Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение люминесцентного метода для экологического анализа качества семян

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение люминесцентного метода для экологического анализа качества семян"

На правах рукописи

КОЗАРЬ Виктор Иванович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КАЧЕСТВА

СЕМЯН

03.00.16-экология 03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Веселовский Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Котелевцев Сергей Васильевич

доктор биологических наук, профессор ЧернавскийДмитрий Сергеевич

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино-на-Оке)

Защита состоится «23» июня 2005 г. в « у » часов на заседании диссертационного совета Д.212.203.17 в Российском университете дружбы народов по адресу: 113093, Москва, Подольское шоссе 8.5, экологический факультет, РУДН. тел.: (095) 952-77-07 факс: (095) 952-89-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117923, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан

«А

.2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ж

//"^.К. Черных.

Актуальность проблемы. Для современного состояния окружающей среды характерно постоянно нарастающее техногенное давление на тропосферу, гидросферу, водные и почвенные экосистемы. По мнению академика АБ.Яблокова [1992], «...критическое экологическое состояние нашей страны в ближайшие годы перейдет в катастрофическое и может стать причиной социально-экономического неблагополучия». Уменьшение и регулирование техногенного воздействия, экологизация производства и оптимизация природопользования - проблемы, требующие серьезного научного обоснования.

Общепринято, что реальная оценка качества окружающей среды возможна только на основании изучения поведения биоты, поскольку токсичность любого фактора - это, прежде всего, биологическая характеристика. В отличие от приемов аналитической химии биологические методы определяют интегральную опасность компонентов среды, действие которых может зависеть от их взаимодействия между собой (синергизма или антагонизма). В настоящее время контроль за состоянием биоты в полевых условиях (биоиндикация, биомониторинг) осуществляют в сочетании с приемами биотестирования.

Биологические методы оценки качества окружающей среды допускают использование различных организмов и определение любых удобных показателей состояния биологического объекта. Семена высших растений практически удобны в качестве тест объекта, поскольку в сухом состоянии они долго остаются жизнеспособными. Однако их использование может показаться нелогичным. Воздушно-сухие семена находятся в анабиозе (ан-гидробиозе), а хорошо известно, что в этом состоянии создается значительная устойчивость организмов к внешним воздействиям, которые те же организмы в жизнедеятельном состоянии не выдерживают. Сухие семена устойчивы к высоким и низким температурам, действию безводных органических растворителей, токсическим газам (за исключением кислорода), ионизирующей и УФ радиации (Голдовский, 1986). Но во время формирования семян, а также в фазу набухания и появления проростков устойчивость семян заметно снижается.

Неблагоприятные условия внешней среды во время созревания семян могут вызывать у них глубокие физиологические и биохимические изменения. Качество и жизнеспособность семян снижает избыточно влажная погода. Не лучше обстоят дела, когда при созревании семян излишне жарко и сухо. Иными словами, «...качество семян и урожай свидетельст-

вуют об условиях, в которых жило растение, и формировались семена» (Реймес,1983).

Если во время набухания семена подвергнуть воздействию высокой или низкой температуры, засолению, интоксикации, повышенному осмотическому давлению, то их прорастание ухудшается. Этот факт широко используют для определения степени биологической опасности различных агентов, а также для исследования механизмов повреждающего или стимулирующего (гормезис) действия предпосевной обработки (Генкель, 1968; Удовенко, 1977; Кузин, 1995; Николаева и др., 1999).

В популяции тест-организмов отдельные индивидуумы различаются по своим свойствам, которые в течение жизни не остаются постоянными. Под влиянием воздействий в популяции меняется соотношение организмов отличающихся чувствительностью. Этот факт существенен при длительных испытаниях с целью выявления биологического действия агентов в малых количествах (дозах).

Популяция семян представляет собой смесь высококачественных семян, из которых вырастают нормальные проростки, семян пониженного качества, дающих ненормальные проростки с морфологическими дефектами (такие семена считаются невсхожими) и мертвых семян. В процессе хранения качество семян ухудшается, они стареют. Проверяют состояние семян проращиванием, но сделать это можно только один раз. Из этого очевидного факта следует, что контролировать кинетику реакции одельно-го семени на внешнее воздействие невозможно. Единственным путем изучения динамики поведения семян является популяционно-статистический подход, при котором сопоставляют физиолого-биохимические или физико-химические характеристики выборки семян с кривыми потери всхожести или жизнеспособности. Применение популяционно-статистического анализа корректно, если распределение семян в популяции по изучаемому свойству является нормальным. Однако на основании среднестатистических данных нельзя однозначно решить, обусловлены ли наблюдаемые изменения поведением только отдельных организмов, или они отражают изменение качественного состава всей популяции семян.

Стандартные методы определения состояния семян (окрашивание витальными красителями, восстановление солей тетразола, учет скорости утечки электролитов при набухании и некоторые другие физико-химические приемы), связаны с частичным или полным разрушением семени, что исключает дальнейшее его использование. Поэтому существует необходимость в методе, который позволял бы многократно контролиро-

вать жизнеспособность сухих семян после различных воздействий, а также ранжировать их по качеству, чтобы для опытов отбирать семена с близкими характеристиками.

Предложенная работа посвящена исследованию возможности использования для этих целей явления послесвечения (фосфоресценции) воздушно-сухих семян. Кратковременное облучение семян с последующей регистрацией свечения не изменяет их исходного состояния и качества, что позволило бы проводить многократные измерения.

Долгое время считали, что фосфоресценцию биопрепаратов можно наблюдать только при криогенных температурах. В 60-е годы прошлого века (Debye, Edwards,1952; Конев, 1965; Gibson, 1967) стало возможным регистрировать фосфоресценцию воздушно-сухих препаратов при комнатной температуре. В химии, начиная с 80-х годов, фосфоресценцию при комнатной температуре широко применяют для количественного анализа пестицидов, ароматических углеводородов и лекарств (обзор Parker et al., 1980). В нашей лаборатории в 1980 году было обнаружено явление длительного послесвечения воздушно-сухих и набухающих семян разных растений после их облучения видимым светом (обзор Веселовский, Весе-лова, 1990).

Для выявления природы этих свечений, создания и апробации нового люминесцентного метода оценки качественных характеристик семян с целью использования последних в качестве тест-организмов для биоиндикации и биотестирования состояния окружающей среды необходимо было решить следующие задачи:

1. определить основные характеристики послесвечения воздушно-сухих и набухающих семян и на их основании формулирование гипотезы о природе свечения;

2. исследовать взаимосвязи послесвечения семян с их качеством (влажность, всхожесть и жизнеспособность);

3. выяснить характер распределений семян в партиях по уровню послесвечения и исследовать влияние факторов среды на вид распределений;

4. продемонстрировать приемы использования послесвечения семян для диагностики состояния внешней среды.

Научная новизна работы. Выяснено, что возбуждаемое видимым светом длительное послесвечение воздушно-сухих семян является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). Основанный на этом явлении метод позволил проводить предварительную оценку качества семян без проращивания. Ухудшение качества семян (снижение всхожести и жизнеспо-

собности) сопровождается увеличением уровня ФКТ, обусловленным уменьшением влажности семян.

Обнаружено, что распределение индивидуальных семян по уровню ФКТ показывает, что партии пониженной всхожести содержат три фракции: из семян фракции I вырастают преимущественно нормальные проростки; семена фракции П дают проростки с морфологическими дефектами или погибают от гипоксии при набухании; во фракции III присутствуют только мертвые семена Установлены закономерности изменения распределений под влиянием стимулирующих и снижающих всхожесть семян воздействий, а также у семян растений, росших в неблагоприятных условиях среды.

Зарегистрировано свечение нативных набухающих семян и выяснено, что возбуждаемое видимым светом данное послесвечение является фосфоресценцией эндогенных порфиринов в анаэробных условиях. Впервые продемонстрировано, что с помощью регистрации фосфоресценции пор-фиринов можно in vivo контролировать возникновение дефицита кислорода в тканях прорастающих семян.

Исследование фосфоресценции прорастающих семян в присутствии малого количества токсиканта (парахлормеркурий бензоата) показало, что увеличение всхожести семян (гормезис), обусловлено уменьшением количества страдающих от гипоксии семян, тогда как снижение всхожести при больших концентрациях токсиканта связано с гибелью семян и увеличением числа проростков с морфологическими дефектами (такие семена не являются всхожими).

Практическое значение работы. Измерение уровня ФКТ у индивидуальных воздушно-сухих семян позволяет характеризовать гетерогенность партии семян и отбирать однородный семенной материал для физио-лого-биохимических исследований, а также освобождать партию пониженного качества от ослабленных и мертвых семян. ФКТ метод позволяет наблюдать за динамикой изменения качества семян под влиянием окружающих условий, выбирать оптимальные условия хранение и прогнозировать сроки последнего. Анализ распределений семян растений, выращенных в разных экологических условиях можно рассматривать как прием биоиндикации среды, в которой росло растение.

Регистрация фосфоресценции эндогенных порфиринов зародыша семени бобовых позволяет проводить прижизненное контролирование возникновения дефицита кислорода у прорастающих семян. В комбинации с другими методами фосфоресценция порфиринов в анаэробных условиях

открывает новые возможности для исследования механизмов биологического действия токсических агентов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Межфакультетской научно-практической конференции "МГУ - сельскому хозяйству", 1982 (Москва); совещании по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме исследования в области биологической физики, 1984 (Пущино-на-Оке); Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии, 1984 (Кишинев); Всесоюзном научном совещании "Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности", 1985 (Минск); Всесоюзном симпозиуме "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", 1986 (Ташкент); Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, 1988 (Алма-Ата); Всесоюзном симпозиуме "Физиология семян", 1988 (Душанбе), V съезде физиологов растений России, 2003 (Пенза), Международном рабочем совещании "Новые достижения в улучшении качества семян", 2003 (Лодзь, Польша).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 стр.

машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (глава II) изложения полученных результатов и их обсуждения (глава III), заключения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 71 отечественных и 72 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность выбранной темы и целесообразность создания нового прижизненного метода оценки качества семян с целью их использования для биоиндикации и биотестирования состояния окружающей среды; сформулированы цели и задачи исследования.

В главе 1, состоящей из шести разделов, представлен обзор приемов диагностики состояния экологических систем, рассматриваются закономерности реагирования организмов на тестовые нагрузки; обсуждаются проблемы использования семян высших растений в качестве тест-объекта в экологических исследованиях, проводится сравнительная оценка различных способов определения их качества, в свете чего приведены известные данные о люминесцентных свойствах биополимеров и семян

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты. Устойчивость семян разных семейств находится в определенной зависимости от места произрастания, ареала распространения и длительности возделывания в тех или иных условиях. Так, представители семейств злаковых по сравнению с бобовыми проявляют обычно большую выносливость. С точки зрения экологии эти различия объясняют тем, что зерновые (пшеница, ячмень, овес, сорго) в основном формировались в аридных районах. У бобовых (бобы, чечевица, соя) исторический процесс приспособления к внешней среде проходил в районах с достаточным увлажнением. Учитывая, что для биотестирования разумно иметь семена с невысокой устойчивостью в работе использовали преимущественно семена растений из семейства бобовых: сои (Glycine max L.) сортов: Букурия, Комсомолка, Адепта, Приморская, Чайка, Мань-цзань-зин, Ван-сей и Бес-сарабка и гороха (Pisitm sativum L.) - Немчиновский, хранившиеся в лаборатории в течение нескольких лет. Отдельные опыты были выполнены на семенах из семейства злаковых: ржи - Вятка, Белозерная,

инбредные линии № 659 и 660) и пшенице (Triticum aestivum L.), а также огурцах из семейства тыквенных и перце

из семейства пасленовых.

1.2. Методы исследования

1.2.1. Всхожесть семян определяли по правилам 1ST А - Международной ассоциации оценки качества семян, 1985.

1.2.2. Влажность семян оценивали весовым способом по правилам ISTA, 1976 (3 навески по 5 г сушили при 105°С).

1.2.3. Ускоренное старение семян сои проводили при 40°С и относительной влажности воздуха 85 или 100%. Семена ржи старили при 37°С и 75%-ной относительной влажности воздуха в течение 7 недель. Состаренные семена подсушивали в комнатных условиях в течение двух недель до постоянного веса, что было необходимо для измерения ФКТ.

1.1.4. Высокотемпературную обработку семян проводили при 60°С после их предварительного содержания в течение нескольких суток в камере со 100%-ной относительной влажностью воздуха.

1.1.5. Выход электролитов во время набухания из индивидуальных семян контролировали по изменению электропроводности дистиллированной воды при помощи осциллотитратора (ОК302, Венгрия). Прибор позволял бесконтактно измерять электропроводность раствора, циркулирующе-

го через камеру с объектом и измерительную ячейку осциллотитратора. Перемещение раствора по замкнутому контуру со скоростью 4,6 л в час обеспечивал перистальтический насос. Рабочий объем жидкости в системе - 5 мл.

1.1.6. Появление свободной воды в набухающих семенах определяли по изменению амплитуды ЯМР сигнала для протонов воды со временем спин-спиновой релаксации Тг более 5 мсек.

1.1.7. Фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом, созданной на кафедре биофизики. Объект освещали импульсами видимого света (6 мс свет, 24 мс темнота) от лампы КГМ-150 с галогенным циклом. В промежутках между импульсами света, через 3 мс после прекращения освещения в течение 15 мс регистрировали послесвечение объекта при помощи фотоумножителя (ФЭУ-79), чувствительного в видимой части спектра. Сигнал от фотоумножителя усиливали (рН-340) и записывали на бумажной ленте КСП-4. Кинетику затухания послесвечения регистрировали на осциллографе с памятью СВ-13.

1.1.8. Спектры возбуждения и излучения послесвечения семян и биопрепаратов регистрировали на двух разных установках.

Одна из них с цилиндрическим фосфороскопом, позволяла регистрировать излучения в интервале времени от 0,5 до 1,5 мс после прекращения действия возбуждающего света ксеноновой лампы ДКСэЛ-1000. Возбуждающий свет разлагали в спектр монохроматором МДР-2, а спектр испускаемого объектом света, измеряли через монохроматор МДР-3. Спектры нормировали на максимальную интенсивность. (Эти измерения были проведены совместно с проф. А.А.Красновским, мл.).

На другой установке с однодисковым фосфороскопом послесвечение измеряли в интервале от 1 до 3 мс после прекращения освещения видимым светом от галогенной лампы КГМ-75 (освещенность объекта 100 Клк). Спектры послесвечения биопрепаратов регистрировали через интерференционный клин (выделенная спектральная ширина щели 10 нм).

1.1.9. Повторность опытов 3-5-кратная. Статистическую обработку результатов при оценке средних значений по выборке проводили с помощью программ статистической обработки данных: определяли средние значения, среднее квадратичное отклонение и дисперсию; использовали корреляционный анализ.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. ПОСЛЕСВЕЧЕНИЕ СУХИХ СЕМЯН И БИОПРЕПАРАТОВ

Послесвечение препаратов животного и растительного происхождения (кости, зубы, высушенные сухожилия, хитин, бумага, порошки белков др.) после облучения солнечным светом или кварцевой лампой известно уже давно [Вессап, 1746; Е.Багшп, 1801; Конев, 1965; Владимиров, 1965]. В 1980 году была обнаружена замедленная люминесценция воздушно сухих семян, возбуждаемая видимым светом (Веселовский и др., 1981). Поскольку природа свечения была неясна, первыми задачами нашей работы было изучение его свойств и выяснение взаимосвязи с качеством семян.

Характеристики послесвечения семян и биопрепаратов. Природа свечения.

При помощи установки с фотоумножителем свечение семян можно наблюдать, начиная от миллисекунд до многих минут после прекращения облучения видимым светом. Сложную кинетику затухания свечения разлагали на несколько компонент, отличающихся временем жизни. При регистрации свечения семян через фосфороскоп (в интервале 3-18 мс) уровень свечения определяют в основном два компонента со временами жизни 2-4 и 15-20 мс. Многокомпонентность послесвечения приводила к нелинейной зависимости свечения семян и биопрепаратов от температуры, представленной в координатах Аррениуса.

Послесвечение биопрепаратов и семян линейно возрастало с интенсивностью возбуждающего света, свидетельствуя о том, что возбуждение эмиттеров послесвечения не является рекомбинационным процессом.

Кислород тушил послесвечение. Эффект был слабо выражен на сухих семян сои (8% на сырой вес). В атмосфере азота свечение возрастало на 810%. При увлажнении семени свечение уменьшалось, но возрастало вдвое после замены воздуха на влажный азот.

Снижение послесвечения при нагревании и увлажнении семян, а также в присутствие кислорода было вызвано уменьшением время жизни компонентов (скорость затухания свечения возрастала).

Спектральные характеристики замедленной люминесценции сухих семян. Спектры излучения сухих семян и биопрепаратов (порошки аминокислот, белков, целлюлозы и простых Сахаров) имели вид широких

слабо структурированных полос в области 450-800 нм (рис. 1). Максимум в спектре возбуждения послесвечения располагался в области 350 - 380 нм.

Поскольку спектры послесвечения семян при комнатной температуре сдвинут в сторону больших длин волн по отношению к спектрам флуоресценции, то это означает, что послесвечение не является замедленной флуоресценцией. На это же указывала и отрицательная температурная зависимость послесвечения.

Анализ спектров испускания свечения целлюлозы и целлюлозы с адсорбированным на ней красителем эозином показал, что имеет место миграции энергии возбуждения с молекул целлюлозы на триплеты красителя. Послесвечение сухой смеси порошка семян с КВг, который увеличивает вероятность синглет-триплетных переходов (Теренин, 1967), в 3-5 раз превышало свечение порошка без КВг.

Рисунок 1. Спектры замедленной люминесценции (1), флуоресценции (3) и спектр возбуждения (2) воздушно-сухих семян сои. Спектр фосфоресценции набухающих семян сои (4).

На основании выше приведенных фактов было предположено, что послесвечение семян, возбуждаемое видимым светом, представляет собой фосфоресценцию, определяемую триплетными состояниями присутствующих в них хромофорных группировок. Природа этих хромофоров не исследовали, но появление или усиление их излучательной способности, по-видимому, обусловлено образованием водородных связей между молекулами. Малополярные органические растворители (диэтило-вый эфир, пентан и др.), неспособные разрушать водородные связи, слабо влияли на свечение сухих препаратов, тогда как вода эффективно тушила свечение.

Послесвечение семян вероятнее всего является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ), сопровождающей дезактивацию триплет-ных состояний многих органических соединений, адсорбированных на твердых и порошкообразных подложках (Parker et. al, 1980).

Важно отметить, что свечение сухих семян отличается от описанной

9

120

250 350 450 550 650 750 850 Длина волны, нм

ранее (Конев, 1965) фосфоресценции ароматических аминокислот и белков, возбуждаемой ультрафиолетом с длиной волны меньше 300 нм

Взаимосвязь ФКТ семян с их качеством

Зависимость послесвечения семян от их влажности. Послесвечение семян при увлажнении затухает (рис.2). Увеличение содержания воды в семенах на 2-3% уменьшает уровень послесвечения более чем втрое. Этому факту можно дать следующее объяснение.

Рисунок 2. Зависимость уровня послесвечения семян сои, пшеницы, ячменя, ржи и гороха от влажности

(1). В полулогарифмических координатах зависимость спрямляется

(2).

Уровень фосфоресценции определяет подвижность молекул-эмиттеров и доступность последних для молекул кислорода - тушителя триплетных состояний. В сухих препаратах адсорбированное на подложке вещество - излучатель при помощи водородных связей образует с подложкой жесткую структуру, что позволяет наблюдать фосфоресценцию без охлаждения образцов (Parker et al., 1980]. В присутствии молекул воды, которые конкурируют за водородные связи, контакт молекулы-эмиттера с подложкой ослабляется, молекулярная структура «размягчается» - увеличивается ее подвижность, время жизни фосфоресценции уменьшается. Кроме того молекулы воды, «разрыхляя» структуру, облегчают доступ кислорода к три-плетно-возбужденным молекулярным-эмиттерам и инактивируют их. По-видимому, в сухом семени имеет место похожая ситуация: хромофоры-эмиттеры иммобилизованы на безводных клеточных структурах - подложках, контакт с которыми нарушается молекулами воды.

Оценка влажности воздушно-сухих семян и биопрепаратов. Основываясь на зависимости ФКТ биопрепаратов и семян от влажности, нами был предложен чувствительный метод оценки влажности этих объектов. Фосфоресцентный метод позволял определить разницу в содержании воды в 0,1-0,2% в интервале влажностей объекта от 6 до 20 %. В этой об-

ласти влажностей биообъектов подобной разрешающей способностью не обладают известные нам оптические и электрические методы. Обычно последние имеют хорошую чувствительность в случае содержания в образце около 30-40% воды

Важно, что определение влажности методом ФКТ можно проводить без нарушения целостности семени и периодически контролировать этот показатель в процессе хранения семян и после различных воздействий.

Взаимосвязь между уровнем ФКТ и всхожестью семян. Ранее [Боч-варов и др., 1984] было установлено, что жизнеспособные семена светятся в 2-3 раза слабее по сравнению с семенами, потерявшими всхожесть. На 8 сортах семян сои мы проконтролировали изменение уровня послесвечения в процессе многолетнего хранения (рис. 3).

Рисунок 3. Изменение всхожести (1) и уровня ФКТ (2) воздушно-сухих семян сои восьми сортов при естественном старении.

Через 4-5 год хранения, когда семена сои уже не прорастали, уровень их ФКТ более чем вдвое, превышал свечение семян из партий с 94-100%-ной всхожестью.

Аналогичный результат был получен в опытах, в которых для снижения всхожести семян сои и ржи использовали процедуру ускоренного старения (рис.4).

Рисунок 4. Соотношение между всхожестью и уровнем ФКТ для семян сои (1) и ржи (2) при ускоренном старении.

Семена экспонировали разное время при температуре 40°С и 100% относительной влажности воздуха. Полная потеря всхожести также сопровождалась двух-трех кратным увеличением интенсивности ФКТ. Между логарифмом уровня ФКТ и всхожестью семян сои и ржи наблюдали линейную зависимость с коэффициентами корреляции -0,96 и -0,92, соответственно.

О причине возрастания ФКТ семян при старении.. Линейная взаимосвязь между логарифмом уровня ФКТ, влажностью семян и их всхожестью поставила вопрос, почему один показатель - уровень ФКТ, одинаково зависит от влажности и всхожести семян? Такое возможно лишь в случае, если снижение всхожести семян сопровождается уменьшением их влажности. Результаты параллельного определения ФКТ, содержания воды в семенах и их всхожести (табл. 1) подтвердили это предположение.

Таблица 1. Всхожесть, влажность и ФКТ семян сои 'Букурия' разных лет урожая.

Всхожесть, % Содержание воды, % сырого веса ФКТ, отн.ед.

97 7,91 ±0,02 48,3 ±2,0

81 7,65 + 0,02 58,9 ±2,3

53 7,20 ±0,03 82,2 + 3,7

41 6,98 ±0,04 94,1+4,3

14 6,42 ±0,05 132,3 ±4,8

0 6,16 ±0,05 152,2±%.3

Разница между влажностью жизнеспособных и нежизнеспособных семян составляет приблизительно 2% (см. таблицу 1). Поскольку в сухом семени практически вся вода находится в связанном состоянии, то потеря семенем жизнеспособности при хранении сопряжена с уменьшением на четверть гидратации биополимеров в клетках.

Необходимо отметить, что, как показано в работе Бочварова и др.(1983), при старении семени в равной степени возрастает свечение как целых семян сои, так и их фрагментов (семядолей и зародышевых осей). То есть при старении в равной степени происходит дегидратация разных тканей семени.

Анализ гетерогенности партии семян методом ФКТ

Построение распределений семян по уровню ФКТ. Приведенные выше средние данные о росте ФКТ у семян не решает вопрос о том, вызвано ли оно постепенным ухудшением качества каждого семени или накоплением в партии нежизнеспособных семян, для которых характерен высокий уровень свечения. Чтобы прояснить ситуацию измеряли свечение индивидуальных семян и строили распределения семян по уровню ФКТ. Тесная взаимосвязь между уровнем свечения семени и их влажностью позволяет утверждать, что распределение семян в партии по уровню ФКТ фактически является распределением семян по влажности

Рисунок 5. Распределения по уровню ФКТ семян сои сорта 'Букурия' разных лет урожая: 1982, 1981, 1980 и 1977г Регистрация ФКТ в 1982 г

Из рисунка 5 видно, что распределение семян сои из партии со 100%-ной всхожестью (урожай 1982 г) имеет вид близкий к нормальному с небольшой дисперсией - 8,7. В распределении семян урожая 1981 года, у которых всхожесть снизилась до 72%, появился второй максимум Распределения семян из партий с низкой всхожестью (42, 10 и 0%) сдвинуты в сторону более высоких интенсивностей ФКТ и имеют больше значения дисперсии (для них дисперсии составляют 15; 18,3 и 27,2, соответственно) Таким же образом изменялись распределения семян сои и ржи в процессе потери всхожести, имевшей место при ускоренном старении.

Анализ большого числа распределений семян по уровню ФКТ позволил заключить, что в процессе снижения всхожести семян происходит не «уширение» нормального распределения, а появление в исходной однородной партии семян качественно новых фракций. В партиях семян разного качества фракция всхожих семян имела такой же средний уровень свечение, что и семена из партии со 100%-ной всхожестью. Фракция мертвых семян по уровню ФКТ всегда была смещена в сторону больших интенсивностей по сравнению со свечением всхожих семян. Семена с промежуточ-

ным уровнем ФКТ либо не прорастали, либо могли оказаться невсхожими, так как образующиеся проростки имели морфологические дефекты. Результат в большой степени зависел от условий проращивания.

Факт возникновения отдельных (дискретных) фракций в пробах семян при постепенном снижении всхожести был многократно воспроизведен позже в опытах с разными видами семян (подсолнечник, сосна, пшеница, горох и др.), а также подтвержден независимыми измерениями другими методами [Веселова и др., 1995, 2002, Леонова и др, 1999].

Анализ распределений семян по уровню ФКТ дает возможность еще до проращивания установить направленность изменения качества партии семян под действием внешнего фактора.

На рисунке 6 представлены результаты воздействия на сухие семена пшеницы электрического поля коронного разряда и лазерного облучения на семена огурцов. Опыты проводили с целью показать, что при определенной дозе эти факторы увеличивают всхожесть семян. Предварительный анализ ФКТ-распределений показал, что под влиянием электрического поля коронного разряда и лазерного облучения семена переходили из фракции II с большим уровнем ФКТ во фракцию I с меньшим уровнем ФКТ (распределение смещается влево). Это означало, что всхожесть обработанных в сухом виде семян должна возрасти. Проращивание семян подтвердило предположение (около кривых указана всхожесть в процентах).

0 10 20 30 0 20 40 60 80 100

ФКТ, отн ед ФКТ, отн ед

Рис. 6. Распределения воздушно-сухих семян пшеницы и огурцов по уровню ФКТ до (1) и после (2) воздействия, увеличивающего всхожесть. Сухие семена пшеницы обработаны электрическим полем коронного разряда (0,5 с, 2 кВт/см2) Сухие семена огурцов облучены гелий-неоновым лазером (632,5 нм, 0,3 мВт/см2,100 имп по 50 мкДж/см2)

Распределение семян по уровню ФКТ, а, следовательно, и качество семян, зависит от условий выращивания растения. Если семена перца сорта Агаповский испытывали при прорастании холодовой стресс, то семена нового урожая, судя по ФКТ распределениям, имели худшее качество по сравнению с семенам, которые не испытывали стресса. (Рис. 7А). При этом всхожесть семян из растений, испытавших холодовой стресс была 24% в то время как из растений, не подвергавшихся стрессу - 87%.

Рисунок 7. Распределение по уровню ФКТ воздушно сухих семян перца сортов Агаповский (А) и Здоровье (Б) из плодов растений, которые во время проращивания подвергались холодовому стрессу (10°С в течение 10 суток) (А, кривая 2); росли на зараженном грибами фоне или в открытом грунте (Б): кривые 1 - семена из плодов растений, произраставших в оптимальных условиях (25°С, здоровый фон).

Распределение по уровню ФКТ семян растений перца сорта Здоровье, выросших на зараженном грибами фоне, резко отличалось от контрольных в худшую сторону (Рис. 7Б). По виду этого распределения можно предположить, что всхожих семян будет мало, поскольку в распределении практически отсутствует максимум, относящийся к всхожим семенам. В группу семян, имеющих низкую интенсивность ФКТ (максимум 5 отн.ед.), по-видимому, входят незрелые семена. В группу (фракцию) семян с максимумом при 35 отн.ед. входят семена, производящие, как правило, ненормальные проростки, а в группу с высоким уровнем ФКТ (>60 отн.ед) - мертвые семена. Действительно, проращивание показало, что всхожесть контрольных семян была 94%, в то время как при выращивании в открытом грунте 32%, а росших на зараженном грибами фоне - 15%.

Метод регистрации ФКТ позволяет выделить из партии семян фракции, в которой содержатся семена близкие по устойчивости. Рисунок 8 по-

называет, что таким образом можно увеличить чувствительность семян к

Рисунок 8. Влияние тепловой обработки (40 и атмосферная влажность 100%) на всхожесть нефракционированной партии семян сои сорта Букурия и выделенных фракций и

При экспонировании семян при 40° всхожесть семян второй фракции экспоненциально снижается и уменьшается за сутки вдвое, тогда как у семян первой фракции она не меняется в течение 4-х дней и затем быстро по 8 -образному закону падает. Всхожесть не фракционированных семян постепенно снижется в течение 6 суток.

2.2. ПОСЛЕСВЕЧЕНИЕ НАБУХАЮЩИХ СЕМЯН КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ИХ СОСТОЯНИЯ

Послесвечение семян при увлажнении уменьшается При содержании в семени около 20% воды не может быть зарегистрировано. Однако, через 10-12 часов набухания у семян бобовых (соя, горох) свечение возобновляется и может в 5-10 раз превышать уровень свечение воздушно-сухих семян.

Излучение набухающих семян располагается в красной области спектра и имеет четыре характерные максимума (рис. 1). В спектре возбуждения послесвечения присутствует максимум при 560 нм На основании спектральных характеристик послесвечение набухающих семян было предположено, что излучение являются фосфоресценцией не содержащих металл порфиринов, которые образуются при распаде молекул хлорофилла

Поскольку фосфоресценцию порфиринов можно наблюдать только при низком содержании кислорода в среде (при давлении кислорода меньшем, чем 10"3мм рт ст., Теренин, 1967), то у набухшего семени све-

воздействию температурного фактора.

0 2 4 6 8

Время тепловой обработки, сутки

титься могут только те его части, которые находятся в условиях гипоксии. На воздухе влажные оболочка, семядоли и зародышевая ось семени сои свечением не обладали. Свечение целого семени исчезало после нарушения целостности семенной оболочки. У таких "потухших" семян свечение можно было восстановить, поместив их в атмосферу азота или в воду, из которой при помощи ИагБОз был удален кислород. В бескислородной среде послесвечением обладали все фрагменты семени.

Таким образом, свечение у целых набухших семян возникает после того как под оболочкой семени создается дефицит кислорода. Гипоксиче-ские условия могут возникнуть при условии, что зародыш семени поглощает кислорода больше, чем его диффундирует через семенную оболочку. Последняя является мощным барьером на пути кислорода к зародышу (Rolletschek et.al.,2002).

Это предположение подтверждают данные, представленные на рис. 9. После нескольких дней набухания семян при комнатной температуре в атмосфере воздуха со 100%-ной относительной влажностью, когда содержание воды достигло 18%, методом ЯМР (спин - эхо) в тканях была зарегистрирована свободная вода. Одновременно резко увеличились потребление семенами кислорода и интенсивность фосфоресценции.

Рисунок 9. Влияние влажности семян на скорость поглощения кислорода (1), фосфоресценцию порфи-ринов (2) и содержание свободной воды в семенах сои по величине амплитуды Т2 ЯМР(З).

Если дыхание семян сои инги-бировали путем их замачивание в растворе цианида натрия в течение 20-30 мин., то нарастание уровня фосфоресценции при набухании сои происходило вдвое медленнее по сравнению контрольными семенами. Напротив, экспонирование семян при повышенных температурах 40 - 60° ускоряло развитие гипоксического состояния (рис. 10 и 11) При высоком уровне фосфоресценции порфиринов семена не прорастали. У семян без оболочки падение всхожести задерживалось. Это означает, что гипоксия может быть одной из причин потери семенами сои жизнеспособ-

ности при набухании Известно, что анаэробиоз у семян бобовых наряду с механическими повреждениями на первых этапах поглощении воды являются главными причинами гибели семян при набухании (Duke, Kakefuda, 1981)

Рисунок 10 Фосфоресценция порфири-нов (3) и всхожесть нативных (1) и скарифицированных (2) семян сои в зависимости от времени тепловой обработки при 60° С

Рисунок 11 Фосфоресценция порфири-

нов (2) и всхожесть семян сои (1) в зависимости от времени экспонирования последних при 40°С и 100%-ной относительная влажность воздуха

От уровня кислородного дефицита во время проращивания семян зависит качество проростков (рис 12) В опытах использовали семена гороха

первой и второй фракций, выбранные по уровню ФКТ, то есть в пробах не было исходно мертвых семян

Рисунок 12 Распределение семян гороха по уровню фосфоресценции норфиринов и качество проростков нормальные проростки (1), ненормальные (2) и задохнувшиеся во время проращивания (3)

Нормальные проростки вырастали из семян с минимальным уровнем фосфоресценции порфиринов (1 фракция сухих семян), из семян со сред-

ним и максимальным уровнем фосфоресценции (II фракция сухих семян) получались ненормальные проростки или семена задыхались и погибали.

Таким образом, путем регистрация фосфоресценции эндогенных пор-фиринов у набухающих семян можно контролировать развитие состояния гипоксии 1П vivo. В свою очередь это позволяет прояснить причину потерю или симуляцию всхожести семян под влиянием токсического фактора. В качестве примера рассмотрим результаты опыта, в котором семена гороха набухали в воде с разным содержанием парахлормеркурий бензоата (таблица). Это соединение является ингибитором тиогрупп белков и ферментов. В малых концентрациях реактив блокирует аквопориновые каналы и тормозит поступление воды в клетки (Maurel, 1997). Ингибитор в концентрации 5 мкМ замедлял скорость набухания семян гороха второй фракции до уровня поглощения воды хорошими семенами 1-ой фракции. Из таблицы 2 видно, что замедление набухания семян уменьшает число семян, погибающих на первой фазе набухания в результате механических повреждений клеток и увеличивает количество нормальных проростков.

Таблица 2. Влияние ПХМБ на набухание семян и соотношение нормальных, ненормальных проростков и ненаклюнувшихся семян.

Показатели Концентрация ПХМБ, мкМ

0 0,1 1,0 5,0 10,0 50,0 100.0

Среднее увеличение веса семян* 71±6 60±6 5616 50±4 4815 5216 50±5

Нормальные проростки, % 47±3 55±4 63±4 67±4 52±5 35±5 31±4

Ненормальные проростки, % 16±3 1313 1514 18±3 2714 3914 4013

Задохнувшиеся семена, % 21±3 18±4 14+4 8±2 12±3 14±4 11±2

Мертвые семена, % 1б±4 1415 813 7±3 9±3 12±3 18±3

* - 20 ч набухания

При высоких концентрациях токсиканта (более 10 мкМ) уменьшение числа нормальных проростков было вызвано в основном ростом количества ненормальных проростков (семян с нарушенным процессом клеточного деления). Парахлормеркурий бензоат заметно не влияет на число семян, страдающих от недостатка кислорода, что видимо, как и в случае цианида натрия, было обусловлено задержкой дыхания.

Таким образом, совместное использование методов регистрации ФКТ воздушно-сухих и фосфоресценции эндогенных порфиринов у набухающих семян позволяет не только оценить величину и направленность эф-

фекта воздействий, но и говорить о причинах снижения или стимуляции всхожести семян. Результаты работы подсказывают, что для биодиагностики целесообразно из популяции отбирать семена второй фракции. Эти ослабленные семена являются более чувствительными, по сравнению с высококачественными семенами первой фракции: при малых стимулирующих дозах воздействиях именно они ответственны за улучшение всхожести и, напротив, большое воздействие быстрее ведет к гибели таких семян.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Контроль состояния окружающей среды с использованием живых организмов основан на анализе поведения последних. Реакция организма на градуально возрастающий по величине фактор не является линейной. В зависимости от силы воздействия знак ответа может изменягься. Различают двухфазный (фармакологическая инверсия, гормезис; Кузин, 1995) и трехфазный (парадоксальная реакция; Александров, 1985) ответы. При парадоксальном ответе стимулирующему действию малой дозы предшествует ингибирование жизнедеятельности живой системы. Характер ответа зависит от устойчивости организма и его функционального состояния. Из-за неодинаковой чувствительности индивидуумов в популяции характер ее ответа на воздействие может быть сложным и плохо предсказуем.

Популяция семян представляет гетерогенное образование, в котором, как считают многие исследователи, семена по свойствам распределены нормально (Roberts, Abdalla, 1968; Ellis et al.,1982). Однако в настоящей работе показано, что распределение семян по уровню ФКТ унимодально лишь в партии с 95-100% всхожестью. В партиях с более низкой всхожестью путем регистрации ФКТ индивидуальных семян можно выделить дискретные фракции, отличающиеся по качеству. Существование отдельных фракций показано также по выходу электролитов из набухающих семян и длине осевых органов (Веселова и др., 1999)

Предложенный в работе люминесцентный метод сортировки воздушно-сухих семян позволяет проводить выбраковку семян низкого качества, повышающую всхожесть семенного материала. Метод нужен для предварительного формирования однородных проб семян (отбор фракций), которые целесообразно использовать при биотестировании и физиолого-биохимических исследованиях. На фракционированных методом ФКТ семенах сои показано, что использование более чувствительной части попу-

ляции семян ускоряет определения опасности термического воздействия (рис. 8).

Построение распределений индивидуальных семян по уровню ФКТ позволило наблюдать факт ухудшения качества семян у растений, перенесших холодовой стресс на фазе прорастания семян и в случае культивирования растений на зараженном фоне (рисунки 7-А, Б). Эти возможности метода помогают в оценке неблагоприятных экологических условий во время роста растения.

Уровень ФКТ семян в основном определяется содержанием в них воды. Неодинаковое свечение семян означает, что они отличаются по влажности и по этому показателю группируются в качественно разные фракции. Конечно, не само содержание воды определяет качество семени. Изменение равновесной влажности индивидуальных семян свидетельствует о том, что ухудшение качества семени при старении или повреждении сопровождается такой модификацией клеточных мембран и биополимеров, при которой снижается их способность к гидратации. Это и приводит к возрастанию уровня послесвечения.

Метод ФКТ фиксирует последействие внешнего фактора Для установления нового уровня равновесной влажности требуется сутки и более, как в случае воздействия на семена электрического поля коронного разряда или лазерного облучения (рис. 6).

Обнаруженное нами явление свечения набухающих семян бобовых, обусловленное фосфоресценцией эндогенных порфиринов в условиях дефицита кислорода, позволяет рекомендовать данный феномен для исследования состояния гипоксии in vivo не только у прорастающих семян, но и в любых тканях растительного организма. Появления фосфоресценции у семян бобовых, экспонируемых при повышенной температуре и влажности, свидетельствует в пользу точки зрения, согласно которой механизм потери семенами жизнеспособности при ускоренном старении отличается от такового при старении семян в сухом состоянии.

Регистрация фосфоресценции порфиринов показала, что причиной стимуляции всхожести семян гороха под влиянием малых количеств токсиканта (явление гормезиса) является уменьшение количества семян в популяции, страдающих от дефицита кислорода во время набухания.

выводы

1. Исследованы закономерности возбуждаемого видимым светом (максимум 390 нм) послесвечения разных видов семян и биопрепаратов при комнатной температуре. Свечение в миллисекундной области имеет два максимума 540 и 620 нм и представляет собой фосфоресценцию, которая активно тушится водой.

2. Предложено по уровню фосфоресценции определять влажность биопрепаратов и семян без разрушения последних при содержании воды от 4 до 20%. Метод позволяет определять разницу во влажности объектов в 0,1-0,2%.

3. Между логарифмом уровня послесвечения семян и их всхожестью установлена корреляция (коэффициент корреляции -0,92 - -0,98). Показано, что взаимосвязь обусловлена уменьшением содержания воды в семенах при снижении качества (старении).

4. Построение распределений воздушно-сухих семян по уровню послесвечения из партий разной всхожести позволило выделить три дискретные фракции. Из семян фракции I вырастают преимущественно нормальные проростки; среди проростков из семян фракции П преобладают проростки с морфологическими дефектами, а также семена, погибающие от гипоксии; фракция III содержит мертвые семена. Предложено при биотестировании использовать более чувствительную к внешним факторам фракцию II популяции семян.

5. Обнаружено явление послесвечения семян при набухании. Установлено, что свечение представляет собой фосфоресценцию эндогенных порфиринов в анаэробных условиях. Анаэробиоз под оболочкой семени возникал как результат активного дыхания зародыша и медленной диффузии кислорода через оболочку. По уровню фосфоресценции можно контролировать глубину гипоксии в растительных тканях in vivo, a также судить о степени токсичности агентов внешней среды.

6. Показано, что распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ зависит от условий выращивания растений. На основании анализа таких распределений можно судить об экологических условиях во время вегетации растения.

Список публикаций по теме диссертации

1. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Маренков B.C., Рубин А.Б., Козарь В.И. 1982. Радикалорекомбинационная люминесценция семян растений и пути практического ее использования. Тез. докл. межфакультетской научно-практической конференции МГУ - сельскому хозяйству. М. С. 140-141.

2. Веселовский ВА, Веселова Т.В., Козарь В.И. 1984. Роль кислорода в процессе ускоренного старения семян. Тез. докл. Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии. Кишинев. С. 106.

3. Козарь В.И., Веселова Т.В., Веселовский ВА 1984. Замедленная люминесценция как показатель состояния семян в процессе ускоренного старения. Тез. докл. Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии. Кишинев. С. 107.

4. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И., Бочваров П.З. 1985. Оценка изменения жизнеспособности семян сои при хранении методом замедленной люминесценции. Сельхоз.биология, № 6. С. 76-79.

5. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И. 1985 О замедленной люминесценции набухающих семян сои. Сельхоз.биология, № 10. С. 57-61.

6. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Kozar V.I., Rubin A.B. 1988. Delayed luminescence of soybean seeds during swelling and accelerated ageing. Seed Sci and Technol. 16. P. 105-113.

7. Веселова T.B., Веселовский В.А., Козарь В.И. 1988. Люминесцентный способ оценки качества семян. Тез. докл. Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур. С.53.

8. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И. 1990. Люминесцентный метод определения влажности и жизнеспособности семян. В сб.: Физиология семян. Формирование, прорастание, прикладные аспекты. Душанбе, с. 276-280.

9. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Усманов П.Д., Усманова О.В., Козарь В.И. 2003. Гипоксия и повреждения при набухании стареющих семян. Физиология Растений, Т. 50, № 6 930-937.

10. Козарь В.И., Веселова Т.В., Веселовский ВА 2003. Контроль состояния семян люминесцентным методом. Тез. Докл. V Съезда Общества Физиологов Растений России. Пенза, 15-20 сентября 2003. С.401.

11. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Kozar V.I. 2003. Room temperature phosphorescence as a marker of seed quality. In: International Workshop on Applied Seed Biology "New Development in Seed Quality Improvement", Book of Abstracts, p.57-59.

12. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Kozar V.I. 2003. Hypoxia in germinating legume seeds. In: International Workshop on Applied Seed Biology "New Development in Seed Quality Improvement", Book ofAbstracts, p. 95-97.

Козарь Виктор Иванович (Россия) Разработка и применение люминесцентного метода для экологического анализа качества семян

Семена высших растений можно использовать для биомониторинга состояния среды и тестирования присутствия токсикантов. Установлено, что длительное послесвечение воздушно-сухих семян является фосфоресценцией при комнатной температуре, а свечение набухающих семян фосфоресценцией эндогенных порфиринов в анаэробных условиях. ФКТ позволяет оценить качество сухих семян (без проращивания) и его изменение в зависимости от условий среды произрастания растения. Фосфоресценция порфиринов является прижизненным методом наблюдения реакции прорастающего семени на токсиканты.

Kozar Viktor Ivanovich (Russia) The development and application of luminescence method for ecological analysis of seed quality

The seeds of higher plant may be used for environment monitoring and testing of toxicant present. It is established that 1) the delayed light emission of air-dry seeds represents the room temperature phosphorescence (RTP); 2) the delayed light emission of imbibed seeds represents the endogenous porphyrin phosphorescence under anaerobic conditions. RTP allows determination the quality of dry seeds (without germination) and its changes in dependence of plant growth environment. Porphyrin phosphorescence is a method for determination in vivo of germination seed response to toxicants present in the medium.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 тираж 100 экз. Подписано в печать 18.05.2005 г.

Ы "

^A-tíi/ísc* s

ъ.

^'ÎJfSf»

У

231

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козарь, Виктор Иванович

ВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Приемы диагностики состояния экологических 11 систем

1.1.1 Индикация состояния почвы.

1.1.2 Анализ загрязнения гидросферы.

1.2. Закономерности реагирования организмов на тестовые нагрузки.

1.3. Семена высших растений как тест-объект для биоиндикации и биотестирования.

1.3.1. Ухудшение жизнеспособности семян при хранении.

1.3.2. Факторы, определяющие сроки хранения семян.

1.3.2.1. Неблагоприятные условия созревания.

1.3.2.2. Генетические факторы.

1.3.2.3. Условия хранения.

1.3.3. Физиолого-биохимические изменения у стареющих семян.

1.3.4. Свободные радикалы и перекисное окисление липидов как главная причина старения семян.

1.4. Способы определения качества семян.

1.4.1. Влажность семян.

1.4.2. Всхожесть семян.

1.4.3. Жизнеспособность семян.

1.5. Люминесцентные свойства биополимеров и семян

1.6. Резюме.

II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

11.1. Объекты.

11.2. Методы исследования

11.2.1. Всхожесть семян.

11.2.2. Ускоренное старение.

11.2.3. Тепловая обработка.

11.2.4. Влажность семян.

11.2.5. Выход электролитов.

11.2.6. Измерение поглощения кислорода.

11.2.7. Регистрация послесвечения воздушно-сухих и набухающих семян.

11.2.8. Регистрация спектров послесвечения при комнатной температуре.

11.2.9. ЯМР-определение содержания свободной воды в семенах.

11.2.10. Статистическая обработка результатов

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

111.1. Послесвечение воздушно-сухих семян.

111.1.1. Кинетика затухания послесвечения.

111.1.2. Зависимость послесвечения от интенсивности возбуждающего света.

111.1.3. Зависимость послесвечения от температуры

111.1.4. Спектральные характеристики послесвечения сухих семян и биополимеров.

111.1.5. Влияние растворителей на послесвечение биопрепаратов.

111.1.6. Зависимость послесвечения семян и порошков веществ от их влажности.

111.1.7. Механизм послесвечения семян (рабочая гипотеза)

111.2. Зависимость ФКТ семян от их качества

III.2.1. Взаимосвязь между уровнем ФКТ воздушносухих семян и их всхожестью.

111.2.2. Оценка влажности воздушно-сухих семян методом ФКТ.

111.2.3. О причине возрастания ФКТ семян при старении .д

111.3. Анализ гетерогенности партии семян методом

111.3.1. Построение распределения семян по уровню ФКТ.

111.3.2. Фракционирование семян по качеству методом ФКТ.

111.4. ФКТ — анализ влияния физических факторов на сухие семена. 8(

III.5. ФКТ — определение качества семян у растений, выращенных в неблагоприятных экологических условиях.

III.6. Послесвечение прорастающих семян.

111.6.1. Спектральные характеристики свечения набухающих семян

111.6.2. Послесвечение и анаэробное состояние у набухающих семян бобовых.

III.7. Контроль состояния семян во время прорастания по уровню фосфоресценции эндогенных ]qq порфиринов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение люминесцентного метода для экологического анализа качества семян"

Для современного состояния окружающей среды характерно постоянно нарастающее техногенное давление на тропосферу, гидросферу, водные и почвенные экосистемы. По мнению академика A.B. Яблокова (1992), «.критическое экологическое состояние нашей страны в ближайшие годы перейдет в катастрофическое и может стать причиной социально-экономического неблагополучия». Уменьшение и регулирование техногенного воздействия, экологизация производства и оптимизация природопользования - проблемы, требующие современного научного обоснования.

Прямая объективная оценка качества окружающей среды основана на анализе поведения биоты, поскольку опасность любого фактора — это, прежде всего, биологическая характеристика (Сборник «Комплексные методы контроля качества природной среды», 1986). В отличие от приемов аналитической химии биологические подход выявляет интегральную опасность компонентов среды.

О реакции биоты на внешнее воздействие обычно судят по изменению средних значений параметров совокупности организмов, полагая, что распределение организмов в популяции по изучаемому признаку является нормальным. Однако на основании среднестатистических данных не всегда однозначно можно ответить на вопрос, обусловлены ли регистрируемые изменения популяции пороговой чувствительностью отдельных организмов, или воздействие изменяет качественный состав всех особей популяции одновременно. Устойчивость популяции к внешним воздействиям выше, чем отдельных организмов (Гродзинский, 1972), и потому в зависимости от состава популяции тестируемая опасность изучаемого фактора может варьировать.

Биологические методы допускают использование в качестве тест объектов различные организмы и определение любых удобных показателей состояния биологического объекта. Семена высших растений с практической точки зрения удобны в качестве тест-объекта, поскольку в сухом состоянии они долго остаются жизнеспособными. Однако их использование может показаться нелогичным. Воздушно-сухие семена находятся в анабиозе (ангидробиозе), а хорошо известно, что в этом состоянии создается значительная устойчивость организмов к внешним воздействиям, которые те же организмы в жизнедеятельном состоянии не выдерживают. Сухие семена устойчивы к высоким и низким температурам, действию безводных органических растворителей, токсическим газам (за исключением кислорода), ионизирующей и УФ радиации (Голдовский, 1986).

Но во время формирования семян, а также в фазу набухания и появления проростков устойчивость семян заметно снижается. Неблагоприятные условия внешней среды во время созревания семян могут вызывать у них глубокие физиологические и биохимические изменения. Поэтому качество и жизнеспособность семян свидетельствуют об условиях, в которых формировались семена на материнском растении (Реймес, 1983).

Хорошо известно, если набухающие семена подвергнуть действию высокой или низкой температуры, засолению, интоксикации и другим факторам, то прорастание семян ухудшается. Эта закономерность лежит в основе испытания биологической опасности различных агентов, а также устойчивости растений к этим факторам (Генкель, 1968; Удовенко, 1977; Кузин, 1995; Николаева и др., 1999).

В процессе длительного хранения характеристика семян постепенно ухудшается, они «стареют», качественный состав популяции семян изменяется. Однако, для биотестирования важен как качественный состав партии семян, так и качество отдельного семени.

Проверяют состояние семян проращиванием, но это медленный процесс и осуществим единожды. Рекомендуемые Международной ассоциацией оценки качества семян - ISTA (1976) экспресс методы определения состояния семян (окрашивание витальными красителями, восстановление солей тетразола, учет скорости утечки электролитов при набухании и некоторые другие физико-химические приемы), тоже не решают проблемы, так как связаны с частичным или полным разрушением семени, что исключает дальнейшее использование последнего, как индивидуального носителя информации в процессе онтогенеза растения, полученного из этого семени.

Из этих очевидных фактов следует, что для целей биотестирования важно иметь такой метод, с помощью которого можно было бы многократно определять качество семян еще до проращивания, не нарушая их нативного состояния. Этот прием позволил бы проследить динамику изменения качества воздушно-сухих семян в зависимости от влияющих на качество семян факторов и отбирать из конкретной популяции семена с близкими характеристиками, что также существенно для определения физиолого-биохимических изменений у подвергнутых испытанию семян.

На кафедре биофизики биологического факультета МГУ в 1980 году было обнаружено явление длительного послесвечения воздушно-сухих семян разных растений, возбуждаемое видимым светом. Соискателем впервые зарегистрировано свечение нативных набухающих семян, которое тоже возбуждается, как и свечение воздушно-сухих семян, видимым светом. Данная работа посвящена выявлению природы этих свечений и созданию на основе этого явления прижизненного метода оценки качества семян с целью использования последних для биоиндикации и биотестирования состояния окружающей среды.

Разработка нового метода предполагала решение следующих задач:

1. определение основных характеристик послесвечения воздушно-сухих и набухающих семян и на их основании формулирование гипотезы о природе свечения;

2. исследование взаимосвязи послесвечения семян с их качеством (влажность, всхожесть и жизнеспособность);

3. выяснение характера распределений семян в партиях по уровню послесвечения и исследование влияния факторов среды на вид распределений;

4. необходимо было продемонстрировать приемы использования послесвечения семян для диагностики состояния внешней среды.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современное экологическое состояние территории нашей страны можно определить как критическое. К зонам экологического бедствия относятся 16% общей площади. Вследствие огромной концентрации тяжелой промышленности, в том числе оборонной, на территории Южного и Среднего Урала скопилось радиоактивных отходов от производства ядерного оружия в сотни раз больше, чем было выброшено во время аварии на Чернобыльской АЭС. Велика вероятность поражения этими отходами территории, на которой проживает до 10 миллионов человек.

Сверхинтенсивное сельскохозяйственное загрязнение Краснодарского края привело к тому, что когда-то самое богатое по уловам на единицу площади Азовское море полностью потеряло рыбо-хозяйственное значение, а огромные территории превратились в промышленные пустоши.

В Центрально-башкирском районе нефтеразрабатываю-щей и химической промышленности, имеющем огромный уровень загрязнения среды, зарегистрирована новая детская болезнь - дети-тикеры (дети с постоянно дергающимися конечностями). Таким же уровнем загрязнения от угольной, химической и других отраслей промышленности отличается Кемеровская область. В реки и озера северной части Тюменской области ежегодно выливается нефти больше, чем ее попадает в мировой океан. Зарево от сжигаемого на тысячах скважин попутного газа видно из космоса. К числу перечисленных регионов следует добавить бассейн Волги и Ладожского озера (индустриальное и сельскохозяйственное загрязнения), Нижний Амур и многие другие.

40% населения страны живет в экологически неблагоприятных условиях. Несмотря на принимаемые меры, уровень загрязнения непрерывно растет. Сокращается естественное плодородие почв, миллионы гектаров ежегодно выбывают из сельскохозяйственного оборота в результате эрозии, засоления и подтопления. Сокращается площадь лесов. Согласно статистике ежегодно лес вырубается примерно на территории, на которой должно происходить его восстановление. Однако на местах варварской вырубки леса опустыниваются большие территории в Коми республике и Хабаровском крае. Во всех регионах добычи нефти и газа (Прикаспий, Сибирь, Дальний Восток, Сахалин, Баренцово море и др.) в результате загрязнения пропадают миллионы гектаров земли и акватории.

Нарастает темп уничтожения животных и растений: ежегодно исчезает несколько видов. Под угрозой уникальное видовое разнообразие озера Байкал.

Анализируя экологическую обстановку на территории бывшего Советского союза академик А.В. Яблоков (1992), пишет: «По всем возможным сценариям развития страны экологический кризис в ближайшие годы будет нарастать и усугубляться. Критическое экологическое состояние страны в ближайшие годы перейдет в катастрофическое и выйдет на второе, а кое-где и на первое место среди причин социально-экономического неблагополучия».

Сложившаяся к настоящему времени неблагоприятная эколого-биохимическая ситуация в стране является следствием научно-технического прогресса. Освобождаясь от прямой зависимости от природы, общество все больше зависит от ее «благополучия». Необходима разработка научных основ оптимизации природопользования, нахождения путей экологизации производства и восстановления природных систем.

Экологи должны иметь представление о надежности экосистем и способности последних переносить существующие антропогенные нагрузки. Наиболее адекватным приемом оценки качества окружающей является изучение поведения биоты, поскольку вредность (токсичность) любого фактора - это, прежде всего, биологическая характеристика. В отличие от приемов аналитической химии биологические методы определяют интегральную опасность компонентов среды, действие которых зависит от их взаимодействия (синергизма и антагонизма). В настоящее время контроль за состоянием биоты в полевых условиях (биоиндикация, биомониторинг) сочетают с приемами лабораторного биотестирования.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Козарь, Виктор Иванович

ВЫВОДЫ

1. Исследованы закономерности возбуждаемого видимым светом (максимум 390 нм) послесвечения воздушно-сухих семян и биопрепаратов при комнатной температуре. Показано, что послесвечение в миллисекундной области имеет два максимума 540 и 620 нм и представляет собой явление фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ).

2. Установлена взаимосвязь между уровнем послесвечения семян и их качеством (всхожесть и влажность). Логарифм уровня послесвечения семян обратно пропорционален их всхожести (коэффициент корреляции -0,92 — -0,98). В области влажности семени 4-20% логарифм уровня ФКТ линейно снижается с увеличением содержания воды в семени. Показано, что однотипная зависимость ФКТ от всхожести и равновесной влажности обусловлена дегидратацией тканей семени при снижении его жизнеспособности. Предложено по уровню ФКТ контролировать изменение влажности биопрепаратов в области от 4 до 20%. Метод позволяет определять разницу во влажности объектов в 0,1-0,2%.

3. Построение распределений воздушно-сухих семян по уровню послесвечения показало, что только высококачественные семена (всхожесть 98-95%) нормально распределены по этому показателю. Партии семян более низкой всхожести состоят из трех дискретных фракций. Из семян фракции I вырастают нормальные проростки; среди проростков из семян фракции II преобладают проростки с морфологическими дефектами; кроме того, часть семян погибает от гипоксии; фракция III содержит мертвые семена. Предложено для биотестирования использовать семена второй фракции, как более чувствительные к внешним воздействиям.

4. Показано, что распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ зависит от условий вегетации материнского растений. Анализа таких распределений позволяет судить об экологических условиях роста растения, а также о последствиях предпосевной обработки семян (лазерное облучение, электрическое поле коронного разряда и др.)

5. Обнаружено новое явление - послесвечение набухших семян. Свечение представляет собой фосфоресценцию эндогенных порфиринов в анаэробных условиях. Причиной анаэробиоза под оболочкой у семян бобовых является активное дыхание зародыша и медленная диффузия кислорода через оболочку. По уровню фосфоресценции можно контролировать гипоксическое состояние у зародыша семени in vivo во время прорастания в нормальных условиях и в присутствии токсиканта.

6. Сделано общее заключение, что регистрацию послесвечения сухих семян и фосфоресценцию эндогенных порфиринов у прорастающих семян можно использовать как методы экоанализа качества семян в работах по биоиндикации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Семена представляют собой достаточно специфический объект для целей биоиндикации состояния окружающей среды. Они надолго «запоминают» условия, в которых росло материнское растение, в виде своего физиолого-биохимического состояния. Качественный состав популяции семян это как бы «летопись» условий, в которых формировались семена. От него зависит динамика старения партии семян при хранении. Поэтому анализ свойств семян в партии может служить биодиагностическим приемом.

В начале прорастания (набухания и проклевывания), то есть во время перехода от инертного нежизнедеятельного состояния к жизнедеятельному, семя становится высоко чувствительной системой. Это фундаментальное свойство любых сложных систем. На основе этого принципа разработаны многочисленные методы испытания надежности механических, электронных и других сложных механизмов.

При набухании семени его клеточные мембраны претерпевают фундаментальные структурно-функциональные перестройки. Это критический момент, стрессовая ситуация в жизни семени. В начале набухания семени мембраны легко проницаемы для воды и низкомолекуляных соединений и потому в этот момент у семени велик риск потери жизнеспособности. По мере восстановления интактности мембран утечка веществ из клеток резко замедляется, включаются репарационные механизмы и восстанавливается энергетика клетки. Именно этот переходный период в жизни семени используют для анализа биологического действия факторов разной природы. Прием известен как «проростковая проба». При использовании семян в качестве организма для контроля состояния окружающей среды необходимо учитывать, что, как и в случае жизнедеятельных систем, реакция семени на градуально возрастающее воздействие не является линейной. Поведение любой живой системы, ее реакция в зависимости от напряженности фактора может изменять знак ответа. Различают двухфазный (фармакологическая инверсия, гормезис [Кузин, 1995]) и трехфазный (парадоксальная реакция [Александров, 1985]) ответы. При парадоксальном ответе стимулирующему действию малых доз предшествует обратимое нарушение жизнедеятельности организма и клетки. Всеобъемлющей гипотезы, объясняющей подобное поведение живых систем, до сих пор нет.

Динамику поведения отдельного семени в ответ на воздействие исследовать невозможно, поскольку для определения состояния семени его необходимо прорастить, что можно сделать только один раз. Поэтому используют попу-ляционно-статистический подход, принимая, что семена в популяции по свойствам (качеству) распределены нормально [Roberts, АЪ-dalla, 1968; Ellis et al., 1982]. Однако и этот подход не решает проблемы, так как остается неясным отражают ли средне-статистические данные изменение свойств каждого семени или они результат изменения состава популяции.

В настоящей работе показано, что распределение семян по уровню ФКТ унимодально лишь в партии с 95-100% всхожестью. В партиях с более низкой всхожестью путем регистрации ФКТ индивидуальных семян можно выделить дискретные фракции, отличающиеся по качеству. Существование таких фракций было показано также по выходу электролитов из набухающих семян и длине осевых органов (Веселова и др., 1999).

Предложенный в работе люминесцентный метод сортировки воздушно-сухих семян позволяет провести выбраковку семян низкого качества и тем самым, с одной стороны, повысить всхожесть семенного материала, а с другой, сформировать более однородные по качеству пробы семян. Использование в опытах таких семян целесообразно при физиолого-биохимических исследованиях, а также может обеспечить получение более надежных результатов при биотестировании.

На фракционированных методом ФКТ семенах сои в работе показано (рис 13), что использование более чувствительной части популяции семян ускоряет определения опасности термического воздействия.

Построение распределений индивидуальных семян перца по уровню ФКТ позволило наблюдать факт ухудшения качества семян у растений, перенесших холодовой стресс на фазе прорастания семян, а также в случае выращивания растений в неоптимальных для них условиях (рис. 16, 17). Эти примеры показывают, что регистрация послесвечения воздушно-сухих семян адекватно отражает существование неблагоприятных экологических условий во время роста растения, и значит метод может быть использован для целей биоиндикации. Эту мысль подтверждают наблюдения закономерности изменения фракционного состава популяции семян после воздействия на семена коронного разряда и лазерного облучения (рис. 14, 15).

Уровень ФКТ семян в основном определяет содержание в них воды. Неодинаковое свечение семян означает, что они отличаются по влажности и по этому показателю группируются в качественно разные фракции. Конечно, не само содержание воды определяет качество семени. Равновесная влажность индивидуальных семян и ее изменение при старении и последействии разных факторов свидетельствует о модификации клеточных мембран и биополимеров, увеличивающей их гидрофобность. Потеря семенем жизнеспособности сопровождается уменьшением в клетках количества связанной воды, что и приводит к возрастанию уровня послесвечения.

В работе показано, что обнаруженное нами явление свечения набухающих семян бобовых, обусловлено фосфоресценцией эндогенных порфиринов в условиях дефицита кислорода. Поэтому наблюдение за уровнем фосфоресценции у набухающих семян позволяет констатировать дефицит кислорода у эмбриона в это время. Известно, что большинство видов семян испытывает дефицит кислорода при прорастании [Джеймс, 1956; Larson, 1968; Leblova, 197S;AI-Ani et al., 1985]. Особенно он опасен для крупных семян бобовых, у которых он может стать причиной их гибели. Нами показано, что наблюдать за развитием гипокического состояния у семян бобовых можно, регистрируя фосфоресценцию. Поскольку все растительные ткани содержат порфирины, то путем измерения уровня фосфоресценции можно наблюдать за этим состоянием in vivo не только у прорастающих семян, но и в любых тканях растительного организма. Появления фосфоресценции у семян бобовых во время процедуры ускоренного старения (рис. 21, 22), свидетельствует в пользу точки зрения, согласно которой механизм потери семенами жизнеспособности при ускоренном старении отличается от такового при старении семян в сухом состоянии.

Регистрация фосфоресценции порфиринов показала, что причиной стимуляции всхожести семян гороха под влиянием малых количеств токсиканта парахлормеркурий бензоата (явление гормезиса) является уменьшение количества семян в популяции, страдающих от дефицита кислорода во время набухания. Дальнейшее исследование этого феномена вероятно поможет ответить на вопрос: в чем причина того, что давно известный результат стимуляции всхожести семян разными физико-химическими воздействиями в малых дозах воспроизводится далеко не в каждом опыте. Эта ситуация порождает дискуссию о существовании явления и его механизме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козарь, Виктор Иванович, Москва

1. Акифьев АП., Потапенко А И, Рудаковская Е.Г. (1997). Ионизирующие излучения и 5-бром-2- дезоксиуридин как инструменты анализа фундаментального механизма старения животных. / / Радиационная биология. Радиоэкология. 37, вып. 4, 613-620.

2. Аксенов СИ (1980). Состояние воды в биологических объектах. В кн. Связанная вода в дисперсных системах. М., Изд-во МГУ, т. 5, 4 8-7 6.

3. Аксенов СИ (1990). Вода и ее роль в регуляции биологических процессов. М.: Наука. 113 с.

4. Александров В.Я. (1985). Реактивность клеток и белки. Л-д., Наука. 317 с.

5. Андреев В. К, Фомичев ММ, Бородин ИФ. и др. (1986). Способ определения жизнеспособности семян зерновых культур. А.с. № 1607712.

6. Артемьев Т.И, Жеребцов Т.К., Борисович Т.М (1988). Влияние загрязнения почвы нефтью и нефтепромысловыми сточными водами на комплекс почвенных животных. // В сб.: Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 82-98.

7. Белецкий В.И (1983). Количественное сопоставление токсичности веществ для гидробионтов и его использование. //В сб.: Обобщенные показатели качества вод-83. Практические вопросы. 31-33.

8. Бочваров 77.3., Николаева А К., Алехина И.Д и др. (1983). Оценка жизнеспособности семян сои при естественном старении, биотестирования и биоиндикации. Черноголовка. 31-33.

9. Бочваров П.З., Веселова Т.В., Алехина Н.Д., Веселовский В.А (1984). Использование метода замедленной люминесценции для оценки изменений, происходящих в семенах сои после ускоренного старения. // Сельхоз. Биология. № 6. 66-68.

10. Бурштейн Э.А (1977). Собственная люминесценция белка (природа и применение). // Итоги науки и техники. Биофизика. М.: ВИНИТИ. 7. 83-105.

11. Ванярхо В.Г. (1990). Способ определения жизнеспособности семян. Патент РФ 2076554.

12. Веселовский В.А, Веселова Т.В. (1990) «Люминесценция растений». Москва, «Наука», 200 с.

13. Веселова Т. В., Веселовский В.А, Маренков B.C., Рубин А Б., Шеберлайн В. Способ определения влажности семян растений и устройство для его осуществления. Авт. свид. № 1047431 с приоритетом от 13 июля 1981 г.

14. Весело в а Т. В., Веселовский В. А, Карташова Е.Р., Тереш-кина С.Д. (1995). Количественное определение потери жизнеспособности семян сосны при разных способах хранения. // Физиология растений. 42, №4, 616-621.

15. Веселова Т.В., Веселовский В.А, Леонова Е.А (1999). Что означает изменение гетерогенности популяции семян при ускоренном старении? // Физиология растений 4 6, №3, 477-483.

16. Владимиров Ю.А (1965). Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука.232 с.

17. Владимиров Ю.А, Литвин Ф.Ф. (1959). Исследование сверхслабых свечений в биологических системах. // Биофизика. 4, № 3. 601-606.

18. Владов Ю.Р. (1985). Люминесцентный автоматический контроль зерна. // Тез. докл. всесоюз. сов. «Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности». Минск.71-73.

19. Габуда СП. (1982). Связанная вода. Факторы и гипотезы. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение. 157 с.

20. Генкелъ П.А (1982). Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М. «Наука».

21. Гиллет Дж. (1988). Фотофизика и фотохимия полимеров. Введение в изучение фотопроцессов в макромолекулах. М. «Мир».435 с.

22. Гиляров КС. (1965). Зоологический метод диагностики почв. М., Наука, 278 с.

23. Голдовский А К (1981). Анабиоз. Л-д: Наука. 136 с.

24. Голдовский АМ (1986). Анабиоз и его практическое значение. Л-д: Наука.187 с.

25. Горчакова И.О., Горчаков С.А, Павлов ЛВ. (1992). Устройство для предварительного определения всхожести семян. Патент РФ № 2060638.

26. Гродзинский ДМ. (1972) «Биофизика растений». Киев. «Наукова думка». 256 с.

27. Джеймс В. (1956). Дыхание растений. М. Изд-во Иностранной литературы. 209-214.

28. Дмитриева А Г., Веселова Т.В., Веселовский В. А (1989). Биотестирование сточных вод с применением регистрации замедленной флуоресценции микроводорослей. // Сб. «Методы биотестирования качества водной среды». Изд-во МГУ, 21-34.

29. Исмаилов Н.М. (1982). Нефтяное загрязнение и биологическая активность почв. // В кн. «Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем.» М. Наука. 227-234.

30. Конев СВ. (1965). Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Минск. Наука и техника.

31. Конев СВ., Катибников МА (1961). Длительное послесвечение белков и аминокислот при комнатной температуре. I. Кинетика послесвечения белков и аминокислот.// Биофизика 6, № 3. 638-642.

32. Кршценко В.П., Ушакова Т.Ф., Верещак MB., Фомина Л.Г., Хомич Н.П. (1990). Способ определения жизнеспособности семян. Патент РФ 2025928.

33. Кудряшов Ю.Б., Беренфелъд Б.С. (1982) Основы радиационной биофизики. 302 с.

34. Кузин AM (1995) Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М.: Наука. 158 с.

35. Ларионов Ю.С, Ларионова ЛМ (1981). Способ определения жизнеспособности семян зерновых культур, преимущественно пшеницы. A.c. № 1015836.

36. Лесников ЛА (1983). Биотестирование и система охраны вод. // Сб.: «Практические вопросы биотестирования и биоиндикации», Черноголовка, 23-27.

37. Литке СВ., Лялин Г.Е (1985). Замедленная флуоресценция адсорбированных флавинов. // Оптика и спектроскопия 59, № 3, 670-673.

38. Мажулъ В.М, Конев СВ., Ермолаев Ю.С и др. (1983). Исследование равновесной динамики белков клетки методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре. // Биофизика 26. 980-983.

39. Международные правила анализа семян. (1984). Перевод с английского "International Rules for Seed Testing. Rules 1976. 310c.

40. Николаева М.Г., Лянгузова КВ., Позднова JLM (1999). Биология семян. С-Пб. 231 с.

41. Обручева Н.В., Ковадло JLC (1985). Два этапа усиления дыхания прорастающих семян гороха по мере увеличения их оводненности. // Физиология растений. Т. 32, вып. 4. 753-761.

42. Орлова H.H., Содатова О.П. (1975). Цитогенетическое изучение мутационного процесса в семенах популяций и чистых линиях ржи (Seeale cereale L.) при хранении. // Генетика. №11.

43. Патрикеев В.В., Чудный AB. (1971). Способ определения жизнеспособности семян и пыльцы растений. A.c. № 381313.

44. Пиковский Ю.И. (1981). Геохимические особенности техногенных потоков в районах нефтедобычи. // В кн.: «Техногенные потоки вещества в ландшафтах и состояние экосистем.» М. Наука. 134-148.

45. Подоба ИМ (1992). Техногенная трансформация почвенного покрова. // В кн.: «Современные проблемы изучения и сохранения биосферы». Ред. Н.В.Красногорская. Т. 3. 180-183.

46. Поликарпов Г.Г., Гродзинский ДМ, Кутлахметов Ю.А, Андреев АД. (1992). Надежность в оценке состояния биосистем. // В кн. «Современные проблемы изучения и сохранения биосферы». Ред. Н.В.Красногорская. Т. 3. 34 6-357.

47. Реймерс Ф.Э. (1987). Растение во младенчестве. Наука. 182 с.

48. Рапли Дж., Янг Л, Толлин Г. (1984). Исследование термических и других параметров взаимодействия воды с белками. В кн.: "Вода в полимерах". М. Мир. 114-136.

49. Роберте Е.Г. (1978а). Влияние условий хранения семян на их жизнеспособность. // В кн.: «Жизнеспособность семян». Ред. Е.Г.Робертс. М. Колос. 20-62.

50. Роберте Е.Г. (19786). Цитологические, генетические и метаболические изменения, связанные с потерей жизнеспособности. // В кн.: «Жизнеспособность семян». Ред. Е.Г.Робертс. М. Колос. 244-293.

51. Рухля АН, Шадыро ЩИ, Петряев Е.П., Петренко ЛИ (1981). Способ определения посевной годности семян. А.с. № 982556.

52. Сборник «Современные проблемы изучения и сохранения биосферы», 1992,том 3, 204.

53. Солдатова О.П., Орлова ЯЯ (1984). Развитие мутационного процесса в семенах при хранении. // Докл. ВАСХНИЛ. 11 18-20.

54. Стрелер Б. (1964). Время, клетки, старение. М.: Мир.

55. Тарушкин В.И, Баутин В.М, Лубников СИ (1999). Способ определения влажности зерновых культур. // Патент ВД 991264.

56. Теренин АН (1967). Фотоника молекул красителей. Л-д. Наука. 308с.

57. Трубицин А Г. (1974). Способ выделение здоровых семян сои. Патент Ш 1205330. А.с. № 513660.

58. Тюрин Ю.С, Шаин С. С (1974). Применение люминесцентного анализа в селекции яровой вики. // Материалы I Все-союз. симп. по молекулярной и прикладной биофизике растений. Краснодар. 188-18 9.

59. Шилова ИМ (1988). Биологическая рекультивация неф-тезагрязненных земель в условиях таежной зоны. // В кн. «Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.» М. Наука. 156-167.

60. Штина Э. А (1985). Почвенные водоросли как пионеры зарастания техногенных субстратов и индикаторы состояния нарушенных земель. // Ж. Общей биологии. 4 6, N 4,435-443/

61. Удовенко Г.В. (1977). «Солеустойчивость культурных растений». Ленинград. Колос. 215 с.

62. Филенко О.Ф. (1988). Водная токсикология. Черноголовка. 157с.

63. Фирсова МК, Попова Е.П. (1981). Оценка качества зерна и семян. М.: Колос. 223 с.

64. Хургин ЮМ (1972). Гидратация глобулярных белков. // Ж. Всесоюз. Хим.об-ва им. Д.И.Менделеева 21. 684-690.

65. Цой КМ, Апрод А К, Алешин ЕЛ, Баллод ЗМ (1970). Способ определения жизнеспособности семян растений. А.с. № 372975.

66. Шилова ИИ (1988) Биологическая рекультиваця нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны. // Сб.: «Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем». Ред. М.А.Глазовская. М. Наука. 159-167.

67. ШимановВ.Г., Шамсутдинов З.Г., Шегай В.Ю., Ионис Ю.И. (1975). Способ определения всхожести семян. А.с. № 546314.

68. Эффекты сверхмалых доз биологически активных веществ. // Российский химический журнал, N 5 (1999).

69. Яблоков АВ. (1992). Введение. // В кн. «Современные проблемы изучения и сохранения биосферы». Т.З. Ред. Н.В.Красногорская, с. 3-7.

70. Aaron J.J,, Andino M, Winefordner J.D. (1984). The effect of ion-exchange filter papers and of heavy atoms on room-temperature phosphorescence of several indoles. // Analityca Chimica Acta. 160. 171-184.

71. Abdul-Baki AA (1980). Biochemical aspects of seed vigor. // Hortscience, 15. 765-771.

72. Al-Anl A, Bruzau F., Raymond P., Saint-Ges V., Leblanc J.M, Pradet A, (1985). Germination, respiration and adenylate energy charge of seeds at various oxygen partial pressures. // Plant Physiol. 79. 885-890.

73. Anderson J.D. (1973). Metabolic changes associated with senescence. // Seed Sci. and Tecnol. 1.401-416.

74. Barton L. V. (1961). Seed preservation and longevity. // London: Leonard Hill.

75. Bernal-Lugo, Camacho A, Carballo A (2000). Effects of Seed Ageing on the Enzymic Antioxidant System of Maize Cultivars. 11 Seed biolody: Advances and Applications (eds M. Black, K.J. Bradford, J. Vazquez-Ramos). 14. 151-160.

76. Blok M.C., Vender Neutkok E.C.M, van Deenen L.L.M de Gier J. (1975). The effect of chain length and lipid phase transitions on the selective permeability properties of liposomes. // Biochim Biophys. Acta. 406. 187-191.

77. Brewer AK, Washington D.C., S.L. Adelman, McLean Va. (1966). Method for analysis and identification of biologic entities by phosphorescence. US Patent №3 470 373.

78. Buchvarov P, Grantcheff T. (1984). Influence of accelerated and natural ageing on free radical levels in soybean seeds. // Physiol. Plant. 60, 53-56.

79. Buitink J., Mireille MAE., Hemminga MA, Hoekstra FA (1998). Influence of water content and temperature on molecular mobility and intracellular glasses in seed and pollen. // Plant Physiology. 118. 531-541.

80. Debye P., Edwards 1.0. (1952). A note on the phosphorescence of proteins. // Science. 116. 143-144.

81. Delouche J.C., Baskin CC. (1973). Accelerated aging techniques for predicting the relative storability of seed lots. // Seed Sci. Technol. 1. 427-452.

82. Dickie J.B., Ellis RH, Kraak H.L., Ryders K, Tompsett P.B. (1990). Temperature and seed storage longevity. // Annals of Botany. 65. 197-204.

83. Duke S.H., Kakefuda G (1983). Differential leakage of intracellular substances from imbibing soybean seeds. // Plant Physiol. 72. 919-924.

84. Ellis RH., Osei-Bonsu, Roberts E. (1982). The influence of Genotype,Temperature and Moisture on Seed Longevity in Chickpea, Cowpea and Soya bean. // Ann. Bot. 50. 69-82.

85. Giese AC., Leighton RA (1937). Phosphorescence of cells and cell products. // Science. 85. 428-437.

86. Goodwin RR (1953). Fluorescent substances in plants. // Annu. Rev. Plant Physiol. 4. 283-304.

87. Harman G.E., Mattick L.R (1976). Association of lipid oxidation with seed ageing and death. // Nature. 260. № 5549. 323-324.

88. Harrington J.F. (1972). Seed storage and longevity. // In: «Seed Biology.» T.T.Kozlowski (Ed.). Vol. 3. N.Y.: Academic Press. 145-245.

89. Harrington J.F. (1973). Biochemical basis of seed longevity. // Seed Sci. Technol. 1. 453-461.

90. Hay F.R, Mead A, Manger K, Wilson F. (2002). One-step analysis of seed storage data and longevity of Arabi-dopsis thaliana seeds. // In: «VII International Workshop on Seed Biology.» Salamanka, Spain. Abst. 47.

91. Hendry G.AF., Khan M (1998). Seed mortality and free radicals. Abs. Book "Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants". // Euroconference, Granada, Spain December 17-19. 40.

92. Hill H.J., Taylor AG., Huang X.L. (1988). Seed viability determinations in cabbage utilizing sinapin leakage and electrical conductivity measurements. // J. Exp. Bot. 39. № 207. 1439-1447.

93. Hoekstra F.A, Golovina E.A, Buitink J. (2001). Mechanisms of plant desiccation tolerance. // TRENDS in Plant Science. 6(9). 431-438.

94. IselyD. (1957). Vigor tests. // Proc. Assoc. Offic. Seed Anal. 47. 176-182.

95. ISTA (1985) (International Seed Testing Association). International rules for seed testing: rules 1985. // Seed Sci. Technol 13. 299-355.

96. Jalink H, Frandas A, van der School R, Bino J.B. (1998). Chlorophyll fluorescence of the testa of Bras-sica oleracea seeds as an indicator of seed maturity and see quality. // Sci agric. Piracicaba. 55. 88-93.

97. Kaloyereas S.A (1958). Rancidity as a factor in the loss of viability of pine and other seeds. // J. Amer. Oil Chemists' Society 35. 176-179.

98. Khan MM, Hendry G.AF., Atherton KM, Walters-Vertucci C. (1997). Light promotes free radical accumulation in ageing soyabean seeds. // In: «Basicand Applied Aspects of Seed Biology.» (Eds. R.H.Ellis, M.Black,

99. A.J.Murdoch, T.D.Hong) Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Printed in Great Britain. 809-815.

100. Koostra P. T., Harrington J.F. (1969). Biochemical effects of age on membrane lipids of Cucumis sativus L. seeds. // Proc. International Seed Testing Ass. 34. 329-340.

101. Krasnovsky AA (Jr.) (1982). Delayed fluorescence and phosphorescence of plant pigments. // J.Photosin Photobiol. 36. № 6. 733-741.

102. Lanteri S., Quagliotti L, Belletti P., Scordino A, Triglia A (1998). Delayed luminescence and priming-induces nuclear replication of unaged and controlled deteriorated pepper seeds {Capsicum annuum L.). // Seed Sci. Technol. 26. 413-424.

103. Larson L.A (1968). The effect soaking pea seeds with or without seedcoats has on seedling growth. // Plant Physiol. 43. 255-259.

104. Leblova S. (1978). Pyruvate conversions in higher plants during naturalanaerobiosis. // In Hook D.D., Crawford R.M.M. (Eds.) «Plant Life in Anaerobic Environments.» Ann Arbor Science, Ann Arbor, Michigan. 155168.

105. Livesley M. A, BrayCM. (1991). The effect of ageing upon a-amilase production and protein synthesis by wheat aleurone layers. // Annals of Botany. 68. 69-73.

106. MacLeod AM (1952). Enzyme activity in relation to barley non-viability. // Transactions and Proceedings of the Botany Society of Edinburgh. 36: 18-33 (umt. no Smith, Berjak, 1995).

107. Maurel Ch. (1997). Aquaporins and water permeability of plant membranes. // Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 48, 399-429.

108. Mazor L, Negbi M, Peri M (1984). The lack of correlation between ATP accumulation in seeds at the early stage of germination and seed quality. // Journal of Experimental Botany. 35. 1128-1135.

109. Mead A, Gray D. (2002). Prediction of seed longevity: a modified model and improved fitting process. // In: «VII International Workshop on Seed Biology.» Salamanka, Spain. Abst. 46.

110. Mukhtar N.D., Laidman D.L. (1982). Mineral ion transport in the embryos of germinating wheat (Triticum aestivum). // J. Exp. Bot. 33, 643-655.

111. Musumeci F., Triglia A, Grasso F., Scordino A, Sitko D. (1994). Relation between delayed luminescence and functional state in soya seeds. // Nuovo Cimento. 16. 65-73.

112. Osada L., Kuroda H. (1982). Luminescence emission of high-density polyethylene. // J. of Polymer Science: Polymer Letter Edition. 20. 577-581.

113. Osborne D.J. (1980). Senescence in seeds. In: «Senescence in Plants.» K.V. Thimann (ed). CRC Press. Boca Raton, FL.

114. Papp S., Vanderkool J.M. (198 9). Tryptophan phosphorescence at room temperature as a tool to study protein structure and dynamics. // Photochem. Photobiol. 49. № 6. 775-784.

115. Parrish D.L., Leopold AC. (1978). On the mechanism of aging in soybean seeds. // J. Exp. Bot. 61. 365-368.

116. Perry M.J., Porter S.M. (198 9). Determination of the cross-section absorption coefficient of the individual phytoplankton cells by analytical flow cytometry. // Limnol. Oceanogr. 34. N8. 1727-1738.

117. Perl M, Luria L, Gelmond R (1978). Biochemical changes in wheat embryos aged under different storage conditions. // J. Exp. Bot. 28. 227-236.

118. Petruzelli L., Taranto G. (1984). Phospholipid changes in wheat embryos aged under different storage conditions. // J. Exp. Bot. 35. 517-534.

119. Poquett RT., Smith MT., Ross G. (1992). Lipid autoxi-dation and seed ageing: putative relationships between seed longevity and lipid stability. // Seed Sci. Research. 2. 51-54.

120. Powell AA, Matthews S. (1978). The damaging effect of water on dry pea embryos during imbibition. // J. Exp. Bot. 29, № 112. 1215-1229.

121. Priestley D.A (1986). Seed Ageing. Implication for Seed Storage and Persistence in the Soil. // Comstock Publishing Associates, Ithaca, New York, London.

122. Priestley D.A, Leopold AC. (1979). Absence of lipid oxidation during accelerated aging of soybean seeds. // Plant Physiology. 63. 726-729.

123. Roberts E.K (1972). Cytological, genetical and metabolic changes associated with loss of viability. // In: «Viability of Seeds.» Roberts E.H. (ed). Chapmam and Hall, London. 253-306.

124. Roberts E.K, Abdalla F.R (1968). The influence of pre- and post-storage hydration treatment on chromosomal aberrations, seeds abnormalities, and viability of lettuce seeds. // Annals of Botany 32. 97-117.

125. Roberts E.E, Ellis RH. (1989). Water and Seed Survival. // Annals of Botany 63. 39-52.

126. Rolletschek H., Borisjuk L, Koschorreck K, Wobus U., Weber U. (2002). Legume embryos develop in a hypoxic environment. // J. Experim. Bot. 53 (371) 1099-1107.

127. Senaratna T., GusseJ.F., McKersle. (1988). Age-induced changes in cellular membranes of imbibed soybean seed axes. // Physiology plantarum. 73, 85-91.

128. Shah N.K, Ludescher RD. (1993). Influence of hydration on the internal dynamics of hen egg white lyso-zyme in the dry state. // J. Photochem. Photobiol. 58. № 2. 169-174.

129. Simon E.W., Ha rum. RMR (1972). Leakage during seed imbibition. // J. Exp .Bot. 23. № 77. 1076-1085.

130. Stewart RRC., Bewley J.D. (1980). Lipid Peroxidation associated with accereted aging of soybean axes. // Plant Physiol. 65. 245-248.

131. Strambini G.B., Gabellieri E. (1984). Intrinsic phosphorescence from proteins in the solid state. // Photochem. Photobiol. 39. 725-729.

132. Vertucci C.W., Ellenson J.L., Leopold AC. (1985). Chlorophyll fluorescence characteristics associated with hydration level in pea cotyledons. // Plant Physiol. 79. 248-252.

133. Vertucci C. W., Roos EE. (1990). Theoretical basis of protocols for seed storage. // Plant Physiol. 94. 10191023.

134. Veselova T.V. (2002). Assessment of individual seed vigor and seed lot heterogeneity by room temperature phosphorescence. // Seed Sci. and Technol. 30. 187-196.

135. Weissenbock G, Schnabl H, Scharf K, Sachs G. (1987). On the properties of fluorescing compound in guard and epidermal cells of Allium cepa L. // Planta. 171. 88-95.

136. Wilson D.O., McDonald MB. (1986). The lipid peroxidation model of seed ageing. // Seed Sci. Technol. 14. 269-300.

137. Woodstock L.W. and Tao KL.J. (1981). Preventing of imbibition injury in low vigour soybean embryonic axes by osmotic control of water uptake. // Physiology Plantarum. 51. 133-139.