Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Парамагнитные центры при УФ-облучении триптофана в разных матрицах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Парамагнитные центры при УФ-облучении триптофана в разных матрицах"

МНО "ЮРУЫ"

АГЕНТСТВО ШОИШОРМАТИКЙ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

Р Г Б ОД

- 5 ДЕК т

на правах рукописи УДК 541.14

СОУ УСЫАН парамагнитные центры

пря уф-сшучисш триптоглнл в разных матрицах

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ыэсква - 1994

Работа выполнена в Агентстве биоинформатики и экологии человека МВО " Форум "ив Институте химической физики им. Е Е Семенова Российской Академии Наук

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор К. М. Львов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

О. С. Неделина,

доктор физико-математических наук, профессор Э. К Рууге

Ведущая организация - Московский государственный университет

им. М. Б Ломоносова

Защита дисертация состоится 23 декабря 1994 года в .^Лчасов на заседании Специализированного Совета Д. 170.01.01 при АгенЬтве биоинформатики и экологии человека МЮ "Форум" по адресу 117977 Москва,ул. Косыгина 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агентства биоинформатики и экологии человека.

Автореферат разослан 22 ноября 1994 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета —^

кандидат физико-математических наук Шэкшеев Э. М.

СЗДЯ ХЛРМТЕИЯШША РШШ1

Актуальность проблемы. Ультрафиолетовое излучение оказывает постоянное воздействие на яздвые организмы. Умеренные дозы УФ излучения необходимы для нормального функционирования и жизнедеятельности людей и лшвотных. Поэтому УФ излучение нашло широкое применение в медицине в лечебно-профилактических и гигиенических целях.

Из-за влияния УФ-излучения на обменные процессы,оно нашло та]«« широкое применение в сельском хозяйстве для повышения продуктивности ливотных и растений.

В настоящее время в результате деятельности людей над че.^с-чеством висит реальная угроза частичного разрушения защитного озонного слоя Земли. Зто мог.ет привести к серьезным экологическим последствиям, так как озонный слой в настоящее время зацигугет шгае-ле.тащ:е слои атмосферы и поверхность планеты от биологически гистив-ного, повреждающего УФ-излучения солнца.

Начиная с 60-х- годов, появляется боль сое количество работ, посвященных изучению действия УФ света на простейшие фаги,вирусы,отдельные клетки, клеточные органеллы и макромолекулы. Подробно проведены исследования действия УФ-излучения на белки и аминокислоты.

Благодаря работам Владимирова 10, А. ,Вагдасарьяна X С.,Конева 1 а .Кашина Л П ,Гроссвейнера Л.,Сантуса Р. .Азизовой 0. А. и других, :тало известно, что чувствительность молекулы белка к ближнему ЛФ-свету определяется наличием в ее составе остатков трех аромати-¿еских аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана. Стало так-известно что, первичным фотохимическим актом в молекуле бедпса яв-шется ионизация остатка триптофана или тирозина, приводящая к обра-юванию свободных радикалов. Трансформация структуры модифицирований белковой макромолекулы приводит к потере ферментативной актив-юсти.

Для понимания молекулярного механизма действия УФ-излучения на организм,необходимым является изучение процессов образования и реакций гибели радикалов в биологических макромолекулах. Глубокое изучение свободнорадикальных процессов в белках облегчается благодаря возможности проведения экспериментов на широком наборе модельных соединений.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение накопления и гибели парамагнитных центров, У$>-индуцированных при 77К в растворах триптофана с разной структурой.

В работе сформулированы следующие основные задачи:

- имея ввиду различное пространственное распределение молекул, исследовать процесс накопления парамагнитных центров в водных растворах триптофана с кислым, нейтральным и щелочным рН при 77К, оценить значения предельной концентрации этих центров в разных случаях и изучить изменение лкминесценции в связи с присутствием в образце парамагнитных центров того или иного типа;

- исследовать процесс накопления парамагнитных центров в нейтральных водных растворах триптофана в присутствии алифатических аминокислот при 77К, оценить значение предельной концентрации центров и изучить изменение люминесценции при накоплении и гибели свободных радикалов.

Научная новизна: Наиболее существенными являются следующие научные результаты,полученные в данной работе:

1. Обнаружено, что анион- и катион-радикалы,возникающие при УФ-облучении водного раствора триптофана (рН5,77К).превращаются при

л

нагревании до 300К в стабильные продукты, на которые эффективно переносится энергия синглетного возбуждения с соседних молекул триптофана. Тушение люминесценции УО^-облученного раствора триптофана удваивается при переыораяивании образца.

2. В водном нейтральном бинарном растворе триптофана с алифатическим:! пептида:ш с соотнесением концентраций 1/100 2 ходе откчга происходи? восстановление потупенпой при УФ-сблучешш при 77К люминесценции. Показано, что тссстаносленке люмгаесцепщш триптофана при отгкгв коррелирует с глбельв серэдишгмх рад:5салов глиптических пептидов.

3. Показано,что з телочном растворе при 77К молекулы триптофана сб^едэненн в мицэдзн по 6-7 стук. Из сбразунззжся при У^еЗдучеяяи парамагнитных дентроз только ашюп-ра&псш являются тулмтелямм л:о-

1й!НеСЦЭ!1Ц-П1.

4. Сказано, что з кислом растзоре при 77К молекулы триптофана сбъедзненц б мицеллы по 6-7 пту^ ;5з обрезуюггеся при У^облуэш'а п.?гР''3"*глттппс центров только анлоч-пз'Р''^"1! тзллются ту;г;ггллн;1 л:о-мипесцэнции.

Едач?]г;ео:сая значимость г-.бгг.т: Результаты исследования свободно- радикальных реакций триптофана з резнях растворах . изучение свойств продуктов фэтожза триптофана как акцепторов энергии элега?-рокно-гозбуддешшх состояний ароматически егзшокяслот,иослздоганпе причин тушения и путей восстановления люминесценции з модельных системах могут быть полезными при рассмотрения действия У<'> облучения аа Селкл ,а такте при создании методов залиты белковых стру.яур от воздействий.

Ссновнь'е пологенил выносимые на задггу:

1. При У'Т-облучении годного нейтрального раствора триптсйана зри 77К, з котором молэкулн хрс?;сйора образует крупице агрегшги, происходит накопление сзсооднмх радикалов и шдосе гулзшю л;г,у:1-зесцеиции, несмотря на то, что примерно С8% молекул триптофана сста-?тся в исходном состоянии. При разшрагяваиил сбразда кятисп- и

анион-радикалы трансформируются в продукты, которые являются стабильными тушителями люминесценции с близкой эффективностью.

2. Добавление в водный нейтральный раствор триптофана больших количеств алифатических пептидов (в сто раз больше концентрации триптофана) приводит при замораживании к образованию крупных агрегатов, в которых молекулы триптофана равномерно распределены среди молекул алифатического пептида. УФ-облучение такого образца ведет к накоплению в нем катион-радикалов триптофана и анион-радикалов алифатического пептида. Фотолизу подвергаются все молекулы триптофана, что приводит к полному исчезновению исходной люминесценции. Бри отжиге образца люминесценция почти полностью восстанавливается. Восстановление люминесценции коррелирует с гибелью серединных свободных радикалов при отжиге. Восстановление люминесценции определяется восстановлением катион-радикалов триптофана до триптофана.

3. При УФ-облучении триптофана в 1Он. NaOH при 77К 75Х заактированных электронов захватывается ловушками в матрице, а 25% взаимодействует с молекулами триптофана с образованием анион-радикалов. В водном растворе с высокой концентрацией щелочи триптофан образует мицеллы,которые включают в среднем по 6-7 молекул. Захваченные электроны и катион-радикалы в данных условиях не тушат люминесценцию триптофана, а каждый анион-радикал тушт люминесценцию всех немоди-фицированных молекул триптофана в мицелле.

4. Молекулы триптофана в 5н. HCl при 77К объеденены в мицеллы по 6-7 пггук. При УЗл-ионизации молекулы триптофана э»актированный электрон с высокой вероятностью захватывается молекулой триптофана в той же мицелле. Образовавшийся радикал триптофана тушит люминесценцию остальных молекул триптофана в мицелле. Все катион-радикалы реагируют с ионами хлора с образованием парамагнитного центра С1г.

Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы

обсу.тдались на семинарах Отдела кинетики химических и биологически? процессов ИХФ РАЕ

Публикации: ГЬ результатам исследований опубликовано 3 статьи I --журнале "Биофизика".

Структура и содерхант диссертации: Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста,состоит ¡га введения,трех глав,выводов,.. рисунков, " и списка цитированной литературы,включающего ... наименований.

гллвл 1. шгссегша п готохизггя шттсздлл

Приводится обзор основных представлений в области фотофизики и фотохимии триптофана в настоящее время. Рассмотрены работы отечественных и зарубежных авторов, в которых исследованы основные свойства триптофана, как люминесцирувдэго хроиофора. Проведен анализ работ, в которых авторы изучали механизм действия УФ-излучения в области поглощения триптофана. Рассмотрены пути ионизации молекул триптофана в различных растворах при УФ-облучении, природа возникающих парамагнитных состояний, реакции свободных радикалов в разных ситуациях, тушение люминесцентных состояний продуктами фотолиза. Сделан краткий обзор работ, касающихся механизма гибели свободных радикалов У'1>-индуцированных в содержащих триптофан образцах.

глаеа 2. сбьеггв п пзтоди "огзесзл1пш Был исследован водный раствора триптофана фирмы "РсапаГ1. Триптофан изучали в нейтральном (рШ) водной растворе, в Юн. НаОН и в 5н. НС1. Концетрация триптофана во всех экспериментах составляла 1сРм. в работе были исследованы также двухкомпонентные водные растворы с рН5. Первый компонент в растворе-триптофан, концентрация которого составляла 10"* ы в качестве второго компонента раствора брали

такие алифатические пептиды, как триглицилглицин, аланилглицилгдицин и глицилаланин, концентрацию которых изменяли от 103до 2-10'и Растворы помещали в кварцевую трубку с внутренним диаметром 2 ш и откачивали до давления 1,3 Н/м? УФ-облучение производили при 7УК сфокусированным светом ртутной лампы сверхвысокого давления ДРШ-500 черев светофильтр У5С-1 (2б0-400нм) и водный фильтр толщиной 80мм. В качестве источника водимого света использовали тот же облучатель с фильтром БС-10 ( > 400 нм ) вместо УФС-1. Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭЛР) измеряли при 77К на радиоспектрометре РЭ 1306, соединенном с ЭБЫ СМ1300. Для определения абсолютной концентрации свободных радикалов использовали эталонный образец моноокиси кремния. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре "БресогсГ. Измерение люминесценции производили на спектрофлуориметре с двумя монохрокаторами.

ГЛАВА а БЗШЕКПЭГГАШШЗ РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 Туиение люминесценции триптофана продукта).»! его фотолиза в нейтральном растворе Цри замораживании нейтрального водного раствора триптофана образующиеся кристаллы воды не включают в себя молекулы растворенного вещества Концентрация его в »щкой фазе возрастает, что приводит в конце концов к образованию крупных агрегатов. Таким образом, при 77К замороженный нейтральный раствор представляет собой смесь кристаллической водной фазы и фазы, состоящей из крупных агрегатов триптофана, включающих некоторое количество вода

Действие УФ-излучения на замороженный раствор приводит к двухк-вантовой ионизации молекул триптофана и к образованию свободных радикалов, спектр ЭПР которых представляет собой синглет с ДЕ=23 Гс (рис.1). УФ-ионизация триптофана приводит к возникновению катион-ра-

- 7 - -

дикала триптофана. Заактированные электроны в крупных агрегатах триптофана, по-видимому, с большой вероятностью захватываются соседними молекулам! триптофана с образованием анион-радикалов. Б рассматриваемых условиях захват электронов в заморо.-хеиной водной матрице маловероятен. Таким образен, спектр ЭПР УФ-облучениого при 77К водного раствора триптофана представляет собой сугс.г/ спектров ЭПР катион- и анион-радикалов.

Накопление свободных радикалов при УФ-облучешш происходит до образования в образце предельной концентрации этих центров (рис. 2). Предельная концентрация свободных радшеалов не определяется в данной случае ионизацией всех молекул хромофора в образце. При достижении предельной концентрации ионизировании!.« оказываются только ~ 2% исходных молекул. Число свободных радикалов, измеренное по эталонному образцу, соответствует ионизации только одной молекулы хромофора из 60.

Рис.1. Спектр ЭПР раствора триптофана в воде (5.10^11, рН 5),УФ-сб-

лученного при 77К. Температура измерения 7711 Рис. 2. Кинетические кривее накопления свободных раднкалов(1) ч тушения Флуоресценции (2) в водном растворе триптофана {10*11, рН 5,77К) при УФ-облучешш.

Близкий результат получен при измерении спектров поглощения водного раствора триптофана (рН 5), облученного при 77К до сСразова-

шя в нем предельной концентрации свободных радикалов. Доля молекул :риптофана, подвергшихся фотолизу при 77К, оказывается незначитель-юй (рис.3).Однако, при приближении концентрации У^-индуцированных ¡вободных радикалов к предельной, интенсивность флуоресценции замо-юяеиного раствора стремится к нулю (рис.2).

^ic.3. Спектры поглощения водного раствора триптофана (рН 5,300К) до (1) и после УФ-облучения при 77К до образования предельной концентрации свободных радикалов (2). to. 4. Кинетические кривые тушения флуоресценции в водном растворе триптофана (10 Ы, рН 5, 77К) при УФ-облучении (1) и при УФ-облучении с последующим перемораживанием образца (2).

Если прекратить УФ-обяучение при достижении некоторой промежуточной степени тушения, разморозить и снова заморозить образец, то :тепень тушения флуоресценции возрастет (рис. 4). Эффект первоначаль-юго тушения флуоресценции почти удваивается, если первоначальное тушение при УФ-облучении не превысило 50%. Если тушение при УФ-облу-1ении превышает 50Х от исходного уровня флуоресценции, то после пе->емораживания наблюдается тушение оставшейся флуоресценции (рис. 4 и >). Флуоресценция не восстанавливается при длительном пребывании об->азца при 300К в ходе переморазкивания.

¿Г,7.

-1-1-1_и

о го ю т л,,7.

■/•-У" »>>

й4 -ч.

Рис. 5. Зависимость дополнительного тушения (1) и суммарного тушения флуоресценции (2) в водном растворе триптофана (рН 5, 77К) от степени тушения при УФ--облучении (&!,)■

Полученные результаты можно объяснить следующим образе;.!. В модельном образце созданы прекрасные условия для реакции элзктироваи-яого электрона с »юлекулаш триптофана Причем, видимо, в крутит; агрегатах заактированный электрон эффективно захватывается блигдЛизД молекулой триптофана, расстояние до которой составляет 0,5 нм. Та5ск.: образом, катион- и анион-радикалы располагаются так близко друг и другу, что сферы эффективной миграции на них энергии электронного возбуждения с молекул триптофана практически совпадают. Радиус сферь эффективного переноса энергии с двуш акцептора1.!!! в центре немного больше, чем в случае одного акцептора При перемораиивании образца катион- и анион-радикалы, видимо, не реагируют друг с другом, е превращаются в нерадикальные продукты, которые распределятся по образцу равномерно. ГЬсле замораживания на какдую из модифицированные молекул триптофана, образовавшихся из катион- и анион-радикалов, ка? на акцептор, происходит эффективный перенос энергии с молекул триптофана Именно поэтому при перемора-апзашш степень тушения возрастаем примерно вдвое. После того как исходное тушение при УФ-облученш превосходит 50%, переморативание, естественно, приводит к тушении остатка флуоресценции. Удваивание тушения флуоресценции при перемо-

рагзщашш Уб-облученного при 7711 образца показывает, что акцепторные свойства катион-радикалов к шшон-радикалов, шдифйцированкых при пэ-рек'оракиваншз шлакуя триптофана, близки.

3. 2 Свободно-радикальные реакции в растворе триптофана с адкФатпческжд пептидами при УФ- облучении.

Известно, что при ваьюракивании водного раствора растворенные Бецэства не включаются в кристаллы льда, а вытесняются в гзщку» фа-85'. ГЬвксгнпе концентрации растворенных вецзств в жидкой фазе приводит г. образованию крупны:; агрегатов, включающих и молекулы воды. Добавление в водный раствор триптофана (10%, рйэ) больших количеств алифатических пептидов приводит при замораживании к образованию агрегатов, в которых триптофан равномерно распределен в алифатике. Действительно, в этом случае наблюдается рост интенсивности люминесценции триптофана и сдвиг максимума флуоресценции с 345 нм до 333 нм. Уа>-облучение такого образца при 77К приводит к ионизации молекул триптофана п образования стабильньп: свободных радикалов, концентрация которых достигает через некоторое время предельного значения (рис. 6). При приблшззнии концентрации свободных радикалов к предельной интенсивность лшинесценции триптофана стремится к нулю (рис. 6). Предельное значение концентрации свободных радикалов не зависит от интенсивности действующего УФ-света. УФ-излучение в области 260-400 нм не поглощается алифатическими аминокислотами.

При ».алой концентрации алифатической добавки (до 5- 10% для триглигли, алаглигли и глиала при концентрации триптофана 10 1.0 спектр ЭПР УФ-облученного при 77К образца представляет собой синглет с йН~23Гс, являющийся суммой спектров катион-радикала и анион-радикала трштофана( рис. 1).

При увеличении количества алифатических молекул в образце ими

- и -

Рис.6. Кинетические кривые накопления свободных радикалов (1) I уменьшения интенсивности Флуоресценции (2,3) в водном растворе (рН5) триптофана (1 сГ^!1) с триглицилглицином С 1(5^11) пр! УФ-облучении (1,2)(77К) и после перемораживания образца(З). Рис.7. Зависимость предельного числа УФ-индуцированных при 771

свободных радикалов, приходящихся на одну молекулу трипто-

-11

фана в водном растворе (10 Н, р15), от концентрации тригли-цилглицина.

перехватывается все больше заактированных электронов. Это видно пс появлению и росту вклада характерного спектра ЭПР радикалов пептида. На рис.7 приведена зависимость предельной концентрации свободных радикалов от количества алифатической компоненты в растворе. Предельная концентрация свободных радикалов стремится к концентрации, соответствующей двум радикалам на одну молекулу триптофана. Это1; результат показывает, что действительно в агрегатах, образующих^ при заморалмваяии двухкомпонентного раствора, триптофан равномерно распределен в алифатике и что при достаточном разведении алифатико* все молекулы триптофана подвергаются фотоионизации. При достаточнс большой концентрации пептида по сравнению с концентрацией триптофан;

в образце при УФ-облучении образуется в равных количествах катион-радикалы триптофана и анион-радикалы пептида

По мере - разбавления .триптофана алифатикой наблюдается исчезновение эффекта дополнительного уменьшения интенсивности люминесценции при перемораяивании образца(см. 3.1). Еместо него появляется эффект восстановления люминесценции при перемораживании (рис.6). Эффект восстановления растет по мере увеличения степени разбавления триптофана в агрегатах алифатикой ( рис. 8). Максимальный эффект восстановления флуоресценции составляет 85Z.

Наблюдаемый экспериментально эффект восстановления люминесценции триптофана в рассматриваемой юдельной системе можно объяснить fia основе предложенного ранее механизма гибели свободных радикалов в Эелках. При достаточно большой концентрации алифатики заактированные

УФ-облученного при 77К водного раствора триптофана (10%, рК5) с триглицилглицином от соотношения их концентрации. Восстановление люминесценции триптофана (1) и гибель серединных радикалов (2) при повышении температуры водного раствора триптофана (10*Ы) с глицилаланином (1б'ы) после УФ-облучения при 7711

электроны, образующиеся при фотоионизации триптофана под действием УФ-света при 77К, будут захватываться преимущественно молекулами алифатического пептида. Основными акцепторам электронов в исследованных нами алифатических молекулах являются концевая аминогруппа н карбонильная группа пептидного звена. Захват электрона аминогруппой при 77К приводит к диссоциативной реакции дезаминирования, при этой образуется концевой радикал типа CHR- . Захват электрона карбонильной группой приводит к образованию анион-радикала пептидного звена. Действие видимого света и нагрев до Т=150К приводят к разрывам связей С-С и C-N и трансформации образующихся радикалов в концевые радикалы типа -CHR. При дальнейшем нагреве до Т=160К-200К концевые радикалы отрывают атом водорода от ближайшего CL-атома, приводя к образованию более устойчивых серединных радикалов -NH-CR-CO-.

Ранее была сформулирована гипотеза, согласно которой серединный радикал с неспаренным электроном на CL-атоме претерпевает трасформацию, приводящую к освобождению атот водорода Освободившийся атом Н с высокой эффективностью реагирует с радикалом триптофана и восстанавливает его. Это приводит к восстановлению интенсивности лши-несценции триптофана. Действительно, рост по мере отжга образца интенсивности люминесценции триптофана, утерянной в ходе УФ-облучения при 77К, хорошо коррелирует с гибелью серединных радикалов (рис.9).

3.3 Шрамагнитные состояния, УФ-индуцированные в цедочном растворе триптофана щш 77К.

Известно, что действие на триптофан У3>-излучения приводит при 77К к двухквантовой ионизации молекул и образованна ¡сатион-радикалов и электронов. Спектр ЭПР катион-радикалов представляет собой синглет с.аН = 22Гс и g =2,004. В щелочном растворе взаимодействие эактированного электрона с молекулами триптофана затруднено, потому что эти

тлекулы является отрицательным!! ионами . В таких условиях электроны эффективно захватываются ловушками в замороженном растворе. Спектр ЭПР захваченных электронов представляет собой синглет с л Н= 14 Гс и 5-2,0012. Оптический спектр поглощения захваченных электронов простирается от 350 до 800нм с максимумом около бООнм. Действие света в полосе поглощения приводит к освобождению электронов из ловушек и рекомбинации их с катион-радикалами.

На рис. 10 приведен спектр ЭПР раствора триптофана в Юн. КаОН, облученного УФ-светом ( 270-380нм). Это синглетный спектр ЭПР с Д Н= 14Гс. При действии видимого света интегральная интенсивность спектра уменьшается на 751. Остающийся после действия видимого света синг-летный спектр ЗПР имеет д Н =■ 22Гс. Исходя из имеющихся в настоящее время представлений, (.южно следующим образом объяснить полученные результаты. После УФ-облучения 37,5% парамагнитных центров в образце представляют собой захваченные электроны. Гак как ширина спектра ЭПР захваченных электронов существенно меньше ширины спектра катион-радикалов, то в нашем случае именно первый определяет ширину суммарного спектра ЭПР между точками максимального наклона ( рис. 10 ). При действии видимого света электрон покидает ловушку и рекомбинирует с материнским катион-радикалом Этому процессу способствует то, что катион-радикал, тлея и положительный и отрицательный заряд, в целом нейтрален в то время, как каздая молекула триптофана имеет один отрицательный заряд. Кулоновское отталкивание, мешающее сближению электрона с молекулой триптофана, в случае взаимодействия с катион- радикалом отсутствует. Видимо электрон, выбитый из ловушки светом, ' не обладает энергией достаточной для преодоления кулоновского отталкивания.

После завершения реакции рекомбинации электронов и катион-радикалов в образце остается 25% парамагнитных центров, которые не чувс-

Рис. 10.

Рис. 11.

О 0.5 I

Спектры 8ПР раствора трсттофзна ( 10" И ) в 1Сн. ;'е.0Н пр:: 7711 1 - УФ-облучэнке ( 270-330 ям ) з течение 30с, 2 - дополнительное облучение ещпглл.; светом (>400 ж.' ) з течение Юг .

Кинетичесюге кривые накопления УйЬ индуцированных при 771! перакагнотных центров (1. 2 ) и тупэнкя флуоресценц-а: ( 3, 4 ) раствора триптофана в Юн. НаОН. 1,4- УФ-с5лу-чение , 2, 3 - облучение УФ и зщтимым светом ( см. подпись к рис. 10).

Интегральная интенсивность спектра БПР: 5 - катпон-ра-дикалов 1(1):2, б - захваченных электронов С 1(1)-1(2)3:2, 7 - анион-радикалов 1(2): 2 .

твительны к действию видимого света ( рис.10 ). Параметры спектра ЗЛР этих центров ( Д Н = 22Гс, г = 2,004 ) позволяет сделать вывод, что они являются свободными рад!5кала1Я1 тр::п?офана. По-видимому, этот СПС1СТР принадлежит сумлз равных количеств катион- и анион-радию-лов триптофана Вероятно, электроны, образующиеся в результате ионизации триптофана, имеет достаточную кинетическую энергии, чтобы преодолеть расстояние до соседней молекулы и кулоновское отталкивание отрицательного иона триптофана

На рис.11 представлены кривые изменения интегральной интенсивности спектра ЭПР парамагнитных состояний, возникающих при 77К в растворе триптофана в концентрированном ЫаОН при разных режимах облучения. Кривая 1 демонстрирует изменение интенсивности спектра ЭПР при действии УвЬсвета в области 270-380 нм. Для получения каждой точки на кр^ой 2 использовался новый раствор; сначала образец облучали УФ-свзтол в течение заданного времени, а затем видимым светом в течение 1Сс. В первом случае в образце в результате ионизации триптофана образуются катион-радикалы, захваченные электроны и анион-радикалы. Число ¡сатион-радикалов равно сумме числа захваченных электронов я числа анион-радикалов. Во втором случае после действия видимого света все захваченные электроны рекомбшшруш с равным количеством каткон-радикалов. В остатке имеем равные количества катион- и анпоя-радикалов. По наклону начальных участков кривых 6 и 7 (рис.11) видно, что начальная скорость образования захваченных электронов примерно в три раза больше, чем скорость образования анион-радикалов, т. е. 75% заактированных электронов захватывается ловушками, а 252 - реагирует с молекулами триптофана с образованием стабильных при 77К анион-радикалов.

Свет в области 270-380 нм перекрывает коротковолновую часть спектра поглощения захваченных электронов. При действии этого света наряду с' ионизацией молекул триптофана протекает фотоосвобождение электронов из ловущек и рекомбинация их с катион-радикалами. Максимум на кривой 1 соответствует выходу на равновесную концентрацию захваченных электронов, когда скорость захвата заактированных электронов в ловушки равна скорости их фотоосвобоэдения с последующей рекомбинацией с катион-радикалом. Дальнейшее облучение образца приводит к постепенному снижению равновесной концентрации захваченных электронов, которое коррелирует с накоплением не чувствительных к

- 17 -

видимому свету свободных радикалов ( рис.11, кривая 2 ).

Интенсивность люминесценции триптофана в щелочном растворе при УФ-облучении снижается ( рис.11, кривые 3 и 4 ). Реяиы облучения при получении кривых 3 и 4 такой ле, как в случае получения кривых 1 и 2, соответственно. Из экспериментальных кривых 1 и 2 , ошфаясь на наш представления об образовании парамагнитных центров, легко получить кривые изменения концентрации для каждого из них. Кривые 5, 6 и 7 демонстрируют изменение концентрации катион-радикалов, захваченных электронов и анион-радикалов. Видно, что изменение лшинесценщш коррелирует только с накоплением анион-радикалов. Интенсивность лю-(¿инесценции стремится к нулю при приблияении концентрации радикалов к предельной.

Рассмотрим тушение люминесценции в связи с присутствием в образце тех иди нных парамагнитных центров в первые секунды фотолиза, тогда степень превращения триптофана »та, и количество этих центров з первом приближении пропорционнально УФ-экспозиции. Облучение - образца УФ-светом в течение 5 секунд приводит к образованию в образце 1,2. ю'у парамагнитных центров ( рис.11, кривая 1 ). Щзп действии видимого света в результате рекомбинации равных количеств катион-ра-дакалов и электронов исчезает 3.10^ центров, что соответствует юсстановлению примерно 7,6±1% молекул триптофана от их исходного галичества 2. ю'5" в образце. В то яе время интенсивность флуоресценции восстанавливается тоге на 8±1% от интенсивности флуоресценции [еоблученного образца. Это означает, что катион-радикалы триптофана ! Юн. ИаОН не тушат флуоресценцию соседних молекул. Это означает так-что захваченные электроны тоже не тушат флуоресценцию триптофана ! условиях настоящего эксперимента

Через 5 секунд УФ-облучения в образце накапливается 1,2.10 ¡вободных радикалов не чувствительных к видимому свету ( кривая 2 ).

Вызе было сделано предположит о том, что это сумма равных количеств катион- и анион-радикалов. Легко посчитать, что в те и другие радикалы превращено по 3% молекул триптофана в образце. Интенсивность флуоресценции в таком образце уменьшена по сравнению с исходной на 19% ( кривая 3 ). Катион-радикалы не тушат флуоресценцию других молекул триптофана в накем случае. Понятно, что интенсивность лгхшнесценщи за счет превращения молекул триптофана в катион-радикалы снизится на 3%. Уменьшение интенсивности флуоресценции еще на 19-3-16% связано с образованием анион-радикалов. На 31 интенсивность флуоресценции уменьшается из-за того, что сами анион-радикалы не лю-мивесцируют. Дополнительное тушение на 13% связано, по-видимому, с тем, что каздый анион-радикал эффективно тушт люминесценцию примерно четырех соседних молекул тр!штофана ( 13:3=4,3 ).

Близкие цифры получается "при рассмотрении соотношения набора свободных радикалов и тусення флуоресценщш в образце после облучения УФ и видимым светом в течение 6 минут ( рис.11, кривая 2 ). В этой случае тушение флуоресценции составило 90% ( кривая 3 ). Количество катион-радикалов разно количеству анкон-радикалов. Число радикалов каждого типа в образце 2,8.10^ . Т.е. примерно по 14% от исходного числа молекул триптофана превращаются в радикалы того и другого типа с потерей способности к люминесценции. Тушение 62% флуоресценщш, как и в предыдущем случае, мы связываем с эффективным тушением каждым анион-радикалом люминесценции четырех соседних молекул триптофана ( 62:14=4,4 ).

Lii огздали, что все реакции в нашем, случае будут протекать как в застекловакком истинном растворе. Действительно, известно, что растворы НаОН с высокой концентрацией стеклукпся при охлаждении. Однако, наги эксперименты показали, что раствор триптофана в Юн.NaOH при 77К не является истинным. Действительно, предельное количество

свободных радикалов в образце в 3,6 раза меньше числа молекул трип-тофана( рис.11, кривая 2 ). Этот результат молю объяснить предположив тушение люминесценции анион-радикалаш ( см. вьспе ). Известно, что тушение люминесценции триптофана свободными радикалами, У<3>-индуцированными в белках и в различных модельных системах при 77К, эффективно на расстоянии меньше 3,4нм. Однако в 10"^ и растворе триптофана среднее растояние между молекулами составляет 26нм. Па таком расстоянии в застеклованном истинном растворе тушение люминесценции триптофана за счет переноса энергии электронного возбуждения по ¡шдук-тивно-резонансному механизму на свободный радикал происходить не может. Если бы застеклованный раствор оставался истинным, то предельное количество свободных радикалов было бы равно либо превосходило число молекул триптофана в образце.

Полученные результаты можно объяснить, если предположить, что молекулы триптофана объединяются по несть итук за счет гидрофобных взаимодействий. Молекулы триптофана являются амфипатическими, т.е. содержат сильно гидрофобную и сильно полярную группа Известно, что амфипатические соединения стремятся образовать мицеллы, в которых гидрофобные группы обращены внутрь, а полярные - наружу. При ионизации одного из триптофанов образуется катион-радикал, который не тушит люминесценцию других молекул триптофана в мицелле. Если эжекти-рованный электрон захватывается другой молекулой триптофана в ющел-ае, то возникает анион-радикал, который тушит люминесценцию четырех оставшихся молекул триптофана

Кривые накопления свободных радикалов и уменьшения интенсивности флуоресценции имеют ясно вырачвнный излом. ¡Медленная часть кривых ¡вязана с накоплением анион-радикалов и равного количества кати-)н-радикалов. Начальная ( до 20с. ) быстрая часть кривых связана с гараллельным протеканием второго процесса - захватом эжектированных

электронов в ловушки и образованием равного количества катион-радикалов. Этот процесс обратим при действии света в области поглощения стабилизированных электронов. Через 20с. скорости прямой и обратной реакций выравниваются и он перестает давать вклад в накопление свободных радикалов и в уменьшение интенсивности флуоресценции (рис.11, кривые 2 и 4 ).

3. 4 Парамагнитные состояния, УФ-индуцированные в кислом растворе триптофана при 77К.

УФ-облучение триптофана в 5н. HCl при 77К приводит к ионизации молекул аминокислоты и образованию парамагнитных центров разного типа, суммарный спектр ЗПР которых приведен на рис. 12. Релаксационные характеристики образовавшихся центров оказались существенно разными. Это позволило разделить их. Синглетный спектр ЭПР слН=20Гс принадлежит свободным радикалам триптофана. Спектр ЭПР сложной формы похожий на дублет с дер=50Гс и ¿>Нк=24Гс был получен ранее от гамма-облу-ченой при 77К соляной кислоты и приписан парамагнитным центрам Кроме этих спектров в УФ-облученноы образце регистрируется дублетный спектр ЭПР с ^ Нр =51ОГс,который принадлежит атомам водорода.

На рис.13 приведены кривые накопления радикалов,спектры ЭПР которых наблюдается в эксперименте. В первые 20с значения концентрации парамагнитных центров двух первых типов остаются равными. Затем рост интенсивности синглетного спектра замедляется и через 1-2 минуты УФ-обдучения совсем прекращается, в то время как спектр ЭПР "дублетной" формы продолжает расти. Кривая накопления атомов Н соответствует кривой роста синглетного спектра ЭПР,однако их предельная концентрация существенно ниже. На рис. 13 приведена также кривая изменения интенсивности флуоресценции триптофана в ходе УФ-облучения. Интенсивность флуоресценции уменьшается антисимбатно росту интенсив-

Рис. 12. Спектры ЭПР УФ-облученного при 77К водного раствора триптофана (рШ). УФ-облучение: 1- 5с, 2- 90с. Рис.13. Накопление разных радикалов (2,3) и тушение флуоресценции (1) при УФ-облучении триптофана в 5и. НС1 при 77К .Объяснения в тексте.

ности синглетного спектра ЭПР, при приблизили концентрации соответствующих парамагнитных центров к максимальной интенсивность флуоресценции стремится к нулю. Аналогично ведет себя и фосфоресценция триптофана

Сшгаение интенсивности люминесценции ароматических аминокислот при УФ-облучении связано, во-первых,с модификацией молекул (анион- и катион-радикалы и продукты их превращения как правило не обладают люминесценцией) и , во-вторых, с переносом энергии с сингяетно-воз-Эувденных состояний ароматических молекул на продукты фотолиза и последующей диссипацией, если расстояние иещу донором и акцептором меньше Знм.

Представление о взаимном расположении молекул модно получить шределив концентрацию свободных радикалов соответствующую снижению ю нуля интенсивности люминесценции триптофана при УФ-облучении. Пре-1ельная концентрация свободных радикалов с синглетным спектром ЭПР

г; пасам случае соответствует 0,15 радикала на одну молекулу триптофана. Однако, на начальном этапе облученга наряду с радикалами с лшглетным спектром в разног,! количестве возникает радикалы СЬ . Зто ззкачает, что сбщня концентрация свободных радикалов, приводящих к хоозюму тусениз люминесценции, в пересчете на одну молекулу трипто-íar-:a равна 0,3. В случае ионизации всех молекул ш получили бы два задикала кг одну молекулу триптофана Таким образом, в насем случае эдпа :-:онизащи1 пр;п:одктсн на 2 / 0,3 = 6,6 молекул триптофана. Такой :з результат был получен H£iai для раствора триптофана в Юн. NaOE L'xtho считать, что и б кислом растворе молекулы триптофана об'едене-•ш з ьсщзллы по 5-7 пггук. Действительно, молекулы триптофана в кхслэк раствора являются гйфшатическиыи, т. е. содержат сильно гид-ро^сйнуз и сильно полярнуз грушш. Такие молекулы склонны об'еде-еятьсе в шцеллы за счэт гидрофобных взаимодействий.

Итак, раствор триптофана в 5н. ЕС1 представляет собой при 77К ;:с-хинный раствор шщелл, кадцая из которых включает 6-7 молекул 1р;штсфана. Каццая молекула триптофана имеет положительно заряженную -rffi¿ группу, заряд которой сольватирован ионами С1 . В этой ситуации образование свободны:: радикалов протекает, по-видимому, следующим образа;,!. Эггктпрованный электрон с высокой вероятностью взаимодействует с одной из -МНз групп молекул триптофана в мицелле. В результате протекает хороео известная реакция дезаминирования и образуется радикал триптофана. Этот радикал таю®, как в щелочном растворе, являясь хороши акцептором энергии молекул триптофана в смнглет-1-0-возбугзэнкоы состоянии, гусит люминесценцию всех остальных молекул в Небольшая часть элозктнроваикых электронов захватывается протонами. Катион-радикал, возникший при ионизации триптофана, является прекрасный акцептором электрона Он, по-видимому, реагирует с ионом хлора Образовавшийся в результате этой реакции атом хлора,

видимо, вступает в реакцию с ионом хлора с образованием наблюдаемого в эксперименте парамагнитного центра С\х . Вероятность протекания реакций с ионом хлора в рассматриваемом растворе еуцественно увеличена из-за значительной локальной концентращш этих ионов в сольват-ных оболочках вокруг положительно заряженных аминогрупп.

Накопление в образце предельной концентрации свободных радикалов триптофана и почти полное тушение люминесценции не приводит к полной остановке процесса образования свободных радикалов. Скорость образования радикалов снижается, но концентрация вырастает во много раз . Причем растет концентрация только за счет накопления свободных радикалов С\. Медленная реакция накопления радикалов протекает благодаря фотодеструкции анион-радикалов. Измерение количества парамагнитных центров в образце показало, что при длительном УФ-облучении суммарное предельное число центров в два раза превышает число молекул триптофана в образце. Таким образом, в этом случае все молекулы триптофана оказываются ионизованными, а все эхектированные электроны захваченными теми или иными акцепторами.

Е!ЗОДЫ

1. Обнаружено, что анион- и катион-радикалы,возникающие при УФ-облучении водного раствора триптофана (рН5,77К) .превращаются при нагревании до 300К в стабильные продукты, на которые эффективно переносится энергия синглетного возбуждения с соседних молекул трипто-|ана С пространственным разделением продуктов трансформации ион-ра-цикалов при перемораживании связан эффект удвоения тушения люминесценции УФ-облученного раствора триптофана

2. Действие УФ-излучения при 77К на бинарный водный (рН5) раствор триптофана с различными алифатическими пептидами приводит при росте концентрации алифатической компоненты к росту предельной кон-

центрации радикалов. Максимальная предельная концентрация соответствует двум радикалам на одну молекулу триптофана В этом случае все заактированные триптофаном электроны захватываются молекулами ароматического пептида Потушенная при УФ-облучении люминесценция восстанавливается при откиге образца Восстановление люминесценции коррелирует с отжигом серединных радикалов в алифатических пептидах.

а Щ?и УФ-облучении триптофана в Юн. ЫаОН при 77К 75% заактированных электронов захватывается ловушками в матрице, а 25% взаимодействует с молекулами триптофана с образованием анион-радикалов, предельное суммарное количество свободных радикалов при одновременном действии УФ-излучения и видимого света соответствует двум радикалам на 6-7 молекул триптофана. Сделан вывод, что в водном растворе с высокой концентрацией еэлочй триптофан образует мицеллы,которые включает в среднем по 6-7 молекул. Показано, что захваченные электроны и катион-радикалы в данных условиях не тушат люминесценцию триптофана, а катдай анион-радикал тушит люминесценцию всех ^модифицированных молекул триптофана в мицелле.

4. Молекулы триптофана в 5н.Ш1 при 77К объеденены в мицеллы по 6-7 штук. При УФ-ионизации молекулы триптофана эзкектированный электрон с высокой вероятностью захватывается молекулой триптофана в той гэ мицелле. Образовавшийся радикал триптофана тушит люминесценцию остальных молекул триптофана в мицелле. Все катион-радикалы реагируют с нонами хлора с образованием парамагнитного центра С12.

СПИСОК РАБОТ, ОПУВЛШЮВАШШ ПО ТЕШ ЩССЕРТАЦЖ:

1. Львов К. М., Coy У. Тушение люминесценции триптофана продуктами его фотолиза // Биофизика. - 1994. - Т. 39. - N3. - С. 405-408.

2. Львов К. М., Coy У., Искаков А. А., Костиков А. Е Свободно-радикальные реакции в растворе триптофана с алифатическими пептидами при УФ-облучении // Биофизика. - 1994. - Т.39 N4. - С. 749.

3. Львов К. М. ,Соу У. .Костиков A.IL Парамагнитные состояния, УФ-индуцированные в щелочном растворе триптофана при 77К // Биофизика. - 1994 - Т. 39. - С. 749.