концентраций 10'11 - Ю'20 М повышали интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ. При этом зависимость эффекта от дозы НуРп имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в области сверхмалых доз (10"16 - 10'15 М) и "мнимых" концентраций (<10'19 М).

Предложена гипотеза, позволяющая объяснить большинство полученных результатов с учетом особой роли водной среды в осуществлении незатухающих

свободнорадикальных реакций в растворах бикарбонатов. Вода рассматривается, как двухфазная система, в которой одна из фаз может служить донором электронов.

Научная новизна исследования:

Впервые обнаружено спонтанное образование супероксидного радикала в водных растворах бикарбонатов, зависящее от концентрации бикарбоната и усиливающееся при освещении.

Впервые обнаружено, что при внесении в водные растворы бикарбонатов солей двухвалентного железа развивается вспышка ХД интенсивность которой возрастает в присутствии ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна в районе pH 8,8-9,0, что совпадает с максимумом сигнала ЭПР для водных растворов бикарбонатов.

Впервые обнаружено, что в водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, развивается ЛМ-зависимая ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев.

Впервые установлено, что гидратированные фуллерены в сверхмалых и «мнимых» концентрациях, повышают интенсивность устойчивой ЛМ-зависимой ХЛ водных растворов бикарбонатов, активированных перекисью водорода.

Впервые показано, что ЛМ в микромолярных концентрациях может выступать в роли усилителя ХЛ в течение чрезвычайно длительного времени (месяцы и годы), что свидетельствует о существовании механизма усиления им интенсивности излучения, сопровождающего свободнорадикальные реакции, который отличается от общепринятого.

Теоретическая и практическая значимость исследования: Теоретическая значимость работы определяется тем, что она вносит определенный вклад в понимание механизмов участия углекислоты в биологических и других природных процессах, что даст возможность целенаправленно влиять на них.

Поскольку активированные перекисью водорода водные растворы бикарбонатов являются стабильными источниками ХЛ, не затухающей длительное время, и обладают чувствительностью к действию низкоинтенсивных физических и химических факторов, появляется возможность использовать их в качестве тест-систем для регистрации физических полей и исследования свойств препаратов, представляющих собой растворы биологически активных веществ в сверхмалых дозах.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (2008 г., ИБХФ РАН, Москва), Международном научном конгрессе: Наука. Информация. Сознание (2008 г.), XIII Международном Научном Конгрессе по Электрофотонике (2009 г.), VIII International Crimean Conference (2009, Sudak, Crimea, Ukraine), X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (ОМИП-2009,

МЭИ, г. Москва), The 26-th Progress In Electromagnetics Research Symposium (PIERS) (2009, Moscow), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (2009 г., Санкт-Петербург, СПб ГУ), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (2010 г., ИБХФ РАН, Москва).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в научных журналах и 12 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, содержит 2 схемы и 35 рисунков. Состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», « Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Литература». Библиографический список состоит из 126 ссылок, в том числе 31 источников на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы по теме данного исследования. В нем охарактеризована роль углекислоты в жизнедеятельности. Описаны процессы генерации АФК, карбонатных радикалов и пероксимонокарбоната в растворах бикарбонатов. Свойства структурированных вод и их роль ы свободно-радикальных процессах, протекающих в водных системах. Рассмотрены свойства фуллеренов и их гидратированных форм как биологически активных агентов.

Вторая глава посвящена описанию оборудования, реактивов и методики экспериментов. В Разделе 2.1. описаны источники использованных реактивов, их характеристики, способы приготовления запасных и рабочих растворов реагентов. Для приготовления водных растворов использовали дистиллированную деионизированную воду, очищенную на приборе ELSICO-HPLC, электропроводность воды составляла 0,8 мкСм/см. Все реагенты были категории не ниже ЧДА (Reagent grade). Концентрации Н2О2 и люминола в запасных растворах уточняли спектрометрически перед их использованием. Различные буферные растворы готовили в соответствии с рекомендациями «Справочника биохимика» (М.: Мир, 1991). В экспериментах, в которых исследовали влияние на ХЛ гидратированных фуллеренов (HyFn), использовали препарат гидратированных фуллеренов Ceo с концентрацией 1мМ в 5мМ NaHC03, любезно предоставленный Г. В. Андриевским. Из исходных растворов HyFn делали серийные десятичные и сотенные разведения HyFn и вносили в 1 мл готовых бикарбонатных растворов по 10 мкл разведений до концентраций 10"9 - Ю"20 М.

В Разделе 2.2. описаны методики измерения XJI и спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали радиоспектрометром ЭПР РЭ-1307 3-х-сантиметрового диапазона (ЭЗАН, г. Черноголовка). Условия регистрации спектров: мощность СВЧ-излучения 4 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 Гаусс. Измерения проводили при комнатной температуре 20-22°С в плоской кварцевой кювете (внутренний зазор 0,25 мм), куда помещали 35 мкл образца. В случае освещения образца использовали светодиод марки «LXHP-PRO 2» фирмы «Luxeon LEDs» с длиной волны 455 нм с мощностью 5 Вт при 6,84 В. В качестве спиновой ловушки ЭПР был взят тайрон (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты), концентрация которого в образцах составляла 10 мМ.

XJI-излучение регистрировали работающими в режиме счета одиночных фотонов люминометрами - «Биотоке 7А», «Биотоке 7», «Биотокс-7С» (АНО «Инженерный центр-экология», Россия). «Биотоке 7» оснащен фотоумножителем ФЭУ-101 с диаметром фотокатода 1 см (темновой ток ~ 10 имп./сек) и имеет термостатируемую камеру для образца; «Биотоке 7А» - фотоумножителем 9750QB/1 (EMI Electronics) с диаметром фотокатода 5 см (темновой ток ~ 25 имп./сек). Область спектральной чувствительности обоих ФЭУ составляет 380-710 нм, а максимальная чувствительность лежит в области 450 нм; «Биотокс-7С» снабжен малошумящими ФЭУ-142 и ФЭУ-101, оба с диаметром фотокатодов 1 см (Россия) (темновой ток ~ 5 имп./сек) с областью спектральной чувствительности ФЭУ 300-600 нм, областью максимальной спектральной чувствительности 380-490 нм. ФЭУ в счетчиках расположены горизонтально и регистрируют излучение с боковой поверхности сосуда, помещенного в камеру для образца. Интенсивность излучения измеряли с дискретой 1 сек (имп./сек). Измерение излучения в большинстве случаев проводили из растворов объемом 1 мл, помещенных в пробирки «Эппендорф». В отдельных экспериментах использовали флаконы для сцинтилляционного счета или кварцевые и стеклянные кюветы. В экспериментах по измерению влияния температуры на ХЛ раствора кварцевую кювету с растворами помещали в медный блок, через полую стенку которого пропускали воду от водяных термостатов, один из которых подавал в блок горячую, другой - холодную воду. Система подачи воды включала краны для переключения подачи воды от термостатов, что позволяло повышать и понижать температуру растворов в кювете. В кювету помещали миниатюрный германиевый датчик температуры, сигнал от которого после преобразования АЦП поступал на компьютер, что позволяло одновременно регистрировать температуру раствора и ХЛ из него. Значения рН растворов измеряли на рН метре-иономере «ЭКСПЕРТ-001» (Экооткс-Эксперт - Россия). Все результаты поступали на компьютер в ASCII-кодах через собственные программы приборов. Полученные файлы переводили в графическую форму с использованием программ Statistica 8 и Microsoft Excel. В этих

же программах статистически обрабатывались полученные результаты и строились графики.

В Третьем главе приводятся результаты исследования и их обсуждение.

В Разделе 3.1. описаны эксперименты по выявлению 0г"«/Н02« в растворе бикарбонатов с помощью метода ЭПР. Как видно из рисунка 1, в темноте сигнал спиновой ловушки тайрона ЭПР регистрируется из раствора с 10 мМ, но не с 5 мМ ЫаНС03. При освещении раствора с 5 мМ №НС03 уровень супероксидного радикала в нем становится достаточным для уверенной регистрации сигнала ЭПР. Следует отметить, что амплитуда сигнала ЭПР из 10 мМ раствора МаНС03 возрастала при освещении в 3,6 раза, по сравнению с его уровнем в темноте, (рис. 1).

Рисунок 1. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона в темноте (А) и при освещении синим светом 455 нМ ( Б ) в растворах КаНС03 (5 и 10 мМ).

Амплитуда спектров ЭПР тайрона зависит от рН (рис. 2). Как на свету, так и в темноте максимальная амплитуда характерна для раствора с рН 9,0. В воде с рН, доведенным 0,Ш КаОН до 8,94, сигнал не наблюдался. Сигнал также не наблюдался в растворах Н202 (3 мМ) и в боратных буферах при значениях рН в диапазоне 8,5-9,4. Это свидетельствовало о необходимости ионов НСОз~7СОз2- для продукции супероксидных радикалов в растворе и о существовании оптимума рН для их продукции.

При одинаковом значении рН 8,9 амплитуды сигнала ЭПР тайрона возрастают с ростом концентрации НС0з~/С032_ (рис. 3). Интересно отметить, что при оптимальном значении рН и при освещении, достаточный для регистрации сигнала ЭПР уровень супероксидного радикала имеется даже в 1мМ растворе бикарбоната.

.1000-1

А.

Б.

lOOO бОО

-600 -i ООО

I ООО бОО

-бОО ■i ООО

lOOO ЛОО

-бОО -lOOO

1 ООО 600

IOOO бОО

-4SOO • lOOO

i ООО ÓOO

-aoo -ÍOOO

tooo 600

-бОО .JOPO

Б.

Рисунок 2. Зависимость амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворе №НС03 (10 мМ) от рН в темноте (А) и при освещении синим светом 455 нМ (Б). рН 8,52 (линия 1); рН 8,72 (2); рН 9,01 (3); рН 9,15 ( 4); вода с рН 8,94 (5),

Рисунок 3. Амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворах КаНС03 (1; 5; 25; 100 мМ) со значением рН 8,9 при освещении светом 455 нМ.

Как видно на рис. 4, при добавлении в раствор №НС03 перекиси водорода (3 мМ) амплитуда сигнала ЭГ1Р спиновой ловушки тайрона при освещении раствора бикарбоната №НС03 (5 мМ) уменьшается на 45% по сравнению с контролем. При добавлении Ре504 (10 мкМ) сигнал уменьшается лишь на 20%, а при одновременном добавлении Н202 и Ре(П), сигнал ингибируется на ~75%.

tООО ■ бОО- О- SOO- -гооо- tooo 600 о -«00--IOOO г^^ДДДД^

IOOO 4SOO о -бОО -г ооо юоо бОО о -бОО -JOOO

Рисунок 4. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона при освещении синим светом 455 нМ в растворе NaHC03 (5 мМ) (линия 1), с перекисью водорода (3 мМ) (2), с FeS04 (10 мкМ) (3), с перекисью водорода (3 мМ) и FeS04 (10 мкМ) (4).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в водных растворах бикарбонатов спонтанно образуется супероксидный радикал, стационарный уровень которого возрастает при освещении раствора. Таким образом, основной физиологический буфер представляет собой редокс-активную среду.

В Разделе 3.2. описаны эксперименты по изучению XJI растворов бикарбонатов. В Подразделе 3.2.1. показано, что в водных растворах бикарбонатов в ответ на добавление солей сульфатного двухвалентного железа FeS04 (доноров электронов), возникает вспышка люминесценции, затухающая в течение нескольких секунд - нескольких десятков секунд с момента добавления соли. Максимальная амплитуда и светосумма наблюдалась при концентрации Fe(II) 5-10 мкМ, однако развитие ХЛ происходило даже при концентрации Fe(II) 0,1 мкМ. Для усиления сигнала ХЛ вместе с Fe(II) в растворы бикарбонатов добавляли ЛМ (неспецифический зонд на АФК). При этом амплитуда вспышки излучения (Fe(II)-ЛМ-зависимая ХЛ) возрастала приблизительно в 10 раз. Оптимальная концентрация ЛМ составляла 5-10 мкМ. При добавлении к растворам бикарбонатов только ЛМ, ХЛ не наблюдается. Реагент Ре(П)-ЛМ использовали в дальнейших экспериментах для изучения влияния различных факторов на реакции, протекающие в водных растворах бикарбонатов.

А Б

Рисунок 5. Излучение 1 мл свежеприготовленных растворов КаНС03 (А) (концентрации указаны на графике) при добавлении в раствор реагента Ре(П)-ЛМ (10 мкМ/10 мкМ). Приведены средние значения для 3-х параллельных проб, разброс не выше 5%. Изменение излучения (Б) раствора №НС03 (5 мМ ) при его хранении при комнатной температуре.

В подразделе 3.2.2 представлены результаты исследований зависимости сигнала Ре(П)-ЛМ ХЛ от рН. При добавлении реагента Ре(11)-ЛМ в свежеприготовленные растворы КаНС03 или КНС03 амплитуда вспышки ХЛ возрастает с ростом концентрации бикарбоната (рис. 5 А). При хранении этих растворов в контакте с воздухом амплитуды вспышек ХМ возрастали (рис. 5 Б). Оказалось, однако, что различия в интенсивности излучения растворов с разной концентрацией НС03~ обусловлено различием в рН этих растворов - чем выше концентрация НС03_ в водном растворе, тем выше значение в нем рН. При хранении водных растворов бикарбонатов в контакте с воздухом значения их рН возрастают.

Для выяснения рН-зависимости интенсивности ХЛ, индуцированной введением в раствор бикарбоната реагента Ре(ГГ)-ЛМ, 5 мМ раствор 1МаНС03 титровали КаОН и определяли амплитуду вспышки излучения и светосумму за 60 сек в диапазоне значений рН 7,5 - 10,5. Из графика на рисунке 6 видно, что амплитуда возрастает при увеличении рН до 9, затем резко снижается и вновь начинает расти в щелочной области при рН > 10. Диапазон рН, в котором значения светосумм индуцированных Ре(П) вспышек ХЛ в растворах бикарбонатов максимальны, был сдвинут ближе к рН 8,6. Учитывая, что значения рКа для углекислоты составляют: рКа1=6,35 и рК^Ю.З (при 25°С), в диапазоне рН, оптимальном для развития индуцированной Ре(Н) ХЛ, углекислота в растворе представлена более, чем на 90% бикарбонатом, но несколько процентов ее представлено С032_.

Для выяснения роли ионов НС03~ и роли рН в развитии индуцированной реагентами ХЛ, реагент Ре(11)-ЛМ вносили в образцы деионизированной воды, рН которой доводили до значений в диапазоне от 8 до 10,5 с помощью Ва(ОН)2. В

растворах Ва(ОН)2 вспышек ХЛ при рН < 9,0 не наблюдалось и ХЛ появлялась лишь при значениях рН > 9,2. Отсутствие ХЛ в растворах Ва(ОН)2 при значениях рН, оптимальных для ХЛ растворов бикарбонатов, может объясняться тем, что ВаС03 слабо растворим в воде, и концентрация бикарбоната, образующегося из С02 воздуха, в них ничтожна.

Рисунок 6. рН-^зависимость амплитуд вспышек, индуцированных реагентом Ре(11)-ЛМ (концентрации по 10 мкМ), в растворе №НСОз (5 мМ), рН в котором доводили до разных значений 1МаОН. Представлены средние значения для 3-х параллельных образцов.

Таким образом, вспышки ХЛ, наблюдаемые в ответ на введение в водные растворы бикарбонатов реагента Ре(Н)-ЛМ в диапазоне рН до 9,0, обусловлены присутствием в воде бикарбоната, а ХЛ при рН > 9,2 связана со свободно-радикальными процессами другой природы.

В Подразделе 3.2.3. описаны результаты экспериментов по влиянию гидратированных фуллеренов С6о (НуРп) на Ре(Н)-ЛМ-зависимые вспышки ХЛ в растворах бикарбонатов.

НуРп представляют собой водный раствор молекул фуллеренов, в котором каждая молекула С6о окружена многослойной водной оболочкой [АлсЫеувку О.У. с( а!., 2002]. НуРп в низких дозах эффективно предохраняют животных от окислительного стресса и формально ведут себя как особого рода антиоксиданты [АпсИеувку О.У. е1 а!., 2009]. Из данных, представленных на рисунке 7, видно, что при относительно высоких концентрациях

рН растворов

Рисунок 7. Концентрационная зависимость влияния НуРп на светосуммы за 1 мин вспышек ХЛ, индуцированных реагентом Ре(П)-ЛМ (10 мкМ/5 мкМ) в 1 мл КаНСОз (5 мМ). К — контроль без фуллеренов

гидратированных фуллеренов (100 нМ) они, действительно, выступают в роли антиоксидантов, подавляя интенсивность индуцированной XJI на 35%. Но в концентрациях < 1 нМ, они усиливают ХЛ, индуцированную в растворе NaHC03. В присутствии 0,1 нМ HyFn превышение над контролем составляет 22%, и этот эффект достоверен с р < 0,05. Повышение светосуммы ХЛ можно объяснить тем, что в суб-наномолярных концентрациях HyFn ускоряют протекание в растворах бикарбонатов свободно-радикальных процессов.

В Подразделе 3.2.4. описаны результаты экспериментов по изучению влияния тайрона (1 мМ) и каталазы (1,75 ед.) на индуцированные реагентами Ре(11)-ЛМ и К3[1е(СК)6]-ЛМ вспышки ХЛ в растворах бикарбонатов. Каталаза несколько снижает амплитуды вспышек Ре(П)-ЛМ ХЛ в растворах NaHC03 с рН 8,4 и 8,5 (рис. 8А), но эффект отсутствует при рН выше 8,6. Это может быть связано либо с тем, что при высоких значениях рН активность фермента снижается [Aebi Н., 1984], либо с тем, что вклад реакции Фентода в развитие вспышки люминесценции при внесении в раствор бикарбоната реагента Ре(П)-ЛМ мало значителен по сравнению с вкладом других реакций, сопровождающихся ХЛ. Тайрон эффективнее снижает сигнал Fe(II)-ЛМ ХЛ в более широком диапазоне рН.

Для выяснения того, присутствует ли перекись водорода в растворе NaHC03 в диапазоне рН, оптимальном для развития вспышки в ответ на добавление реагента Ре(П)-ЛМ, мы использовали другой реагент, K3[Fe(CN)s] - ЛМ, который часто применяют для определения присутствия в растворах перекиси водорода в широком диапазоне рН [Shevlin and Neufeld, 1970]. Каталаза и особенно тайрон подавляли индуцированные реагентом K3[Fe(CN)6]-.JTM вспышки ХЛ из растворов NaHCOj намного более эффективно, чем вспышки, индуцированные реагентом Fe(II)-nM (Рис. 8Б).

Таким образом, в растворах бикарбонатов, во-первых, непрерывно происходит генерация АФК, в частности, супероксидного радикала и перекиси водорода, а, во-вторых, вклад, который вносят супероксид радикал и Н2О2 в развитие вспышки ХЛ при внесении в раствор реагента Ре(11)-ЛМ, является далеко не исчерпывающим. Можно предположить, что в развитие волны ХЛ при добавлении в раствор бикарбоната Fe(II) вносят вклад также и карбонатные радикалы, которые окисляют Fe(II) до Fe(III), а сами превращаются в исходные бикарбонат или карбонат-ионы [Alvarez, et al., 2007].

Рисунок 8. Влияние каталазы (1,75 ед) и тайрона (1 мМ) на амплитуду вспышек XJI, индуцированной введением в раствор NaHC03 (5 мМ) (А) реагента Fe(II)-JIM или (Б) реагента К3[Ре(СК)б]-ЛМ (конечные концентрации — по 10 мкМ). рН растворов доводили NaOH до указанных значений. Каталазу добавляли в раствор NaHC03 за 30 мин до внесения реагента, а тайрон - за 30 сек до внесения реагента. За 100% принимают максимальную амплитуду вспышек ХЛ в данном эксперименте. Данные представлены как средние значения из 3-х параллелей ± стандартные отклонения от среднего.

В Разделе 3.3. представлены результаты, полученные при исследовании ХЛ-свойств водных растворов бикарбонатов, в которые вносили Н202. Недавно было обнаружено, что Н202 реагирует с НС03"/С02 с образованием пероксимонокарбоната (НООСОСГ), [Richardson D.E. et al., 2003], при разложении которого возникает богатый набор АФК и повышается интенсивность окислительно-восстановительных и, в частности, свободно-радикальных реакций, протекающих в физиологических условиях [Medinas D.B. et al., 2009]. В связи с этим представляло интерес исследовать сопровождающиеся ХЛ свободно-радикальные процессы в водных растворах бикарбонатов, активированных введением в них Н202.

Как показано в Подразделе 3.3.1 в водных растворах бикарбонатов Na или К (1-5 мМ), к которым добавлена перекись Н202 (0,3-3 мМ), развиваются процессы с участием АФК, которые сопровождаются ЛМ-зависимой ХЛ даже без внесения в раствор Fe(II), хотя в присутствии Fe(II) интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ выше, чем в его отсутствие (рис. 9).

В отличие от быстро затухающей вспышки ХЛ, развивающейся в ответ на внесение в раствор бикарбоната реагента Ре(П)-ЛМ, в активированных Н202 растворах бикарбонатов, помещенных в герметично закрытые пробирки или запаянных в стеклянные ампулы, ЛМ-зависимая ХЛ не исчезает в течение многих месяцев и даже лет. На рисунке 10 представлена типичная многомесячная динамика излучения растворов натрия бикарбоната (5 мМ), находящихся в герметично

закрытых пробирках «Эппендорф» (1 мл), в которые 14 октября 2008 года внесли Н202 (1,5 мМ) и JIM (5 мкМ). Каждая точка на графике в течение первых двух месяцев - среднее значение, полученное при измерении пяти идентично приготовленных и хранившихся между измерениями в одинаковых условиях образцов. Стандартные отклонения для каждой точки варьировали в разные дни измерений от 5 до 16%, т.е. наблюдаемые на графике колебания активности в большинстве случаев высоко достоверны.

2008 г., 2009 г. 2010 г.

• 4 . - - • ' k V «

ЛМ-Fe Н202 * Fe Н202+ЛМ Н202*1!М-

Дата

Рисунок 9. ХЛ растворов №НС03 Рисунок 10. ЛМ-зависимая ХЛ 1 мл (5 мМ) после внесения в них Н202 раствора МаНС03 (5 мМ), Н202 (1,5 мМ) (3 мМ), Ре(П) (10 мкМ), ЛМ в герметично закрытых пробирках (10 мкМ) или разных комбинаций этих «Эппендорф». Приведены средние реагентов. значения излучения для 5-ти

параллельных проб.

Несмотря на тенденцию к снижению интенсивности ХЛ активированные Н202 растворы бикарбонатов сохраняют способность к ЛМ-зависимой ХЛ более полутора лет после их приготовления. Наиболее устойчивые и длительные сигналы ЛМ-зависимой ХЛ активированных растворов были получены при концентрации Н202 выше 0,15 мМ (оптимум концентрации в области 1,5-3 мМ), при концентрации бикарбонатов 5-10 мМ и ЛМ 5-10 мкМ. При концентрациях этих компонентов выше оптимальных ЛМ-зависимая ХЛ становится менее устойчивой.

В выше описанных экспериментах образцы между измерениями хранили в темноте, но для проведения измерений их было необходимо извлекать на свет и помещать в счетчик фотонов. Как описано в Подразделе 3.3.3, образцы при этом подвергались воздействию света и непроизвольно встряхивались. Чтобы исключить эти факторы, пробирку с излучающим раствором помещали в измерительную камеру счетчика одиночных фотонов «Биотоке 7», которую термостатировали при 21,5±0,1 °С с использованием водяного термостата и осуществляли непрерывную регистрацию ХЛ в течение нескольких недель. На рисунке 11 приведена типичная запись ЛМ-

зависимого излучения из 5 мМ активированного раствора КаНС03 за период с 02.02.09 по 07.02.09. Этот раствор активировали 3 мМ Н202 11 ноября 2008 г., а непрерывная регистрация излучения в счетчике была начата 26.01.09, т.е. приведенный на рисунке 11 график соответствует излучению, длящемуся уже более 2,5 месяцев. В течение нескольких дней тенденции к снижению интенсивности излучения не происходит, и оно варьирует с суточной ритмикой вблизи одной и той же средней величины.

Относительная стабильность интенсивности излучения резко нарушилась 9 февраля 2009 г. (рис. 12). 9.02.2009. В 17:34 начался резкий подъем интенсивности излучения, а в 19:38 на кривой наблюдался пик (врезка А на рис. 12). В этот день в Москве наблюдалось полное лунное затмение, которое началось в 17:37, а полное затмение наступило в 19:38. Таким образом, начато роста интенсивности излучения и острый пик излучения совпали с двумя ключевыми моментами затмения.

Рисунок 11. Непрерывная регистрация Рисунок 12. Продолжение регистрации

JIM-зависимой ХЛ 5 мМ раствора излучения из образца, приготовленного

NaHC03, активированного Н202 11.11.2008 г. в течение недели с 9 февраля

11.11.2008. Приведены данные по по 15 февраля 2009 г. Пояснения в тексте, излучению в течение 6 дней пребывания раствора в камере счетчика.

После затмения интенсивность излучения начала варьировать с характерным суточным ритмом на уровне, превышающем исходный в 2-3 раза. Через двое суток после начала затмения интенсивность излучения резко снизилась до значений, предшествовавших ему, а через 3 суток после затмения интенсивность излучения вновь возросла более чем в 2 раза, но вскоре упала до начального уровня. Интересно отметить, что на нисходящих ветвях излучения вновь наблюдались пики повышения его интенсивности, отстоящие друг от друга почти точно на 24 часа (врезки В и С).

После того, как интенсивность излучения вышла на уровень, предшествующий затмению, еще в течение нескольких дней наблюдались вспышки излучения, которых не было ни в период, предшествующий затмению, ни в последующие недели. Следует

отметить, что счетчик с ооразцом в это время не подвергался никаким механическим воздействиям.

В Подразделе 3.3.4, показано влияние гидратированных фуллеренов в малых, сверхмалых и «мнимых» концентрациях на ХЛ активированных растворов МаНС03. На рисунке 13 представлена динамика ЛМ-зависимой ХЛ 5 мМ растворов N81-1003, активированных Н202 7 октября 2008 г., в которые внесли НуРп до конечных концентраций 10'12 - 10"9 М. В первые дни после приготовления образцов НуРп в концентрациях 10"" -10"9 М либо не влияли, либо снижали интенсивность излучения из

активированных растворов ЫаНСОз, тогда как в присутствии 10" интенсивность излучения с самого начала была выше, чем в контроле.

20000

12000

М HyFn

7.10 14.10 21.10 28.10 4.11 11.11 1&11 Дата

Рисунок 13. Влияние HyFn на интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ из 5 мМ растворов NaHC03, активированных Н202 (1,5 мМ). К - контроль (без HyFn). 1 - 10"9 М, 2 - Ю"10 М, 3 - 10"и М, 4 - 10"12 М HyFn в образцах. Представлены средние значения для 3-х параллельных образцов (стандартное отклонение от среднего — не выше 10%).

Гндрятированкый фуллерен [NyFn], 1з{М)

Рисунок 14. Влияние сверхмалых и «мнимых» концентраций НуРп на интенсивность ЛМ-зависимого излучения из растворов ЫаНС03 (5 мМ), активированных Н202 (1,5 мМ). Данные приведены для 5-го дня после приготовления образцов. Представлены средние данные для 3-х параллельных проб.

На рисунке 14 видно, что в диапазоне концентраций HyFn Ю"20 - 10"9 М, зависимость доза-эффект носит немонотонный характер. Такая зависимость характерна для действия в разнообразных системах in vitro других биологически активных веществ в диапазоне сверхмалых и «мнимых» концентраций [Davenas Е. et al., 1988; Maltseva E.L. et al., 1998]. Как отмечалось выше, влияние гидратированных фуллеренов на протекающие в активированных растворах бикарбонатов процессы объясняются, вероятнее всего, изменением состояния водной среды, в которой протекают свободнорадикалькые реакции в растворах бикарбонатов.

В Подразделе 3.3.5. приводятся данные по влиянию различных апти- и про-оксидангов на протекающие в активированных растворах бикарбонатов процессы. Так, Fe(II) в диапазоне концентраций 1-100 мкМ. при внесении в растворы спустя несколько дней после запуска процесса, увеличивал в них интенсивность JTM-зависимой XJ1.

Рисунок 15. Влияние каталазы (20 ед./мл), тайрона (10'3 М) и пероксидазы (0,2 ед./мл) на ЛМ-зависимую ХЛ в активированных Н202 (1,5 мМ ) растворах NaHC03 (25 мМ) в присутствии ЛМ (5 мкМ).

Как видно на рисунке 15, пероксидаза хрена (0,2 ед./мл) усиливает ХЛ, каталаза в дозе 20 ед./мл через 3 минуты практически полностью ингибирует ХЛ, а тайрон (1 мМ) подавляет ее сразу. Полученные результаты подтверждают участие 02_* и П202 в длительной стабильной ЛМ-зависимой ХЛ в активированных растворах бикарбонатов.

Подраздел 3.3.6. Для выяснения вклада рН раствора и специфичности НС03_ в обеспечении длительной ХЛ активированных растворов бикарбонатов сравнили поведение деионизированной воды, рН которой доводили до разных значений с помощью NaOH или Ва(ОН)2, боратного и фосфатного буферов с разными значениями рН, в которые вносили Н202 (1,5 мМ), с поведением ЛМ-зависимой ХЛ активированного 5 мМ раствора NaHC03 при разных значениях рН.

Образцы помещали в пробирки, которые герметично закрывали и в течение 1 недели регистрировали ЛМ-зависимую ХЛ из них. Как видно из рисунка 16, после 7-дневной инкубации образцов с рН в диапазоне 8,8 - 9,2 излучение из раствора NaHC03 локально максимально. В щелочных водах длительная ХЛ отсутствует. Эти результаты указывают на важную роль НС03_ в длительной JIM-зависимой ХЛ растворов, активированных перекисью водорода. Интересно отметить, что в фосфатном буфере при щелочных значениях рН, в который также вносили Н202, тоже наблюдается длительная ХЛ, которая может быть связана с образованием пероксимонофосфата [LaButti J.N. and Gates K.S., 2009].

Bpew, секунды

Рисунок 16. рН-зависимость излучения из растворов: 1 -NaHC03 (5 мМ); 2 - боратный буфер (5 мМ); 3 - фосфатный буфер (5 мМ); 4 деионизированная вода с NaOH; 5 - деионизированная вода с Ва(ОН)2. Через 7 суток после внесения Н202 (3 мМ) и люминола (5 мкМ). Представлены средние значения для 5-ти параллельных образцов

(стандартное отклонение от среднего - не выше 10%).

В Подразделе 3.4. представлены результаты, полученные при регистрации ХЛ активированных Н202 растворов бикарбонатов с использованием ЛЦ. ЛЦ представляет собой специфический ХЛ-зонд на супероксидные радикалы [Greenlee L. et al., 1962]. В присутствии ЛЦ в активированных растворах бикарбонатов наблюдается длительная ХЛ, но она затухает через 1-3 недели в зависимости от концентрации ЛЦ и Н202. В отличие от ЛМ, для которого наблюдался оптимум концентрации в диапазоне 5-10 мкМ, с увеличением концентрации ЛЦ от 1 до 50 мкМ как интенсивность ХЛ, так и ее длительность росла. Добавление ЛЦ в реакционную смесь на стадии затухания реакции сопровождалось повышением интенсивности ХЛ, т.е., в отличие от ЛМ, ЛЦ расходовался в реакционной системе. Внесение тайрона (0,25 мМ) в активированные растворы с ЛМ полностью устраняло ХЛ, тогда как при использовании ЛЦ тайрон снижал интенсивность ХЛ на 75-80%. ЛМ, в отличие от ЛЦ, является зондом на все виды АФК. Полученные результаты свидетельствуют о ключевой роли супероксид радикала в развитии ХЛ в активированных растворах.

Заключение.

Для спонтанной генерации ЛФК о водных растворах бикарбонатов, служащих моделью биологических жидкостей, в них должен присутствовать источник электронов, обеспечивающий постоянное образование ЛФК. Таким источником электронов может служить вода- Исследования последнего времени свидетельствуют, что в воде сосуществуют фазы динамически организованной низкоэнтропийной воды и гораздо менее организованной (объемной) воды [Huang С.К. et al., 2009]. Размеры устойчивых наноассоциатов организованной воды в растворах ряда веществ в малых и сверх-малых концентрациях достигают сотен нанометров [Ямсков И.А. и др., 1999; Рыжкина И.С. и др., 2009] и даже микрон [Lo S. Y., 2009 ]. Вода, смачивающая гидрофильные поверхности («пограничная вода»), обладает свойствами жидкого кристалла. Ширина этой зоны (фазы) может составлять десятки и сотни микрон [Zheng J.-M. et al., 2006]. Пограничная вода, а также вода стабильных наноассоциатов заряжена отрицательно, и разность потенциалов между организованной и объемной водой достигает многих десятков милливольт [Pollack G. and Clegg J., 2008]. Таким образом, одна из водных фаз является потенциальным донором электронов. В соответствии с одной из моделей структурной организации пограничной воды, объясняющей целый ряд ее необычных свойств, в ней присутствуют квазиполимерные структуры с общей формулой (H302)"n. [Pollack G., 2010]. По-видимому, в воде в отсутствие посторонних доноров и акцепторов электронов на границе между пограничной и объемной водой устанавливается динамическое равновесие: (Н302) п П ( Н20 + НО. + C'aq)

В водных растворах бикарбонатов это равновесие нарушается. НС03-/С032~ легко окисляются гидроксил радикалом НО* до карбонат-анион радикала (С03~»), Регенерация квазиполимерной воды тормозится, и появляется возможность

восстановления растворенного в воде кислорода до 02_У*/Н02*, которые регистрируются спиновой ловушкой — тайроном. При облучении пограничной квази-полимерной воды источниками видимого и РЖ-света возрастают ширина ее зоны и ее электрон-донорная емкость, что может объяснить усиление сигнала тайрона при освещении бикарбонатного раствора [Chai В. et al., 2009]. Стационарной уровень супероксидного радикала определяется как скоростью его синтеза, так и скоростью устранения в реакции дисмутации и при рекомбинации с

I «S««" Н20 ' »111

é -А fj Ч /

нсо,/со,

\ со>;нсо>

OUVHjO ~' COj'- .

\ Чч Aj--

.liyyjr >03Hiv

Схема i

j PCеыа í 1 схема I

карбонатными радикалами, при которой i / *• i

,,. „ ni! • О; КО * HÇO3\

регенерируются кароонаты IMazellier г. • ;

f i

if/

et al., 2002]. В ходе этих реакций ¡ ЛГ / ч____ <

i о2* -......—г:..................HUA].....¡0=<„ i j

образуются продукты в электронно-возбужденном состоянии, в частности,

синглетный кислород. Вспышку ХЛ в , ■ >__ .

1 ОН'+'О-,-*-ОН*--"'

бикарбонатных растворах при | у

добавлении Ре(П), можно лишь

I / ^.......

Icaer \vA

I AJ

он*- (ÇWj

Схема 2

частично объяснить появлением в растворе Н202. Гораздо быстрее Fe(IÍ) окисляется С03~» [Alvarez M.N. et al., 2007], и наличие вспышки излучения свидетельствует о спонтанной продукции этих радикалов в водных растворах бикарбонатов.

Появление длительной собственной и ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении в бикарбонатный раствор Н202 связано, по-видимому, с тем, что при реакции Н202 и НС03~ образуется пероксимонокарбонат (НООСОО-). При его разложении возникает богатый набор АФК: С03~*. НО», 02_»/Н02* и синглетный кислород ('02) [Lin J.-M. and Liu M., 2009]. Скорости протекания всех свободнорадикальных реакций в системе увеличиваются, что сопровождается увеличением интенсивности ХЛ, тогда как стационарные уровни АФК снижаются. Это отражается на уменьшении сигнала ЭПР тайрона. Протекающие в активированном водном растворе бикарбонатов реакции являются циклическими, т.е. расходования реагентов не происходит. Состояние водной среды небезразлично для устойчивого протекания этих сопряженных процессов, на что указывает влияние на интенсивность ХЛ HyFn в сверх-малых концентрациях, в которых они влияют на структурную организацию воды.

Выводы:

1. Показано что, в водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала.

2. При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Ре(Н) регистрируется вспышка ХЛ. Интенсивность ХЛ возрастает в присутствии люминола, максимальна при рН 8,6-9,0, снижается в присутствии каталазы и тайрона.

3. Активированные Н2О2 растворы бикарбонатов в присутствии люминола становятся длительными источниками ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии пероксидазы и железа (II) и подавляется в присутствии каталазы и тайрона.

4. Гидратированные фуллерены (НуБи) в концентрациях 100 нМ и выше снижают интенсивность вспышки Ре(П)-ЛМ-зависимой ХЛ в растворах бикарбонатов, в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ.

5. В диапазоне концентраций Ю"20 - 10"9 М НуБп повышают интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ растворов бикарбонатов, активированных Н202. Зависимость эффекта от дозы НуРп имеет полимодальный характер.

6. Предложена гипотеза, позволяющая объяснить полученные результаты с точки зрения участия водной среды как двухфазной системы в свободно-радикальных процессах, спонтанно протекающих в растворах бикарбонатов.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Воейков B.JI. До Минь Ха, Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Андриевский Г.В. Влияние гидратированных фуллеренов в суб-наномолярных концентрациях на окислительно-восстановительные реакции в водных средах и на активность ферментов. XII Международный Конгресс по биоэлектрографии. 5-7 июля 2008 г. Санкт-Петербург. Тезисы и труды Конгресса, с. 95-96.

2. Воейков B.JL, Виленская Н.Д., До Минь Ха, Малышенко С.И., Мухитова О.Г., Андриевский Г.В. Влияние гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на макроскопические флуктуации скоростей реакций в водных системах. IV Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: Тезисы докладов. 28-29 октября 2008 г. М:РУДН, 2008, с. 24-25

3. До Минь Ха, Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Яблонская О.И., Воейков B.JL, Андриевский Г.В. Влияние гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на щелочную фосфатазу и пероксидазу in vitro. IV Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: Тезисы докладов. 28-29 октября 2008 г. М:РУДН, 2008, с. 34-35.

4. Воейков В.Л., До Минь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И. Активированные перекисью водорода водные растворы бикарбонатов -длительный источник сверх-слабого излучения и чувствительная тест-система для физических и химических факторов крайне низкой интенсивности. Материалы Международной научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы обеспечения спорта высших достижений». Минск, 810 апреля 2009 г. Минск: БГУФК, 2009, с. 178-180.

5. Воейков В.Л., До Минь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И. Водный раствор бикарбоната - модель биологических жидкостей, служащих источниками биофотонного излучения. Труды X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» 23-26 июня 2009 г. Москва. Издательский дом МЭИ. 2009, с. 406-409.

6. Воейков В.Л., До Мннь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И. Влияние сверхмалых доз гидратированных фуллеренов и лизатов крови на сверх-слабое излучение водных растворов бикарбонатов. Труды X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» 23-26 июня 2009 г. Москва. Издательский дом МЭИ. 2009, с. 410-413.

7. Воейков В.Л., До Минь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И. Активированный раствор бикарбонатов - стабильный источник сверхслабого излучения и детектор сверх-слабых воздействий. Тезисы V Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург, 29.06.2009-03.07.2009, с. 46.

8. Воейков В.Л., До Минь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Богачук A.C. Устойчиво неравновесное состояние водных растворов бикарбонатов. Proceedings of XIII International Congress on GDV Bioelectrography "Science. Information. Spirit." St. Petersburg. July 4-5, 2009. St. Petersburg, c. 72-76

9. Воейков BJI., До Мннь Ха, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Богачук A.C. Устойчиво неравновесное состояние и чувствительность к сверхслабым факторам внешней среды бикарбонатных вод и их роль в биосфере.VIII

Международная крымская конференция «Космос и биосфера». Судак, Крым, Украина, 28 сентября-3 октября 2009, с. 10-11.

10. Voeikov V.L., Do Minh На, Mukhitova О. G., Vilenskaya N. D., Malishenko S. I. Bicarbonate Aqueous Solutions Activated with Hydrogen Peroxide - Long-term Sources of Low-level Photon Emission and Test Systems for the Effects of Ultra-weak Intensity Physical and Chemical Factors. Progress In Electromagnetics Research Symposium Abstracts, Moscow, Russia, August 18-21,2009, p. 1024.

11. Voeikov V.L., Do Minh Ha, Mukhitova O.G., Vilenskaya N.D., Malishenko S.I. & Bogachuk A.S. Activated bicarbonate solutions as models of confined ontic open system and prototypes of living respiring systems. Int. J. of Design & Nature and Ecodynamics. 2010, Vol. 5, No. 1, pp. 30-38

12. Воейков В.Л., До Минь Xa, Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Буравдева Е.В. Бикарбонатные водные растворы находятся в устойчиво неравновесном состоянии и реагируют на космические события. Материалы Международного научного Конгресса «Наука - информация - сознание» (Биоэлектрография). Санкт-Петербург, 3-4 июля 2010 г, с. 279-281.

13.Воейков В.Л., Буравлева Е.В., Виленская Н.Д., До Минь Ха, Малышенко С.И. Редокс-активность карбонатных водных систем: роль в биологических процессах. «Биоантиоксидант»: Тезисы докладов VIII Международной конференции. Москва, 4-6- октября 2010 г. М..-РУДН, 2010, с. 85-87.

14. Voeikov V.L., Do Minh На, Vilenskaya N.D., Malishenko S.I., Bouravlcva E.V. Bicarbonate aqueous systems exhibit sustained non-equilibrium state and display sensitivity to cosmic events. La Medicina Biologica, 2010 Ottobre-Dicembre № 4, pp. 45-53.

15. До Минь Xa, Мухитова О.Г., Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Воейков В.Л. Активированные перекисью водорода водные растворы бикарбонатов -долговременные источники низкоинтенсивного излучения, реагирующие на слабые и сверх-слабыс воздействия. Биомедицинская радиоэлектроника. 2011 №2, с. 28-38.

Подписано в печать:

12.05.2011

Заказ № 5511 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, До Минь Ха

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль углекислоты. б

1.1.1. Структурная и регуляторная роль углекислоты в живых 6 системах.

1.1.2. Механизмы действия углекислоты на биологические процессы.

1.2. Активные формы кислорода.

1.2.1. Биорегуляторная роль активных форм кислорода.

1.2.2. Активные формы кислорода и углекислота.

1.2.3. Роль АФК в биоэнергетических процессах.

1.2.4. Структурные особенности водных систем и участие воды в 28 свободно-радикальных процессах.

1.3. Гидратированые фуллерены - структуризаторы воды и 33 катализаторы окислительно-восстановительных процессов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Оборудование и реактивы.

2.2. Методы.

2.2.1. Приготовление растворов:

2.2.2. Регистрация физико-химических свойств растворов.

2.2.2.1. Измерение рН.

2.2.2.2. Метод электронного парамагнитного резонанса.

2.2.2.3. Метод хемилюминесценции ^

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Генерация супероксидных радикалов в водных растворах бикарбонатов.

3.1.1. Регистрация сигналов ЭПР спиновой ловушки - тайрона в растворах бикарбоната натрия.

3.1.2.Характеристика сигналов ЭПР спиновой ловушки — тайрона, активированных перекисью водорода растворов бикарбоната, натрия ^

3.2. Хемилюминесценция растворов бикарбонатов.

3.2.1. Возникновение вспышек хемипюминесценции растворов бикарбонатов при добавлении солей двухвалентного железа в 54 отсутствие или в присутствии люминола.

3.2.2. Зависимость сигнала Ее(Н)-ЛМ хемипюминесценции растворов бикарбоната от рН.

3.2.3. Влияние гидратированных фуллеренов (С6о)(Н20)п на индуцированную Ре(П)-ЛМхемилюминесценцию растворов бикарбоната.

3.2.4. Влияние тайрона и каталазы на индуцированную Ре(11)-ЛМ и Кз[Ре(СИ)б]-ЛМхемилюминесценцию растворов бикарбоната.

3.3. Люминол-зависимая хемилюминесценция растворов бикарбонатов, активированных перекисью водорода.

3.3.1. Выявление длительных сигналов хемилюминесценции в присутствии люминола активированных перекисью водорода 68 растворов бикарбоната натрия.

3.3.2. Зависимость интенсивности и стабильности излучения активированных перекисью водорода растворов бикарбоната натрия 72 от концентрации компонентов систем.

3.3.3. ЛМ-зависимая ХЛ активированных перекисью водорода растворов бикарбонатов, изолированных от света и действия 74 механических факторов. Вариации ХЛ в период лунного затмения.

3.3.4. Влияние НуРп в малых и сверхмалых дозах на ЛМ-зависимую ХЛ, активированных Н2О2 растворов бикарбоната натрия.

3.3.5. Влияние антиоксидантов и прооксидантов на ЛМ-зависимую

ХЛ активированных перекисью водорода растворов бикарбонатов.

3.3.6. Зависимость ЛМ-зависимой ХЛ активированных перекисью водорода растворов бикарбоната натрия от рН. 81 3.4. Люцигенин-зависимая хемилюминесценция растворов бикарбонатов, активированных перекисью водорода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Устойчивые свободно-радикальные реакции в водных растворах бикарбонатов"

Актуальность проблемы:

Углекислый газ и образующиеся при реакции С02 с водой угольная кислота, бикарбонаты и карбонаты, которые в совокупности именуются углекислотой, присутствуют в разных соотношениях практически во всех природных водных системах. Все биологические жидкости, включая цитоплазму живых клеток и внеклеточные среды, являются бикарбонатными водными системами. Углекислота, образующаяся в организме при окислении органических соединений, играет важную роль в регуляции разнообразных биологических процессов. Так, при дефиците в организме углекислоты, подавляется дыхание как на уровне целого организма [Haldane, 1927; Henderson Y., 1938; Агаджанян H.А. и др., 1995], так и на клеточном уровне [Bicz W., 1960; Palet A. et al., 1991]. Углекислота влияет на активность многих ферментов, экспрессию генов, систему кровообращения, иммунные реакции [Коган А.Х. и др., 2006]. Биологические эффекты углекислоты столь многообразны, что представителей семейства углекислоты можно считать универсальными регуляторами метаболизма.

Механизмы действия углекислоты на клеточном и молекулярном уровнях изучены в настоящее время недостаточно. Углекислота играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного баланса в биологических системах, но механизм ее действия не сводится только к этому фактору. Лишь в последнее время стали появляться работы, свидетельствующие о существенном влиянии углекислоты, в частности, бикарбоната на процессы с участием активных форм кислорода (АФК). Коганом А.Х. с соавт. [1995] было обнаружено, что углекислота служит универсальным регулятором свободнорадикального гомеостаза клеток и тканей у живых организмов. Она влияет на активность супероксиддисмутаз, ксантиноксидазы и других ферментов, участвующих в процессах обмена АФК [Fridovich I. et al., 1976, 2004], на неферментативные окислительные процессы, протекающие в водных системах in vitro и in vivo [Médinas D.B. et al., 2007]. Влияние представителей семейства углекислоты на свободнорадикальные процессы обусловлено тем, что они реагируют с АФК и превращаются в относительно долгоживущие и селективно действующие на свои мишени карбонатные радикалы и пероксикарбонаты [Augusto О. et al., 2002]. Появляется все больше доказательств того, что как АФК, так и свободнорадикальные реакции с их участием служат универсальными регуляторами процессов жизнедеятельности на разных уровнях организации живых систем, а патогенное действие АФК связано с нарушениями регуляции их обмена [Ramasarma Т., 1990; Thannickal V.J. and Fanburg B.L., 2000; Droge W., 2002; Voeikov V.L., 2001, 2007]. Поэтому изучение модулирующей роли углекислоты в действии АФК весьма актуально.

Каждая форма углекислоты имеет свои физико-химические свойства, и одним из важных факторов, обеспечивающих многообразие биологических эффектов, служит изменение их соотношения за счет изменения pH водной среды. Однако вода может и непосредственно участвовать в реализации модулирующего действия углекислоты на процессы с участием АФК. В' настоящее время появились как экспериментальные [Pollack G., 2003-2010], так и теоретические [Del Giudice Е. and Preparata G., 1995] обоснования возможности расщепления воды на радикалы в мягких условиях, что должно сопровождаться развитием в ней окислительно-восстановительных процессов. Действительно, при действии на воду факторов весьма низкой интенсивности (звук, механическое перемешивание воды, замораживание-оттаивание, воздействие низкочастотными электромагнитными полями) вода служит источником АФК [Домрачев и др., 1992; Воейков B.JI. и др. 1996; Ikeda S. et al., 1999; Брусков В.И. и др. 2001; Wentworth P., Jr. et al., 2001; Belovolova L. V. et al., 2009]. Учитывая чрезвычайно важную роль, которую играет углекислота как в биологических, так и в других природных водных системах, изучение реакций с участием АФК в водных. растворах бикарбонатов может открыть дополнительные возможности для понимания механизмов влияния углекислоты на широкий спектр биологических процессов, что позволит эффективно управлять ими.

Цель данной работы заключалась в исследовании свойств и динамики свободнорадикальных реакций, непрерывно протекающих в водных растворах бикарбонатов, а также влияния разных физико-химических факторов на эти реакции.

Основными задачами исследования являлись:

Выявление присутствия супероксидных радикалов в растворах бикарбонатов с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спинового зонда тайрона (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты) и изучение зависимости сигнала ЭПР от концентрации бикарбонатов, pH, влияния физических (освещение) и химических факторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

В водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала, стационарный уровень которого возрастает с увеличением концентрации бикарбоната от 5 до 100 мМ. Интенсивность сигнала тайрона (ЭПР-зонда на супероксидный радикал) возрастает при освещении раствора белым и синим (А,=455 нм) светом и максимальна при рН около 9,0. Сигнал отсутствует в дистиллированной воде и в растворах Ва(ОН)2 в этом диапазоне рН, что свидетельствует о специфической роли бикарбоната в продукции супероксидного радикала в воде.

При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Ре(Н) или К3[Ре(СЫ)6] в микромолярных концентрациях регистрируется вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии люминесцентного зонда на АФК - ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна при значениях рН водных растворов 8,8-9,0. Интенсивность ХЛ снижается в присутствии тайрона - ловушки супероксидных радикалов и при добавлении катапазы, что свидетельствует о продукции супер оксидного радикала и перекиси водорода в водных растворах бикарбонатов.

При внесении в водные растворы бикарбонатов Н202 в субмиллимолярных концентрациях в присутствии ЛМ они становятся длительными источниками ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев. Интенсивность ХЛ возрастает при внесении в реакционные смеси Ре804 в микромолярных концентрациях или пероксидазы и подавляется в присутствии каталазы и тайрона, что свидетельствует об участии Н2Ог и супероксидного радикала в процессах, сопровождающихся ХЛ. В присутствии ЛЦ интенсивность ХЛ ниже, чем в присутствии ЛМ, и она затухает быстрее, но ее интенсивность вновь возрастает при повторном внесении ЛЦ в «затухший» раствор.

Гидратированные фуллерены (НуБп) в концентрациях выше 10 нМ снижают интенсивность вспышки ХЛ, индуцированной внесением Ре(П) в водные растворы бикарбонатов, а в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ. В водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, НуБп в диапазоне концентраций 10"п - Ю'20 М повышали интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ. При этом зависимость эффекта от дозы НуБп имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в области сверхмалых доз (10~16 - 10"15 М) и "мнимых" концентраций (<10"19 М).

Предложена гипотеза, позволяющая объяснить большинство полученных результатов с учетом особой роли водной среды в осуществлении незатухающих свободно-радикальных реакций в растворах бикарбонатов. Вода рассматривается, как двухфазная система, в которой одна из фаз может служить донором электронов.

Научная новизна исследования:

Впервые обнаружено спонтанное образование супероксид радикала в водных растворах бикарбонатов, зависящее от концентрации бикарбоната и усиливающееся при освещении.

Впервые обнаружено, что при внесении в водные растворы бикарбонатов солей двухвалентного железа развивается вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна в районе рН 8,8-9,0, что совпадает с максимумом сигнала ЭПР для водных растворов бикарбонатов.

Впервые показано, что ЛМ в микромолярных концентрациях может выступать в роли усилителя ХЛ в течение чрезвычайно длительного времени (месяцы и годы), что свидетельствует о существовании механизма усиления им интенсивности излучения, сопровождающего свободно-радикальные реакции, который отличается от общепринятого.

Теоретическая и практическая значимость исследования:

Теоретическая значимость работы определяется тем, что она вносит определенный вклад в понимание механизмов участия углекислоты в биологических и других природных процессах, что даст возможность целенаправленно влиять на них.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", До Минь Ха

ВЫВОДЫ:

1. Показано что, в водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидпого радикала.

2. При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Ре(П) регистрируется вспышка ХЛ. Интенсивность ХЛ возрастает в присутствии люминола, максимальна при рН 8,6-9,0, снижается в присутствии каталазы и тайрона.

4. Гидрагированные фуллерены (НуРп) в концентрациях 100 нМ и выше снижают интенсивность вспышки Ре(П)-ЛМ-зависимой ХЛ в растворах бикарбонатов, в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ.

5. В диапазоне концентраций Ю~20 - 10~9 М НуРп повышают интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ растворов бикарбонатов, активированных Н2О2. Зависимость эффекта от дозы НуРп имеет полимодальный характер.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Хорошо известно, что в химических реакциях с участием активных форм кислорода, в частности, свободных радикалов и пероксидов, продуцируется энергия электронного возбуждения, эквивалентная энергии фотонов в видимой и даже УФ-области спектра [Уое1коу, 2001]. Если в такие реакционные системы, в которых происходит рекомбинация свободных радикалов или разложение мало устойчивых промежуточных соединений пероксидной природы, вводят люминесцентные (флуоресцентные) или хемилюминесцентные зонды, генерируемая энергия высвечивается в форме слабого или сверх-слабого излучения. Однако обычно излучение быстро угасает за счет исчерпания реагентов и/или разложения введенных люминесцентных зондов. Поведение водных растворов бикарбонатов, в которые в довольно низкой концентрации вводят Н202, оказалось неожиданным. Н202 инициирует в водных растворах бикарбонатов процесс, который сопровождается ЛМ-зависимой ХЛ в течение многих месяцев в полной темноте и в условиях, в которых обмен веществом (например, кислородом и другими газами) со средой исключен. При определенных условиях интенсивность люминесценции после внесения в бикарбонатные растворы перекиси водорода и люминола начинает возрастать, и рост продолжается в течение нескольких дней, а затем интенсивность излучения в течение длительных периодов времени относительно постоянна.

Согласно принятой в настоящее время модели хемилюминесценции люминола, в присутствии окислителей в щелочном растворе это вещество окисляется радикалом или окисленной формой металла переменной валентности, превращаясь в оксильный радикал. Далее оксильный радикал люминола при взаимодействии, например, с супероксид радикалом превращается в крайне неустойчивый эндопероксид, который затем превращается в электронно-возбужденный аминофталат с выделением Ы2. Переход аминофталата из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением фотона [Владимиров, Проскурина, 2009]. Таким образом, в присутствии оксидантов и АФК люминол должен достаточно быстро разложиться, а люминесценция исчезнуть. Чрезвычайно длительная ЛМ-зависимая ХЛ активированных перекисью водорода растворов бикарбонатов не укладывается в эту схему. Однако, в литературе имеются и другие наблюдения, которые ей противоречат. Так, еще в работах 1930х - 1940х гг. сообщалось, что в щелочных растворах с перекисью водорода люминол может реагировать с АФК и другими радикалами с образованием аминофталата и азота как побочных продуктов и восстановлением люминол а через промежуточные продукты (цит. по [Рид, I960]). Недавно появились сообщения об открытии явления «пост-хемилюминесценции» — появлении вспышки излучения при введении доноров электронов (восстановителей) в раствор перманганата или феррицианида калия и люминола после того, как, согласно общепринятой схеме, оба реагента должны исчерпаться [Feng, et al., 2005]. Таким образом, до сих пор детальный механизм усиленного люминолом излучения из целого ряда водных систем остается до конца не выясненным [Li, et al., 2008]. Так или иначе, люминол представляет собой очень чувствительный зонд на протекающие в реакционной системе процессы с участием АФК и других свободных радикалов, в ходе которых генерируется энергия электронного возбуждения.

В отличие от ЛМ-зависимой ХЛ ЛЦ-зависимая ХЛ через 2-3 недели после активации растворов затухала. Однако это было обусловлено не тем, что растворы теряли активность, а, по-видимому, тем, что люцигенин в этой активной среде утилизировался, поскольку после добавления новой порции ЛЦ интенсивность излучения вновь возрастала до исходного и даже до более высокого уровня, чем сразу после активации раствора бикарбоната.

Чрезвычайно длительная люминесценция исследованных в настоящей работе активированных растворов бикарбонатов после добавления в них люминола свидетельствует, что в них постоянно происходят процессы генерации АФК и других видов радикалов карбоната. Для этого, для спонтанной генерации АФК в водных растворах бикарбонатов, служащих моделью биологических жидкостей, в них должен присутствовать источник электронов, обеспечивающий постоянное образование АФК. Таким источником электронов может служить вода.

Исследования последнего времени свидетельствуют, что в воде сосуществуют фазы динамически организованной низкоэнтропийной воды и гораздо менее организованной (объемной) воды [Huang С.К. et al., 2009]. Размеры устойчивых наноассоциатов организованной воды в растворах ряда веществ в малых и сверхмалых концентрациях достигают сотен нанометров [Ямсков И.А. и др., 1999; Рыжкина И.С. и др., 2009] и даже микрон [Lo S. Y., 2009 ]. Вода, смачивающая гидрофильные поверхности («пограничная вода»), обладает свойствами жидкого кристалла. Ширина этой зоны (фазы) может составлять десятки и сотни микрон [Zheng J.-M. et al., 2006]. Пограничная вода, а также вода стабильных наноассоциатов заряжена отрицательно, и разность потенциалов между организованной и объемной водой достигает многих десятков милливольт [Pollack G. and Clegg J., 2008]. Таким образом, одна из водных фаз является потенциальным донором электронов.

Количество:

Водорода х 6 = 3

Кислорода \ ]/ъ \ х 6 = 2

Заряд:

Водорода 3 х (+1) = +3 Кислорода 2 х (-2) = -4

Заряд одного кольца = -1

Рисунок 35. Квази-полимерные лёдо-подобные структуры пограничной воды по G. Pollack (2010). Красным цветом обозначен атом кислорода, синим - атом водорода.

В соответствии с одной из моделей структурной организации пограничной воды, объясняющей целый ряд ее необычных свойств, в ней присутствуют квазиполимерные структуры с общей формулой (Нз02)"п- [Pollack G., 2010]. Согласно этой модели, в воде в отсутствие посторонних доноров и акцепторов электронов на границе между пограничной и объемной водой устанавливается динамическое равновесие:

H302)-n п ( Н20 + НО® + e"aq)

В водных растворах бикарбонатов это равновесие может нарушаться. НС0з~/С0з2 легко окисляются гидроксил радикалом НО» до карбонат-анион радикала (СОз-«) (см. Обзор литературы). Регенерация квази-полимерной воды тормозится, и появляется возможность восстановления растворенного в воде кислорода до 02-*/Н02», которые регистрируются спиновой ловушкой — тайроном. При облучении пограничной квази-полимерной воды источниками видимого и ИК-света возрастают ширина ее зоны и ее электрон-донорная емкость, что может объяснить усиление сигнала тайрона при освещении бикарбонатного раствора [Chai В. et al., 2009]. Стационарной уровень супероксидного радикала определяется как скоростью его синтеза, так и скоростью устранения в реакции дисмутации и при рекомбинации с карбонатными радикалами, при которой регенерируются карбонаты [Mazellier P. et al., 2002].

В ходе этих реакций образуются продукты в электронно-возбужденном состоянии, в частности, синглетный кислород. Вспышку XJI в бикарбонатных растворах при добавлении Fe(II), можно лишь частично объяснить появлением в растворе Н2О2. Гораздо быстрее Fe(II) окисляется С03~* [Alvarez M.N. et al., 2007], и наличие вспышки излучения свидетельствует о спонтанной продукции этих радикалов в водных растворах бикарбонатов (Схема 1).

Появление длительной ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении Н202 в растворы бикарбонатов связано, по-видимому, с тем, что при реакции Н202 и НС03~ образуется пероксимонокарбонат (НООСОО-) (Схема 2). При его разложении возникает богатый набор АФК: С03~*, НО«, 02~*/Н02* и синглетный кислород (!02) [Lin, Liu, 2009]. Скорости протекания всех свободно-радикальных реакций в системе увеличиваются, что сопровождается увеличением интенсивности ХЛ, тогда как стационарные уровни АФК снижаются. Это видно по уменьшению сигнала ЭПР спиновой ловушки тайрона. Протекающие в активированном водном растворе бикарбонатов реакции являются циклическими, т.е. расходования реагентов не происходит.

Н302)

Н20 + |ОН*|+ е" схема 2 о2

0,7Н07*

Ьу-* ч С0327НС03

СО продукты1* Ь\

Схема 1 схема 1 4

ОН"+ 'о2 + но *

НСОз

1 : о2 2Н + еу

ОНГ + т

Схема 2

Состояние водной среды небезразлично для устойчивого протекания этих сопряженных процессов, на что указывает влияние на интенсивность XJI HyFn в сверх-малых концентрациях, в которых они влияют на структурную организацию воды.

Таким образом, водный раствор бикарбонатов представляет собой активную среду, пребывающую в устойчиво неравновесном состоянии в течение чрезвычайно длительного времени. Поддержание такого состояния требует постоянного притока энергии извне. Поскольку облучение организованной воды ИК-светом в области 2-3 мкм существенно повышает ее электрон-донорную емкость [Chai В. et al., 2009], источником энергии может служить тепловая энергия и энергия внешних низкочастотных электромагнитных полей. В растворах бикарбонатов разность электрических потенциалов между организованной и объемной водой преобразуется в энергию свободно-радикальных реакций. Таким образом, растворы бикарбонатов исполняют роль «повышающих трансформаторов», преобразуя энергию низкой плотности в энергию высокой плотности — энергию электронного возбуждения. Поскольку все биологические жидкости представляют собой растворы бикарбонатов, в первую очередь, кровь, описанные выше процессы должны, по-видимому, играть важную роль в метаболизме живых организмов. А именно, в дополнение к различным молекулярным механизмам биологического действия представителей семейства углекислоты, их способность катализировать и участвовать в свободно-радикальных процессах ( окислении воды ) может играть фундаментальную роль в биоэнергетическом обеспечении процессов жизнедеятельности, а также в поддержании живой материи в устойчиво возбужденном состоянии, обеспечивающем его чрезвычайно высокую чувствительность к действию на живые системы химических и физических факторов низкой и сверх-низкой интенсивности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, До Минь Ха, Москва

1. Агаджанян H.A., Степанов О.Г., Архипенко Ю.В. Дыхательные газы и функциональное состояние пищеварительной системы. Москва-Краснодар, 2002.- 191 с.

2. Блюменфельд JI. А. Воеводский В.В., Семенов А.Г. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии. Новосибирск: СО АН СССР, 1962. - 300 с.

3. Брусков В.И., Масалимов Ж.К., Черников A.B. Образование активных форм кислорода в воде под действием тепла. // Доклады академии наук, 2002. Т.384. № 6. С.821-824.

4. Бурлаков А., Бурлакова О., Голиченков В. Дистантные волновые взаимодействия в раннем эмбриогенезе вьюна. // Онтогенез, 2000. Т.31. №5. С.343-349.

5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

6. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. // Успехи биологической химии, 2009. Т.49. Р.341-388.

7. Воейков B.JI. Ключевая роль устойчиво неравновесного состояния водных систем в биоэнергетике. // Российский химический журнал. (Журнал РХО им. Д.И. Менделеева), 2009. T.LIII. №6. С.41-49.

8. Воейков B.JL, Баскаков И.В., Кафкифлис К., Налетов В.И. Инициация вырожденно-разветвленной цепной реакции дезаминирования глицина сверхслабым ультрафиолетом или перекисью водорода. // Биоорганическая химия. 1996. Т.22. С.39-47.

9. П.Гулый М.Ф. О некоторых проблемах биохимии. Киев: Наукова думка, 1997. С.38-39.

10. Гулый М.Ф., Мельничук Д.А. Роль углекислоты в регуляции обмена веществ у гетеротрофных организмов. Киев: Наукова думка, 1978. -243 с.

11. Гурвич А.Г., Гурвич Л.Д. Митогенетическое излучение, физико-химические основы и приложения в биологии и медицине. М.: Медгиз, 1945. - 283 с.

12. Домрачев Г.А., Ролдыгин Г.л', Селивановский Д.А. Роль звука и жидкой воды как динамически нестабильной полимерной системы в механохимически активированном процессе производства кислорода // Ж. Физ. Хим., 1992. Т.66. С.851 -855'

13. Журавлев А. И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей. // В кн.: Биохемилюминесценция. М.: Наука, 1983. С.3-30.

14. Коган А.Х., Грачев C.B., Елисеева C.B. Модулирующая роль С02 в действии активных форм кислорода. М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2006. 224 с.

15. Куликов В.П., Беспалова А.Г., Якушев H.H. Состояние мозговой гемодинамики при долговременной адаптации к гиперкапнической гипоксии. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2008. №2. С.191-197.

16. Лукьянова Л.Д. Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислород-зависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М.: Наука, 1982. С. 172173.

17. Мельничук Д.А. Механизмы образования и биологическое значение карбаматов белков // Укр. биохим. жури., 1985. Т.57. №3. С.98-115.

18. Мельничук Д.А., Силонова Н.В., Шевченко М.И. Влияние различных концентраций НСОЗ— и двуокиси углерода на активность некоторых ферментов. //Укр. биохим. журн., 1980. Т.52. №2. С.150-154.

19. Методические указания к лабораторным работам по курсу: Физические методы исследований в физико-химической биологии. Электронный парамагнитный резонанс в биологии. М.: МФТИ, 2005 г. 23 с.

20. Практикум по биофизике. (Под ред. А. Б. Рубина, И. И. Иванова). М.: Изд. МГУ, 1984 г. С.156-170.

21. Рид Д. Возбужденные электронные состояния в химии и биологии. М: Изд-во иностр. литературы, 1960. С. 165-170.

22. Рощупкин Д.И., Белакина Н.С., Мурина А.А. Усиленная люминолом хемилюминесценция полиморфноядерных лейкоцитов кролика: природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола. // Биофизика, 2006. Т.51. С.99-107.

23. Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Киселева Ю.В., Коновалов А.И. Свойства супрамолекулярных наноассоциатов, образующихся в водных растворах низких и сверхнизких концентраций биологически активных веществ. // Доклады РАН, 2009. Т.428. №4. С.487-491.

24. Свиряева И.В., Рууге Э.К. Генерация свободных радикалов кислорода в митохондриях сердца: Эффект гипоксии-реоксигенации. // Биофизика, 2006. Т.51. №3. С.478-484.

25. Сент-Дьерди А. Биоэнергетика. М.: ОГИЗ, Гос. изд-во физико-математической литературы, 1960. 155 с.

26. Степанов А.Н. Дыхательные гимнастики по методам Бутейко, Стрельниковой, Фролова и других авторов. М.:Вектор, 2005. -160 с.

27. Таубе П.Р., Баранова А.Г. Химия и микробиология воды. М.: Высшая школа, 1983. С.98-104.

28. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М., Захаров И.В. Вичутинский А.А., Цепалов В.Ф. Хемилюминсцентные методы исследования медленных химических процессов. М.: Наука, 1966. 300 с.

29. Albrect-Buehler G. Changes of cell behavior by near-infrared signals. // Cell Motil Cytoskeleton, 1995, V.32. №4. P.299-304.

30. Ashkanian M, Borghammer P, Gjedde A, Ostergaard L, Vafaee M. Improvement of brain tissue oxygenation by inhalation of carbogen. Neuroscience, 2008. V.156. №4. P.932-938.

31. Augusto O., Bonini M.G., Amanso A.M., Linares E., Santos C.C., De Menezes S.L. Nitrogen dioxide and carbonate radical anion: two emerging radicals in biology. // Free Radic. Biol. Med., 2002. V.32. P.841-859.

32. Augusto O., Vaz S.M. EPR spin-trapping of protein radicals to investigate biological oxidative mechanisms. // Amino Acids, 2007. V.32. P.535-542.

33. Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., Marshall P.A., and Freeman B.A. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. V.87.P.1620- 1624.

34. Beckman K.B., Ames B.N. The Free Radical Theory of Aging Matures. // Phys. Rev., 1998. V.78 P.547-581.

35. Bohr C., Hasselbalch K.A., Krogh A.S. Ueber einen in biologischer beziehung wichtigen einfluss, den die kohlensäurespannung des blutes auf dessen sauerstoffbindung übt. // Skand. Arch. Physiol., 1904. V.16. P.402-412.

36. Bonini M.G., Miyamoto S., Di Mascio P., and Augusto O. Production of the carbonate radical anion during xanthine oxidase turnover in the presence of bicarbonate. //J. Biol. Chem., 2004. V.279. P.51836 -51843.

37. Bonini M.G., Radi R., Ferrer-Sueta G., Ferreira A.M., and Augusto O. Direct EPR detection of the carbonate radical anion produced from peroxynitrite and carbon dioxide. // J. Biol. Chem., 1999. V.274. P.10802 10806.

38. Boveris A., Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. // Biochem J., 1973. V.134. P.707-716.

39. Chen H., Lin L., Lin Z., Guo G., Lin J.M. Chemiluminescence arising from the decomposition of peroxymonocarbonate and enhanced by CdTe quantum dots. // J. Phys. Chem. A., 2010 V.l 14. №37. P.10049-10058.

40. Chen S.N, Hoffman M.Z. Rate constants for the reaction of the carbonate radical with compounds of biochemical interest in neutral aqueous solution. // Radiat. Res., 1973. V.56. №1. P.40-47.

41. Cilento G. Photobiochemistry without light. // Experientia, 1988. V.44. P.572-576.

42. Cleland W.W, Andrews T.J, Gutteridge S, Hartman F.C, Lorimer G.H. Mechanism of Rubisco: The Carbamate as General Base. // Chem Rev., 1998. V.98. №2. P.549-562.

43. Cohen G., Heikkila R.E. The generation of hydrogen peroxide, superoxide radical, and hydroxyl radical by 6-hydroxydopamine, dialuric acid, and related cytotoxic agents. // J. Biol. Chem., 1974. V.249, №8. P.2447-2452.

44. Coteur G., Dubois P. Interaction of metals with peroxidase-mediated luminal enhanced chemiluminescence (PLmCL). // Luminescence, 2004. V.l9. P.283-286.

45. Curnutte J.T., Babior B.M. Chronic granulomatous disease. // Adv. Hum. Genet., 1987. V.16, P.229-297.

46. Datta D., Vaidehi N., Xu X., Goddard W.A. 3rd. // Proc"NaL Acad"Sci"USA., 2002. V.99. P.2636-2641.

47. D'Autreaux B., Toledano M.B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. // Nature Reviews. Molecular cell biology, 2007. V.8. №10. P.813-824.

48. Davenas E., Bauvais F., Amara J., c^ ^j. Human basophil degranulation triggered by very diluted antiserum against Ig E jj

49. Nature, 19gg y.333" P.267-272"59.de Brito-Ashurst I., Varagunam M., Raftery M.J., Yaqoob M.M. Bicarbonate supplementation slows progression of CKD and improves nutritional status. // J. Am. Soc. Nephrol.,' 2009. V.20. №9. P.2075-2084.

50. De Keulenaer G.W., Chappell D.C., Ishizaka N., et al. Oscillatory and steady laminar shear stress differentially affect human endothelial redox state—role of a superoxide-producing NADH oxidase. // Circ. Res., 1998. V.82. P.1094-1101.

51. Feng N., Lu J., He Y., Du J. Post-chemiluminescence behaviors of Ni2+, Mg2+, Cd2+, and Zn2+ in potassium ferricyanide-luminol reaction. // Luminescence, 2005. V.20. P.266-270.

52. Frank H.S., Wen W.-Y. Ion-solvent interaction. Structural aspects of ion-solvent interaction in aqueous solutions: a suggested picture of water structure. // Discuss. Faraday Soc., 1957. V.24. P. 133-140.

53. Galantsev V.P., Kovalenko S.G., Moltchanov A.A., Prutskov V.I. Lipid peroxidation, low-level chemiluminescence and regulation of secretion in the mammary gland. // Experientia, 1993. V.49. P.870-875.

54. Goto K. A study of the acidosis, blood urea, and plasma chlorides in uranium nephritis in the dog, and of the protective action of sodium bicarbonate. // J. Exp. Med., 1917. V.25. №5. P.693-719.

55. Greenlee L., Frivdovich I., Handler P. Chemiluminescence Induced by Operation of Iron-Flavoproteins. // Biochemistry, 1962. V.l. №5. P.779-783.

56. Haldane, J.S. Respiration. New Haven: Yale University Press, 1922. - 427 p.

57. Harvey T.C, Raichle M.E, Winterborn M.H, Jensen J., Lassen N.A., Richardson N.V., Bradwell A.R. Effect of carbon dioxide in acute mountain sickness: a rediscovery. // Lancet 2, 1988. V.8612. P.639-641.

58. Henderson. Y. Adventures in Respiration. Modes of Asphyxiation and Methods of Resuscitation. Baltimore: Williams & Wilkins, 1938. - 273 p.

59. Henderson. Y. Cyclopedia of Medicine. Philadelphia: F.A. Davis, (ed. by H.H. Young), 1940.-303 p.

60. Hendrson Y. et al. The treatment of pneumonia by inhalation of carbon dioxide. I. The relief of atelectasis. // Arch. Int. Med., 1929. V.45. P.72-91.

61. Hendrson Y. The prevention and treatment of asphyxia in the new-born. // J. Am. Med. Assoc., 1928. V.90. P.583-586.

62. Hodgson E.K. and Fridovich I. The mechanism of the activity-dependent luminescence of xanthine oxidase. // Arch. Biochem. Biophys., 1976. V.l72. P.202-205.

63. Huang C.K.T., Wikfeldtb T., Tokushimac et al. The inhomogeneous structure of water at ambient conditions. // Proc. Nat. Acad. Sci., 2009. V.l06. P. 15214-15218.

64. Kilmartin J.V, Rossi-Bernardi L., Inhibition of C02 Combination and Reduction of the Bohr Effect in Haemoglobin chemically modified at its a-Amino Groups. // Nature, 1969. V.222. P.1243-1246.

65. KIebanoff S.J., Foerder C.A., Eddy E.M., Shapiro B.M. Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of a peroxidatic mechanism. //J. Exp. Med., 1979. V.149. №4. P.938-953.

66. Krieger-Brauer H.I., Kather H. The stimulus-sensitive H202-generating system present in human fat-cell plasma membranes is multireceptor-linked and under antagonistic control by hormones and cytokines // Biochem. J., 1995. V.307. P.543-548.

67. Li B., Deng Q., Guo L., Zhang Z. Secondary chemiluminescence emission of the luminal ferricyanide system induced by reducing agents. // Microchim Acta., 2008. V.162. P.189-198.

68. Lin J. M., Liu M. Singlet oxygen generated from the decomposition of peroxymonocarbonate and its observation with chemiluminescence method. // Spectrochimica Acta. Part A, 2009. V.72. P. 126-132.

69. Liochev, S. I., and Fridovich, I. Copper, zinc superoxide dismutase and II202. Effects of bicarbonate on inactivation and oxidations ofNADPH and urate, and on consumption of H202. // J. Biol. Chem., 2002. V.277. P.34674 34678.

70. May J.M., de Haen C. The insulin-like effect of hydrogen peroxide on pathways of lipid synthesis in rat adipocytes. // J. Biol. Chem., 1979. V.254. №18. P.9017-9021.

71. Mazellier P., Leroy E., De Laat J., and Legube B. Transformation of carbendazim induced by the H202/UV system in the presence of hydrogenocarbonate ions : involvement of the carbonate radical. //New J. Chem., 2002. V.26. P.1784-1790.

72. Moulton P.J., Goldring M.B., Hancock J.T. NADPH oxidase of chondrocytes contains an isoform of the gp91phox subunit. // Biochem. J., 1998. V.329. №3. P.449-451.

73. Pagourelias E.D., Zorou P.G., Tsaligopoulos M., Athyros V.G., Karagiannis A., Efthimiadis G.K. Carbon dioxide balneotherapy and cardiovascular disease. // Int. J. Biometeorol., 2010. Oct 22. Epub. ahead of print., DOI: 10.1007/s00484-010-0380-7.

74. Peachman K.K., Lyles D.S., Bass D.A. Mitochondria in eosinophils: Functional role in apoptosis but not respiration. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001. V.98. P. 1717-1722.

75. Pollack, G.H; Clegg, J. Unsuspected Linkage Between Ustirred Layers, Exclusion Zones and Water. // In Phase Transitions in Cell Biology. (Pollack G.H., Chin W.C., Eds.). New York: Springer, 2008. - 183 p.

76. Popp F.A., Li K. Hyperbolic relaxation as a sufficient condition of a fully coherent ergodic field. // Int. J. Theoret. Physics, 1993. Y.32. №9. P.1573-1583.

77. Powell M.E., Collingridge D.R., Saunders M.I., Hoskin P.J., Hill S.A., Chaplin D.J. Improvement in human tumour oxygenation with carbogen of varying carbon dioxide concentrations. // Radiother. Oncol., 1999. V.50. P.167-171.

78. Richardson D.E., Regino C.A.S., Yao H., and Johnson J. V. Methionine oxidation by peroxymonocarbonate, a reactive oxygen specie formed from C02/bicarbonate and hydrogen peroxide. // Free Radie. Biol. Med., 2003. V.35. P.1538-1550.

79. Richardson D.E., Yao H., Frank K.M., and Bennett D.A. Equilibria, kinetics, and mechanism in the bicarbonate activation of hydrogen peroxide: oxidation of sulfides by peroxymonocarbonate. // J. Am. Chem. Soc., 2000. V.122. P.1729-1739.

80. Robey I.F., Baggett B.K., Kirkpatrick N.D., Roe DJ, Dosescu J., Sloane B.F., Hashim A.I, Morse D.L, Raghunand N, Gatenby RA, Gillies RJ. Bicarbonate increases tumor pH and inhibits spontaneous metastases. // Cancer Res., 2009. V.69. №6. P.2260-2268.

81. Roy R., Rao M. L. and Kanzius J. Observations of polarized RF radiation catalysis of dissociation of H20-NaCl solutions. // Materials Research Innovations, 2008. V.12. №1. p.3-6.

82. Sankarapandi S., Zweier J.L. Bicarbonate is required for the peroxidase function of Cu,Zn-superoxide dismutase at physiological pH. // J. Biol. Chem., 1999. V.274. P. 1226- 1232.

83. Santos C.X.C., Bonini M.G., and Augusto O. Role of the carbonate radical in tyrosine nitration and hydroxylation by peroxynitrite. // Arch. Biochem. Biophys., 2000. V.377. P.147-152.

84. Schoppen S., Pérez-Granados A.M., Carbajal A., Oubiña P., Sánchez-Muniz F.J., Gómez-Gerique J.A., Vaquero M.P. A sodium-rich carbonatedmineral water reduces cardiovascular risk in postmenopausal women. // J. Nutr., 2004. V.134. №5. P.1058-1063.

85. Shevlin P.B., Neufeld H.A. Mechanism of the Ferricyanide-Catalyzed Chemiluminescence ofLuminol. //J. Org. Chem., 1970. V.56. №7. P.2178-2182.

86. Shoaf A.R., Shaikh A.U., Harbison R.D., Hinojosa O. Extraction and analysis of superoxide free radicals (.02-) from whole mammalian liver. // J. Biolumin. Chemilumin., 1991. V.6. №2. P.87-96.

87. Sodium Bicarbonate Cancer Treatment. -electronic resourse., URL:http://www. wellsphere.com/wellpage/sodium-bicarbonate-cancer-treatment (дата обращения 15.02.2011).

88. Stubbe J., van der Donk W. Protein radicals in enzyme catalysis. // Chem. Rev., 1998. V.98. P.705-762.

89. Taiwo F.A. Mechanism of tiron as scavenger of superoxide ions and free electrons. // J. Spectroscopy, 2008. V.22. №.6. P.491-498.

90. Townsend P.D., Holliday P.M., Fenyk S., Hess K.C., Gray M.A., Hodgson D.R, Cann M.J. Stimulation of mammalian G-protein-responsive adenylyl cyclases by carbon dioxide. // J. Biol. Chem., 2009. V.284. №2. P.784-791.

91. Trimarchi J.R., Liu L., Porterfield D.M., Smith P.J.S., Keefe D.L. Oxidative Phosphorylation-Dependent and -Independent Oxygen Consumption by Individual Preimplantation Mouse Embryos. //Biol. Reproduc., 2000.V.62. P.1866-1874.

92. Vlessis A.A., Bartos D., Muller P., Trunkey D.D. Role of reactive 02 in phagocyte-induced hypermetabolism and pulmonary injury. // J. Appl. Physiol., 1995. V.78. №1. P. 112-118.

93. Voeikov V. Reactive Oxygen Species, Water, Photons, and Life. // Rivista di Biologia/Biology Forum, 2001. V.94. P. 193-214.

94. Voeikov V., Asfaramov R., Koldunov V., et al. Chemiluminescent analysis reveals spontaneous oxygen-dependent accumulation of high density energy in natural waters. // Clin. Lab., 2003. V.49. P.569.

95. Voeikov V.L. Reactive Oxygen Species(ROS): Pathogens or Sources of Vital Energy? Part 1. ROS in Normal and Pathologic Physiology of Living

96. Systems. // Journal of Alternative and Complementary Medicine, 2006. V.12, №2. P.111-118.117. voeikov v.l. bj0i0gjca oxidation: over a century of hardship for the concept of active oxygen. // Cdl Mo1.Bio1. (Nois-v-,e-grand)'2005. V.51" P.663"675

97. Voeikov V.L., Asfaramov R., Bouravleva E.V., Novikov C.N., Vilenskaya N.D. Biophoton research in blood reveals its holistic properties. // Indian J. Exp. Biol., 2003. V.43. P.473-482.

98. Vukmir R.B., Katz L. Sodium bicarbonate improves outcome in prolonged prehospital cardiac arrest. //Am. J. Emerg. Med., 2006. V.24. P.156-161.

99. Wainstain J., Bielski B.H.J. Kinetics of the interaction of H02 and 02-radicals with hydrogen peroxide. The Haber-Weiss reaction. // J. Am. Chem. Soc., 1979. V.101.P.58-62.

100. Wardman P. Candeias L.P. Fenton Centennial Symposium. Fenton Chemistry: An Introduction. // Radiation Reasearch., 1996. V.145. P.523-541.

101. Wentworth A.D., Jones L.H., Wentworth P., Jr., Janda K.D., Lerner R.A. Antibodies have the intrinsic capacity to destroy antigens. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2000. V.97. №20. P. 10930-10935.

102. Wuttke M.S., Buck J., Levin L.R. Bicarbonate-regulated soluble adenylyl cyclase. // Journal of the pancreas, 2001. V.2. 4 Suppl. P.154-158.

103. Zheng J.M., Chin W.C., Khijniak E., et al. Surfaces and interfacial water: evidence that hydrophilic surfaces have long-range impact. //Adv. Colloid

104. Interface Sci., 2006. V.127. P. 19-27.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

Информация о работе

До Минь Ха
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Устойчивые свободно-радикальные реакции в водных растворах бикарбонатов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы