Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободнорадикальные процессы в белках в поле УФ-излучения. Влияние ионного заряда, степени агрегации, структуры макромолекул и переноса энергии

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальные процессы в белках в поле УФ-излучения. Влияние ионного заряда, степени агрегации, структуры макромолекул и переноса энергии"

МНО „ФОРУМ"

АГЕНТСТВО БИОИНФОРМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи УДК 577.4+547.96+541.14

БЕКМУРЗАЕВ Бейбит Минжасарович

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БЕЛКАХ В ПОЛЕ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ

Влияние ионного заряда, степени агрегации, структуры макромолекул и переноса энергии

(03.00.16 —экология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва —1991

Работа выполнена в Ордена Ленина Институте химической физики им. ЕЕ Семенова АН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук К Ы. Львов

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Табагуа М. И..

кандидат физико-математических наук Усатый А. Ф.

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. 11 Е Ломоносова кафедра биофизики

Защита диссертации состоится " " января 1992 года в час. 00 мин. на гаседании Специализированного Совета Д. 170.01.01 при Агентстве биоинформатики и экологии человека ШЮ "Форум" по адресу? 117342, Москва, ул. Бутлерова, 16.

С диссертацией мозшо ознакомиться в библиотеке Агентства биоинформатики и экологии человека.

Автореферат разослан " " декабря 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор фив. -мат. наук

Добряков С. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

л

Актуальность. Взаимодействие ультрафиолетовой части излучения Солнца с компонентами биосферы несомненно оказывает огромное влияние на протекание жизни многих организмов. Действие ультрафиолетового излучения Солнца в предбиологическуга эпоху в условиях отсутствия озонного слоя было, видимо, одним из важнейших факторов, влиявших на формирование биологически важных молекул и самой жизни.

Деятельность Человека привела к созданию искусственных источников ультрафиолетового излучения, с одной стороны, и к реальной угрозе разрушения защитного озонного слоя Земли, с другой. Оба этих фактора могут привести к серьезным экологическим последствиям.

Комплекс явлений, происходящих при действии ультрафиолетового света на живые объекты, давно привлекает внимание исследователей. Мэжно выделить ряд вопросов, имеющих большое теоретическое и практическое значение, тесно связанных с проблемой трансформации энергии ультрафиолетового (УФ) излучения в компонентах клетки. Прежде всего следует сказать об использовании УФ-радиации в медицине. Здесь УФ-излучение уже давно широко используется в лечебно-профилактических целях. Широко применяется УФ-облучение в гигиенических целях. Прочно вошло в практику медицинских- а научно-исследовательских учреждений использование бактерицидных свойств коротковолнового ультрафиолета Применяется УФ-радиация и в сельском хозяйстве для улучшения здоровья и увеличения продуктивности сельскохозяйственных животных и поднятия урожайности сельскохозяйственных растений. Интересен эволюционный аспект взаимодействия УФ-света с живой материей. Важно понять механизмы заняты клеток и организмов от УФ-иэлучения.

- г -

В практическую деятельность научно-исследовательских учреждений УФ-свет все более широко входит как мощный инструмент познания закономерностей организации и функционирования биологических систем на молекулярном и клеточном уровнях.

В этих и других случаях взаимодействия УФ-излучения с биологическими объектами для глубокого понимания происходящих процессов и сознательного управления ими необходимо знание элементарных первичных и начальных этапов превращения УФ-излучения в биологически важных молекулах, в частности, в белках. Большой вклад в изучение действия УФ-излучеюш на белки внесен фундаментальными работами таких отечественных и зарубежник ученых как Владимиров 1С А., Конев С. Е , Кашин Л П., ¡Буртгейн а А., Азизова О. А., Львов К. Ы., Сент-Дь-ердьи к., Карреман Г., Стал Р. , Вебер Г., Ковгшш Р., Сантус Р., Птак М., Гроссвейнер Л. и др. Изучена структура электронных уровней белков, характеристики возбужденных состояний, свойства разных хромофоров, включенных в белковую молекулу. Большое количество работ посвящено изучению миграции энергии электронного возбуждения ароматических аминокислотных остатков в белковых молекулах. В ряде работ показано, что при действии УФ-света на растворы белков наблюдаются такие явления, как потеря ферментативной активности, изменения молекулярного веса, растворимости, вязкости, спектров поглощения и других физических и химических характеристик.

Таким образом, проблема действия ультрафиолетового света на белки является актуальной и с точки зрения создания полной теории процессов, протекающих в живой клетке при УФ-облучении, и особенно

для глубокого понимания возможных экологических последствий повреждающего действия ультрафиолета.

Цель работа Целью настоящей работы является изучение влияния некоторых физических факторов на протекание свободнорадикальных процессов УФ-индуцированных в белках.

В работе сформулированы следующие основные задачи:

- исследовать влияние суммарного ионного заряда ароматических аминокислот, пептидов и белков на начальную скорость образования свободных радикалов при УФ-облучении;

- определить радиус эффективного переноса анергии синглет-но-воэбуиденных состояний хромофора на УФ-индуцированные свободные радикалы отдельно для триптофана и для тирозина;

- провести анализ свободнорадикальных состояний УФ-индуцированных в белках с целью выяснения возможности их участия в качестве акцепторов энергии в тушении люминесценции белков;

- изучить влияние молекулярной массы аминокислот, пептидов и белков и степени их агрегации на значение предельной концентрации УФ-индуцированных свободных радикалов;

- используя влияние вторичной структуры белков на кинетику гибели УФ-индуцированных свободных радикалов, изучить вторичную структуру коллагена I из коли холоднокровных животных.

Научная новизна. Наиболее существенными являются следующие научные результаты, полученные в данной работе:

1. Скорость образования свободных радикалов при УФ-облучении ароматических аминокислот, пептидов и белков при 77 К резко возрастает, если суммарный варяд молекулы после УФ-иониэации остается отрицательным.

2. Радиус сферы эффективного переноса энергии по индуктивно-резонансному механизму на УФ-индуцированные при 77 К свободные радикалы триптофана и тирозина составляет 2,9 и 3,2 ны соответственно.

3. Основными тушителями люминесценции в УФ-облученных белках

+ • •

являются -три -три -,. -тир

4. Показано, что в случае истинных растворов ароматических аминокислот, пептидов и малых (Ш<30 КДа) белков, в каждой молекуле может произойти только одна ионизация и образоваться два свободноради-■ кальных центра. Агрегация этих молекул приводит к тому, что предельное число радикалов в образце уменьшается пропорционально степени агрегации.

Б. Рекомбинационно-кинетическим методом исследована вторичная структура коллагена из кожи холоднокровных животных. Показало нарушение вторичной структуры этого белка при высушивании и реставрация структуры при растворении при рН<3.

Практическая значимость'работы. Результаты исследования влияния таких физических факторов, как агрегация-дезагрегация, суммарный ионный заряд, перенос анергии на разные радикалы и вторичной структуры на протекание свободнорадикальных процессов в бедках при УФ-об-лучении несомненно полезны в следующих областях:

- при создании общей теории процессов, протекающих в белках при действии ультрафиолетового излучения и способов защиты белков и белковых структур;

- в лабораторных исследованиях структуры и свойств различных белков и белковых образований.

- Б -

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Скорость образования свободных радикалов при УФ-облучении ароматических аминокислот, пептидов и белков при 77 К резко возрастает, если суммарный ионный заряд молекулы после УФ-ионизации остается отрицательным и продолжает расти с ростом избыточного отрицательного заряда.

2. Радиус сферы аффективного переноса энергии синглетно-возбуж-денных состояний на радикалы, возникающие при ионизации остатков триптофана и тирозина, близки и составляют 2,9 и 3,2 нм соответственно.

3. Основными тушителями люминесценции в УФ-облученных белках

+ » •

являются такие радикалы как -три -три -, -тир -.

4. В истинных растворах ароматических аминокислот, пептидов и белков с ММ<30 КДа при 77 К УФ-облучение приводит в пределе к протеканию одной ионизации и образованию пары свободных радикалов на одну молекулу.

Б. Вторичная структура коллагена из кожи холоднокровных животных нарушается при высушивании и восстанавливается при растворении и уменьшении рН раствора до рЖЗ.

Апробация работа Основные результаты диссертационной работы обсуждались на семинарах Отдела кинетики химических и биологических процессов ИЗ® АН СССР.

Публикация. По результатам исследований опубликовано 6 статей в отечественных журналах.

Структура и содержание диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, вы-

- в -

водов, 27 рисунков, 2-х таблиц и списка цитированной литературы, включающего 82 наименования.

ГЛАВА I. ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БЕЛКИ

Приводится обзор основных работ, касающихся механизма действия УФ-излучения на белки, природы возникающих свободных радикалов и их реакций, миграции анергии на УФ-индуцированные радикалы и предельной концентрации этих радикалов. Рассмотрено исследованное в ряде работ влияние вторичной структуры белков на протекание реакции гибели УФ-индуцированных свободных радикалов.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Действие ультрафиолетового излучения в области поглощения ароматических аминокислотных остатков (250-300 нм) было исследовано на растворах ароматических аминокислот, ароматических пептидов и белков. Из ароматических аминокислот были изучены триптофан и тирозин -аминокислоты, играющие основную роль в фотолизе белков. В качестве соединений, моделирующих участки пептидной цепи белков, бьши исследованы такие ароматические пептиды, как глицил-триптофан и гли-цил-глутаминил-тирозин. На белков были выбраны рибонуклеаза панкреатическая, пап айн, «¡¿-химотрипсиноген, сывороточный альбумин быка (САБ), сывороточный альбумин человека (САЧ) и глобин. Все препараты - аминокислоты, пептиды и белки фирмы "Reanal".

Аминокислоты, пептиды и бедки растворяли в смеси равных объемов дистиллированной воды и химически чистого этиленгликоля. Эта смесь хорошо стеклуется при охлаждении, что дает возможность при крайних значениях рН получать истинные растворы веществ в застеклованной матрице.

Рекомбинационно-кикэтическим (РК) методом при разных значзшмх рН раствора исследована степень спиральности коллагена I из кожи холоднокровных животных.

Выделение кислоторастворимого коллагена проводили по стандартной методике.

РК-методом и методом измерения предельной концентрации радикалов (ПКР-метод) были исследованы водорастворимые белки из хрусталиков мышей. Белки экстрагировали иэ гомогената хрусталиков.

Образцы откачивали до 1,3 Н/и*~. Дяя ЭПР и спектрофлуориметри-ческих измерений использовали плоские образцы с малой толщиной.

Для облучения образцов ультрафиолетовым светом применялись облучатели с ртутными лампами сверхвысокого давления. Нужные участки спектра выделяли стеклянными светофильтрами.

Спектры ЭПР измеряли на радиоспектрометре РЭ 1306, который был связан с ЭВМ СМ 1300.

Спектры поглощения измеряли на спектрофотометрах "БреоогсГ и Си-50 Весктап.

Спектры лшинисценции измеряли на спектрофотометра с двумя мо-нохроматорами.

ГЛАВА III. ВЛИЯНИЕ ИОННОГО ЗАРЯДА МОЛЕКУЛЫ БЕЛКА НА'СКОРОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В ГОЛЕ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ

Была поставлена задача изучить влияние ионного состояния аминокислот, пептидов и белков на процесс образования свободных радикалов при УФ-облучении.

Влияние суммарного ионного заряда ароматических аминокислот и пептидов на скорость образования свободных радикалов

Исследованные нами растворы ароматических аминокислот, пептидов в смеси воды с атиленгликолем при охлаждении хорошо стеклуются. Нами было показано, что такие растворы ароматических аминокислот и пептидов при замораживании остаются истинными.

Кривые накопления свободных радикалов в эастекловаяных растворах ароматических аминокислот и пептидов при УФ-облучении показывают, что предельное значение, к которому стремится число радикалов, одинаково для всех исследованных растворов. Предельное количество радикалов в два раза превышает число молекул хромофора в образце. Таким образом, имеет место ионизация каждой молекулы хромофора с образованием двух парамагнитных центров.

На рис. 1 приведены зависимости начальной скорости образования радикалов (Уд), и на рис. 2 - тушения флуоресценции (У^) от рН раствора для ароматических аминокислот и пептидов. Наблюдается увеличение скорости обоих процессов для тирозина и гли-глу-тир при переходе от рН < 9,5 к рН > 11. Цри других значениях рН изменение скорости атих процессов не наблюдали. В случае триптофана изменение \ и У<рЛ. незначительно.

Спектры ЭПР радикалов, образующихся в исследованных ароматических аминокислотах и пеп/идах при рН < 9,6 ничем не отличается от спектров, 'полученных при рН > 11. Этот результат показывает, что ускорение образования радикалов связано не с запуском каких-то новых рутей образования радикалов, а с увеличением скорости процесса

Рис. 1. Зависимость от рН начальной скорости обраэования радикалов в застеююваннызс (77 К) растворах триптофана (1), тирозина (2) и глшри-глутатнш-тировина (3) при УФ-оОдучении.

Рис. В. Зависимость от рН начальной скорости тушения флуоресценции в ?астеклованных (77 К) растворах триптофана (1), тирозина (2) и глицил-глутаминил-тироэина (3) при УФ-облучении.

В таблице 1 дня трех исследованных веществ приведены ааряды ионных состояний молекул для трех значений рЕ Кроме этих зарядов каждая молекула хромофора приобретает один положительный заряд после УФ-ионизации. В таблице приведены также относительные значения начальной скорости реакции фотообразования радикалов, причем значение Уяпри рН 7 для всех хромофоров принято аа единицу. Видно, что возрастание значения \имеет место, когда суммарный заряд молекулы после ионизации остается отрицательным. Такая ситуация имеет место только при рН > 10. В триптофане при рН 12 суммарный заряд после УФ-ионизации равен нулю, существенного изменения скорости образования радикалов не наблвдается. В тирозине при рН 12 имевтс.т две отрицательно заряженные группы (-СОО~и -0*). После УФ-иониаации в молекуле остается один нескомпенсированный отрицательный эаряд. Значение ^возрастает в 3 раза.

Таблица 1

Заряды (ч) на молекулах и относительные значения начальной скорости образования радикалов при трех значениях рН

1 ■ 1 а 1 1 и -------г ■ ■ 1----------1

1 рН 1 я 1 2 1 ■ 1 1 V« 9 ч « 1 2 а. 1 ■ 1 1 п ч iSq.iv, |

триптофан И 8 тирозин И гли-глу-тир |

1 1 + 2+ 1 I + 2+ 1 1 + 2+1|

1 7 + - 1+ 1 I + - 1+ 1 1+ - - 0 1|

| 12 0 1 8 - - 1- 3 1- - - 2- 4,5 1

а а 1

В пептиде гли-глу-тир при рН 12 имеются три отрицательно заряженных группы (две - СОО* и -6"). Шзсле УФ-ионизации в молекуле остаются два нескомпенсированных отрицательных заряда Значение Уд возрастает в 4,5 раза. Ясно, что кулоновское взаимодействие с суммарным отрицательным зарядом молекулы хромофора выталкивает эжек-тированный электрон в растворитель. Это затрудняет рекомбинацию его с катион-радикалом, что приводит к увеличении скорости образования радикалов.

Чем больше суммарный отрицательный заряд молекулы, тем сильнее этот эффект. Возрастание эффекта на трипептиде показывает, что отрицательный заряд, расположенный не на хромофоре, а на соседнем остатке, также вносит вклад в наблюдаемый эффект.

Количество положительно заряженных групп в молекуле не влияет заметно на скорость образования радикалов. Видимо, можно представить следующую картину начальник этапов образования радикалов. Шсде выброса электрона из хромофора (эяэкции) он обладает некоторой кинетической энергией. Кинетическая энергия электрона убывает со временем из-за взаимодействия электрона с атомами окружающих молекул, а также ив-ва кулоновского взаимодействия электрона с катион-радикалом в случав, если суммарный заряд катион-радикала положительный. Отсутствие влияния величины этого заряда на начальную скорость образования радикалов, видимо, означает, что потеря кинетической энергии определяется не куло'новским взаимодействием электрона с катион-радикалом, а определяется его взаимодействием с атомами окружающих молекул.

После термолизации электрода он может реагировать с окружающими

молекулами на конкурентной основе. Видимо, константа скорости реакции электрона с катион-радикалами существенно больше константы скорости взаимодействия электрона с молекулами спирта. Поэтому большая часть электронов рекомбинирует с катион-радикалами, восстанавливая их до исходного состояния. Таким образом, в конкретных экспериментальных условиях существует определенная вероятность как реакции электрона с молекулами матрицы, так и с катион-радикалами. Соотношение этих вероятностей определяет скорость образования радикалов в наших образцах при 77 К.

Влияние суммарного ионного заряда белка на скорость образования свободных радикалов

Эффект возрастания скорости фотореакции образования радикалов еще резче проявляется в белках, где суммарный нескомпенсировашшй отрицательный эаряд значительно больш. Зависимость от рН начальной скорости образования радикалов, УФ-индуцированных при 77 К в РНКаэе и в сывороточном альбумине быка (САБ) представлена на рис. 3. Подобные зависимости были подучены для папаша, оС-химотршсиногена и сывороточного альбумина человека (САЧ).

В области значений рН 3-9 исследованию ыашэ белки образует димеры, которые при рН < 2 и рН > 10 распадаются на шяомэры(гл. Б). Таким образом, как в области кислых, так и в области щелочных значений рй увеличение начальной скорости реакции в два раза определяется увеличением в два раза концентрации независимо ионизирующихся хромофоров. Однако при щелочных значениях рН величина Удвозрастает в 24 раза (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость от рН начальной скорости накопления радикалов в застеклованных (77 К) растворах РНКаэы (1) и сывороточного альбумина быка (2) при УФ-обдучении.

Результаты, полученные на ароматических аминокислотах и пептидах, позволяют сделать вывод, что дополнительное увеличение У^в 12 раз обусловлено появлением нескомпенсированного отрицательного заряда молекулы белка.

В РНКаэе, папшгае, оС-хиыотрипсиногене, САБ, САЧ при вначеиия

+

рН > 10 происходит депротонизация -Ш3-групп лизина (число которых в этих белках равно, соответственно, 10, 9 , 13, 68, 60) и увеличение, таким образом, нескошенсированного отрицательного заряда молекул.

Десятикратное увеличение скорости образования радикалов показывает, что при нейтральных значениях рН уход*элактрона от катион-радикала имеет место только в 10% случаев. В 90X случаев после ионизации происходит рекомбинация электрона и катион-радикала. Появление достаточного по величине суммарного отрицательного варяда при щэлочных значениях рН приводит в конце концов к тому, что каждый электрон после ионизации покидает молекулу белка. Рекомбинации электрона и катион-радикала не происходит.

ГЛАВА IV. ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ В УФ-ОБЛУЧЕННЫХ БЕЛКАХ

Чрезвычайно низкое значение предельной концентрации свободных радикалов по сравнению с концентрацией ароматических аминокислотных остатков объясняется аффективным переносом энергии синглетно-воэбуж-денных состояний хромофоров бедка на образовавшиеся радикалы по индуктивно-резонансному механизму.

Вопрос о природе радикалов - акцепторов энергии - также не исследован. Нами была поставлена задача провести анализ акцепторных свойств свободных радикалов разных типов, возникающих в белках при УФ-облучении.

Исследование спектральных характеристик аминокислот, пептидов и белков при УФ-обяучении £77

Практически во всех белках физические и химические фотопроцессы определятся остатками триптофана и тирозина. Рассмотрим возможную роль продуктов фотолиза остатков этих аминокислот в переносе энергии по индуктивно-резонансному механизму и тушении люминесценции. Из трех необходимых условий протекания переноса анергии два в нашем случае выполняются. Во-первых, в белках в отсутствии тушителей всег-

да наблюдается УФ-индуцированная люминесценция триптофанила и/или тирозилз, и, во-вторых, среднее расстояние между соседними остаткам! этих аминокислот составляет «->1,5 нм, что существенно меньше расстояний, на которые возможна миграция энергии в рассматриваемом случае.

Третьим необходимым условием миграции энергии го индуктивно-ре-эонансному механизму является перекрывание спектров флуоресценции донора и спектра поглощения акцептора энергии. Скорость миграции энергии пропорциональна значению интеграла перекрывания этих спектров.

Нами проведен анализ спектральных характеристик свободных радикалов, возникающих в белках при действии ультрафиолетового излучения, с целью выяснения возможности их участия в качестве акцепторов анергии в переносе ее по индуктивно-резонансному механизму от ароматических аминокислотных остатков в синглетно-возбужденном состоянии.

Необходимо отметить, что абсорбционные и люминесцентные характеристики твердых растворов ароматических аминокислот и растворов их радикалов совпадают или отличаются незначительно от таких характеристик соответствующих аминокислотных остатков в белках.

Показано, что перекрывание спектра флуоресцепции тирозина со спектрами поглощэния ион-радикалов и радикалов тирозина и триптофана больше, чем со спектром поглощения триптофана. Таким образом, в белке после УФ-обдучения анергия электронного возбуждения остатков тирозина может мигрировать по индуктивно-резонансному механизму на ра-+ • •

дикалы три , три и тир . Эффективность этой миграции, видимо, больше эффективности миграции с тирозила на триптофанил.

Показано, что перекрывание спектра флуоресценции триптофана со

спектрами поглощэния ион-радикалов и радикалов тирозина и триптофана существенно больше, чем со спектрами поглощения триптофана и тирозина Таким образом, в УФ-облученном белке энергия электронного возбуждения остатков триптофана может эффективно мигрировать на радикалы + •

три , три и тир .

Нами показано, что при УФ-облучении застеклованных растворов белков заактированный электрон покидает белковую молекулу и захватывается акцепторными молекулами в матрице. Были исследованы стеклую-

-Ч

щиеся растворы РНКаэы и сывороточного альбумина человека (2*10 Ю в смеси воды с этиленгликолем (1:1 по объему). При добавлении в раствор белка глицина в спектре появляются линии триплетного спектра ЭПР, характерного для радикала глицина, образующегося при захвате электрона и последующем дезамшировании. Увеличение концентрации глицина ведет к росту вклада триплетного спектра ЭПР при уменьшении исходного спектра. Б крайнем случае интегральная интенсивность триплетного спектра близка к половине полной интегральной интенсивности. Это означает, что практически все электроны покидают молекулу белка и захватываются молекулами глицина. Предельное количество радикалов в образце при этой не меняется. Видимо, радикалы, образующиеся в матрице в результате захвата электронов, не оказывают влияния на дальнейшее образование радикалов в белке.

Таким образом, в истинном растворе белка после УФ-облучения

+ .

оконечными акцепторами энергии становятся радикалы три , три и тир . Эти радикалы не люминесцируго, возбужденные состояния в них дезактивируются безизлучательно. Энергия электронного возбуждения не может с этих радикалов переноситься на другие акцепторы. Итак, для белков.

+ • •

в которых УФ-иидуцированы радикалы три , три и тир пути переноса

энергия можно представить следующим образом:

+

три--^»-три

тир"-

В агрегатах белгоьух уюаакуа жжтаануга аршигтиасгах аминокислотных остатков, образование катион-радикалов и их последующие фото- и термореакции протекают, видимо, также как в истинных растворах белков. Однако вероятность захвата эжекгированного электрона акцепторными группами белка в белковых агрегатах возрастает.

Показано, что радикалы -Б-Б могут конкурировать в системе миграции энергии в белке с радикалами три , три и тир . Однако, кванто-

• + •

вый выход радикалов -Б-Б- на порядок меньше, чем радикалов три , три или тир. Это снижает участие радикалов -Б-Б- в общей миграции энергии в крупном белковом агрегате.

Перекрытие спектров поглощения основных радикалов пептидной цепи, возникающие в ходе фотопревращэний анион-радикалов пептидной

группы со спектрами флуоресценции тирозина или триптофана, мень-

+

ше.чем спектров поглощения радикалов три, три, тир.

Радикалы пептидной цепи типа И-СО при действии света с Л >БООнм

превращаются в радикалы типа -СШНСШ?. В области 300 - 400 нм ради-«

калы Я-СО не имеют существенного поглощения и, таким образом, не могут выступать в качестве акцепторов анергии возбуждения ароматических аминокислотных остатков.

Итак, сопоставление степени перекрытия спектров флуоресценции основных хромофоров белков с их спектрами поглощения и со спектрами

поглощения УФ-индуцированных в белках радикалов показывает, чло в истинных растворах: бежав основными акцепторами энергии являются катион-радикалы и продукты их превращений. Б крупных белковых агрегатах акцепторами энергии являются также основные анион радикалы и продукты их превращений. Рассмотренные радикалы не обладают люминесценцией. Это приводит к тому, что энергия возбужденного состояния любого ароматического аминокислотного остатка прямо или через другие ароматические остатки мигрирует в конце концов на радикалы и превращается в тепло.

Перенос анергии на радикалы триптофана и тирозина Эффекты, связанные с миграцией энергии в белках, являюгся интегральными, в них дают вклад все ароматические аминокислотные остатки и радикалы разных типов. Нами изучен перенос энергии электронного возбуждения триптофана и тирозина на УФ-индуцированные радикалы этих аминокислот при 77 К

На рис. 4 приведена зависимость ш от концентрации хромофора.

Зависимость для раствора триптофана измерена при рН 1, для раствора

-з

тирозина при рН 12. При С < 10 М ш 2. Этот результат означает, что все молекулы хромофора ионизованы. Каждая ионизация привела к образованию двух радикалов- катион-радикала и радикала, возникшего в результате реакции электрона с молекулой спирта (Пшежецкий С. а ,1972).

е- + ОНСН^СН^ОН-Н + 0НСНгСН20" (1)

Н + 0НСН2СНА0Н-Н + ОНСНСНдОН (2)

-3 -3

Б области 2*10 > С > 10 М значение ш уменьшается до величины,

-а

близкой к единице и далее не меняется до С = 10 М (рис. 4).

/и,Я

X

О О

о

'X,

-5

-3

-2

Рис. 4. Зависимость предельного числа радикалов (ш), приходящихся на одну, молекулу хромофора (1, 2), начальной скорости тушения флуоресценции (3) и начальной скорости образования радикалов (4) от концентрации хромофора для триптофана при рН 1 в-водно-глицериновом (1, 3) и для тирозина при рН 12 в водно-зтиленгликолэвом рзетво-ре (2, 4).

Рассмотрим возможные причины снижения значения т в два раза. Во-первых, к такому аффекту мог бы привести перехват заактированных электронов соседними молекулами ароматической аминокислоты. Во-вторых, к снижения значения т в два раза мог бы привести перехват соседними молекулами хромофора атомов Н, обрвзущихся в реакции (1). В двух этих случаях образующиеся радикалы ароматической аминокислоты

перестают люминесцировать и теряют способность к УФ-ионизации.

л

В-третьих, можно предположить, что при С > 10 М молекулы хромофора в растворе образуют димеры. Ионизация одной молекулы приводит к тому,

что анергия со второй эффективно мигрирует на образовавшийся катион-радикал. Иониеацга второй молекулы, таким образом, предотвращается.

-з _з

Во всех трех случаях при переходе от С < 10 и к С > 2*10 М

нужно было ожидать постоянства начальной скорости образования радикалов и увеличения в два раза начальной скорости тушения люминесценции. Однако, начальная скорость тушения флуоресценции и фосфоресцен-

-ц

ции остается постоянной для 10 < С < 10 М, а начальная скорость

-3 -3 I

образования радикалов в области 10 > С > 2*10 'уменьшается примерно вдвое (рис. 4). Таким образом, три первых гипотезы оказались неверными.

-3

Полученный аффект можно объяснить тем, что при С > 10 М образующиеся в реакции (1) атомы Н, по-видимому, преимущественно реагируют друг с другом. Стабильными остается только катион-радикалы и значение т становится равным единице. Изменения скорости тушения флуоресценции в атом случае быть не должно, а начальная скорость образования радикалов должна уменьшиться в два раза, что и имеет место (рис. 4). Первая ступенька на зависимости т от С и снижение начальной скорости образования радикалов имеют место в одной и той же области С. Это связанные явления, два проявления одного и того же процесса. Только реакция атомов водорода объясняет все полученные экспериментальные результаты.

-3

Добавление в раствор ароматической аминокислоты (2*10 М) в качестве акцептора электрона глицина (1 и) привело к увеличению значения ш до 1,7. Этот результат подтверждает наш предположение о причине уменьшений значения ш.

- 21 --3

Таким образом, при С > 2*10 и в образце стабилизируются в основном радикалы ароматической аминокислоты.

~г

Снижение значения ш при С > 10 М (рис. 4) объясняется тем, что при высоких значениях концентрации расстояния между молекулами становятся достаточно малыми для эффективной миграции энергии по индуктивно-резонансному механизму с молекул ароматической аминокислоты на радикалы этих молекул, образовавшиеся при УФ-облучении. Действительно, в надам случае выполняются все условия, необходимые для эффективной миграции. Ароматические аминокислоты, выступающие в качестве доноров энергии, обладают флуоресценцией, т. е. время лизни их в синглетном возбужденном состоянии достаточно для того, чт'обы произошла миграция энергии. Спектр поглощения катион-радикала ароматики шш радикала, образующегося в результате депротонирования ион-радикала, хорошо перекрывается со спектром флуоресценции исходной молекулы как для триптофана, так и для тирозина И, наконец, при увели-

-а -1

чении концентрации от 10 до 10 М среднее расстояние между молекулами меняется от 5,5 до 2,6 нм. Миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму может осуществляться и на бодышэ расстояния.

На рис. Б приведены оптические спектры поглощения водно-глицеринового раствора триптофана при 77 К с предельной концентрацией УФ-индуцированных свободных радикалов.

При концентрации Б*10 Ы исходный спектр исчезает полностью,

-я

наблюдается только спектр продуктов фотолиза. При концентрации 6*10 Ы исходный спектр уменьшается при выходе на предельную концентрацию примерно в 2 раза. Половина молекул триптофана остается в исходном состоянии. Доля исходных молекул, не участвующих в фотопревращэниях,

Рис. 5. Спектры поглощения водка-глицершэвого (1:1 по объему) раствора (рН 1) триптофана 5*10 М (1,3) и 5*10 ¡1 (2) при 77 К до (3) и после УФ-облучения до накопления предельной концентрации радикалов (1,2).

растет с ростом концентрации ароматической аминокислоты. Однако, флуоресценция тушится полностьо. Ход тушения хорошо коррелирует с накоплением свободных радикалов. Начальная скорость тушения флуоресценции при С > 10"АМ возрастает, т. к. растет число молекул» флуоресценция которых тушится одним радикалом (рис. 4, Б). Эти эксперименты демонстрируют явления, происходящие в истинном растворе хромофора при 77 К. УФ-облучение приводит к образованию стабильных радикалов ароматической аминокислоты. Энергия электронного возбуждения молекул хромофора, находящихся достаточно близко от радикала, эффективно мигрирует на него и превращается в тепло. 1Ьлекулы хромофора, оказавшиеся в сфере эффективной миграции энергии на радикалы, защищены от ионизирующего действия УФ-излучения. Каков же радиус этой

-3 -2.

сферы? Как было показано выше, в диапазоне концентрации 3*10 -ЮМ ионизация каждой молекулы приводит к стабилизации при 77 К одного радикала ароматической аминокислоты. Радиус сферы эффективной миграции для определенной пары донор-ачцептор имеет вполне определенную величину. Ери некоторой концентрации радикалов сумма объемов всех

этих сфер будет равна объему образца. Такая ситуация складывается -г.

при С > 10 Ы. При дальнейшем росте концентрации предельное число радикалов в образце с постоянным объемом остается неизменным.

№

-I

Для С > 10 М имеем:

JL-rr^- JL-_v___t_•

3JU ~ й„р М-Ы ~ m-C-Va.'

Y--

где г - радиус сферы эффективной миграции; V - объем образца; предельное число радикалов в образце; N - число молекул хромофора в образце, ш - R/N, С - молярная концентрация хромофора.

Откуда получили гТри- 2,9+0,2 нм, 3,2+0,2 нм. Итак, ради-

усы сферы эффективной миграции энергии для пар три—*тр"и и тир—> тир имеют близкие значения. Значения г для триптофана и тирозина близки к значению радиуса сферы эффективной миграции для белков в крупных агрегатах (3,4 нм). Эта величина имеет одно и то же значение для белков класса А и В, что было не понятно. Результаты показывают, что радикалы триптофанйлов и тирозилов очень близки по свойствам в качестве акцепторов энергии возбуждения ближайших остатков ароматических аминокислот.

ГЛАВА V. НАКОПЛЕНИЕ УФ-ИВДУЦИРОВАНШХ РАДИКАЛОВ В БЕЛКАХ

С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ АГРЕГАЦИИ В крупных белковых агрегатах радикалы, возникшие в результате одной ионизации, аффективно защищают от действия УФ-излучения сферу с радиусом 3,4 нм. В такую сферу укладывается пептидная цепь с молекулярной массой ~ 120 кДа. В этом случае на 1 грамм сухого веса J9

белка приходится 10 радикалов.

Нами была поставлена задача исследовать предельную концентрацию свободных радикалов в истинных при 77 К растворах белков.

Влияние агрегации ароматических аминокислот, ароматических пептидов и белков на предельную концентрации УФ- индуцированных при 77 К свободных радикалов

Были исследованы триптофан, тирозин, глицил-триптофан, гли-цил-глутаминил-тирозин, рибонуклеаза панкреатическая, папаин.оС-хи-мотрипсиноген, сывороточный альбумин быка (CAB) и сывороточный альбумин человека (САЧ). Вещества растворяли в смеси равных объемов воды и этиле нг дико ля, которая хорош стеклуется при охлаждении.

В качестве модельных "нами были исследованы растворы ароматических аминокислот и ароматических пептидов в водко-этиленгдико левом растворе. Концентрация радикалов, которые образуются в процессе УФ-облучении этих соединений при 77 К, через некоторое время достигает предельного значения. Во всех случаях значение предельного числа радикалов, приходящихся на одну молекулу (швр - Rn/>/N) равно двум (Rn? - предельное число радикалов в образце, N - число молекул хромофора в образце).

Такой результат имеет место при любом значении'pH в диапазоне 1 - 12. Это означает, что действительно смесь воды с этиленгликолем (1:1) хорош стеклуется, и при 77 К мы имеем истинный раствор.

На рис. 6 приведена зависимость значения m от значения pH раствора РНКааы.

Рис. 6. Цредедьнов при 77 К число свободных радикалов (т „р ),

-Ч

приходящихся на одну молекулу РНКазы (4*10 Ы) в воде с этиленгликолем (1:1), при разных значениях рЕ

В области рН 3 - 9 шпр - 1,2. При рН < 2,5 и рН > 9,5 значение ¡^возрастает и стремится к двум. Как можно объяснить такую зависимость значения тг?от рН? Молекула РНКазы, имея Ым. 13,7 кДа, представляет собой глобулу с диаметром ~ 3,2 нм. Петли пептидной цепи молекулы РНКазы в четырех местах сшиты дисульфидными мостиками, так что даже при крайних значениях рН, когда молекула приобретает максимальный положительный или отрицательный заряд, глобула не может

существенно изменить свои размеры. Известна, что гидрофобные аминокислотные остатки, каковыми являются остатки ароматических аминокислот, располагаются ,в основном не на поверхности глобулы. Так что максимальное расстояние между ними в молекуле РНКазы меньше, чем 8,2 нм. Таким образом, при УФ-ионизации лзобого ароматического остатка, вся глобула попадает в сферу эффективной миграции энергии на образовавшиеся радикалы. В истинном растворе таких молекул предельное число радикалов должно равняться удвоенному числу молекул в образце. Такая ситуация действительно наблюдается в сильно кислых и щелочных растворах (рис. 6). Так же как и в модельных соединениях при этих значениях рН т„= 2.

При рН 3 - 9 молекулы РНКааы в исследуемом растворе при 77 К, видимо находятся в основном в виде димеров и радикалы, возникающие при первой ионизации, защищают от действия УФ-излучения весь димер. Димеры распадаются на мономеры при достижении суммарным положительным или отрицательным зарядом определенной величины. В щелочной области изменение заряда молекулы РНКазы происходит за счет депротони-вации Е -аминогрупп остатков лизина (рК*- 10,2), которых в каждой молекуле десять. В кислой области изменения заряда определяется карбоксильными группами остатков аспарагиновой и гдутаминовой аминокислот, которых в молекуле РНКазы в суше десять (рК*- 4,7).

Подобная зависимость тп? от рН была получена и для других исследованных нами малых белков (палата, с£-химотрипсиноген). Размеры этих белков превосходят размеры молекулы РНКазы. Пептидная цепь па-паина сшата в трех местах дисульфидными мостиками и о£-химотрипси-ногена - в пяти.

На рис. 7 приведены зависимости т пр от И. м. для белков в истинном растворе (рис. 7а) и в крупных агрегатах (рис. 76). Зависимость, приведенная на рис. 76, получена ранее для белков в водном растворе при 77 К В этом случае при замораживании происходит высаливание белка, сопровождающееся образованием крупных агрегатов.

Рис. 7. Зависимость предельного числа свободных радикалов (Шцр ), образующихся при 77 К в истинном растворе ароматических аминокислот, пептидов и белков о'т молекулярной массы:

1 - триптофан, глицил-триптофан, тирозин и глицил-глу-таминил-тирозин; 2 - РНКаэа; 3 - папаин; 4 - d-хиьо-трипсиноген; б - CAB; 6 - САЧ.

В крупных агрегатах радикалы, возникающие при одной ионизации, аффективно защищают от действия УФ-иэлучения все молекулы белка в сфере с радиусам 3,4 нм. ГЬэтому в атом случае для малых белковых

молекул значение т„р существенно меньше единицы. В случае истинного раствора таких хромофоров, как ароматические аминокислоты, пептиды и малые белки происходит одна ионизация в каждой молекуле. Значение ш в этих случаях равно двум. Таким образом, агрегация молекул приводит к уменьшению значения ш .' Эти изменения значительны. Так для РНКазы тПр уменьшается от 2 до 0,16. Значение тПр — 1, полученное наш для малых белков при рН 3 - 9, действительно, можно объяснить тем, что при этих значениях рН в смеси воды с этиленгликолем при 77 К преобладают димеры белковых молекул, фи ионизации одного из ароматических остатков образовавшиеся радикалы защищают от действия УФ-излучения обе молекулы. На две молекулы белка в димере могут образоваться только два радикала Итак, исследование малых (с Ни<30 кДа) глобулярных белков показало, что в истинных растворах в каждой молекуле, несмотря на больше число остатков ароматических аминокислот, происходит лишь одна ионизация и образуется два парамагнитных центра Эта величина, с одной стороны, остается неизменной при росте Ы. м. молекулы до 30 кДа. С другой стороны, при агрегации таких белковых молекул значения т ^ будет уменьшаться пропорционально степени агрегации. Степень агрегации, до которой такая зависимость сохраняется, зависит от и. м. молекулы-мономера Так для РНКазы эта зависимость будет сохраняться до степени агрегации 10, в случае

х. з

триптофана - до степени агрегации 10 - 10 .

Для белков с И.Ы. > 30 кДа в истинном растворе возникает возможность протекания двух и большего числа иониэаций. Это может происходить, если найдутся достаточно далеко расположенные остатки ароматических хромофоров. Так для истинных растворов исследованных нами

САЧ и САБ с И м. 69 кДа тПр близко к 4 (рас. 7), т.е. в каждой молекуле имеют место две ионизации. Для этих белков в агрегированном состоянии значение снижается в 2, Б раза.

Таким образом, измеряя предельное число радикалов, приходящихся на одну молекулу ароматической аминокислоты, ароматического пептида или белка, можно делать определенные выводы о степени агрегации этих молекул в исследуемом образце.

Определение предельной концентрации радикалов, УФ-индуцирован-ных в белках (метод ПКР), позволяет судить о состоянии белковых молекул: наблюдать агрегации-дезагрегацию, сворачивание-разворачивание пептидной цепи, расщепление молекулы на фрагменты.

Исследование методом ПКР растворимых белков хрусталиков

мышей в норме и при катаракте

В настоящей работе определено относительное изменение концентрации растворимых белков, экстрагированных из гомогенатов нормальных и катарактальных хрусталиков мышей.

Для определения относительной концентрации и относительной степени агрегации молекул экстрагированного белка совместно с методом абсорбционной спектрофотометрии использовали метод измерения предельной концентрации УФ-индуцированных радикалов (метод ПКР).

Сопоставление величин оптической плотности при длине волны 280 нм показывает, что при развитой катаракте концентрация экстрагированного белка снижается примерно в 10 раз.

Значение предельной концентрации УФ-индуцированных свободных радикалов в водно-эгиленгликолевом застекдованном растворе для

экстракта из катарактальяых хрусталиков снижается также примерно в 10 раз по сравнению с нормой. Совпадение результатов, полученных методом абсорбционной спектрофотометрии и методом ЕКР показывает, что 902 водорастворимого белка нормального хрусталика оказываются связанными в хрусталике при развитии катаракты. МЬжно также сделать вывод, что олигомерный состав водорастворимых белков в норме и при катаракте примерно одинаков.

I

ГЛАВА VI. ВЛИЯНИЕ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НА КИНЕТИКУ ГИБЕЛИ УФ-ИНДУЦИРОВАННЫХ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В БЕЛКАХ Была поставлена задача исследовать рекомбинационно-кинетическим методом вторичную структуру белков из тканей, в которых предполагалась перестройка вторичной структуры белков в результате протекания нормальных или патологических процессов.

Вторичная структура коллагена 1_ из кожи холоднокровных животных Для коллагена I из кожи разных холоднокровных животных была исследована зависимость доли УФ-индуцированных при 77 К радикалов (1М ), участвующих в медленной реакции гибели, от значения рН раствора. На рис. 8 приведена зависимость 1и от значения рН для водного раствора коллагена I иэ кожи речной камбала В исходном растворе с рН 4,3 IM - 17Х. Титрование раствора соляной кислотой приводит к уменьшению 1м до 2X при рН 1,5. Титрование раствора коллагена NaOH, начатое с любого значения рН не приводит к существенному изменению значения (рис. 8). Для коллагенов ив кожи других холоднокровных животных рН-аависишсти параметра 1м , количественно характеризующего вторичную структуру, имеют аналогичный вид.

Рис. 8. Изменение вторичной структуры коллагена из коли речной камбалы при изменении рН раствора. Стрелки показывают направление изменения рЕ 1м - параметр, равный доле пептидной цепи, не входящей в тройную суперспираль

В случае> коллагена заряженные группы всегда располагаются вдоль оси молекулы и направление сил кулоновского взаимодействия между ними практически совпадает с направлением оси. Известно, что при высушивании вторичная структура коллагена нарушается. Высокие аначения 1м на образцах, полученных путем растворения сухого препарата коллагена, по-видимому, объяснятся именно этим. Наш результаты позволяют сделать вывод, что возникшие при высушивании дефекты в структуре спирали молекулы коллагена не восстанавливаются полностью после растворения при рН в области ИЭТ. Однако, растяжение молекулы, которое появляется при уменьшении значения рН из-за кулоновского отталкивания положительных зарядов способствует реставрации мест молекулы с нарушенной структурой тройной суперспирали.

Реставрация спирали коллагена имеет шсто и в том случае, если после растворения рН раствора увеличить примерно до рН 10. Переход для коллагена из кожи тиляпии начинается при рН 9,5, т.е. вблизи от рК аминогруппы. Однако, измерения при щелочных значениях рБ затруднены из-за аагустевания раствора.

Из сказанного выше следует, что если коллаген при получении не подвергать высушиванию, структура его молекулы не должна нарушаться. Действительно, эксперименты на коллагене, выделенном из кожи карпа без этапа высушивания, показали, что при рН 4,7 ! I- (2,4 + 1)&. Эти результаты подтверждают сделанный вывод о том, что именно деструкция молекул коллагена при лиофильном высушивании является причиной высоких значений 1М при рН 4-6.

Интегральная характеристика вторичной структуры растворимых белков из нормальных и катаракгальиых хрусталиков мышей РК-методом показано, что интегральная характеристика вторичной структуры водорастворимых белков из хрусталика мышей не меняется при развитии катаракты.

- 33 -

основные вывода

I. Обнаружено многократное увеличение скорости образования УФ-индуцированных в аминокислотах пептидах и белках при 77 К свободных радикалов в случае, если молекулы этих соединений после ионизации имеет отрицательный суммарный ионный заряд.

II. Показано, что в УФ-облученных при 77 К белках эффективность переноса энергии электронного возбуждения остатков тирозина и триптофана на радикалы три", три , тир больше, чем на неповрежденные ароматические аминокислотные остатки.

III. Радиус сферы эффективного переноса энергии по индуктивно-резонансному механизм на УФ-индуцированные при 77 К радикалы триптофана и тирозина составляет 2,9 и 3,2 нм, соответственно. Близость значений этих величин объясняет совпадение масштабов миграции энергии в белках класса А и В при УФ-облучении.

IV. Показано, что в эастеклованных растворах ароматических аминокислот, пептидов и белков предельная концентрация УФ-индуцированных при 77 К свободных радикалов уменьшается пропорционально степени агрегации. Предложен метод определения степени агрегации этих соединений.

V. Показано, что рекомбинационко-кинетический метод правильно определяет вторичную структуру.

1. Модифицированным РК-методом определена степень спиральности коллагена I из кожи холоднокровных животных. Установлено, что при лиофильном высушивании вторичная структура коллагена сильно нарушается и восстанавливается в растворе только при смещении значения pH в кислую область.

2. Модифицированным РК-методом показано, что вторичная структура растворимых белков из хрусталика глаза мышей в норме и при катаракте остается неизменной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Львов К И , Бекмурзаев Е11 Накопление УФ-индуцированных радикалов в белках с разной степенью агрегации // Биофизика. - 1990. -Т. 36. - С. 421424;

2. Львов К. 11, Бекмурзаев Б. 11 Влияние заряда молекул ароматических аминокислот, пептидов и белков на скорость образования радикалов при УФ-облучении // Биофизика - 1990. - Т. 36. - С. 564-Б67;

3. Львов К. 11, Бекмурзаев Е11 Природа тушителя люминесценции в УФ-облученных бедках // Биофизика. - 1990. - Т. 35. - С.568-Б72.

4. Львов К. 11, Бекмурзаев Б. 11 Эффективность индуктивно-резонансного переноса энергии на радикалы триптофана и тирозина // Биофизика - 1991. - Т. 36. - С. 244-247.

Б. Шведова к. А., Львов К. 11, Полянский Е Б., Бекмурзаев Е11 Исследование растворимых белков хрусталиков мышей в норме и при катаракте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - N 6. - С. 609-610.

6. Львов К. 11, Бекмурзаев Е11, Андреева А. П. Вторичная структура коллагена I ю кожи холоднокровных животных // Биофизика -1991. - Т. 36. - В печати.