Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания"
На правах рукописи
□03494579
Сивожелезов Виктор Семенович
Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания
03.01.02 Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой стспсии доктора биологических паук
2 5 мд? 2010
Пущиио-2010
003494579
Работа выполнена в Учреждении российской академии наук Институте биофизики клетки РАН
Консультант:
Доктор физико-математических наук Роберт Валентинович Полозов
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Станислав Владимирович Никонов Доктор биологических наук Александр Владимирович Веселовский Доктор физико-математических наук Людмила Владимировна Якушевич
Ведущая организация:
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова
Защита состоится 15 апреля 2009г. в 14:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН.
Автореферат разослан « ¿/.У » марта 2010г.
Общая характеристика работы
Актуальность темы обусловлена, с одной стороны, огромным массивом экспериментальных данных, подтверждающих важность влияния электростатических сил па скорость образования, конфигурацию и устойчивость функциональных комплексов макромолекул. Такие данные имеются и для мутаптпых белков с искусственно модифицированными заряженными аминокислотами. В частности, известно, что экспериментально определенные константы скорости взаимодействий белков могут на несколько порядков превосходить величины, ожидаемые в предположении случайных столкновений за счёт предварительной ориентации при сближении, обусловленной электростатическими взаимодействиями.
С другой стороны, актуальность темы обусловлена фундаментальными свойствами электростатических полей, специфически организованных в биологических системах. Одним из таких свойств является наличие знака у электростатических зарядов и потенциалов, которое усиливает физиологически значимые контакты между макромолекулами и препятствует нежелательным, приводящим к беспорядочному слипанию биомолекул (агрегации). Другим свойством является дальнодействие, благодаря которому, начиная с некоторых расстояний, электростатические силы оказываются единственными силами, действующими между биологическими макромолекулами. Биологически значимой особенностью электростатических систем является также неустойчивость любых систем электрических зарядов (теорема Ирпшоу), которая способствует динамичности молекулярных комплексов, их способности к изменению организации. Кроме того, энергия электростатического поля в диэлектрике является свободной энергией, то есть включает как энтальпийую, как и энтропийную составляющую. Из-за аномальной температурной зависимости диэлектрической константы воды (е~1/7) следует, что энтропийная составляющая электростатической свободной энергии в воде преобладает над эптальпийпой, так как сближение сильно сольватированных в воде противоположных зарядов приводит главным образом к высвобождению молекул воды из сольватных оболочек в объём. Таким образом, электростатические взаимодействия в воде
энтропийно выгодны, так же как и гидрофобные взаимодействия. Поэтому распространенная точка зрения об исключительно гидрофобной природе аффинности белок-белковых комплексов нуждается в уточнении. Электростатические взаимодействия могут определять аффинность связывания заряженных биополимеров, что подтверждено наличием чисто электростатических функциональных белковых комплексов.
Целью работы было определить, какие именно характеристики электростатических полей вокруг макромолекул определяют вклад электростатических сил в молекулярное узнавание белами других белков и ДНК. В работе было выдвинуто и доказано предположение, что такими характеристиками являются односвязные области положительного и отрицательного потенциала - так называемые лоскуты (в англоязычной литературе patches; в топологии - это одпосвязпая область, ограниченная замкнутой кривой, в молекулярной биологии — область поверхности белка), и были исследованы их связи со структурой, функцией и эволюцией белков. Кроме того, исследованы электростатические потенциалы вокруг нуклеиновых кислот, где также обнаружены электростатические лоскуты.
В диссертации были поставлены следующие задачи:
1) Изучить зависимость электростатических потенциалов и полей белков от геометрической формы диэлектрической границы между молекулой и растворителем, а также дисперсии диэлектрической проницаемости растворителя.
2) Определить эффективные размеры и заряды белков, рассматриваемых как однородно заряженные частицы, из экспериментальных значений аффинностей и скоростей их комплексообразовапия при разных ионных силах.
3) Вычислить распределения электростатического потенциала вокруг белков и сравнить их с определенными из задачи 3) параметрами.
4) Сравнить распределения электростатического потенциала в нескольких семействах белков, определить инвариантные области (лоскуты) потенциала внутри каждого из семейств и исследовать инвариантность образующих эти лоскуты заряженных аминокислот.
5) Вычислить и сравнить электростатические потенциалы нромогорных ДНК, изучить их вклады в ДНК-белковое узиаваиие в зависимости ог степени конденсации нротивоиопов.
6) Исследовать роль электростатических потенциалов ДНК в ДНК-белковом узнавании, включая и стадию формирования атом-атомпых ДНК-белковых контактов.
7) Вычислить электростатические потенциалы транспортных РНК, оцепить величины конденсации нротивоиопов па поверхности тРНК и влияние поля тРНК на заряды гистидиповых остатков амипоацил-тРНК сиптетазы при се связывании с тРНК.
8) Изучить, насколько электростатическое поле сильно заряжеппогог полимера может изменить скорость взаимодействия присоединенного к полимеру фермстпа с ингибитором, заряженным противоположно по отношению к полимеру.
Научная новизна и значимость работы заключается в том, что лоскуты электростатического потенциала впервые введены здесь как параметры молекулярного узнавания на характерных расстояниях около 5 Л от молекулярной поверхности биомакромолекул, которые относятся к чисто электростатической стадии молекулярного узнавания. Эти расстояния задаются границей второй гидратпой оболочки (~5 А), дсбаевским радиусом экранирования при физиологическая ионная силе (8 А от зарядов) и бьёррумовой длиной при низкой ионной силе (7 А) - расстоянием, на котором два элементарных заряда в воде взаимодействуют с энергией, равной энергии теплового движения.
Эти расстояния обоснованы также тем, что уравнение Пуассона-Больцмана теряет смысл из-за корреляций и флуктуаций в положениях нротивоиопов и молекул воды, а также квантовых эффектов. На расстояниях же, больших 5-7 А, энергия электростатического поля становится сопоставимой с энергией теплового движения, и поле не может вносить существенного вклада в узнавание. До настоящей работы в биологической литературе подобные лоскуты вычислялись непосредственно па молекулярной поверхности белков, но из-за
неопределенностей, вносимых указанными эффектами, трактовать их физико-химическую природу не удавалось.
Наличие лоскутов выведено из экспериментальных зависимостей аффинностей белковых комплексов и скоростей их образования от ионной силы. Впервые обнаружено специфическое (функциональное) распределение лоскутов вокруг биополимеров. Если функция гомологичных белков идентична, то лоскуты вокруг них консервативны. Однако те заряженные аминокислоты, которые образуют лоскуты, не всегда являются консервативными. В отличие от консервативных аминокислот, ответственных за пространственную структуру белков, аминокислоты, образующие лоскуты, "консервативны" лишь настолько, настолько это необходимо для консервативности лоскута, но не обязательно консервативны в первичной структуре белка. Из этого следует, что электростатические поля являются тем физико-химический фактором, который подвержен эволюционному отбору, а сами лоскуты являются эволюционно обусловленной характеристикой. Наличие лоскутов оказалось достаточным для ранней стадии молекулярного узнавания, в противоположность необходимости электростатической комплементарности аминокислот контактирующих белков для узнавания, предполагавшейся ранее. Для ряда белков, а также для ДНК в В-форме, показан фокусирующий эффект потенциала на приближающийся партпер-биомакромолекулу. Новым в методическом отношении является применение распределенных вычислений для расчетов электростатических потенциалов ДНК, белков и их комплексов. Кроме того, в рамках работы разработан высокоэффективный вариант многосеточного конечно-разностного метода для расчета электростатических потенциалов не только глобулярных (цитохромы, ДНК-связывающие белки), но и протяженных структур, например вытянутых (промоторные ДНК) и сплющенных (мембраны, тРНК).
Биологическая значимость лоскутов проявляется в ориентации и фокусировке биомолекул в поле других молекул при их сближении, нейтрализации зарядов фосфатов ДНК зарядами аминокислот лизина и аргинина, одномерной диффузии заряженного белка вдоль цепи заряженного полимера, индукции полем транспортной РНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе и других явлениях, изученных в настоящей диссертации.
Основными положениями, выносимыми на защиту, являются:
1) Наличие характеристического параметра поля вокруг макромолекулы -электростатического лоскута, важного для межмолекулярного узнавания.
2) Инвариантность размера, формы и положения электростатических лоскутов в семействах белков даже при отсутствии инвариантности в их первичных структурах заряженных аминокислот, образующих лоскуты, и следующая отсюда эволюционная обусловленность электростатических потенциалов белков.
3) Анизотропия электростатических потенциалов промоторных ДНК в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, отличающая не только промоторпые ДНК от периодических, но и промоторы один от другого, а также участки промоторов друг от друга.
4) Двойственность функции фосфатов ДНК при образовании атом-атомных контактов в системе гомсодомсн-ДНК: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиповыми и аргинииовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов.
5) Почти полное отсутствие конденсации противоиопов па транспортных РНК в отличие ог двуспиральпых ДИК из-за различия в их геометрии. Как следствие, дополнительная индукция электростатическим полем тРНК зарядов па амипоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гистидипов для специфичности и надёжности узнавания.
Практическая значимость настоящей работы обусловлена необходимостью понимания механизмов электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот для создания белков с заранее заданными свойствами. Это особенно касается иммобилизации белков, лежащей в основе биосенсорных технологий. В частности, был выполнен расчет электростатических взаимодействий, обеспечивающих ускорение реакции фермента трипсина с его ингибитором путём иммобилизации трипсина на поликатионпой матрице. Результаты этого расчёта подтвердились экспериментально - константу скорости удалось увеличить более чем на два порядка. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот
составляет основу предсказаний свойств нековалентио иммобилизованных белков, являясь тем самым одним из направлений в новой междисциплинарной области науки - вычислительной бионанотехнологии.
Апробация результатов работы и публикации. Материалы, включенные в настоящую диссертацию, докладывались на Международной конференции по биосепсорам и биокомпыотерам (Санта-Клара, США, 1988), 11 Международной конференции по молекулярной электронике и биокомпыотерам (Москва, 1989), Международной конференции по вычислительной математике "CSAM-93" (Петербург, 1993), конференции по информационно-вычислительным технологиям "ИВТН-2002" (Москва, 2002), III съезде Российского биохимического общества, (С.-Петербург, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной научной школе "Quantum Physics and Communication" (Дубна, 2005), двух Международных научных школах «ELBA Nanoforum» - «Proteome: Technologies And Applications» (Портоконте, Италия, 2007) и «Nanotechnology And Nanobioelectronics» (Генуя, Италия, 2009), Международной конференции по распределенным вычислениям GRID2008 (Дубна, 2008), Международной конференции по математическому моделированию и вычислительной физике ММСР-2009 (Дубна, 2009).
Работы по теме диссертации поддерживались грантами Государственного комитета по науке и технике СССР (1989-1990 гг., проект № 89), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 94-04-12471, 96-04-48778, 07-0700234).
По теме работы имеется 56 публикаций, в том числе 33 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Работа состоит из Введения, Литературного обзора, раздела «Методы», раздела «Результаты и обсуждение» (7 глав), Заключения, Выводов и списка литературы (178 наименований). Полный объём работы составляет 186 страниц, число рисунков-31, таблиц - 12.
Содержание работы
Во Введении указано место настоящей работы на стыке теоретической молекулярной биофизики и структурной биоинформатики, и на этой основе дано
обоснование выбора объектов исследования. Вкратце, для исследования из числа белков выбраны гембелки, ферменты и ДНК-связывающис белки, потому что вклад электростатических взаимодействий в узнавание с их участием показан наиболее четко, причем изучены несколько гомологов каждого белка. Рассмотрены также ДНК и РНК, являющиеся сильными полиэлсктролитами. Из ДНК-связывающих белков выбраны гомеодомсны и сигма-субъединицы РНК-полимсразы, отличающиеся в функциональном, структурном и эволюционном аспектах. Из нуклеиновых кислот выбраны длинные промоторные ДНК как пример протяженных структур и транспортные РНК как пример квазиглобулярной сплющенной структуры.
В Литературном обзоре, во-первых, изложены имеющиеся по каждому из объектов настоящего исследования теоретические и экспериментальные предпосылки изучения электростатических полей биомакромолскул как факторов молекулярного узнавания. Во-вторых, описаны теоретические подходы к задачам моделирования этих полей и их связи с экспериментально определенными параметрами межмолскулярного узнавания.
В разделе «Методы», состоящем из б подразделов, представлены: 1) Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг молекулы белка или нуклеиновой кислоты с учетом геометрической формы молекулы и больцмановского распределения ионов в растворителе. Это необходимо для адекватной, по крайней мерс на расстояниях больше 5 А от молекулярной поверхности, оценки экранировки электростатических полей вокруг всех биомакромолскул, рассмотренных в настоящей диссертации. Расчёт электростатического потенциала проводился путем решения уравнения Пуассона-Больцмана
- ?(*(?)??(?)) = 4я(л(г) + дШ) (1)
где ф - потенциал, е -диэлектрическая проницаемость, ро- плотность зарядов атомов молекулы, для которой будем использовать выражение (где г,-, заряд /-
го заряженного атома молекулы, г, - радиус-всктор этого атома, е - элементарный заряд), р1 схр(-2,ечЛ|)7) - плотность зарядов ионов (где n¡ - концентрация
ионов <-го типа, г,- - заряд иона /-го типа. Уравнение (1) нелинейное, т.к. член р[ в правой части содержит неизвестный потенциал под экспопсптой. Граничное
условие для потенциала определяется тем, что на достаточном удалении от белковой глобулы потенциал не зависит от диэлектрической проницаемости внутри глобулы. Поэтому для численного решения бесконечную область заменим достаточно большим параллелепипедом Г, на границе которого примем
Использовались два варианта зависимости диэлектрической проницаемости от координат:
1) Постоянная диэлектрическая проницаемость во всей области;
2) Ступенчатая зависимость:
где ср, е8 - диэлектрические проницаемости белка и воды, т - радиус-вектор ближайшего атома белка, го - средний радиус этого атома белка плюс эффективный радиус молекулы растворителя (принят равным 1.4 Л).
Применение к уравнению (1) с учётом (2) и (3) метода Галеркииа [Федоренко, 1994] приводит к линейной алгебраической системе уравнений для определения коэффициентов и:
которое решается многосеточным методом, в котором высокочастотные (быстро меняющиеся) компоненты поправки к текущему приближению решения ищутся на мелкой сетке, а для вычисления соответствующих гладких компонент используются более грубые сетки. Решение системы линейных уравнений на сетке L ищется итерациями с использованием вспомогательных сеток 0,/,-] (0- наиболее грубая сетка). На каждой итерации задача сводится к меньшей системе на сетке LA, для решения которой рекурсивно применяется тот же алгоритм. Критерием окончания процесса решения является норма вектора невязки r=||/-ylu||, являющаяся оценкой ошибки вычисления потенциала. В наших вычислениях она составляет менее 0,001 кцТ/е. Вышеописанный метод лежит в основе разработанного нами оригинального программного обеспечения, реализованного
(2)
(3)
Au=f
(4)
как на индивидуальных процессорах, гак и в распределённой вычислительной срсде типа ГРИД. Программное обеспечение позволяет рассчитывать потенциалы как глобулярных, так и протяженных (вытянутых и сплющенных) структур.
2) Вывод выражений для напряженности электростатического поля с учетом структуры растворителя. основанный на формализме "нелокальной электростатики" т.е. при соотношении между электрическим смещением и напряженностью ноля, заданном в интегральном виде. Эти выражения используются для учета структуры растворителя при моделировании взаимодействия цитохрома С с мембраной. Было использовано основное уравнение электростатики, связывающее электрическое смещение Ь с полем Е
«Ну б(г) = 4тгр(г) (5)
где р - плотность заряда. Оно традиционно решается в предположении пропорциональности электрического смещения полю:
б(г) = б(г)£(г) (6)
где е - диэлектрическая константа. Последнее предположение означает, что диэлектрический отклик элемента объема на приложенное поле определяется только поляризацией этого элемента объема. В случае ориептационной поляризации каждый постоянный диполь среды будет ориентирован вдоль ноля. Это будет не так для взаимодействующих друг с другом диполей, ориентация которых будет зависеть от ориентации соседних диполей. Такая зависимость в нелокальном формализме решения задач электростатики учитывается соотношением между О и Е в виде
д(г)=1К(г,г')Ё(г')аг' (7)
где функция отклика К характеризует взаимную зависимость ориентации диполей. В изотропной среде
К(г,г')=Цг-г\) (8)
причем К становится постоянной для больших |л* — , что отражает малость корреляции па больших расстояниях, так что в последнем случае вместо уравнения (7) имеем (6). Решение уравнения (5) с учётом (7) и (8) даёт выражение для поля однородно заряженной плоскости, в зависимости от расстояния с! от нее
= -УОмр(-«*/Л) + 1/*,] (9)
ЕЧ
где Л=5А, е/=6 и б.,=80 - длина корреляции диполей воды и диэлектрические константы в отсутствие и присутствие ориентационной поляризации соответственно.
3) Методика расчета эффектов модификации лизиновых групп СМ С при его взаимодействии с мембранными белками. Эти выражения связывают вычисленную в предыдущем разделе напряжённость поля с наблюдаемыми значениями кинетических констант взаимодействия цитохрома С с мембраной. Модификация Су! С изменяет заряды групп на его поверхности и, соответственно, изменяет энергию взаимодействия модифицированного Су1 С с партнером. Последнее было представлено как взаимодействие системы точечных зарядов с однородным электрическим полем. Разница в энергии между двумя положениями системы относительно поля для произвольного поля Е составляет
и = Х "¡чДг.Щ (10)
где q¡ - /-й заряд, Г, - его координаты. В случае поля однородно заряженной поверхности его напряжённость направлена нормально к поверхности, так что его можно рассматривать как скаляр и подставить из уравнения (9). Эффект модификации лизипового остатка определялся из уравнения теории активированного комплекса для константы скорости
к = А ехр(-ДС" 1кпТ) (И)
где АСг* - свободная энергия активации. Если и есть изменение свободной энергии активации за счет модификации, то для модифицированного белка получаем
к _ /<cxp(-(AG' + U)/k„T) кй ~ A cxp(-AG"/kBT)
= cxp (,-U/kJ)
(12)
где toil i ■ константы скорости для нативпого и модифицированного белка, соответственно. Различные значения U, вычисленные по уравнению (10), соответствуют вариантам цитохрома С, модифицированным по различным лизинам, для которых величины к и ко измерялась экспериментально. Таким образом, зависимость 1п(Шо) от U должна быть линейной. В свою очередь, U, как видно из (9) и (10), прямо пропорциональна поверхностной плотности заряда рсдокс-партнера CytC, которая априори неизвестна. Соотношение между поверхностной плотностью заряда и напряженностью поля в случае однородного поля определяется как
причем плотность заряда а может быть выражена в единицах напряженности однородного поля, даже если поле в действительности не является однородным, но является полем однородно заряженной плоской поверхности. Для "нелокального" случая поле па достаточном удалении от заряженной поверхности будет однородным. Дополнительная энергия активации рассчитывалась па единицу однородного электрического поля, 1ЛЕ. Эту величину мы назовем фактором ориентации. Если отложить экспериментально найденные 1п к против рассчитанных значений факторов ориентации для каждого из лизип-модифицироваипых вариантов Су1 С, получается прямая линия, из наклона которой можно определить неизвестное значение плотности заряда а:
4) Методика интерпретации зависимостей скорости и аффинности белок-белковых взаимодействий от ионной силы. Методика позволяет из этих зависимостей оценить те особенности распределения заряда белков, которые проявляются в распределениях потенциалов вокруг них как электростатические лоскуты. Наиболее простым аналитическим выражением, описывающим зависимости констант скоростей взаимодействия молекул от ионной силы, является уравнение
£=о/ссо,
(13)
1П(УМо)=(С/есо)Х(£//£)
(14)
Веланда-Грэя. Оно использует выражение теории Дебая-Хкжкеля для расчета парного взаимодействия однородно заряженных сферических частиц:
7 7 в2
\пк = \пк--
( е-* е"* \
8 тг£0£кпТ(Я, +Я2)
ч 1 + кй, 1 + кК2//
(15)
В нем параметрами являются к,„ - константа скорости при бесконечной ионной силе, е - элементарный заряд, к - выраженный в А"1 обратный дебаевский радиус, равный 0.329 /"2, I - ионная сила, 2Г,- и Д,- - заряды и радиусы частиц, ео -диэлектрическая проницаемость вакуума, с - диэлектрическая константа растворителя, кп - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура. Здесь молекулы белка представлены непроницаемыми для растворителя сферами с однородным распределением заряда на поверхностях. Методом нелинейной регрессии определялись неизвестные параметры уравнения, при которых достигается наименьшая сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от теоретической кривой (5!). В качестве неизвестных параметров в уравнениях фигурировали ка, '¿{¿1 и !{=!(\так как заряды входят в уравнение в виде произведения, а независимое варьирование и Яг не улучшает качества регрессии.
5) Пространственное выравнивание структур ДНК-белковых комплексов и идентификация инвариантных и вариабельных контактов в них. Для сравнения атом-атомных контактов нескольких ДНК-белковых комплексов необходимо провести пространственное выравнивание интерфейсов. Однако применение общепринятых алгоритмов пространственного выравнивания белковых структур (по С-альфа атомам) или двуспиральных ДНК (по параметрам Дикерсона) необоснованно для интерфейсов белок-ДНК, поскольку топологии белковых альфа-спиралей и двойных спиралей ДНК сильно различаются. Мы разработали для пространственного выравнивания ДНК-белковых интерфейсов оригинальную процедуру, в которой попеременно (итеративно) совмещаются либо С-альфа атомы узнающих спиралей, либо атомы, участвующие в контактах во всех исследованных комплексах. Пространственное выравнивание производилось с использованием пакета программ МОЬМОЬ.
Идентификация атом-атомных контактов проводилась по пороговому расстоянию 3,35 Л для полярных контактов, в том числе и для контактов через молекулу воды, и 3,9 Л для пеполярных контактов. Инвариантными считались контакты, присутствующие во вссх исследованных комплексах.
6) Методики химической модификации трипсича ноликатионом. измерения скорости ингибирования трипсина соевым ингибитором (СИТ) и констант связывания соевого ингибитора с ноликатионом.
Для исследования влияния электростатического поля поликатиона на взаимодействие трипсина с соевым ингибитором (СИТ) к поликатиону поли-Ы-этил-4-випилпиридииий-бромиду с молекулярной массой 1.8х]05 ковалентпо присоединяли трипсин. За кинетикой ингибирования трипсина соевым ингибитором следили спсктрофотометричсски по кинетике гидролиза этилового эфира бсизоиларгинина. Таким образом, в исследуемой системе трипсин ковалентпо присоединен к поликатиопу, а СИТ в условиях эксперимента (рН 8) заряжен отрицательно.
Константы скорости ассоциации трипсина с ингибитором рассчитывались из кинетических кривых убывания концентрации активных центров трипсина в предположении второго порядка реакции. Кинетические кривые связывания трипсина (£) с ингибитором (/) строились в координатах ([Е]о-[£])/[£]о[ЩгУ Д-™ [£]о=[/]о или (для [£МЛо) 1п(1/]о[Е]/[Е]о[/])/([Е]сг[/]о)=у от времени (. Индекс «О» соответствует начальной концентрации. При этом тангенс угла наклона равен искомой константе скорости.
Константы диссоциации комплекса СИТ с трипсином (в том числе ковалентпо связанным с ноликатионом), были рассчитаны из кривых титрования трипсина СИТом. Экспериментальные данные подгонялись к уравнению, связывающему концентрацию активных центров фермента Е, с общими концентрациями фермента и ингибитора /о и Ео и концентрацией субстрата X:
= +Е. (16)
Х-Е/Е, Ки Е
где Км - константа Михаэлиса, К\ - константа ингибирования, в данном случае равная искомой константе аффинности фермент-ингибиторного комплекса.
Раздел «Результаты и обсуждение» состоит из следующих глав: Глава 1. Влияние заряженного полимера па взаимодействие белков. В этой главе исследовано, насколько введение дополнительного электростатического поля путём присоединения к одному из взаимодействующих белков сильно заряженного полимера, противоположного по знаку заряда другому взаимодействующему белку, может повлиять на скорость образования и аффинность белок-белкового комплекса. Оказалось, что это влияние существенно - скорость и аффинность повысились более чем на два порядка, и наиболее вероятный механизм этого повышения состоит в том, что белок присоединяется к произвольному месту противоположно заряженного полимера, а затем диффундирует вдоль полимерной цепи, пока не произойдёт контакт с белком-партнёром. Трипсин был химически модифицирован сильно положительно заряженным полимером поли(ТЧ-винилпиридиний)бромидом, и была сравнена скорость реакции модифицированного и нативного трипсина с отрицательно заряженным соевым ингибитором Кунитца. Из Табл.1 видно, что низкой ионной силе ковалентное
Таблица 1. Константы скорости связывания, (к\), диссоциации (к.\) и равновесная константа связывания (К л) трипсина с соевым ингибитором.
Объект изучения СМ сек)"1 к. ь сек" К л. М"1
Трипсин 4.3x10" 3x10'5 1.4x10"
Трипсии-ноликатион 5x10" Ю"1 5x10"
Трипсин + 0,35М №С1 5.8х105 3.8х10"4 1.5x10"
Трипсин-поликатион + №С] 7.7x106 ю-4 7x10'"
присоединение трипсина к поликатиону приводит к 115-кратному увеличению константы скорости ассоциации трипсина с соевым ингибитором, причем присоединение трипсина к поликатиону приводит к увеличению скорости ассоциации, но не диссоциации фермент-ингибиторпого комплекса. Повышение ионной силы до 0,35 М №С1 существенно снижает и саму скорость ассоциации фермепт-ингибиторного комплекса, и эффект присоединения трипсина к поликатиону. Таким образом, электростатическое поле существенно влияет на кинетику взаимодействия между белками, и это влияние зависит от ионной силы, как и предсказывалось теорией Дебая-Хюккеля.
Увеличение константы скорости ингибировапия трипсина ингибитором, вызываемое поликатиопом, можно было бы объяснить концентрированием конъюгата СИТ-ЦКП па поликатионе. Такого рода эффекты хорошо известны из мицеллярного катализа. В этом случае наблюдаемая константа является
эффективной величиной и должна зависеть от концентрации полимера. Мы же обнаружили, что варьирование концентрации ноликатиона не приводит к изменению константы скорости иигибирования. Таким образом, фактором, определяющим скорость процесса в целом, является частота столкновений ноликатионных клубков друг с другом. Эта частота была оценена теоретически в предположении, что молекулы полимера представляют собой вытянутые эллипсоиды вращения. С учетом электростатического фактора частота столкновений полиэлсктролитных клубков произвольными участками составила ¿=3х108 М"'с"'. Принципиально возможны два варианта переноса белковой глобулы при столкновении цепей поликатиона: 1) белковые глобулы неподвижны относительно полимерной цепи, и для иигибирования необходимо столкновение полимерных цепей строго определенными участками; 2) белковые глобулы подвижны и могут передвигаться относительно полимерной цени; в этом случае достаточно столкновения произвольными участками. В первом случае необходимо ввести стсричсский фактор, примерно равный отношению линейных размеров белка и полимерного стержня. Частота столкновений для такой модели составляет 2.4х106М"'с"', что значительно ниже экспериментально определяемого значения. Поэтому необходимо принять, что перенос белковой глобулы происходит практически при столкновении любыми сегментами, т.е. за время контакта двух полимерных цепей глобулы ингибитора успевают "обежать" всю полимерную цепь. Получаемое для такой модели оценочное значение А=3х IО8 М"'с"'практически совпадает с экспериментальным. Таким образом, при низких значениях ионной силы раствора глобулы белка-ингибитора с высокой скоростью диффундируют вдоль цепи полимера, и этот процесс можно рассматривать как одномерную диффузию. Скорость такой диффузии может определяться временами перемещения отдельных сегментов полимерной цепи.
Из литературы известен факт, что и скорости, и аффинности большинства взаимодействий белок-белок и белок-ДНК в водной среде существенно зависят от ионной силы. Это даст основание предполагать существенный вклад электростатики в белок-белковые взаимодействия. Для взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами, которые сами являются сильными нолиэлсктролитами, ключевым вопросом является экранировка их зарядов противоионами, в
особенности конденсация противоионов. Этот вопрос рассмотрен в других главах работы.
Глава 2. Дисперсия диэлектрической проницаемости и вклад отдельных зарядов цитохрома С в его взаимодействие с мембраной. Существенность вклада электростатики во взаимодействия между биомакромолекулами требует изучения механизма межмолекулярных электростатических взаимодействий. В частности, в этой главе выяснено, необходимо ли допущение комплементарных заряд-зарядовых взаимодействий для описания влияния точечных замен лизиновых остатков белка цитохрома С на скорость его взаимодействия с мембраной. Оказалось, что такой необходимости нет, если учесть дисперсию диэлектрической проницаемости воды.
Первая же работа [Коррепо1 и Ма^оПавЬ, 1982], где были выполнены точечные замены лизилов цитохрома С, показала, что вклады этих лизинов в свободную энергии активации наблюдаемого процесса переноса электрона между цитохромом и мембранным белком неодинаковы и различаются в несколько раз. Таким образом, кинетика взаимодействия белка с заряженными объектами не определяется суммарным зарядом белка. Поле мембраны вместе с белком было принято однородным. Тогда энергия взаимодействия этого поля с С>1 С будет равна произведению дипольного момента Су1 С па напряженность поля, а вклад замены каждого из лизинов будет определяться его вкладом в дипольный момент Су1 С. Однако расчет совпал с экспериментом лишь для половины лизинов, причем совпадение определялось положением данного лизина относительно некоего экватора сфероидальной молекулы Су1 С, почти перпендикулярного вектору его дипольного момента. Авторы сделали вывод, что лизины-исключепия образуют комплементарные зарядовые контакты (солевые мостики) с мембранным белком.
В настоящей работе исследовался вклад дисперсии диэлектрической проницаемости среды в энергию взаимодействия цитохрома С с мембраной. На Рис.1 представлены логарифмы экспериментально измеренных бимолекулярных констант скорости переноса электрона между мембраной и Су1 С, отложенные против величин факторов ориентации, рассчитанных для модификаций по каждому из лизиповых остатков Су1 С (Уравнение 14). Эти величины представляют собой разности энергий активации модифицированных и нативпого белка и, отнесенные к напряженности поля мембраны Е. Поскольку поле мембраны принято
однородным, эти величины пропорциональны дипольпому моменту каждого из вариантов Cyt С. Ордината каждой точки па Рие.1 соответствует логарифму измеренной константы скорости модифицированного по определенному лизину Cyt С. Абсцисса - рассчитанному для этой модификации по одной из четырех моделей значению U/E. Наклон линий пропорционален эффективной плотности заряда па мембране.
Расчет (Рис.!) был выполнен для четырех моделей, в которых электростатическое поле мембраны моделировалось по-разному: 1 - однородное электрическое поле, 2 - поле однородно заряженной плоскости в среде с пространственной дисперсией проницаемости ("нелокальная электростатика"), 3 и 4 - поле однородно заряженного диска с радиусом 15 А при постоянной проницаемости и с дисперсией проницаемости соответственно. Модели 2 и 4, в которых учитывается пространственная дисперсия, дают гораздо лучшее согласие расчета с экспериментом, чем модели 1 и 3, то есть эффект модификации лизиповых групп Cyt С лучше описывается при использовании «нелокальных» моделей.
\дк1коЪг- 1 í
-1.0
ШгхЮ28, КПхМ
Рис.1. Зависимости логарифмов экспериментально измеренных констант скоростей переноса электрона с мембранного белка Cyt С-редуктазы па Cyt С для модифицированных Cyt С (к), отнесенных к константе для нативного Cyt С {ко), от величин факторов ориентации VIE, рассчитанных для каждой из модификаций. Каждая точка соответствует варианту Cyt С, модифицированному по определенному остатку. Наклон линий соответствует эффективной плотности заряда па мембране. Нумерация точек и линий соответствует нумерации моделей (см.тскст).
Модели 2, 3 и 4 дают существенно лучшее согласие с экспериментом по сравнению с исходной моделью 1. Следовательно, если учесть вклад дисперсии диэлектрической проницаемости посредством введения в расчет поправок на расстояние между каждым из терминальных азотов лизина цитохрома С и поверхностью мембраны, упомянутые исключения не возникают. Кроме того, оцененная из сравнения расчета с экспериментом плотность заряда на мембране оказывается более реалистичной, чем в работе [Koppenol & Margoliash, 1973].
Таким образом, для объяснения кинетики взаимодействия Cyt С с мембраной нет необходимости привлекать представление о комплементарных электростатических взаимодействиях.
Глава 3. Анализ зависимостей скоростей реакций биомакромолекул от ионной силы. В этой_главс определяются характерные размеры взаимодействующих заряженных областей (доменов) белка. Они оценивается из зависимостей констант скоростей образования белок-белковых комплексов от ионной силы. Вводится понятие электростатического лоскута - области электростатического потенциала, образуемой таким доменом.
Зависимости констант скоростей реакций однородно заряженных сферических молекул от ионной силы выводятся аналитически и используются в работе для определения размеров взаимодействующих областей белка и их зарядов (Рис 2). Из рисунка 2 следует, что ни заряды, ни радиусы взаимодействующих частиц, полученные из зависимостей от ионной силы, не соответствуют таковым для целых взаимодействующих белков, т.е. аппроксимация целых белков однородно заряженными сферами явно неадекватна. Учёт поправки на дипольный момент белков при вычислении констант аффинности и скорости не улучшает приближения. То есть, получаемые параметры - заряды и радиусы - могут соответствовать эффективным размерам и зарядам не целых белков, а неких взаимодействующих доменов белков. Если теперь рассчитать электростатический потенциала вокруг белка, то на эквидистантных поверхностях, отстоящих от молекулярной поверхности белка примерно па 5 À, возникают области одного и того же знака потенциала (лоскуты), причём по расположению относительно белка и размерам эти лоскуты потенциала могут быть образованы зарядами, включёнными в упомянутые домены этого белка. Лоскуты являются важной
характеристикой электростатического поля вокруг белка, которая и явилась основным объектом исследования в настоящей работе. Основанием для выбора такой характеристики является и то, что на меньших расстояниях лоскуты сильно искажаются. Электростатические эффекты становится невозможно оценить в рамках макроскопической (использующей диэлектрическую константу) электростатики из-за выхода за границу сс применимости вследствие флуктуаций и корреляций в расположении противоионов и диполей воды и квантовых эффектов. На больших же расстояниях энергия поля становится малой по сравнению с энергией теплового движения.
1п /С 22 20 18 16 14
0.0 0.4 0.8 1.2 1Ш
Рис. 2. Зависимость от ионной силы экспериментально измеренной бимолекулярной константы скорости переноса электрона между Су1 В5 и Су1 С. Точки соответствуют экспериментальным значениям констант [МогШгир и др., 1993]. Линии - теоретические кривые : сплошная - 11=8.6 А, штриховая -Я=2 А, пунктирная -11=15 А. Произведения зарядов при этом равны 6, 22 и 84 соответственно. Истинные радиусы этих белков составляют около 15 А, а произведение их зарядов около 50.
Глава 4. Электростатические лбекуты белков. В этой главе показана важная роль электростатических лоскутов в функции ряда белков. Сравнение электростатических лоскутов внутри семейств белков показало, что лоскуты являются эволюциоипо отобранной характеристикой белков.
4.1) Супероксид-дисмутаза. На Рис. 3 приведены распределения электростатического потенциала супероксид-дисмутазы для двух электростатических моделей. Ключевое значение для описания скорости диффузуоппо-коитролируемой реакции диспропорциопирования сунероксида имеет величина области, занимаемой положительным потенциалом вблизи активного центра, т.е. оценка величины мишени для супсроксид-аниона (Рис. 3).
Рис.3. Карта изолиний распределения электростатического потенциала супероксид-дисмутазы в плоском срезе через активный центр. Жирной линией показана молекулярная поверхность супероксид-дисмутазы, аппроксимирующая границу белок-вода. Цепа масштабного деления 10 А. Приведены изолинии 0,5, 1 и 2 кцТ/е, положительные - сплошная линия, отрицательные - штриховая. Слева, диэлектрическая проницаемость принята равной 80 по всему объему. В центре, диэлектрической проницаемость принята 2 внутри белка и 80 вне белка при нулевой ионной силе. Справа, то же при ионной силе 0,15 М.
При использовании модели с постоянной диэлектрической проницаемостью по всему объему оцененные из размера мишени скорости реакции оказываются заниженными по сравнению с экспериментальными примерно на порядок. Учёт различия диэлектрических свойств белка и воды увеличивает размер мишени как раз примерно на порядок, а введение в модель ионной силы - к смещению изолиний положительного потенциала в сторону от активного центра, что соответствует понижению скорости реакции. То есть, зависимость последней от ионной силы отслеживается моделью качественно верно, в отличие от модели с постоянной диэлектрической проницаемостью, в которой повышение ионной силы приводит к увеличению мишени (не показано).
4.2) Цигохромы Р450. Эти ферменты осуществляют метаболизм многих органических субстратов путём оксигенации — введения атома кислорода в субстрат. Для осуществления функции им нужен вовремя доставленный электрон.
Во многих случаях эту функцию осуществляет специальный белок-кофактор, переносчик электрона. Нами обнаружен лоскут положительного потенциала, расположенный вблизи гемовой группы - акцептора электрона. Этот лоскут
Рис.5. Цитохром Р4508сс: электростатический потенциал (слева), заряженные аминокислоты, его образующие (справа). Помечены остатки, консервативные в цитохромах Р450.
Рис.4. Электростатические лоскуты вокруг цитохромов Р450: цитохром Р450зсс и два наиболее подобных ему по пространственной, но наиболее различающихся по первичной структуре. Слева направо: Р4508СС, Р450ВМЗ, Р4502С5. Здесь и далее, если не указано иначе: синий цвет - положительный потенциал > 1 к^Т/е ~ 25 мВ при 300 К, кв - постоянная Больцмана, Т -абсолютная температура, е - элементарный заряд, красный -соответствующий отрицательный потенциал.
инвариантен у цитохромов Р450 (Рие.4), требующих кофактора (у других электрон доставляется другим доменом самого цитохрома Р450).
Идентифицированы аминокислоты, создающие лоскут. Для одного из них, цитохрома Р450.чсс, были предсказаны как константы связывания, так и скорости переноса электрона, подтвердившиеся экспериментально, при том что в отсутствие пространственной структуры этого белка предсказания были выполнены, исходя из весьма грубой модели, основанной на структуре его отдаленного гомолога (-10% идентичности аминокислот) - камфорного цитохрома Р450.
Таким образом, показано, что лоскут положительного потенциала указывает на место контакта с белком-кофактором. Все такие кофакторы, как известно, отрицательно заряжены. Как выяснилось из пространственной структуры одного из них (адрснодоксина), он содержит лоскут отрицательного потенциала, комплементарный лоскуту цитохрома Р450. Несмотря па инвариантность обнаруженного электростатического лоскута, далеко не все из образующих его заряженных аминокислот инвариантны (Рис. 5).
4.3) ДНК-связывающие белки.
Рассмотрены два семейства ДНК-связывающих белков - вторые домены сигма- субъединицы бактериальной РНК-полимеразы и эукариотические факторы транскрипции семейства гомеодоменов. Второй домен сигма70-субъединицы (далее сигма2-домеи) узнаёт промоторную ДНК в области нуклеотида -10 от точки старта транскрипции у различных бактерий. Сигма70-субъединица функционирует в составе холофермента вместе с еще четырьмя субъедипицами. Ее второй домен отличается большим разнообразием аминокислотных последовательностей, в ряде случаев имеются длинные вставки. Мы обнаружили (рис.6) лоскут положительного потенциала, общий для сигма2-домснов различных биологических видов. При этом ароматические аминокислоты, примыкающие к этой области, по данным мутагенеза, связываются с ДНК, а узнавание на уровне атомных контактов происходит по механизму интеркаляции. Во время выполнения настоящей работы была расшифрована структура холофермента РНК-полимеразы, и оказалось, что обнаруженный нами лоскут потенциала является инвариантным не только на сигма2-домепах, по и па всём холоферменте, и обращен вовне холофермента. При
этом аминокислоты, образующие этот лоскут, за исключением одной, не являются инвариантными (рис.7).
Факторы транскрипции семейства гомеодоменов в эукариотах ответственны за дифференциацию клеток по органам. К этому семейству в одном организме принадлежит множество похожих белков. Гомеодомены являются одними из наиболее консервативных белков, в т.ч. и из числа ДНК-связывающих белков. В отличие от сигма-еубъедиииц РНК-полимеразы, гомеодомены могут специфически узнавать ДНК независимо от других доменов. Узнавание на уровне атомных контактов осуществляется гомеодомепами посредством водородных связей их аминокислот с основаниями ДНК. Мы показали, что у гомеодоменов имеется единственный лоскут положительного потенциала, расположенный с одной стороны молекулы (Рис.8). Именно эта сторона, по кристаллографическим структурам комплексов Д11К-гомеодомен, контактирует с большим желобом Д1 ¡К.
Рис.6. Электростатические потенциалы второго домепа четырех сигма70 субъединиц бактериальной РНК-полимеразы. Верхние рисунки отличаются от нижних поворотом вокруг горизонтальной оси па 180°. Слева направо: E.coli sigma70, T.aquaticus sigmaA, E.coli sigmaE, S.coelicolor sigmaR.
Рис. 7. Инвариантная область электростатического потенциала сигма2 домена сигма 7 субъсдиницы Е. coli, (слева); аминокислотные остатки, образующие лоскут (справа). Помечена единственная инвариантная аминокислота.
Рис. 8. Электростатические потенциалы гомеодомснов. Верхний и нижний отличаются поворотом па 180° вокруг оси Y. Слева направо: гомеодомеиы Pit-1, парный, гранёный, антеннапедия и Msx-1.
В отличие от сигма2-доменов, формы лоскутов положительного потенциала существенно отличны от друга у различных гомеодомепов, что па первый взгляд
удивительно, так как все гомсодомены связываются в одной и той же области большого желоба ДНК и одинаково ориентированы относительно двойной спирали. Одно объяснение состоит в том, что у сигма2 лоскут расположен между двух его альфа-спиралей, а у гомсодоменов - охватывает узнающую альфа-спираль, по не соприкасается с двумя оставшимися спиралями. Узнающая же спираль содержит именно те боковые группы аминокислот, которые образуют водородные связи с основаниями ДНК. Они располагаются непосредственно в области электростатического лоскута и искажают его. Кроме того, сигма-субъединицам нет необходимости нейтрализовать фосфаты ДНК, так как иш еркаляциониые взаимодействия от электростатических полей зависят слабо. Напротив, нейтрализация фосфатов ДНК необходима гомеодомснам, которые узнают основания ДНК посредством водородных связей, энергия которых сильно зависит от внешних электростатических полей. Поэтому функция лизинов и аргининов гомеодомепа состоит не только в создании электростатического лоскута, но и в нейтрализации фосфатов ДНК, и эта дополнительная функция также может исказить форму лоскута.
Таким образом, общим в электростатических полях ДНК-связывающих белков оказывается электростатический лоскут, направляющий белок в большой желоб ДНК, а различия связаны, во-первых, с олигомеризациопным состоянием белков, а во-вторых, с функциями, относящимися к стадиям молекулярного узнавания, следующим за чисто электростатической стадией. Для комплексов гомсодоменов с фрагментами промоторных ДНК эти стадии были изучены подробно (глава 6).
Полученные результаты указывают на необходимость при расчёте электростатических потенциалов белков не ограничиваться рассмотрением индивидуального белка, а исследовать целые семейства белков. При этом возникает большое число однотипных вычислительных задач, естественным способом решения которых является применение распределённых вычислительных сред, содержащих множество процессоров, чтобы потенциал каждого из множества белков вычислялся на индивидуальном процессоре. Программное обеспечение, разработанное для расчётов электростатических потенциалов, реализовано нами именно в такой среде типа ГРИД.
Глава 5. Распределение электростатического потенциала вокруг промоторпых ДНК.
В этой главе исследованы характерные особенности электростатического потенциала промоторпых ДНК, в том числе фрагментов промоторпых ДНК, узнаваемых гомеодомепами. Установлено, что лоскуты электростатического потенциала, подобные белковым, возникают вокруг этих фрагментов ДНК при тех значениях степени конденсации противоионов, которые наблюдаются экспериментально. Для длинных промоторпых ДНК оказалось, что анизотропия электростатического потенциала резко различается как между промоторами в целом, так и между участками одного и того же промотора. Как выяснилось их расчёта электростатических потенциалов ДНК периодических последовательностей, ДНК последовательности (АТАТАТ...) имеет аномально низкую анизотропию.
При расчете электростатических потенциалов нуклеиновых кислот по уравнению Пуассона -Больцмана необходимо явно учесть конденсацию противоионов на ДНК, так как это уравнение в используемом нами приближении избытка соли не воспроизводит эффекта конденсации. Поскольку основной эффект конденсации, независимо от фактического расположения противоионов состоит в уменьшении остаточного заряда фосфатов ДНК, мы варьировали заряды на фосфатных атомах кислорода ДНК в пределах от-1.0 до -0.1 (Рис.9).
При отсутствии конденсации (заряд -1.0), электростатический потенциал отрицателен на всей поверхности. Чередование отрицательных (лоскутов потенциала) и нейтральных участков возникает при некоторых значениях доли остаточного заряда, существенно различных для более коротких и более длинных ДНК. Так, для более коротких фрагментов ДНК, узнаваемых белками антепнапедия, \1sx-l и парным, выраженные лоскуты потенциала возникают при доле остаточного заряда 0,4-0,45, а для более длинных - граненого и РИ-1 - при 0,3. В литературе доли остаточного заряда на ДНК были оценены методом ЯМР 23№, и они практически совпали с приведенными значениями.
Доля остаточного заряда
0.1 0.3 0.4 0.45 0.5
1.0
Со стороны контакта с белком С противоположной стороны 1167 9А1МТ ЗНОР 1F.IL 1А117 1Ю7 9А1ЧТ ЗНйй 1F.1L 1А117
§ д В 15
& а & щ ~
ъ а в
1111 11
Рис.9. Электростатические потенциалы фрагментов промоторных ДНК, узнаваемых гомеодоменами. Расчеты выполнялись в предположении различных степеней конденсации противоионов на ДНК, указана соответствующая доля остаточного заряда ДНК. Слева направо, ДНК, узнаваемая соответственно гомеодоменами МвхИ, антеннапедией, гранёным, парным и РК-1 (показаны соответствующие коды РОВ). Показан потенциал со стороны контакта с белком и с противоположной стороны. Более тёмный цвет соответствует потенциалу < 1 кцТ/е.
Таким образом, лоскуты потенциала на ДНК появляются именно при экспериментально найденных долях остаточного (после конденсации противоионов) заряда ДНК. Лоскуты оказались расположены в желобах, а не вблизи фосфатов, что па первый взгляд удивительно, так как именно заряды фосфатов являются основными источниками поля на ДИК. Однако в том же ЯМР-исследовании определены места связывания противоионов N3' на ДНК, и они оказались расположены именно в большом желобе (малый жёлоб почти недоступен для ионов из-за имеющегося там хребта гидратации). Из рисунка также видно, что лоскуты отрицательного потенциала в большом желобе, способствующие «посадке» па него белков, несколько более выражены со стороны контакта с белком, чем с противоположной стороны. Возможно, это связано с индуцированной белком искажением геометрической формы ДНК по сравнению с канонической В-формой, также способствующим ДНК-белковому узнаванию.
На рисунке 10 представлены электростатические потенциалы ДНК периодических последовательностей: поли -А, поли-АТ, поли-0 и гюли-СС. Как и
следовало ожидать, потенциалы также периодичны. Видно, что потенциал поли-АТ резко отличается от остальных периодических последовательностей, а именно, лоскуты и синего (менее отрицательного), и красного (более отрицательного) потенциала меньше и но размеру, и гто отличию от среднего потенциала. То есть, из периодических последовательностей поли-АТ наиболее электростатически однородна. Видимо, однородность электростатического «фона» необходима для более поздней стадии узнавания промоторов белками, и эту однородность мотуг обеспечить именно участки ДНК с последовательностью (АТАТАТ...).
poIy(AT)
poly(G)
¿11 poiy(GC)
Рис. 10. Электростатические потенциалы ДНК периодических последовательностей. Потенциал показан па расстоянии 15 А от оси спирали, где расположена элсктрофоретическая граница скольжения длинных ДИК. Синий цвет - менее отрицательный потенциал, белый - промежуточный, красный - более отрицательный ( >-0,5, = -1 и < 1,5 кдТ1е соответственно). Показаны две проекции, отличающиеся поворотом па 180° вокруг горизонтальной оси.
100
200
300
400
.l.iil 4. ¡Il ' M | -«t,., A* A -^..l 'A,,.. ! ' t I \ И ' mJI-i.à. „.'.„i « « . * ! à
Я»1."' - IV ■ v 1 • >1 r t ili ■ 1. , i . t.» . i >4 " * ----I J IÎCTlI •y TT""
uvrA
м-M 1 . » . ..a. -i .. i, 1 II wàm..... A
>* i1 f » » i» r". '——M- ' i i >. t. 1 ' 1 ---, -, t 1 ! 1. ! i —w^f ■« » » ■ . л_ LLli
uvrB-P1
ai......s .s Л . .. t i 1 u.L u \ • f f „..„...УА..,,;,,...^,.,,.,!,.^,,.. T», »T 4
IT»—l'y T-T»T-T----- 1 > A; 1 t v • i '1.....» 1 'I i ! i 1 i
uvrD-P 1
Г 1 T rF'! .'.H i —- *..... 1 J\ \ ! i ^ > HI L .là . .. H ..i
(•*»■ 1 < с - ■ * i'1*1 - t ! , ' * '• ; ' ' Î ...........- «l.>....................t."' •л.. ' f f ' il . il1 .U - ■ *•' i •.......T"""'
uvrD-J'2
1 ^ ^JùSLi.
i li !■"■ LIES ■ *..
accA
r _
L l i . tl J l,k .. ^ . '.
accBC
Рис. 11. Электростатические потенциалы ДНК некоторых промоторных последовательностей Е. coll. Обозначения - как на предыдущем рисунке.
IIa рисунке 11 показаны электростатические потенциалы нескольких промоторов Е. coli, которые качественно отличаются от периодических, а именно у промоторов очень силси дипольиый момент в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, причем у всех промоторов дипольиый момент варьирует в зависимости от последовательности. Напротив, потенциал периодических последовательностей более напоминает потенциал квадруполя. Из показанных здесь промоторов два верхних, uvrA и uvrB-Pl, показывают гораздо большую анизотропию, чем другие. На каждом из промоторов видны отдельные участки, выделяющиеся как по отрицательности, так и по анизотропии.
Исследованы все промоторные последовательности Е. coli - около 400. Для расчётов электростатического потенциала применено программное обеспечение, реализованное нами в среде распределённых вычислений ГРИД. Это первый известный нам пример применения распределённых вычислений для массового расчёта электростатических потенциалов биомакромолекул.
Глава б. Атом-атомные контакты при узнавании ДНК гомсодоменами. В этой главе была оценена степень нейтрализации зарядов фосфатных групп ДНК, необходимая для узнавания отдельных аминокислот гомсодомснов отдельными основаниями ДНК посредством атом-атомных контактов, то есть специфического узнавания. Оказалось, что для этого недостаточна нейтрализация фосфатов противоионами и требуется их нейтрализация лизинами и аргининами белка. Была также поставлена задача идентифицировать и классифицировать атом-атомные контакты в интерфейсах гомсодомсн-ДНК. Было найдено, что контакты разбиваются па два класса - инвариантные, характеристические для контактов гомеодоменов с ДНК, и вариабельные, обеспечивающие индивидуальную специфичность комплексов внутри семейства гомеодоменов.
Для оценки степени нейтрализации, необходимой для атом-атомного узнавания, были вычислены электростатические потенциалы тех же фрагментов промоторпых ДНК, что представлены на рис.9, но на более близком (3 А) расстоянии от молекулярной поверхности. Варьируемым параметром был остаточный (после нейтрализации) заряд фосфатных групп. На этом расстоянии потенциал перестаёт зависеть от остаточного заряда фосфатов при доле последнего, меньшей 0,1 (не показано). То есть, даже если допустить максимально возможную
нейтрализацию иротивоиоиами, соответствующую но теории Мэннинга остаточному заряду 0,24, этого оказывается недостаточно для специфического узнавания. Необходима нейтрализация зарядов фосфатных групп лизиповыми и аргипиновыми аминокислотами белка. Таким образом, функция последних в узнавании ДНК гомсодомепами двояка: они и образуют электростатический лоскут па ранней стадии узнавания, и нейтрализуют заряды фосфатов, что необходимо на стадии атом-атомных контактов. Для последней мы, па примере пяти вышеуказанных комплексов, показали, что узнающая альфа-спираль гомсодомена образует как инвариантные, так и вариабельные контакты аминокислот с основаниями ДНК. В числе инвариантных оказались:
- высокоспецифичпый аспарагин-адепиповый контакт, общий для всех комплексов гомеодомен-Д1 IK;
- неполярные контакты гидрофобных аминокислот с метиловой фуппой тимипа, служащие стерсохимическим барьером, фиксирующим гомсодомеп на ДНК;
- кластер молекул воды, контактирующих и с основаниями, и с аминокислотами и служащий для копформационпой подвижности, необходимой для диссоциации комплекса.
Инвариантные контакты образуются в основном с мотивом ТААТ, распространённым среди ДНК, узнаваемых гомеодомспами. Инвариантные контакты выделяют комплексы гомеодомен-ДНК из всего множества ДНК-белковых комплексов, а вариабельные обеспечивают индивидуальную специфичность комплексов внутри семейства гомеодомепов. Отметим, что распространение найденных закономерностей па все ДНК-белковые комплексы потребует быстрого анализа большого числа структур этих комплексов (па сегодня известно около 1600, и это число быстро растёт). Здесь также возникает необходимость в распределённых вычислениях.
Глава 7. Распределение электростатического потенциала вокруг транспортных РНК. В этой главе выполнена оценка степени конденсации противоионов на тРНК. Транспортные РНК так же сильно заряжены, как и ДНК, по их квазиглобулярная форма резко отличается от квазицилиндрической формы двуспиральпой ДНК, что может сказаться на конденсации и тем самым на эффективном заряде тРНК, который важен для её узнавания амипоацил-тРНК синтетазой. Оказалось, что, в
отличие от двуспиральпой ДНК конденсации противоиоиов около тРНК не происходит, и её суммарного заряда достаточно для индукции зарядов на сиптетазс посредством ионизации её гистидинов, что важно для узнавания.
В литературе имеются измеренные сдвиги рК флуоресцентных меток, присоединённых ктРПК. Они находятся в диапазоне 0,24-1,18 единицрАГ, причем преобладают большие значения. Поскольку эти сдвиги пропорциональны электростатическому потенциалу, мы рассчитали их и изобразили на той поверхности, на которой, исходя из длины спейссра, расположены метки (рис. 12).
Если принять заряд тРНК равным -10 (максимальная конденсация), потенциал получился почти нулевой - сдвига рК не должно быть (не показано). Если принять его равным -40 (промежуточная степень конденсации), потенциал оказывается в пределах 0-0,5 единицрКГ, за исключением узлов тРНК, недоступных для присоединения флуоресцентных меток. Наконец, если предположить отсутствие конденсации (заряд -76, по числу нуклеотидов), расчёт соответствует эксперименту. Таким образом, получается, что конденсация противоиоиов на тРНК не происходит или незначительна, что при таком большом заряде тРНК на первый взгляд кажется невероятным.
Рис. 12. Предсказанные электростатическими расчётами сдвиги рК флуоресцентных меток на расстоянии от гРНК, соответствующему положению этих меток (7.5 А). Оранжевый, 1 единица рК\ желтый, 0.5 единицы рК\ зелёный, 0. Слева, суммарный заряд тРНК принят равным -40; справа, -76. Экспериментальные значения сдвигов рК находятся в диапазоне 0,24 - 1.18, с преобладанием больших значений.
В литературе имеются теоретические оценки конденсации противоиоиов около плоских, цилиндрических и сферических поверхностей. Показано, что наличие или отсутствие конденсации определяется главным образом не величиной
заряда, а геометрической формой поверхности. Около плоское™ полная конденсация сеть всегда (известный слой Штерна). Около сферы (аппроксимация глобулярного белка и в некоторой степени тРНК) конденсация не происходит никогда. Около цилиндра (двуспиральная ДНК в Л, В, 7 формах) величина конденсации зависит от плотности заряда и длины цилиндра. Последнее наблюдается в эксперименте (см. главу 5). При этом предельный переход от сферы или цилиндра к плоскости происходит при кЛ »1, где к и Л - обратный дебаевский радиус и радиус сферы либо цилиндра соответственно, то есть при физиологической ионной силе (к"' = 8 А) радиус кривизны большей части поверхности тРНК (й~ 10 А) явно недостаточен для предельного перехода.
синтетазы. Показаны поверхности равного потенциала +0.01 кцТ/е (синий) and -0.01 кКТ!е (красный). Левая панель, незаряженные, правая - заряженные гистидины.
Наличие такого огромного пескомпенсированпогого заряда должно сказываться па узнавании тРНК аминоацил-тРНК синтетазой (Рис. 13). Поскольку заряд тРНК так велик, он будет сказываться уже при малых значениях электростатического потенциала синтетазы, показанных на рисунке. При этом в узнавании будут, помимо остатков лизина и аргинина тРНК-синтетазы, участвовать и её гистидиновые остатки. Они, как видно из рисунка, вносят существенный вклад в формирование её электростатического потенциала,
поскольку в иоле тРНК будет происходить их ионизация и соответственно индукция зарядов. Такой механизм электростатического узнавания, потенциально важный, крайне редко обсуждается в литературе.
В Заключении указано, что в работа относится к новой междисциплинарной области науки - физической биоинформатике, и обоснована необходимость появления последней как с позиций биофизики, так и с позиций биоинформатики. Обсуждаются ограничения использованного теоретического похода и перспективы его развития как в плане усовершенствования электростатических расчётов, так и их распространения на большее число биополимерных объектов (вплоть до полных геномов и протсомов) с использованием распределённых вычислений.
выводы
1) Разработан вариант многоссточного метода решения уравнения Пуассоиа-Больцмана и построен соответствующий высокоэффективный алгоритм для расчета электростатических потенциалов больших молекул с атомным разрешением: глобулярных белков, протяженных структур (длинные двухцепочечные ДНК до 1000 пар оснований, мембраны, тРПК). Алгоритм реализован в виде программного обеспечения, функционирующего в том числе и в распределенной вычислительной среде ГРИД.
2) Показано, что электростатический лоскут является характеристическим параметром поля вокруг макромолекулы, важным для межмолскулярпого узнавания. В белок-белковом узнавании механизм электростатического узнавания посредством полей (электростатических лоскутов) является преобладающим. В этом случае именно лоскут ответственен за рашпою стадию узнавания. Значительно реже встречается механизм контактов заряженных атомов (зарядовая копмлсмс! гтар! юсть).
3) Найдено, что размер, форма и положение электростатических лоскутов в семействах белков инвариантны, даже если в их первичных структурах заряженные аминокислоты, образующие лоскуты, не являются инвариантными, указывая на то, что не только структуры белков, но и их электростатические потенциалы подвержены эволюционному отбору и поэтому эволюционпо обусловлены.
4) Величина электростатического потенциала нромоторпых ДНК, являющаяся важной характеристикой при узнавании белками ДНК, определяется её первичной структурой и зависит от степени конденсации противоиопов. Появление лоскутов отрицательного потенциала обусловлено степенью конденсации противоиопов, равной наблюдаемой в эксперименте.
5) Электростатические потенциалы промоторных ДНК характеризуются протяженными участками однородного потенциала, чередующиеся с участками неоднородного потенциала, в частности анизотропного в направлении, перпендикулярной оси спирали. По однородности электростатического потенциала
промоторы Е. coli резко различаются также на всей их протяженности. Из потенциалов ДНК периодических последовательностей наиболее однородным является потенциал поли (ЛТ).
6) Найдено, что при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК функция фосфатов ДНК двояка: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиповыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов. Найдено два типа контактов: инвариантные контакты характеризуют семейство гомсодоменов и выделяют их среди всех ДНК-белковых комплексов. Вариабельные контакты специфичны для индивидуальных комплексов внутри семейства гомсодоменов.
7) Показано, что конденсация противоионов на транспортных РНК, в отличие от двуспиральных ДНК, практически не происходит из-за квазиглобулярной геометрической формы тРНК. Как следствие, электростатические поля тРНК дополнительно индуцируют заряды на аминоацил-тРНК синтетазс посредством ионизации ее гистидинов, что обеспечивает необходимую специфичность и надёжность узнавания.
8) На модельной системе трипсин+поликатион-сосвый ингибитор (СИТ) экспериментально показано, что электростатические поля способны существенно (два порядка) увеличить скорость белок-белкового взаимодействия. Узнавание происходит посредством связывания СИТ с поликатоном (конденсация) и затем одномерной диффузии СИТ по цепи поликатиона к специфическому месту контакта.
Список публикаций
Статьи в рецензируемых журналах
1. Изумрудов В.А., Савицкий А.П., Сивожелезов B.C., Зезин А.В., Кабанов В.А., Перечни И.В. (1987) Ускорение взаимодействия трипсина с соевым ингибитором в присутствии поликатиона. Доклады АН СССР, 294, 1501 -1505.
2. Lazarcv P.I., Sivozhclczov V.S. (1991). Solvent Permittivity Dispersion Electrostatic Model Better Fits Kinetic Data. Topics in Molecular Organization and Engineering, 7, 149-160.
3. Постникова Г.Б., Цсликова СВ., Сивожелезов B.C. (1992) Изучение переноса электрона в гем-белках. X. Влияние рН, ионной силц и ионов цинка на скорость восстановления феррицитохрома С окси-миоглобипом сердца свиньи. Мол. биология, 26, 880-890.
4. Postnikova G.B., Sivozhclczov V.S., Tsclikova S.V. (1995) Controlling the electron transfer rate between oxymyoglobin and fcrricytochromc C. The rolc'of histidincs and electrostatic and steric interactions in the mechanism of the reaction. Mol. Engineering, 4,431-439.
5. Sivozhelczov V.S. Interpretation of ionic strength dependencies of the electron transfer in the cytochrome С - cytochrome 135 system for the wildtype and lysine-mutatcd yeast cytochrome С Mol. Engineering, 1996,6,405-414.
6. Сивожелезов B.C., Комаров Ю.Е., Постникова Г.Б. (1996) Изучение переноса электрона в гемопротеипах. Применимость моделей электростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом с от ионной силы. Биофизика, 41,1180-1192.
7. Сивожелезов B.C., Комаров Ю.Е., Постникова Г.Б. (1998) Применимость моделей электростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом с от ионной силы. Биофизика, 43, 16-26.
8. Polozov R.V., Dzhelyadin Т.К., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelczov V.S., Kamzolova S.G.
(1999) Electrostatic potentials of DNA. Comparative analysis of promoter and nonpromotcr nucleotide sequences. J. Biomol. Struct. Dyn. vol.16, No.6, 1135-43
9. Моисеева C.A., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C. (2000). Окисление оксимиоглобина кашалота, катализируемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм, Биофизика 45, 10191028.
10. Kamzolova S.G., Sivozhclezov V.S., Sorokin А.А., Dzhelyadin T.R., Ivanova N.N., Polozov R.V.
(2000) RNA polymcrase-promoter recognition. Specific features of clectrostaticpotential of "early" T4 phage DNA promoters. J. Biomol. Struct. Dyn. vol.18 No.3, 325-334.
11. Hou S., Bclisle C„ Lam S., Piatibratov M., Sivozhelczov V., Takami II., Alam M. (2001)A globin-coupled oxygen sensor from the facultatively alkaliphilic Bacillus halodurans C-125. Extrcmophiles 5,351-354.
12. llou S., Freitas Т., Larsen R.W., Piatibratov M., Sivozhelczov V., Yamamoto A., Melcshkevitch E.A., Zimmcr M., Ordal G.W., Alam M. (2001) Globin-coupled sensors: a class of heme-containing sensors in Archaea and Bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 9353-9358.
13. Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Sivozhclezov V.S., Ivanova N.N., Polozov R.V., Kamzolova S.G.
(2001) New approach in studying RNA polymerase-promoter recognition code. J. Biomol. Struct. Dyn., 18,922-923.
14. Т.Р.Джелядин, А.А.Сорокин, Н.Н.Иванова, B.C.Сивожелезов, С.Г.Камзолова, Р.В.Полозов. (2001) Особенности электростатического взаимодействия РНК-полимеразы Escherichia coli с промоторами ДНК фага Т4. Биофизика 46, 1022-1026.
15. Nicolini С., Erokhin V., Ghiscllini P., Paternolli С., Ram M.K., Sivozhclezov V. (2001) P450scc engineering and nanostructuring for cholesterol sensing, Langmuir 17,3719-3726
16. Шсховцова E.A., Гораев E.B., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. (2005) Окисление миоглобинов кашалота, лошади и свиньи, катализируемое ионами феррицианида. Кинетика и механизм. Биофизика 50(1):39-48.
17. Сабурова Е.А., Дыбовская Ю.Н., Сивожелезов B.C., Елфимова Л.И. (2005) Электростатический вклад во взаимодействие некоторых белков с полиэлсктролитами. Биофизика 50(3):423-432
18. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. (2005) Механизм катализируемого ионами ферроцианида окисления оксимиоглобина: химически модифицированный и мутантный миоглобины кашалота Биофизика 50(4): 631-640.
19. Sivozhclezov V., Nicolini С. (2005) Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal ampcromctric sensor. J Theor Biol. 234,479-485.
20. Pcchkova E., Sivozhclczov V., Tropiano G., Fiordoro S., Nicolini C. (2005) Comparison of lysozyme structures derived from thin-film-based and classical crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 803-808.
21. Polozov, RV, Sivozhelczov, VS, Ivanov, VV, and Mclnikov, YB. (2005) On a Classification of E. coli promoters according to their electrostatic potentials. Physics of Particles and Nuclei Letters 2, 241-246.
22. Polozov R.V., Montrel M., Ivanov V.V., Melnikov Y., Sivozhclezov V.S. (2006) Transfer RNAs: electrostatic patterns and an early stage of recognition by synthetases and elongation factor EF-Tu. Biochemistry 45,4481-9440.
23. Sivozhelczov V., Pcchkova E., Nicolini C. (2006) Mapping electrostatic potential of a protein on its hydrophobic surface: implications for crystallization of cytochromc P450scc. J. Thcor. Biol. 241, 7380.
24. Sivozhclezov V., Giacomelli, L., Tripathi, S., & Nicolini, C. (2006) Gene expression in the cell cycle of human T lymphocytes: 1. Predicted gene and protein networks, J Cell Biochcm 97, 11371150.
25. Sivozhclczov V and Nicolini, C. (2006) Theoretical framework for octopus rhodopsin crystallization. Journal of Theoretical Biology 240,260-269.
26. Sivozhclczov V and Nicolini, C. (2007) Prospects for octopus rhodopsin utilization in optical and quantum computation. Physics of Particles and Nuclei Letters 4(2): 189-196.
27. Postnikova G.B., Moisecva S.A., Shckhovtsova Е.Л., Goraev E.V., Sivozhclezov VS. (2007) Ferrocyanide - a novel catalyst for oxymyoglobin oxidation by molecular oxygen. FEBS Journal 274, 5360-5369.
28. Pechkova E., Sivozhclezov V., Nicolini C. (2007) Protein thermal stability: the role of protein structure and aqueous environment. Arch Biochcm Biophys. 466,40-48.
29. Sivozhelczov V., Braud C., Giacomelli L., Pcchkova E., Giral M., Soulillou J.P., Brouard S., & Nicolini C. (2008) Immunosuppressive drug-free operational immune tolerance in human kidney transplants recipients. Part II. Non-statistical gene microarray analysis, J Cell Biochem 103, 16931706
30. Nicolini C, Bruzzcse D, Sivozhelczov V, Pcchkova E. (2008) Langmuir Blodgelt based lipase nanofilms of unique structure-function relationship. Biosystems 94,228-232
31. Covani U., Marconcini S., Giacomelli L., Sivozhelcvov V., Barone A., Nicolini C. (2008). Bioinformatic prediction of leader genes in human periodontitis. J. of Pcriodontology, 79,1974-1983
32. Chirgadzc YN, Zhellukhin EI, Polozov RV, Sivozhelczov VS, Ivanov VV (2009). Binding regularities in complexes of transcription factors with operator DNA: homcodomain family. J Biomol Struct Dyn. 26, 687-700.
33. Sivozhclezov V., Bruzzcse D, Pastorino, L, Pcchkova, E, Nicolini, С (2009). Increase of catalytic activity of lipase towards olive oil by Langmuir-film immobilization of lipase. Enzyme and Microbial Technology 44, 72-76.
Статьи в научных сборниках, тезисы, препринты
34. Buravtscv V.N., Lazarcv P.l. (1990) The Role of Spatial Dispersion of Solvent Permittivity in Electrostatic Interactions in Proteins Molecular Electronics: Proceedings of Santa Clara Conference on Biosensors and Biocomputcrs. New York: Plenum Press, 97-104.
35. Fcdoseyev A.I., Purtov S.V., Lazarcv P.I, Sivozhclezov V.S. (1992) Mathematical modelling of 3D protein moleculc potential in nonlinear media. Proceedings of the International Conference "Physique en I Ierbe-92", Marseille, 1992. p.233-242
36. Sivozhclezov V.S. (1993) Modeling electrostatic interactions of proteins Abstr. Int. Conf. CSAM-93, St. Petersburg, 1993, p.121
37. Nicolini C., Sivozhclezov V.S. (1996) Ab Initio Molecular Design. In: Molecular Bioclectronics, Singapore, World Scientific Publishers, ISBN 9810226853, 9789810226855,266 pps, p.77-110.
38. Горасв E.B., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C (2002). Моделирование каталитического окисления миоглобина. Тезисы докладов конференции по информационно-вычислительным технологиям в наус "ИВТН-2002", Москва, с. 125
39. Горасв Е.В., Моисеева С.А., Постникова Г.Б. Каталитическое окисление миоглобина ферроцианидом калия. Тезисы докладов III съезда Российского биохимического общества, С.Петербург, 2002, с.70
40. Постникова Г.Б., Моисеева С.Л., Шеховцова Е.А., Сииожелезов B.C., Целикова С.В. (2004) Каталитический эффект фсрри- и фсрроцианида на перенос электрона в гсмеодержащих белках: кинетика и механизм. Тсз.докл. III Съезда биофизиков России, июнь 2004 г., Воронеж, т.1, с.87-88.
41. Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Горасв Е.В., Сивожелсзов B.C. (2004) Каталитическое окисление оксимиоглобинов ионами меди. Тсз.докл. III Съезда биофизиков России, июнь 2004 г., Воронеж, т.1, с.88-89.
42. Сабурова Е. А., Дыбовская Ю. Н., Авсеенко П. В., Сивожелсзов В. С. (2005) Применение расчетов электростатического поля белков при выборе ферментов для микрокапсулирования. В сб. "Математика. Компьютер. Образование". Под общей редакцией Г.10. Ризниченко. Ижевск: Научно-издательский центр "Регулярная и хаотическая динамика", 2005. Том 3, ISBN 5-9397-2495-7, с. 923-933.
43. Akishina Т.Р., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2005) Study of elcctorostatic potentials of DNA promotors. Abstracts of the 3rd International Workshop "Quantum Physics and Communication" QPC 2005 Dubna, Russia, 30 June - 3 July, 2005, http://lit.jinr.ru/QPC2005/abstracls.html, p. 38.
44. Nicolini C., Pcchkova E., Sivozhelezov V. (2005) Protein-based quantum computation Part I. Cytochromes and nanoparticlcs for electronic QC. Ibid., p. 42-44.
45. Sivozhelezov V., Nicolini C. (2005) Protein-based quantum computation. Part 2. Possible use of rhosopsins as efficient optical QC dctectors. Ibid., p. 45-46.
46. Marconcini S., Giacomclli L., Sivozhelezov V., Barone A., Covani U. (2006) Prediction of Leader Genes in Human Periodontitis. Abstracts for presentations at the 92nd American Association for Peridontology Annual Meeting, San Diego, http://www.pcrio.org/rcsourccs-products/rescarch-forum06.htm
47. Mayburov S, Nicolini C, Sivozhelezov V (2006). Quantum Effects and Genctics Code: Dynamics and Information Transfer in DNA Replication. Stanford University Library Arxiv preprint q-bio/0611009.
48. Giacomelli L., Sivozhelezov V., Orlando В., Chiappe G., Dcrchi G., Bezerra Т., Barone A., and Covani IJ. (2008) Periodontitis association with diabetes and heart ischemia: a data-mining study. Abstracts of the international Association for Dental Research 86th General Session & Exhibition, Toronto, 2008, Session #63, Abstract 0295, http7/iadr.confcx.com/iadr/2008 Toronto/techprogram/sessionl 9425.htm
49. Иванов В.В., Зрелов П.В., Полозов Р.В., Катаев А.А., Сивожелезов B.C. (2008) К вычислительной биосенсорной нанотехнологии: электростатические свойства ферментов и полиэлектролитов. В сб.: Ядерная физика и нанотехнологии. Под общей редакцией А.Н.Сисакяна. Дубна: ОИЯИ, 2008, ISBN 5-9530-0170-3, с.293-311.
50. Chirgadze Yu.N., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S., Stepanenko V.A., Zrclov P.V. (2008) Recognition of Promoter Binding Regions in the Double-Chained DNA by Transcription Factors with the Use of Molccular Cartography. In: Distributed Computing and Grid-Technologies in Science and Education: Proceedings of the Third International Conference (GRID'2008), Dubna, June 30 - Jule 4, 2008.- Dubna: JINR, 2008, 400 p., ISBN 978-5-9530019-8-4, - p.233-237.
51. Akishina T.P., Ivanov V.V., Zrclov P.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2008) Distributed Computations in Physical Bioinformatics Tasks. Там же, p.221-224
52. Akishina T.P., Zrelov P.V., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2008) Distributed Computations in Physical Bioinformatics Tasks: Calculations of Physicochemical Characteristics and Interactions of Proteins (Protein Data Bank), Their Systematization and Classification/ // Distributed Computing and Grid-Technologies in Science and Education: Book of Abstracts of the 3rd International Conference, Dubna, June 30 - July 4,2008,- Dubna: JINR, 2008.-p.20-21
53. Chirgadze Yu.N., Stepanenko V.A., Zrclov P.V., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2008) Recognition of Promoter Binding Regions in the Double-Chained DNA by Transcription Factors with the Use of Molecular Cartography.- Там же, p.41.
54. Ivanov V.V., Stepanenko V.A., Zrclov P.V., Zheltukhin E.I., Chirgadze Yu.N., Sivozhelezov V.S., Polozov R.V. (2009) Toward I'rotcin-DNA Stereochemical Recognition Codes. In: Mathematical Modeling and Computational Physics (MMCP'2009): Book of Abstracts of the International Conference, Dubna, July 7-11, 2009 . - Дубна : ОИЯИ, 2009. - 228p. ISBN 978-5-9530021-5-8, p. 152.
55. Akishina T.P., Ivanov V.V., Stepanenko V.A., Sivozhelezov V.S., Polozov R.V.. (2009) Toward Classification of Promoter DNAs According to Their Electrostatic Potentials.TaM же, p. 153.
56. Mayburov S, Nicolini C, Sivozhelezov V (2009). Influence of Protein Electrostatic Field on Hydrogen Bonding. Stanford University Library Arxiv preprint q-bio/0911.3563.
Подписано в печать 02.03.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.
Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссс, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сивожелезов, Виктор Семенович
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Способы определения вкладов рассчитываемых электростатических параметров в биомолекулярное узнавание
Взаимодействие цитохрома С с цитохром С-оксидазой и редуктазой
Взаимодействие цитохрома С с цитохромом В
Взаимодействие супероксид-дисмутазы с супероксидом
ДНК- связывающие белки - сигма-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы семейства а
ДНК- связывающие белки семейства гомеодоменов
Роль электростатики в функционировании нуклеиновых кислот
МЕТОДЫ
Вывод выражений для напряженности электростатического поля с учетом структуры растворителя
Методика расчета эффектов модификации лизиновых групп Су1 С при его взаимодействии с мембранными белками
Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг молекулы белка или нуклеиновой кислоты
Методика интерпретации зависимостей скорости и аффинности белок-белковых взаимодействий от ионной силы
Методики химической модификации трипсина поликатионом, измерения скорости ингибирования трипсина соевым ингибитором (СИТ) и констант связывания соевого ингибитора с поликатионом
Пространственное выравнивание структур ДНК-белковых интерфейсов и идентификация инвариантных и вариабельных контактов в них
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Влияние заряженного полимера на взаимодействие белков
Глава 2. Дисперсия диэлектрической проницаемости и вклад отдельных зарядов цитохрома С в его взаимодействие с мембраной
Глава 3. Анализ зависимостей скоростей реакций биомакромолекул от ионной силы
Глава 4. Электростатические лоскуты белков.
Электростатический потенциал супероксид-дисмутазы и его роль в узнавании активного центра супероксид-дисмутазы с супероксид-анионом
Взаимодействие цитохромов Р450 с белком-переносчиком электрона
Взаимодействия ДНК-связывающих белков с ДНК
Второй домен сигма70-субъединицы
Факторы транскрипции семейства гомеодоменов
Глава 5. Распределение электростатического потенциала вокруг промоторных ДНК
Глава 6. Атом-атомные контакты при узнавании ДНК гомеодоменами
Глава 7. Распределение электростатического потенциала вокруг транспортных РНК.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания"
Электростатическое поле белковой молекулы является одной из ее важнейших функциональных характеристик, часто определяющей скорость образования, конфигурацию и стабильность комплексов белков [1-6].
Долгое время считалось, что электростатика слабо влияет на взаимодействия белков в воде. Это мнение основано на превалирующем вкладе энтропийного фактора в термодинамику связывания белков, что традиционно интерпретируется как превалирующая роль гидрофобных взаимодействий [7]. Действительно, если взаимодействие гидрофобное, то основной вклад в его свободную энергию внесет энтропийный член [8]. Однако обратное, вообще говоря, неверно. Известно [9], что энергия электростатического поля не только в вакууме, но и в диэлектрике может быть целиком использована для совершения системой работы. Поэтому она вносит аддитивный вклад в свободную энергию, а не только в энтальпию. При этом энтальпийный и энтропийный вклады определяются зависимостями диэлектрической проницаемости среды от температуры, а именно, они пропорциональны производным <ЦеТ)1с1Т и с1 е!йТсоответственно [10]. Вода же, вещество аномальное во многих отношениях, аномальна и как диэлектрическая среда, а именно её диэлектрическая проницаемость обратно пропорциональна температуре. Поэтому электростатические взаимодействия в водной среде, точно так же, как и гидрофобные, в значительной мере имеют энтропийную природу, и утверждение в первом предложении этого абзаца оказывается необоснованным. Имеются и примеры доказанного решающего вклада электростатики в свободную энергию комплексообразования белков. В частности, это касается белков-переносчиков электрона [11,12].
Взаимодействие же белков с нуклеиновыми кислотами имеет электростатическую природу уже потому, что нуклеиновые кислоты являются полианионоами.
Укажем свойства электростатических взаимодействий, определяющие их ключевую роль в молекулярном узнавании. Во-первых, это наличие у электростатических зарядов знака, который вносит ключевой вклад в специфичность взаимодействия. Во-вторых, это неустойчивость любых систем электростатических зарядов (теорема Ирншоу), предопределяющая способность этих систем к развитию во времени. В-третьих, это уже указанное дальнодействие, исключающее нежелательные (например, приводящие к агрегации) межмолекулярные контакты и способствующие физиологически значимым уже при подходе молекул друг к другу, ещё до образования межмолекулярного контакта.
Поскольку речь в работе идёт о межмолекулярном взаимодействии и узнавании, мы ограничимся рассмотрением-роли электростатики во взаимодействиях белков и нуклеиновых кислот, т.е. будет рассмотрена роль электростатического поля за пределами биомолекул в реакциях с их участием. При этом для анализа электростатических полей выбирается максимальное расстояние, при котором энергии электростатического поля значимы по сравнению с энергией теплового движения, примерно 5 А от молекулярной поверхности. На меньших же расстояниях действуют, помимо электростатических, и другие не менее значительные силы, например, лондоновские и обменные.
Как известно, электростатический потенциал вокруг белковой молекулы определяется в основном зарядами ионизирующихся в нейтральной среде боковых групп следующих аминокислот: катионных - лизина и аргинина и анионных - глутаминовой и аспарагиновой кислот. Поэтому следующим г вопросом, рассматриваемым в настоящей работе, является пространственный масштаб специфичности электростатических потенциалов биомакромолекул. До представленных в настоящей работе исследований преобладало представление о необходимости строгой комплементарности распределений зарядов белков по принципу "одна положительно заряженная аминокислота на одну отрицательно заряженную" для обеспечения белковой системой биологической функции, сделанное в работе [13] на примере взаимодействия цитохрома С с редокс-партнерами - оксидазой и редуктазой. В настоящей работе будет показано, что именно для этих систем это неверно, так же как и для других систем, например цитохром С - цитохром Bs.
Целью работы было определить, какие именно характеристики электростатических полей вокруг макромолекул определяют вклад электростатических сил в молекулярное узнавание белками других белков и ДНК. В работе было выдвинуто и доказано предположение, что такими характеристиками являются односвязные области положительного и отрицательного потенциала - так называемые лоскуты (в англоязычной литературе patches; в топологии -это односвязная область, ограниченная замкнутой кривой, в молекулярной биологии - область поверхности белка), и были исследованы их связи со структурой, функцией и эволюцией белков. Более того, лосукты электростатического поля, в случае, если они выполняют одну и ту же функцию, например связывание с ДНК либо кофактором, почти идентичны (инвариантны) по положению на поверхности белка, размеру и форме даже у очень непохожих по аминокислотной последовательности белков. Кроме того, исследованы электростатические потенциалы вокруг нуклеиновых кислот, где также обнаружены электростатические лоскуты.
В диссертации были поставлены следующие задачи:
1) Изучить зависимость электростатических потенциалов и полей белков от геометрической формы диэлектрической границы между молекулой и растворителем, а также дисперсии диэлектрической проницаемости растворителя.
2) Определить эффективные размеры и заряды белков, рассматриваемых как однородно заряженные частицы, из экспериментальных значений аффиностей и скоростей их комплексообразования при разных ионных силах.
3) Вычислить распределения электростатического потенциала вокруг белков и сравнить их с определенными из задачи 2) параметрами.
4) Сравнить распределения электростатического потенциала в нескольких семействах белков, определить инвариантные области (лоскуты) потенциала внутри каждого из семейств и исследовать инвариантность образующих эти лоскуты заряженных аминокислот.
5) Вычислить и сравнить электростатические потенциалы промоторных ДНК, изучить их вклады в ДНК-белковое узнавание в зависимости от степени конденсации противоионов.
6) Исследовать роль электростатических потенциалов ДНК в ДНК-белковом узнавании, включая и стадию формирования атом-атомных ДНК-белковых контактов.
7) Вычислить электростатические потенциалы транспортных РНК, оценить величины конденсации противоионов на поверхности тРНК и влияние поля тРНК на заряды гистидиновых*остатков аминоацил-тРНК синтета-зы при ее связывании с тРНК.
8) Изучить, насколько электростатическое поле сильно заряженного полимера может изменить скорость взаимодействия присоединенного к полимеру фермента с ингибитором, заряженным противоположно по отношению к полимеру.
Таким образом, две рассмотренные в настоящей работе биохимические реакции относятся к ферментативным - реакция трипсина с ингибитором и супероксид-дисмутазная реакция, четыре - к реакциям межбелкового переноса электрона - реакции цитохрома С с оксидазой, редуктазой, цитохромом В5, перенос электрона с белка-кофактора на цитохром Р450 и две - ко взаимодействию ДНК-связывающих белков с ДНК - бактериальных сигма-факторов и эукариотических гомеодоменов. Заметим, что перенос электрона на цитохром Р450 и взаимодействие указанных ДНК-связывающих белков с ДНК являются компонентами монооксигенации субстратов и РНК-полимеразной реакции соответственно, так что эти реакции тоже можно считать ферментативными.
Для трех рассмотренных классов белков имеется большое количество экспериментальных данных по роли электростатики в их функционировании, что и предопределило их выбор в качестве объектов исследования настоящей в работы. Что касается нуклеиновых кислот, то были выбраны промоторные ДНК, являющиеся физиологическими партнерами рассмотренных ДНК-связывающих белков, и транспортные РНК^из-за их необычного сочетания большого заряда и геометрической формы, более близкой к белку, чем к регулярным нуклеиновым кислотам.
Научная новизна и значимость работы заключается в том, что лоскуты электростатического потенциала впервые введены здесь как параметры молекулярного узнавания на характерных расстояниях около 5 А от молекулярной поверхности биомакромолекул. Эти расстояния относятся к чисто электростатической стадии молекулярного узнавания. Они задаются границей второй гидратной оболочки (~5 А), дебаевским радиусом экранирования при физиологической ионной силе (8 А от зарядов) и бьёррумовой длиной при низкой ионной силе (7 А) - расстоянием, на котором два элементарных заряда в воде взаимодействуют с энергией, равной энергии теплового движения.
Эти расстояния обусловлены также тем, что уравнение Пуассона-Больцмана теряет смысл из-за флуктуаций противоионов и молекул воды и корреляций в их взаимных положениях, а также квантовых эффектов [2,14]. На расстояниях же, больших 5-7 А, энергия электростатического поля становится сопоставимой с энергией теплового движения, и поле не может вносить существенного вклада в узнавание. До настоящей работы в биологической литературе подобные лоскуты вычислялись непосредственно на молекулярной поверхности белков [15,16], но из-за неопределенностей, вносимых указанными эффектами, трактовать их физико-химическую природу не удавалось.
Кроме того, в рамках работы разработан высокоэффективный вариант многосеточного конечно-разностного метода для расчета электростатических потенциалов не только глобулярных (цитохромы, ДНК-связывающие белки), но и протяженных структур, например вытянутых (промоторные ДНК) и сплющенных (мембраны, тРНК).
Основными положениями, выносимыми на защиту, являются:
1) Наличие характеристического параметра поля вокруг макромолекулы — электростатического лоскута, важного для межмолекулярного узнавания.
2) Инвариантность размера, формы и положения электростатических лоскутов в семействах белков даже при отсутствии инвариантности в их первичных структурах заряженных аминокислот, образующих лоскуты, и следующая отсюда эволюционная обусловленность электростатических потенциалов белков.
3) Анизотропия электростатических -потенциалов промоторных ДНК в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, отличающая не только промоторные ДНК от периодических, но и промоторы один от другого, а также участки промоторов друг от друга.
4) Двойственность функции фосфатов ДНК при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов.
5) Почти полное отсутствие конденсации противоионов на транспортных РНК в отличие от двуспиральных ДНК из-за различия в их геометрии. Как следствие, дополнительная индукция электростатическим полем тРНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гистидинов для специфичности и надёжности узнавания.
Практическая значимость настоящей работы обусловлена необходимостью понимания механизмов электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот для создания белков с заранее заданными свойствами. Это особенно касается иммобилизации белков, лежащей в основе биосенсорных технологий. В частности, был выполнен расчёт электростатических взаимодействий, обеспечивающих ускорение реакции фермента трипсина с его ингибитором путём иммобилизации трипсина на поликатионной матрице. Результаты этого расчёта подтвердились экспериментально - константу скорости удалось увеличить более чем**на два порядка. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот составляет основу предсказаний свойств нековалентно иммобилизованных белков, являясь тем самым одним из направлений в новой междисциплинарной области науки - вычислительной бионанотехнологии.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Способы определения вкладов рассчитываемых электростатических параметров в биомолекулярное узнавание. В нескольких разделах настоящего обзора изложены имеющиеся в литературе экспериментальные данные по скоростям специфических взаимодействий с участием рассматриваемых биополимеров и аффинностям образующихся при этом комплексов, с учетом структурных аспектов рассматриваемых процессов узнавания. В настоящем разделе описывается связь этих данных с вычисляемыми электростатическими характеристиками белков. Сами же методы расчета этих характеристик явились предметом нескольких исчерпывающих обзоров [1-6], поэтому будут упомянуты в диссертации лишь вкратце, при обсуждении результатов. Система трипсин - соевый ингибитор трипсина (Глава 1 результатов и обсуждения), в настоящей диссертации используется лишь для оценки влияния поля ковалентно пришитого заряженного полимера на белок-белковое узнавание в этой системе. Поскольку поле использованного полимера заведомо превосходит по напряжённости поля обоих белков, особенности последних в настоящей диссертации не рассматриваются, и соответствующие литературные данные в настоящий обзор не вошли. Что касается цитохромов Р450, исчерпывающий обзор структурных и электростатических аспектов их взаимодействия с редокс-партнерами сделан в [17], а проведенный диссертантом литературный поиск показал, что данные этого обзора не устарели.
Для получения основных результатов настоящей диссертации принципиально важны способы сопоставления рассчитываемых электростатических параметров (потенциалов, энергий взаимодействия и т.п.) с экспериментально наблюдаемыми величинами, характеризующими молекулярное узнавание. Ими здесь являются константы скорости и равновесные константы реакций с участием белков электронного транспорта, ферментов и нуклеиновых кислот. ж.
Выбор способа сопоставления теоретических расчетов с экспериментальными данными определяется тем, является ли рассматриваемая реакция диффузионно-контролируемой или активационно-контролируемой. В первом случае аналитическое выражение для константы скорости удается получить лишь для однородно заряженных сферических молекул путем решения уравнения Фика с соответствующими граничными условиями [18,19]. Для белков же характерна асимметрия распределения заряда, а для многих ферментов - еще и весьма далекая от сферичной геометрическая форма. Для
-с этих случаев разработан метод броуновской динамики (Brownian Dynamics, BD), который представляет собой имитацию траекторий относительного движения двух белков согласно уравнению Ланжевена, причем на каждом шаге траектории к смещению добавляется случайный член, воспроизводящий коэффициенты диффузии белков, и таким образом моделирующий броуновское движение. При BD-моделировании скорости переноса электрона важно принять критерий определения той точки этой траектории, в которой происходит перенос электрона. Подробное изложение метода можно найти в работах [20,21], где он применен к супероксид-дисмутазной реакции.
Метод броуновской динамики применен к моделированию суммарного процесса взаимодействия Cyt С - Cyt В5, включающий и ассоциацию белков, и перенос электрона [22], причем были использованы два подхода: 1) модель порогового расстояния, в которой было принято, что перенос электрона происходит мгновенно при достижении белками определенных ориентаций, характеризуемых межгемовыми расстояниями и двугранными углами, и
2) модель экспоненциальной реактивности, в которой вероятность переноса электрона зависела от расстояния между краями гемов экспоненциально:
Аге1=£°ех р(-да (1) где Я - расстояние между краями гемов, кл и к^ - мономолекулярные константы скорости переноса электрона для данного расстояния и для непосредственного контакта гемов, соответственно.
Выбор между этими двумя моделями непосредственно связан с предположением о том, какая из стадий процесса является лимитирующей. В то время как для модели порогового расстояния реакция является полностью диффузионно-контролируемой, модель экспоненциальной реактивности учитывает соотношение между временем жизни т.н.комплекса столкновения (то есть чисто электростатического комплекса, еще не специфичного по атом-атомным контактам) и характерного времени переноса электрона. Тогда модель оказывается промежуточной между диффузионно-контролируемой и недиффузионно-контролируемой (активационно-контролируемой) реакцией.
Теоретические подходы, основанные на теории активированного комплекса, были разработаны с целью описать влияние ионной силы на скорость окислительно-восстановительных реакций между белками [23]. В этих работах показано, что уравнения, вытекающие из тёЬрий Бренстеда-Дебая-Хюккеля или Маркуса хорошо описывают взаимодействие между малыми молекулами, а в ряде случаев и реакции между малыми молекулами и белками, а также белок-белковые взаимодействия.
Принципиальное отличие между подходами, исходящими из двух упомянутых теорий, заключается в том, что в первом исходят из теории активированного комплекса независимо от типа протекающей реакции, а во втором используется специфика реакций переноса электрона, в которых по теории Маркуса электростатическая составляющая константы скорости определяется энергией парного электростатического взаимодействия.
В первом подходе используется соотношение Бренстеда-Бьеррума, связывающее константу скорости к любой реакции в растворе с коэффициентами активности реагентов /у,/г и активного комплекса /12: где ко - константа скорости при бесконечном разбавлении (нулевой ионной силе). В случае реакции переноса электрона между белками активным комплексом будет комплекс этих белков с достаточно высокой вероятностью переноса электрона между их редокс-центрами. При повышении ионной силы происходит усиление взаимодействия белка-реагента или комплекса со своей ионной атмосферой, что и выражается соответствующим уменьшением коэффициента активности: к = к0/1/2 //12
2)
1п/,=
3)
Яя£0еквТ(\ +кИ,) где - заряд частицы (белка или комплекса), е - заряд электрона, к -выраженный в А"1 обратный дебаевский радиус, равный 0.329 /|/2,1 - ионная сила, Л,- - радиус частицы, ¿о - диэлектрическая проницаемость вакуума, е -диэлектрическая константа растворителя, кв - постоянная Больцмана, Т-абсолютная температура.
Здесь и молекулы белка, и их комплекс представлены непроницаемыми для растворителя сферами с однородным распределением заряда на поверхностях. Заметим, что, поскольку во взаимодействии заряда белка с противоионами играет роль только поле вне белка, такое представление в силу симметрии и по теореме Гаусса эквивалентно точечным зарядам в центрах сфер. Величину этого заряда обычно рассчитывают, исходя из зарядов аминокислотных остатков при данном рН, или оценивают экспериментально из данных потенциометрического титрования и сравнивают с величинами, полученными из тех же кривых, описывающих зависимость скорости реакции от ионной силы. При этом зависимость константы скорости реакции от ионной силы будет описываться при /<0.1 уравнением Бренстеда-Дебая-Хюккеля:
2 Г -72 ГГ7 , Г7 ч2 Л 1п&0 +
8тг£0 еквТ
1 + I+аЯ2 1 + кК где к - константа скорости для данной ионной силы / (и, соответственно, для данного к), -/?ь - радиусы взаимодействующих частиц, 2\,2г- их заряды. Радиус активированного комплекса В. обычно принимают равным
Многие авторы пользуются упрощенным вариантом уравнения (4), принимая, что переходный комплекс и реагирующие ионы имеют одинаковый радиус, Я1=Я2=Я, что вполне справедливо для малых молекул, и получают выражение
При очень низкой ионной силе (к/?с1) зависимость 1п к от 1т становится линейной:
1пА: = 1пЛь + 2.34 2{1гГ
4/2
5а)
Разные варианты уравнения (5) применяются без всяких к тому оснований также и к белкам и в ряде случаев хорошо описывают экспериментальные данные. Причина, видимо, заключается в том, что в этом уравнении правая часть является функцией не более одной переменной размерности длины, и, следовательно, уравнение описывает по существу энергию парного электростатического взаимодействия заряженных частиц в растворе, то есть принадлежит к методам второй группы.
Во второй группе методов наиболее простым является уравнение Веланда-Грэя [23], использующее выражение теории Дебая-Хюккеля для расчета парного взаимодействия однородно заряженных сферических частиц в диапазоне /0-0.3. В нем, в отличие от уравнений первой группы (4-5), параметром является константа скорости при бесконечной ионной силе (&»):
Ък = \пк„--^^
8 тг£0£квТ(К1+К2)
2 С 0~«*г Л
6)
1+Л/?, \+КЯ2;
Уравнение (6) широко используется для описания зависимостей от ионной силы в реакциях переноса электрона с участием белков. При изучении взаимодействия Су1 С с Су1 В5 было показано [23], что близкая к линейной
I м зависимость 1п к от / хорошо описывается уравнением (6) в диапазоне /=0.05-2.5 только при значениях Я\=Я2-К=2 А и 2\2г=-1, что не соответствует ни полным зарядам, ни радиусам реагирующих молекул. Авторы предположили комплементарные взаимодействия заряженных групп в комплексе переноса электрона и предложили, следуя подходу Веланда-Грея, уравнение
1пк = \ъкх +3.576/1 6ХР( (7) где п - число комплементарных взаимодействий, К=2 А и Х\=-2г=\. При более низкой ионной силе, /<0.05, это уравнение редуцируется в уравнение, аналогичное по форме простому уравнению Бренстеда (5а): пк = \пко- 2.34«/172 (8)
При выводе этих уравнений сделано несколько смелых допущений, в том числе предполагалось отсутствие электростатических взаимодействий между ионами, участвующими в комплементарных парах. Последнее, как отмечают сами авторы, справедливо при/>0.1, но, очевидно, не выполняется при низких 2 ионных силах, вследствие чего п в уравнении (8) следовало бы заменить на п .
Следует заметить, что в случае, когда за активированный комплекс принимается не сфера увеличенного радиуса, а две соприкасающихся сферы с радиусами, равными радиусам реагирующих белков, нет необходимости применять соотношение Бренстеда-Бьеррума. Вместо этого можно, исходя из основного выражения теории активированного комплекса: к = (квТ/И)К* (10) где А - постоянная Планка, а К* - формальная константа равновесия между переходным состоянием и исходными веществами, далее выразить К* через коэффициенты активности [24], что приведет к уравнению (2). Можно также вь1разить К* через соответствующую свободную энергию - свободную энергию активации. Электростатическая часть последней будет работой, совершаемой белками для сближения, необходимого для образования активированного комплекса с бесконечного расстояния, т.е. энергией парного электростатического взаимодействия в комплексе. Таким образом, теоретические зависимости констант скоростей переноса электрона от ионной силы, рассчитанные на основе энергии парного взаимодействия (вторая группа методов) могут получаться не только из теории переноса электрона Маркуса, но и непосредственно из теории активированного комплекса.
Как в первой, так и во второй группе методов для уточнения используемых приближений помимо полного заряда применяется учет дипольного момента одной или обеих взаимодействующих молекул [23].
Взаимодействие цитохрома С с цитохром С-оксидазой и редуктазой. Цитохром С-оксидаза и редуктаза - сложные мембранные комплексы, состоящие из нескольких субъединиц, а СуХ С переносит электрон с редуктазы на оксидазу, причем центральным вопросом в функционировании оксидазно-редуктазного комплекса является то, каким образом цитохром выполняет свою роль переносчика, т.е. диффундирует ли он между активными центрами оксидазы и редуктазы или фиксирован между ними [25]. С этим связан и вопрос о контактных площадках на цитохроме С: если они совпадают для оксидазы и редуктазы, то работает первый механизм, т.к. оксидаза и редуктаза не могут занимать одновременно одну и ту же площадку. Первоначально, на основании сопоставления кинетических данных по переносу электрона (константы Михаэлиса) с независимо измеренными константами устойчивости комплекса С с оксидазой предполагалось, что связывание Су1 С с мембраной с высоким сродством (высокоаффинное) обеспечивается в основном оксидазой, а редуктаза также может восстанавливать СуХ С в том же месте связывания [26]. Однако изучение диффузионных характеристик отдельных компонентов митохондриальной электрон-транспортной цепи [27] показало лишь то, что наблюдаемые скорости переноса электрона не достигают диффузионного предела (определенного исходя из измеренных коэффициентов диффузии). Таким образом возможную роль латеральной диффузии Су1 С при переносе электрона между оксидазой и редуктазой с его участием исключить не удалось.
На основании рентгеноструктурных данных было сделано предположение, что во взаимодействиях СуХ С ключевую роль играет кластер из боковых групп лизина, расположенных по краям гемовой щели [28]. Для проверки этого предположения была проведена химическая модификация цитохрома С по остаткам лизина. При замене у нескольких цитохромов типа С всех лизинов на аргинин, не меняющей знак заряда групп, но несколько увеличивающей как их заряд, так и размеры [29] скорость переноса электрона не уменьшилась, т.е. функционально важен главным образом заряд лизинов цитохрома С. Модификация же индивидуальных лизинов реагентами, убирающими заряд, V трифторацетатом (ТФА) и трифторметилфенилкарбаматом (ТФК) (последний более объемист) в примерно одинаковой степени уменьшает скорость переноса, указывая на более важную роль электростатических взаимодействий по сравнению со стерическими [30]. Модификация лизинов 4-карбокси-2,6-динитрофенилом (КДНФ), меняющим заряд на противоположный, дает гораздо больший эффект [13].
Распределение лизинов по степени уменьшения скорости при модификации представлено в Табл. 1.
Табл.1. Эффекты химической модификации лизинов цитохрома С на скорости реакций с оксидазой и редуктазой. Знаки «»> и «=» означают соотношения величин эффектов между различных лизинов цитохрома, числа - номера этих лизинов в аминокислотной последовательности цитохрома.
Модификация Эффект с оксидазой Эффект с редуктазой
ТФА/ТФК (без Ьуэ86) 13>72>87>25 = 8 13>72>79>87>27
КДНФ (без Ьуэ79) 13>72>86>87=8 13>86>87>27
Сравнительная 13>86>87>8>72 13>86>87>8>79
Интересно, что замена соседнего с Ьуз72 лизина 73 не влияет на перенос электрона. Согласно рентгеноструктурным данным, этот лизин, в отличие от а»
72, обращен аминогруппой в сторону, противоположную гемовой щели. С этой же стороны (в литературе называемой задней) располагаются также остатки ШвЗЗ и Ме1б5, при метилировании которых оксидазная активность Су1 С не изменяется [31]. Таким образом, доказано, что "задняя" сторона С^ С в переносе электрона с физиологическими партнерами не участвует.
Предпринята попытка объяснить уменьшение скорости реакции цитохрома С с оксидазой и редуктазой эффектом нарушения ориентации диполя цитохрома при модификации заряженных аминокислот [13]. Авторы оценили дипольный момент наивного Су1 С (300 Б) и рассчитали, насколько он изменится при той или иной точечной замене заряженных аминокислот. Исходя из этого, была оценена дополнительная работа для достижения модифицированным белком ориентации наивного (свободная энергия ориентации). В предположении однородности электрического поля оксидазы и редуктазы зависимость логарифма константы скорости от коэффициента ориентации, определенного как отношение энергии ориентации к потенциалу поля редуктазы, должна быть линейной (кадедой модификации соответствует точка на графике). Точки, соответствующие лизинам, не упомянутым в Табл.1, действительно лежат на прямой, наклон которой дает значение напряженности поля редуктазы 2х 107 В/м. Прочие точки отклоняются от прямой, и чем левее соответствующие модификации располагаются в Табл.1, тем больше отклонение. Показательно, что модификация ни одного из лизинов не приводила к полному подавлению переносу электрона в системе, а данные сравнительной (в присутствии и отсутствии оксидазы либо редуктазы) химической модификации Cyt С по остаткам лизина (3-я строка Табл.1) в целом согласуются с результатами модификации индивидуальных лизинов
32]. Все приведенные данные свидетельствуют в пользу перекрывания контактных площадок для оксидазы и редуктазы на цитохроме С.
Была изучена зависимость скорости реакции Cyt С с цитохро-мом Ci (гемсодержащий фрагмент редуктазного комплекса) от ионной силы
33]. Оказалось, что в диапазоне от 0.22 до 1*13 М константа скорости уменьшается более чем на два порядка, с З.Ох 107 до 1.8х 105 M'V1. Равновесная константа переноса электрона, определенная при высоких значениях ионной силы (>1М) из кинетических и равновесных измерений, оказалась идентичной (0.74), что свидетельствует в пользу недиффузионного контроля реакции переноса электрона. При использовании высокочистого Cyt Ci, содержащего только гем-пептид, зависимость от ионной силы была гораздо слабее [34]. Однако при иммобилизации высокочистого Cyt Q на липосомах зависимости от ионной силы была такой же, как и у мембранно-связанного белка [35].
Бимолекулярная константа скорости переноса электрона от Cyt С к оксидазе при ионной силе 0.2 М составляет Зх 107М"1с"1, а эффект ионной силы на нее двоякий: общее понижение скорости и появление второй кинетической фазы, возможно отвечающей второму, менее зависящему от электростатических взаимодействий месту связывания Cyt С на оксидазе [36].
При этом оцененная из концентрационных зависимостей скорость внутри-комплексного переноса электрона между Cyt С и оксидазой сама по себе зависит от ионной силы и обнаруживает максимум при 0.11 М [37]. Из этого следует, что электростатические взаимодействия в комплексе между двумя белками не обязательно обеспечивают оптимальную, с точки зрения переноса электрона, конфигурацию комплекса, даже в случае физиологических партнеров. При ковалентной сшивке Cyt С с оксидазой карбодиимидом в условиях, соответствующих образованию электростатически стабилизированного комплекса оказалось, что перенос электрона в сшитом комплексе вообще не идет [38], однако при этом свободный Cyt С отдает электрон оксидазе несмотря на наличие ковалентно связанной молекулы Cyt С, хотя и с пониженной примерно вдвое скоростью. Это также указывает на наличие на оксидазе более одного места связывания Cyt С.
При замене ароматического остатка Phe82 на Ser, Тгр и Не оказалось, что реакция с оксидазой практически не замедляется, хотя в случае замены Phe на алифатические остатки Ser и Не (но не ароматический Тгр) вместо моноэкспоненциальной обнаруживается полиэкспоненциальная кинетика, характерная для большего разброса ориентаций в комплексе переноса электрона [39]. При этом пространственная структура цитохрома С в целом не меняется (см.записи банка данных PDB lcif, lcig, leih).
Роль положительно заряженного остатка Cyt С в положении 13 в переносе электрона на оксидазу была подтверждена тем, что его замена на цистеин в дрожжевом Cyt С (Argl3Cys) привела и к общему падению скорости, и к исчезновению одной из кинетических фаз [40]. При этом, вопреки принятой в литературе точке зрения, что солевой мостик этого остатка с карбоксилом в 90-м положении играет важную роль в стабильности глобулы Cyt С, никаких изменений в стабильности при замене не наблюдалось. Замена же 90-го остатка (Asp90Cys), наоборот, понижала стабильность Cyt С, но не его эффективность в реакции переноса электрона с оксидазой.
Мономолекулярный перенос электрона между Cyt С и оксидазой в условиях, когда между ними существует комплекс, изучался для рутенирован-ного по индивидуальным лизиновым группам Cyt С, полученного с помощью (дикарбоксипиридин)-бис-(дипиридин)-рутения(11) [41]. Возбуждение лазерным импульсом приводило к быстрому восстановлению гемового железа Cyt С, а затем происходил перенос электрона на оксидазу. Скорость последнего была примерно одна и та же (константа около 104с"') для Cyt С, рутенированного по Lys25 (периферия гемовой щели) и по Lys 7, 39, 55 и 60 (противоположная сторона цитохрома) и примерно на порядок ниже - по Lys 13 и 27 - в непосредственной близости от гема. Авторы предполагают, что в последних случаях объемистая рутениевая группа создает стерические препятствия для достижения ориентации комплекса, оптимальной для переноса электрона. Рутенирование Cyt С другим реагентом, (4-бромметил-4'метилдипиридин)-(бис-дипиридин)-рутением (II) по 39-му остатку, для этой цели превращенному путем мутагенеза в цистеин, дало при низких ионных силах скорости того же порядка. Однако вышеупомянутый максимум зависимости от ионной силы при 0.11 М воспроизвести не удалось, так как при ионной силе 0.1 М реакция становится бимолекулярной. Бимолекулярная
1 11 константа скорости (около 2.6х 10 М" с" при /=0.23) при этом практически та же, что и у нативного С^ С [42].
Точечный мутагенез медьсодержащего фрагмента бактериальной Су! С-оксидазы дал возможность выявить четыре карбоксильных аминокислотных остатка, ответственных за взаимодействие с Су1 С (три из них консервативны). При этом замена каждого из них снижала скорость переноса на 35-85%, а трех консервативных остатков - более чем в 20 раз. Эта картина практически повторяет вышеупомянутый эффект химической модификации аминогрупп С вблизи гемовой щели и подтверждаете концепцию электростатически комплементарных мест переноса электрона. Бактериальная оксидаза, однако, не является физиологическим партнером Су1 С, и скорости переноса электрона для нативной оксидазы на порядок меньше [43].
При изучении структурных изменений в окисленном Су1 С и оксидазе при образовании комплекса между ними методом резонансной рамановской спектроскопии оказалось, что структурные изменения происходят только в цитохроме, и сводятся к появлению, с 45% содержанием, т.н. конформера II цитохрома С, имеющего более раскрытую гемовую щель, более низкий редокс-потенциал и, возможно, более низкую энергию реорганизации при переносе электрона [44]. Генно-инженерная замена лизинов 72 и 79 на аланин приводят к снижению содержания конформера II до 15% и 35% соответственно, а замена
Lys79 на Ala приводит также и к локальным конформационным изменениям в гемовой щели [45].
Взаимодействие цитохрома С с цитохромом В5. Здесь и далее под цитохромом В5 имеется в виду его растворимый домен, выделяемый с помощью трипсинолиза. Хотя физиологическое значение этой реакции неизвестно, при низкой ионной силе она протекает со скоростями до о | |
5x10е MTV1 [13], типичными для физиологических реакций переноса электрона. Эти скорости только на порядок меньше, чем диффузионный предел для идентичных сферических частиц (7х 109 M'V1). С учетом того, что при переносе электрона между белками не вся поверхность глобулы реакционно-способна, это значение не исключает диффузионного контроля. С другой стороны, приведенные ниже данные убедительно доказывают существование устойчивого комплекса этих двух белков, что говорит в пользу того, что стадия ассоциации является равновесной.
Поскольку структуры Cyt С и Cyt В5 определены с высоким разрешением [46], были сделаны попытки выявить роль электростатических сил во взаимодействии, в особенности роль положительно заряженных лизиновых остатков, окружающих гемовую полость. В результате компьютерной стыковки (докинга) трехмерных структур Cyt С и Cyt В5 [28] была предложена гипотетическая структура комплекса, в котором концевые аминогруппы лизинов 13,27,72 и 79 цитохрома С участвуют в комплементарных электростатических взаимодействиях с карбоксилами Asp48, Glu44 и Asp60 и наиболее экспонированным гемовым пропионатом, соответственно, цитохрома В5. При этом достигается высокая степень комплементарности поверхностей белков в области контакта, достаточная для полного исключения воды. Наименьшее расстояние между краями гемов в предполагаемом комплексе 8.4 А, а двугранный угол между плоскостями гемов -15 градусов. В уже цитированной работе [22] с использованием более сложного аппарата броуновской динамики наряду с подтверждением данных предыдущего исследования была предложена и другая структура комплекса (см. ниже).
Статические исследования были дополнены расчетами комплекса Су1 С -С^ В5 методом молекулярной динамики [47]. Расчеты показывают, что электростатические взаимодействия в месте контакта молекул приводят к образованию гибкого комплекса, в котором разрешены различные относительные положения гемов и конформации аминокислотных остатков. Некоторые из этих промежуточных положений, по-видимому, более благоприятны для переноса электрона, чем сформированные в исходном комплексе.
Существование устойчивого комплекса Су! С с Су1 В5 при низкой ионной ш силе было первоначально экспериментально установлено с помощью ультрацентрифугирования и гель-фильтрации [13]. Зависимость константы устойчивости комплекса от ионной силы, определенная потенциометрическим титрованием [48], совпадает по форме с зависимостью константы скорости переноса электрона в системе, что свидетельствует в пользу активационного контроля реакции переноса электрона, поскольку в этом случае константа скорости переноса электрона пропорциональна константе устойчивости комплекса.
Комплексообразование между С и С}^ В5 изучалось также методом 'Н-ЯМР [49]. Найдено, что при рН 6.3 (27°С, /=0.04), эти цитохромы образуют комплекс 1:1 с константой ассоциации приблизительно 103 М'1. По оценкам характерное время переноса электрона в комплексе составляет примерно 10"5 с, что сравнимо с данными, полученными методом импульсного фотолиза для Zn-замещенного Cyt С, приведенными ниже. Область белок-белкового взаимодействия, как было найдено, включает область поверхности Cyt С лошади, где локализованы Ile81, Phe82, А1а83 и Ile85, а также Lysl3 и Lys72. Эти лизины, как полагают, участвуют в двух важных межмолекулярных комплементарных взаимодействиях с анионными группами Cyt В5. Эти результаты свидетельствуют об участии Phe82 в переносе электрона.
Одной из важных особенностей структуры цитохрома В5 состоит в наличии двух гемовых пропионатов около электронпереносящего участка. Чтобы исследовать их роль в белок-белковом взаимодействии, была изучена в широком наборе экспериментальных условий стабильность комплекса Cyt С и Cyt В5, в котором гем был замещен его диметиловым эфиром (DME-Cyt В5) [50]. Оказалось, что при рН 8 (25°С, 1=5 мМ) DME-Cyt В5 и Cyt С образуют комплекс состава 1:1с константой ассоциации Ка=Зх 10б М"1. При этом значение рН, оптимальное для образования комплекса, значительно выше, чем для взаимодействия между нативными белками. Стабильность комплекса DME-Cyt Bs и Cyt С сильно зависела от ионной силы (значения КА составляли m от 2.4х Ю7 М"1 при 1=1 мМ до 8.2х 104 М"1 при 1= 13 мМ). Эти данные согласуются с предположением о том, что модельный межмолекулярный комплекс [28] описывает белок-белковую ориентацию, которая является преимущественной при нейтральном значении рН.
Восстановление цитохрома С лошади цитохромом В5 экспериментально изучалось спектрофотометрическими методами в широком диапазоне ионных сил в четырех различных буферных системах [13]. Было найдено, что при низких ионных силах скорость реакции линейно уменьшается с увеличением /ш, указывая на то, что электростатические взаимодействия важны для копмлексообразования. Зависимость скорости реакции от ионной силы количественно описывалась теорией Веланда и Грея (уравнение 6) только в том случае, если эффективный радиус взаимодействия полагать 2 А. Согласно теории, это означает, что взаимодействие между двумя белками лучше всего описывается как сумма п комплементарных взаимодействий, каждое из которых включает определенный лизин цитохрома С и, соответственно, карбоксильную группу цитохрома В5. Число таких комплементарных взаимодействий составляло 5-7. Однако, по данным [51], зависимость от ионной силы бимолекулярной константы переноса электрона в области низких ионных сил идет гораздо круче, что исключает роль комплементарных взаимодействий. Это противоречие, игнорированное авторами [51], будет е разобрано в настоящей диссертации при обсуждении результатов (Глава 3).
Модификация индивидуальных лизинов цитохрома С [52] дала следующий ряд по влиянию на скорость переноса электрона в системе Cyt С - Cyt В5: Lysl3=72>79>27>8. При этом, как и с оксидазой и редуктазой, ТФА и ТФК давали одинаковый эффект и полного подавления переноса электрона не достигалось.
Эта же реакция исследовалась для нативного цитохрома С и его мутантов по лизиновым остаткам [22]. Экспериментально и теоретически исследовали влияние модификации зарядов и стерических изменений на скорость переноса электрона. Чтобы предсказать результат влияния аминокислотных замен на константы скорости, использовался метод броуновской динамики. Предполагалось, что сам акт переноса электрона происходит в точках броуновской траектории с вероятностью, изменяющейся экспоненциально с расстоянием между краями гемов в соответствии с уравнением (1). Методом броуновской динамики удалось количественно предсказать константы скорости для нативного Cyt С в большом диапазоне ионных сил. Для этого, однако, параметр модели {3 из уравнения (1) пришлось установить равным 1.0 À"1. В отличие от этого, для моделирования взаимодействия Cyt В5 с лошадиным Cyt С [51] и реакции самообмена Cyt С551 [53] оптимальным оказалось значение (3=1.2 À'1. Последнее значение принято также в классической работе [54]. Теоретически рассчитанные константы скорости располагались в том же порядке, что и ж константы, наблюдаемые экспериментально: нативный Cyt С > Lys79Ala > Lys72AIa > Lys72Ala+Lys79Ala, однако сами константы скорости для мутантных белков были приблизительно на 40% меньше экспериментальных. Причиной этих несоответствий теории эксперименту может являться слишком грубое приближение вероятности переноса электрона (уравнение 1), а также то, что броуновская динамика, полагая молекулы твердыми телами, тем самым неправильно описывает взаимодействия белков на малых расстояниях, определяющие конформацию белков в месте их непосредственного контакта.
Работы по мутагенезу системы Cyt С дрожжей - Cyt В5 быка суммированы в работе [55]. В этой же работе структуры комплексов, полученных методом броуновской динамики в [13], были уточнены путем минимизации энергии.
Рассчитанные броуновские траектории предсказывают конфигурации электростатического комплекса между белками, соответствующие самому короткому расстоянию между их темами, около 12 À. Были предсказаны два преобладающих типа электрон-переносящих комплексов, в которых наиболее часто реализуются следующие взаимодействия: Argl3, Lys87, Lys86 и Lys72 цитохрома С и Glu48, Glu56, Asp60 и гемовые пропионаты Cyt В5 со средней электростатической энергией -13.0 ккал/моль. Другой тип комплекса совпадает с вышеупомянутым комплексом, предложенным первоначально [28], с энергией -6.4 ккал/моль. Важный результат этой работы заключается в том, что форма зависимости скорости реакции от ионной силы (независимо от выбранного значения параметра р) хорошо-воспроизводилась в рамках диэлектрической модели, учитывающей различные проницаемости белка и растворителя, но не модели, игнорирующий это различие. Этот результат показывает необходимость подробного учета геометрической формы белка и распределения его зарядов даже в рассматриваемом примере, в котором и общая геометрическая форма белков, и изолинии их электростатических потенциалов в областях контакта почти сферичны.
Для прямого измерения скорости переноса электрона в комплексе Cyt В5 -Cyt С был с помощью (4-бромметил-4'-метилдипиридин)-(дипиридин)-рутения(П) получен модифицированный рутением по 65-й аминокислоте цитохром В5 [56]. Рутениевая группа в Ru65-Cyt В5, локализованная на расстоянии всего 12 À от гема, но не на участке, контактирующем с Cyt С, служила для фотоиндуцированного инжектирования электрона в комплекс. Лазерное возбуждение комплекса приводило к переносу электрона от возбужденного состояния Ru(II*) к гемовой группе Ru65-Cyt В5 с константой скорости более 10б с'1. Последующий перенос электрона от гема Ru65-Cyt В5 к гему Cyt С был двухфазным с константой скорости быстрой стадии 4х Ю5 с"1 и медленной стадии Зх 104 с"1, что указывает на наличие двух разных путей переноса электрона в комплексе. Разумно предположить, что ими являются пути через Cysl7 и Phe82. С увеличением ионной силы реакция становится однофазной и скорость ее уменьшается, то есть, в условиях, когда комплекс не образуется, работает только один путь. В эхой системе замена Phe82 на Туг, Gly, Leu или Ile не приводит к заметному изменению констант скорости для какой-либо из фаз [57].
Другой подход для прямого измерения скорости переноса электрона внутри комплекса состоит в изучении редокс-реакции между Zn-замещенным Cyt С и Cyt В5 с использованием лазерного импульсного фотолиза [58]:
3Zn-CytC/CytBs(Fe3+) -> Zn-CytC + CytB5(Fe2+) (11)
Здесь 3Zn - фотоиндуцированное триплетное состояние цинк(П)порфирина. Исследовался как нековалентный, так и ковалентно сшитый комплекс. В случае нековалентного комплекса константа скорости составляла 3.5х105 с"1 и кинетика реакции была однофазной, что предполагает единственный путь переноса электрона. Скорость не зависела от концентрации белка и ионной силы, но уменьшалась с увеличением вязкости при добавлении глицерина или сахарозы, указывая на то, что самой медленной стадией является не белокшг белковая ассоциация, а скорее конформационные перестройки в уже сформированном комплексе. Напротив, в ковалентном комплексе наблюдались многофазные кинетики, указывая на присутствие по крайней мере двух путей переноса электрона. Из этих данных была получено значение 3.0x105 с"1 для константы скорости перестройки комплекса 3Zn-Cyt C-Cyt Bs(Fe3+) из начальной конфигурации в более реакционноспособную.
Инфракрасная спектроскопия, благодаря присутствию полос поглощения между 1600 и 1500 см"1, принадлежащим боковым цепям аминокислот, является быстрым и количественным методом изучения электростатических взаимодействий между белками [59]. В условиях, благоприятствующих образованию ионного комплекса между Cyt В5 и Cyt С, наблюдаются изменения в полосе 1562 см"1, принадлежащей боковым цепям остатков Glu. Эти изменения указывают на то, что при взаимодействии белков три ионизованных Glu участвуют в образовании солевых мостиков, что хорошо согласуется с модельными структурами комплекса, упомянутыми выше.
Как уже отмечалось, реакция переноса электрона iso-1-феррицитохрома С (ycytc) и нескольких его мутантов с цитохромом Ь5 (cytb5) была изучены в условиях, в которых она бимолекулярна [22]. Влияние изменения электростатического заряда и стерических изменений на кинетику реакции для мутантов ycytc К79А, К72А, К79А / К72А и R38A. Методом броуновской динамики (BD) была имитирована стыковка и диффузионный перенос электрона. Это было использовано для расчета влияния мутаций константу скорости реакции. Метод количественно предсказывает зависимости константы скорости от ионной силы и полуколичественно от мутаций. И экспериментальные, и расчетные константы располагаются в следующем порядке: нативный ycytc>
К79А> К72А> К79А / К72А. Расчеты предсказывают что два белка взаимодействуют посредством единственного интерфейса, с расстоянием наибольшего сближения двух групп в гем твердого тела стыковки 12 А. Преобладают два класса комплексов (Табл. 2), один из которых определяется контактами между суЛ5 и усуК; С1и48-А^13, С1и56-Ьуз87, АБрбО-ЬуэЗб и гем-пропионат-Ьуз72 соответственно, с электростатической энергией -13,0 ккал / моль. Второй, который ранее постулировался в [28], содержит контакты 01и44-Ьуз27, С1и48-Аг£13, Азр60-Ьуз72 и гем-Ьуз79 и имеющие энергию -6,4 ккал / моль. я»
Табл.2. Зарядовые взаимодействия в гипотетических комплексах цитохрома С с цитохромом В5. Курсивом обозначены контакты в одном гипотетическом комплексе [22,28], - жирным шрифтом - в другом [22].
Су1 С дрожжей цитохромом В 5
Агй13 в1и48 С1и48
Ьув27 С1и44
Ьув72 Нете /АврбО
Ьув79 Нете
Ьуэ87 в1и56
1^86 АярбО
Дальнейшие исследования комплексов цитохрома С с цитохромом В5 проводились с помощью сочетания методов ЯМР и автоматического (в отличие от ручного, как в [28]) докинга [60]. Главным выводом этих работ является то, что на цитохроме С имеется единственная область контакта, а на цитохроме В5
- либо весьма протяженная область, либо две области. К сожалению, однозначно определить конфигурацию комплекса из этих данных не удается. Однако среди множества возможных областей контакта встречаются и те, зарядовые контакты которых представлены в Табл. 2.
Для сравнения приведем также взаимодействие цитохрома С с цитохром С
- пероксидазой, приводящее к образованию физиологического комплекса переноса электрона. Методом интерактивного (ручного) докинга построена гипотетическая модель комплекса [61]. Расстояния в парах, образующих водородные связи и солевые мостики, близки к оптимуму (2.7-3.0 А). В Табл.3 приводится их список для двух цитохромов С и пероксидазы дрожжей.
Табл.3. Зарядовые взаимодействия и водородные связи в гипотетических комплексах цитохрома С с пероксидазой для лошадиного и дрожжевого цитохромов С [61].
Cyt С дрожжей Cyt С лошади Пероксидаза
Агд13 Lysl3 Asp37
Lys27 Lys27 Asp79
Lys72 Lys72 ~ Asp216
Lys87 Lys87 Asp34
Lys86 Lys86 Asp37
Glnl6 Gin 16 Gln86
Thrl4 Gin 12 Asn87
В дальнейшем пространственные структуры комплексов пероксидазы с дрожжевым и лошадиным Cyt С получены методами рентгеноструктурного анализа [62]. Эта структура резко отличается от цитированной выше модельной структуры [61]. В Табл. 4 приведен список водородных связей и солевых мостиков, аналогичный Табл. 3. Видно, что резко уменьшилось число ионных контактов (комплементарных электростатических взаимодействий). По сравнению с Табл. 3 остались ионные контакты Cyt С лишь с наиболее заряженной областью пероксидазы (остатки 32-38), а вместо области 217-224 пероксидазы в контактах участвует С-концевая область, так что вместо Hisl81 на предполагаемом пути переноса электрона в этом комплексе оказывается непосредственно примыкающий к гему пероксидазы Тгр191 и следующие по цепи остатки 192-194, последний из которых экспонирован.
Основных отличий между реттеноструктурными комплексами пероксидаз с лошадиным и дрожжевым Cyt С два. Первое - это гораздо большее (10 против 3) число ван-дер-ваальсовых контактов. Второе - в дрожжевом комплексе гем, сера Cysl7 и концевые атомы Gin 16 цитохрома С расположены гораздо ближе (3.6-4 А) к остаткам 193 и 19*4 пероксидазы, чем для лошадиного
Су1 С (7 А между ближайшими атомами этого фрагмента пероксидазы и гемом Су1С).
Табл.4. Зарядовые взаимодействия и водородные связи в комплексах цитохрома С с цитохром С - пероксидазой для лошадиного и дрожжевого цитохромов, полученных методом рентгеноструктурного анализа [61].
Cyt С дрожжей Cyt С лЪшади Пероксидаза
Lys87 - Asp34
- Lys87 Glu35
- Lys8 Asn38
Asn70 Lys72 G1u290(0Di)
Lys73 - Glu290(0n2)
Взаимодействие супероксид-дисмутазы с супероксидом. Физиологическая функция супероксид-дисмутазы (SOD) состоит в превращении анион-радикала супероксида 02 в пероксид-анион Ог2~ и кислород 02 посредством циклического процесса, в котором супероксид попеременно окисляет и восстанавливает ион меди, входящий в состав молекулы супероксид-дисмутазы:
SOD(Cu2+) + Or ->S0D(Cu,+) + 02" S0D(Cu,+ ) + 0r ->S0D(Cu2+) + 02
Супероксид-дисмутаза состоит из двух^практически идентичных субъединиц, пространственно связанных осью вращения второго порядка. Область межсубъединичного контакта составляет около 15% общей площади субъединиц. Димерность нужна для поддержания пространственной структуры белка в воде. Молекула имеет два активных центра, каждый из которых содержит ион меди и атом цинка, причем субъединицы функционируют независимо друг от друга [63]. Ключевой особенностью супероксид-дисмутазной реакции является электростатическое узнавание между супероксид-дисмутазой и супероксидом. Действительно, эти молекулы реагируют со скоростями порядка
109 M'V1, что характерно для диффузионно-контролируемых реакций при условии продуктивности любого столкновения молекул [64]. При этом, однако, рассматриваемая реакция фактически является реакцией супероксида с ионом меди. Это означает, что для того, чтобы реакция прошла, необходим непосредственный контакт супероксида с ионом меди, площадь которого составляет около 0.01% площади белка. Единственное возможное объяснение столь высокой скорости реакции состоит в том, что электростатические силы направляют супероксид к активному центру белка [64].
Последнее, по-видимому, справедливо для супероксид-дисмутаз всех биологических видов, поскольку анализ последовательностей 15 видов подтвердил, что остатки, определяющие стереохимию активного центра, инвариантны, а область положительного потенциала вблизи активного центра динамически расширена и сглажена за счет*конформационной подвижности этих остатков [65].
Кроме того, анализ последовательностей супероксид-дисмутаз 38 видов на основе пространственных структур SOD быка, дрожжей и шпината показал, что существует целых семь устойчивых вариантов расположения заряженных остатков по краю активного центра, причем их суммарный заряд всегда один и тот же [66].
Общий заряд супероксид-дисмутазы быка при нейтральном значении рН составляет -4 и мешает отрицательно заряженному супероксиду достичь активного центра. Таким образом, если учитывать только общий заряд, электростатическое взаимодействие должно мешать реакции, и ее скорость должна повышаться при более высокой ионной силе. Экспериментально наблюдаемый эффект противоположен [64,67]. Это означает, что главную роль играет заряд непосредственного окружения активного центра супероксидт дисмутазы, который положителен вследствие зарядов атомов металлов и близлежащих аминокислотных остатков Ьуэ 133,134 и Аг£141. Об этом же свидетельствуют зависимости от рН и ионной силы активностей супероксид-дисмутаз различных биологических видов, отличающихся по изоионным точкам (от р/8.0 у овцы до р/4.8 у дрожжей), причем аминокислотные последовательности консервативны у супероксид-дисмутаз млекопитающих и отличаются в области активного центра у дрожжевого белка [68]. Во всех случаях найдено, что взаимодействие белка с субстратом управляется ионизацией двух положительно заряженных аминокислот с рКа 9.2 и 11.0 (для дрожжевого белка -9.1 и 11.4), а зависимости от ионной силы аналогичны для всех супероксид-дисмутаз (20%-я убыль в интервале /=0.02-0.1 М при рН 8.5). Скорость реакции идентична для окисленной (купри) и восстановленной (купро) форм фермента, поскольку внутренний остаток Шб61 при восстановлении меди депротонируется, что частично компенсирует изменение общего заряда активного центра [69,70].
Изучались кинетики ферментативной реакции супероксид-дисмутазы для нативного и модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ), уксусным или янтарным ангидридами белка в зависимости от рН и ионной силы [71]. Было показано, что основную роль в направляющем действии электростатического поля при подходе субстрата к активному центру принадлежит остаткам Ьуэ120 и 1^134. Сравнение кинетических данных для нативного с ПЭГ-модифицированным белком показало, что ПЭГ-модификация затрагивает только Ьув120 и при этом направляющее действие поля сохраняется. Напротив, депротонирование путем повышения рН, модификации всех аминогрупп ангидридами, а также повышение ионной силы снижает бимолекулярную константу скорости до одного и того же значения Зх 108 ГуГ'сЛ
В ряде работ проведено моделирование взаимодействия супероксид-дисмутазы с супероксидом методом броуновской динамики, в которых супер оксид считался однородно заряженным шаром, а для моделирования супероксид-дисмутазы и распределения зарядов на ней использовались различные модели. Для простых моделей, в которых форма супероксид-дисмутазы считалась сферической, а при расчете электростатических сил игнорировалась разница диэлектрических свойств белка и растворителя [19,20] в лучшем случае удавалось воспроизвести лишь знак зависимостей от ионной силы, но наклон кривых зависимостей скорости реакции от ионной силы был сильно занижен.
Расчет распределения электростатического потенциала супероксид-дисмутазы путем решения линеаризованного уравнения Пуассона-Больцмана [72]. Диэлектрическая константа была задана равной 2 для белка и 80 для растворителя. Расчет показал, что, в отличие от модели с постоянной диэлектрической проницаемостью, область положительного потенциала доступна из объема раствора, а не прикрыта потенциалом противоположного знака, вызванным суммарным зарядом белка и зарядом близлежащих карбоксильных групп.
Расчет бимолекулярных констант скорости методом броуновской динамики с использованием этой электростатической модели и топографической модели белка с точностью до атома для супероксид-дисмутазы дикого типа воспроизводит форму зависимости от ионной силы существенно лучше, чем для простой электростатической модели с £-=50 во всем объеме [21,22].
При использовании этой же топографической модели, но при полном отсутствии зарядов, предсказанная константа скорости составила 2х 108, что лишь в полтора раза меньше экспериментально измеренной позднее константы скорости для высокой ионной силы [71].
Такое же исследование для диэлектрических констант 2 и 80 для белка и растворителя проведено в работе [72], но форму зависимости константы скорости реакции авторам воспроизвести не удалось, хотя направление эффекта ионной силы предсказано правильно. Для нативного белка и белка с нейтральным А^141 влияние ионной силы,в этой работе недооценено, а для случая, когда все лизины нейтрализованы - переоценено по сравнению с цитированными в той же работе экспериментальными данными (в последнем случае повышение ионной силы ускоряет реакцию).
Направляющий эффект электростатических взаимодействий был теоретически исследован методом броуновской динамики для различных моделей распределения зарядов супероксид-дисмутазы, включая удаление зарядов с ионизованных аминокислотных остатков [73]. Эти расчеты предсказывают, что удаление заряда приводит к заметному (в 2 раза) изменению скорости лишь для непосредственно примыкающих к активному центру остатков Argl41, Glul31 и Lysl34. Для других остатков этот эффект порядка 20-40%. Ни общий заряд супероксид-дисмутазы, ни степень окисления меди на скорость реакции не влияют, что прекрасно согласуется с вышеприведенными экспериментальными данными [70,71]. Что касается эффекта модификации остатка Argl43, по которому также имеются экспериментальные данные, он, по расчетам [73], сильно занижен. Действительно, химическая модификация дает эффект в 5-50 раз [64,74], мутация на аланин -10 раз, а на лизин (т.е. с сохранением заряда) - в 2,5 раза [75]. Таким образом, хотя часть эффекта модификации Argl43, очевидно, имеет неэлектростатическую природу (например, стерическое блокирование), электростатическая часть эффекта замены Arg 143 в этих расчетах все равно недооценивается. Рассчитанный наклон зависимости от ионной силы для мутантного белка по сравнению с белком я» дикого типа при этом практически не уменьшается, что соответствует экспериментальным данным. Объяснение, видимо, состоит в том, что эффект Argl43 локализован в пределах канала активного центра [64], и его модификация мало влияет на диффузию супероксида в объеме раствора. Остаток Lysl34, напротив, находится на периферии активного центра. У супероксид-дисмутазы акулы этот остаток заменен на Arg - без изменения заряда, и ферментативная активность его при нейтральном pH не отличается от других видов, хотя эта замена отражается на pH-зависимости в щелочной области [76].
Молекулярно-динамические расчеты супероксид-дисмутазы показывают, что мутации в положении 132,133 и 136 не затрагивают канала активного центра [77], в отличие от положения 137, мутация которого снижает ферментативную активность на 30% [78]. ~
При вычислении констант скорости реакции методом броуновской динамики ключевым моментом является критерий, по которому определяется, прошла ли реакция в данной точке броуновской траектории. Таким критерием принимается либо столкновение супероксида с атомом меди, либо приближение его на расстояние менее некоторого фиксированного. Что касается самих значений констант скорости, то в случае грубых моделей супероксид-дисмутазы и поля вокруг нее сравнение их с экспериментом не имеет смысла из-за слишком большого произвола в выборе критерия реакции. Более точные модели, учитывающие геометрическую форму белка и различие поляризуемости белка и воды, во всех случаях дают систематически завышенные значения констант скорости. Возможно, это связано с тем, что канал, ведущий от поверхности супероксид-дисмутазы к атому меди, плотно заполнен молекулами воды, связанными водородными связями, как показало кристаллографическое исследование супероксид-дисмутазы с высоким разрешением [79]. С другой стороны, из этого результата следует, что вместо с диффузии субстрата к атому меди по каналу реакция может происходить путем передачи протона.
Основываясь на распределении заряда супероксид-дисмутазы, с помощью генной инженерии были сконструированы точечные мутанты по остаткам С1и132 и 133 [80]. Эта работа будет рассмотрена здесь наиболее подробно, поскольку в ней скорости реакции и определены экспериментально, и рассчитаны теоретически. Замена любого из этих отрицательно заряженных остатков на нейтральные (Gin) увеличивает скорость реакции. Это соответствует предполагаемому направляющему эффекту положительного заряда области активного центра супероксид-дисмутазы.
Однако в случае двойного мутанта Glul32Gln+Glul33Lys дополнительное введение положительно заряженного остатка понижает скорость по сравнению с Glul32Gln.
Это свидетельствует в пользу диффузионного контроля процесса дисмута-ции, так как в противном случае скорость определялась бы энергией взаимодействия супероксид-дисмутазы и супероксида лишь в реакционноспо-собном комплексе, но не на всей протяженности диффузионных траекторий, ведущих к этому комплексу, и соответственно увеличивалась бы при увеличении электростатического потенциала в области активного центра. Падение же скорости при введении дополнительного положительного заряда в область активного центра, очевидно, вызвано искажением диффузионных траекторий, которые при отсутствии этой замены более эффективны. Кроме того, замена глутаминовой кислоты на лизин (но не на глутамин) приводит к введению дополнительной СНг-группы, что может вызвать стерические затруднения при подходе субстрата.
У всех мутантов, по сравнению с нативным белком, возросли как абсолютные значения констант скорости, так и наклоны зависимостей от ионной силы. Однако теоретический расчет бимолекулярных констант скорости методом броуновской динамики, как и во всех других процитированных здесь работах, для всех вариантов белка дает завышенные значения констант скоростей реакции. При этом форма кривой зависимости скорости реакции от ионной силы воспроизводится лишь для нативных белков, а для всех мутантов наклон теоретических зависимостей меньше экспериментальных. Неточно воспроизводится и соотношение скоростей для различных мутантов. Экспериментально определенное влияние мутации С1и13301п на скорость т реакции при высокой ионной силе оказалось таким же, как С1и132С1п (30%), в то время как броуновская динамика предсказывает эффект мутации около 10% для 01и132 и более чем в два раза для С1и133. Предсказанный наклон зависимости от ионной силы для этих двух мутаций одинаков и соответствует, в интервале ионных сил 19-265 мМ, уменьшению константы скорости в 3 раза, а экспериментально наблюдается уменьшение в 3.5 и 4 раза для остатков 132 и 133 соответственно. Для двойных мутантов 01и(133,132)С1п и ' 01и13201п,01и133Ьуз теоретический расчет даст, в том же диапазоне ионных сил, уменьшение константы скорости в 4 раза, а экспериментально наблюдается уменьшение в 8 и 4 раза соответственно. У всех вариантов белка значения констант скорости при повышении ионной силы приближаются друг к другу и при 265 мМ составляют (6.7-10.6)х 108 М^с"1. Этот эффект не предсказывается вычислительным экспериментом методом броуновской динамики, который дает линейные зависимости логарифма константы скорости от квадратного корня ионной силы в рассматриваемом диапазоне для всех вариантов белка.
ДНК- связывающие белки - сигма-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы семейства ст70. ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) является ферментом, ответственный за транскрипцию, важнейшую стадию и основную точку контроля биологической обработки информации. Начальная стадия транскрипции - узнавание промотора полимеразой РНКП [81]. За исключением некоторых фагов и митохондрий, где они состоят из одной субъединицы [82], РНКП - олигомерные ферменты, с числом субъединиц от 47 у прокариот до >11 у эукариот [83]. У бактерий холофермента РНКП состоит из тесно связанных центральных или коровых субъединиц (агрр'со, [84]) и способной к диссоциации сигма-субъединицы, также называемой сигма-фактором. Сигма-субъединица отвечает за инициацию транскрипции, особенно за РНКП-промоторное узнавание. Коровый фермент содержит каталитический механизм, работающий при синтезе РНК, который достаточен для элонгации и т терминации. Таким образом, сигма-субъединица, как полагают, отделяется от основной РНКП после завершения инициации транскрипции [85]. Однако некоторые исследования показывают, что она может оставаться связанной с основной РНКП и во время элонгации [86]. Все промоторы, узнаваемые сигмой, содержат характерные нуклеотидные последовательности (элементы) на -10 позиции от точки старта транскрипции [87]. Некоторые из них также содержат специфичные последовательности нуклеотидов около -35-й позиции [87], в то время как другие вместо этого содержат т.н. расширенный -10 элемент, достигающий до -17 позиции [88]. Узнавание некоторых промоторов может быть облегчено также С-концевым доменом апьфа-субъединицы [89], но их узнаваемый сайт промоторной ДНК находится гораздо выше по последовательности (upstream), около -60 позиции. Механизм инициации транскрипции рассматривается в [90]. Вкратце, узнавание промотора приводит к формированию комплекса РНКП: промотор, в котором ДНК остается двуспиральной (закрытый комплекс). Дальнейшие этапы инициации транскрипции связаны с расплетанием (плавлением) двойной спирали ДНК с образованием открытого комплекса, в котором читаемая ДНК связана с активным центром РНКП. Происходит абортивная инициация, т.е. высвобождение коротких олигорибонуклеотидов, которая повторяется, пока нарождающаяся цепь РНК не становится достаточно длинной, чтобы вытеснить фрагмент РНКП, блокирующий её траекторию в комплексе инициации. У бактерий этот фрагмент РНКП считается чЗ&гыо сигма-субъединицы.
Выбор именно второго домена ст-субъединицы для сравнительных расчетов электростатического потенциала обусловлен несколькими известными фактами. Во-первых, второй домен участвует в узнавании промоторов как типа -35/-10, так и типа расширенного -10 [91]. Во-вторых, второй домен является самым консервативным и, видимо, выполняет самый широкий набор функций среди структурных доменов членами семейства о-70 [92]. Этот весьма консервативный домен полностью а-спирален. В-третьих, имеются 3D структуры для пяти различных вторых доменов сигма субъединиц, и все эти домены имеют идентичные укладки, что позволяет провести сравнительные исследования. А именно, пространственные структуры имеются для вторых доменов субъединиц ст70 Е. coli, аА Т .aquaticus и Т. thermophilus (последние почти идентичны) [93], все из которых являются первичными сигмами, а также аЕ Е. coli и aR S. coelicolor [94], обе из которых являются внеклеточными (ECF) сигмами. В-четвертых, четыре сигмы отличаются наличием/отсутствием длинной вставки во втором домене. Много субъединиц типа а70 имеют аминокислотные вставки во втором домене (между субдоменами 1.2 и 2.1), которые меняются в длине от ~ 50 до ~ 250 аминокислот [92]. Более длинные вставки часто содержат кислые (отрицательно заряженные при pH 7) петли. Функция вставки в целом и петель в частности пока остается неясной, и этот вопрос рассматривается в данной работе. Из четырех сигм, рассматриваемых здесь, две непервичных сигмы не имеют вставки, сигмы Т. aquaticus и Т. thermophilus имеют ~50-аминокислотные вставки, а су70 Е. coli имеет ~250-аминокислотную вставку. Не имеющие вставки аЕ Е. coli и aR S. coelicolor регулируются анти-сигмами и не требуют автоингибирования, в отличие от трех других первичных сигм. Кроме того, в случае сигм ECF, анти-сигма-фактором является трансмембранный белок, который удерживает сигма-фактор вблизи мембраны. Только после того, как сигнал принимается внеклеточным доменом анти-сигмы, сигма высвобождается и становится способна связывать и основную (коровую) РНКП, и промотор [94].
Основанием для выбора электростатических расчетов в качестве метода анализа узнавания РНКП промотором состоит в общепринятой модели процесса белок-ДНК узнавания, сформулированной в [95], которая включает не менее трех этапов. Узнавание начинается с неспецифического связывания белков с ДНК, которая происходит под воздействием электростатической комплементарности ДНК с контактирующей поверхностью белка [96], а затем одномерной диффузии белка вдоль цепи ДНК, которая ускоряет ассоциацию до ш диффузионного предела и даже сильнее [97]. Наконец, формируются более прочные контакты между ДНК и белком, который возникает, когда белок находит свой специфический сайт.
Из литературы известны расчеты электростатического потенциала для РНКП:ДНК элонгационных комплексов, а именно комплекса для фага Т7 РНКП [98] и комплекса бактериальных РНКП [99], где электростатические потенциалы были спроецированы на молекулярные поверхности. Показано, что положительный потенциал совпадает с расположением двойной спирали ДНК в комплексах. Однако использование молекулярных поверхностей для электростатического потенциала отображение отражает состояние системы, когда ДНК уже сильно связана с РНКП, и не позволяет исследовать роль электростатики на ранних стадиях РНКП: ДНК узнавания.
ДНК- связывающие белки семейства гомеодоменов. В большинстве известных исследований ДНК-белковых комплексов изучалось связывание белков с двуспиральной ДНК в В-форме, в районе ее большого желоба. Авторы [100] проанализировали особенности поверхностей ДНК-связывающих доменов белка, такие как доступность, электростатический потенциал, гидрофобность и консервативность аминокислотных остатков. Оказалось, что наиболее характерным параметром ДНК-связывающих белков, является именно их положительный электростатический потенциал [100]. При узнавании в большом желобе сайт связывания формируется за счет определенной (узнающей) а-спирали, причем ведущую роль играют полярные аминокислоты [101]. Контакты между белком и ДНК традиционно определяются по координатам соответствующих ДНК / белковых пар атомов с помощью таких стереохимических критериев, как пороговые расстояния между углерода в неполярных контактах или параметры водородных связей . Следует отметить, что такое определение контактов не является достаточным для всех случаев, потому что оно игнорирует структурный контекст возникновения каждого данного контакта. В частности, известны "структурные соотношения", выражаемые в виде тензоров, описывающих соотношения между вектором пути основной цепи белка на каждой аминокислоте и плоскостью каждого нуклеотидного основания [102]. В цитированной работе, однако, было идентифицировано семейство белков, где такие отношения оказались очень схожими внутри этого семейства и очень отличными от соотношений других семейств. Поэтому мы выбрали для анализа именно семейство гомеодоменов, учитывая также, что гомеодомены известны как наиболее древнее и консервативное семейство эукариотических белков.
Среди индуцибильных факторов транскрипции, гомеодомены являются едва ли не самым важным в эукариотах, потому что они контролируют дифференциацию развития эмбриональных клеток по тканям или органам. Первоначально обнаруженные у плодовых мушек, эти факторы были найдены и у всех позвоночных животных [103]. Согласно их кристаллографическим структурам, гомеодомены являются тртрехспиральными белками, включающими мотив НТН, к которому присоединена, с его N-конца, осно'вная (положительно заряженная) петля. Взаимодействие гомеодоменов с ДНК были всесторонне проанализированы в [104], но в этой работе не пытались выявить функциональное значение контактов или классифицировать их. Согласно базе данных SCOP [105], насчитывается около 40 гомеодоменов с известными структурами их комплексов с ДНК. Большинство гомеодоменов, даже при самых различных первичных структурах, имеют очень похожие кристаллографические структуры, совпадающие, как правило, со среднеквадратичным отклонением ниже 1 А, и ниже 0,6 А по узнающей спирали. Структуры гомеодоменов очень часто остаются практически неизменными при связывании с ДНК [106]. Исследование методом молекулярной динамики показывает, что не только структура, но также и подвижность гранёного (англ. engrailed, термин описывает узор на крылыйгках дрозофилы) гомеодомена остается неизменной как в ДНК-связанной, так и в свободной форме [107].
Роль электростатики в функционировании нуклеиновых кислот. В то время как электростатический потенциал белков и его роль в белок-ДНК взаимодействии достаточно хорошо изучены (предыдущие разделы Литературного обзора), влияние электростатических свойств ДНК на этот процесс до сих пор остается мало изученным. Электростатические свойства ДНК являются существенными во взаимодействиях ДНК-ДНК и белок-ДНК, а
-т также определяют природу и структуру конденсированных противоионов окружающих ДНК. Поэтому электрические поля и потенциалы ДНК и детали взаимодействия ДНК-растворитель являются предметом большого числа теоретических исследований.
Электростатические модели систем ДНК-растворитель обязательно используют идеализацию из-за большой длины исследуемых фрагментов ДНК. В ряде исследований использовались упрощенные геометрии и распределения зарядов [108], а также идеализированные модели диэлектрических постоянных [109]. Было разработано несколько теоретических методов расчета потенциалов, основанных на полно-атомной модели ДНК. В частности, Клейн и Пак [110] рассчитывали потенциалы при помощи итеративного метода, основанного на законе Кулона и уравнении Пуассона-Больцмана для определения самосогласованного набора потенциалов и ионных концентраций. Джайярам [111] также применял полно-атомную модель для определения электростатического потенциала B-ДНК, используя метод конечных производных для решения нелинейного уравнения Пуассона-Больцмана. Позже Джайярам и Беверидж [112] решили линаеризованное уравнение Пуассона-Больцмана (в приближении Дебая-Хюкеля) аналитически для конечной длины ДНК для определения свободной энергии различных конформаций.
Хохберг [113] аналитически определил электростатические потенциалы и поля вокруг ДНК в приближении исключительно-фосфатной модели диэлектрического слоя при помощи метода"функций Грина, а позже расширили модель до учета всех атомов ДНК [114]. Этот метод включает предположение о симметрии ДНК. Бейли [115] произвел подобные вычисления для потенциала внутренней части ДНК с учетом окружающего растворителя в приближении Дебая-Хюкеля, но учитывая только фосфатные заряды.
В 1999 году был разработан простой и быстрый метод расчета распределения электростатического потенциала вокруг длинных фрагментов ДНК (>1000 п.о.) [116,117], позднее модифицированный для расчета электростатического профиля нуклеотидных последовательностей целых прокариотческих геномов (>1000 п.о.) [89]. Показано, что электростатический потенциал промоторной ДНК может выявлять функционально значимые свойства промоторов, которые не могут быть обнаружены при анализе собственно ануклеотидной последовательности. В частности, в электростатическом профиле дальней upstream области промоторных ДНК ранних генов генома бактериофага Т4 были обнаружены специфические элементы, вносящие вклад в промоторно-полимеразное узнавание через взаимодействие с а-субъединицей РНК-полимеразы [89]. Установлено, что характер этих взаимодействий определяет функционирование ранних Т4 промоторов. В частности, специфика ответа промоторов ранних генов фага Т4 на физиологический сигнал, связанный с АДФ-рибозилированием а-субъединицы РНК-полимеразы, объясняется характером электростатических взаимодействий между upstream областью соответствующих промоторов и С-концевьцл доменом а-субъединицы, электростатические свойства которого изменяются при АДФ-рибозилировании.
Функция тРНК - доставка аминокислот к рибосоме при трансляции, то есть РНК-зависимом синтезе полипептидной цепи. Кроме тРНК, факторов инициации IF1-IF3, фактор терминации RF-3, рибосом и аминокислот, в трансляции участвуют: мРНК, факторы элонгации EF-Tu и EF-G, и аминоацил-тРНК синтетаза (ARSa3a) [118].
Подробная информация о сценарии цикла элонгации приводится в [119]. Она указывает на два различные типа молекулярного узнавания в этом процессе: кодон-антикодон и ARSa3a-TPHK. Специфика первого типа обеспечена водородными связями между комплементарными нуклеиновыми основаниями. Механизмы элонгации в целом [119] и образования пептидной связи в частности [120] хорошо изучены. Однако природа специфики ARSa3a-тРНК узнавания не совсем ясна. В прокариотах каждая аминокислота имеет свои собственные уникальные тРНК и ARSa3y. Тем не менее, фактор EF-Tu не является специфичным для аминокислот, хотя некоторая специфичность была т отмечена среди несобственных комплексов тРНК с аминокислотами [121].
Для белок-нуклеинового узнавания принят иерархический механизм, состоящий, по меньшей мере, из трех этапов [95]. Первый - неспецифическое связывание белков с нуклеиновой кислотой - происходит за счет электростатической комплементарности контактирующих поверхностей нуклеиновых кислот и белков. Второй шаг, одномерная диффузия белка вдоль цепи ДНК, вряд ли подходит для тРНК, имеющую сложную форму и небольшие размеры. Следующим этапом является формирование более плотных контактов нуклеиновых кислот и белков, которое происходит на целевом сайте, уже локализованном на цепи ДНК (в случае ДНК) или РНК, локализованной относительно АКЭазы или рибосомы.
Исследования электростатических потенциалов тРНК были впервые проведены Пюльманом с сотр. [122], которые использовали методы квантовой химии для расчета электростатического потенциала остова тРНК и азотистых оснований в вакууме. В более поздних исследованиях, электростатический потенциал был рассчитан в растворе с помощью решения уравнения Пуассона-Больцмана. Хонигом с сотр. был рассмотрен электростатический потенциал антикодоновой петли тРНК [123] и выявлены различия между инициаторной и элогнгаторной тРНК, а также различия между конформациями РНК, такими как псевдоузел и тетрапетля [124]. Результаты последнего исследования установили, что функции тРНК не могут быть описаны из одной структуры тРНК, но необходимы расчеты электростатического поля.
Специфика тРНК-белкового узнавания остается до сих пор нерешенной проблемой. Например, в работе [125], взаимодействие тРНК с АЛЗазой рассматривается в предположении, что поле тРНК описывается единичным зарядом (монополем), а специфика определяется уникальным электрическим полем АЯБазы.
МЕТОДЫ
Вывод выражений для напряженности электростатического поля с учетом структуры растворителя. Для учета структуры растворителя было использовано основное уравнение электростатики, связывающее электрическое смещения
Ь с полем Ё где р - плотность заряда. Оно традиционно решается в предположении пропорциональности электрического смещения полю: где е - диэлектрическая константа. Последнее предположение означает, что диэлектрический отклик элемента объема на приложенное поле определяется только поляризацией этого элемента объема. В случае ориентационной поляризации каждый постоянный диполь среды будет ориентирован вдоль поля. Это будет не так для взаимодействующих друг с другом диполей, ориентация которых не будет независимой от ориентации соседних диполей. сЦу £>(г) = 4яр (г)
13) = £{г)Ё{г\
14)
Такая зависимость в нелокальном формализме решения задач электростатики учитывается соотношением между D и Е в виде
D(r) = \K(r,ry )Ё{7' )dr[1 (15) где функция отклика К характеризует взаимную зависимость ориентации диполей. В изотропной среде
F')=^(|F-r1) - (16) причем К становится постоянной для больших |r — г'j, что отражает малость корреляции на больших расстояниях, так что в последнем случае вместо уравнения (15) имеем (14).
Решение уравнения (13) проводится с помощью преобразования Фурье
F = jexp(-ikr)dr (17) так что пространственная дисперсия диэлектрической проницаемости вводится в виде зависимости К от волнового вектора к
К(к)= £:"£i +£s (18) 1+^-Рл2 где параметрами являются корреляционная длина сетки водородных связей воды, высокочастотная (короткодействующая) и низкочастотная (дальнодейст-вующая) диэлектрическая константа воды. Это выражение соответствует экспериментально наблюдаемой зависимости проницаемости воды от частоты поля с А=5 А, ei=6 и es—SQ. Таким образом, в этой модели не учитывается структура белка и детали взаимодействия белок-вода. Предполагается, что они могут быть в некоторой степени описаны взаимодействиями, наблюдаемыми в чистой воде. Основанием является то, что пространственный масштаб невалентных взаимодействий внутри белка и между белком и водой близок к масштабу этих взаимодействий в воде и составляет несколько ангстрем. Подставляя в (13) выражение (15), а также соотношение между потенциалом и напряженностью поля
Дг) = -вга<1р(г) (19) и условие точечности заряда
Р{г) = д3{г) (20) а затем применяя преобразование (17), ползаем р{к)= (20) К(к)-к
Подставляя выражение (18) в (20) и применяя преобразование, обратное
17)
Р"1 = —/ ехр {-йг)Ог (22)
2лполучаем окончательно выражение для потенциала точечного заряда р(К) = ^[{Уе, -1Я)е*р(-Я/Л) + 1/^] (23) и для поля точечного заряда в зависимости от расстояния от него
Е{К) = -Ш/е, - 1/е5 XI + Я/Л)ехр(- Д/Л) + \/ех ] (24) к
Аналогичное выражение получаем и для однородно заряженной плоскости, в зависимости от расстояния d от плоскости
E(d) = —[{l/s, -1/*, )exp(—d/A) +1¡st ] (25)
Методика расчета эффектов модификации лизиновых групп Cyt С при его взаимодействии с мембранными белками. Модификация Cyt С изменяет заряды групп на его поверхности и, соответственно, изменяет энергию взаимодействия модифицированного Cyt С с партнером. Последнее было представлено в работе [13] как взаимодействие системы точечных зарядов с однородным электрическим полем. Следуя этой работе, координаты Cyt С из сердца лошади брали из Protein Data Bank и остаткам Cyt С приписывались заряды по -0,5 на терминальные атомы кислорода аспартата, глутамата и гемового пропионата, по +0,5 на терминальные атомы азота аргинина и +1,0 лизина. Разница в энергии между двумя положениями системы относительно поля для произвольного поля Ё , соответствующих лизин-модифицированному и нативному цитохрому, составляет
LU = ^\qMW (26) где qi - z'-й заряд, ri - его координаты. В случае однородного поля (26) превращается в выражение
AU ~гц) = E(j}2 -Д ) (26а) где ц - дипольный момент Су1 С, а индексы 2 и 1 соответствуют опять лизин-модифицированному и нативному цитохрому. Эта разница в энергии интерпретируется как дополнительная свободная энергия активации, необходимая для того, чтобы молекула модифицированного Су1 С достигла ориентации нативной молекулы. В случае однородно заряженной плоскости с пространственной дисперсией проницаемости выражение (24) может быть подставлено в (25а), давая "нелокальный" аналог уравения (25а): ас/ = £1ос(^Г,-Апоп1) (266) где
Кс . Нелокальные эффекты в этом случае сводятся лишь к модификации значений дипольного момента, теперь учитывающих близость каждого из зарядов к заданной поверхности. Для заряженного диска аналитического выражения для Д£/ получить нельзя, и интеграл (26) рассчитывали численно по формуле Симпсона.
-ш
Эффект модификации лизинового остатка определялся из уравнения константы скорости теории активированного комплекса к = А ехр(-Ав#/квТ) (27) где АС? - свободная энергия активации. Если С/ есть изменение свободной энергии активации за счет модификации, то для модифицированного белка получаем к0 А ехр(- АО /къТ) - ' где к0ик- константы скорости для нативного и модифицированного белка, соответственно. Для каждого из вариантов белка, модифицированных по определенному лизину, рассчитывалось свое значение U а также экспериментально измерялась величина к/ко. Таким образом, зависимость 1п (к/ко) от U должна быть линейной. В свою очередь, U прямо пропорциональна поверхностной плотности заряда редокс-партнера Cyt С, которая априори неизвестна. Поэтому для всех модификаций Cyt С рассчитывалось отношение U к плотности заряда. Соотношение между поверхностной плотностью заряда и напряженностью поля в случае однородного поля определяется как
Е = ег /ее о, (29) так что плотность заряда сможет быть выражена в единицах напряженности соответствующего однородного поля, даже«если поле в действительности не является однородным (см. уравнение 26а). Для "нелокального" случая оно представляет собой поле на достаточном удалении от заряженной поверхности. Дополнительная энергия активации рассчитывалась на единицу однородного электрического поля, U/E. Эту величину, следуя авторам [13], мы называем фактором ориентации. Если отложить экспериментально найденные 1п к против рассчитанных значений фактора ориентации для каждого из лизин-модифицированных вариантов Cyt С, получается прямая линия, из наклона которой можно определить неизвестное значение плотности заряда ст: ln (k/ko)=(q/£ e0)x(U/E) (30)
Вышеописанная модель требует дальнейшего уточнения и является первым приближением для оценки эффекта пространственного распределения проницаемости, позволяющей, однако, учесть важное физическое свойство воды как структурированного растворителя,
Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг молекулы белка или нуклеиновой кислоты. Распределение электростатического потенциала белка вычислялось путем решения уравнения Пуассона-Больцмана, получаемого при подстановке в правую часть уравнения (13) пространственного распределения зарядов белка или ДНК и пространственного распределения зарядов подвижных ионов, распределенных по энергии по Больцману:
-У^(г)У^(г)) = 4л:(^0(г) + Л^(г))) (31) где ф - потенциал, & -диэлектрическая проницаемость, ро- плотность зарядов атомов белка или ДНК, для которой будем использовать выражение ро=2,г,(?5(Я) (где г,-, заряд /-го заряженного атома молекулы, - радиус-вектор этого атома, е - заряд электрона), р ехр(-2,еср/£в7) - плотность зарядов ионов (где щ - концентрация ионов /-го типа, 2,- - заряд иона /-го типа. Уравнение (31) нелинейное, т.к. член р1 в правой части содержит неизвестный потенциал под экспонентой.
Кроме уравнения (31), будем также рассматривать упрощенные модели: 1) Уравнение Пуассона (описывает поле молекулы в отсутствие соли в растворе)
-У(^(г)У^(?)) = 4л-р0(г) (32)
2) Линеаризованное уравнение Пуассона-Больцмана:
- У(е(г)У<р(г)) + к2<р(г) = 4тгр0 (г) где к2;=е2(Е]«] ^ )/квТ- квадрат обратного радиуса ионной атмосферы дебаевского радиуса).
Граничное условие для потенциала определяется тем, что на достаточном удалении от белковой глобулы потенциал не зависит от диэлектрической проницаемости внутри глобулы. Поэтому для численного решения бесконечную область заменим достаточно большим параллелепипедом Г, на границе которого примем
Использовались три варианта зависимости диэлектрической проницаемо ста от координат: •
1) Постоянная диэлектрическая проницаемость во всей области;
2) Ступенчатая зависимость: где ер, е8 - диэлектрические проницаемости белка и воды, г - радиус-вектор ближайшего атома белка, г0 - средний радиус этого атома белка плюс эффективный радиус молекулы растворителя (принят равным 1.4 А); ш
3) Плавная экспоненциальная зависимость:
34) ер, если г-гр <г0 если г-гр >г0
35)
1/е(г )=(1/бр-1/е8)ехр(-|г - гр|/г0)+1/е8 (36)
При дискретизации области на каждом конечном элементе диэлектрическая проницаемость по всему элементу полагается равной ее значению для радиус-вектора центра элемента. Размер элемента в практических расчетах составлял 0.5-2.0 А, что при величине Л порядка 5 А позволило хорошо приблизить плавную зависимость диэлектрической проницаемости.
Для решения уравнения Пуассона-Больцмана в настоящей работе применен метод, предложенный для решения конечно-разностных систем уравнений [126]. Идея метода состоит в том, что высокочастотные (быстро меняющиеся) компоненты поправки к текущему приближению решения искать на мелкой сетке, а для вычисления соответствующих гладких компонент использовать более грубые сетки. Заданная точность решения дискретной задачи при этом достигается за О(А0 арифметических операций (здесь N - число узлов сетки).
Решение нелинейного уравнения (31) проводилось итерационно
-У(£У<рп+1) + ар"н =4я(р0 +р1(<рп)) + а<рп (37) где ф"- /2-е приближение решения. Таким образом, на каждой итерации
V, м-М гч решается линеиная задача относительно ф . В качестве начального приближения берется, например, решение задачи (33).
Для решения задач (31-33) с граничным условием (34) область Г разбивается на конечные элементы. Приближение решения ищется в конечномерном пространстве £ базисных функций конечных элементов Ф'(г): = 2й'ф< (38>
Применение к уравнениям (31-33) с учётом (34) и (35) метода Галеркина
126] приводит к линейной алгебраической системе уравнений для определения коэффициентов и:
Аи=/ (39)
Система (39) решается многосеточным методом. В ММ используется последовательность сеток конечных элементов, таких, что = 2^,5м ей,/=0,1 (40) где А/ - шаг сетки с номером /, 51 - соответствующее пространство базисных функций. Сетка с номером 0 - самая грубая (с наибольшим шагом йо). Число неизвестных на ней невелико, поэтому система уравнений для этой сетки может быть быстро решена прямым методом, например, гауссовым исключением. Надо получить решение на самой подробной сетке. Решение системы линейных уравнений на сетке Ь ищется итерациями с использованием вспомогательных сеток 0,1,-1. На каждой итерации задача сводится к меньшей системе на сетке Ь-1, для решения которой рекурсивно применяется тот же алгоритм. Алгоритм одной итерации ММ для сетки / приведен ниже: procedure mgm(/,w/j/J) array uifû if /=0 then iio:=A~lf0 else begin integer J; array d,v; ui=RELAX(Ai,ut,fi); d:= //"' (fi - Ami); v:=0; for j:=1 until y do mgm(/-l,v,c/); щ := м/ + //, v;
W/:=RELAX (Ai,uijï)\ end
Здесь величины с индексом I относятся к сетке с номером /; запись обозначает процедуру прямого решения на сетке /=0 с малым числом неизвестных; /- оператор перевода с одной сетки на другую; RELAX -итерации типа Гаусса-Зейделя для подавления высокочастотных компонент невязки.
Критерием окончания процесса решения является норма вектора невязки r=\f-Au||. Для достижения г/||/||<10"5-ь10~б обычно требуется 4-5 итераций. Если же в качестве начального приближения на сетке L взять решение, полученное на сетке 1,-1, то потребуются всего 1-2 итерации.
Методика интерпретации зависимостей скорости и аффинности белок-белковых взаимодействий от ионной силы. Сравнительный анализ соответствия уравнений (4-8) экспериментально полученным зависимостям констант скорости переноса электрона от ионной силы проводился посредством нелинейной регрессии. Поскольку каждое в отдельности из этих уравнений широко применяется к исследованию взаимодействия белков, они приводятся и обсуждаются в Обзоре литературы. Бимолекулярные константы скорости окисления МЬОг и Cyt В5 феррицитохромом С при различных значениях рН и ионной силы имеются в литературе (Обзор литературы). Методом нелинейной регрессии определялись неизвестные параметры уравнения, при которых достигается наименьшая сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от теоретической кривой (5), а также-фактор взаимозависимости (£>). В качестве неизвестных параметров в уравнениях (4-6) фигурировали ко, 2\2г и так как размеры Су1 В5 и Су1: С примерно одинаковы, а заряды входят в виде произведения во все уравнения, кроме (4). Если заряды в уравнении (4) варьировали независимо, то получали, что 2\=-2г.
Для учета рН-зависимых электростатических взаимодействий (в исследуемой области рН это взаимодействия с участием остатков гистидина) проводилась аппроксимация зависимостей от ионной силы при определенном рН (рНг), исходя из параметров уравнения (6), полученных для более высокого рН (рН1), с помощью модифицированного уравнения (6) - е Г рН: ю 8 яе0£къТ гЛ)рн,ехР(-*Арн,) + пс ехр(-х#с) 1 + 1+лЯс ,
41) в котором фиксировались значения и Я, полученными для рНь и было добавлено пс электростатических взаимодействий индивидуальных зарядов аминокислот при Яс-2 А, как в модели комплементарных взаимодействий. Подгоночными параметрами в этом случае были пс и
В уравнении (7) задавались размеры дисков р в интервале 3-20 А, а в качестве неизвестных параметров определяли ко и 2\Хг!ъ, так как точное значение диэлектрической проницаемости 8 электрон-переносящем комплексе неизвестно и может в подобных системах варьировать от 2 до 80 [127].
Методики химической модификации трипсина поликатионом, измерения скорости ингибирования трипсина соевым ингибитором (СИТ) и констант связывания соевого ингибитора с поликатионом. К поликатиону поли-М-этил-4-винилпиридинийбромйду с молекулярной массой 1.8х105 Ба. содержащему 3% остатков ЛГ-(со-карбоксидодецил-пиридиний-бромида, ковалентно, при помощи 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида пара-толуолсульфоната (КДИ) присоединяли трипсин. Выделение модифицированного белка проводилось методом ионообменной хроматографии на карбоксиметил-целлюлозе, на которой время удержания поликатиона гораздо больше, чем у всех остальных компонентов реакционной смеси. За кинетикой ингибирования трипсина соевым ингибитором следили спектрофотометриче-ски по кинетике гидролиза этилового эфира бензоиларгинина. Таким образом, в исследуемой системе трипсин ковалентно присоединен к поликатиону, а СИТ в условиях эксперимента (рН 8) заряжен отрицательно [128].
Взаимодействие СИТ с поликатионом изучали методом тушения флуоресценции. Для этого в СИТ вводили флуоресцентную метку цинк-копропорфирин (ЦКП), которую ковалентно присоединяли к аминогруппе СИТ по одной из карбоксильных групп ЦКП, активированных КДИ. Выделение модифицированного белка проводилось методом жидкостной хроматографии высокого давления при одновременном детектировании выхода белка (по поглощению) и порфирина (по флуоресценции), так что пик, соответствующий модифицированному белку был единственным, присутствующим на обеих хроматограммах. К СИТ присоединялась одна молекула ЦКП, при этом конъюгат СИТ-ЦКП сохранял 100% ингибиторной активности. Поли-№-этил-4-винилпиридинийбромид, как известно, является эффективным тушителем флуоресценции [129]. При расчете кинетических констант пользовались концентрациями активных центров трипсина и СИТ, определенными по выбросу оптической плотности при добавлению к раствору трипсина нитрофенилгидразинбензоата, а ингибитора - по излому на кривой титрования трипсина ингибиором [130]. Условия кинетических измерений и титрований приведены в подписях к соответствующим рисункам (Результаты и Обсуждение).
Константы диссоциации комплекса конъюгата СИТ-ЦКП с трипсином (в том числе ковалентно связанным с поликатионом) были рассчитаны из кривых титрования трипсина конъюгатом СИТ-ЦКП. Для этого экспериментальные данные подгонялись к уравнению, связывающему концентрацию активных центров фермента Е, с общими концентрациями фермента и ингибитора /о и Ео и концентрацией субстрата 5 [131]:
0 £
42)
-Е/Е0 Км Е где Км - константа Михаэлиса. Константы Скорости ассоциации трипсина с ингибитором рассчитывались из кинетических кривых убывания концентрации активных центров трипсина в предположении второго порядка реакции.
Пространственное выравнивание структур ДНК-белковых интерфейсов и идентификация инвариантных и вариабельных контактов в них. Для сравнения атом-атомных контактов нескольких ДНК-белковых комплексов необходимо провести пространственное выравнивание интерфейсов. Однако применение общепринятых алгоритмов пространственного выравнивания белковых ж структур (по С-альфа атомам) или двуспиральных ДНК (по параметрам Дикерсона) необоснованно для интерфейсов белок-ДНК, поскольку геометрии белковых альфа-спиралей и двойных спиралей ДНК сильно различаются и по радиусу спирали, и по расположению относительно нее боковых групп. Мы разработали для пространственного выравнивания ДНК-белковых интерфейсов оригинальную процедуру, в которой попеременно (итеративно) совмещаются либо С-альфа атомы узнающих спиралей, либо атомы, участвующие в контактах во всех исследованных комплексах. Пространственное выравнивание производилось с использованием пакета программ МОЬМОЬ.
Идентификация атом-атомных контактов проводилась по пороговому расстоянию 3,35 А для полярных контактов, в том числе и для контактов через молекулу воды, и 3,9 А для неполярных контактов. Инвариантными считались контакты, присутствующие во всех исследованных комплексах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Сивожелезов, Виктор Семенович
ВЫВОДЫ
1) Разработан вариант многосеточного метода решения уравнения Пуассо-на-Больцмана и построен соответствующий высокоэффективный алгоритм для расчета электростатических потенциалов больших молекул с атомным разрешением: глобулярных белков, протяженных структур (длинные двухцепочечные ДНК до 1000 пар оснований, мембраны, тРНК). Алгоритм реализован в виде программного обеспечения, функционирующего в том числе и в распределенной вычислительной среде ГРИД.
2) Показано, что электростатический лоскут является характеристическим параметром поля вокруг макромолекулы, важным для межмолекулярного узнавания. В белок-белковом узнавании механизм электростатического узнавания посредством полей (электростатических лоскутов) является преобладающим. В этом случае именно лоскут ответственен за раннюю стадию узнавания. Значительно реже встречается механизм контактов заряженных атомов (зарядовая копмлементарность),
3) Найдено, что размер, форма и положение электростатических лоскутов в семействах белков инвариантны, даже если в их первичных структурах заряженные аминокислоты, образующие лоскуты, не являются инвариантными, указывая на то, что не только структуры белков, но и их электростатические потенциалы подвержены эволюционному отбору и поэтому эволюционно обусловлены.
4) Величина электростатического потенциала промоторных ДНК, являющаяся важной характеристикой при узнавации белками ДНК, определяется её первичной структурой и зависит от степени конденсации противоионов. Появление лоскутов отрицательного потенциала обусловлено степенью конденсации противоионов, равной наблюдаемой в эксперименте.
5) Электростатические потенциалы промоторных ДНК характеризуются протяжёнными участками однородного потенциала, чередующиеся с участками неоднородного потенциала, в частности анизотропного в направлении, перпендикулярной оси спирали. По однородности электростатического потенциала промоторы Е. coli резко различаются также на всей их протяженности. Из потенциалов ДНК периодических последовательностей наиболее однородным является потенциал поли (AT).
6) Найдено, что при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК функция фосфатов ДНК двояка: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов. Найдено два типа контактов: инвариантные контакты характеризуют семейство гомеодоменов и выделяют их среди всех ДНК-белковых комплексов. Вариабельные контакты специфичны для индивидуальных комплексов внутри семейства гомеодоменов.
7) Показано, что конденсация противоионов на транспортных РНК, в отличие от двуспиральных ДНК, практически не происходит из-за квазиглобулярной геометрической формы тРНК. Как следствие, электростатические поля тРНК дополнительно индуцируют заряды на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гиетидинов, что обеспечивает необходимую специфичность и надёжность узнавания.
8) На модельной системе трипсин+полцкатион-соевый ингибитор (СИТ) экспериментально показано, что электростатические поля способны существенно (два порядка) увеличить скорость белок-белкового взаимодействия. Узнавание происходит посредством связывания СИТ с поликатоном (конденсация) и затем одномерной диффузии СИТ по цепи поликатиона к специфическому месту контакта.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа относится к наиболее ранней и дальней стадии биомолекулярного узнавания - сближению и взаимной ориентации биологических макромолекул. В последние годы в мировой литературе наличие этой стадии постепенно становится общепринятым, и для ее обозначения даже появился новый термин «ухаживание» (англ. courtship) белков и ДНК друг за другом
170]. Если ранее комплекс столкновения, примерно соответствующий обсуждаемой нами ранней стадии узнавания, считался гипотетическим, то теперь его наличие можно считать установленным экспериментально с помощью нового ЯМР-метода PRE - "Paramagnetic relaxation enhancement"
171]. Этот метод позволяет измерять расстояния между молекулами до 25 А. Ранее используемый метод (NOE, "ядерны^ эффект Оверхаузера") был ограничен расстояниями 5-6 А. Теперь в рамках этого метода возможна и оценка соответствующих констант ассоциации с помощью титрования [172,173]. Разумеется, молекулярное узнавание этой стадией не исчерпывается. В последнем разделе главы 4, касающейся узнавания ДНК-гомеодомен, рассмотрена и последующая стадия точечных атомных контактов, формирующих интерфейс физиологического комплекса гомеодомена с ДНК, и электростатические эффекты рассмотрены в контексте всего процесса биомолекулярного узнавания.
Оказалось, что для полуколичественного описания ранней стадии узнавания достаточно рассмотреть электростатические лоскуты - односвязные области электростатического потенциала одного знака, ограниченные замкнутой кривой, причем поверхность, на которой изображается лоскут, находится на расстоянии порядка 5 А от молекулярной поверхности белка или ДНК, что примерно соответствует внешней границе второй гидратной оболочки. То есть, лоскуты проявляются именно на таких расстояниях от биомолекул, где воду уже можно считать однородной средой, но энергия единичного заряда в поле данной молекулы все еще превосходит энергию теплового движения. Таким образом, применение весьма грубого приближения - уравнения Пуассона-Больцмана - оказывается именно для этой, наиболее ранней стадии узнавания, оправданным.
Наличие лоскутов выведено в настоящей работе из экспериментальных зависимостей аффинностей белковых комплексов и скоростей их образования от ионной силы. Впервые обнаружено специфическое (функциональное) распределение лоскутов вокруг биополимеров. Оказалось, что если функция гомологичных белков идентична, то лоскуты вокруг них консервативны. Однако те заряженные аминокислоты, которые образуют лоскуты, не всегда являются консервативными. В отличие от консервативных аминокислот, ответственных за пространственную структуру белков, аминокислоты, образующие лоскуты, "консервативны" лишь настолько, настолько это необходимо для консервативности лоскута, но не обязательно консервативны в первичной структуре белка. Из этого следует, что электростатические поля являются тем физико-химический фактором, который подвержен эволюционному отбору, а сами лоскуты являются эволюционно обусловленной характеристикой.
Биологическая значимость лоскутов проявляется в ориентации и фокусировке биомолекул в поле других молекул при их сближении, нейтрализации зарядов фосфатов ДНК зарядами аминокислот лизина и аргинина, одномерной диффузии заряженного белка вдоль цепи заряженного полимера, индукции полем транспортной РНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе и других явлениях, изученных в настоящей диссертации.
В ряде работ, цитированных в обзорах [1-6], уравнение Пуассона-Больцмана используется и для расчета энергии связывания в комплексах биомолекул, то есть при непосредственном их контакте. Однако фактически (хотя не все авторы это признают) варьируемым параметром в этих работах является положение диэлектрической границы раздела между биомолекулой и растворителем, в зависимости от которой рассчитываемые энергии меняются на порядок величины и даже меняют знак. Если же, как в настоящей работе, рассчитываются и сравниваются электростатические потенциалы биомолекул на достаточно большом расстоянии от белков, эта проблема не возникает. Суть т настоящей работы - не столько в физическом методе расчета электростатических потенциалов, сколько в сравнительном анализе этих электростатических потенциалов, без чего биологический смысл проведенных расчетов в значительной степени теряется. Подобное сравнение электростатических потенциалов белков и их классфикация на этой основе известны, но предсказательная сила этих расчетов весьма ограничена [100,174]. По мнению в диссертанта, причиной является картирование потенциала, рассчитанного, как и в настоящей работе, по Пуассону-Больцману, но, в отличие от нее, непосредственно на молекулярной поверхности, что физически бессмысленно. Как из настоящей работы, так и из литературных данных последних лет следует, что для повышения биологической значимости своих результатов вычислительная молекулярная биофизика должна дополняться сравнительным анализом возможно большего числа белков-гомологов исследуемого белка. Это значит, что должно параллельно решаться большое число однотипных вычислительных задач. Адаптация программного обеспечения для распределенных вычислительных сред, выполненная в рамках настоящей работы, направлена на решение именно таких задач.
С другой стороны, в биоинформатике сравнительный анализ применяется уже давно, но лишь для структур - вначале первичных, а с середины 1990-х годов и третичных, потому что оказалось, что у белков очень непохожих последовательностей могут быть практически идентичные пространственные структуры. Настоящая работа показывает, что и этого недостаточно. Причина в том, что аминокислоты, отличающиеся по положениям и в первичной, и в третичной структурах, могут образовывать похожие электростатические лоскуты. Понимание этого факта в мировом научном сообществе растёт - уже разработаны программные средства для классификации электростатических потенциалов биомолекул [175-177], а среди биоинформатиков-эволюционистов возникло даже понятие «электростатическия эволюция» [178].Таким образом, настоящая работа, начатая еще в 1980-е годы, теперь оказалась в русле новейших тенденций развития как вычислительной молекулярной биофизики, так и биоинформатики.
Наличие лоскутов оказалось достаточным для ранней стадии молекулярного узнавания, в противоположность необходимости электростатической комплементарности аминокислот контактирующих белков для узнавания, предполагавшейся ранее. Для ряда белков, а также для ДНК в В-форме, показан фокусирующий эффект потенциала на приближающийся партнер-биомакромолекулу. Новым в методическом отношении является применение распределенных вычислений для расчетов электростатических потенциалов ДНК, белков и их комплексов.
Главная проблема, не решенная в настоящей работе, как и в биологической электростатике вообще, связана именно с ролью электростатики во взаимодействиях биомакромолекул. Она состоит в том, что физиологические , среды имеют ионную силу 0,15 М, что соответствует падению потенциала в е раз на расстоянии 8 А, малом по сравнению с размерами белков. Однако эксперименты по определению параметров взаимодействий белков, проводимые в водном растворе при вариации ионной силы от 0.001 до 0.1 М, показывают, что последняя приводит к значительному (на порядки) изменению этих параметров [127]. Таким образом, основное падение приходится на диапазон 0-0.2 М. Физиологическая же ионная сила составляет 0.15 М, при которой электростатические взаимодействия должны быть почти полностью экранированы. Возникает противоречие: за^ем живой клетке нужны электростатические взаимодействия, проявляющиеся в основном при низких, не физиологических, ионных силах?
Разрешить это противоречие возможно, видимо, двумя способами. Во-первых, в цитозоле ионная сила (фактически концентрация солей) не обязательно однородна по клетке. Её физиологическое значение — это лишь среднее по клетке. Во-вторых, коэффициент пропорциональности между дебаевским радиусом и ионной силой включает диэлектрическую константу среды, которая внутри клетки тоже весьма неоднородна. В частности, при небольших (порядка 5А) расстояниях между заряженными объектами имеет место дисперсия диэлектрической проницаемости (Глава 2). Всё это может уменьшить эффективное значение параметра к и увеличить вклад электростатики в термодинамику и кинетику межмолекулярных взаимодействий в клетке. Соответствующее усовершенствование электростатических расчетов, в частности переход с мембранным белкам в природном окружении, а также включение в электростатические расчеты целых органелл, находится в стадии разработки.
Суммируя, отметим, что работа относится к новой междисциплинарной области науки - физической биоинформатике, и в ней обоснована необходимость появления последней как с позиций биофизики, так и с позиций биоинформатики. Обсуждаются ограничения использованного теоретического похода и перспективы его развития, как в плане усовершенствования электростатических расчётов, так и их распространения на большее число биополимерных объектов (вплоть до полных геномов и протеомов) с использованием распределённых вычислений.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сивожелезов, Виктор Семенович, Пущино
1. Sinha N, Smith-Gill SJ. (2002) Electrostatics in protein binding and function. Curr Protein Pept Sci. 3(6):601-14.
2. Grochowski P, Trylska J. (2008) Continuum molecular electrostatics, salt effects, and counterion binding—a review of the Poisson-Boltzmann theory and its modifications. Biopolymers 89(2):93-113.
3. Fogolari F, Brigo A, Molinari H. (2002) The Poisson-Boltzmann equation for biomolecular electrostatics: a tool for structural biology. J Mol Recognit. 15(6):377-92.
4. Neves-Petersen MT, Petersen SB. (2003) Protein electrostatics: a review of the equations and methods used to model electrostatic equations in biomole-cules-applications in biotechnology. Biotechnol Annu Rev. 9:315-95.
5. Koehl (2006) Electrostatics calculations: latest methodological advances. Curr Opin Struct Biol. 16(2): 142-51.
6. Dong F, Olsen B, Baker NA. (2008) Qomputational methods for biomolecular electrostatics. Methods Cell Biol. 84:843-70.
7. Rush J.D., Koppenol W.H. (1988) Electrostatic interactions of 4-carboxy-2,6-dinitrophenyllysine -modified cytochromes С with physiological and non-physiological redox partners. Biochim. Biophys. Acta 936:187-198
8. Tanford, C. (1973) The hydrophobic effect. N.-Y.: Wiley, 200 pps.
9. Тамм И.Е. (1922) Основы теории электричества. Цит.по 9-му изд., М.:Наука, 1989
10. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций. Москва: Книжный Дом Университет (2002), 376 е., глава 6.
11. Кантор Ч., Шиммел М.П. (1984) Биофизическая химия. М.: Мир т.1, 286-287
12. Mauk M.R., Barker P.D., Mauk A.G. (1991) Proton linkage of complex formation between cytochrome С and cytochrome B5: electrostatic consequences of protein-protein interactions. Biochemistry 30:9873-9881
13. Kang SA, Maijavaara PJ, Crane BR. (2004) Electron transfer between cytochrome с andcytochome с peroxidase in single crystals. J Am Chem Soc. 126(35): 10836-7.
14. Koppenol W.H., Margoliash E. (1982) Asymmetric charge distribution of cytochrome C: functional implications. J.Biol.Chem. 257:4426-4437
15. Netz, R. R., Orland, H. (2000) Beyond Poisson-Boltzmann: Fluctuation effects and correlation functionsEur. Phys. J. E 1: 203-214
16. Weiner PK, Langridge R, Blaney JM,-Schaefer R, Kollman PA. (1982) Electrostatic potential molecular surfaces. Proc Natl Acad Sci USA. 79(12):3754-8.
17. Steinkellner G, Rader R, Thallinger GG, Kratky C, Gruber K. (2009) VASCo: computation and visualization of annotated protein surface contacts. BMC Bioinformatics 24:10:32.
18. P. Hlavica, J. Schulze, D.F.V. Lewis. (2003) Functional interaction of cytochrome P450 with its redox partners: a critical assessment and update of the topology of predicted contact regions, J. Inorg. Biochem., 96(2-3):279-297.
19. Alberty R.A., Hammes G.G. (1958) Application of the theory of diffusion-controlled reactions to enzyme kinetics. J. Phys. Chem. 62:154-159
20. Shoup D., Lipari G., Szabo A. (1981) Rate constants of diffusion-controlled reactions for nonuniformly reactive spheres. Biophys. J. 36:697-704
21. Allison S.A., Northrup S.H., McCaimnon J.A. (1986) Modeling the diffusion-controlled reaction between speroxide and superoxide dismutase using simple electrostatic models. Biophys. J. 49:167-175
22. Allison S.A., Ganti G., McCammon J.A. (1985) The Brownian dynamics method for modeling protein-protein interactions. Biopolymers 24:13231336
23. Wherland S., Gray H.B. (1976) Metalloprotein electron transfer reactions: analysis of reactivity of horse heart cytochrome С with inorganic complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:2950-2954
24. Stonehuerner J., Williams J.B., Millett F. (1979) Interaction between cytochrome С and cytochrome B5. Biochemistry 18:5422-5427
25. Van Leeuwen J.W., Mofers F.J.M., Veerman E.C.I. (1981) The ionic strength dependence of the rate of a reaction between a small ion and a large ion with a dipole moment. Biochim. Biophys. Acta 635:434-439
26. Van Leeuwen J.W. (1983) The ionic strength dependence of the rate of a reaction between two large proteins with a dipole moment. Biochim. Biophys. Acta 743:408-421
27. Rush J.D., Koppenol W.H. (1988) Electrostatic interactions of4-carboxy-2,6-dinitrophenyllysine-modified cytochromes С with physiological and non-physiological redox partners. Biochim. Biophys. Acta 936:187-198
28. Панченков B.M., Лебедев Г.П. (1974) Химическая кинетика и катализ. М.: Химия, 214-217
29. Margoliash Е., Bosshard H.R. (1983) Guided by electrostatics, the "textbook protein" comes of age. Trends in Biol. Chem. No.9:216-220
30. Ferguson-Miller S., Brautigan D.L., Margoliash E. (1976) Correlation of the kinetics of electron transfer activity of various eukaryotic cytochromes С with binding to mitochondrial cytochrome С oxidase. J. Biol. Chem. 251:1104-1115
31. Salemme F. R. (1976) A model of an electron transfer complex. J. Mol. Biol. 102:563-572
32. Smith H.T., Staudenmayer N., MillettF. (1977) Use of specific lysine modifications to locate the reaction site of cytochrome С with cytochrome oxidase. Biochemistry 16:4971-4974
33. Smith M.B, Millett F. (1980) A 19F nuclear magnetic resonance study of the interaction between cytochrome С and cytochrome С peroxidase. Biochim. Biophys. Acta 626:64-72
34. Ando K., Matsubara H., Okuniki K. (1966) Alkylation of cytochromes C. II. Carboxymethylation of beef and human cytochromes С in the oxidized and reduced forms. Biochim. Biophys. Acta 118:256-267
35. Rieder R., Bosshard H.R. (1980) Comparison of the binding sites on cytochrome С for cytochrome С oxidase, cytochrome BQ:and cytochrome Ci. Differential acetylation of lysyl residues in free and complexed cytochrome C. J. Biol. Chem. 255:4732-4739
36. Rogers N.K. (1986) The modelling of electrostatic interactions in the function of globular proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol. 48:37-66
37. Kim C.H., Balny C., King Т.Е. (1984} Kinetics of electron transfer between cardiac cytochromes Q and C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2026-2029
38. Kim C.H., King Т.Е., Balny C. (1989) Electron transfer between liposomal cytochrome Ci and cytochrome C: catalytic implications of electrostatic potentials. Biochem Biophys Res Commun, 163:276-283
39. Antalis T.M., Palmer G. (1982) Kinetic characterization of the interaction between cytochrome oxidase and cytochrome C. J. Biol. Chem. 257:6194-6206
40. Huang Y., Beeser S., Guillemette J.G., Storms R.K., Kornblatt J.A. (1994) Mutations of iso-1-cytochrome C at positions 13 and 90. Separate effects on physical and functional properties. Eur. J. Biochem. 223:155-160
41. Pan L.P., Hibdon S., Liu R.Q., Durham B., Millett F. (1993) Intracomplex electron transfer between ruthenium-cytochrome C derivatives and cytochrome C oxidase. Biochemistry 32:8492-8498
42. Lappalainen P., Watmough N.J., Greenwood C., Saraste M. (1995) Electron transfer between cytochrome C and the isolated Cua domain. Biochemistry, 34:5824-5830
43. Hildebrandt P., Heimburg T., Marsh D., Powell G.L. (1990) Conformational changes in cytochrome C and cytochrome oxidase upon complex formation: a resonance Raman study. Biochemistry 29:1661-1668
44. Hildebrandt P., Vanhecke F., Buse G., Soulimane T., Mauk A.G. (1993) Resonance Raman study of the interactions between cytochrome C variants and cytochrome C oxidase. Biochemistry 32:10912-10922
45. Takano T., Trus B.L., Mandel N., Mandel G., Kallai O.B., Swanson R., Dickerson R.E. (1977) Tuna cytochrome C at 2.0 A resolution. II. Ferrocy-tochrome structure analysis. J. Biol. Chem. 252:776-785
46. Wendoloski J.J., Matthew J.B., Weber P.C., Salemme F.R. (1987) Molecular dynamics of a cytochrome C-cytochrome B5 electron transfer complex. Science 238:794-797
47. Mauk M.R., Mauk A.G. (1989) Crosslinking of cytochrome C and cytochrome B5 with a water-soluble carbodiimide. Reaction conditions, product analysis and critique of the technique. Eur. J. Biochem. 186:473-486
48. Eley C.G., Moore G.R., Williams G., Williams R.J. (1982) JH-NMR studies of the electron exchange between cytochrome C and iron hexacyanides. Definition of the iron hexacyanide binding sites on cytochrome C. Eur. J. Biochem. 124:295-303
49. Mauk M.R., Fener J.C., Mauk A.G. (1986) Electrostatic analysis of the interaction of cytochrome C with native and dimethyl ester heme substituted cytochrome B5. Biochemistry 25:7085-7091
50. Eltis L.D., Herber R.G., Barker P.D., Mauk A.G., Northrup S.H. (1991) Reduction of horse heart ferricytochrome C by bovine liver ferrocytoch-rome B5. Experimental and theoretical analysis. Biochemistry 30:3663-3674
51. Ng S., Smith M.B., Millett F. (1977) Effect of specific trifluoroacetylation of individual cytochrome C lysines on the reaction with cytochrome oxidase. Biochemistry 16:600-604
52. Herbert R.G., Northrup S.H. (1989) Brownian simulation of cytochrome C551 association and electron self-exchange. Journal of molecular liquids 41:207-221
53. Marcus R.A., Sutin N. (1985) Electron transfer in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta 811:265-322
54. Guillemette J.G., Barker P.D., Eltis L.D., Lo T.P., Smith M., Brayer G.D., Mauk A.G. (1994) Analysis of the bimolecular reduction of ferricytochrome C by ferrocytochrome B5 through mutagenesis and molecular modelling. Biochimie, 76 592-604
55. Willie A., Stayton P.S., Sligar S.G., Durham B., Millett F. (1992) Genetic engineering of redox donor sites: measurement of intracomplex electron transfer between ruthenium-65-cytochrome B5 and cytochrome C. Biochemistry 31: 7237-7242
56. Willie A., McLean M., Liu R.Q., Hilgen-Willis S., Saunders A.J.,
57. Pielak G.J., Sligar S.G., Durham B., Millett F. (1993) Intracomplex electron transfer between ruthenium-65-cytochrome B5 and position-82 variants of yeast iso-1-cytochrome C. Biochemistry 32: 7519-7525
58. Qin L., Kostic N.M. (1994) Photoinduced electron transfer from the triplet state of zinc cytochrome C to ferricytochrome B5 is gated by configurational fluctuations of the diprotein complex. Biochemistry 33:12592-12599
59. Holloway P.W., Mantsch H.H. (1988) Infrared spectroscopic analysis of salt bridge formation between cytochrome B5 and cytochrome C. Biochemistry 27:7991-7993
60. Banci L, Bertini I, Felli IC, Krippahl L, Kubicek K, Moura JJ, Rosato A. (2003) A further investigation of the cytochrome b5-cytochrome c complex. J Biol Inorg Chem. 8(7):777-86.
61. Poulos TL, Kraut J. (1980) A hypothetical model of the cytochrome c peroxidase . cytochrome c electron transfer complex. J Biol Chem. 1980 255(21): 10322-30.
62. Pelletier H, Kraut J. (1992) Crystal structure of a complex between electron transfer partners, cytochrome c peroxidase and cytochrome c. Science. 258(5089): 1748-55.
63. Fridovich I. (1986) Structure and function of superoxide dismutases. Adv. Enzymol. 58:61-97
64. Cudd A., Fridovich I. (1982) Electrostatic interactions in the reaction mechanism of bovine erythrocyte superoxide dismutase. J. Biol. Chem. 257:11443-11447
65. Getzoff E.D., Tainer J.A., Weiner P.K., Kollman P.A., Richardson J.S., Richardson D.C. (1983) Electrostatic recognition between superoxide and copper, zinc superoxide dismutase. Nature 306:287-290
66. Fisher C.L., Hallewell R.A., Roberts V.A., Tainer J.A., Getzoff E.D. (1991) Probing the structural basis for enzyme-substrate recognition in Cu,Zn superoxide dismutase. Free Radic. Res. Commun. 12-13 Pt. 1:287-296
67. Bordo D., Djinovic K., Bolognesi M. (1994) Conserved patterns in the Cu,Zn superoxide dismutase family. J. Mol. Biol. 238:366-386
68. Argese E., Viglino P., Rotilio G., Scarpa M., Rigo A. (1987) Electrostatic control of the rate-determining step of the copper, zinc superoxide dismutase catalytic reaction. Biochemistry 26:3224-3228
69. O'Neill P, Davies S, Fielden EM, Calabrese L, Capo C, Marmocchi F, Natoli G, Rotilio G. (1988) The effect of pH and various salts upon the activity of a series of superoxide dismutases. Biochem J. 251(l):41-6.
70. Bannister J.V., Bannister W.H., Rotilio G. (1987) Aspects of the structure, function, and applications of superoxide dismutase. CRC Crit. Rev. Biochem. 22:111-180
71. Bannister W.H., Bannister J.V., Barra D., Bond J., Bossa F. (1991) Evolutionary aspects of superoxide dismutase: the copper/zinc enzyme. Free Radic. Res. Commun. 12-13:Pt 1:349-361
72. Argese E., Girotto R., Orsega E.F. (1993) Comparative kinetic study between native and chemically modified Cu,Zn superoxide dismutases. Biochem. J. 292 (Pt 2), 451-455
73. Klapper I., Hagstrom R., Fine R., Sharp K., Honig B. (1986) Focusing of electric fields in superoxide dismutase. Proteins 1:47-59
74. Sharp K., Fine R., Honig B. (1987) Computer simulations of the diffusion of a substrate to an active site of an enzyme. Science 236:1460-1463
75. Sines J., Allison S.A., McCammon J.A. (1990) Point charge distributions• and electrostatic steering in enzyme/substrate encounter: Brownian dynamics of modified copper/zinc superoxide dismutases. Biochemistry 29:9403-9412
76. Cocco D., Rossi L., Barra D., Bossa F., Rotilio G. (1982) Carbamoylation of Cu,Zn-superoxide dismutase by cyanate. Role of lysines in the enzyme action. FEBS Lett. 150:303-306
77. Beyer W.F. Jr., Mullenbach G.T., Halewell R. (1987) Examination of the role of arginine-143 in the human copper and zinc superoxide dismutase by site-specific mutagenesis. J. Biol. Chem. 262:11182-11187
78. Calabrese L., Polticelli F., O'Neill P., Galtieri A., Barra D., Schinina E., Bossa F. (1989) Substitution of arginine for lysine 134 alters electrostatic parameters of the active site in shark Cu,Zn superoxide dismutase. FEBS Lett. 250:49-52
79. Banci L., Carloni P., Orioli P.L. (1994) Molecular dynamics studies on mutants of Cu,Zn superoxide dismutase: the functional role of charged residues in the electrostatic loop VII. Proteins 18:216-230
80. Banci L., Bertini I., Cabelli D. (1990) Investigation of copper-zinc superoxide dismutase Serl37 and Alal37 mutants. Inorg.Chem 29:2398-2403
81. Rypniewski W.R., Mangani S., Bruni B., Orioli P.L., Casati M., Wilson K.S. (1995) Crystal structure of reduced bovine erythrocyte superoxide dismutase at 1.9 A resolution. J. Mol. Biol. 251:282-296
82. Getzoff E.D., Cabelli D.E., Fisher C.L., Parge H.E., Viezzolli M.S., Banci L., Halewell R.A. (1992) Faster superoxide dismutase mutants designed by enhancing electrostatic guidance. Nature 358:347-351
83. Borukhov, S. and K. Severinov. (2002) Role of the RNA polymerase sigma subunit in transcription initiation. Res Microbiol 153:557-62.
84. Cheetham, G.M. and T.A. Steitz. (2000) Insights into transcription:structure and function of single-subunit DNA-dependent RNA polymerases. —-Curr Opin Struct Biol 10:117-23.
85. Cramer, (2002) Multisubunit RNA polymerases. Curr Opin Struct Biol 12:89-97.
86. Maeda, H., N. Fujita, and A. Ishihama. (2000) Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase. Nucleic Acids Res 28:3497-503.
87. Darst, S.A. (2001) Bacterial RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol 11:155-62.
88. Bar-Nahum, G. and E. Nudler. (2001) Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell 106:443-51.
89. Daube, S.S. and P.H. von Hippel. (1999) Interactions of Escherichia coli sigma(70) within the transcription elongation complex. Proc Natl Acad Sci USA 96:8390-5.
90. Gross, C.A., C. Chan, A. Dombroski, T. Gruber, M. Sharp, J. Tupy, and B. Young. (1998) The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63:141-55.
91. Polozov R.V., Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelezov V.S., Kamzolova S.G. (1999) Electrostatic potentials of DNA. Comparative analysis of promoter and nonpromoter nucleotide sequences J. Biomol. Struct. Dyn. V. 16(6). 1135-43.
92. Murakami, K.S. and S.A. Darst. (2003) Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol 13:31-9.
93. Campbell, E.A., O. Muzzin, M. Chlenov, J.L. Sun, C.A. Olson, O. Weinman, M.L. Trester-Zedlitz, and S.A. Darst. (2002) Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell 9:527-39.
94. Paget, M.S. and J.D. Helmann. (2003) The sigma70 family of sigma factors. Genome Biol 4:203
95. Malhotra, A., E. Severinova, and S.A. Darst. (1996) Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell 87:127-36.
96. Zhang, G., E.A. Campbell, L. Minakhin, C. Richter, K. Severinov, and S.A. Darst. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98:811-24.
97. Vassylyev, D.G., S. Sekine, O. Laptenko, J. Lee, M.N. Vassylyeva, S. Bo-rukhov, and S. Yokoyama. (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417:712-9.
98. Helmann, J.D. (2002) The extracytoplasmic function (ECF) sigma factors. Adv Microb Physiol 46:47-110.
99. Ohlendorf, D.H. and J.B. Matthew. (1985) Electrostatics and flexibility in protein-DNA interactions. Adv Biophys 20:137-51.
100. Fogolari, F., A.H. Elcock, G. Esposito, Viglino, J.M. Briggs, and J.A. McCammon. (1997) Electrostatic effects in homeodomain-DNA interactions. JMol Biol 267:368-81.
101. Hsieh, M. and M. Brenowitz. (1997) Comparison of the DNA association kinetics of the Lac repressor tetramer, its dimeric mutant Lacladi, and the native dimeric Gal repressor. J Biol Chem 272:22092-6.
102. Jeltsch, A., C. Wenz, F. Stahl, and A. Pingoud. (1996) Linear diffusion of the restriction endonuclease EcoRV qji DNA is essential for the in vivo function of the enzyme. EMBO J 15:5104-11.
103. Berkhout, B. and J. van Wamel. (1996) Accurate scanning of the BssHII endonuclease in search for its DNA cleavage site. J Biol Chem 271:183740.
104. Schellman, J.A. (1977) Electrical double layer, zeta potential, and electrophoretic charge of double-stranded DNA. Biopolymers 16:1415-34.
105. Tahirov, T.H., D. Temiakov, M. Anikin, V. Patlan, W.T. McAllister, D.G. Vassylyev, and S. Yokoyama. (2002) Structure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution. Nature 420:43-50.
106. S. Jones, H. Shanahan, H. M. Bermaq, and J. M. Thornton (2003) Nucleic Acids Res 31:7189-7198.
107. H. Shanahan, M. A. Garcia, S. Jones, and J. M.Thornton. (2004) Nucleic Acids Res 32:4732-4741.
108. Y. Tsuchiya, K. Kinoshita, and H. Nakamura. Proteins 55:885-894 (2004).
109. Y. N. Chirgadze and O. Y. Tabolina. Protein Eng 9:745-754 (1996).
110. C. O. Pabo and L. Nekludova. J Mol Biol 301:597-624 (2000).
111. C. Cappen. In: Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics, Part 1.1.Genetic Variation and Evolution. DOI:10.1002/047001153X.g 101209 (2005)http://mrw.interscience.wiley.c0m/ggpb/articles/g 101209/frame.html
112. R. K. Ledneva, A. V. Alexseevskii, S. A. Vasiliev, S. A. Spirin, and A. S. Karyagina. (2001) Mol Biol (Moscow) 35:764-777.
113. A.G. Murzin, S. E. Brenner, T. Hubbard, and C. Chothia. (1995) J Mol Biol 247:536-540
114. E. Fraenkel, M. A. Roald, K. A. Chambers, and C. O. Pabo. (1998) J Mol Biol 284:351-361.
115. N. D. Clarke, C. R. Kissinger, J. Desjarlais, G. L. Gilliland, and C. O. Pabo (1994) Protein Sci 3,1779-1787.
116. X. Zhao, X. R. Huang, and C. C. Sun. (2006) J Struct Biol 155:426-437.
117. Hill L.T. (1955) Approximate calculation of the electrostatic free energy of nucleic acids and other cylindrical macromolecules. Arch. Biochem. Bio-phys. 24: 427-439.
118. Stigter D. (1975) The charged colloidal cylinder with a Gouy double layer. J. Colloid Interface Sci. 53: 296-306.
119. Hingerty В.E., Ritchie R.H., Ferrell T.L., Turner J. E. (1985) Dielectric effects inbiopolymers: the theory of ionic saturation revisited. Biopolymers 24: 427-439.
120. Pack G.R., Lamm G., Wong L., Clifton D. (1990) The structure of the electrolyte environment of DNA., in Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics., L.R. Beveridge D.L., Editor, Adenine Press: New York. 237246.
121. Klein В J., Pack G.R., (1983) Calculations of the spatial distribution of charge density in the enviroment of DNA. Biopolymers 22: 2331-2352.
122. Jayaram В., Sharp KA, Honig B. (1989) The Electrostatic potential of B-DNA. Biopolymers,. 28: 975-993.
123. Jayaram В., Beveridge D.L. (1990) Free energy of cm arbitrary charge distribution imbedded in coaxial cylindrical dielectric continua: application to conformational preferences of DNA in aqueous solutions. J. Phys. Chem. 94:4666-4671.
124. Hochberg D., Kephart T.W., Edwards G. (1994) Structural information in the local electric field ofdissolved B-DNA. Phys. Rev. E 49: 851-867.
125. Edwards G., Hochberg D., Kephart T.W. (1994) Structure in the electric potential emanating from DNA. Phys. Rev. E.,. 50: R698-R701.
126. Bailey J.M. (1973) The electrostatic potential of a discretely charged cylinder in solution. Biopolymers 12: 559-574.
127. Сорокин A.A., Осипов A.A., Бескаравайный П.М., Камзолова С.Г. (2007) Анализ распределения нуклеотидной последовательности и электро-статического потенциала генома E.coli Биофизика 52(2):223-227.
128. Джелядин Т.Р., Сорокин А.А., Иванова Н.Н., Сивожелезов B.C., Камзолова С.Г., Полозов Р.В. (2001) Особенности электростатического взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с промоторами фага Т4 Биофизика 46:972-976.
129. Koolman, J., and Rohm, К. H. (1998) Taschenatlas der Biochemie, Suttgart-New York, Georg Thieme Verlag, New York.
130. Rodnina, M. V., Gromadski, К. В., Kothe, U., and Wieden, H. J. (2005) Recognition and selection of tRNA in translation, FEBS Lett. 579:938-942.
131. Wintermeyer, W., Peske, F., Beringer, M., Gromadski, К. В., Savelsbergh, A., and Rodnina, M. V. (2004) Mechanisms of elongation on the ribosome: dynamics of a macromolecular machine, Biochem. Soc. Trans. 32:733-737.
132. Rodnina, M. V., Beringer, M., and Bieling, (2005) Ten remarks on peptide bond formation on the ribosome, Biochem. Soc. Trans. 33:493-498.
133. Sharp, K. A., Honig, В., and Harvey, S. C. (1990) Electrical potential of transfer RNAs: codon-anticodon recognition, Biochemistry 29:340-346.
134. Chin, K., Sharp, K. A., Honig, В., and Pyle, A. M. (1999) Calculating the electrostatic properties of RNA provides new insights into molecular interactions and function, Nat. Struct. Biol. 6:1055-1061.
135. Tworowski, D., and Safro, M. (2003) The long-range electrostatic interactions control tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase complex formation, Protein Sci. 12:1247-1251.
136. Федоренко Р.П. Введение в вычислительную физику. М.: Изд-во МФТИ, 1994:172-180
137. Kirsh Yu.E., Pavlova N.R., Kabanov V.A. (1975) Fluorescence quenching by polyvinylpyridinium derivatives. EuroPolymer J. 11:495-498
138. Frattali V., Steiner R.F. (1969) Interaction of trypsin and chymotrypsin with a soybean proteinase inhibitor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 34:480487
139. Vincent J.P., Peron-Renner M., Pudles J., Lazdunski M. (1974) The association of anhydrotrypsin with the pancreatic trypsin inhibitors. Biochemistry 13:4205-4211
140. Изумрудов B.A., Савицкий А.П., Сивожелезов B.C., Зезин А.Б., Кабанов В.А., Березин И.В. (1987) Ускорение взаимодействия трипсина с соевым ингибитором в присутствии поликатиона. Доклады АН СССР, 294:(1501) -1505.
141. Березин И.В., Клибанов A.M., Мартинек К. Кинетико-термодинамические аспекты катализа иммобилизованными ферментами. У сп. хим. 44: 17-47
142. Березин И.В., Мартинек К., Яцимирский А.К. (1973) Физико-химические основы мицеллярного катализа. Усп. хим. 42: 1729-1756
143. Тенфорд Ч. (1965) Физическая химия полимеров. М.: Химия, 519-5561.zarevP.I., Sivozhelezov V.S. (1991). Solvent Permittivity Dispersion Electrostatic Model Better Fits Kinetic Data. Topics in Molecular Organization and Engineering, 7:149-160.
144. Sivozhelezov V.S. (1996) Interpretation of ionic strength dependencies of the electron transfer in the cytochrome C cytochrome B5 system for the wildtype and lysine-mutated yeast cytochrome C. Mol. Engineering 6:405414.
145. Gill DS, Roush DJ, Shick KA, Willson RC. (1995) Microcalorimetric characterization of the anion-exchange adsorption of recombinant cytochrome b5 and its surface-charge mutants. J Chromatogr A. 715(l):81-93.
146. Jeng M.F., Englander S.W., Pardue K., Rogalskyj J.S., McLendon G. (1994) Structural dynamics in an electron-transfer complex. Nat. Struct. Biol. 1:234-238 '
147. Gilson M.K., Honig B. (1988) Calculation of total electrostatic energy of a macromolecular system: solvation energies, binding energies, and conformational analysis. Proteins 4:7-18
148. Horovitz A. (1987) Non-additivity in protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 196:733-735
149. Tanford C., Kirkwood J.G. (1957) Theory of protein titration curves. I. General equations for impenetrable spheres. J. Am. Chem. Soc. 79:5333-5339
150. Nicolini C., Erokhin V., Ghisellini P., Paternolli C., Ram M.K., Sivozhelezov V. (2001) P450scc engineering and nanostructuring for cholesterol sensing, Langmuir 17:3719-3726
151. Sivozhelezov V., Nicolini C. (2005) Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor. J Theor Biol. 234:479-485.
152. Sivozhelezov V., Pechkova E., Nicolini C. (2006) Mapping electrostatic potential of a protein on its hydrophobic surface: implications for crystallization of cytochrome P450scc. J. Theor. Biol. 241:73-80.
153. Vijayakumar, S., and Salerno, J. C. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1160:281-286.
154. Hasemann, C. A., Kurumbail, R. G., Boddupalli, S. S., Peterson, J. A., and Deisenhofer, J. (1995) Structure 3:41-62.
155. Adamovich, T. B., Pikuleva, I. A., Chaschin, V. L., and Usanov, S. A. (1989). Biochim. Biophys. Acta 996:247-253.
156. Turko, I. V., Adamovich, T. B., Kirillova, N. M., Usanov, S. A., and Chaschin, V. L. (1988), Biochemistry*(Mosco w) 53:1810-1816.
157. Chernogolov, A. A., Schwarz, D., and Usanov S. A. (1996) Biochemistry (Moscow) 61:1512-1523.
158. Pikuleva, I. A., Mackman, R. L., Kagawa, N., Waterman, M. R., and Ortiz de Montellano R., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 322:189-197.
159. Katagiri, M., Takikawa, O., Sato, H., and Suhara, K. (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 77 804-809.
160. Kido, Т., and Kimura, Т. (1979) J. Biol. Chem. 254 11806-11815. Shkumatov, V. M., Smetttan, G., Ristau, O., Rein, H., Ruckpaul, K., Chaschin, V. L., and Akhrem, A.A. (1998) Chem. Biol. Interact. 68:71-83
161. Dhariwal, M. S., Kowluru R. A., and Jefcoate, C. R. (1991) Biochemistry 30:4940-4949.
162. Chirgadze YN, Zheltukhin EI, Polozov RV, Sivozhelezov VS, Ivanov W2009). Binding regularities in complexes of transcription factors with operator DNA: homeodomain family. J Biomol Struct Dyn. 26:687-700.
163. Juang, Y.L. and J.D. Helmann. (1994) A promoter melting region in the primary sigma factor of Bacillus subtilis. Identification of functionally important aromatic amino acids. J Mol Biol 235:1470-88.
164. Bowers, C.W. and A.J. Dombroski. (1999) A mutation in region 1.1 of sigma70 affects promoter DNA binding by Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme. EMBO J 18:709-16.
165. Callaci, S., E. Heyduk, and T. Heyduk. (1999) Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol Cell 3:229-38.
166. Bateman, A., E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, and E.L. Sonnhammer. (2002) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res 30:276-80.
167. Schwabe JW. (1997) The role of water in protein-DNA interactions. Curr Opin Struct Biol. 7(1): 126-34.
168. Polozov R.V., Montrel M., Ivanov V.V., Melnikov Y., Sivozhelezov V.S. (2006) Transfer RNAs: electrostatic patterns and an early stage of recognition by synthetases and elongation factor EF-Tu. Biochemistry 45:4481-9440.
169. Friedrich, K., Woolley, P., and Steinhauser, K. G. (1988) Electrostatic potential of macromolecules measured by pKa shift of a fluorophore. 2. Transfer RNA. Eur. J. Biochem. 173:233-239.
170. Manning, G.S. (2008) Approximate Solutions to Some Problems in Polyelectrolyte Theory Involving Nonuniform Charge Distributions Macromolecules 41: 6217-6227
171. Manning GS. (2007) Counterion condensation on charged spheres, cylinders, and planes. J Phys Chem B. 111(29):8554-9.
172. Ubbink M. (2009) The courtship of proteins: understanding the encounter complex. FEBS Lett. 583(7): 1060-6.
173. Jahnke, W. (2002) Spin Labels as a Tool to Identify and Characterize Protein-Ligand Interactions by NMR Spectroscopy. ChemBioChem 3(2-3): 167—173
174. Tang C, Iwahara J, Clore GM. (2006) Visualization of transient encounter complexes in protein-protein association. Nature 444(7117):383-6.
175. Fawzi NL, Doucleff M, Suh JY, Clore GM. (2010) Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proc Natl Acad Sei USA.107(4): 1379-84.
176. Blomberg N, Gabdoulline RR, Nilges M, Wade RC (1999). Classification of protein sequences by homology modeling and quantitative analysis of electrostatic similarity. Proteins 37(3):379-87
177. Schmidt TR, Wildman DE, Uddin M, Opazo JC, Goodman M, Grossman LI. (2005) Rapid electrostatic evolution at the binding site for cytochrome c on cytochrome c oxidase in anthropoid primates. Proc Natl Acad Sei USA. 102(18):6379-84.
178. Diugosz M, Trylska J. (2008) Electrostatic similarity of proteins: application of three dimensional spherical harmonic decomposition. J Chem Phys. 129(1):015103.
179. Richter S, Wenzel A, Stein M, Gabdoulline RR, Wade RC. (2008). webPIPSA: a web server for the comparison of protein interaction properties. Nucleic Acids Res. 36:W276-80.
-
Сивожелезов, Виктор Семенович
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 2010
-
ВАК 03.01.02
