Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фотофизики и фотохимии порфиринов, ароматических аминокислот и белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование фотофизики и фотохимии порфиринов, ароматических аминокислот и белков"

MHO "ФОРУМ" ATL.ICTBO БИОИНФОРМАТИКИ И ЭКОЛО! ЛИ ЧЕЛОВЕКА

Р Г Б ОД

- ^ Д£[{ ф!. на правах рукописи

VTK 577.3^17.93» 541.14

КОСТИКОВ Александр Петрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОФИЗИКИ И ФОТОХИМИИ ПОРФИРИНОВ, АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ.

03.00.02. - Биофизика

А ВТ О Р " Ф Е Р AT

диссертации на соискание-ученой степени доктора физико-математических пу"

Москв - 1ЭТ4

Работа выполнена в

Институте химической физики им. Н.Ь. Семенова "АН и Славянском гс дарственном педагогическом институте

Официальные огпоненты:

доктор физико-математические наук, профессор В.Е. Холмогоров

доктор физико-мат-Ж-ггических наук, профессор М.К. Пула.ова

доктор 1ризико-математичесгоа наук, - прс'ессор Э.К. Рууте

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РйН

Зашита сьзтоигся " £.йК.й<Г{г-3 г. в /2

2о

_ часов на

пру Агенстве

за«. лцании Сшцизлизиропанногс Совета Д. Г7Г. 01.01 <5иошфс$м)фгики и экологии человека МНО "Форум" по адресу: Москва, улица Косыгина, 4. " :

С диссертацией могло ознакомил, зя в библиотеке Агеяствэ биоин-формапзси ч экологии человека.

Автореферат разос. эн " 22- Нб^^Л 199^ г.

Учет Ш сгчрвтарь

Специализированного Совета Д 170.01.01

Н.Шекшеев

ОБЩАЯ ХАРаКТЕГИСТ'ИА РлЕСТЫ

Ащ^^лытость проблемы.

Действие свота на биологические структуры приводит к самым разным последствия". Диапазон таких последствий чрезвычайно широк, от жизньлно необходимых (фотосинтез) до нежелат-льных или опасных для организма (сенсибилизированная г.острукция и прямой фотолиз молекул). Молекулярные механизмы, лежащие ^ основе всех этих воздействий такие зосьма разнообразны. Это процессы миграции энергии, фотоиндунирозакого переноса ■ электронов, сенсибилизированные реакции образования свободных радикалов. В качестве фотосенсибилизатора могут служить как молекулы, имокщие биологическою природу (порфирины, фдзвины, прсматическиз аминокислоты), так и молекулы, попавшие в организм извне. В последние год штснсивно развивается очень интересная область фотохимии - "фг~сбиохимия в темноте". Как выяснилось, в живом организме в различных процессах жизнедеятельности (ферментативные реакции, перенос олегс ронов, рекомби;-1иля ион-радикалов и др.) образуется целый ряд молекул в возбужденных состояниях, в частности, ацетон и другие соединения в триплетнем состоянии. Эти молекулы, образовавшиеся в темного ь возбуждением состоянии, способны передавать свою зноргио возбуждения согэдним молекулам, в том числе порфиринам или триптофану, дальнейшие реакции составляют предает обычной фотохимии.

Особый интерес представляет исследование механизмов действия ультрафиолетового излучения (УФ) на биологические структуры. Результата такого воздействия могут быть -ведень- в три группы: изменение струю^ры и функции ДГ{, фотоинзктивг•гия ферментов, повреждение биомембрак. При фотс.лактивации белков рошаюа;ео значение имеют ароматические аминокислотные остзтки (тирозин и, особенно, триптофан). Эти аминокислотные остатки, имея полосы пглощения в длинноволновой УФ облас—л, способны инактивировзть белок ■ не только из-за собственной деструкции, но могут тагско сенсибилизировать разрушение алифатических групп белка, но поглощяющих дгиинсзалгоБоо УФ-издучекио.

Сотохимическиэ реакции биологически важных молекул иг •лодопа-лись многими авторами (А.Н.Теронин, В.Е.Холмогоров, Ю.я.Владимиров, Л.П.Каюшин, О.А. Азизобз, М.К.Пулатова, К.М.-Тьвов, Р. Сайту с, У."так, К.Хелен, Л.Гроссг*.Янер, Д.Бент, Е.ХаЯог и другие), и многие детали их механизма хорошо изучены. В частности, наястяо

установлено. что в шых фотопроцессах определяющую роль

часто играют молекулы в триплетном возбуящэ^,>м состоять. Это справедливо как для реакций фотоинд>цирован..ого переноса электрона, в которых участвует к шее-триплета'-возбужденное состояние, так и длг ррчкций фотоионизации или фотодиссоциаци.-, в которых нижнее триплетное состояние играет роль промежуточного в двух-квсдтовом фотохимии леком процессе. В частности, установлено, что первичные продукты фотоионизации ароматической аминокислоты, катион-радикал и зжектированный электрон, способны взаимодействовать с различными группами белка, гекериру; радикалы этих групп. Показа!-), что большая часть эть; радикале способны к дальнейшим фотохимическим превращениям. Многое извес гно о характеристиках образующихся ^чдикалов.

Несмотря на все успе .и в выяснении механизмов фотопроцессов, происходящих с участием ароматических аминокислот, остаетс.. еще много неясных вопросов. Это г-носится как с 4отофизичес им характеристикам трипле~юго состояния, так и к механизму первичных фотохимических пронессо" . В последние ror J можно раблюдать воз-растан.лэ и: гереса : тршт гным состояниям в связи с регистрацией фосфоресценц/и белков ггч комнатной температуре. Высокая чувстпипльност^ характеристик триплетного состояния, особенно прокосов ого пезс.стив< да, к свойствам ближайшего окружения хро..;офор^, позволяет и-пользовять фосфоресценцию белков душ изучения структуры и динамики белковой молексль; в процессе её фликциони]..ования. 1даак^ .далеко не все известно о св^лствах молекул в триплетном состоял: л, ocJghho, в высоковозбужденных триплэтных состяниях. Во многом нс 1зучен вопрос г механизме тЛк называемых сенсиЗилизиров^Еных ¡ла&ълл с участием ароматических аминокислот. Лонтта "сенсибилизация" испсль уется часто для обозначения пло*о изученного механизма, в результате которого рогаст^ируптся конечные продукты многоступенчатых процессов. Однако су^твуят пр мори, "огда удавалось наблюдать реакции, в которых молекула ф-этосевсибилизатора не испытывала химических прг вращений в процессе сенсибилиза. ли. В частности, в работах В.Е Хо.таогорова и А.Н.Терекина была.показана ljsmojkh ггь переноса энр~гии с : ¡сокэвозбувдзнных триплетных уровней энергии сенсиби-лизаторз нэ молекулы матрицы " последующей да- :оцv шей последних ка радикалы. Нам предст влялось странным, что для первичн го

фотохимического гродасс® ароматических а**инокислот обдапри..ятым считается злы си ж .анизм фотоиониза.дии. г учетом новых данных о высоковозбуждеиных триплетных состояниях молекул, мы считали полезньш провести "наллз механизмов генерации радикала при облучении УФ светом pat .'воров ароматических аминокислот особенно в случаях, когда в растворе имеется большая концентрация других аминокислот.

Падь пайота. Изучение свойг в триплатного' состояния пор<лринов и ароматические аминокислот мэтод-ч ЭПР и оптическими методами, .исследование фотофизики высоковозбуждеиных -риплетных состояний,. а также изучекие механизмов фотореакций хлорофилла и ароматических аминокислот.

Задачи ис ледований. Лля ;,_1стижения цели работы требовалось роптать следукпиз задачи: .

1. Исследоват, спектры ЭПР триплетного сост яго ; гюрфирипов и ароматических аминокислот. Из спектров определить главные значения тензоров ит-тн-спинового взаимодействия неспа; jhi.jx электронов триплетного состояния (параметры \ ющеплепия в пулов«..л магнитно-; толе).

2. Исследовать методом ЭПР фоторзакции в растворах хлорофилла и его аналогов с хинонами и другими акцепторами электронов, .установит^ кгхсякзм происходящих процессов.

3. Исследовать факторы, влияющие на степень засоле лости триплетных состояний в «эстворчх зроматичоских аминокг^лот и белков.

4. Создать автоматизированные комплексы ¿.Т-спектрометра, спектрофотометра и фосфороскопической установил на иазе IBM типа СМ-с. СМ-4.

5. Найти оптимальные условия для получения спектров ЭПР радикалов, возникающих при двкарбоксилиро^ании пептидов и алифатических аминокислот, изучить механизм этоР реакции.

6. Ис ладовать механизм ^отосенсибили ированных реакций в твердых растворах ароматических аминокислот с алифатическими аминокислотами и пептидами. Идентифицировать продукты реакции по "поктрлм ЭПР и с ветрам электронного поглощения.

7. исследовать закономерности накопления У<5-ипдударовэнгчх радикалов в замороженных растворах белков, провести анал 'з механизма установления предельной концентрации таких радикалов.

- б -

Научная новизна.

В работе впервые измерены и ^характерисованы спок"ры ЭПР триплетно-возбужденых порфиринов г твердых матрицах при 300 К и 77 К для переходов с дтп=+".

Обнартаено обратимое световое тушение триплетнгго состояния триптофана и его аналогов при облучении в области длинноволновой полосы ^/пплет-тркплетного поглощения. Изучен механизм аффекта. Показано, что он связан с дезактивацией триплетного состояния при взаимодействии высоковозбужденного триплетного состояния иядольного кольца с С=0 группами, входящими в состав молекулы или тюлллежалтя соседним молоку -эм.

При исследовании концентрационного тушения триплетного во&^уж-дения в растворах триптофана при 77 " показано, что т.у жен та можно объяснить механизмом, важную роль в котором играют высоковозбуж-денпые триплет;.ые состояния. Этот же механизм позволяет объяснить особенности заселенности триплетных состояний ароматических аминокислотные остатков белков.

показано, что в растворах хлорофилла с хинонами может происходить ^отоичдуцироранный горенос электрона с образованием катион-радикала хлорофилла и анио^-радикала хинона.

При исследовании фотороакции сенсибилизированного обоазования рздасалов в тверды? растворах ароматических аминокислот с алифа-•пгзскиу" аминокислотами показано, что ранее принятый механизм не позволяет удовлетворительно объяснить окспери'-'ентальные данные. ?5с.уудикп-я альтерчат/н ь'о мехаку мы.

Изучены процессы, призодяш'э к установлению предельной концентрации У 5 индуцированных радихалгв в растворах белков при Т<К. Предполагается, что интегральны хара,./ор предельной концентрации радиксов, гтг лсгически не коррелирующий с количеством фотохимически активных .роматических остатков белка, обеспечивается раз-

образ/.ом радикалов - тушителей синглетного возбуждения таких остатков.

"ПЙййНйСКаа значимость. Экспериментальные данные и механизмы ф.:тпроцэссоз. предложенные ь рзбе-г, являются теоретическим фундаментом для объяснения механизма действия свста на биологические системы.

По материалам диссертации с-пуб-их.-;ь-\чо 28 работ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на ¡Всесоюзном с'-чпозиуме "Проблемы биофо: -химии" (МГУ, Москва, 1970); конференции "Биология и научно- эхяический прогресс" (Пущино, 1971); Международном симпозиуме "Ис-лодование свободно-радикальных состояний в связи с их ролью в рогул^ции биологических процессов" 'Пущино, 1971); IV Международном биоф'*зическом конгрессе (Москва, 1972); I Всесоюзном симпозиуме "Окислительно-восстановительные реакции свободных радикалов (Кип, 1976); I сесоюзно: биофизическом ^ъезде (Москва, 1982); II и VII Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резон-нс в биологии и медицине*• (Черноголовка, 1981, 1089), а также научных семинарах Ян ст.. гута биологической физики и Института химической физики.

Основные положения. выност..,1ые на заиит.у.

1. Спектры ЭПР триплетаoí с состояния металлопорфиринов и дикати-онов порфиринов позволяют заключить, что для них играет роль искажение плоскости молекулы из-зз эффекта Яна-Геллера.

2. В растворах хлорофилла с хиненами происходит фотоиндуцир ванный Перенос электрона от хлорофиллз на хинон с сбрззог :нием катион-рад. гкалов хлорофилла и аниоп-радикалов хинона. Стационарные коцентрации радикалов хлорофилла и хино..а в жидких раствг_;ак могут различаться из-за влияния на них различных ф^.сторов.

3. При возбуждении триптофана и его аналогов в высокое триплетное состояние может появиться новый канал дезактивации возбуждения, связанный с взаимодействием высоковозбужденного тр^плетного состояния индольного колы, i карбонильными rpyrn.-iMii. К: етичеекга характеристики такого канала дезактивации хорошо описываются моделью промежутс того состояния, которое заселяется из высоковозбужденного триплетног' состояния индольного кольца, а при дезактивации переводит индольноа кольцо в основное состояние. Свойства этого состояния позволяют определить его как "триплетный эксиплекс".

4. Три! ¡летное состояние триптофана при его высоких концентрациях в растворе может тушитьс.1 за счет переноса энергии с заселением высоковозбужденногс триплетного состояния Последующие ; роцеты дезак~иьации аналогичны процессам при прямом засолении высоких триплетных уровней зне>рггт с помощью двух источяикоь с. jro.

Аналогичные процесы переноса энергии триплотпогг восбувдния и дезакгива-ии происходят в беках.

5. Сравнение данных шпк температурной слтической спектроскопии, тушения фосфоресценции и данных, получении:. методом Г.ЛР, для облученных УФ светом растворов арсматаческ ас аминокислот при 77К, содержащих другие амоток' глоты в высокий концентрации позволяет зг-лючит', что ранее; принятый механизм процессов не- объясняет весь набор данных. Нельзя исключить, что наряду с фотоионизацией ароматический аминокислота может происходить, например, перено^ лнерпш высоких триплетных уровней энергии триптофан? на карбонильные группы соседних молекул с последующей их диссоциацией на радкалы. у

6. предельная концентрация УС индуцированных радикалов в белках может устанавливаться за счет индуктивно-резонансного перслоса энергии с синглетно-возбужденных ароматических остатков на образо-авшиеся радикал" белка. Интегральный хапактер предельной концентрации >ад.лалов обеспечивается разнообразием рада„салов-тушггелей. ■

СОДЕРЖАНИЕ ?АБОТН

Г.' -.вз "г. Лггор-турный збзор.

Г. главе приводятся литрпатурные ДспШ"е о фочофизже и фотохимии порфиринов и хлорофилла, а т<<кже о фотофизических свойствах ■зро л-ических -ат окис-от. Представлены краткие сведения об 01 бонн ;тях спектров Э^Т беспорядочно ориентированны)' триплетно-возбужденных молекул.: .Обсуждаотс I основные <лботы, посвященнъи .Денису энергии т бел.г. Икэет^л обзор экспериментальны, данных о фотохимических реакциях арг:атуческих аминокислот.

■')

Глава II. Методика и техник, эксперимента.

Описаны т,_личныо методики приготовления оС;>аг1юв. Приводятся краткие. сведе 1-я ой использованной технике для лшинесцентнюс жч«срг>нка*..«шулъснов' спэкфсслсг.апи,' о спектрометрах ЭПР. Автором Зыли созданы автомз~излроРчн.чь:с ЭПР-сязктрометр, спектрофотометр на Сззо "ЗрессгсГ, фосфориметр, позволившие сущзстх.одно повысить дг-товорностп- и воспроизводимость кспериментов, их информативность. Сообщается о возможностях этих прис.-ров, программном обеегючэнг- для регистрации и обработки данных.

- 9 -

о '

Часть I. Исследование триплетного со. :ояния порфиринов и ароматических аминокислот.

^лавэ III. И; "ледсвзние нижнего тр/плетного состояния порфири-нов и ароматических зу.шокислот.

Трип, тноо возбуждт'ное. состояние молекул зксгоримеь ■•ально можпо изучать по изду- .?пйо из otoi .. состояния (фосфоресцепгии) и с ломоиъю метода ЭП?. тоскольку • это состоя1.,,э является па. змаг-нитньм. При регистрации ЭПР триплетного состояния обычно наблюдает спектр для переход-.в с-дт +2 (сингдетна.. линия области шлей 1500 гс). В некоторые w :аях удается регистрировать значительно более информативный ■ •■пзктр для переходов с ¿~=ti, однако его регистрация затруднен i из-за высокой анизотро.ли (ширина спектра превышае- 1000 гс) и изкого отношения сигнэл/шум, поэточу такие спек'.ри можно налога) регистрировать, как праь/лс, то.льг"> при исполъ'^в .нии техники, синхронного накопления.

В ]. Jotg подучены спектры ЭПР для шрехс,;св с дга=±1 трипле ио-возбуждешшх металле симплексов порфиринов: Mg-эп. по})фирина, Mg-мозопорфипина и гп-'сгиопорфирина, а также спектры дикатионов и оснований этио-. учзо-, гемато- и протопорфирин... Измерения проводились при 77R и ЗСОК для твердых растворов хаотически ориентированных'моле су .. Зсо спектры имели ч. .таре г тонических линии в области знз1 :*ний магнитного шля от 2800 да 3800 гс. С помощью метода ьагнт-офотоселегапш зти каноническы линии отнесены к молекуляглым осям порфпинов и вычислены параметры расщепления триплетного уровня в нулевом магнитном поле D и I. Параметр В рзвен 0.03Л см-1, 0.033 см"1 и 0.048 см"1 (iO.OOI см-1) для металлокомплсссов, дик.тионов и оснований порфиринов, сиотвотствешю. Точнее значения параметра Е из наших спектров подучить не удалось, по .сольку соответствующие каноничеасие линии Н и Н сливались г. одну линию К . Прт ерзпнепии кан.- тичегких лини4 и душ дикатионов и металлокомплексов обнаружилось, что

ЯУ ^

ширина этих линий дая дикатионов заметно больше, че,.. для металлокомплексов. При измерении спектров Mg-г-иоларфирина в полимерной матрице эбнаруж^-'о, что повышение"темп, ратуры от 77К до 300К приводит к уменьшению ширины линий Н в три раза. Пр^д-

полагается, что это связано с эффек/ом Лна-Те-лера.

Как следует из оптических данн: -х, дикатчоны и металлокомплексы порфиринов иыеит симметрию ic-электро иного облака D4h> этого факта естественно было предположить, что и тензор /чши-спинового взаимодействия обл~мет такой же симметрией, другими словами, м^жно было предположить, что для них Е=0, D/0. Однако у-известной теоремы Яна-Теллера следует, что орбитальное вырождение симметричных нелинейных молекул снимается небольшими их искажениями, „результате чего возникает более устойчивая^ кок.эрмац..д. Если принять во внешние этот эффект для плоской г-злектрс ной систеи. порфкрина, то Ян-Т.,ллеровское иекзгэнио должно оказывать заме\ноо влияние на параметр I, связанный с осями в плоскости молекулы, что касается параметра В, то его изменение дол не быть не значите лоным или ьовсе отсутстпвать. Именно такол эффект мы и наблюдали, поэтому можно- утветдать, что для дикзтионив и кеталлокомплексов перфиршюв необходима "читы-вачь эффект Яна-1вллеря.

Результаты наших изме^ний спектр лв ЭПР триплетно-возбужденных ароматичос; ix аминоклелот по.достьк согласуй гея с имеющимися данными (J.Zuclic'n, 1970).

Глав" IV. Исследование фотсфизических процессов в триптофане и ого аналогах с участием вдеоков^збуждемых тркплетных. состояний.

При исследовании влияния спектрального состава возбуждающего света н люминесценцию триптофана при /7К обнаружилось, что кг jh-тсвый выход фосфоресценции за—лсит г наличия видимого света в пучке возбуи' аюцзго свата. После более твате 'ьного исследования выяснилось, чт фосфоресценция, индуцированная монохроматическим сватом (280 нм- обэатимо уменьшается, если образец дополнительно облучаететсьетсм видя диапазона длин волн, рис.1. Изменений флуоресценции при этом мы обнаружили.

Был изморен ешкгр действия обнаруженного эффекта светового тушения фосфоресценции. В качестве характер'/-тики т^иония исполь-

Щ

- tu*.

ß =

стаи

(1)

где I-интенсивность стэвдояарной фосфоресценции при монохроматическом (250 нм) пзбуздэнии, 1'-интенсивность стационарной фосфоресценции при действии света от двух источников света. Оказалось, что спектр действия совпадает с доинноволногой полосой спектра триплет-триплетного поглощения триптофана в области длин волн 400-^00 нм с максимумом при 450 нм. Эт> позволило предгсложить, что наблюдаемое уменьшение фосфоресценции триптофана под действием видимого света связано с переходом молекулы в высо:.овозбу>еден-ное триплотное состояние . ■ "

30 100 150 200 с

Рис.1. Изменение интенсивности фосфоресценции триптофана (2-Ю~1 М> в стекле этиленгликоль/во ^з при 77К при включении V выключении света с Л=280 нм (1_> и \Н00 нм (1_).

О X

При изучении затухания фосфоресценции образца, облучаемого д полосе Т-Т поглощения, выяснилось, что затухание фосфоресценции ц этих условиях происх шгг быстрее, чем в темноте, причем коьстэнтэ скорости затухания, окззалас; пропорциональной интенсипсст^ видимого света. При сравнегчи закономерностей уменьшения изгюн-сивности фосфоресценции и увеличения константы скорости ео затухания в зависимости с~ интенсивности вялимого света.

обнаружилась их полна* корреляция. Этгт результат позволил нам заключить, что за эффект обратимого светового тушения фосфоресценции ответственны процессы, приводящие к уменьшению времени жизни триплеп. го фосфореицентного состияния.

Все зга .результат: указывают на то, что ойг/ченив в области полосы Т-Т. поглощения приводит к появлению дополнительного канала дезактивации трил^етного состслния молекулы через высоковоз-СужденЕое. трлплетное состояние. М ;кно было предположить, что э~м каналом дезактивации является фотоионизация триптофана. Однако, , нам не уд" яось обнаружить спектра ЭПР каких-либо радикапв даже после длительного обручения 'образца (=<60 мин). Фотоионизацию триптофана с появление:: соответствующего спектра ЭПР можно было наблюдать то. ько в случае, если коротковолновая граница второго источника света била в области А43'3 нм.

Суммируя результаты экспериментов по регистрации эффекта светового ту зния фосфоресценции триптофана можно утверждать следующее: :

- спектр де ствия эффекта в области \.>3?0 нм совпадает с полосой триплет -котлет аогг поглощения;

- эффект полностью обрати«;

- е дьина зф'окта рз тот с ростом интенсивности видамс.-о света, .тричем это сзязаяо с уменьшением времени жизни фосфоресценциг;

- при с сетевом тушении фосфорес денции -штенсивность .^луоресцен-циу образца остается неизменной.

При аьалиэе литературы мы обнаружили, что подсевши эффект светового тушения фосфоресценции набж, ,злся ранее чВ.Н.Скворцг.з, М.В.Алфимов, 1982) для нафталина и др'"-их ароматических молекул в присутствии различных соединений, имеющих свойства акцепторов элэ¡страна, однако цельного механизма наблюдаемого явления этими авторами предложено не было. Предполагая, "что явление светового туаекх.я фосфоресценции может играть важную роль в фотофизике бшка, мы попытались выясш ь механизм зтога явления для триптофана- и его аналогов. Экспериментальные данные, представленкь'.е в эт..а разделе, достаточно четко указывают ка необходимость анализа цу: 2 дезактивации тркплетво-возбужденкоХ молекулы через высокое гр-плотное ¿остпяниа <Т ■). Результата такого анализа представлены

Б сэстветств'.сл с известкой схемой . Яблонского молекула может

перейти в высоковозбуждонное триплетное состояние из гопгого триплатног^ сос оян^я Т1 в результата пох-лощения квантов света, возбуждающих переходы Т2«— Т1. При этом, в принципе, происходит уменьшение заселенности состояния Т, однако из-за высокой скорости обратного процесса Т2......•>Т1, это уменьшение, . ри использовании

обь :ных источни..эв света, не может превышать 0.01«, тс.дз кзк в обсуждаемом эффекте наблюдалось уменьшение фосфоресценции до 502. Отсюда ясно, чтс. для объяснения эффекта светового тушения Лосфо-рзсценами необходимо привлекать более сложные модели фотофизических процессов.

При построении таких моде-ей необходимо обеспечить возможность дезактивации состояния Т , по механизму, котооый эффектов: )

конкурирует с внутренней конр^рсией I....... имеющей константу

скорости к «1012 с-1. Для то~о, чтобы этот механизм к_як рировал

с процессом Тг.......►Т1,. константа скорости его первого ^кга должна

быть сравнимой с константной скорости К^. Естественно предполс-жить,' что в первом акте обсуждаемого механизма мгтек-*ла хромофора из высокгвозбужденного триплетного состояния Т2 должнп перейти ч энергетически более низкое состояние, по-видимому, той же мульти-плетности. В самом деле, если это состояние энергетически более выгодно, то обратным переходом в о последующей дезактивацией

по обычнот-у механизму (Т .....—>50) можно пренебречь. Одинаковая

мультиплетность предполагаемого промежуточного . состояния и состояния Т2 должна обеспечить высокую, конкурентную с к^, константу скорости этого перехода. Не -точняя пока природу промежуточного состояния, рассмотрим по еле,-,по!ДИЗ ' озможчые пути его дезактивации. В дальнейшем, дуд краткости, это пргуэжуточное состояние мы будем обозначать X. 1лшм образом, рассмотренный первый акт можно представить в вида'

хг "" х

Слгтуюшим, существенным для дальне ^аго, является предположению об участии промер-точного состояния X в балансо всех возможных энергетических состояний хромофопа:

[Б МБ З+'^Ы^ЫХГ» п где п-концентрация триптофана в образце. Фактически это 1.год..эло-жение означает, что убыль фосфоресцирующих молекул при облучении в облает' Т-Т поглощения -"вязана с переходом этих молекул в

нефосфоресдаитное состояние X, имеющее конечное время ж..зни 1х и поэтому можно говорить, например, о с.зционарной концентрации таких нефосфорасцирующиг возбужденных молекул. Существенно, что км долнгчл иметь возможность говорить о заселении и дезактивации X как об отдельных процессах. Это очевидно, если состояние X является, например, комплексом с переносом заряда или эксиилексом. ,1а самом дчле. знание всей последовательности процессов в рамках промежуточного состояния X не потребуется, важно только, ччобы была обеспечена обратимость суммарного процесса. При зт^м, Б каздпй из моделей обратимость обеспечивается собственным путем выхода Ко состояния X. который и определяет тип модели, а также ерэднае время жизни состояния X (т^) в конкретной модели. Далее, в заг'.симости от осно-ного пути выхода из состояния х рассмотрим три модели:

- Модель I. Из состояние X хромофор возвращается ~ синглетное возбужденное состояние :

3Х*.........-»ХКз??--51

- Модаь 2. УЬ состояния X хромофор переходит в нижнее трип-летное фосфоресцентное состояние Т1.

.- Модель 3. Из состояния X хромофор переходит в основное сктг-лвтное состояние &0:

Зх*.........

Для каждой из указанных коделей можно составоть систему дифференциальных уравнений для концентраций всех возбужденных состояний. Решая эта системы можно, в частности, получить выражения для стационарных концонтраций молекул в триплет :ом фосфоресцектном состоянии:

; 1Т Л" п .

1 ст4ц п 1/г .4 г I + Ф с I (г + (И )/Ф е I ]

г г э э ттт x 4 т' т3 в

п

--

1 1+ ф е I 1 Ф е I

т Т 38 XXII

---:-----:-

Здесь 1^=1/'кт- время жизни никнего тр'-'тлетного состояни.. Т ;

¿ля мидел л I и 3 и дя" модели 2; ен> 1д. е^,

Тт - коэффициенты экстинкшш и интенсивности возбуждающего света в области персс-щов 5г<— и — Т1, соответственно; Фт=',<зт/ 5 квантовый выход триплет ного состояния;

фх=ктх/<!стх+кта)_ квант0БЫЙ выход состояния X.

Для дальнейшего анализа этих трех моделей получим выраженпя, удобные для оценки влияния иг -енсивностей возбуждающего с_зта I и I на эффективность светового ту-г'ия фосфоресценции:

гт 1 — гт ~ _ _1 стац ~ 1 ^тац

т - —--(■=>)

[Т Г

1 стаи

где [Т^ Зстац - стационарна.; концентрации триплс .иого фосфорес-центного состояния в условиях- облучения одним ксточгчком света, (кет тушителя); ГТ11'тац - стационарная концентрация триплетного фосфоресцентного состояния в условиях облучения двумя источниками света (есть тушитель). Подставлп сюда выражения ГТ1для каждой из моделей можно получить:

Т1 - -тт^^

ТхФтед18 ; тг = Ух6!1! 1 + 1„Ф„е„!..

1183 1 + 1хФтед13 Т3 = УхУт 1 + а_Ф1

Г 1,;8 8 '.

Анализируя по "ученные выражения можно видеть, что величина 7 для всех трех моделей .-члжна липег "О зависеть от интенсивности Г^, что и наблюдалось в наших экспериментах.

Зависимость от интенсивности света 1д величин 7 , 72 и 73 для каждой из моделей имеют свои хар^.торн'-'э особенности. Для моделей 1 и ^ функция 7(13) может иметь как нарастающий, так и спадаюоий характер в зависимости ит соотношения между временами жизни 1 и а , причем при уменьшении 1д функция • ( стремятся к , Ф тогда как функши 73. должна стремиться к. "оньйвуу

значении (1-Ф )а Ф 8 I . П модели 2 - тг<1д) долша у1..жь...аться до нуля при уменьшении интенсивности света 1д.

Для проверки предложеннг"- моделей были проведаны экспэрлмопты,

в каждом из которых измер-лг - практически весь набор кинетических характеристик при установлении стационарны., котптраций три-лет-кого фосфоресдантного состояния гос. ■ з включения или выключения любой комбинации затворов дг'-'х источников света. Рис Л иллюстрирует типичную процедуру измерений. В представленном "а рисунке эксперименте измерено „зсть кинетических кривых. Вись этот набор крив' 'х мы могли обрабатывать с использованием метода наименьших КБзттратоБ, уштропретируя каждую из'них одной.или двумя экспонентами. Из набора кривых, подученных в одном эксперименте, можнс было вычислить, в частности,.характеристику эффективности светового т., дакия фосфоресценции 7.

т/фхеЛ (с)

3

7

б -

'- -;-1-L--.-1-1-> ФеГ

Т 3 S

0.005- U.010 ' с0.015 с 1

Ри^.,2. 3dbv имость эффект тчости се тового тушения фосфоресг-нции. (7) от интенсивности возбуждающего света . I для раствора триптофана (2.5-Ю-4 М) в <-текль этилекгликоль/вода прл 77К. •

Па рис.2 прод^.аалены результаты измерения зависимости 7(1«,). для трутггофана. По оси абсцисс откладывалось значение "отг-рое уы мсгли '■■'. используя кривые I и 6 (рис.1).

Потру сю показать, что показатель экспоненты кривой 1 кС1)= k^C cs-s» з. кривой б покэзате'V экспоненты соответствует кгнст'нто скорости затухания фосфоресценции к, (ксб)~к„). Таким Ф е I = ki1)-kt6>, По оси оодинат откладывалось знэче-

X w> О • *

ню >'(k:3)-kt6,>.' Смысл -разно *ти k!3)-kt6) £\ ?т - 'сужден ниже.

о

Сейчас для на^ существенно только, то что эта разность не зависела от интенсивности света I . \в обсуждаемой серии экспериментов к(3)-ксб>=0.046 ±0.002

Сравнивая данные, представленные на рис.2, ~ теоретическими .кривыми, можно -включить, что экспериу-нтальная зависимг-.ть 7(13> полностью исключает модель 2, в которой хромофор после возбуждения в высокое -лэиплетное состояние и перехода в ромежуточное состояв: ■ х снова воз~ аащается в нижнее триплетное состояние. Этот вывод подтверждается и данным.. характере затухания фосфоре гцекции в .условиях, когда свет с Л=280 нм ьоключен, а облучониэ образца в области Т-Т поглощения продолжается (кривая 3 рис.1). В соответствии с мс„зльп 2 эта кривая дилкна ииоть вид суммы двух огсспоконт:

[Т1]=А1ехр(-КЕг)+Агехр{-(кхт-н5хеу1т>1>.

где А1 и А2 могут быть выражены через ГТ .

В связи с этим заметал, что кон.ганта скоростг к'0' для коивой 3 во все: нзиих измерениях была вьппв констэнты скорос" : текновог° затухания фосфоресценции к(б,=к„. В рамках модели 2 втерое слагаемое в представленном выражении для кривой 3 могло бы объяаг.ггь качальдую часть наблюдаемой кинетической кривой, если только "Л8!1, "т* но даж5 в зтом с-луча0 Д0-®®3 легко обнаруживаться более долгоиивущая компонента с константой скор^тги к . Ни в одном из наших ¡г-спериментов такой компоненты >:е обнаруживалось. Таким образом, модель 2 мо«но исключить.

Прежде, чем продолжить обсуждение тмысла рез'-тьтатов, представленных и^ рис.2, заметам, что кинетичес ое поведение затухания и возгорания фосфоресцё.»1®и для обоих оставшихся моделей одинаково. Существенно, что :бе эта модели для кривой 3 в эксперименте на рис.2 могут быть описаны зкспонептоЯ с ког таите й сг-рогти к[3|=к е 1„. Таким.образо", в моделях I и 3 разность

констант скорости к(3)->"'0) давала значение Ф е I =к£3)-к'б).

Обратив внимание, на диапазон значений величины Ф е I , мс ¡о замот-тгь, что в наших —ссгаримонтах выполнялось • "словно поэтому соотв' -ствугацие теоретические, вырз;к. ли;. для моделей I и 3 мог.ут быть представлены линейными за' :скмостя.ми:

т /Ф е I « ч +т 'I - )Ф Е т Г3 X Т Т Т Г X 1' I I Б

Из представленных формул' следит, что значение 7/фхе„Дт Щ™

»0 должно принимать гначзние С. 75 с для триптофана) в

ог'чае моде.та 3 или т: (1-Ф ) для модели I. Из шс.2 видно, что

измеренная величин.- Т/Фхет1т хорошо согласуется с моделью 3

(" /Ф а I «V с), тогда как а модели I следовало ожидать значена.I

3 X Т 5 " • этого параметра от 5.4 с (если Ф^,=0.2) до 4 с (для Ф,,-0.4).

Еще более существенный аргумент против модели I связан с

отстутствием. изменения флуоресценция в условиях светового тугчния'

фос^тесцьпиии. Воспользовавшись для характеристики тушения фос-

форесц8нц>.и " увеличения флуоресценции параметрами и

соответственно, которые определяли®: в соответс~вии с выражением

(1), в котором I- интег'.явность фосфоресценции и та флуоресценции,

соответственно, к- по-дучили выражение:

5 /0 = _ _- к ---\<®теч1ч>1

Велич:.ша в модели I, ю-видалому, не может быть больше, чем время «яги;, синглеткого выведенного ".остояния; а-10~9 с. Если пренебречь 1: , то выражение в скобках для триптофана равно 0.65, и ее у. считать.--Ф =".4, ""¡гда -- -0.4. Здесь знак отражает р.-. ~Еь;е ■ 1зки ожидаемого /.¿кзнония фосфоресценции и ф.г/ороецзнции при облучении б области Т-Т перехоДо.ТакиУо, образом, если бм . зетоьоо "уконие Босфор-'данюш ;.роисходало за счет у^ха1...зма, в котором дезактивация высоковс-буждекного триплетного состояния Т£ ссуда сл.. .яотся через возбуждение - 'синглетное стояние 3 ,''. то долкзо было наблюдаться однов^ ллэнно^ увеличение флуоресценции, состзздяыее от уменьшения фосфоресценции Поскольку такого явления мы ко „зблюдали, можно сделать вывод, что модель 1 не хежет считаться удовлетворительней. '

Тагам .бразом, осяоь^ой путь дезактивации высоковозбужденного тспг-летного состояния ? описывается котяьад 3, в кетовой лооме-

с. "

жу-ечкее состояние х релаксируст дс состояния, из которого может перейти толь:» в осповноо состояние ипдоль:. )го хг хоФора 5 ' с ко к гтзнтой с::г.гссти . Анализ экспериментальных данных, позво-сшгиггь значение -г =1 /Тс Сказалось, что -ля г -створа тсипто-пи 77К з скоси эти-энгликсл1 глдз 7 с £ 1 с 13 с.

- <о -

Этот, на первый взгляд неожиданный результат, можно объяснить, если предположи~ь, например', что пргчежуч^чвое состояние X после первого акта Т^—»wx* релаксирует до нижнего триплетного состояния Зх, энергия которого ниже энергии фо'¿оресцэнтнпго уровня Т1, а время жизни Ллизко или несколько больше г^емени жизни Т1. При этом приход тся предположить, что чонстанта скорос- : излуча-тельного перехода Зх—>S0 значительно меньше соответствующей константы скорог-и перехода Т,—*SQ. Если эта конст гтта не очень мала, т в последующих экспериментах можно надеяться обнаружить соответствующую фосфоресценцию, смзыутую в красную область по cj. jbhshhk) с известной фосфоресценцией триптофана.

Q природе промежуточного состояния. .

.. Фотофизические свойства i ^иптофана определяются его индольным кольцом. Если предположит^, •сто эффект светового тупк .гиг фосфоресценции связан только с индольным фрагментом молекулы, то обсуждаемый эффект должен был бы наблюдаться и для индола в тех же экспериментальных условиях, то.'для триптофан?. Однако, в растоораг индола нам не удалось обнаружить эффект. Такмм образом, эффект обратимого светового тушения фосфоресценции связан с наличием у триптофана боковой группы в С3-положении индольиого. кольца.

Для производных индола с другими заместителями в том нгэ положении: индолил-3-пропионовой кислоты :(-СН -СН2~С00Н) и индолил^З-масляной кислоты <-СН2-СН2-СН2-ССОН> световое тушониг фосфоресценции также н^б^далось, (таблиц? 1).: Этот результат указывает на существенную роль группы -COOP в прссхояитении наблюдаемого эффект. . Небольшие разлг"ия з эффектавнгтп* светового тушения фосфоресценции щ. триптофан;, и дая С3-,ооизводных индслз могут быть связаны со следующими причинами:

- наличием у триптофана группы -NH2>,

- различием расстояни" от групгш-. -ССЧ до индольного кольца.

Мы допытались выяснить роль ионизируемых боковых групп триптофана (-СООН « -СОО~+Н+ / и «=» -îiH*).'■■'С этой целью была измерена зависимость эффекта светового .ушения фосфорьоцеп: ги трипг-фа^а от рН раствора. Mc-'io было ожидать изменений зф'г<тз в областях рН, соответствуют i рК ионизации указанных тут <рК 2.8 для -СООН и рХ 9.л для -NH ). Оказалось, что . :о параметры, характери-'шцио эффективное светового тушения. f -»сфоросшшда*

так же как время шгчу фосфоресценции, не зависят от рН в диапазоне значений рН от I до 10.4. В с.-льно -елочной сргте, при рН>10.4 заметно уменьшалось врмя жи~чи фосфоресценции и увеличивалась эффективность светового тушения фосфоресценции. Эти изменения связаны, вероятно, с диссоциацией протог"> группы -Ш яндолького кольца, а также с образованием элх^голятов раство-рг^ля. Наш« резутьтаты позволяют заключить, что ионизируемы группы практически не влияют на эффект светового тушения фосфоресценции триптофана и указывают* на существенную роль в Э1 м эффекте фрагмент л С=0 карбоксильной группы.

Таблицг. I. Время яа^ни фосфоресценции (а ) и параметры (б, 7, Фх>, характеризузидое еввтовиз тушения фосфоресценции триптофана I' его производных при 77 К.

Образец :; \ <С> б , 7 Ф 8 I ТГ" (с-1) 'с)

Триптофан 6.75 0.19 0.24 С.036 7.5

+Гли <5 1 ~3 М)* 5.Г) С.5С 1.0 0.150 7

+Гли '5 10-г М)1 6.2 0.48 0.92 0.1^8 7

+/ Тзтон (5 1и"3">* 5.5 0.64 1.80 0.293 6

/ли-Тр.. ■ /5.4 0.45 0.87 0.12° 7

Ивдг -ал-3-пвош-новая 1.,;слота 6.30 о. к 0.17 0 0.027 6

Кндоли1-3-масля-ная кислота 6.25 ОИЗ 0.22 0.134 7.

Й1Д0Л ** 6.8 <0.01. <0.01 - -

Рйстесг«: гель. ог:1ленгллкс>яь-&ода. СЮ вода, С *>0 этанол.

Концентрация исследуешь соединении - 2.М.

<{н .сисиомссть света " яПя осах - опытов была одинакова.

Этот вы&од г.одгвзрждается и нашими измерениями фосфоресценции ииола в уот^лоле и зтаколе в присутствии ацетона или уксусной га». югы. Введение в раствор индола этих соединение, содерка:цих к .бок;:лы-,о группу С=0, приводило к появления, эффекта светового ту¿ешкя 'оефоресцекции индол , пр"чем окзза.,...сь, .то зависимость

эффегстивности тушения б от концентоации ацетона или уксусной кислоты вполне удовлетворительно ошсьгвг :тся законом Перрона. Радиусы "черных сфер", соответствующие квантовому выходу тушения, равному единице, слученные из таких -данных.' равны 4.7 X, т.е. срг^кимы с ваг-дер-заальсозым радиусам индола. Это позволяет предполагать, что за эффект светового тушения фосфоресценции ответственно короткодействующее взаимодействии тага обменного, т.е. фа- ~ичоски можно '-творит*, об образовании комплекса кпдоль-ного кольца, возбужденного в бь згзе триплзтное состояние с -карбонильной группой добавки. По-видимому, ,ля такого комплекса уместен термин "триплетный оксиплекс".

Дополнительным подгверждс теем такой ш ерпретс да могут служить опыты с водными рас .".орэмл триптофана с глицином или ацетоном, -таблица I. В водном растворе триптофана, замороженном до 77К,'фосфоресценция триптофана не регистрировалась из-за образования агрегатов триптофана. Если же. в-.'раствора присутс-повьл глицлн в концентрациях от 5'Ю-3 до 10"1 М, возгорались фосфоресценция образца и можно было наб—одать ее эффективное световс .• тушение, которое практически не зависело о: .концентрации глиуна, что может быть связано с фиксированной стехиома зиай комплекса тришвтно-возбужденного индольного кольца с С=0 грушами глицина. Интересно, что в этих опытах величина эффекта ^ыла заметно больше, чем для раствора триптофана в водно-спи^/овой матрице. Это может служить 'осг :в. :ием для предположеТ. :я, чт~ в водном растворе карбонильные группы глицина расположены геометрически болов благоприятно для образования эксишюксов. Приме .ательно, что наибольший эффект. ср~тового туигтия фосфорасданци».'мы наблюдали для водного раствора триптофана с ацетоном. По-в'ддимому, карбонильные группы -электрически нейтральной молекулы ацетояз способны более эффективно взаимо, .зйстповать с индольным кольцом триптофана. '

Интересные'для поним гая фотофизики белков результаты получены в опытах с дипеггг'яом, содержащим триптс*шт: Гли-Т'ри. Гтактог-:,гй быхр ^ т^иплетного состояния тлипгофанрвого остатка в этом пептидо практически совпадает с ?оотвэтствующим квантовым вы: 'ж. дяя • молекул триптофэнз, однако эффективность световогг т.,^яия фосфо-росценци" почти в три раза чем для триптофана (табл; ;а 1).

Этот 'дапаптвд содержит две С=0 группы,: одна из них фрагмент

карбоксильной группы триптофанила, • д- .тая - фрагмент пептидной связи. Сравнение результатов дяя, пептида Гли-Трп и для других образцов позволяет заключить, что С=0 группа пептидной связи взаимодействуйс индольным кольцом сильнее, чем фрагмент С=0 карбоксильн^л групп-, тригтгофанового остатка пептида. Такая возможность может быть обеспечена сближении карбонильной rpyn^ • пептвдной связи за счет врэщени,. боковой группы тригггофана вокруг лязи Сл других одинарных с: :зей пептида. Возможность та: )й ориентации пегг-едной связи подтверждается, например, данными-рабг- Дил.* на (J.Dillon, 1980,1931,, в которых показано, что при анаэробном фотолизе пгттидов с. трипгофановы:: остатком на С-конце после дэзамиилрования пептид;, происходит циклизация пептида в положение С4 индола. Возможность вращения вокруг С-С связей, приводящая к pySr-iy разных конфор„.зров (рота, .еров) триптофана и ого произво, дых в растворе, широко обсуждалпсь, кроме того, для объяснения не экспоненциального затухания их флуоресценции. !'одель рот моров, по-Б^^имому, необходимо учитывать и для светового тушения фосфоресценции тпигггофана и его производных, В связи с этим следуе^ заметить, что прак плеск- для всех образцов, указан. ных в таблице I, лы наблюдали, по-меньшей мере, д. з компоненты ззту- ак»ш фосц jpecnem^oi в условиях, когда сват, во-^'уждающий пеьохолы St«— выклк>1- н, но образец продолжает облучаться у области полосы Т-Т поглощения. L частно'ти. для дипелгыда Гли-Трп на благ лись компоненты затухания " си с. ,

Таким образом, результаты, полученные в нашей рабиге, позволяют прртполсжить, что за ооратимое световое тушолко ■ фосфор,-д-:энши триптофана и его аналогов отггтстзенны н&фосфоресцентные оксиллексы инвольного кольца с карбонильной группой, сближо"ной с. ним на расстоятг"1 порядка 4-5 . .

ЭКект обратимого светового тусения фосфоресценции наблюдался так»»', для белков. причс величина эффекта■ сильно различалась для разных белков. Эти ■ разлит..'i связаны, очевидно, с особенностями стру5:туры белков вб.тизи фосфоресцир.тещого триптофанового остатка.

лова V. Поронсс энергии тряоютного возбуждения в растворах

¡рсузг.г-.^ских аминокислот и белков при 77К.

Учат® тюспетяого «,э;тоявхя° ' згсматкческих аминокислот, х.

- 2w -

частности, триптофана в'фотохимических реакциях в твердых матрицах в нзс~аящс: в^мя не вызывает сомнений. Хорошо известно, также, что и в белках при низкой температуре первичные фотохимические реакции протекают через промежуточное гриплетиог состояние ароматических аминокислотных остатков. Однакс фотсфизические свс ства трипле, лого состояния аромат», ¡еских аминокислс. изучены еще недостаточно. В частности, нет ясного шг1"мания особенностей взаимодействия ~ ришатно-возбу"«яенных молекул тршге'^ана г~и его высокой концентрации, сравнимой с локальными концентрациями тргаггофановых остатков в белках, т.е. тякими. при которых расстояние между соседними хромофорами но превышает размеров белковой глобулы (10-30

В данной работе б" ли изучено концентрационное тувонио фосфоресценции триптсфзпа при его концентрациях до I :,.. Гри этом были приняты меры, чтобы в растворе не образовывались ассоциэты триптофана, поскольку хорош известно, что дилеры, например, акцептируя энергию возбужденных мономеров, тргтгическ« по люминееццруют. В работе в качестве растворителя г-пользовали смесь воды с зтиленгликолем, подкисленную с помощью НС1 до рН 0.8. Растворы помещали на кварцевую подложку с рабочей площадью 4x6 мм2, причем объем образца изменяли пропорционально концентра:'чи триптофана так, что количество молекул f образце при изменении концентрации оставалось постоянным, 70 изменялось среднее расстоян"э между ними.

Обнаружилось, что при неизменном кзэнтс-ом выходе <^туоресцз;г-ции, квантовый выход фосфоресценции образцг возЙ5 дзннг*-о монохроматическим светом с \=2S0 н , уменьшается в диапазоне концентраций триптофана -3~1 M - I >!. С -уменмшием квантового выхода фосфоресценции хорош корр лировало уменьшение времени жизни фосфоресценции. При увеличении интенсивности возбуждающего уГ ср„тэ т.ушопио фосфс _ есценции нагч дается при более низких концентрациях, Эти результаты были подтверждены и при измерениях спсктра "ГТР триплетпо-возбувдзнных молекул (для переходов с

д!п=1?).

R :ащем случае, как .уже oi заризалось, концентрационного ~упо-ния Флуоресценции тршггоф;...а не наблюдалось до концентрации Г М. Поотому мы можем исклочигь или, по крайней мере, ¡.рвнебрв«ь про- , цосоями, вязанными с образ .шиом нелюмшюсцирук и димеров или

с примесями в образце. Посколг'у г^ниектпационное тушение трип-летных состояний триптофана сопровождалось уменьшением времени затухания фосфоресценции, следует рассмотреть только такие процессы, Которые могут привести к увеличению скорости дезактивации тр^етного состояния. При этом следуе- учитывать, что уже при кое.знтрациях триптофана порядка 1СГ2 М наблюдается деполяризация фдуоребценции, свя1,;нная с межгриптофановой миграцией знер1,да сдаглетного возбуждез !Я <С.В.Конев с сотр. ,1984 и ттр.).

Анализ полученных результатов, привел нас к выводу, г,что наиЗо зе вероятной причиной к нцентраииснного тушения -^лглетных состс,ниЯ предстг~ляется модель ту^ония с учетом перенося эне~тии с констаиГой cKopt ти Х^ г. механизму:

D*<?/ + А*(Т ) ...........♦ D(S.) ч А* (Т ) (3)

11 о г

Рассмо'. ри. подробнее эту модель. Пра этом будем учюыза. ь

возможность дезактивации высоковозбувдс люго триппетного состояния ) по механизму, соответствующему модели 3 в гл зе тц, б 2

котором заселение происходит за рчет переноса энергии.

Мсчно пс-учить - выражение для стационарной концентрации состояния Т . учитывающее ^роцес^ (3):

п Фк (Tv+1/4 е т ) „ ; =----х ч х-М-*- п (4>

1 1+1 'гФеГ (1 +1 /1ФБ1)

' IIS S 1ISS

В экспериментелвгко о к гить кпцентравдю хре эфора п^^, при топой наблюдается "половинное" тушение5. При низких инт-нсив-ностях возбуздзюкега свата Is и с учетом того, ,то тх не может быт*-, заметно больше, чем i„, для 1/£ можно пс.;учить вырг'-енио:.

Видно, чти - увеличение, интенсивности света I должно приводить к -:лонце5траииовкому туиенкю при меньших • концентрациях хромофора, что й наблюд'. ::ось т . наших экспериментах. Концентрация п ; зависит от величины Фх> имевшей смысл квантового ьыходз заселения зкеигпо! ов /индэльвэго хромсч^ра в триплетнем состоянии Т с кзрбс-нильп^ми группами. Пак следует из ..заих ; -кных по измерению сватс ого ту—сния пептида Гли-Трл и бежев, эта величина г.качигелько возрастает, если вблизи кн; .лыг -о хромофора ихекггея кзреонильяке групп.; пептидных связей. Лругими словами, > кно бь,„,о

ожидать, что для белков процессы переноса энергии по механизму рассмотренному вып. гшиы имать вес ма существенную роль.

Засалпнность триплвтко-зозбуждвнных состояни .трштофа*"^тов и

тирозйЗЭй в белках.

Спектр излучения УФ-возбуждеялых белков, содермаих триптофан, об:, ловлея люминесц -щивй его триптофановых остатков к, £зсткч"т. тирозиновьп. Этот факт, обычно связывают.с перекосом энергии между ароматическими остатками белка. Нашей задачей было оценить эффективность такого переноса, воспользовавшись методом ЭПР для регистрации триплетно-возбужденных триптофанилов и тирозилов белка. Этот метод имеет существенное преимущество перед люминесцентными методами, ' связанноес тем, что соответствующие спектры ЭГГ* не перекрывается, тогда как. спектры фосфоресценции тчрезинг и триптофана шрокрывэются почти полностью.

Для количественных оценок эффектив; оста заселониг т^тплэтнохо состояния ттиптофанилов и тирозилов -белка мы использопли ~юг факт, что п^л достаточно большой- интенсивности возбуждающего вета интенсивность сигнала ЭПР их'триплвтного состояния достигает продельного значения, не изменяющегося при дальнейшем упс.т/.-чешии интенс—вности света. Используя в качестве эталон* разбавленные истинные растворы триптофана и тирозина в стекающейся при 77К смеси зода/зтилчнгликоль или вода/глицерин, мы определили предельную заселенность соответствующих . триа-^тных' сост^ший в молекуле белка по формуле: • . ;

п = (С0/10Х1^У где Сч - концентрация тригтгс.зна или ти^зипа в лт„лонном образ-т'е, Сб - концентрация белка в образце, - интенсивность спектра ЭПР триплетного состояния в эталонном образце с предельной "он-изнтр-цией этих состояний, - то же для итгофанилов или тирозилов в белке. Результаты такого определения представлены в таблице» Я.

7з ТЗбЛИЧЫ ВИДНО, го число тирозилов в '.рИПЛСТНОМ состоянии для все: исследованных белков к не, чем число таких остатке . а батае. Это модат свидетельств мть' о высокой эффективности ¡•оса 'анергии с большей части тдаозилов па то хромофоры, котог.ыо давали сгег. ЭПР трэтхлптнпго остояния_ т.о.. на тт. гггсфэпс'иыс

остатки и на часть тирозиновых остат. ов.

Как и следовало ожидать, в сь^ороточння альбумине человека (САЧ), содержащем один триптофановый хромофор, этот хромофор в условиях насыпающей интенсивности возбуждающего ср^та со 100% эффективностью оказьг^тся в триплетном состояние. Примерно, такая ж ситуация . зблюдалась и для сывороточного альбумина быка (САБ). Этот белок содержит два тригтгофа..эвых остатка и, как можно заключить из данных таблицу, оба этих остатка независимо могут нахг -диться в триплет/ом состоянии. Другими словами, миграции энергии межд. этим;, остатками практически к~т.

Таблица 2. Относительная интенсивность сигналов ЭПР триптофана и типсзина в трише-игам состоянии (пф) в водно-глицериновых растворах бе тсг~> при 77К (И-число остатков ^ молекуле бе.~са).

. Белок тр;. N аггофан П1 ' тирозин N

Тр/лтофян 1- 1 Л - -

Тирозин. 1 1.0

САЧ 1 1.0*0.1 18 3.9

С; î г 1,7±0.? 19 2.4

Ничны* альбумин с 1.9*0.1 9 1.4

Трипсин . 4- 1.б±Г.2 10 1.8

Поп. ин Я 2,0*0.4 - .'. - ■

'Глобин 5 2.1 ±0.2 .11 4.0

ДККаз- 5 3.1U.2 2* 4.8,- .

Лизоцин 6 О.Г.О.1 • J w 1.4

а-химотрип' инсген" 8 1.8*0.2 . 4 1.8

При отсутствии миграции энергии между • триптофанилами можно былл сжкд-ть, что в рз. ;ых балках продельная концентрация трил-лг.-пгых состояний будет пропорциональна числу триптофанилов в бол-, ко'".?, молоку ля. Сказалось, однако, что для большинства исследо-взшпл болкоз, в которых число триптсфанилср на молекулу больше до\а, значение п^ остается близким к двум. В ДНКазе значение п. Л,* пят,-: трилтофанилах ка молекулу. Унтересен результат, д:я лкзоцдаа - знс .©пит ^=0,5 при sorv, триптофан/^ах хплокулу. Тг-пте образе«, в белках* существуют процессы, огэзпи-

чиваювде продольную концентрацию тришютно-возбуг ценных состояний триптофанилов и тьрозилов. "стествонно предположить, что такими процессами являются процессы переноса энергии.

Известно, что в белках может происходить перенос энергии синглэтногп возбуждения остатков гаматичоск"х аминокислот по индуктивно-резонансному механизму, который при нейтральных рН осуществляется в "зпиавлении фзнилаланил - тирозил - трипгофанил. Миграция энергии возможна та;..,© и между одинаковыми остатпми ароматических аминокислот. Эффективность переноса энергии в белках в различных донорно-акц-.пгорных парах сильно варьирует. Видимо в молекуле белка можно рчделигь некоторое число зон миграции энергии, каждая из которых объединяет группу ароматических остатков. Энерг..д возбуждения любого члена этой групп мигрирует на "конечный" акцептор, в качестве которого выступает один из трихтгофанилов или тирозидов. Наличие такой сети миграции приводит к тому, что "конечный" акцептор как бы имеет коэффициент молярной экстанкции равный сумм-! коэффициентов для всех членов группы миграцти.

Таким образом, с одной стороны, миграция энергии электронного возбуждения остатков аромат гческих а- чнокиплот в "елке приводит к увеличению вероятности перехода "конечных" акцепторов в ■"•■¡иплетное состояние. С другой стороны, миграция энергии приводит к тому, что сильно снижается вероятность заселения тршиютных состояний промежуточных переносчиков энергии в ■группе миграции. Это пр'/.^оди" к тому, что заселенность триплетных состояний .в растет пропорционально числу триптсфанилов или тирозилов в белковой молекуле.

Другой причиной ограничения заселенности триплетных сос~ швй триптофанилов в белках может быть перенос энергии по механизму (3) с триплотно-возбужт,ениого состояния донора на тако« же состояние акцептора,, как в рассмотренном выше случае кенцзь™ 'ационно-го тушешя триплетно-возбужденных молекул тришофана. Для такого механизма из выражения (4) для иасыщакипос интенсизностей сьота межло получить:

гтАт * п Ф к т: п2

1 <-т X ц X.

Виг'о. что при наличии переноса энергии, т.е. при к стационарная концентрация триплетных состояний может быгь'^о;. ,з;с, чом

ожидаемая п, когда все молекулы горазда засе яктгся в триплэтное сос~оянк1. Учитывая, что значение <®х сильно зависит ст ориентации карбонильных груш' ближайшего 01фужения тригггофанового остатка в белке, г^гистрируемая преде, ьная концентрация триплетъых состояний в разных ьелках с одинаковым количеством триптофанилов .может заметно варьировать, что и наблюдалось в наших опытах. Еще одно подтверждение предлагаемой модели переноса энергии тгчплетного возбуждения с заселением высоковозбужденного триплетного состояния связано с зависш,юсг.ъю времени жизни трипльгного состгчния триптофанилов белков от. интенсивности возбуждающего света. Как и зри концентрационном тупении, зремя жизни, триплетного состояния уменьшалось с ростом интенсивности возбуждающего света.

Часть 2. Фотохимия црфиринов и ароматических аминокислот.

Глава VI. Оотох1...жг хлорофилла и его аналогов.

Дигидро- и тетрагкцропорф5фИ;г! образуют ..ласс хлорзфиллов и бактериохлорофшиов, пигментов зеленьп; растений и фотос^штезирую-щих бактерий. Интерес к ф/гохиши этих соединений обусловлен их ролью в первичных фотореакциях фотосинтеза. К началу выполнения нашей работы многими автор^ли с помощью спектральных и по-"енцио-метрических методов было пока;, зно,, что облучение растворов хлоро-филлов в их длинноволновой полосе поглоцочия может пр-*зости к их фотоонислзнию. Однако ЛрИрОДЗ 0КИСЛ8НН0Й формы хлорофилла но была установлена, а поэтому и механизм фотиокисления был во многом неясен. Главным препятствием для понимания механизма были неудач" в попытках обнаружить спектр ЭПР катион-радикалов хлорофилла в расгп .-pax хлорофилла с хиионами, ; . :алогамк первичного акцептора в фотосинтезе - пластохкнона. Иассй. задачей было' выяснить эти вопросы. Для этого необходимо; б1.'ло сначала получить спектры ЭПР катион-радикалов хлорофилла в любой простой системе, чтобы затем можно было их идентифицировать в более сложных случаях.

Используя в качестве акцептора электрона молекулярный код мы получили катион-радикалы - хлорофилла а, дейтерохлорофилла а и бакгориохлорофиллз в фоторе :щии с кодом. Сигналы ЭП? радикалов в жидких растворах при штатнойтемпературе представляют с.лг-

летные линии гауссовий формы с 2=2.0025 и шириной /*1 =7.9. 3.1 и 12 гс, соответственно.

Из данных о ширине ллнии спектра ЭПР для хлорофилла а и дейте-рохлорофилла а, воспользовавшись теориек Ван Ф~лсз мы оценил.» вклад протонов и атомов" азота . в ширину линии катион-радикалов хлоре 'илла а.

Д"н=7.5 гс. ДН^.88 гс. Л1у=2.47 ГС.

Из полученных данных . .ожно оценить г тотность неспаренного электрона на атомах водорода и ато!.. iX азота в катион-радикале хлорофилла. Считая, что ксстанты сверхтонкого взаимодейч.^ия для ядер водорода и азота равры, получаем, что плотность неспаренного электрода на периметре молекулы (атомы Н) в с* раза больше плотности ..е"паренного электрона на атомах N г цзнтрэ молекулы (дН^/д^ = 3). Но это означгзт, что катион-радикал хлорофилла является х-катион-радикалом, т.е. неспарзнный г лектрон делокалк-зован, в основном, по тс-системе молекулы.

При освещении гласным светом зтанольных растворов хлорофилла о содержащие избыток хинонов или яшросоединений, -кцепторов электрона, при комнатной температуре мы, как и другие авторы, наблюдали спектры ап'тан-радаклшв соотвэ^тгвую'дего акцептора. Спектры ЭПР радикалов большинства использованных акцепторов имеют хорошо выраженную СТО, что позволило легко их идентифицировать. Например, для гс-бенз-хинона наблюдался спектр из шгги компонент с биномиальным распределением интенсивности л константой СТС 2.37 гс и ~=2.0047. Сигнал ЭПР катион-радикалов хлорофилла в этих условиях не обнаруживался.

Сравнение интенсивности фотоиндуцированных спектров ЭПР в растворах хлорофилла с хинонами показало, что стационарная концентрация радикалов увеличивается в ряду: хлоранил, п-бензохинон, дурохинон (тетр^метилхинон), 1.4-нафтохинон. ^итросоедапзпия, т.е. в сс тветствии с зь-четглями их электронного сходства.

В последующих экспериментах преследовав сь цель - обнаружить в исследуемых растворах, наряду с спектром анион-радикалов хинона. спектр катион-радикалов хлорофилла. Учитывая, что ширина компонент спектра ЭПР радикалов ~инона намного меньше ширины сигнала радикалов хлорофилла, что приводит к значительному разнице в их амплитуде, в дальнейших опытах мы использовали ем? то хлорофилла

его дейтерированный аналог - чейтерохлор^ филл. Уменьшение ширины сиг-ала с 7.9 до 3.1 гс, т.е. в 2.5 раза должно привести к тому, что амплитуда сигнала <А) должна увеличиться в соответствии с соотношением А]3=(ЛНн/ДТ7Х))г»Ан в 6.3 раза. В с-мом дале, для растворов дейтерохлорофилла а с хинонами можно было одновременно наблюдать спектры ЭПР радикалов пигмента и хинона. Это позволило выяснить условия, в которых стационарная концентоация катион-радикалов пигмента растет. Были исследованы зависимости формы фотоиндуцированнс-го rnempa i-ЛР от концентрации хинона, ^Н среды, температуры образца, полярности среды.

Для стабилизации радика "ов кы использовали .увеличение вязкости растворителе при понижении температуры образца. При температурах, близких к комнатной, так же как при использс зании обычного, про-тонированного хлорофилла, наблюдался спектр ЭПР анион-радикалов п-бензохинона. Понижение температуры образца приводило к уширению личи* СТС слектрз радикалов хинона и увеличению вклада в спектр синглет ого с: гнала гауссовой формы катион-радикалов дейтерохлорофилла. После выключения света спектр радикалов »шона быстро исчезал, одновременно спектр радикалов .лорофилла уменьшался до определенной величины, зависящей от температуры. . Остаточный синглэтный спектр ЭПР ри температурах ниже -90°С был стабилен и исчезал только при нагревании образца. Спектр радикалов хинона быстро исчезал дат лри' температурах, близких к температуре стеклования растворителя -Эти данные свидетельствуют о том, что после образования радикалов хлорофилла II хинона часть этих радикалов остаются близко друг к другу (в одной "клетке" растворитель), а другая часть радикалов исчезает по тезависимым механизмам. Для ьлк-а-радакалоз хинона такой реакцией ^.вля.тся реакция даспропорциони^ования, причем зта реакция может роисходить даже в вязких -редах. Гибель же катион-радикалов хлорофилла затруднена и в вязких средах они с абильны. Вероятно, эти радикалы также епособш к реакции диспропорционирования, однако из-за больших размеров молекулы константа скорости такого процесса мала.

При исследовании зависимости формы спектра ЭПР от концентрации хинона выяснилась, что при сравнимых концентрациях хлорофилла и хинона в спектре ЭПР м -то обнаружить спектры обоих радикалов, а при увеличении конц атраиии хинона стационарная концлггравдя

анион-радикалов хинона увеличивалась, тогда как стационарная концентрация катион-радикалоь хлорофилла уменьшалась. При этом обнаружилось, что вклад радикалов хлорофилла резко возрастает, если используется свежий, очищенный вакуумной возгонкой, хинон. Отсюда мы сделали вывод, что важну., роль в \ .зтанаа; жии стацио-напной концентрации натион-радикалов играет примесь гидрохинона, образующаяся пр' хранении хинона. Этот вьнод подтвердился в опытах с растворами хлорофилла с хиноном, в коюрые дополнил; шно вводился гидрохинон. Эт"! результаты позволили нам заключить, что катион-радикалы хлорофилла могут восстанавливаться до исходного состояния в реакции с гидрохипном.

Было показано, что при уменьшении рН среда стационарная концентрация катиил--эадикалгв хлорофилла увеличивается, а стационарная концентрация радикалов хинона уменьшается, причем в сильно кислых растворах <рН<4) мы наблюдя, л вместо анион-радикалов хинона его протонирсчанные радикалы. Скорость гибели катион-радикалов хлорофилла а после вы: лючения света у •.егьшалась при уменьшении рН, тоща как ско[ ють их образования, а также скорость затухания триплетных состояний практически не зависе. э от рН. Катион-радикалы бактериохлорофилла, ^Лразовави..еся "ри ось-щении раствора, содержащего п-бензохинон, при рН <4.3 были практически стабильны.

При исследовании влияния полярности среды, мы обнаружили, что в растворах безводных спиртов (содержание вода - менее 0.05%) фотоиндуцированный спектр ЭПР в системе хлор Эилл-хинон имееч форму _шг: тгной линии с АНрр » 8 гс. причем скорость его исчезновения увеличивалась при освещении образца светом с 700 нм < % < 850 нм. Если же в такой раствор вводилась вода (1+10Г, сигнал ЭПР имел СТС, характерную для анион-радикалов х^яона. Можно предположить, что эти результаты связаны с возникновении комплексов с переносо- заряда (СЫ*.. .0»), относительно устойчивых в безводно.,1 этаноле. Возможно, устойчивость таких комплексов обеспечивается молекулами спирта, входящими в их структуру.

Можно предположить, что наличие водь' в спиртах обеспечивает более высокую поллрность матрицы и. следовательно, возможность сольватации ион-радикалов. Крох того, молекула вода мс зт входить в состав комплекса, вытесняя молекулу спирта и превращая комплекс в лабильное образование, способное к диссоциации. Роль воды в фотохимии хлорофилла до конца еще не ясна, однако можно

.утверждать определенно, что фотохимические реакции в воде идут не менее успешно, чем в спиртах. Такое заключение мы можем сделать из заших результатов по исследованию фотоиндуцированного переноса зле .трона в водных раствор?" х^рофшиов с .инонами, содержащих детергент Triton Х-100 (¡SO. 5%). Детер знт в этих опытах необходим для растворения в воде хлорофилла, имеющего гидрофобную £ ггольную группу. Поскольку измере'.ия методом ЭПР водных растворов сопряжены с заметным ухудшением чувствительное, л метода, мы в этой работе широко использовали метод импульсной спектроскопии.

Были исслед .ваны фотоивдуцированные изменения спектров поглощения зьг-ргфа.'.'ла а и бакгериохлорофилла в з-знольном. и водном растворах, содержащих п-бензохияон. Выяснилось, что механизм фотореакций: при замене этанола-ректификата лэ воду с детергентом в целом остаемся прежним. В частности, мы показали, что катион-радикалы хло^оф-мла а и бактериохлорофилла стабилизирюгся в .лслых средах. . При использовании бакгериохлорофилла время жизни катион-радикалов ..ри pH 4 составляло несколько минут/при комнатной тс шературе.

Весь нг'ор полученных результатов позволил предложить следующую схему реакций:

Chi* + Q -p-*(Chl*.. .Q')—» Chi* + .Q« образование ион-радикалов

Chit + Q- —► Chi + Q рекомбинация

Chi* + Q2" (01.', GHg) —► Chi + Q« реакция с гидрохиноном

qt + qt •—•» q + q2~ . диспропордаонировант

Q7 + н+ —► QH» ' протонированис

QH« + QH- —» Q + qh2 ■'■ даспропорционировании

Здзсь Chi* - хлорофилл в триплетном возбужденном состоянии; Chl*-натион-гчдикал хлорофилла; Q- и ОН» - анион-радикал хинона и его протонированная форма; QHg, ОН" и Q2". - гидрохинон и его ионизованные формы. -ч

Глава VII. Двкарбо^силирование аминокислот и пептидов в фотореакции с фг рицианвдом калия при 77 К.

■ Декарбоксилирование . аминокислот и пептидов является г *шой из важг-йтих реакций, сопровождающих фотопо-рездение этих соединений

как ири прямом фотолизе за счет п-и* возбуждения карбонильной группы, так и в сенсибилизированных ароматическими аминокислотами реакциях. Одн ко мехзн"зм последних, как правило, известен только схематически, упрощенно. ^то связано, " частности, с от-сутстЕкем надежных данных о характеристиках продуктов реакции. В данном разделе представлены наши данные о спектрах ЭПР и спектрах электронного поглощения продуктов декариокешшрования аминокислот и пептидов, позволяющие идентифицировать эти продукты в сложных системах с большим наОр^м продуктов рпкций.

В связи с этим необходимо было, з чг тяоети, найти условия, при которых происходит реакция декарбокешшрования аминокис-.^г и пептидов, но не происходят втошчные реакции лр^вращвний соответствующих ра^лкалов. Из анализа литературных данных мы пришли к заключению, чт~ наиболее подходящим для наших це"ей способом получен; 1 таких радикалов являете реакция исследуемых молекул при 77 К с возбужденными комплексами переходных металлов. В качестве такого сенсибилизатора Мы выбрали феррицианвд калия.

Спектр действия декарбоксилирования аминокислот и петт-рв э фоторьакции с ферридазвидом калия рри 77К. Спектры ЭПР и спектры электронного поглощения рг-тзкэлов.

Об-учение водных растворов феррицизнида калия с пептидами при 77К све'им в области 410-450 нм приводила к накоплению радикалов, форма спектра ЭПР которьг. не зависал.: от длительности облучения. Измерение спекгра действия образования этих радисалов при исполь зовани" монохроматического света показало, что он совпадав' с полосой переноса заряда лиганд —► металл, расположенной в длинноволновой области спектра поглощения феррицианида.

Характер спектров ЗПР возникающих радикалов зависел от г^ироды аминокислотного ос.^тка на С-конце пептида. В частности, для пептидов Ала-Гли и Г.*и-Ала наблюдались триплетный к квинтетный спектры ЭПР, .^ответственно. Эти спектры совпадают с "одельными спектр;..,.и ЭПР (таблица 3), вычисленными в предположении, что носпаренный электрон взаимодействует с двумя (для Ала-Гли) или четырьмя (для Гли-Ала) эквивалентными протонами. Такой характер взаимодействия однозначно свидетельствует о том, что образуются

рапикалы вида -С0-Ш-СН2 для топтицез с глицином на С-конце и

-СО-Ш СН(СН3) для пептидов с аланином на С-конце, т.е. происходит декарбоксилирование этих шптвдов.

"аблица 3. Характеристики спектров ЭПР радикалов пептидов, образ. зщихся при их декарооксгпрощании: АН -ширина индивидуальной компоненты между точками максимальных наклона (гс), Ад-константа СТВ (гс), Ы-число компонент в спектре.

Пептид в-фактор АН Т>ь> N

Ала-Гли 2.0030 13.5 18.6 3

Ала-Гли-Гли 2.1030 12.8 18.6 3

Гли-Ал^ 2.0030 14.0 21.6 5 .

Были измерены измеьиния спектров электр.. яного поглощения при

77К образцов, содержащих феррицианид и пептид, после их облучения

в длинноволновой полосе поглощения феррицианвда. Как и следовало

ожыать, поглощение феррицианида уменьшалось, т.е. происходило

его восстановление в ферродаанид. Удалось обнаружить, кроме того,

одновр. ленное появление полеты поглощения в области 330-400 нм с

X «362 нк Поскольку методов ЭПР в этих условиях регистрировать _

лись только радикалы- декарбоксилирования пептида, естественно

предположить, что именно эти радикалы ответственны за полосу

поглощения с максимумом при 362 нм. Предполагая, что в каждом

акте восстановления ферршианвда появляется один радикал пептида,

мы получили коэффициент зкетинкции этого радикала е3б2 * 5*10г

М-1см"1.

Облучение образцов, содержащих гчесто пептида алифатическую аминокислоту, напри-ер, глицин или аланин, светом в область, дат н-новолновой полосы поглоще: тя феррицианида не приводило к появлению радикалов. Радикалы можно было подучить только при облучении образца светом с Я.<400 нм; в области более коротковолновой полосы поглощения феррицианида. Спектры ЭШ? радикалов глицина и аланина имели пять и семь компонент, соответственно. -Такие спектры может дать взаимодействие неспаренного электрона с четырьмя и шестью

почти эквивалентными ¿^ротонами. Для глицина такое взаимодействие

в

может быть обес;~,чено в радикале Н2И-СН2. а для аланина - в рада-кале Н^-СЖСНд), в котором протон у атома Са,'протоны метяьной

группы и протоны аминогруппы почти одинаково взаимод Яствуют с неспаренным электроном. •

Измерение при 77К спектров поглощения образцов, содержащих такие радикалы, показало, что полосы поглощения фер^щианида в них .уменьшились, однако увеличения поглощения, которое можно было бы отнест : поглощению радикалов, я^л обнару"-гь не .удалось. Это связано, по-видимому, с низким коэффициентом экстинкции таких радикалов.

Возможность декарбоксилирования аминокислот и пептидов пр.: их взаимодействии с возбу. денным комплексом Ге(Ш), феррицианчцом калия, по-видимому, связана с электронно-акцепторными свойствами последнего, поскольку наблюдав ./ый процесс происходил г условиях, исключающих диффузию, можно заключить, что реакция идет в комплексе, образ завшемс ; до замораживания образца В первичном акте, в результате возбуждения перехода переноса заряда электрон от лиганда смещается на атом ж^.-зза, затем злеетрондефицитный лиганд отбирав" электрон от гидроксила карбоксильной группы. После этого в молекуле пептида шп-" аминокислоты происходит перер.определение электронной плотности, способное привести к разрыву наиболее слабой связи. Такой связью, очев:дно, является связь атома Са с карбоксильной груа.ой.

Эта схема позволяет понять причины декарбоксилирования, но она недостаточна для объяснения разницы в спектрах действия фото-декарбоксилирования пептидов и аминокислот. Имеется, однако, примечательное соответствие между спектрами дзйс зия и характеров, сюрхтинкои взаимодействия не спаренного электрона в образовавшихся радикалах. Сравнивая спектры ЭПР радикалов аминокислоты и пептида с той же аминокислотой на г-конце, можно предположи---., что неспаренньй электрон .в радикалах аминокислот более дело-кэлизован, чем в радикалах пептидов. Это различие в двлокализации неспаренного электрон , возможно, является ключевым для понимания различия спенгров действия фотодэкарбоксилировакия ;.лггидов и свободных алифатических аминокислот.

Можно предположить, что б переходном состоянии комплекса возбужденного ферришянзда с аминокислотой или пептидом электронная плотность перераспределяется, приближаясь к ее распределен;- : в кс-ечном свободнорадакальном состоянии. В таком случае з колокуло пептида электронный дефицит локализован только в обл*. та связи

Са-С(ЮН. В результате, в neir. де связь ¿..ока Са с карбоксильной грушюй способна диссоциировать уже в условиях длинноволнового возбуждения феррицианида, т.е. при сравнительно небольшом уверении электронного, сродстгз этого ак"оптора. В молекуле аминокислоты, в тех же условиях, элек-ронный дефицит распределен по всей молекуле и доли этого децивдта, которая прихо.гмтся на связь С^-СООН недостаточно для ее диссоциации. П{ i возбуждении комплекса аминокислоты с феррицианидом в области коротковолновых полос поглощения фе^рицианида электронное сродство последнего возрастает болт-ше, чем при возбуждениии в области полосы переноса заряда феорициянида, и деф.лит электрона в молекуле аминокислота увеличивается так, что в обл ;ти связи Са-ССЮН становится достаточным для ее разрыва.

Предложенная хема, по нашему мнению, применима для объяснения аналогичных реакций любым фотоактивным акцептором электрона, в ча<~тнисти, катион-радикалом ароматической аминокислоты.

Глаяа 7III. Фотоионизация ароматических аминокислот при 77К.

.Возмошость фотоионизации триг^офанз, тирозина их аналогов надежно показана многа,.и авторами. Наиболее информативные данные получены методом импульсного ..лазерного фотолиза растворов этих соединений при комнатной температуре. Однако даже сама.. современная техника лазерной спек.роскопш не позволяет решить некоторые вопросы. В частности, недостаточно иг-чены вторичпе процессы, в которых участвуют катаон-радикал аминокислоты и эжекткрованный электрон, нет ясности в механизме тушения' флуоресценции и фосфоресценции образовавшимися радикалами, в том числе, вторичным:..

Низкотемпературные исследования фотохимических реакций аромз-1 деских молекул и,; в частно с. и, их фотоионизации, дают важную информагмэ о этих процессах.\ В нашей работе были выполнены тзкиь исследования для триптофана, гирозийа и и аналогов при 77К при использовании метода ЭПР и спектроскопии электронного поглощения.

После облучения ргг-творов /ароматических, аминокислот при 77К УФ светом регастрипущся. синглетные спектры ЭПР, в которые дают вклад катион-радикалы аминокислоты и гидратированные электронь!. Последующее облучение г_.кого/ образца видимым светом приводит к уменьшению интенсивности сигнала ЭПР и небольшому уменьшению его

вирины, что связывают с ре: омбинацией пары электрон - разжал. Мы проверили эту интерпретацию, воспользовавшись метеном низкотемпературной спектроско^ш. Оказа ось, что выцветание полосы поглощения гидратированного электрона (е~) не сопровожу тгея з'четным уменьшением полос поглощения катион-радикалов. Это установлено для радикалов триптофана и тирозина в нейтра чьной и щелочной среде. Только для простейшего аналога тирозина, фенола в щелочной среде удалось набл^ца-.ь одновременное уменьшение поглощения е~ и небольшое уменьшение поглощени. ценоксильного радикала. Так^м образом, рекомбинация родившейся после фото...шизации пары А+...е-при 77К является достаточно мг -.овероятным процессом. Впрочем, нужно отметить, что он все же происходит, давая о^энь слабую изо-гермическую льдинесценцию (R.Santus et al.), однако его ролью в фотохимии можно т.^чебречь.

Можно д^едтоложить, что высвободи шийся из неглубокой довушки матрицы в результате облучения в его полосе поглощени ;, электрон захватывается более глубокими ловушками или другими молекулами ароматической аинокислотр. В последнем случае можно предположить Пов возможности. Первая - захват электрона и-системой аромата1 ic-кой молекулы с образованием анион-радикала А~, вторая - захват электрона боковой аминогрупг'й аминок"слаты. с последующим деза-шниров ,шем. Обе эти возможности должны приводить к появлению си-кала видимо, слабо отличающегося от синглетного сигнала ЭПР катион-рздикалов. В сп_.ггре поглоще-ия при этом следует ожидать уменьшение полосы поглощения хромофорной группы и появление полос по: юще*тш анион-радикала, если реализуется первая возмож иость. В случае дезаминирования полоса поглощения хромофорной группы может не измениться, так как тс-система хромофора при этом ве нарушается, но должна появиться полоса поглощения соответствующего радикала дезавуирования. Именно последний процесс для триптофана, видимо, мы ч наблюдали, так как кроме полоо катион-радикалов триптОанз <330 и 5?о нм) и.их депротонировэнн-й формы <320 и 5Ы нм) после длительного облучения наблюдалась полоса б области 340-360 нм.

Интересные результаты, связанные с наблюдением электронов в глубоких ловушках, были получены м^одом ЭПР. В водных рэстворях триптофана, тирозина или фенола, содержащих высокие концентрации (>10 г М) алифатических аминокислот или пептидов, пг~ло УФ

облучения при 77К можно набл .дать чрезвычайно узкий сигнал ЭГР с .9988±0.0002 и АН^О.ОЗ гс. После тщательного исследования свойств этого сигнала и условий его появления мы пришли к выводу, чт" за него ответственны глубокие ловушки электрона, возможно, двухзарядоые ионы непарамагнитных / металов, присутствующих в образце, как примеси аминокислот.

Глава IX. Фотохимия ароматических аминокислот в присутствии алифатических аммокислот и пептидов при 77К,

Воспо.льзовявшись спетыми ЭПР радикалов пекарбоксилирования аминокислот и пептидов, катионэдикзлов ароматических, аминокислот, полученными наш и обсужденными в пре-ыдущих главах, мы провели количестве шый анализ спектров ЭПР радикалов, образующихся в сенсибилизированные ароматическими аминокислотами реакциях в р-стъорах алифатических аминокислот и пептидов при 77К. При этом мы предполагав проверить икроко принятый механизм реакций, в соответствии с которым в петичном фотохимическом акте происходит двухкванточая фотоионизацш, ароматической аминокислоты (А) с образованием катион-радикала (А*; и электрона <е~)'

А + -► А* .........А* + Ъу2-А* + е~

Все остальные цродукггы должны образовываться в резуль~ате взаимодействия первичных продтсгов А* и е~ с окружающими молекулами, алифатической аминокислоты, например, глицина. По имеющимся пред-ствлениям, наиболее вероятными могут два дополнительных процесса. В.одном из иих электрон, взаимодействуя с алифатической аминокислотой, вызывает еь д^заминирование:

е~ + Ш^-СН£-СОО- -> КН3 + -СН2-СОО-

Катион-^адикал, в свою очередь, способен вызкчть декарбоксилиро-вание аминокислоты из ближайшего окружения:

А* + Ш+-СН2-С00- * А +'Н+......М^-СН- + СО,,

В соответствии с так м механизмом в УФ-облученном образце должен присутствовать набор радикалов:

а*, ш2-гн-, е~. -снг-соо-,

причем концентрация гидратированных электронов с с^глетным

спектром ЭПР, 6=2.001, лН =15 гс и радик-лов *СН -П00-, с триплетным спектром ЭПР, должна равняться или быть меньше концентрации катион-радикалов триптофана (А*) с сыглетным спектром ЭПР и радикалов, продуктов его взаимодействия с окружением, 15Н -СН^, имеющих квинтетный спектр ЭПР, идетгичный спектру, полученному в экспериментах с феррицианидом калия.

Для растворен триптофана-, содержащих большую концентрацию алифатической аминокислоты (соотношение концентраций от 1:200 до 1:2000) после УФ обДу^ния при 77К наблюдались сложные спектры со сверхтонкой структурой, форма которых зависела от природа о.лино-кислоты. В частности, для глцина наблюдался усложненный триплет-ный спектр ЭПР с небольшим вкладом квинтетного спектра. Анализ этого спектро позволи.* заключить, что коицзнтрашя радикалов, возникающих при декарбоксилирован..и глицина (Ш2~СН-) не превышает 10% суммарной концентрации радикалов, остальные 90% радикалов представлены усложненным триплетным спектром ЭПР, который можно объяснить наложением двух спектров с оазличающимися ^-факторами. Один из этих спгктров может принадлежать радикалам дезаму :ирова-ния "(*СН -С00-), природа второго будет обсуждена ниже. Существенно, что в спектрах нет сметного вклада сшг.'этного спектра (в обседаемых экспериметнах этот вклад не превышает 5%), который можно приписать гидратированным электронам или радикалам хромофора. Попытка объяснить полученные результаты механизмом, указанным выше, приводит к серьезным противоречиям. В самом деле, такой п-ханизл ре-кций может объяснить только 20% наблюдаемых радикалов. Из них половина представлена радикалами дзкарбоксилирования, а вторая половина, по-видимому, радикалами деззминирования. В связи с этим необходимо обсудить другие возможные механизмы гор-ичных: и вторичных реакций.

Наиболее вероятны два объяснения наблюдаемого набора радикалов. Первое сводится к предположению о возможности /-эугих путей гибели катион-радикалов ароматической амкною.„лоты при 77 К. Второе может быть связано с механизмом, отличающимся от приведенного выше.

При обсуждении дополнительнь- путей гибели катион-радикалв А* *ожно предположить две реакции. В одной та них радикалы А * взаимодействуют с ионами гидроксила воды, давая радикалы г'-;

А* + ОН" -► А + ОН-

Спектр ЭПР радикалов ОН*, стэбилизировангчх во льду при 77К, из-за анизотропии £-фактора и взаимодействия неспаренного электрона с протоном состоит из трех линий и может давать вклад в регистрируемый спектр. С другой стороны» учитывая высс..ую. реакционную споиобнос-ь гидроксильнах радикалов ОН«, образовавшихся в непосредственной близости от индольного кольца триптофана, следует ожидать, что они должны образовывать парамагнитные ОН*-адцукты триптофана с си-л-летным спектром ЭПР. Впрочем, необходимо учитывать, что для обрэзцнв, использованных в обсуждаемых экспериментах, молекулы триптофана сольватированы молекулами алифатической аминокислоты и радикалы ОН- могут реагировать с этими молекулами.

Можно дп^дожить, кроме того, что катион-радикал А* способен реагировать с высвободившейся в реакции де ^минирования аминогруппой, при этом следует, ожидать появления в образце радикалов •Ш . Для проверки . такой: возможности мы исследовали систему триггг-фап - аммиак. Оказалось, что после облучения УФ светом в области '60-39Г нм при 77К водного раствора триптофана с аммиаком регистрируется спектр ЭПР,. в. котором на фоне.синглетного спектра катион-радикалов триптофана т» е~ имеете:, триплетный сигнал ЭПР радикалов -^.Аналогичный'спектр ЭПР радикалов -Ш.^ регистрировался нами и при облучении при 77К водного раствора "феррицианида калия .с аммиаком. Таким образом, принципиально вполне возможен фотоиндуцированный процесс

А*+ ЙН • Ьу > А + -1Ш., + Н+

■.:.■■ з ... г

При анализе спектра ЭПР, регистрируемого поело облучения УФ светом при растворов ароматических аминокислот, содержащих высокую концентра^'Ю алифатической аминокислоты, обнару: дло"ь, что нельзя исключить, что в регистрируемый спектр ЭПР дают вклад и радикалы -М^.

Наконец, на наш взгляд, нельзя исключить возможность другого Механизма образования радикалов. По сути, речь вдет о фотодиссоциации молекул окружения в первом фотохимическом акта:

А + —» А* .........- А; + » А-

А** + Ш+-СН2-СОО- —> (Ш^-СН2-С00-)*

(Ш+-СН2-С00->* -> -Шг + -СНг-С00- + н+

В соответствии с ирг "догаемой схемой, после триплет-три.-летно-

го поглощения молекула хромофора приобретает энергию, „остаточную для возбуэдения п-тс* перехода карбонильной группы соседней алифатической аминокислоты. Но известно, что облучение алифатических аминокислот в области п-тс* перехода карбонильной гру!ЛЫ приводит к дезаминированию аминокислоты. Первичными продуктами при этом должна бь^ь пара радикалов - радикал дезамир;.роваша. -СН2-С00~ и радикал аммиакз -КН^.

Косвенным подтг ^радением возможности альтерн -.тивного фотоионизации механизма фотопроцессов в образцах, содержащих триптофан и алифатическую аминокис~оту являются результаты наших рабо~ по наблюдению эффекта обратимого светового тутения фосфоресценции триптофана и его аналогов за чет появления ноього кагэла дезактивации при образовании эксиплекса высоковозбужденного триллэтно-го состояния и£' триптофана с карбонильной группо" (глава IV). Было показано, что в этом эффекте может участвовать С=0 группа как самой молекулы триптофана, так и посторонней молекулы с такой группой, оказавшейся в окрестности тригггофана. Более того, было показано, что этот эф^зкг особенно хо/осп проявляется в водных раствглах триптоф на с глицином. Можно предположить, что, если возбуждать еще более высоколежащие триплетные. уровни (вместо переходов Тг<— Т1 возбуждать Т3<—), ~о зксиилексы будут способны дезактивироваться, образуя радикалы.

Дополнительные подтверждения предположений, сделанг х на основании данных ЭПР, были получены при исследовании аналогичных образцов с использованием метода низкотемпературной спектроскопии электрслног поглощения и измерений тушения фосфоресценции. Результаты этих исследований могут быть сформулированы в виде следующих утверждений:

- полоса поглощения ароматической аминокислоты (с к =¿>30 нм

тах

для триптофана) в процессе накопления радикалов не изменяется, т.е. ^-система хромофг а не повреждается.

- появляется интенсивная широкая полоса поглоа^ния в ^льней УФ области спектра, оканчивающаяся в области 400 нм и хор~ш выраженный узкая полоса в области 340-380 нм 1 X >*360 нм.

- тушенке фосфоресценции образца полностью коррелирует с накоплением радикалов и появлением но..о!х полос поглощения.

Попостзвляя эти результаты и результаты, полученные методсм ЗПР, можно предположить, что за полосу 380 нм отЕетство,..:Ы ради-

калы дгзаминирования алифатической аминокислоты.

Отсутствие изменений спектр э спектра поглощения триптофана при польом тушении, его фосфоресценции позволяет сделать вывод о том, ■что люминесценция тушиггся появившимися в окрестности молекулы триптофана продуктами . максимумом поглощения ЗьО нм. В самом деле, спектр флуоресценции триптофан? в водных растворах имеет максимум излучения около 325 им, хорошо перекрывающийся с полосой поглощения с ¡1^^=360 нм. Такое перекрывание обеспечивает высокую эффективность переноса энергии по индуктирчо-резонансному механизму:

1тгР* + К360 — 1тгР * ^60 с последутцей бззизлучательной дезактивацией возбужденного состояния продукта К* .

Глава X. Фотохимия белков. Предельная концентрация УФ-индуци-

рованных радикалов при 77К.

При УФ облучеили белков при 77К концентрация образующихся радика. эв стремится к некоторому пределу Ш]пр, значение которого зависит от размеров белковой глобулы. С процессом накопления радикалов коррелирует тушенке люминесценции белка. Но хорошо известно, что первичные фотохимические реакции образования радикалов в белке имеют духквантовый характер и идут через промежуточное триплетное состояние ароматических остатков, триптофана и тирозина. В связи с этим естественно предположить, что рост концентрации УФ индуцированных радикалов прекращаемся из-за процессов, делапих невозвожным первичш-'й фотохимический акт. Такими процессами могут "ытъ повреждение ароматических остатке, з "ли эффективная конкуренция заселению нижнего триплетного состояния (дезактивация их синглетного возбуждения за счет переноса энергии на радикалы), или, наконец, сочетание обоих этих механизмов.

Для проверки этих возможностей мы воспользовались методом низкотемпературной спектроскопии оптического поглощения. Выяснилось, что после выхода концентрации радикалов на предельный уровень длинноволновая полоса поглощения бежов, за которую ответственны триптофэновые и тирозиновые остатки, уменьшается не более, чем на Ъ% (для яичного яльбумина, например, около 3%). Учитывая, что при исследовании фотоионизации триптофана, ' тирозина и фегэла в

стеклующихся растворах, мы регистрировали уменьшение ьа 50" этой полосы, можно сделать вывод, что щл накоплении предельной концентрации радикалов в белка.., ароматические аминокислотные остатки остаются практически неповрежденными.

Таким образом, приходится заключить, что определяющую роль в механизме ограничения роста концентрации УФ индуцированных рэди-кй ;ов играют процессы дезактивации возбуждения ароматических аминокислот образовавшимися рал'®« тами. В связи с этим возникает вопрос о механизме такого тушения. Поскольку радикалы-тушители должны дезактивировать синглетное возбужденное состояние аре этических аминокислотных остатков, видимо, юханизм дезактивации должен свод ггься к переносу энергии синглетного возбуждения на радикалы. Для обеспечения такого переноса энергии радикалы должны иметь полосу поглощения, перекрывающуюся с полосой флуоресценции ароматических остатков, т.е. их полоса поглощения должна лежать в области 300-400 нм. В качестве таких радикалов-тушителей могут выступать как радикалы ароматических аминокислотных остатког, так и другие радикалы, как в случае водны., растворов триптофана, содержащих высокую концентрацию алифатической аминокислоты (глава IX). При измерении спектров поглощения УФ облученных белков при 77К рэм удалось такие полосы обнаружит однако идентификацию этих по. .ос из-за недостаточной чувствительности спектрофотометра трудно провести однозначно. Hanpia.jp. после УФ об луче, ля раствора яичного альбумина мы обнаружили появление полос с максимумами при 310 нм и при 410-420 нм. Длинноволновая полоса 410-420 нм хорошо совпадает с полосой поглощения феноксильного радикала тирозина, э также с длинноволновой полосой радикалов шидазола. Полосу 310 нм, по имеющимся данным, можно отнес »и к радикалам имидазола .ли гистицина. Нельзя пключить и другое отнесение этих полос. Можно только утверждать достаточно определенно, что этг полосы не тринадлежат рцикалам тригггоПановых остатков яичного альбумина.

Дру эй подход к выяснению механизма выхода УФ индуцированных эадикалов в белках на предельную концентрацию связан с .измерением злияния сторонних доноров и акцепторов электрона на процесс нако-1Л9НИЯ радикалов. Оказалось, что введение в раствор белка низких [сравнимых с концентрацией белка) концентраций феррицианида калия ¡с влияет на кривую накопления радикалов. Если же в растворо ¡рисутствовал феррошанад калия (донор электронов), продельная

- - .

Кон"ентрация УФ индуцированных радикалов не изменялась, но скорость выхода на предельную концентрацию росла с ростом концентрации ферроцианвда. №>-видимому, это означает, то ферроцианид способен увеличивать скорс зть восстановления катион-радикалов ароматических аминокислотных остатков до исходного состояния. При этом сотаетствутаций остаток снова способен участвовать ь фотохимических реакцк.а образования радикалов белка. Поскольку предельная концентрация радикалов гги этом заметай те изменялась, можно предположить, что она определяется не количеством вовлеченных в фотохимические процессы ароматических аминокислотных остатков, а расстояний от этих остатков до радикала-тушителя (в соответствии с теорией индуктивно-резонансного переноса энергии Ферстера это расстояние может быть до нескольких десятков ангстрем). Заметим, что поскольку ион ферроцианвда не может внедриться внутрь глобулы белкг он 'тособен взаимодействовать только с катион-радикалами аминокислотных остатков, находящихся на поверхности болтовой глобулы.

Таким образом, лз наших данных можно предположить, что накопление радикалов 15м УФ облучен"и белков прекращается за счет эффективной миграции энергии с синглетно-возбувдэнных ароматических остатков белка на радикалы, имеющие спектр поглощения в области 300-400 ни. Такими радикалами могут быть практически любые радикалы, возникающие в молекуле бежа за счет первичных или вторичных фотохимических процэссов. Такая .универсальность природа радикалов-тушителей обеспечивает интегральный характер предельной концентрации УФ индуциро: энных радикалов, не зависящий от количества и с^сива ароматических аминокислотных остатке 5 в конкретном белке.

; В НВОДИ

I. Для ряда металлокомплексов. дикатионов и оснований порфи ринов в твердых матрицах при ЗООК и 77К впервые измерены спектры ЭПР триллетноге состояния для переходов с дт=±1. Используя метод магнитофотоевлекции канонические линии ЭПР-поглощения триплотно-возбужденных молекул отнесены к молекулярным осям. Из по-ученных спектров вычислены параметры расщеплег'п триплетного уровня в

нуле: эм магнитном го. _>. Анализ формы линии спектров ЭПР порф.'ри-нов, имеющих симметрию позволил предположить, ч.о для них играет роль Ян-Те»леровское снятие вырождения'т^люютного ¿ровня.

2. Обнаружено обратимое ветовое тушение триплетного состояния триптофана и его аналогов при облучении в области длинноволновой полосы тришгет-триплетного поглощения. Изучен механизм эффекта. Показано, что он свягъл с дезактивацией триплетного состояния при взаимодействии высоковозбуя ¡денного триплетного состояния индольногс кольца с С=0 группами, входящими в состав молекулы или принадлежащими соседним молекулам. ЭС-^ект наблюдается и для трип^фана, входящего в состав белков.

3. Изучено концегтрационное тушение триттного возбуждения в растворах трлотофана при 77 К. Предложен механизм туше- ия, важную роль в котором играют высоковозбуященные триплетные состояния. Концентации, при которых наблюдается такой пер юс энергии, соответствуют локальным концентрациям триптофана в белках. Это позволило предположить важную ро~ь высоковозбужденных триплетных состояний трип.офановых остатков белка в его фотофизике и фотохимии. В частности, предложенный мсха:изм позволяет объяснить особе-:гасти заселенности триплетных состояний . ароматических аминокислотных остатков белков.

4. При исследовании фотохимических реакций в растворах хлорофилла с хинонами показано, что происходит фотоиндуцированный перенос электрона с образованием катион-радикала х орофилла и анион-радикала хинона. Предложен механизм процессов. Показано, что стационарные концентрации радикалов хлорофилла и хинона могу г значительно различаться из-за разных факторов (примесь гидрохинона, рН среда!, вязкость растворителя, температура), влияющих на скорости гибели радикалов.

5. Исследована реакция фотоиндуцированного декарбоксилирования алифатических аминокислот и пеггпщов при 77К в присутствии феррицианида «-алия. :.одученг спектры ЭПР и спектры электронного поглощг-шя продуктов реакции. Обнаружено, что "жэрбоколлирование пептидов происходит при возбуждении феррицианид- в его длинноволновой полосе переноса заряда л!..-анд —» металл, тогда как для декарбоксилирования аминокислот необходимо возбуждение болео коротковолновых полос поглощения феррицианида. Предлагается кс .анизм реакции декарбоксилирования.

6. Измерены оптические сг^ктры поглг-цения в УФ и видимой облглп, тушение фосфоресценции и спектры ЭПР при фотоионизации ароматических аминокислот при 77 К. Показано, что после длительного УФ облучения растворов тшптофана, тироз.^а и фенола, соответстьующего накоплению предельной концентрации -радикалов, повреждается около 50% молекул в растворе.

7. Используя метод /ЭПР, проведен количественный анализ продуктов фотос&лсибилизированного образования радикалов в водных растворах аромата .ecicix аминс.сислот с алифатическими амичокисло-тами при 77К. Результаты анализа не согласуются с принятым механизмом. Показано, что i процессе реакции оптический спектр поглощения сенсибилизатора остается неизменным, но появляется полоса поглощения в области 360 нм. Туше.ле фосфоресценции, коррелирущее с накоплением радикалов и увеличением поглощения при 360 нм связывается г переносом энергии возбуждения хромофора на радикалы. Осуждаются механизмы процессов.

8. 7. учены процессы, приводящие к установлению предельной концентрации УФ индуцированных радикалов в растворах белков при 77К. Предполагается, что интегральный характер предельной концентрации радикалов, практически не коррелирующий с количеством фотохимически активных ароматических остатков белка, обеспечивается разнообразием радикалов - тушителей синглетного возбуждения таких остатков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Костиков А.П., Грибова З.П., К^шин Л.П. Применение метода магнитофотоселекцли при исследовании ЭПР триплетного состояния порфиринов. // Докл. АН СССР, 1970, T.I93, XZ, с.469-472.

£. Грибова З.П., Кашин Л.П., Костиков А.П... Сибельдшна Л.А. Электронный парамагнитный резонанс триплетного состояния порфиринов дяя переходов дт t1. // Докл. АН СССР, 1970, т.193, М, с.926-938.

3. Костиков А.П., Грибова З.П. Исследование свойств триплетного возбужденно э состояния порфиринов методом ЭПР. Тезисы докл. на симпоз. "Проблемы биофотохимии", МГУ, Москва, 1970, с.38.

4. Евстигнеев В.Б., Садовникова H.A., Костиков А.П., Грибова З.П., Каюшин Л.П. Зависимость сигнала электронного парамагнитного резонанса при фотоокисленш хлорофилла хиноном от кислотности среды. // Биофизика, 1971, т.18, вып.З, с.431-435.

5. Садовгикова H.A., Костиков а.П. Ясс-удованиь первичных продуктов фотоокисления хлорофилла а методом ЭПР. Тезисы докл. на конф. "Биология ч научно-технический прогресс", Пукдано, 1971, с.120-122.

в. Евстигнеев В.Б., Садовникова H.A., Костиков А.П., Кз.ошил Л. П., Исследование первичных продуктов фотоокисления хлорофилла а методом электронного парамагнитного резонанса. // Докл. АН СССР, 1972, т.203. c.I343-I346.

7. Костяков А.П. Применение метода ЭПР к исследованию триплетно-го возбужденного состояния пор^лринов для переходов с дт=±1. // В сб. "Исследование свободно-радикальных состояний в связи с их ролью в ре-уляцим биологических процессов", (ред. Л.П.Каюшин).'Пущино, 1972, т.Г, с.14-27.

8. Всеволодов H.H., Костиков А.П. Наблюдение двухфотоняого поглощения в хлорофилле и других орггтгачесюис красителях. // В сб "Исследование свободно-радикальных состояний в связи с их ролью в регуляции биологических процесс Г. (ред. Л.П.Каюшин). Пудано, 1972, t.I, С.147-153.

9. Всеволодов H.H., Костиков А.П. Двухфотонное поглощение лазерного излучения хлорофиллом а и некоторыми другими органическими веществами. Тезисы докл. на IV Международном биофизическом конгрессе. Москва, 1972, с.28.

10. Костиков А.П., Садовникова H.A. Исследование методом ЭПР фотоокисления хлорофилла а. Тезисы докл. на IV Международном биофизическом конгрессе. Москва, 1972, с.344-345.

11. Всеволодов H.H., Костиков А.П., Каюиин Л.П., Г( йатонков В.И. Двухфотонное поглощение лазерного излучения хлорофиллом а и некоторыми органическими красителями. // Биофизика. 1073, т.18, вып.4. с.755-757.

2. Костиков А.П., Садовникова H.A., Евстигнеев В.Б., Кашин Л. П. Исследование методом ЭПР первичных продуктов фотоокисления хлорофилла а. Влияние воды. // Биофизик, 1974, т.19, ВЫП.?, с.244-248.

13. Kostikov А.P., Kayushin L.P., Chekulaeva L.N., Badovnikova N.A., Evstigneev V.B. IPR detection of deute^iochiorophyll cation-radicals arising at its photoreaction with quinone at low tempera.ure // „IBS Letters, 1974, v.4n. No. 1, p.149-151.

14. Костиков ' П., Садовнытова H.A., Евстигнеев В.Б, Исследование выхода катион-радикалов ..лгмеята в реакции фотоокисления хлорофилла хишж..ли. // Биофизика, 1976, т. 21, выл! 5, с.803-807.

15. Гчдовникова H.A., Костиков А.П., Евстигнеев В.Б. Фотоинду-цирпванный перенос электрона в растворах хлорофилла с хинона-ми. // Тезисы докл. на I Всесоюзном симп. "Окислительно-вс^становигельные реакции свободных радикалов". Киев. 1976.

16. Костиков Д.П., Овчарегпсо В.П. , Львов K.M. Влияние феррициа-да на предельную концентрацию УФ-облученных белков при 77К.Тезисы докл. на II Всесоюзном симп. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черногологго, 1981, с.248-2").

17. Костиков Д.П. Изученка природа аномально узкого сигнала ЭПР, возникающего при УФ облучении растворов бел,:ов при 77 К. Тезисы докл. на I Всесоюзн. бдаФизич. съезде, Москва, 1882.

18. Костиков А.П.,. С.'.чаренко В.П., Львов K.M. Особенности mí :са-низма" фотохимических - реакций образования радикалов в белках при 77К в присутствии феррицианвда. Тезисы докл. на I Всосюзн. биофизическом съезде, Москва, 1982.

19. Костиков А.П., Волощенкг C.B.. Овчаренко В.П. Фотоиндударо-ванное:декарбоксилирование аминокислот и пептидов при 77 К.. Тезись: докл. на vil Всесоюзнс конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Москва, 1889, с.54-55.

20. Костиков А.П., Волощенко C.B., Овчаренко В.П., Пугачева Н.С. Фотопревращениз радикалов, возникающих при докарбокст'чирава-иии пептвдов. // Биофизика, 1990, т.вып.4, с.560-583.

!1. Костиков А.П., Овчаре dira В.П., Львов K.M. Сверхузк-Я спектр ЭПР водных растворов белков, УФ-облученныу при 77 ¥ // Биофизика, I99U, т.35, ВиП.5. о.783-78Ь.

Î2. Львов K.M., Кузнецов C.B., Костиков А.П. Обратимое« снижение интенсивности фосфоресценции триптофана при действии света в облает», триплетного поглощения при 77 К. Биофизика, 1993, г.38, вып.4, С.5Р8-573.

?3. Львов K.M., Кузнецов C.B., Котиков А.П. Кинетическая модель аффекта обратимого снижения засг тенности гриплетниго состояния триптофана при действии света. // Биофизика, К 3, Т.38, ВЫП.4, с.574-579.

>4. Львов K.M., Кузнецов C.B., Бибиков С.Б., Костиков А.П. Заселенность ~риплепг -возбужденных состояний три- тофанилов и тирозилов в белках. // Биофизика, 1993, т. 33, вып.5, с.741-745.

Ï5. Львов K.M., Joy У., Костиков А.П. Парамагнитные состояния, УФ-индуцированные в щелочном раствора триптофана при 77К. // Биофизика, 1994, т.39, вып.4, с.749.

28. Львов K.M., Coy У., И~каков A.A., Костиков А.П. Свободно-ра. икальные реакции в растворе триптофана с алифатическими пептидами при УФ-облучении. // Биофизика, 1994, т.39, вып.4,