Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электростатические свойства промоторов, взаимодействующих с РНК-полимеразой Е. coli Eo70

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Джелядин, Тимур Рустемович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Взаимодействие РНК-полимеразы Е.соН Ест70 с промоторами.

Общая характеристика РНК-полимеразы Е.соН Е (Ее70). Структурно-функциональная организация субъединиц фермента.

Структурные особенности промоторной ДНК.

Молекулярные механизмы кодирования промоторно-полимеразного узнавания. 10 Характеристика процесса взаимодействия РНК-полимеразы с промоторными участками ДНК и стадии процесса.

Вклад электростатики во взаимодействие белок-ДНК.

Вычисление электростатического потенциала вокруг ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Уравнение Пуассона-Больцмана

Кулоновская модель

Визуализация результатов

ГЛАВА 1. РАЗРАБОТКА БЫСТРОГО МЕТОДА ВЫЧИСЛЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ВОКРУГ ДНК.

Сравнение распределения потенциала вокруг фрагмента ро1ус1(АТ)*ро1у(1(АТ), полученное путем решения уравнения Пуассона-Больцмана и простым кулоновским приближением.

Влияние точечной нуклеотидной замены в регулярной последовательности ДНК на распределение электростатического потенциала.

ГЛАВА 2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ВОКРУГ ПРОМОТОРНОЙ И

КОДИРУЮЩИХ УЧАСТКОВ МОЛЕКУЛЫ ДНК.

Распределение потенциала вокруг фрагмента бактериофага Т7, содержащего промоторы А1, А2 и АЗ.

Распределение потенциала вокруг фрагмента хромосомы Е.соЦ, содержащего промотор шС.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОМОТОРОВ РАННИХ ГЕНОВ ФАГА Т4. РОЛЬ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В

РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ РАЗВИТИИ Т4 ФАГА.

Трехмерная структура С-концевого домена а-субъединицы РНК-полимеразы (аСТБ).

Распределение электростатического потенциала вокруг аСШ.

Распределение электростатического потенциала вокруг промотров «ранних» генов фага Т4.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электростатические свойства промоторов, взаимодействующих с РНК-полимеразой Е. coli Eo70"

Проблема молекулярного узнавания является одной из важнейших в современной молекулярной биофизике. В рамках этой общей проблемы существует задача взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. Точное молекулярное узнавание конкретным белком определенных последовательностей нуьслеотидов необходимо для осуществления ряда биологически важных функций, таких как репликация, транскрипция, сплайсинг, синтез белка, рестрикция, регуляция экспрессии генов и др. Одной из актуальных проблем белково-нуклеинового узнавания является объяснение способности РНК-полимеразы, осуществляющей транскрипцию, быстро и точно находить в ДНК генома редкие промоторные участки, находящиеся в начале индивидуальных генов и оперонов и обозначающие начало считывания с них генетической информации. От точнрсти и эффективности промоторно-полимеразного узнавания зависит Специфичность и эффективность транскрипции генома и регуляция активности генов. Важность этой проблемы определила огромный интерес исследователей к выяснению механизмов кодирования специфичности промоторно-полимеразного взаимодействия. Решаемые в диссертации задачи относятся к данному направлению и посвящены поиску новых промоторных детерминант на основе анализа электростатических свойств промоторной ДНК. Для решения этой задачи предварительно потребовалось разработать метод, позволяющий расчитывать распределение электростатического потенциала вокруг промоторных последовательностей ДНК.

Литературный обзор.

Взаимодействие РНК-полимерты E.coli Ео70 с промоторами.

Процесс транскрипции, т.е. синтез РНК на матрице ДНК является одним из ключевых в экспрессии закодированной в ДНК генетической информации. Помимо важной роли в обеспечении функционирования биологических систем, исследование процесса транскрипции представляет особый интерес, поскольку РНК-полимеразы занимают совершенно особое место среди белков, способных связываться с ДНК.

Как правило, ДНК-связывающие белки разделяют на специфические, которые имеют высокую константу связывания с определенными нуклеотидными последовательностями и поэтому способны узнавать определенные сайты в ДНК, и неспецифические, которые имеют одинаковое сродство к разным нуклеотидным последовательностям. РНК-полимеразы относятся к специфическим ДНК-связывающим белкам, поскольку они начинают синтез РНК с определенных участков ДНК, называемых промоторами. Однако они способны и к неспецифическому связыванию с ДНК, что имеет важное значение для ускорения поиска промоторов среди других последовательностей ДНК. Наиболее необычным свойством РНК-полимеразы является ее способность к узнаванию сильно варьирующих по своей первичной последовательности промоторных участков. Возможность узнавания разнообразных промоторных последовательностей одним и тем же белком — РНК-полимеразой, без участия каких-либо дополнительных белков-регуляторов, позволяет предположить, что в этом случае фактором, определяющим взаимодействие фермента с промотором, является не только пространственное положение некоторого набора нуклеотидов, образующих контакты с боковыми цепями аминокислот, но и физико-химические характеристики промоторной ДНК.

Общая характеристика РНК-полимеразы E. coli Е (Ео70). Структурно-функциональная организация субъединии фермента.

РНК-полимераза E.coli является ферментом, который осуществляет синтез всех мРНК в бактериальной клетке. РНК-полимераза состоит из нескольких субъединиц: a,ß nß', которые формируют кор-фермент в составе ci2ßß', ответственный за полимеразную реакцию. Для того, чтобы осуществлять синтез РНК со специфических последовательностей - промоторов кор-фермент нуждается в присутствии еще одной субъединицы - cr-фактора. Клетка E.coli содержит, по крайней мере, 7 различных а-факторов, направляющих синтез РНК с разных групп промоторов в разных условиях. Основным из а-факторов

70 является а - белок с молекулярной массой 70263 [X], который ответственен за специфичность синтеза в условиях вегетативного роста клеток, что представляет синтез более чем с 90% промоторов. Молекулярные массы других субъединиц составляют 155160, 150618 и 36512 для ß', ß и а - субъединиц соответственно [2],[3],[4].

В настоящее время известно, что каждая из четырех субъединиц РНК-пол им еразы состоит из отдельных структурно-независимых доменов [5],[6],[7],[8]. Предполагается, что домены субъединиц действуют независимо друг от друга, участвуя в реализации многочисленных стадий транскрипционного цикла. Для 3-х доменов РНК-полимеразы доказана возможность образовывать контакты с ДНК промоторов. Два из них расположены на сг-субъединице и взаимодействуют с -10 и -35 областями промоторов (домены 2.4 и 4.2 соответственно) [9], а третий домен расположен на С-концевом участке а-субъединицы и взаимодействует с UP-элементом промоторов [10]. По-видимому, в структуре РНК-полимеразы E.coli могут присутствовать и другие ДНК-связывающие домены, поскольку мутации, оказывающие влияние на взаимодействие фермента с промоторами, были получены для всех субъединиц фермента

11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19]. Однако в этом случае нельзя исключить возможность опосредованного влияния мутаций на узнавание промоторов через изменение архитектуры фермента и соответственно, изменение взаимного расположения известных ДНК-связывающих доменов. В то же время следует отметить, что в литературе имеются и другие данные, свидетельствующие о возможности формирования контактов некоторых участков ß- и ß'-субъединиц РНК-полимеразы с промоторной ДНК в транскрипционном комплексе [20] .

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о сложности субъединичной структуры РНК-полимеразы, о доменной организации всех ее субъединиц и о возможном участии некоторых конкретных доменов фермента в специфическом взаимодействии с промотоной ДНК.

Структурные особенности промоторной ДНК.

Нуклеотидная последовательность ДНК генома E.coli полностью расшифрована [21]. Согласно существующим оценкам геном E.coli содержит около 4000-5000 промоторов, причем более 90% промоторов узнаются

70 ферментом, содержащем в качестве фактора специфичности - а . Кроме того, этот фермент контролирует транскрипцию с промоторов ранних генов родственных E.coli бактериофагов, таких как фаги Т2, Т4, Т6, ТЗ, Т5, Т7 и некоторые другие. Таким образом, количество промоторов, с которыми РНК

ПГ\ полимераза E.coli (Ест ) взаимодействует in vivo, оценивается >4500. В настоящее время из них выделены, идентифицированы по нуклеотидной последовательности, и биохимически охарактеризованы более 400 промоторов [22]. Показано, что все идентифицированные промоторы сильно варьируют по нуклеотидной последовательности.

Статистический анализ нуклеотидных последовательностей известных промоторов выявил 2 гомологичных гексануклеотида TTGACA и ТАТААТ в участках, отстоящих от стартовой точки транскрипции на 35 и 10 пар оснований, получивших название канонических консенсусных -35 и -10 гексануклеотидов [23],[24]. Функциональное значение этих канонических элементов, как промоторных детерминант было показано для нескольких десятков промоторов с помощью генетических и биохимических экспериментов. В частности, в настоящее время получено более 300 одиночных мутаций в промоторной ДНК, влияющих на эффективность транскрипции. Оказалось, что большая часть из них (>70%) приходится на канонические пары [25],[26]. При этом для многих испытанных промоторов было показано, что мутации, приближающие последовательности реальных промоторов в -10 и -35 областях к каноническим гексануклеотидам, приводят к усилению мутантного промотора по сравнению с исходным, и наоборот, мутации, которые приводят к уменьшению промоторной силы, как правило, удаляют нуклеотидную последовательность промоторов от канонической. Предполагается, что при специфическом взаимодействии с промотором РНК-полимераза образует контакты одновременно с -35 и -10 областями промоторов. Некоторые авторы считают, что последовательность в -35 области является наиболее важной в первичном узнавании и оказывает наибольшее влияние на величину константы связывания РНК-полимеразы с промотором, а последовательность в -10 области имеет наибольшее значение для локального плавления ДНК вблизи точки старта транскрипции. В связи с этим гексануклеотид в -35 области иногда называют «recognition domain», а в -10 области - «melting domain» [27]. Канонические -35 и -10 области промоторной ДНК узнаются двумя разными доменами а-субъединицы [13],[28]. Степень консервативности отдельных нуклеотидов в -10 и -35 областях и их функциональная значимость различается для 12 консенсусных нуклеотидов, в частности, среди нуклеотидов в -10 области замена основания в -12 и -11 положении, а в -35 области замена основания в -34 и -32 положении приводит к более заметному снижению промоторной активности [26]. В целом, надо отметить, что реальные промоторы содержат в среднем только 7.9 любых канонических пар из 12, а около 10% промоторов имеют меньше 6 совпадений с каноническими элементами [24].

Консенсусные гексануклеотиды разделены спейсерным участком длиной 16-18 нуклеотидных пар. Оптимальной является длина спейсера в 17 нуклеотидов. Однако, для 10% известных промоторов это расстояние варьирует в пределах 15-21 пар. Мутации, оптимизирующие длину спейсера до 17, как правило, усиливают промотор и наоборот, мутации, увеличивающие отклонения в любую сторону, как правило, уменьшают эффективность промотора [29], [30]. Спейсерные участки не имеют какой-то характеристической нуклеотидной последовательности. Однако, при неидеальной длине спейсера, в его нуклеотидной последовательности обнаруживаются некотрые закономерности, не наблюдающиеся в 17-членных спейсерных участках [31]. При длине спейсера менее 17п.о. в области, примыкающей к -35 гексамеру, преобладают пурин-пуриновые и пиримидин-пиримидиновые гомонуьслеотиды, а в более длинных спейсерах в этой области преобладают пурин-пиримидиновые гетеродинуклеотиды. Таким образом, для узнавания промоторов имеет значение не только последовательность в -35 и -10 консенсусных гексамерах, но и их пространственное расположение друг относительно друга, которое, в свою очередь, определяется длиной и структурой спейсерной ДНК.

Стартовая точка транскрипции отстоит у разных промоторов на 5-12 пар от канонического элемента -10. В качестве инициирующего субстрата в 70% охарактеризованных промоторов используется пурин, преимущественно аденин. С помощью статистического анализа обнаружено предпочтительное присутствие CAT в точке инициации, однако, подтвердить функциональную значимость этого триплета не удалось [32]. Изменения в последовательности нуклеотидов вблизи стартовой точки транскрипции могут повлиять на эффективность промотора, однако, какой-то общей закономерности этого влияния не было найдено.

Еще одной отличительной особенностью нуклеотидных последоватей промоторных ДНК является их обогощенность А/Т-парами, особенно это выражено в upstream области промоторов. Было отмечено, что этот участок промоторов способен формировать устойчивый изгиб двойной спирали ДНК [33],[34],[35],[36]. Образование этого изгиба рассматривается в качестве механизма, объясняющего возможную функциональную роль этого участка, основанную на образовании дополнительного контакта РНК-полимеразы, а именно ее а-субъединицы с изогнутым upstream элементом промотора.

Таким образом, исследование структурно-функциональной организации промоторов выявило ряд структурных элементов в промоторной ДНК и некоторых особенностей в ее физико-химических свойствах, которые могут принимать участие во взаимодействии с РНК-полимеразой и выступать в качестве промоторных детерминант.

Молекулярные механизмы кодирования промоторно-полимеразного узнавания.

В течение многих лет основопологающим постулатом при изучении кода

7 П промоторно-полимеразного узнавания для РНК-полимеразы E.coli (Ее ) было представление об универсальном характере молекулярных механизмов, обеспечивающих специфичность взаимодействия этого фермента с его многочисленными нативными промоторами. Концепция универсального кода предполагала существование единого центра в ферменте, взаимодействующего со всем многообразием промоторов на основе консенсусного промотора, содержащего 2 гомологичных гексануклеотида в -10 и -35 областях [24],[23]. Однако по мере исследования все большего числа промоторов появлялись факты, не согласующиеся с этой концепцией:

- было показано, что консенсусный промотор не является максимально активным [37],[38];

- для ряда промоторов не наблюдалось прямой корреляции между активностью и соответствием структуры их гомологичных областей консенсусному промотору [39], [40], [41], [26];

- было обнаружено, что функционально значимые участки различались для разных промоторов и их групп [33],[42],[43],[44];

- были обнаружены промоторы, у которых отсутсвовали или были слабо выражены консенсусные гексануклеотиды [45],[46];

- появились данные, свидетельствующие о различии структуры активного центра РНК-полимеразы в комплексах с разными промоторами [47],[48],[49],[43],[50],[10].

Поскольку все эти данные противоречили основным постулатам концепции универсального кода, ряд авторов принимали к заключению, что промоторно-полимеразное узнавание может быть закодировано разными программами у разных промоторов [51],[37],[40],[43],[46].

Принцип дифференцированного кодирования промоторно-полимеразного узнавания предполагает, с одной стороны, существование альтернативных элементов у разных промоторов или их групп, а с другой стороны, возможность формирования в ферменте альтернативных промоторсвязывающих центров, каждый из которых настроен на взаимодействие со своей группой промоторов [37],[52],[53].

Ряд литературных данных прямо или косвенно подтверждает оба эти предположения. К настоящему времени получены многочисленные мутации по всем субъединицам РНК-полимеразы, имеющие дифференцированное проявление в функциональной активности разных промоторов (по ст-субъединице [11],[12],[46],[13],[14], по сс-субъединице [50],[10],[43], по р- и р'-субъединицам [15],[16],[17],[18],[19]). Анализ действия этих мутаций создает сложную картину структурно-функционального устройства промотор-связывающего центра РНК-полимеразы, указывая на прямое или косвенное участие в его организации всех субъединиц фермента и их отдельных участков. Результаты такого анализа согласуются с заключением о возможности формирования в РНК-полимеразе разных промотор-связывающих центров, содержащих альтернативные узнающие элементы, участвующие во и взаимодействии с разными группами промоторов. В отдельных случаях показано, что центры, взаимодействующие с разными промоторами, могут формироваться с участием разного набора субъединиц РНК-полимеразы [54],[43].

К настоящему времени получены многочисленные данные, свидетельствующие о том, что -10 и -35 консенсусные гексамеры, функциональная значимость которых была показана для нескольких десятков бактериальных и фаговых промоторов, не могут рассматриваться больше как универсальные промоторные детерминанты [26],[42],[55].

Было высказано предположение, что отсутствие или слабая выраженность консенсусных гексамеров может быть скомпенсирована присутствием альтернативных сигнальных элементов, не являющихся универсальными детерминантами промоторов.

Статистическая обработка нуклеотидных последовательностей всех известных промоторов с использованием разных математических методов, таких как Фурье-анализ, кластерный анализ, метод нейронных сетей выявила большое число неканонических консенсусных структурных элементов, характерных для отдельных групп промоторов

56],[57],[58],[59],[31],[60],[61],[62]. Однако следует отметить, что ни в одной из указанных работ не приведено убедительных доказательств о функциональной значимости этих неканонических структурных элементов для активности соответствующей группы промоторов. Более того, хотя все авторы использовали для статичтической обработки одну и ту же подборку нуклеотидных последовательностей известных в литературе промоторов, результаты их классификационного анализа отличаются. Соответственно разные авторы выдвигали для одних и тех же промоторов совершенно разные структурные элементы в качестве возможных неканонических промоторных детерминант. К настоящему времени сложилась такая ситуация, что расшифровка первичной структуры нескольких сотен промоторов, учет всех канонических и неканонических структурных элементов не привели к разработке эффективного алгоритма корректной идентификации известных и поиска новых промоторов в нуклеотидной последовательности ДНК генома. А все попытки сформулировать общие правила, связывающие нуклеотидную последовательность промотора с его функциональными характеристиками, такими как «промоторная сила» или температура образования открытого комплекса, оказались безуспешными [58],[63]. Стало очевидным, что не только первичная структура промоторов ответсвенна за их взаимодействие с РНК-пол I им еразой. Наиболее наглядно это было продемонстрированно на примере промоторов «ранних» генов фага Т4. Расшифровка нуклеотидной последовательности более 30 промоторов фага Т4 показала, что все они обладают высокой степенью гомологии на протяженных участках и могут быть разбиты на 4 группы с коэффициентом подобия внутри групп >75-80% [58]. Однако было показано, что промоторы, относящиеся к одной и той же группе по нуклеотидной последовательности, отличались по функциональной активности: по силе промоторов, а также по их ответу на АДФ-рибозилирование а-субъединицы [63] и мутационные гроВ403- и гроВ409-изменения Р-субъединицы [53],[64],[65]. В то же время промоторы Т4, более далекие по нуклеотидной последовательности, обладают сходными функциональными характеристиками. Все эти данные поставили вопрос о том, что какие-то другие детерминанты помимо первичной структуры промоторов вносят вклад в определение их функциональной активности.

Согласно современным представлениям не толко нуклеотидная последовательность промоторов, но и физические свойства, задаваемые этой последовательностью, играют важную роль в обеспечении специфичности и эффективности промоторно-полимеразного взаимодействия [66],[67],[68],[69]. В настоящее время известно, что существенное влияние на «силу» промоторов и характер их взаимодействия с РНК-полимеразой оказывают такие физико-химические характеристики промоторной ДНК, как геометрия двойной спирали, ее изгибность или наличие изломов

70],[71],[72],[73],[42],[74],[75],[67],[76], присутствие легкоплавких участков [77],[68], а также динамические свойства как промоторных участков ДНК, так и макромолекулы в целом [7В],[69].

Вероятно, некоторые физические свойства ДНК могут иметь совместное проявление и оказывать объединенное воздействие на взаимодействие с ДНК связывающими белками, в котором трудно определить какое свойство является причиной, а какое - следствием. В частности, наличие легкоплавких участков в ДНК, может сопровождаться деформированием двойной спирали и увеличением ее изгибности [79],[70]. В последние годы в литературе активно обсуждается также вопрос о роли электростатического фактора в формировании изогнутой ДНК [80],[81]. Все это свидетельствует о сложной взаимосвязи в проявлении различных физических свойств в двойной спирали ДНК, что затрудняет исследование участия каждого из них в процессах ДНК-белкового взаимодействия, в том числе во взаимодействии с РНК-полимеразой.

Характеристика процесса взаимодействия РНК-полимеразы с промотооными участками ДНК и стадии процесса.

Взаимодействие РНК-полимераза (Ео70) — промотор является сложным многостадийным процессом, в который вовлечены различные механизмы распознавания ферментом промотора. Избирательное связывание белка со специфической последовательностью ДНК требует распознавания белком ряда стерических и физико-химических особенностей, которые полностью определяют место связывания. Процесс распознавания белком ДНК по существу сравним со связыванием лигандов с белком и белок-белок взаимодействием, но и является более сложным, поскольку для ДНК-связывающих белков возможно как специфическое связывание, так и не специфическое. Учитывая эту особенность ДНК-связываюпщх белков, процесс распознавания РНК-полимеразой специфических участков ДНК можно разбить на 3 стадии.

На первой стадии происходит неспецифическое связывание белка с ДНК, которое происходит, вероятно, за счет электростатического притяжения белка к ДНК [82],[83],[84],[85],[86]. Этот процесс аналогичен первой стадии белок-белок распознавания, когда электростатические силы ускоряют диффузию взаимодействующих молекул друг к другу, ориентируя их соответствующим образом [85],[86],[87],[88].

На второй стадии неспецифически связанная с ДНК РНК-полимераза претерпевает одномерную диффузию вдоль ДНК [89],[90],[91],[92], что приводит к ускорению поиска промоторов РНК-полимеразой. По-видимому, процесс одномерной диффузии вдоль ДНК является общим для всех специфических ДНК-связывающих белков [93]. Например, было показано, что lac репреесор E.coli обнаруживает сайт связывания на ДНК во много раз быстрее, чем при теоретически предсказанной трехмерной диффузии [94]. Скорость линейной диффузии вдоль ДНК неодинакова на участках, имеющих разную последовательность. Так, для рестриктазы EcoRI было показано, что скольжение этого фермента вдоль ДНК замедляется на участках с необычной структурой (изгиб, триплекс), а также на участках ДНК, имеющих сходную последовательность с сайтами разрезания этого фермента [95]. По-видимому, скольжение РНК-полимеразы E.coli также может замедляться на последовательностях ДНК, имеющих необычную структуру, и на участках, имеющих сходство с промоторными сайтами.

По ходу линейной диффузии белка вдоль ДНК происходит поиск участков ДНК, комплементарных ДНК-связывающей поверхности фермента. Когда белок обнаруживает специфический участок, то образуются более прочные контакты с ДНК, которые представляют третью стадию белок-ДНК узнавания. В этот процесс, скорее всего, вовлечены электростатические взаимодействия и водородные связи [96], перераспределение как анионов, так и катионов вокруг белка и ДНК, а также взаимные конформационные изменения белка И ДНК [97],[98],[99],[Ю0],[Ю1].

Таким образом, можно сделать вывод о том, что топология ДНК, ее вторичная структура и физико-химические особенности регулируют скорость поиска промоторов РНК-полимеразой Е. coli, хотя процесс скольжения фермента по ДНК требует дальнейшего более детального исследования. В частности, практически не изучены неспецифические комплексы РНК-полимеразы с ДНК. По аналогии с другими специфическими ДНК-связывающими белками можно предположить, что эти комплексы стабилизируются преимущественно за счет электростатических взаимодействий белка с сахаро-фосфатным остовом ДНК, в то время как контакты боковых цепей белка с основаниями в неспецифических комплексах

ОТСУТСТВУЮТ [102].

Вклад электростатики во взаимодействие белок-ДНК.

Распределение электростатического потенциала вокруг поверхности макромолекулы является одной из ее фундаментальных физико-химических характеристик, которая влияет на взаимодействие макромолекулы с различными лигандами. Электростатический потенциал играет роль во взаимодействии двух макромолекул, не только из-за притяжения и отталкивания областей положительных и отрицательных зарядов на поверхности молекул, но и способствует соответственно ориентировать молекулы относительно друг друга, что, в свою очередь, может инициировать взаимные конформационные изменения, приводящие к формированию более экстенсивных контактов. Молекула ДНК является высоко заряженным полиэлектролитом и, следовательно, ее электростатический потенциал может являться одной из основной характеристикой, распознаваемой ДНК-связывающими белками. Таким образом, необходимо исследовать вклад электростатических сил в стабилизацию специфического комплекса белок-ДНК.

Было показано, что электростатические взаимодействия играют важную роль в процессе образования специфических комплексов ДНК с белками, увеличивая скорость различных стадий этого процесса [85],[86] и оказывая влияние на структуру и стабильность образованных комплексов [96],[100],[101]. В частности, было найдено, что для группы белков ЬZIP семейства эукариотических транскрипционных факторов электростатические силы определяют форму межмолекулярного комплекса с ДНК, приводя к изгибанию двойной спирали ДНК в результате нейтрализации зарядов фосфатных групп на одной стороне молекулы [юо]. Для некоторых белков (лямбда с1 репрессора, ЕсоЫ эндонуклеазы, гомеодоменов), теоретические оценки свидетельствуют о том, что электростатический вклад локального белок-ДНК взаимодействия (солевые мостики) в изменении свободной энергии во время образования специфического комплекса мал [85],[юз]. Однако, для комплекса гомеодомен-операторный участок ДНК было показано, что нейтрализация фосфатных групп некоторых нуклеотидов приводит к тонкой подгонке структуры ДНК-белкового комплекса, причем оптимальной геометрия комплекса получается при нейтрализации части фосфатных групп, не имеющих прямого контакта с молекулой [Ю4]. Для фермента рестрикции ЕсоЫ было показано, что диффузия вдоль молекулы ДНК зависит от ионной силы и обусловлена контактами между аминокислотными остатками белка и сахарофосфатным остовом ДНК, особенно электростатическим взаимодействием между аминокислотной поверхностью цепи и фосфатными группами ДНК [95]. Таким образом, влияние электростатических сил на формирование специфического комплекса белок-ДНК может быть также и опосредованным, т.е. влиять через переорганизацию молекул воды.

Суммируя вышесказанное, электростатические взаимодействия играют существенную роль в многоэтапном процессе белок-ДНК узнавании. Детальная характеристика силы и специфичности этих взаимодействий для каждой отдельной белок-ДНК пары является одной из важнейших задач современных исследований.

Вычисление электростатического потенциала вокруг ДНК

В то время как электростатический потенциал белков и его роль в белок-ДНК взаимодействии достаточно хорошо изучены [85], [86], [юз], [Ю5], [Юб], [Ю7], [ios], влияние электростатических свойств ДНК на этот процесс до сих пор остается мало изученным. Электростатические свойства ДНК являются существенными во взаимодействиях ДНК-ДНК и белок-ДНК, а также определяют природу и структуру конденсированных противоионов окружающих ДНК. Поэтому, электрические поля и потенциалы ДНК и детали взаимодействия ДНК-растворитель являются предметом большого числа теоретических исследований, а так же экспериментальных измерений электростатического потенциала. Эти исследования тесно связаны с экспериментальными попытками воспроизведения ДНК и измерениями ДНК-ДНК отталкивающих сил.

К настоящему времени развиты достаточно эффективные методы численного решения уравнения Пуассона-Больцмана (как линейного, так и нелинейного) для белков и нуклеиновых кислот. Конечно-разностные методы были применены для нахождения решений линейного уравнения Пуассона-Больцмана в работах [109],[110],[111], для нелинейного в работе [112]. Метод граничных элементов использован в работе [113], конечных элементов-[114], многосеточный метод-[115].

Электростатические модели систем ДНК-растворитель обязательно используют идеализацию из-за сложности системы. В ряде исследований использовались упрощенные геометрии и распределения зарядов [116],[117],[118],[119], а также идеализированные модели диэлектрических постоянных, начиная с отсутствия различий между внутренней и внешней стороной макромолекул и кончая зависимой от расстояния, сложной диэлектрической функцией [120],[121],[122],[123],[124],[125],[126],[127],[128].

Чтобы учесть вклад противоионов в потенциал многие теории, рассматривающие потенциалы и концентрации противоионов используют различные формы уравнения Пуассона-Больцмана, включая полное нелинейное уравнение, его частное приближение, и линеаризованную форму, известную как модель Дебая-Хюкеля [129],[130],[131],[112],[132],[133]. Линеаризация уравнения Пуассона-Больцмана, не применимая, когда электростатические энергии не являются много меньшими чем тепловые энергии, позволяет использовать принцип суперпозиции для электростатических потенциалов.

Было разработано несколько теоретических методов расчета потенциалов, основанных на полно-атомной модели ДНК. В частности, Клейн и Пак [121],[122] рассчитывали потенциалы при помощи итеративного метода, основанного на законе Кулона и уравнении Пуассона-Больцмана для определения самосогласованного набора потенциалов и ионных концентраций. Джайярам [112] также применял полно-атомную модель для определения электростатического потенциала В-ДНК, используя метод конечных производных для решения нелинейного уравнения Пуассона-Больцмана. Позже Джайярам и Беверидж [132] решили линаеризованное уравнение Пуассона-Больцмана (в приближении Дебая-Хюкеля) аналитически для конечной длины ДНК для определения свободной энергии различных конформаций.

Хочберг [128] аналитически определил электростатические потенциалы и поля вокруг ДНК в приближении исключительно-фосфатной модели диэлектрического слоя при помощи метода функций Грина, а позже расширили модель до учета всех атомов ДНК [126]. Этот метод включает предположение о симметрии ДНК. В частности, атомы ДНК должны образовывать последовательности параллельных линий на поверхности концентрических цилиндров [134]. Растворитель рассматривался как однородная диэлектрическая среда. Байли [135] произвел подобные вычисления для потенциала внутренней части ДНК с учетом окружающего растворителя в приближении Дебая-Хюкеля, но учитывая только фосфатные заряды.

Материалы и методы.

В работе использовалась атомная модель ДНК, координаты атомов нуклеотидной пары взяты из работы [136]. Заряды, представляющие сумму плотностей а- и к- электронных облаков, взяли из работы [137] и помещали в центре атомов. При построении модели учитывались вариации величин расстояния между плоскостями соседних пар (rise) и угла поворота следующей пары относительно предыдущей (twist) в зависимости от нуклеотидной последовательности участка [138].

Последовательность ДНК фага Т7, содержащую промоторы AI, А2, A3 и кодирующую область гена 0.3, из GenBank (№V01146). Нуклеотидную последовательность E.coli с cysG промотором и nirC и cysG генами взяли из GenBank (№U00096)

Трехмерная структура С-концевого домена а-субъединицы РНК-полимеразы была взята из банка данных [Ю]. Как натйвную, так и АДФ-рибозилированный С-концевой домены а-субъединицы РНК-полимеразы минимизировали по энергии, используя модуль молекулярной динамики SANDER пакета программ Amber 5.0 с силовым полем [139]. Минимизация по энергии проводилась в водном растворе с добавленными ионам Na+ для нейтрализации зарядов. Для расчетов применяли независимую от расстояния диэлектрическую постоянную равную 4 и использовали cut-off в 8Ä для non-bonded взаимодействий. Полученные структуры очищали от воды и ионов натрия и использовали для вычисления электростатического потенциала.

Пространственное распределение потенциала находили как путем решения уравнения Пуассона-Больцмана, так и с использованием простой кулоновской формулы. Уравнение Пуассона-Больцмана

Электростатический потенциал вокруг молекулы в растворе в присутствии соли можно найти, решив уравнение Пуассона-Больцмана: -V(e(r)V<p(f) ) = 4я(р0(г) + pi«p(r) ) ), (1) где ф — электростатический потенциал, 8(г) — диэлектрическая проницаемость, р0=2/гге§(г1) — плотность зарядов атомов молекулы, р1=^п,^хехр(г}е(р/квТ) — плотность зарядов ионов (где и,- - концентрация ионов /-го типа, т.{ - заряд иона г-го типа), е — заряд электрона.

Граничное условие для потенциала определяется тем, что на достаточном удалении от макромолекулы потенциал не зависит от диэлектрической проницаемости внутри молекулы. Это позволяет заменить бесконечную область достаточно большим параллелепипедом Г, на границе которого где 8о — диэлектрическая проницаемость вакуума.

Решение нелинейного уравнения (1) с граничным условием ( 2) искали многосеточным методом [140]. Решение уравнения Пуассона-Бльцмана проводилось на прямоугольной сетке с 64x64x128 интервалами по координатным осям и размером бокса -30x30x120А. Итеративная процедура считалась завершенной при разности искомого потенциала на очередном шане итерации и значения на предыдущем шаге менее 10"4 кТ/е. Концентрация соли была принята равной 0,15М.

Распределение потенциала на сетке интерполировали кубическими сплайнами для получения распределения на поверхности цилиндра, ось которого совпадала с осью двойной спирали молекулы ДНК, радиусом 12А и с шагом 1А вдоль оси цилиндра и 1 ° по азимутальному углу. Кулоновская модель

Потенциал находили по кулоновской формуле: где ф — заряд ¿-того атома; г, — радиус-вектор йгого атома; в — диэлектрическая проницаемость. Для учета экранирования противоионами заряда на фосфатных группах абсолютную величину заряда на атомах О! и 02

2) этих групп уменьшали на 0.25е, что приводило к эффективному снижению заряда пары в целом с 2е до 1е. Диэлектрическая проницаемость выбиралась пропорционально расстоянию до точки наблюдения. Вклад атомов, расположенных на расстоянии больше 70 А от точки наблюдения, при вычислениях не учитывался. Распределение заряда рассчитывали на поверхности цилиндра с радиусом 15 А и с осью, совпадающей с осью двойной спирали молекулы ДНК (шаг 1А вдоль оси цилиндра и 1° по азимутальному углу).

Визуализация результатов

Результаты представлялись в виде развертки цилиндра на поверхность которого нанесена топологическая картина распределения электростатического потенциала. Для сравнительного анализа значения электростатического потенциала нормировали от -1 до 1 и каждому значению потенциала ставили в соответствие свой цвет. Для наглядности, рядом с каждым рисунком изображена цветовая шкала, соответствующая изменению значения потенциала от максимального к минимальному.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Джелядин, Тимур Рустемович

Выводы.

1. Разработан простой и быстрый метод вычисления распределения электростатического потенциала вокруг протяженных (-1000 пар нуклеотидов) участков двойной спирали молекулы ДНК, который позволяет проводить сравнительный анализ распределений электростатического потенциала функционально важных участков молекулы ДНК.

2. Показано, что точечные нуклеотидные замены в ДНК оказывают влияние на распределение электростатического потенциала на расстоянии -30 пар оснований.

3. Найдено, что распределение электростатического потенциала в промоторной области ДНК отличается от характера распределения электростатического потенциала в кодирующих участках генов.

4. Показано, что АДФ-рибозилирование остатка Arg-265 С-концевого домена а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli не приводит к возмущению третичной структуры белка, но существенно изменяет пространственное распределение и топографию электростатического потенциала субъединицы.

5. Найдены характерные мотивы в распределении электростатического потенциала в upstream области ранних промоторов фага Т4. Наличие этих мотивов обуславливает изменение функциональной активности промоторов при АДФ-рибозилировании а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli Ест70.

6. Показано, что характер воздействия АДФ-рибозилирования РНК-полимеразы на активность промоторов фага Т4 определяется спецификой электростатических взаимодействий промоторной ДНК с АДФ-рибозилированным С-концевым доменом а-субъединицы.

7. Найдена зависимость пространственного распределения электростатического потенциала промоторов от первичной стуктуры.

Высказана гипотеза об электростатической регуляции функциональной активности промоторов.

Работа поддержана грантами РФФИ №99-04-48177 и №01-04-06409.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Джелядин, Тимур Рустемович, Пущино

1. Burton Z., Burgess R.R., Zin J., Moor D., Holder S., Gross СЛ., The nucleotide sequence of the cloned rpoD gene for the RNA polymerase sigma submit from E.coli K12. Nucl. Acids Res., 1981. 9: p. 2889-2903.

2. Ovchinnikov Y.A., Lipkin Y.M., Modyanov N.N., Chertov O.Y., Smirnov Y.V., Primary structure of a-subunit of E.coli RNA polymerase. FEBS Lett., 1977. 76: p. 108-111.

3. Mustaev A, Kozlov М., Markovtsov V., Zaychikov Е., Denissova L., Goldfarb A., Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. 94(6641-6645).

4. Negishi Т., Fijita N., Ishihama A., Structural map of the alpha submit of Escherihia coli RNA polymerase: structural domains indentified by proteolytic cleavage. J. Mol. Biol., 1995. 248: p. 723-728.

5. Severinov K., Mustaev A., Severinova E., Bass J., Kashlev M., Landick R., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S.A., Assembly of functional Escherichia coli RNA polymerase containing ¡3-suhunit fragments. Proc. Natl., Acd. Sci USA, 1995. 92(4591-4595).

6. Severinova E., Severinov K., Fenyo O., Marr M., Brody E.N., Roberts J.W., Chait B.T., Darst S.A., Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 submit. J.Mol.Biol., 1996. 263: p. 637-647.

7. Chan C.L., Lonetto M.A., Gross C.A., Sigma domain structure: one domain, one to go. Structure, 1996. 4(1235-1238).

8. Jeon Y.H., Negishi Т., Shirakawa M., Yamazaki Т., Fujita N., Ishihama A., Kyogoku Y., Solution structure of the activator contact domain of the RNA-polymerase alpha submit. Science, 1995. 270(5241): p. 1495-1497.

9. Siegele D.A., Hu J.C., Walter W.A., Gross C., Altered promoter recognition by mutant forms of the a7() submit of Escherichia coli RNA polymerase. J.Mol.Biol., 1989. 206: p. 579-590.

10. Gardella Т., Moyle Т., Susskirh М., А mutant of Escherichia coli o70 submit of RNA polymerase with altered promoter specificity. J.Mol.Biol., 1989. 206: p. 579-590.

11. Waidburger C., Gardella Т., Wong В., Susskind M.M., Changes in the conserved region 2 of Escherichia coli o70 affecting promoter recognition. J.Mol.Biol., 1990. 215: p. 267-276.

12. Hernandez V.J., Cashel M., Changes in the conserved region 3 of E.coli <j70 mediate ppGpp-dependent functions in vivo. J.Mol.Biol., 1995. 252: p. 536549.

13. Камзолова С.Г., Арутюнян A.B., Озолинь O.H„ Оганесян М.Г., Роль РНК-полимеразы в регуляции активности генов у Escherichii coli. Мутанты с плейотропным эффектом. Мол.Биол., 1979. 13: р. 681-688.

14. Jura Т., Ishihama A., Genetics of E.coli RNA polymerase submits. Annu. Rev. Jenet., 1979.13: p. 681-693.

15. Ларионов O.A., Грагеров А.И., Каляева Э.С., Никифоров В.Г., Холодочувствительная мутация в ß-субъединице РНК-полимеразы E.coli, влияющая на открывание промоторов. Мол.Биол., 1979.13: р. 1327-1340.

16. Bartlett M.S., Gaal T., Ross W., Course R.L., RNA polymerase mutants that destabilize RNA polymerase-promoter complexes alter NTP sensing by rmPl promoters. J.MoLBiol., 1998. 279: p. 331-345.

17. Zhou Y.N., Jin DJ., The rpoB409 mutants destabilizing initiation complexes at stringently controlled promoters behave like "stringent" RNA polymerase in E.coli. Proc. Natl. Aead. Sei. USA, 1998. 95: p. 2908-2913.

18. Nudler E., Gusarov J., Avetissova E., Kozlov M., Goldfarb A., Spatial organization of transcription elongation complex in Escherichia coli. Hcmyrcy, 1998. 281: p. 424-428.

19. Lisser S., Margalit H., Compilation of E.coli mRNA promoter sequences. Nucleic Acids Res., 1993.21: p. 1507-1516.

20. Hawley D., McClure W.R., Compilation analysis of Escherichia coli promoter DNA sequences. Nucl.Acids Res., 1983.11: p. 2237-2255.

21. Harley C.B. and Reynolds R.P., Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res, 1987.15(5): p. 2343-2361.

22. Schölten M., Tommassen J., Effect of mutations in the -10 region of the phoE promoter in Escherichia coli on regulation of gene expression. Mol. Gen. Genet., 1994. 245: p. 218-223.

23. Kobayashi M., Nagata K., Ishihama A., Promoter selectivity of Escherichia coli RNA polymerase: effect of base substitutions in the promoter -35 region on promoter strength. Nucleic Acids Res., 1990.18: p. 7367-7372.

24. Were! W., Schickor P., Heumann H., Flexibility of the DNA enhances promoter affinity of Escherichia coli RNA polymerase. EMBO J., 1991. 10: p. 25892594.

25. Dombroski A.J., Walter W.A., Record M.T., Siegele D.A., Gross C.A., Polypeptides containing highly conserved regions of transcription factor o70 exhibit specificity of binding to promoter DNA. Cell, 1992. 70: p. 501-512.

26. Mulligan M.E., Brosins J., McClure W.R., Characterization in vitro of the effect of spacer length on the activity of Escherichia coli RNA polymerase at the tacpromoter. J.Biol.Chem., 1985. 260: p. 3529-3538.

27. Bauer F.B., Elford R.M., Holmes W.M., Mutagenesis andfunctional analysis of the E.coli tRNA leu promoter. Mol.Microbiol., 1993. 7: p. 265-273.

28. Beutel B.A. and Record J.M.T., E. coli promoter spacer regions contain nonrandom sequences which correlate to spacer length. Nucleic Acids Research, 1990.18: p. 3597-3603.

29. Aoyama T., Takanami M., Essential structure of E.coli promoter. II. Effect of the sequences around the RNA start point on promoter function. Nucl. Acids Res., 1985.13: p. 4085-4096.

30. McAllister C.F., Achberger E.C., Effect of polyadenine containing curved DNA on promoter utilization in Bacillus subtilis. J.Biol.Chem., 1988. 263: p. 1174311749.

31. Wang Q., Albert F.G., Fitzgerald D.J., Calvo J.M., Anderson J.N., Sequence determinants of DNA bending in the ilvH promoter and regulatory region of E.coli. Nucl. Acids Res., 1994. 22: p. 5753-5760.

32. Harrington R.E., DNA curving and bending in protein-DNA recognition. Mol.Microbiol., 1992. 6: p. 2549-2555.

33. Adhya S., Gottesman M., Garges S., Oppenheim A., Promoter resurrection by activators. Gene, 1993.132: p. 1-6.

34. Deuschle U., Promoters of Eschericia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. The EMBO Journal, 1986. 5(11): p. 2987-2994.

35. Kammerer W., Deuschle U., Gentz R., Bujard H., Functional dissection of Escheichia coli promoters: information in the transcribed region is involved in the late step of the overall process. EMBO J., 1986. 5: p. 2995-3000.

36. Bruner M., Bujard H., Promoter recognition and promoter strength in Escherichia coli system. EM BO J., 1987. 6: p. 3139-3144.

37. Keilty S., Rosenberg M., Constitutive function of a positively regulated promoter reveals new sequence essential for activity. J.Biol.Chem., 1987. 262: p. 6389-6395.

38. Chan, B., Spassky A. and Busby S., The organization of open complexes between Escherichia coli RNA polymerase and DNA fragments carrying promoters either with or without consensus -35 region sequences. Biochemical Journal, 1990. 270: p. 141-148.

39. Bertrand-Burggraff E., Dunamd J., Fuchs R.P.R., Lefevre J.F., Kinetic studies of the modulation of ada promoter activity by upstream elements. The EMBO J., 1990. 9: p. 2265-2297.

40. Ross W., Gosink K.K., Solomon Y., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R.L., A third recognition element in bacterial promoters. DNA binding by the a-subunit of RNA polymerase. Science, 1993. 262: p. 1407-1413.

41. Ponnambalam S., Webster C., Bingham A., Busby A., Transcription initiation at the Escherichia coli galactose operon promoters in the absence of the normal -35 region sequence. J. Biol. Chem., 1986. 261: p. 16043-16048.

42. Kumar A., Grimes B., Fujita N., Nokino K., Malloch R.A., Hayward R.S.,1.hihama A., The role of submit of E.coli RNA polymerase in transcription activation. J.Mol.Biol., 1994. 235: p. 405-413.

43. Ozoline O.N., Kamzolova S.G., Physico-chemical studies of complex formation of DNA with wild and mutant E.coli RNA polymerase. FEBS Letters, 1986. 200: p. 291-297.

44. Камзолова С.Г., Озолинь О.Н., , Утешев Т.А,, Влияние мутации в f3-субъединице РНК-полимеразы E.coli на селективность комплексообразования с промоторами Т7 ДНК. ДАН СССР, 1989. 309: р. 487-490.

45. Gaal Т., Ross W., Blatter E.E., Targ H., Jia X., Krishnan V.V., Assa-Munt N.,Ebright R.M., Gourse R.L., DNA binding determinants of the alpha submit of RNA polymerase: novel DNA binding domain architecture. Genes Dev., 1996.10: p. 16-26.

46. Камзолова С.Г., Озолинь O.H., Специфические конформационные переходы РНК-полимеразы при образовании открытых промоторных комплексов с Т7 ДНК. ДАН СССР, 1986. 287: р. 731-734.

47. Chan В., Busby S., Recognition of nucleotide sequences at the Escherichia coli galactose operon PI promoter by RNA polymerase. Jene, 1989. 84: p. 227-236.

48. Камзолова, С.Г., Interaction of Escherichia coli RNA polymerase with promoters. The need for a classified approach in studying the code of promoter-polymerase recognition. Биохимия, 1995. 60(3): p. 285.

49. Rozkot F., Sazelova P., Pivec L., A novel method for promoter search enhanced by junction-specific subgrouping of promoters developed and tested on Escherichia coli system. Nucl. Acids Res., 1989.17: p. 4799-4815.

50. O'Neill M.C., Chiafari F., Escherichia coli promoters. II. A spacing class-dependent promoter search protocol. J. Biol. Chem., 1989. 264: p. 5531-5534.

51. Liebig H.-D., Ruger W., Bacteriophage T4 early promoter regions consensus sequences of promoters and ribosome-binding sites. J. Mol. Biol., 1989. 208: p. 517-536.

52. O'Neill M.C., Escherichia coli promoters. I. Consensus as it relates to spacing class, specificity, repeat substructure, and three-dimensional organization. Journal of Biological Chemistry, 1989. 264: p. 5522-5530.

53. Lukashin A.V., Anshelevich V.V., Amirikyan R.R., Gragerov A.J., Frank-Kamenetskii M.D., Neural network models for promoter recognition. J. Biomol. Struct. Dyn., 1989. 6(6): p. 1123-1133.

54. Ozoline O.N. and Tsyganov M.A., Structure of open prromoter complexes with Escerichia coli RNA polymerase as revealed by the DNase I footprinting technique: compilation analysis. Nucleic Acids Research, 1995. 23(22): p. 4533-4541.

55. Кутузова Т.К., Франк Г.К., , Макеев В.Ю., Есипова Н.Г., Полозов Р.В., Фурье анализ нуклеотидных последовательностей. Периодичность в промоторных последовательностях E.coli. Биофизика, 1997. 42: р. 354362.

56. Камзолова С.Г., Взаимодействие РНК-полимеразы Escherichia coli с прмоторами. Необходимость классификационного подхода в изучениикода промоторно-полимеразного узнавания. Биохимия, 1995. 60: р. 387394.

57. Perez-Martin J., Rojo F., de Lorenzo V., Promoter responsive to DNA bending: a common theme in prokaryotic gene expression. Microbiol. Rev., 1994. 58: p. 268-290.

58. Камзолова С.Г., Иванова H.H., КамзаловС.С., Якушевич Л.В., Конформационный анализ комплексов РНК-полимеразы E.coli с ДНК Биофизика, 1998. 43: р. 433-437.

59. Kamzolova S.G., Ivanova N.N., Kamzalov S.S., Complex formation of E.coli RNA polymerase with bacteriophage T2 DNA: long-range effects in DNA. J. Biol. Phys., 1999.24: p. 157-166.

60. Travers A.A., DNA conformation and protein binding. Annu. Rev. Biochem., 1989. 58: p. 427-453.

61. Travers A.A., Why bend DNA. Cell, 1990. 60: p. 177-180.

62. Lozinski Т., Adrych-Rozek K., Markiewicz W.T., Wierzchowski K., Effect of DNA bending in various regions of a consensus-like E.coli promoter on its strength in vivo and structure of the open complex in vitro. Nucl. Acids.Res., 1991.19: p. 2947-2953.

63. Gaal Т., Rao L., Estrem S.T., Yang J., Wartell R.M., Course R.L., Localization of the intrinsically bent DNA region upstream of the E.coli rrnBPl promoter. Nucl. Acids. Res., 1994. 22: p. 2344-2350.

64. Hsu L.M., Gannini J.K., Leung T.W.C., Crosthwaite J.C., Upstream sequence activation of Escherichia coli argT promoter in vivo and in vitro. Biochemistry, 1991. 30: p. 813-822.

65. Ohyama T., Nagumo M., Hirota Y., Sakumo S., Alteration of the curved helical structure located in the upstream region of the ft-lactamase promoter of plasmidpUC19 and its effected on transcription. Nucl. Acids. Res., 1992. 20: p. 1617-1622.

66. Kamzolova S.G., Postnikova G.B., Spin-labeled nucleic acids. Quart. Rev. Biophys., 1981.14: p. 223-268.

67. Yakushevich L., Non-linear DNA dynamics and problem of gene regulation. Nanobiology, 1992.1: p. 343-350.

68. Travers A. A., Structure and function of E. coli promoter DNA. CRC Crit. Rev. Biochem., 1987. 22: p. 181-219.

69. Hud N.V., Sklenar V, Feigon J., J. Mol. Biol., 1999. 286: p. 651-660.

70. Chiu T.K., Zaczor-Grzeskowiak M., Dickerson R.E., J. Mol. Biol., 1999. 292: p. 589-608.

71. Krishna T.S.R., Kong X.-P., Gaiy S., Burgers P. M., Kuriyan J., Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA■ Celb 1994- 79 P- 1233-1243

72. Honig B., Nichols A., Classical electrostatics in biology and chemistry. Science, 1995.268: p. 1144-1149.

73. Harada I., Funatsu T., Nonoyama Y., Yanagida T., Single molecule image of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys. J., 1998. 74: p. A69.

74. Kabata H., Kurosawa O., Arai I., Washizu M., Margason S.A., Glass R.E., Shimamoto N., Science, 1993. 262: p. 1561-1563.

75. Singer P., Wu C.-W., J. Buiol. Chem., 1987. 262: p. 14178-14189.

76. Belinstev B.N., Zavriev S.K., Shemyakin M.F., Nucleic Acids Res., 1980. 8: p. 1391-1404.93. von Hippel P.H., Berg O.G., Facilitated target location in biological systems. J. Biol. Chem., 1989. 264: p. 675-678.

77. Riggs A.D., Bourgeois S„ Cohn M.J., J. Mol. Biol., 1970. 53: p. 401-417.

78. Jeltsch A., Alves J., Wolfes H., Maass G., Pingoud A., Pausing of the restriction endonuclease EcoRI during linear diffusion on DNA. Biochemistry, 1994. 33: p. 10215-10219.

79. Ohlendorf D. H., Matthew. J.B., Electrostatics and flexibility in protein-DNA interactions- Adv. Biophys., 1985. 20: p. 137.

80. Votavova H., Hodanova K., Arnold L., Sponar J.> Interaction of a bZIP oligopeptide model with oligodeoxyribonucleotides modelling DNA bindingsites. The effect of flanking sequences• J. Biomol. Struct. Dyn> 1997. 15(3): p. 587-596.

81. Carra J. H., Privalov P.L., Energetics of folding and DNA binding of the MAT alpha 2 homeodomain■ Biochemistry» 1997. 36(3): p. 526-535.

82. Guzikevich-Guerstein G., Shakked Z., A novel form of the DNA double heliximposed on the TATA-box by the TATA-bindingprotein■ Nature Struct. Biol.?1996. 3(1): p. 32-37.

83. Strauss-Soukup J. K., Mahed L.J., 3rd,* Electrostatic effects in DNA bending by GCN4 mutants- Biochemistry, 1998. 37(4): p. 1060-1066.

84. Werner M. H., Groienborn A.M., Clore G. M.» Intercalation, DNA kinking, and the control of transcription- Science» 1996. 27: p. 778-784.

85. Albright R.A., Mossing M.C., Matthews B.W., Crystal structure of an engineered Cro monomer bound nonspecifically to DNA: possible implications for nonspecific binding by the wild-type protein. Protein Sei., 1998. 7: p. 14851494.

86. Misra V.K., Hecht J.L., Sharp K.A., Friedman R.A., Honig B., Salt effects on protein-DNA interaction. The lambda cl repressor and EcoRI endonuclease■ J. Mol. Biol, 1994. 238(2): p. 264-280.

87. Labeots L. A., Weiss M.A., Electrostatics and hydration at the homeodomain

88. DNA interface: chemical probes of an interfacial water cavity■ J- Mol. Biol.,1997. 269(1): p. 113-128.

89. Zacharias M., Luty B.A., Davis M.E., McCammon J.A.> Poisson-Boltzmann analysis of the lambda repressor-operator interaction- Biophys. J.> 1992. 63(5): p. 1280-1285.

90. Warwicher J., Watson H.C., J. Mol. BioL, 1982. 157: p. 671.

91. Klapper I., Hagstrom R., Fine R., Sharp K.A., Honig В., Proteins, 1986. 1: p. 47.

92. Warwicher J. Theoret. Biol, 1986.121: p. 199.

93. Jayaram В., Sharp K.A., Honig В., The Electrostatic potential of B-DNA. Biopolymers, 1989. 28: p. 975-993.

94. Zauhar R„ Morgan R.J., J. Mol. Biol, 1985. 186: p. 815.

95. You T.J., Harvey S.C., J. Comput. Chem., 1993.14: p. 484.

96. Федоренко Р.П., Введение в вычислительную физику. 1994, Москва: МФТИ.

97. Hill L.T., Approximate calculation of the electrostatic free energy of nucleic acids and other cylindrical macromolecules. Arch. Biochem. Biophys., 1955. 24: p. 427-439.

98. Stigter D., The charged colloidal cylinder with a Gouy double layer. J. Colloid Interface Sci., 1975. 53: p. 296-306.

99. Scheilman J.A., Electrical double layer, zeta potential, and electrophoretic charge of double-stranded DNA. Biopolymers, 1977.16: p. 1415-1434.

100. Weisbuch G., Gueron M., Poly electrolyte theory. 3. The surface potential in mixed-salt solution. J. Phys. Chem., 1982. 85: p. 517-525.

101. Pullman A., Pullman В., Molecular electrostatic potential of the nucleic acids. Q. Rev. Biophys., 1981. 14: p. 289-380.

102. Klein В J., Pack G.R., Calculations of the spatial distribution of charge density in the enviroment of DNA. Biopolymers, 1983. 22: p. 2331-2352.

103. Pack G.R., Klein B.J., Generalized Poisson-Boltzmanncalculation of the distribution of electrolyte ions around the B- and Z-conformers of DNA. Biopolymers, 1984. 23: p. 2801-2823.

104. Hingerty B.E., Ritchie R.H., Ferrell T.L., Turner J. E., Dielectric effects in biopolymers: the theory of ionic saturation revisited. Biopolymers, 1985. 24: p. 427-439.

105. Pack G.R., Lamm G., Wong L., Clifton D., The structure of the electrolyte environment of DNA., in Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics., L.R. Beveridge D.L., Editor. 1990, Adenine Press: New York. p. 237-246.

106. Pack G.R., Garret G.A., Wong L., Lamm G., The effect of a variable dielectric coefficient and finite ion size on Poisson-Boltzmann calculations of DNA-electrolyte systems. Biophys. J., 1993. 65: p. 1363-1370.

107. Edwards G., Hochberg D., Kephart T.W., Structure in the electric potential emanating from DNA. Phys. Rev. E., 1994. 50: p. R698-R701.

108. Lin-Chung P.J., Rajagopal A.K., Helical coordinate system and electrostatic fields of double-helix charge disributions. Phys. Rev. E., 1995. 52: p. 901-906.

109. Hochberg D., Kephart T.W., Edwards G., Structural information in the local electric field of dissolved B-DNA. Phys. Rev. E., 1994. 49: p. 851-867.

110. Soumpasis D., Debye-Huckel theory of model polyelectrolytes. J. Chem. Phys., 1978.69: p. 3190-3196.

111. Pack G.R., Wong L., Prasad C.V., Counterion distribution around DNA: variation with conformation and sequence. Nucleic Acids Res., 1986. 14: p. 1479-1493.

112. Gilson M.K., Sharp K.A., Honig B.H., Calculating the electrostatic potential of molecules in solution: method and error assessment. J. Comp. Chem., 1987. 9: p. 7782-7786.

113. Jayaram B., Beveridge D.L., Free energy of an arbitrary charge distribution imbedded in coaxial cylindrical dielectric continual application toconformational preferences of DNA in aqueous solutions. J. Phys. Chem., 1990. 94: p. 4666-4671.

114. Sharp K.A., Honig B., Calculating total electrostatic energies with the nonlinear Poisson-Boltzmann equation. J. Phys. Chem., 1990. 94: p. 76847692.

115. Record M., Electrostatic effects on polynucleotide transitions. I. Behavior at neutral pH. Biopolymers, 1967. 5: p. 975-992.

116. Bailey J.M., The electrostatic potential of a discretely charged cylinder in solution. Biopolymers, 1973. 12: p. 559-574.

117. Landolt-Bornstein, Numerical Data and Functional Relationships in Science and Technology. New Series, ed. W. Saenger. Vol. VII/lb. 1989, Berlin: Springer-Verlag.

118. Zhurkin V.B., Poltev V.L, Florent'ev V.L. Atom—atomic potential functionsfor conformational calculations of nucleic acids. Mol Biol (Mosk)> 1980. 14(5): p. 1116-1130.

119. Ponomarenko M.P., Ponomarenko I.V., Kel' A.E., Kolchanov N.A., Karas H., Wingender E., Sklenar H.> Computer analysis of conformational features of the eukaryotic TATA-box DNA promotors■ Mol Biol (Mosk> l"7- 31: p. 733740.

120. Gould I.R., Merz Jr.K.M., Ferguson D.M., Spellmeyer D.C., Fox T., Caldwell J.W., Kollman P.A., J. Am. Chem. Soc., 1995.117: p. 5179-5197.

121. Fedoseyev A.I., Lazarev P.I., Sivozhelezov V.S., Chernyaev E.V., Petrenko I.I., Purtov S.V. Mathematical modelling of 3D protein molecule potential in nonlinear media- iQ Proceedings of the 'Physique en Herbe" Congress. 1992.1. Marseille

122. Gavryushov S., Zielenkiewicz P., Electrostatic Potential of B-DNA: Effect of Interionic Correlations. Biophysical Journal, 1998. 75: p. 2732-2742.

123. Manning, G.S., Q. Rev. Biophys., 1970.11(1087).

124. Франк-Каменецкий М.Д., Аншелевич В.В., Лукашин A.B., Полиэлектролитная модель ДНК. УФН, 1987.

125. Wagner К., Keyes Е., Kephart T.W., Edwards G., Analitical Debye-Huckel Model for Electrostatic Potentials around Dissolved DNA. Biophisical Journal, 1997. 73: p. 21-30.

126. Delrow J.J., Gebe J.A., Schurr J.M., Biopolymers, 1997. 42: p. 455.

127. Mazur J., Jernigan R.L., Distance-dependent Dielectric constants and their application to double-helical DNA. Biopolymers, 1991. 31: p. 1615-1629.

128. Ramstein J., Lavery R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1988. 85: p. 7231.

129. Sarai A., Mazur J., Nussinov R., Jernigan R.L., Biochemistry, 1989. 28: p. 7842.

130. Lazarev P. I., Sivozhelezov V.S., Top. Mol. Organ. Engin., 1991. 7: p. 149.

131. Dausse J. P., Sentenac A., Fromageot P.> Interaction of RNA polymerase from Escherichia coli with DNA. Effect of temperature and ionic strength on selection ofT7DNA early promoters• Eur. J. Biochem» 1976. 65(2): p. 387393.

132. Wienand U., Beck E., Fuchs E.? Short RNA chains synthesized at low pH are initiated at promoter sites- Nucleic Acids Res.> 1978. 5(4): p. 1403-1411.

133. Mishra R. K., Gopal V., Chatterji D.> Correlation between DNA supercoiling and the initiation of transcription by Escherichia coli RNA polymerase invitro: role of the sequences upstream of the promoter region■ FEBS Lett? 1990. 260(2): p. 273-276.

134. Steven A.C., Couture E., Aebi U., Showe M.K., J. Mol. Biol., 1076. 106: p. 187-221.

135. Wilkens K., Ruger W., in Molecular biology of bacteriophage T4, D.J.W. Kram J.D., Kreuzer K.N., Mosig G., Hall D.H., Editor. 1994, ASM Press: Washington D.C.p. 132-141.

136. Wilkens K., Tiemann B., Bazan F., Ruger W., in ADP-ribosylation in Animal Tissue., H.a. Koch-Nolte, Editor. 1997, Plenum Press: New York. p. 71-82.

137. Blatter E., R.W., Tang H., Gourse R.L., Ebright R.H., Cell, 1994. 78: p. 889896.

138. Newlands J.T., Josaitis C.A., Ross W., Gourse R.L., NucL Acids Res., 1992. 20: p. 719-726.

139. Zhou Y., Merkel T.Y., Ebright R.H., J. Mol. Biol., 1994. 243: p. 603-610.