Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотосенсибилизированное образование и дезактивация синглетного молекулярного кислорода и их роль в биологических системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотосенсибилизированное образование и дезактивация синглетного молекулярного кислорода и их роль в биологических системах"

На правах рукописи оозовтгьи

Егоров Сергей Юрьевич

Фотосенсибилизированное образование и дезактивация синглетного молекулярного кислорода и их роль в биологических системах

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

003067260

Работа выполнена в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор A.A. Красновский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В.Климов доктор биологических наук, профессор A.B. Иванов доктор биологических наук, профессор A.C. Соболев;

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М.Эм: ануэля РАН.

Защита состоится 22 марта 2007 года в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском государственном университете им М.В. Ломоносова (119992, г. Москва, Воробьевы горы, биологический факультет, кафедра биофизики, новая ауд.).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова (119992, г. Москва, Воробьевы горы, биологический факультет).

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Т.Е. Кренделева

Реферируемая диссертация представляет биофизическое исследование участия возбужденной синглетной формы молекулярного кислорода в ^-состоянии ('02), возникающей при участии возбужденных светом триплетных молекул биологически значимых пигментов, в фотоиндуцированных процессах в живых системах и их моделях. В работе обобщаются результаты и выводы, полученные автором в ходе работ, проводившихся в 1982-2006 гг. главным образом на биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН. Отдельные этапы исследования выполнялись в сотрудничестве с Международным учебно-научным лазерным центом Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Институтом биофизики Минздрава РСФСР, Московской академией тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова и рядом других.

Актуальность проблемы. Интенсивное освещение пигментированных клеток и тканей живых существ способно вызывать в них фотодеструктивные изменения и гибель, инициировать фотоокислительный стресс, фотоингибирование, вызывать мутации и другие повреждения нативных процессов жизнедеятельности. Наиболее вероятные интермедиа™ первичной стадии фотоокисления - активные формы кислорода (АФК): молекулы '02, радикалы «Ог", *Н02, «ОН, перекись водорода, а также возбужденные синглетные и триплетные молекулы пигментов, радикалы и перекиси липидов и др. Эти существенно различные по химической активности молекулы способны разрушать органические молекулы, клетки и ткани, инициируя деструктивные процессы. Для понимания механизмов фотодинамических, фотоинформационных и фотопротекторных процессов и их места в метаболизме и жизнедеятельности организмов необходимо детальное исследование роли отдельных активных форм активных молекул в живых системах и их моделях. Несмотря на многообразие накопленной экспериментальной информации остается неясной роль 'С>2 и триплетных возбужденных молекул пигментов в механизме инициации различных фотоокислительных процессов в живых клетках и их моделях. С другой стороны, показано, что '02 может участвовать в фотоинформацион-

ных и фоторегуляторных процессах [Síes et al., 2004-2005]1. Предполагается, что именно необходимость предотвращения губительного действия фотоокислительного стресса привела к выработке фотопротекторных механизмов в клетках живых существ, которые особенно развиты в пигментированных, например, в фотосинте-зирующих, зрительных и других окрашенных клетках, однако вклад и роль дезактивации 'С>2 в защите от фотоокисления также остается не вполне ясной.

В классических фотохимических исследованиях [Kautsky, 1939; Теренин, 1943-1947, Foote, 1964-1979] высказано предположение, что основным путем образования одной из наиболее химически активных возбужденных форм кислорода -'02 - является пере-• 1 эВ нос энергии от фотосенсибилизаторов в возбужденном триплетном состоянии (3Р) на молекулярный кислород. Однако прямых доказательств участия этого процесса в инициировании фотодинамических реакций in vivo не было. Существенным успехом в исследовании роли '02 в инициации фотобиохимических процессов было открытие явления собственной фосфоресценции '02 в органических растворителях [Красновский, 1976] и воде [Краснов-ский, 1979; Khan, 1979], которое позволило получать неинвазивно достоверную информацию о свойствах '02 (без введения дополнительных химических акцепторов !02) в системах любой сложности.

К моменту начала данного исследования (1982 г.) была накоплена обширная информация о свойствах '02, полученная методом химических ловушек (акцепторов '02). Однако достоверность этой информации во многих случаях вызывала сомнение в виду недостаточной специфичности химических ловушек и их способности вступать в реакции не только с '02, но и с другими активными формами кислорода, свободными радикалами и электронно-возбужденными состояниями молекул. Измерения, основанные на регистрации фосфоресценции '02, были выполнены главным образом с использованием ограниченного круга органических рас-

1 В связи с ограниченным объемом, в автореферате приводятся ссылки только на

наиболее важные работы ключевых авторов из представленного в диссертации

списка.

творителей, в которых время жизни '02 наиболее велико (10 и более мс). Эти исследования убедительно показали важность фосфоресцентного метода для фотобиологических исследований (Красновский, 1976-1982). В частности, было установлено, что основные биологические пигменты: хлорофиллы, бактериохлоро-филлы, порфирины и ретинали способны эффективно генерировать и тушить синглетный кислород в этих средах. Получены точные значения констант скорости тушения '02 жирными кислотами и липидами и многими органическими молекулами. Однако были сделаны лишь первые шаги в анализе фосфоресценции '02 в органических средах с малым временем жизни '02, воде, моделях мембран, а измерения in vivo полностью отсутствовали.

Таким образом, имевшаяся экспериментальная информация и новый исследовательский подход, основанный на измерении собственной фосфоресценции '02, определили выбор стратегии исследования и сделали возможным выполнение настоящей работы. Имевшаяся информация показывала, что наиболее актуален анализ участия '02 в таких процессах как фотодинамическая терапия опухолей с участием водорастворимых порфиринов, агрегатов и комплексов с моноклональными антителами, фотодеструкция фотосинтетического аппарата растений и бактерий, фотоиндуцированный катарактогенез, фотоинформационные и фоторегуляторные процессы, инициируемых флавинами и птеринами, фотопротекторные и фоторегуляторные реакции с участием широкого круга физиологически активных веществ и антиоксидантов и ряд других. С другой стороны, требовалось развитие экспериментальных подходов с целью проведения измерений в модельных системах, наиболее приближенных к живым клеткам и тканям, а также собственно in vivo, что требовало существенного развития методик проведения экспериментов и усовершенствования измерительной техники. Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование роли фотосенсибилизированного образования и дезактивации синглетного молекулярного кислорода в возбужденном 'Ag состоянии ('02) в фотобиологических процессах на основе прямой регистрации собственной фосфоресценции '02 в воде, моделях биологических систем и клетках. Для достижения этой цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Разработать новые экспериментальные методы для исследования свойств и роли '02 в биофизических процессах в живых клетках, тканях и их моделях на основе анализа кинетических и спектральных свойств фотосенсибилизированной фосфоресценции '02 и возбужденных триплетных молекул фотосенсибилизаторов.

2. Изучить кинетические свойства '02 в моделях биологических мембран и цитоплазмы с привлечением широкого круга исследуемых моделей и объектов и оценить константы скорости взаимодействия с компонентами клеток и биологически активными веществами.

3. Исследовать эффективность образования '02 природными и синтетическими фотосенсибилизаторами, участвующими в фотобиологических и фотодинамических процессах, и влияние физико-химического состояния фотосенсибилизаторов на эффективности образования '02.

4. Осуществить сравнительное изучение фотосенсибилизированной хлорофиллом фосфоресценции '02, фосфоресценции и фотодеструкции хлорофилла в модельных системах, хлоропластах и листьях растений.

5. На основании результатов исследования различающихся по действию биологически важных фотосенсибилизаторов, антиоксидантов, фотопротекторов природного и искусственного происхождения провести анализ участия '02 в важнейших фотобиофизических процессах, роли дезактивации ]02 в нативных фотопротекторных механизмах и перспективах использования изученных веществ в медицине, фармакологии, нано- и биотехнологии.

Научная новизна работы. В результате представленной в настоящей диссертации работы сконструированы и созданы приборы, позволяющие проводить измерения кинетики затухания и нарастания фосфоресценции '02 и ее спектральных характеристик непосредственно в растворах, моделях биологических структур и суспензиях клеток при импульсном лазерном возбуждении.

С высокой точностью определены кинетические характеристики фотосенсибилизированной фосфоресценции *02 в воде, моделях мембран и суспензиях живых клеток. Проведено определение значений квантовых выходов генерации '02 природными и синтетическими фотосенсибилизаторами различной химической природы, лекарственными препаратами и биологически важными веществами.

Доказано влияние ассоциации и конформации мономерных, димерных и полимерных молекул водорастворимых порфиринов на эффективность генерации '02 в водных растворах и моделях биологических мембран. Установлено, что высокая эффективность ковалентных димеров и полимеров порфиринов при фотодинамической терапии связана с высоким уровнем генерации '02 за счет дезагрегации их ассоциатов в мембранах клеток. Показано, что скорость дезактивации '02 в водных растворах и моделях биологических мембран зависит от состава и свойств биохимических компонентов мембран и цитоплазмы живых клеток. Доказано участие триплетных молекул наиболее коротковолновой формы хлорофилла и синглетного кислорода в фотоповреждении хлоропластов растений при действии интенсивного освещения. Показана необходимость контроля уровня фотогенерации '02 при разработке новых средств для фотодинамической терапии кожных и опухолевых заболеваний, других веществ, обладающих фотосенсибилизирующими свойствами и перспективных для применения в медицине и биотехнологии.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Сконструированные в лаборатории экспериментальные установки, основанные на применении импульсных лазерных генераторов с высокой частотой повторения импульсов и измерении фосфоресценции 'Ог способом разрешенного во времени счета фотонов, обладают исключительно высокой чувствительностью и могут использоваться для изучения кинетических и спектральных характеристик *02, измерения времени жизни 'Ог, квантовых выходов генерации '02 и констант скоростей тушения '02 в водных растворах, суспензиях клеток и их моделях. Разработанный метод измерения применим для изучения фундаментальной роли '02 в фотобиофизических процессах, а также для развития новых методов тестирования новых соединений в био-, нано- и медицинских технологиях, технике и фармакологии.

2. Прямое измерение эффективности фотосеисибилизированного образования '02 в моделях биомембран, содержащих природные фотосенсибилизаторы, в согласии с имеющимися в литературе теоретическими представлениями об определяющей роли *02 в инициации ряда фундаментальных фотоиндуцированных процессов in vivo и иг vitro указывает на ключевую роль '02 в инициации таких

важнейших фотобиологических процессов, как фотоингибирование, фотоокисление, фотодеструкция, фотоповреждение, фотодинамическое действие и возможное участие '02 в фотоинформационных процессах. Это эффект в первую очередь определяется более активными мономерными формами фотосенсибилизаторов, однако неактивные в воде полимеры водорастворимых порфиринов в мембранах эффективно генерируют '02, что по-видимому и обуславливает их роль в фотодинамическом разрушении клеток.

3. Разрешенные во времени измерения фосфоресценции поддерживают представление о том, что высокоэффективная дезактивация 'Ог природными водорастворимыми биомолекулами отвечает за существенное сокращение времени жизни и дальности пробега молекул 'Ог в цитоплазме и водных суспензиях компонентов живых клеток и тканей и позволяют существенно уточнить влияние на эти параметры биомолекул. В частности, показано, что природа среды и характер сольватации молекул хлорофилла, бактериохлорофилла и их производных не изменяют их способность генерировать 'О2 при освещении, и эффективно дезактивировать 'Ог в темноте, сохраняя при этом достаточную устойчивость к фотоокислению. Это свидетельствует о фундаментальной фотопротекторной роли данных пигментов in vivo, которые совместно с каротиноидами защищают компоненты клеток от деструктивного действия '02.

4. Стационарная концентрация триплетных молекул хлорофилла коррелирует со скоростью фотодеструкции хлорофилла в хлоропластах и листьях нормальных и мутантных растений, существенно различавшихся по фотоустойчивости. Эти факты соответствуют представлению о том, что при действии интенсивного света, существенно превышающего порог насыщения фотосинтеза, определяющую роль в фотодеструкции пигментного аппарата хлоропластов играют, по-видимому, не •02", а триплетные молекулы хлорофилла и '02. Наиболее вероятными сенсибилизаторами образования возбужденных триплетных состояний и '02 в хлоропластах и модельных системах являются коротковолновые формы хлорофилла и прото-хлорофилл.

Теоретическое и практическое значение работы. Значение работы состоит в развитии нового научно-исследовательского направления в исследовании фо-

тоиндуцированных процессов - кинетической спектроскопии фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода в клетках, тканях и их моделях, на основе установок с импульсным лазерным возбуждением, разрешенным во времени счетом фотонов и накоплением сигнала от неограниченно большого числа лазерных вспышек. Разработанные методы кинетической спектроскопии позволяют анализировать свойства фосфоресценции *02 на фоне других люминесцентных процессов, изучать спектральные и кинетические характеристики свечения, судить об эффективности образования и скорости расходования молекул '02 в биологических и, в первую очередь, фотобиофизических процессах.

Результаты, полученные в работе вносят вклад в развитие исследований по приоритетному направлению «Живые системы», фундаментальным направлениям «Механизмы биологической фотоактивации кислорода: образование синглетных молекул кислорода и их роль в деструктивных, защитных и информационных процессах в клетках» и «Преобразование энергии света при фотосинтезе: биогенез, молекулярная организация пигментного аппарата». Эти результаты нашли практическое применение в научно-технической программе Правительства Москвы, Ми-нобрнауки РФ и РАН «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических заболеваний». Они были использованы при разработке новых методов лечения и лекарственных препаратов для фотодинамической терапии опухолевых заболеваний различной природы, фототерапии кожных и иных заболеваний, могут применяться при создании безопасных в отношении возможного фототоксического действия лекарств и косметических средств, могут найти дальнейшее практическое для повышению продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений на основе подбора методов и условий селекции, выращивания и специальной обработки, приводящих к повышению устойчивости фотосинтетического аппарата к воздействию избыточной солнечной радиации.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на 16 конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Москва, 1983), 5 Всесоюзном совещании по фотохимии (Суздаль, 1984, Всесоюзной конференции «Фотофизика и фотохимия молекулярного кислорода» (Караганда, 1985), Всесоюзной научной

конференции «Применение проблемно-ориентированных информационно-измерительных комплексов» (Кишинев, 1986), V Всесоюзном совещании по фотохимии (Суздаль, 1985), II Всесоюзной конференции «Биоантиоксидант» (Черноголовка, 1986), Международном семинаре «Эволюция фотобиологических процессов» (Пущино, 1986), Международной конференции по лазерной хирургии и терапии (Самарканд, 1988), Всесоюзной конференции «Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях» (Пущино, 1989), XIII Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Минск, 1988), Международной конференции по фотодинамической терапии (Болгария, София, 1989), Советско-Индийском симпозиуме по регуляции фотосинтеза (Пущино, 1990), 4 Конгрессе Европейского фотобиологического общества (Нидерланды, Амстердам, 1991), 9 Международном конгрессе по фотосинтезу (Япония, Нагойя, 1992), 11 Международном конгрессе по фотобиологии (Япония, Киото, 1992), 11 Биофизическом конгрессе (Венгрия, Будапешт, 1993), Международной конференции ЬАЬБ 94 (Минск, 1994), Международном симпозиуме «Стресс от действия видимого и ультрафиолетового излучения» (Франция, Париж, 1995), 1й и 2й Всероссийских конференциях фотобиологов (Пущино, 1996,1998), Юм Международном семинаре по лазерной физике (Москва, 2001), II Международном симпозиуме под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Дубна, 2002, в докладах в Гумбольдском университете (ФРГ, Берлин).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (96-03-34 100а, 98-03-32071а, 01-03-32821а, 04-03-32223а).

Диссертация обсуждалась на заседаниях кафедры физико-химической биологии и кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 37 работ. Основные результаты опубликованы в 17 публикациях в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской Федерации, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех частей, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована рисунками и таблицами. Во введении обосновывается актуальность избранной темы, формулируются гипотезы, теоретико-методологическая основа, предмет, цели и задачи исследования, формулируется научная новизна, теоретическое и практическое значение диссертации, приводятся положения, выносимые на защиту.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены научные достижения, послужившие основой данного исследования. Показано, что фотодеструктивные окислительные реакции играют существенную роль в ряду биофизических процессов, отвечающих за жизнедеятельность организмов на молекулярном уровне. Рассмотрены фотобиологические процессы, в которых по современным представлениям, ключевую роль могут играть возбужденные молекулы '02 (фотолабильность и устойчивость фотосинтетического аппарата, образование '02 фоторецепторными и фото-регуляторными компонентами клеток, компонентами хрусталика глаза, фотосенсибилизаторами фотодинамической терапии раковых заболеваний и др.). Разработка новых спектроскопических методов и подходов к изучению эффективности образования и дезактивации 'о2 в последние десятилетия позволило получать точные и достоверные данные о свойствах и механизмах участия *02 в фотобиофизических процессах. Анализ литературы показывает, что исследование живых систем путем измерения фосфоресценции кислорода существенно ограничено действием природных защитных систем и сверхнизким квантовым выходом люминесценции '02 (менее 10'8), что требует использования искусственных моделей. Заключительные положения отражают поставленные цель и задачи исследования.

Часть II. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения свойств '02 использовано явление фотосенсибилизированной фосфоресценции '02 (1270 нм) [Красновский, 1976-1979], позволяющее получать значительно более достоверную информацию об образовании, дезактивации и свойствах '02, чем применявшиеся ранее химические методы. Созданы и ис-

14

1. Лазер

■К 6

СЬ

«Стоп» ~

13. Режим

многоканальн

ого счета

«Старт»

«Стоп»

11а

1 10

! )

12

За

116

4а

2. Моно-хороматор

: 5

86: 81

У

76

|>3б ^

46

т

«Старт»

Рис. 1. Блок-схема установки для времяразрешенной регистрации фосфоресценции '02 с лазерным импульсным возбуждением. А - оптоэлектронный блок: 1 -лазер; 2 - дифракционный монохроматор; 3. фотоэлектронный умножитель (За -охлаждаемый парами азота ФЭУ-83 с предусилителем; 36 - синхронизирующий ФЭУ-51); 4а и 46 - высоковольтные стабилизированные блоки питания; 5 - свето-изолированная камера для объекта; 6 - зеркало; 7а и 76 - линзы; 8а, 86, 8в - светофильтры; 9 - кварцевая кювета с объектом; 10 - усилитель. Б - блок анализа импульсов в микросекундном диапазоне: Паи 116 - дискриминация и формирование импульса с возможностью задержки по времени; 12 - частотомер; 13 - многоканальный анализатор ОТА-1024 (Венгрия) или компьютерная плата многоканального анализа; 14 - персональный компьютер (ТОМ РС) или программируемая микро ЭВМ (при наносекундном разрешении модифицировали «Б»),

пользованы два типа установок: с времяразрешенной регистрацией одиночных фотонов в микросекундном диапазоне (рис. 1) и времякоррелированным счетом фотонов в наносекундном диапазоне (с модифицированным блоком «Б», рис. 1) с импульсным возбуждением азотными лазерами ЛГИ-21 (10 не, 20-100 Гц, 0,04 мДж) или ЛГИ-505 (0,5-1 кГц, 10-12 не, 0,02 мДж); или лазерами на парах меди (510 нм, 10 кГц, 15 не, 0,1 мДж) или (511 и 518 нм, 15 не, 12,2 кГц, 7-40 мкДж). Накапливали (суммировали) сигнал от 105-107 лазерных вспышек. Разработаны методы определения времени жизни '02 (гд) в клеточных суспензиях, моделях клеточных мембран и других средах, квантовых выходов фотогенерации '02 (Фа) и констант скорости тушения 102 (кч).

В опытах применяли методы культивирования, физиологические, препара-

и

тивные и лабораторные методики, методы абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии, описанные в литературных источниках. Объектами исследования служили суспензии бактериальных клеток; плазма крови; модельные системы на основе растворов мицелл детергента, суспензий липосом и растворов в НгО и D20, в органических растворителях; фотосинтетические пигменты растительных клеток и бактерий, белки и моноклональные антитела, хлоропласты и листья нормальных, мутантных и зеленеющих растений ячменя, гороха и кукурузы.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для понимания роли *02 в развитии фотоиндуцированных процессов требуется оценка эффективности генерации *02 природными и искусственными фотосенсибилизаторами таких процессов, определение времени жизни '02, отражающее дальность пробега и вероятность повреждающего действия ]02 в исследуемых системах, а также оценка констант скорости дезактивации (тушения) '02 компонентами клеток. В соответствии с целями и задачами исследования, наибольшее внимание было уделено анализу тех важнейших фотобиологических процессов, в развитии которых, в соответствии с литературными данными, возможно участие '02, однако достоверные систематические измерения эффективности образования и скорости дезактивации ]02 прямым люминесцентным методом не проводились.

Важной задачей нашего исследования явилось изучение феноменологии фо-тосенсибилизированной люминесценции *02 с привлечением широкого круга исследуемых объектов (от живых клеток и тканей до искусственных систем и растворов) с целью установления границ применения фосфоресцентного метода для исследования свойств '02 и выработки методик изучения таких систем.

Глава 1. Фотосенсибилизированная люминесценция 'О? в клетках, тканях и моделях мембран. В главе 1 проведен кинетический анализ фосфоресценция '02 в области 1270 нм в моделях клеток и тканей и описаны измерения, предпринятые гп vivo.

Вода представляет собой естественную среду обитания живых организмов, в значительной степени определяющей характер обменных процессов, протекающих в клетках и тканях. К началу настоящего исследования не имелось прямых данных

в *т,

J_1_1_I_и

1ХЭв 1278

Рис. 2. Кинетика затухания (а) и спектр люминесценции (б) '02 в Н20 (1) и Э20 (2). Сенсибилизатор - антрацен (3 10"5 М). Ширина щелей монохроматора - 44 нм; кинетические кривые усреднены на 3-Ю5 лазерных импульсов (337.1 нм) [Егоров, Красновский 1983]

Рис. 3. Кинетические кривые затухания фотосенсибилизированной люминесценции '02 в воде при разных давлениях 02: (1) линейная шкала, 1 атм.; (2) линейная шкала, 6 атм.; (3) полулогарифмическая шкала, 6 атм. Точками обозначены экспериментальные данные, линии показывают рассчитанные кривые по уравнению (1). 1-Ю7 вспышек лазера [Егоров и др., 1988; Е§огоу еХа\., 1989]

о кинетических свойствах '02 в воде и важнейших биохимических системах, что важно для оценки тл и дальности повреждающего действия '02 в клетках и окружающей среде. Имевшиеся данные, полученные методом ловушек, сильно варьировали. Особый интерес представляло изучение кинетики *02 в Н20 и Б20, а также в моделях мембран клеток на основе Б20 и Н20.

Для определения параметров кинетических кривых затухания фосфоресценции ®02 использовали упрощенное уравнение (1):

/(0 = /0-[ехр(-^ -/)-ехр(-£, г)] + я, (1)

где Щ - интенсивность люминесценции *02; 1о -интенсивность люминесценции '02 в начальный момент; кг и к^ - константы скорости нарастания и затухания люминесценции '02 после вспышки, соответственно (1/гг и 1/гД п - фон ФЭУ в от-

сутствии люминесценции '02. Учитывая, что время излучательной дезактивации 'О2 (trad) на порядки выше величин td, то принимали, что тА = тг1.

В первых опытах (шаг измерения - 5±0,05 мкс) наблюдали колоколообраз-ную форму кинетики люминесценции '02 в D20 и, в согласии с данными других авторов, отметили существенный изотопный эффект: примерно двадцатикратный рост времени жизни '02 в дейтерированной воде. При насыщении воздухом td составило в D20 - 67 мкс (рис. 2). Добавление компонентов, входящих в состав простых физиологических сред (например, фосфатного буфера Серенсена, NaCl), снижало Та в D20 примерно на 15-30% (до «45-55 мкс), но не влияло на хА в Н20. Кислородное барбатирование Н20 сокращало т^, указывая на то, что измеренное в насыщенных воздухом растворах rd является суперпозицией тА и г,, поэтому тл в Н20 бьшо определено при обогащении раствора 02 (табл. 1). В дальнейших опытах с наносекундным разрешением полученные результаты были подтверждены и уточнены (рис. 3). Максимум «колокола» в насыщенных воздухом растворах приходится на 2,5 мкс, тг равно 2,0+0,2. Значения тг в D20 и Н20 близки. Величина тг в Н20 сокращалась с ростом парциального давления 02 (около 0,5±0.1 мкс при 1 атм.), достигая постоянного значения при 4 атм. (rrf. тл).

Полученные нами данные подтверждены результатами других лабораторий, причем оба метода анализа люминесценции '02 в воде (с наносекундным и микросекундным разрешением) дают одинаковые результаты. В дальнейшем мы исполь-

Таблица 1. Время жизни '02 в воде и дейтерированной воде (мкс)

Среда Измерение фосфоресценции '02 Метод тушения" Метод акцепторов*"

микросекундное разрешение (Рис. 1, наши данные) наносекундное разрешение (Рис.2, наши данные) Данные других^ авторов

H20 3,1±0,5 3,2±0,2 3-4 5-7 4

d2o 67+4 - 50-75 100-120 53

'[Hurst; Ogilby; Салохиддинов; Rodgers, 1982; Parker, 1984; Shimizu, 1997] "[Красновский, 1976-1981]. ***[Lindig, 1979; Peters, 1981]

зовали оба метода измерений в соответствии с условиями и требованиями проводимых экспериментов.

Эти результаты важны для оценки времени жизни и дальности пробега молекул '02 в клетках и тканях, а также для оценки экспериментальных данных по изучению фотодинамического действия, получаемых прямьми (люминесценция '02) и косвенными (тушители, акцепторы '02) методами, а также для оценки качества Б20 при биологических тестах (см. ниже).

Модели клеточных мембран. Кинетика затухания '02 в суспензиях липо-сом (лецитин) и растворах детергента существенно отличалась от Б20 или ЦО. В соответствии с данньми Ыос^егз е! а!., 1983, 1984 мы наблюдали, что добавление 1% Тритона Х-100 к раствору тетракис(4-сульфонато-фенил)порфина (ТСФП) в Н20 повышало тЛ до 4,9+0,1 мкс, а тг - до 2,6±0,1 мкс. При концентрации детергента 10-80% тА изменялось в пределах 6-8 мкс. Это указывает на преимущественное нахождение '02 в мицеллярной фазе раствора. Для понимания этого эффекта существенен результат, полученный в нашей группе [ВиКтпа ег а1., 2001], показывающий, что добавление 5-12 мМ азида натрия (тушителя '02), который в водном растворе сенсибилизатора снижает тЛ до сотен наносекунд, что соответствует предполагаемому тА в клетках, в исследованном детергентом растворе снижает тд лишь до 2,0±0,2 мкс. В данном случае кинетика затухания люминесценции '02 определяется временем жизни триплетного порфирина, а нарастание - кинетикой дезактивации '02. Вероятно, образование '02 в живых клетках в большей степени может быть локализовано в липофильных локусах, а тл можно определить из кинетики нарастания люминесценции '02 после лазерной вспышки. Мы также провели оценку гд в ряде органических растворителей и пленках полистирола, окрашенных хлорофиллом.

Таким образом, в результате детального изучения кинетических свойств фосфоресценции '02 в Н20, 020, мицеллярных и липосомальных моделях биомембран, органических растворителях и полимерной матрице установлено, что высокая вязкость естественных мембранных систем клеток не является препятствием для образования в них синглетного кислорода.

Клетки и ткани. Изучали люминесценцию в области 1100-1300 нм при освещении суспензий хлоропла-стов в буфере Серенсена (в Н20 или В20), а также листьев зеленого гороха, этиолированных проростков фасоли на ранних стадиях зеленения (1 час) и гомогенатов из них. При их облучении импульсами азотного лазера (337,1 нм) не удалось зарегистриро-

Рис. 4. Кинетика затухания люминесце- вать свечение с характерным макси-

нции (1, 2) и спектр (3) суспензии дрож- мум 1270 Нм и гл«0,05-3 мкс, что, ножей в фосфатном буфере в Н20 {БасИа-

гот1се$ уМ) окрашенных ТСФП. (1) - видимому, определяется сильным рас-

линейная шкала; (2) полуло- сеяшш и П0ГЛ0Щении возбуждающего гарифмический масштаб; (3) - спектр

люминесценции, измеренный в интерва- света и действием нативных фотопро-ле от 2 до 7 мкс после лазерных вспьшдек текторных систем (1-Ю7) [Егоров и др., 1988; Egorov й а1.,

1989] Была предпринята попытка ис-

следования биологических систем, не содержащих природных фотопротекторных комплексов: суспензий дрожжевых или бактериальных клеток или плазмы крови. При освещении в проточной кювете при барбатировании кислородом импульсами лазера на парах меди суспензии дрожжевых клеток (БасИаготкез чтг), окрашенных ТСФП (1 ч., 25°С, 0,1 М нейтральный фосфатный буфер, Н20) и многократно промытых с последующим центрифугированием до оптической прозрачности су-пернатанта, обнаружена люминесценция с максимумом нарастания в области 300 не (рис. 4). Спектр и гА измеренные в интервале от 2 до 7 мкс после вспышки соответствовали люминесценции '02 в Н20 . Наиболее вероятным сенсибилизатором измеренной люминесценции '02 были молекулы ТСФП на поверхности клеток, что соответствовало результатам Файрей и Роджерса, полученным на окрашенных тенях эритроцитов в 020 ([ТЧгеу, 1988] и последующие работы).

Сходные результаты были получены нами при исследовании окрашенных

аналогичным способом суспензий бактерий (Е coli) или раствора плазмы крови кролика в D20 с добавлением ТСФП. В разбавленном растворе гемоглобина в D20 при облучении импульсами азотного лазера свечение '02 наблюдать не удавалось. При облучении окрашенной псораленом кожи кролика возникает фотосенсиби-лизированная люминесценция в области 1270 нм, состоящая из нескольких компонент {rd самой короткоживущей «2 мкс). Спектр люминесценции не соответствовал излучению '02, и, наиболее вероятно, что наблюдаемое свечение является суперпозицией нескольких типов люминесценции, причем доминирует, по-видимому, излучение, не связанное с '02.

Таким образом, нам удалось наблюдать компонент фосфоресценции *02 в суспензиях клеток при введении экзогенного фотосенсибилизатора. Полученные данные хорошо согласуются с результатами других авторов [Parker, 1987; Truscott, 1988; Patterson, 1990; Backer, 1991; Philips, 1997; Butorina, 2000; Ogilby, 2004, 2005]. Сходные результаты были в дальнейшем получены в лаборатории Дж.Барбера в экспериментах с содержащими природный фотосенсибилизатор фрагментами фотосинтетического аппарата. Авторы предположили, что фосфоресценция '02, по-видимому, обнаруживается в окружающей объект среде за счет фотогенерации *02 мономерными молекулами пигмента [Macpherson, 1994].

Следует отметить, что кинетическая картина фосфоресценции '02, измеренная нами in vivo, соответствовала кинетике, измеренной нами при тушении фосфоресценции *02 в водной среде (короткое нарастание, отражающее время жизни *02, и более длительное затухание в микросекундном диапазоне, соответствовавшее времени жизни триплетного состояния сенсибилизатора) [Butorina, Egorov, et al., 2001]. Это соответствует представлению о том, что время жизни *02 в живых клетках определяется тушением водой и биохимическими компонентами клеток (см. главу 3) и варьирует в пределах от десятков наносекунд до единиц микросекунд [Красновский, 1998-2004].

Таким образом, в согласии с данными других авторов, интенсивность измеренного нами свечения оказалась недостаточной для проведения систематических измерений in vivo, что, в первую очередь, по-видимому, обусловлено действием природных фотопротекторных систем. В связи с этим актуальным явилось изуче-

ние фосфоресценции '02_ фотосенсибилизированной пигментами в моделях биологических мембран, клеток и тканей.

Глава 2. Эффективность фотосенсибилизированного образования !Р? в моделях биологических мембран отражает вероятность участия '02 в фотодинамических процессах в живых клетках. В соответствии с поставленной целью и задачами исследования, нами была изучена эффективность образования '02 природными и синтетическими фотосенсибилизаторами важнейших фотобиологических процессов. Измерения проводили методом сравнения со стандартом при неизменных условиях измерения (геометрия и оптическая плотность образцов, выцветание раствора менее 10-15%,). Стандартом служили водные растворы ТСФП (10-100 мкМ) или растворы тетрафенилпорфирина (ТФП, Институт биофизики Минздрава СССР) в органических растворителях.

Фотосинтетические порфирины растительного и бактериального происхождения. Порфирины, это полифункциональные вещества, широко распространенные среди живых существ всех таксономических групп. С начала XX в. известно, что хлорофиллы, инициирующие фотосинтез и ассимилирование световой энергии, способны инициировать фотодеструкцию фотосинтетического аппарата. Представляло интерес детально изучить способность хлорофилла, бактериохлорофиллов, протохлорофилл(ид)а, а также их безмагниевыих производных сенсибилизировать образование *02 и влияние на этот процесс особенностей среды (включение в липосомы, растворение в мицеллах, сольватация и ассоциация пигмента, включение его в полимерную матрицу).

Рис. 5. Кинетика затухания (1) и спектр (2) фосфоресценции '02 в насыщенных воздухом растворах хлорофилла а после лазерных вспышек (337,1 нм, 1-3-105). (□) Triton Х-100, (■) суспензии липосом (яичный лецитин) в D20, (•) диэтиловый эфир, (0,2) раствор мицелл детергента Triton Х-100 (0.14%) в D20

Установлено, что эффективность образования '02 (Фа ) бактериальными пигментами и хлорофиллом а в диэтиловом эфире и пиридине различается несущественно и варьирует в пределах 40-55% (рис. 5, табл. 2). Несколько выше значения ФА в СС14 (55-75%). В мицеллярном растворе детергента Тритона Х-100 Фл заметно меньше (10-35%). Наиболее резкое уменьшение Фл наблюдали в растворах пигментов в воде, содержащей 5% этилового спирта (Фл <0,03%). Спектры поглощения растворов свидетельствовали, что в органических растворителях и в водных растворах детергента пигменты мономерны. В диэтиловом эфире, по-видимому, центральный атом магния бактериохлорофиллов и хлорофилла сольва-тирован одной молекулой растворителя, а в пиридине - двумя [Callahan, 1987]. В D20 без детергента пигменты, судя по смещению ИК-максимумов поглощения в длинноволновую область, представлены главным образом молекулярными ассо-циатами-олигомерами. В пленках полистирола Фл в 2—3 раза меньше, чем в ацетоновых растворах хлорофилла. Учитывая измеренное нами низкое значение Фа фитола и низкую молярную экстинкцию при длине волны возбуждения (в 50 раз ниже, чем у хлорофилла), можно заключить, что его вклад в генерацию '02 хлоро-филлами ничтожен.

Биосинтетические предшественники хлорофилла. 5-аминолевулиновая

Таблица 2. Относительные значения квантовых выходов генерации '02 пигментами фотосинтезирующих бактерий (Фа, отн. ед,, ± 10%)

Пигмент ссц* Диэтило-вый эфир Пиридин D20 /тритон Х-100 D20 + 5% этанола

ТПП (ТСФП) 1 1 1 1 1

Хлорофилл а 0,82 0.74 0.84 0.50 <0,03

Бактериохлорофилл а 0.86 0.61 0.60 0.15 <0,03

Бактериохлорофилл Ъ 0,93 0.68 0,62 0.22 <0.03

Бактериофеофитин а 1,07 0.69 0.90 0,52 <0,03

Бактериофеофитин b 1.07 0.61 0.72 0.50 <0.03

* [Красновский и др., 1979-1985]

кислота и а, а'-дипиридил приводят к накоплению биосинтетических предшественников хлорофилла, резко снижая фотоустойчивость фотосинтетического аппарата растений, что может быть использовано для создания фотодинамических гербицидов. Мы исследовали эффективность фотосенсибилизированного образования 'Ог предшественниками хлорофилла - протохлорофиллидом (ПХд), протохлоро-филлом (ПХл), протопорфирином IX (ПП, в органических растворителях использовали диметиловый эфир ПП - ПП-ДМЭ) и его магниевым комплексом, что, вероятно, лежит в основе фотогербицидного действия.

В диэтиловом эфире все исследованные пигменты мономерны и обладают близкой фотосенсибилизирующей активностью, практически совпадающей с описанной ранее активностью ПХл ПП-ДМЭ в СС14. При этом значения ФА, равные или выше (на 10-20%) Фл ТФП или ТСФП, близки к значениям Ф, исследованных порфиринов. Судя по спектрам поглощения, в мицеллярных водных растворах ПП и М§-ПП-ДМЭ мономерны и, вероятно, сорбированы на мицеллах детергента. Согласно с этим Фл ПХл и ПХд в мицеллярных растворах и в эфире совпадают. Пигментные агрегаты, по спектральным свойствам близкие к основной фотоактивной форме предшественника хлорофилла в растениях, примерно на два порядка менее активны, чем мономерные пигменты, активность которых не зависела от природы среды и контакта с водной фазой. Таким образом, фотосенсибилизиро-ванная порфириновыми предшественниками генерация 'Ог может быть основной причиной фотогербицидного действия стимуляторов биосинтеза хлорофилла, а генерация 'Ог коротковолновых форм хлорофилла причиной фотоповреждения растений, богатых такими формами, например, мутантных или зеленеющих.

Водорастворимые порфирины и их применение в фотодинамической терапии (ФДТ). Эффект нехирургической (лазерной) ФДТ определяется способностью красителей избирательно накапливаться в пролифелирующих клетках опухолей и при освещении вызывать их фотодинамическое разрушение. Избыточное накопление эндогенных порфиринов - причина патологической светочувствительности, фотодинамических болезней и интоксикаций. Разработка современных мето-

дов ФДТ требует исследования свойств природных и синтетических порфиринов для их использования в качестве фотосенсибилизаторов, и участия *02 в ФДТ.

Исследовали производные мезо-, дейтеропорфирина и порфирина (структура и форма использованных порфиринов описаны в диссертации) при концентрация 5-45 мкМ. В спиртовых и слабощелочных водных растворах генерация '02 тетра(Ы-метилпиридиний)порфирином (ТМПП) практически была равна активности ТСФП, а Фл не зависела от их концентрации (5—30 мкМ) и природы среды. При изучении фосфоресцентным методом фотосенсибилизирующей активности порфиринов в разных средах, мы фактически получаем относительные значения отношения Ф/Jtrach где Trad радиационное время жизни '02 в использованных средах. Оказалось, что (t>Jrraii в растворах ТСФП и ТМПП в D20 существенно меньше, чем в этаноле и в растворах ТФП в CCI4 и бензоле. Анализ привел нас к заключению, что изменение 0Jvrad в этих средах связано с изменением Traj, тогда как Фл остается примерно постоянным. В дальнейших опытах мы учитывали это явление при оценке абсолютных значений Фл порфиринов.

В качестве стандартов для определения ФА в водных растворах и спиртовых растворах использовали ТСФП или, в отдельных опытах, рибофлавин, а в органических растворителях - ТФП. По литературным данным и в соответствии с проведенным нами анализом наиболее вероятная величина абсолютного значения Фл для этих стандартов в водных растворах 65±5%, в спирте и других органических растворителях - 70±5%.

В водных растворах гематопорфирин (ГП) и производное гематопорфи-рина (ПГП) образуют смесь мономерных и ассоциированных молекул, относительное содержание которых зависит от концентрации порфирина, его химического строения и pH. Мономеризация достигается при добавлении детергентов, этанола и других органических растворителей. Наибольший эффект при ФДТ оказывает ПГП. Высказывались различные мнения о фотодинамической активности мономеров и агрегатов: одинаковой [Seret, 1986; Moan, 1984] или более высокой у мономеров [Reddi, 1983; Lambert; Keene, 1986].

Измерение люминесценции '02 показало, что наибольшая величина Фл характерна для мономерных молекул свободного основания ГП в этаноле и дикатио-на ГП в кислых водных растворах (рБ 2). В щелочных растворах или в смеси Б20 с этанолом (2:1) Фл ассоциатов ГП существенно ниже, причем минимальное значение Фа характерно для нейтральных водных растворов, содержащих максимальное количество ассоциатов. Таким образом, агрегаты ГП по крайней мере в 3 раза менее активны, чем мономерные молекулы ТМПП, ТСФП, и ГП.

Удалось выявить три типа ассоциатов порфиринов, сильно различающихся по (1) димеры ТСФП со слабым взаимодействием молекул в димере, не отличающиеся от мономеров по Фй и спектру поглощения (полоса Соре); (2) агрегаты ГП (димеры с примесью олигомеров), отличающиеся от мономеров по спектру поглощения и имеющие, примерно, в 20 раз меньшее значение Фл, чем у мономеров; и (3) агрегаты (олигомеры), например, БФАА-МП, практически не генерирующие синглетный кислород. Столь же низкий Фл характерен для водных коллоидных растворов, содержащих агрегаты не растворимых в воде порфиринов — хлоро-филлов, эфиров протопорфирина-1Х и мезопорфирина-1Х и их металлокомплек-сов.

Ковалентные димеры (ДФ) и олигомеры (ОФ) в составе ПГП. В отличие от образующихся в воде ассоциатов ГП, молекулы, составляющие ДФ и ОФ и наиболее активные при ФДТ, соединены ковалентными связями. В Э20 спектры ДФ и ОФ соответствуют ассоциатам ГП; в детергентных и спиртовых растворах -растворам ГП, содержащим смесь мономеров и ассоциатов. Фа ДФ и ОФ в Э20 существенно ниже, чем у ГП в тех же средах, причем ОФ менее активна, чем ДФ (табл. 3). Таким образом, ассоциированная конформация полимерной фракции ПГП обладает относительно низкой фотодинамической активностью. В спиртовых и мицеллярных растворах ДФ и ОФ наблюдается существенное увеличение Фа, который, однако, не достигал значения, характерного для мономерных молекул ГП, что, видимо, определяется частичном разрушением внутри- и межмолекулярных комплексов под действием органического растворителя или детергента.

Таблица 3. Эффективность генерации '02 (Фл отн.ед.) агрегатами порфиринов

Сенсибилизатор D20 D20+2% ТХ100 Этанол

ТСФП 1,0 1,0 1,0

Гематопорфирин IX 0,40±0,10 1,05±0,07 0,95±0,09

Димерная фракция 0,15±0,05 0,75±0,05 0,85±0,04

Олигомерная фракция 0,09±0,02 0,70±0,07 0,44±0,07

Таким образом, димерные и олигомерные производные ГП генерируют '02 в водных растворах существенно хуже не только мономерных, но и ассоциированных молекул ГП. Фл резко возрастает в системах, моделирующих липидную фазу биомембран. Поскольку, полимерные компоненты более гидрофобны, чем ГП, и локализуются преимущественно в липидной фазе [Dougherty, 1987], можно предположить, что именно этот эффект определяет участие димерных и олигомерных компонентов в действии препаратов, перспективных для фотодеструкции опухолевых клеток, и играет ключевую роль в ФДТ.

В согласии с этим препараты, используемые в ФДТ: Фотофрин (Photofrin), Фотосан (Photosan), Фотосан III (Photosan III) и лабораторный препарат ПГП - обладали в исследованных системах примерно одинаковой фотосенсибшшзирующей активностью с существенным (в 3,5-7,5 раза) увеличением Фл в мицеллярном растворе по сравнению с D20. Наибольший рост (в 7.5 раза) характерен для обогащенных олигомерной фракцией смесей Фотофрина и Фотосана.

Следует отметить, что более глубокое проникновение ИК-излучения в ткани организма делает перспективными сенсибилизаторы бактериального происхождения, поглощающие свет в «окне прозрачности» тканей. Бактериофеофорбид а и метил-бактериофеофорбид а, также как и производные хлорофилла а (феофор-бид и феофитин) в мономерной форме (диэтиловый эфир, мицеллы детергента в D20) имели высокие ФА близкие к значениям Ф, (40-65%), что позволяет считать эти пигменты перспективной группой сенсибилизаторов для ФДТ.

Кинетический анализ процесса образования '02 в результате тушения 3Р кислородом позволил заключить, что Фд =Ф,ккк0га Фл и Ф, могут отличаться на

величину отношения sA=k&k0^[ (k0i - общая константа скорости тушения 3Р кислородом; кл - константа скорости переноса энергии от 3Р на 02 с образованием '02) Ранее показано, что в растворах, содержащих молекулы порфиринов в мономерном состоянии, кА~к0г, а Ф& ~Ф1 [Krasnovsky, 1979; Венедиктов, 1982 и др.]. Импульсный фотолиз показал, что агрегация ГП в водных растворах незначительно снижает Ф, и т, [Reddi, 1983; Lambert, 1986; Smith, 1985], что не может объяснить описанное выше резкое уменьшение Фл при агрегации ГП и производных МП. С другой стороны, образование длинноволновых агрегатов хлорофилла и феофити-на, по-видимому, олигомеров, сопровождается резким уменьшением Фг и г,, достаточным для существенного уменьшения Фд [Bowers and Porter, 1967; Гуринович и др., 1968]. Это наблюдение согласуется с изложенным в предшествующем разделе предположением, что уменьшение Фд обусловлено образованием олигомеров порфиринов.

Таким образом, наши измерения показали, что также как и в предшествующих измерениях в органических растворителях [Красновский, Венедиктов, 19771982; Джагаров, Гуринович и др., 1980-1982] в водных растворах наибольшей фо-тосенсибилизирующей активностью обладают мономерные молекулы порфиринов и их комплексы с цинком, магнием, оловом, алюминием, кадмием и некоторыми другими металлами. Причем активность порфиринов без металла не зависит от их химической структуры, ионизации, связывания с аминокислотами. Весьма вероятно, что высокую активность сохраняют также димерные молекулы некоторых порфиринов, однако образование олигомеров сопровождается резким уменьшением эффективности фотогенерации '02. Отсюда следует, что среди изученных соединений наиболее перспективны для фотодинамической терапии порфирины, не образующие агрегатов в клетках опухолей.

Конъюгаты порфиринов с моноклоншьными антителам и._Высокяс терапевтические дозы порфиринов за счет невысокой селективности их накопления

в опухолевой ткани по сравнению с нормальной (обычно не выше, чем в 10 раз) и связывание сывороточными белками являются недостатками методики ФДТ. Ко-валентные конъюгаты порфиринов с антителами к специфическим опухолевым маркерам (фотоиммунотоксины, [Ме\у, 1985]), могут снизить эффективную дозу вводимого порфирина в 50—100 раз. Мы изучили ковалентные конъюгаты 2,4-ди (а-метоксиэтил) дейтеропорфирина IX (ДМДП), копропорфирина 1 (КП) и цикло-пентен-копропорфирина I (ЦКП), с мышиными моноклональными антителами класса ^М к специфическим поверхностным маркерам клеток аденокарциномы легкого человека (т1§М), мышиными моноклональными антителами к инсулину (клоны С7 класса ^в] - ш^О] и В9 класса 1§М - ш!§Ма; мышиными моноклональными антителами к раковоэмбриональному антигену класса ^вга (т^С2а) и человеческим у-глобулином (hIgG), не содержащих несвязанного порфирина. Спектры поглощения соответствовали смеси мономеров и ассоциатов порфиринов: одна молекула белка связана с 3-5 молекулами порфирина.

Исследованные порфирины эффективно сенсибилизировали образование '02 в свободном состоянии и в составе ковалентных конъюгатов с антителами, хотя в последнем случае эффективность фотогенерации '02, как правило, ниже и близка к Фа растворов порфиринов, содержащих большую долю ассоциатов. Эффективность генерации *02 фотоиммунотоксинами слабо зависит от природы бежа и не зависит как от класса антител (ГдО или ^М, 150 и 950 кД, соответственно), так и от источника выделения (мышиные или человеческие глобулины). Было показано, что фотодинамическая активность порфиринов по отношению к клеткам аденокарциномы легкого человека существенно ниже (или отсутствует вовсе, как в случае ЦКП и КП), чем и их конъюгатов с моноклональными антителами [Егорова, 1988; Егоров, 1990; РаркоУБки, Щохо\, е1.а1, 1990], причем цитотоксическая активность конъюгатов коррелировала с величиной Фл. Фотоцитотоксическая активность конъюгатов по отношению к неспецифическим маркерам (другие опухоли, нормальные ткани) не проявлялась [Егорова, 1988].

Таким образом, конъюгаты порфиринов с антителами к антигенам раковых клеток могут служить эффективными сенсибилизаторами образования '02 и ини-

циировать фотодинамическое повреждение клеток, что указывает на перспективность их применения для повышения эффективности ФДТ, а предложенный метод анализа эффективности фотогенерации '02 в сочетанием с оценкой фототоксической активности может быть использован для разработки и тестирования новых классов фотоиммунотоксинов для их медицинского применения.

Помимо порфирин-содержащих фотосенсибилизаторов нами были изучены представители других классов биологических сенсибилизаторов, играющие ключевую роль в инициации важнейших биологических процессов.

Птерины и флавины составляют другую важную группу фотосенсибилизаторов. Хромофорная функция природных птеринов определила интерес к изучению механизмов их участия в фотохимических реакциях (фотолизисе ДНК, "эффекте синего света", фотодинамическом действии УФ излучения). Интересным кажется и возможное функциональное сходство птеринов с флавинами. Флавины известны в качестве коферментов конечных стадий ферментативных окислительных процессов, возможна их роль в фоторецепции и фотосенсибилизации фотоокислительных реакций [Sanear, 1994; Lin, 1995; Malhotra, 1995 и др.]. Нами была исследована способность 2-амино-4-гидрокси-6,7-диметилптеридина (ДМП), 2-амино-4-гидрокси-6-тетрагидроксибутил- (D-арабо-)- птеридина (ТОП), рибофлавина, ФАД и ФМН генерировать ]02 в воде после вспышек импульсного лазера.

Эффективность образования '02 птеринами оказалась достаточно высокой Ф& (10-20%), указывая на существенную долю именно этого механизма преобразования оптической энергии и возможность участия молекул ]02 в сигнальных и деструктивных процессах, фотосенсибилизируемых птеринами в живых клетках. Полученные значения близки Ф, 2-амино-4-гидроксиптеридина (20%).

Рибофлавин и ФМН показали высокоэффективную генерацию '02. (абс.<2>1«50%), тогда как активность ФАД существенно (в 6-7 раз) ниже. Высокие уровни Фа птеринов и флавинов позволяют предположить возможное непосредственное участие молекул '02 в процессах, сенсибилизируемыми исследуемыми соединениями в живых, в частности, фоторецепторных клетках. Одной из возможностей является, как указывалось ранее, фотоокисление компонентов клеток, приво-

дящие к снижению концентрации физиологически активных веществ или повреждению клеточных мембран, что может в дальнейшем привести к появлению физиологических реакций или структурным нарушениям.

Фурокумарины (псоралены), широко используемые для фотоиндукции метагенеза, фототерапии псориаза и витилиго, бактерицидного действия, могут вызывать эритемы, пигментацию и изменения свойств кожи; отвечают за развитие фотоаллергий при контакте с листьями ряда зонтичных и играть роль активируемых светом фитоалексинов растений. Фотореакции псораленов включают как без-кислородные, например, фотозависимое связывание с ДНК, так окислительные, возможно, с участим '02 [Poppe, Grossweiner, 1975].

Наши измерения (в соответствии с предшествующими измерениями в CCI4 [Красновский, Потапенко и др. 1983]) показали, что освещение растворов псораленов в D20, метаноле, Н20 и смеси спиртов и воды вызывает люминесценцию *02 с максимумом около 1272 нм. Активность всех псораленов и кумарина оказалась близкой: абсолютная величина ФА достигала 1-5%, то есть, существенно, примерно на порядок больше, чем в СС14, который, очевидно тушит основное возбужденное состояние псораленов.

Достаточно низкий абсолютный выход ФА фурокумаринов, по-видимому, объясняет невыраженный спектр люминесценции в области 1270 нм в содержащей псорален коже кролика (см. выше). Наши данные согласуются с выводом о том, что лечебный фотомедицинский эффект фурокумаринов (ПУВА терапия), по-видимому, не связан с генерацией *02 [Потапенко, 2000]. Полученные нами данные, тем не менее, не отрицают возможности участия '02 в некоторых фотореакциях in vivo, а также, возможно, при фотодеструкции пестицидов и дефолиантов, химически родственных фурокумаринам, в природных условиях [Клюев, 2003].

Компоненты хрусталика глаза и лекарственные препараты. Развитие старческой катаракты — следствие помутнения хрусталика за счет образования поперечных сшивок между молекулами белков-кристаллинов, главным образом, из-за накопления [Зигман, 1977]) производных кинуренина и ß-карболинов и сенсибилизации ими окисления компонентов хрусталика кислородом. Наряду с этим

функцию эндогеных фотосенсибилизаторов в водянистой влаге и хрусталике может выполнять рибофлавин и тетрациклин. Оказалось, что Фл (±15%) в 020 кину-рениновой кислоты лишь в два раза ниже, чем у рибофлавина, тогда как самими слабыми генераторами '02 (около 1%) оказались кинуренин и его 3-гидрокси производное, а харман и тетрациклин гидрохлорид (около 5%) показали промежуточные значения. Таким образом, прямые измерения люминесценции '02 подтверждают представление о возможности участия '02 в фотосенсибилизированном исследованными соединениями процессе образования катаракты.

В итоге, полученные данные говорят о высокой фотосенсибилизирующей активности исследованных ключевых природных и синтетических фотосенсибилизаторов важных фотобиологических процессов. Наибольшую активность показали мономерные молекулы порфиринов и их комплексы с металлами, аминокислотами и биологическими макромолекулами (моноклональными антителами). Оказалось, что высокую активность, по-видимому, сохраняют также димерные молекулы некоторых порфиринов, однако образование олигомеров сопровождается резким уменьшением эффективности фотогенерации '02. Высокая фотоактивность ковалентных олигомеров порфиринов - компонентов ПГП - при ФДТ, по-видимому, определяется разрушением ассоциатов порфиринов в клеточных мембранах, причем активность ди- и олигомеров порфиринов в этом случае близка и лишь несколько ниже активности порфиринов в органических растворителях. Поскольку эффективность и степень агрегации существенно зависит от структуры порфиринового макроцикла, этот вывод открывает возможность для направленного синтеза активных сенсибилизаторов новых поколений для фототерапии или низкоинтенсивной лазерной терапии и указывает на перспективность использования люминесценции *02 в качестве метода отбора таких соединений.

Значения Фа, полученные при исследовании фотосенсибшшзаторов непор-фириновой природы (флавинов, птеринов, фурокумаринов, производных кумарина и родственных соединений и др.), указывает на возможное участие молекул '02 в фотомедицинских, фотодинамических, и, возможно, фотоинформационных процессах, фотосенсибилизируемых этими соединениями в живых клетках, что хоро-

шо согласуется с обсуждающимися в литературе путями вовлечения '02 в указанные фотобиологические процессы. Полученные значения Фл согласуются с результатами косвенных измерений, а примененный подход перспективен для исследования широкого круга аналогичных фотосенсибилизаторов, как природного, так и искусственного происхождения.

_Глава 3. Оценка скорости дезактивации 'СЬ в биологических системах

на основании оценки констант скорости тушения 'О? компонентами мембран и цитоплазмы живых клеток. В предыдущих главах нами были исследована способность ряда биохимических компонентов клеток и фотосенсибилизаторов приводить к образованию '02 в растворах и биологических моделях при действии света. Воссоздание целостной картины процессов, происходящих при образовании '02 в живых системах и моделях, требует оценки скорости дезактивации молекул '02 при взаимодействии с компонентами живых клеток, поскольку, по-видимому, именно этот процесс лежит в основе действия некоторых нативных фотопротекторных механизмов, приводящих к снижению уровня фотогенерации '02 до ничтожно пренебрежительных значений в нормально функционирующих неповрежденных клетках живых организмов.

Значения кч (кч = кох + кру), определяли на основании прямого анализа концентрационных зависимостей изменения кинетики затухания люминесценции '02. Значения кч определяли с помощью упрощенного уравнения Штерна—Фольмера на основании измерения в отсутствие (тм) и в присутствии тушителей

(%): т"у -1 + к^тАаСс, где Сд—молярная концентрация тушителей. При этом всегда проверяли выполнение условия линейности для исследуемой системы в координатах Штерна-Фольмера. Такой метод точнее метода, основанного на изменении интенсивности свечения '02, и позволяет исключить ошибки, связанные с экранирующим действием тушителей. Главным образом, измерения проводились в водных растворах и водных моделях мембран. Тяжелая вода была использована в опытах в связи с тем, что в этой среде значение тл существенно больше, чем в Н20

Таблица 4. Тушение '02 фотосинтетическими порфиринами (kq • 108, М"1 «с'1)

Данные этой работы Данные работы "

Пигмент Диэтиловый эфир Пиридин ССЦ

Хлорофилл а 1,0 + 0,3 0,9 ± 0,3* 7,0 ± 0,7

Бактериохлорофилл а 2,2 ± 0,3 5,9 ± 0,8 9 ± 2

Бактериохлорофилл b 5,8 ± 0,9 13,0 ±3 15 ± 10

Бактериофеофитин а 0,3 ± 0,1 - 0,12 ±0,01

Бактериофеофитин b 1,9 ±0,1 2,8 ± 0,5 2 ± 1

'Измерено в дейтерированном пиридине; " [Красновский, 1985].

и поэтому точность определения констант скоростей тушения '02 в тяжелой воде существенно выше, чем в обычной.

Фотосинтетические пигменты растений и бактерий. Ранее была обнаружена способность фотосинтетических пигментов порфириновой природы наряду с фотогенерацией '02, эффективно тушить '02 [Красновский, 1979, 1985]. Мы попытались оценить значения кч представителями группы фотосинтетических пигментов зеленых растений и бактерий в различных условиях.

Хлорофилл а. В дейтеропири-дине, ацетоне, диэтиловом эфире и в водном растворе мицелл детергента Тритона Х-100 в Э20 кч практически одинаковы и незначительно меньше, чем в четыреххлористом углероде (рис. 6, табл. 4). Следовательно, хлорофилл в разных средах остается активным тушителем '02. В ацетоне кч фитола на несколько порядков ниже, чем у хлорофилла, следовательно, порфириновый

Конценарация хлорофилла, М (*105)

Рис. 6. Тушение фосфоресценции *02 хлорофиллом а в 0.14% растворе мицелл детергента Тритона Х-100 в D20. Рассчитано по общей концентрации хлорофилла в растворе (Kobs =l/u К0=1 /тЛ0)

макроцикл определяет величину кя молекулы хлорофилла.

С целью изучения влияния сольватации на вклад в суммарную активность хлорофилла химического тушения, выражающегося в фотодеструкции тушителя (в данном случае тушителем является сенсибилизатор), мы исследовали процесс фотоокисления пигмента кислородом в ацетоне и дейтерированном пиридине. Эффективность окисления хлорофилла в СС14 примерно в 4 раза выше, чем в дейте-ропиридине и ацетоне. Ранее показано, что в СС14 пигмент разрушается в 1 случае из 350 актов тушения '02 (Красновский, Венедиктов, Черненко, 1982) следовательно, в дейтеропиридине и в ацетоне фотодеструкция пигмента происходит примерно один раз на 1500 событий тушения 'Ог- Таким образом, хлорофилл а является чрезвычайно эффективным физическим тушителем '02 и его активность близка к активности каротиноидов (кч р-каротина = (0,7-3)»Ю10 М^с"1). Следовательно, хлорофилл - вероятный фотопротектор мембран хлоропластов, а его защитная роль определяется способностью молекул хлорофилла тушить '02.

Исследованные бактериальные пигменты эффективно тушат '02 причем бактериохлорофиллы существенно более активны, чем их безмагниевые производные (табл. 4). Ранее показано, что фотоустойчивость бакгериохлорофилла в ди-этиловом эфире почти на два порядка величины выше, чем в других растворителях, тогда как кч в эфире меньше лишь в 2—4 раза и, следовательно, повышенная фотоустойчивость пигмента в эфире — следствие малой величины константы скорости химического тушения '02 бактериохлорофиллами в этом растворителе.

Полученные нами результаты и данные других авторов были использованы для оценки тл и средней дальности пробега '02 в живых клетках и обобщены в обзоре [Красновский, 2001 и ссылки в нем]. Учитывая, что концентрации пигментов в фотосинтетических мембранах высока (около 3*10'2 М) это должны приводить к существенному тушению '02 (тл около 70 не, пробег'02 около 55 нм, что соответствует примерно половине толщины мембраны). Наоборот, при более низких концентрациях пигментов в клетках, характерных при ФДТ (35*10"4 М), тушение не существенно. Этот факт следует учитывать при разработке методов и препаратов

для фотодинамической терапии, а также анализа фотоустойчивости и фотоповреждения бактериальных, растительных и животных клеток.

Водорастворимые компоненты клеток и тканей. Вода является естественной средой живых организмов, а оценка длины пробега молекул *02 и тА в живых клетках и in vitro требует оценки скорости тушения '02 компонентами клеток растений и биологически важных веществ (белков, аминокислот, нуклеотидов, Сахаров, полисахаридов). Особое внимание уделено веществам, функции которых, по-видимому, в той или иной степени определяются их способностью дезактивировать !02 (дипептиды, оммохромы, меланины и др.).

Эксперименты показали, что зависимость тл от концентрации тушителя (Q) хорошо аппроксимируется прямой (рис. 7), указывая на то, что процесс тушения '02 подчиняется уравнению Штерна — Фольмера, что позволяет определить значения kq для исследованных соединений.

Оказалось, что среди испытанных соединений наибольшую кд имеют восстановители: аскорбат натрия, НАД-Н (около 1*10"7 M'V) и высокомолекулярные соединения: сывороточный альбумин и фикол-400. Активность этих веществ близка к активности азида натрия и триптофана — соединений, которые часто используются в качестве ингибиторов с целью определения участия J02 в фотодеструктивных процессах. Менее эффективны компоненты буферных растворов, сахара, нуклеотиды, органические кислоты (более подробные данные приведены в тексте диссертации). Восстановление НАД до НАД-Н приводит к значительному (на три порядка) увеличению кд. Неорганическая

Рис. 7. Тушение фосфоресценции соль ^¡аС1) практически не способна 02 в D20 азидом натрия (1); сывороточным бычьим альбумином дезактивировать *02 (kq «103 М"'с"').

(2); сывороточным альбумином Полученные нами данные хорошо человека (3) фиколом-400 (4).

Сенсибилизаторы - рибофлавин совпадают с данными других авторов для (1,4) или карбоксиантрацен (2, 3)

0.1 0.2 0 3 0.4 мМ

большинства соединений, но в некоторых случаях (аскорбата, НАД) можно отметить некоторые расхождения между результатами разных лабораторий.

Проведенные эксперименты показывают, что аскорбат может играть фотопротекторную роль по механизму тушения '02 как in vivo (например, в тиллакои-дах хлоропластов, где его содержание до 50 мМ, что сравнимо с концентрацией самого хлорофилла), так и в некоторых искусственных системах при физиологически нормальном содержании аскорбата (см. также [Szigeti, 1984].

Гистидин-содержащие соединения - карнозин и анзерин устраняют мышечное утомление, защищают клеточные мембраны от повреждений, дезактивируют АФК что, по-видимому, играет ключевую роль в антиоксидантной активности указанных соединений [Болдырев, 1977,1990]. Мы изучили эффективность тушения '02 в водной среде ß-аланином, L-гистидином, карнозином и имидазо-лом, а также другими биохимическими компонентами мышечной ткани (анзерином и таурином. Сенсибилизатором служили водорастворимое производное антрацена и рибофлавин, поскольку ТСФП не-эффективен из-за вероятного образования комплекса с гистидин-содержащими соединениями.

Процесс тушения *02 подчинялся уравнению Штерна-Фольмера (рис. 8), а величина kq не зависела от природы фотосенсибилизатора. Значения kq для производных имидазола в среднем близки величине константы скорости тушения *02 имидазолом и варьировали в пределах от 2*107 до 4.107М, что хорошо соотносится с данными других авторов [Rougee, 1986, 1986, Michaeli, 1994, Devasagayum, 1991]. ß-аланин (входящий в состав карнозина) тушит '02 существенно слабее, что подтверждает предположение о том, что способность имидазолсодержащих соединений тушить *02 определяется химической структурой имидазола, а пептидная связь между гистидином и аланином в составе карнозина не влияет (в пределах экспериментальной ошибки наших измерений) на величину kq. Активность гистидин-содержащих дипептидов анзерина и эрготеонеина, отличных по своему строению и биологической роли от карнозина, была близка к kq карнозина и гис-тидина. Таурин не обладал существенной измеримой активностью тушения '02.

Таким образом, карнозин не превосходит гистидин и другие гис-тидин-содержащие вещества по способности дезактивировать '02. Нами не подтверждены более ранние результаты (метод акцепторов) о том, что карнозин в два- четыре раза более активный тушитель '02, чем свободный L-гистидин [Pavlov, 1993, Dahl, 1988]. Учитывая тот факт, что физиологически активные концентрации карнозина часто ниже, чем требуемые для эффективного тушения '02, а ан-тиоксидантная и физиологическая активность этих соединений может существенно различаться [Болдырев, 1998], можно считать, что биологическое значение дипептидов не исчерпывается их способностью тушить '02, а скорее связано с их способностью нейтрализовать другие АФК или определяется другими свойствами этих соединений.

Меланины позвоночных животных и оммохромы беспозвоночных — широко распространенные пигменты, локализованные, главным образом, в тканях глаза, кожных покровах, а также в некоторых структурах мозга и внутренних органов. Они эффективно экранируют видимое и УФ излучение и способны ингиби-ровать темновые и фотосенсибилизированные процессы перекисного окисления липидов. Основа их антиокислительной активности - связывание прооксидантных ионов железа в неактивные комплексы и взаимодействие с *02. Поскольку, как отмечалось выше, инициаторами фотосенсибилизированных реакций окисления в структурах глаза и клетках кожи могут служить молекулы *02, мы исследовали взаимодействие синтетических ДОФА-меланинов (полимер 5,6-индолхинона) и оммохромов (из глаз креветок) с '02 в модельной системе, в качестве которой были выбраны водные растворы. Препараты меланинов содержали смесь из полимерных молекул разной длины и молекулярной массы.

Концентрация тушителя, М 104

Рис. 8. Зависимость тушения фосфоресценции '02 в координатах Штерна-Фольмера для карнозина (1), анзерина (2), имидазола (3) и азида натрия (4) в О20 -фосфатном буфере. В качестве фотосенсибилизатора использован кар-боксиантрацен

Установлено, что все исследованные пигменты эффективно тушат '02. Ом-мохромы—слабые тушители '02 (кч = (0,3±0,1)»106 М^с"1), тогда как ДОФА-меланин весьма активен. При оценке активности ДОФА-меланина рассчитывали активность одного мономерного звена в молекулах меланина (1,2±0,6)«108 М"'с"'. Однако минимальное количество мономеров в меланине не менее 50, поэтому значения кч для полимера, примерно, на два порядка величины выше, чем для мономера.

Тушение '02 было обнаружено также при введении в растворы меланосом ретинального пигментного эпителия (органеял, основным составляющим компонентом которых является меланин) и в водных растворах щелочного экстракта из чернильного мешка кальмара, содержащего -70% природного меланина — сепио-меланина. Следует отметить, что в палочках сетчатки основным тушителем '02, по-видимому, является родопсин; с учетом его концентрации и кч было рассчитано время жизни и длина пробега '02 в наружных сегментах палочек сетчатки, которые составили около 400 не и 13 нм [Красновский, 2001].

Таким образом, обнаружено новое свойство экранирующих пигментов— меланинов и оммохромов,— способность тушить синглетный кислород. Следовательно, можно полагать, что функция меланина в структурах глаза и клетках кожи состоит не только в экранировании солнечной радиации, но также и в ингибирова-нии фотодинамического повреждения клеток путем тушения *02 и ингибирования свободнорадикальных реакций.

Вода, органические растворители, детергенты. Жизнеспособность организмов в значительной степени определяется высоким содержанием воды как внутри их клеток, так и, в ряде случаев, в окружающей среде, а нарушение водного обмена и баланса, обезвоживание - существенные факторы комплексного функционального нарушения жизнедеятельности. Таким образом, многие нарушения метаболизма, в частности связанные с образованием АФК, включая фотодеструктивные, разворачиваются в системах, насыщенных водой. Как указывалось выше, гА в Н20 существенно отличается от органических сред (значительно ниже). В связи с этим, Н20 можно рассматривать как тушитель, ограничивающим время

жизни и дальность пробега '02 в живых клетках. Представляло интерес изучить, зависит ли способность молекул Н20 дезактивировать ]02 от молекулярного окружения (например, в органических растворителях, детергентах, мицеллах). Оказалось, что эта зависимость несущественна (кд = 2,8-4,4.10'3 М"'с"'). Некоторый рост способности Н20 дезактивировать ]02 мы наблюдали в дейтерированной воде (4,4«10"3 М"'с"'). Таким образом, молекулы воды способны активно дезактивировать молекулы '02, вызывая их дезактивацию в различных компартментах клеток живых организмов. Следует отметить, что разработанный метод анализа тушения водой люминесценции '02 в D20 может быть использован как метод контроля содержания Н20 в D20 при использовании замены обычной воды тяжелой водой при проведении биофизических и биохимических исследований (например, при имму-нофосфоресцентном анализе [Савицкий, 2000]).

Полученные нами данные подтверждают, что многие биологически-значимые компоненты клеток и моделей биологических мембран являются эффективными тушителями 102. В согласии с данными и гипотезами других авторов именно каротиноиды и аскорбат натрия могут быть отнесены к нативным компонентам живых клеток, осуществляющих фотопротекторную функцию по механизму дезактивации *02. Как мы отмечали выше, пигменты хлорофилловой природы обладают такими же свойствами. Причем в этом случае дезактивация *02 происходит в основном по физическому (без деструкции) механизму. Дезактивацию *02 могут осуществлять и многие другие водорастворимые и липорастворимые компоненты клеток. Этот факт должен учитываться и при проведении фотобиофизических и фотофизиологических экспериментов с интенсивным освещением в модельных или живых системах, а также при осуществлении фотомедицинских процедур (например, при фотодинамической терапии).

Одним из важных следствий указанных измерений является возможность применения полученных констант к гипотезе Matheson (1974) - Moan (1979), которые указали на возможность оценки времени жизни и дальности пробега '02 в живых системах на основе измерения величин кч биологических компонентов клеток in vitro с учетом содержания этих веществ в живых клетках и скорости диффузии кислорода. Подробная разработка этой гипотезы, выполненная в работах Краснов-

ского (1983-2001) и КапоГэку (1990-2001), показала, что время жизни '02 в живых системах, по-видимому, варьирует в пределах от 7 мкс (липидная часть мембраны) до 0,07 мкс в насыщенных хлорофиллом тилакоидах хлоропластов и 0,05 мкс в мембранах эритроцитов, а средний пробег '02 за время его жизни от 220 нм в ли-пидной части мембран клеток (при толщине мембраны около 10 нм) до 5.5 нм в тилакоидах и 4.5 нм в мембранах эритроцитов, что является важным свидетельством, подтверждающим предположение о том, что молекулы '02 за время своей жизни способны проходить достаточно расстояния для повреждения компонентов клеток.

Глава 4. Исследование первичных реакций фотодинамического повреждения хлоропластов при участии триплетных возбужденных молекул фотосенсибилизаторов и 'О?.

В соответствии с результатами, полученными в предыдущей главе и в согласии с данными других авторов, мы предположили, что фотопротекторные механизмы, обеспечивающие жизнедеятельность клеток и тканей, содержащих природные или экзогенные фотосенсибилизаторы, должен включать как механизмы, обеспечивающие тушение - дезактивацию - '02, но также и (с учетом существенного пробега *02 в цитоплазме и мембранах), механизмы, существенно снижающие выход образования '02. Эту гипотезу мы попытались проверить, исследуя на-тивные модельные системы.

Как указывалось в гл. 1, ограниченность систематических измерений с использованием фосфоресценции '02 в сложных биологических живых объектах потребовало привлечения специально разработанного подхода, основанного на сопоставлении данных по скорости фотодеструкции компонентов клеток и оценки эффективности образования триплетных молекул фотосенсибилизатора, приводящих к образованию'02. В качестве исследуемой системы был выбран фотосинтетический аппарат высших растений, для фотосенсибилизаторов которых были проведены детальные систематические измерения эффективности образования и дезактивации *02.

Устойчивость хлоропластов растений к фотоповреждению существенно зависит от генетических особенностей, местообитания, условий выращивания и, по-видимому, является одним из важных факторов естественного отбора и продуктивности растений. Первичными инициаторами окислительного фотоповреждения фотосинтетических мембран могут быть молекулы 3Хл и '02 (механизм 1) или радикалы *02, возникающие при взаимодействии 02 с восстановленными переносчиками электрона в электронтранспортной цепи хлоропластов (механизм 2) [РоЛе, 1964]. Причем остается неясным, какой из указанных механизмов играет доминирующую роль. При механизме 1 скорость фотодеструкции (Уах) должна определяться стационарной концентрацией 3Хл ([3Хл]) в освещенных хлоропластах и увеличиваться пропорционально интенсивности действующего света, не обнаруживая характерного для скорости фотосинтеза насыщения при умеренных осве-щенностях. При механизме 2, наоборот, связь между [3Хл] и фотодеструкцией должна отсутствовать, так как первичное разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтеза идет через синглетное, а не триплетное состояние хлорофилла. Кроме того, в этом случае можно ожидать, что световая кривая фотодеструкции окажется близкой к световой кривой фотосинтеза. Мы сопоставили Уох хлорофилла фотосинтетических мембран и стационарную концентрацию 3Хл в листьях и хлоропластах, существенно различающихся по фотоустойчивости, а также изучили зависимость скорости фотодеструкции от интенсивности освещения. В качестве показателя эффективности фотодеструкции использовали величину квантового выхода фотоокисления хлорофилла (Фох), а о стационарной концентрации три-плетных молекул пигмента судили по квантовому выходу его фосфоресценции (ФрЬ). Фох определяли на основании скорости фотовыцветания длинноволновой полосы поглощения пимента. Триплетное состояние хлорофилла изучали с помощью измерения низкотемпературной (-196°) фосфоресценции пигмента на установках с механическими фосфороскопами [Красновский, Лебедев, Ковалев, Литвин, 1974-78]. Исследовали растворы хлорофилла а в органических растворителях (эталон); зеленеющие листья фасоли на начальной стадии зеленения, когда полностью завершено превращение предшественников в хлорофилл, но хлорофилл и ка-

Таблица 5. Относительные значения квантовых выходов фосфоресценции (Фра) и фотоокисления (Фох) хлорофилла а в растворах, листьях и хлоропластах нормальных и мутантных растений

Объект Ф„к Фпг

отн. ед. (±20%)

Хлорофилл а в дейтерированном пиридине 1 1

Хлорофилл а в ацетоне 1 1

Этиолированный лист фасоли после 1 ч зеленения 1/2 1/5

Хлоропласты £,-каротиновых мутантов кукурузы 1/25 1/15

Хлоропласты нормальных растений кукурузы* 1/150 1/170

Хлоропласты мутантов ячменя без хлорофилла Ъ 1/200 1/140

Хлоропласты нормальных растений ** 1/400 1/300

♦Растения выращивали при освещенности 20 лк и ** 5000— 10 000 лк.

ротиноиды остаются пространственно разобщенными; хлоропласты, выделенные из мутантных растений кукурузы, синтез каротиноидов у которых блокирован на стадии ^-каротина (Р-каротин и ксантофиллы отсутствуют) ; хлоропласты, выделенные из листьев мутантных растений ячменя, лишенных компонентов пигмент-белкового светособирающего комплекса и хлорофилла А, а также хлоропласты, выделенные из нормальных растений тех же видов растений.

Зависимость Фох от 1/[Хл] в дейтерированном пиридине и ацетоне оказалась линейной. Предельное значение Фох (Фолтах), соответствовавшее 1/[Хл]->0, оказались одинаковыми. Одинаковыми также были и значения ФрН в этих средах. Следовательно, оба параметра (Фотшах и Фрь) не зависели от типа сольватации хлорофилла по центральному атому магния. Максимумы фосфоресценции расположены у -975 им в пиридине и -950 нм в ацетоне.

Значения Фох (Таблица 5) в листьях и хлоропластах значительно ниже, чем у хлорофилла а в растворах. Наиболее существенное уменьшение Фох (в 300 раз) характерно для сформированных хлоропластов нормальных растений. Это отражает,

по-видимому, высокую эффективность их защитных систем. В зеленеющих листьях на ранних стадиях зеленения и в мутантных растениях защитные системы, по-видимому, значительно менее эффективны. Полученные данные находятся в согласии с качественными оценками устойчивости хлорофилла в листьях и хлоро-пластах, отмеченными для этих объектов ранее. При измерениях ФрА обнаружилось, что выцветание хлорофилла сопровождается увеличением этого параметра. Особенно, существенное увеличение Фрь наблюдалось при фотодеструкции хло-ропластов нормальных растений. В таблице указаны значения Фрн равные среднему арифметическому между Фр!, до выцветания и после выцветания пигмента на 30%. Данные таблицы свидетельствуют о том, что между значениями Фох и Фр/, во всех исследованных объектах имеется наглядная корреляция.

Зависимость скорости фотоокисления хлоропластов от интенсивности освещения не обнаруживала насыщения при освещенностях, соответствующих насыщению фотосинтеза (5-10'3—10"2) Вт/см2. Полученные нами данные показывают, что нарушения структуры и каротиноидного состава хлоропластов приводят к одновременному и примерно пропорциональному возрастанию стационарной концентрации долгоживущих триплетных молекул и эффективности окислительной фотодеструкции хлорофилла, а световая кривая фотоокисления пигмента в хлоро-пластах не имеет насыщения, характерного для световой кривой фотосинтеза. Очевидно, что эти факты свидетельствуют в пользу определяющей роли триплетных молекул хлорофилла (механизм 1) в процессе фотодеструкции хлоропластов.

Весьма вероятно, что дальнейшее развитие этого процесса связано с образованием '02. Как показано ранее и в главе 2 настоящей работы высокое значение Фа !02 хлорофилла а в растворах и моделях биологических мембран близко значению Ф,. Поскольку наиболее сильно выраженное увеличение скорости фотодеструкции характерно для листьев и хлоропластов с нарушениями в биосинтезе и состоянии каротиноидов, в согласии с данными других работ можно сделать вывод, что именно каротиноиды играют основную роль в защите хлоропластов от фотоповреждения. Наличие корреляции между Фох и Фри позволяет полагать, что защитная функция каротиноидов определяется преимущественно их способностью ту-

шить 3Хл, а не 'С>2. В итоге полученные данные свидетельствуют о том, что фотоповреждение фотосинтетического аппарата хлоропластов определяется главным образом триплетными молекулами хлорофилла и, возможно, синглетным кислородом, который образуется при взаимодействии триплетных молекул пигмента с 02.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате наших исследований показано, что фосфоресценция '02 может обнаружена у широкого круга объектов, начиная от водных растворов пигментов и моделей мембран вплоть до целых клеток. Фотосенсибилизаторами образования '02 могут служить как эндогенные и экзогенные пигменты и красители, находящиеся в клеточных мембранах или растворенные в водной фазе (например, мономерные молекулы хлорофиллов, протохлорофилл, бактериохлорофиллы; водорастворимые порфирины, их ковалентные конъюгаты и полимеры, флавины, кинуре-нины, фурокумарины, лекарства, промышленные красители, фталоцианины и др.).

Полученные результаты также указывают на перспективность использования метода измерения фотосенсибилизированной фосфоресценции '02 для разработки тест-систем для отбора фотодинамических сенсибилизаторов и изучения их свойств. Широкий диапазон исследованных систем позволяет заключить, что предложенные методы могут представлять интерес для дальнейших фундаментальных исследований, а также для развития новых направлений в области изучения наноструктур и создания нанотехнологий (липосомы, мембранные структуры), при проектировании систем, работающих в условиях высокой освещенности или предназначенных для биологической или химической конверсии энергии света.

Хорошо известно, что в нативных живых системах возникновению и действию АФК препятствуют мощные фотопротекторные антиоксидантные системы и механизмы. Сюда можно отнести как механизмы, обеспечивающие высокий уровень эффективного преобразования оптической энергии по основному пути (например, при фотосинтезе - передача энергии возбуждения на реакционный центр и эффективная работа ЭТЦ), так и собственно фотопротекторы и антиоксиданты. Важно отметить, что эффективная работа биохимических машин клетки всецело зависит от сохранения и поддержания структурного порядка и целостности этих

систем. Как показали измерения, проведенные с хлоропластами и листьями диких, мутантных и зеленеющих растений, генетические и структурные нарушения (отсутствие компонентов фотосистем, неполная сборка систем на ранних стадиях зеленения и т.п.) приводят к резкому росту выхода триплетного состояния хлорофилла, что, следовательно, пропорционально увеличивает выход '02, и, как следствие, фотолабильность клеток. Одновременно, по-видимому, возрастает и выход других АФК за счет реакций с участием '02 и процессов типа I (Боо1е). Наши данные показывают, что фотогенерация *02, по-видимому, также может участвовать в действии фотодинамических гербицидов (протохлорофилл), фотоаллергических реакциях, возникать при фототоксических реакциях (флавины, птерины) и ряде других соединений, при развитии катаракты (кинуренины). Последнее подчеркивает, что использование оптических фотопротекторов, поглощающих ультрафиолет, и, возможно, лекарственных офтальмологических препаратов - тушителей *02 -важно для профилактики указанного заболевания.

Наши измерения, в согласии с данными других авторов, показали, что многие лило- и водорастворимые компоненты растительной клетки в той или иной мере участвуют в защите клеточных структур от фотоповреждения, выполняя функцию антиоксидантов. Среди таких соединений следует выделить каротинои-ды и, как ни парадоксально, хлорофиллы и бактериохлорофиллы. Последние сочетают свойство эффективно генерировать !02 (квантовый выход около 70%), так и дезактивировать *02 с высокой активностью, близкой активности (3-каротина. Среди водорастворимых соединений следует отметить соли аскорбата и восстановленные нуклеотиды, триптофан, гистидин, меланины и оммохромы, полипептиды, а-токоферол и ряд других. В то же время нами установлено, что защитное действие некоторых дипептидов (карнозин), по-видимому, не определяется их способностью тушить '02, а вероятнее связано с другими свойствами таких соединений.

Для понимания взаимосвязи процессов возникновения '02 и его участия в повреждении живых клеток важным является тот факт, что время жизни тА (а, соответственно, и 1Л - дальность пробега !02 за это время) определены величиной

этих параметров в воде - основном компоненте живых объектов. Время жизни '02 в Н20 существенно меньше, чем в большинстве известных растворителей и составляет по нашим оценкам 3,2±0,2 мкс, что близко к тл в липидах. Однако, высокоэффективные тушители *02 способны существенно сократить тл, ограничивая пробег '02 в определенных клеточных компартментах. Так расчеты, выполненные с использованием значений констант скоростей тушения *02 кд, полученных в нашей и других лабораториях [Красновский, 1983-2001], показали, что 1А в насыщенных эффективными фотопротекторами тилакоидах мембран хлоропластов и в цитоплазме близок или несколько выше толщины биомембраны, тогда как в воде и чистом липиде этот пробег, примерно, в 20 раз больше. Наиболее вероятно, что при коротком пробеге, мишенью ]02 могут быть молекулы, находящиеся в ближайшей окрестности его возникновения (молекулы хлорофилла, каротиноиды, другие компоненты фотосинтетической системы). В связи с этим особенна важна способность каротиноидов и хлорофиллов тушить '02 без разрушения молекул тушителя (физический тип тушения).

Относительно высокий пробег *02 в водных и органических средах важен при рассмотрении фотосенсибилизированной генерации ]02 для целей опухолевой и антимикробной ФДТ. В последнем случае краситель может быть адсорбирован на поверхности клеточной стенки или растворен в удалении от мембраны клетки, вызывая повреждение на расстоянии действия, производимого АФК (в частности, '02). Наши измерения показали, что мономерные молекулы водорастворимых порфиринов эффективно генерируют '02. Их ковалентные коньюгаты с монокло-нальными антителами к раковым антигенам также сохраняют высокую активность, что может быть использовано для повышения эффективности ФДТ. Важно отметить, что растворимые в воде димеры и олигомеры порфиринов в водной фазе почти не генерируют '02 , тогда как в липидной фазе они высокоэффективны. Учитывая, что именно такие производные в настоящее время используются в ФДТ, этот факт важен для понимания механизма их фототоксического действия. Следует отметить, что перечисленные факты указывают на перспективность использования люминесцентного метода анализа '02 для первичного отбора препа-

ратов, перспективных для ФДТ, а также для повышения эффективности этого метода (например, при разработке методов ФДТ, основанных на прямом оптическом возбуждении молекул кислорода ИК-лазерами). Возможно, применение развитой в данном исследовании методологии к анализу действия слабых доз оптического излучения также окажется перспективным.

Значительный пробег '02 в водных растворах и мембранах подтверждает предположение о том, что эта возбужденная молекула может выполнять также функцию переносчика информации (медиатора) в живых клетках ^¡ев). При этом важно, что ограниченность пробега '02 десятками-сотнями нанометров определяет радиус дальнодействия этого медиатора, делая возможным передачу информации лишь в ограниченном пространстве вблизи источника *02 (фотосенсибилизатора или ферментативной или иной системы), локализованного, например, на внутренней поверхности мембраны клетки или клеточной органеллы.

Таким образом, среди изученных полифункциональных и широко распространенных биологически важных веществ многие способны сенсибилизировать образование или тушить '02, а некоторые сочетают эти свойства, а дальность пробега молекул *02 говорит об их способности вызывать существенные повреждения. Можно считать, что уровень образования и дезактивации !02 и триплетных молекул природных фотосенсибилизаторов является важной характеристикой биохимического и физиологического статуса живых клеток и тканей наравне с другими общепринятыми показателями. Целесообразно учитывать указанные характеристики при анализе устойчивости живых организмов к неблагоприятным воздействиям в условиях высокой освещенности, а также для характеристики вновь создаваемых генетически модифицированных клеток и организмов. Учитывая то, что фотосенсибилизированное образование '02 может существенно влиять на содержание активных форм кислорода в живых клетках, можно заключить, что фотозависимые процессы могут оказывать влияние на изменение и деградацию живых клеток, влияя на процессы жизнедеятельности и развития организмов, включая такие фундаментальные биологические процессы как апоптоз и феноптоз.

Важным фактом кажется то, что ключевые пигменты, отвечающие за преобразование энергии при фотосинтезе - хлорофиллы и бактериохлорофиллы - соче-

тают в себе способность генерации и тушения '02. Можно предположить, что формирование фотосинтетического аппарата на основе пигментов с таким сочетанием свойств является важным фактом для понимания эволюции фотосинтеза. Таким образом, можно заключить, что !02, возникающий в процессе фотосенсибили-зированных реакций, является вероятным фактором естественного отбора, а выработка устойчивости организмов к действию '02 участвовала в эволюции и формировании ряда клеточных структур современных представителей флоры и фауны.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы новые методы и экспериментальные установки для изучения кинетических и спектральных характеристик '02 в водных растворах, суспензиях клеток и их моделях. Разработан комплекс методов для измерения времени жизни '02, квантовых выходов генерации '02 и констант скоростей тушения *02 биологически важными соединениями, компонентами живых клеток, лекарственными препаратами и другими веществами в водных средах на основе применения импульсных лазерных генераторов и измерения фосфоресценции '02 методами разрешенного во времени счета фотонов.

2. На основе исследования затухания люминесценции *02 после лазерных вспышек определены кинетические характеристики фотосенсибилизированного '02, определены скорости затухания люминесценции и времена жизни '02 в водных растворах (Н20 и D20), органических растворителях, моделях биологических мембран и суспензиях клеток. Доказан существенный (в 21,6 раза) изотопный эффект в D20 по сравнению с Н20.

3. Водорастворимые порфирины и их полимерные производные способны эффективно фотосенсибилизировать образование '02 в водных растворах и моделях биологических мембран, причем эффективность генерации *02 выше в липо-фильной фазе, в которой мономерные звенья порфиринов менее ассоциированы. Эти имеют важное значение при разработке основанных на порфиринах противоопухолевых препаратов.

4. Хлорофиллы, бактериохлорофиллы природного происхождения и ряд их химических производных эффективно сенсибилизируют образование '02 в моно-

мерном состоянии как в органических растворителях, так и в моделях клеточных мембран: мицеллярных растворах, суспензиях липосом, твердых полимерных пленках. Агрегация пигментов приводят к снижению эффективности фотосенси-билизированного образования '02, что, по-видимому, связано со снижением эффективности образования триплетных состояний и переноса энергии на молекулы кислорода Тушение фотосенсибилизированного *02 хлорофиллом а, бактерио-хлорофиллами и их производными высокоэффективно, при этом вклад актов тушения, приводящих к разрушению указанных пигментов мал, что соответствует представлениям о фундаментальной фотопротекторной роли указанных липо-фильных пигментов in vivo.

5. Обнаружена высокая эффективность фотосенсибилизированной генерации *02 в водных растворах водорастворимых порфиринов, фурокумаринов, пте-ринов, флавинов, их производных, что указывает на возможность участия фотосенсибилизированного *02 в процессах, сенсибилизируемых этими фотосенсибилизаторами in vivo и in vitro, включая фотодинамическую терапию раковых и иных заболеваний, фотоповреждение кожных покровов, фотодинамические и фотоинформационные процессы.

6. На основе исследования тушения люминесценции '02 водорастворимыми соединениями, входящими в состав живых клеток установлено, что наиболее активны белки, некоторые аминокислоты (триптофан, гистидин), полисахариды, восстановленные пиридин-нуклеотиды и аскорбат, который может играть роль протектора насыщенных водой компонентов хлоропластов от окисления '02. Указанные вещества отвечают за существенное сокращение времени жизни и дальности пробега молекул '02 в цитоплазме и водных компонентах живых клеток.

7. Показано, что стационарная концентрация триплетных молекул хлорофилла коррелирует со скоростью фотодеструкции хлорофилла в хлоропластах и листьях нормальных и мутантных растений, существенно различавшихся по фотоустойчивости, что соответствует представлению об определяющей роли триплетных молекул хлорофилла и '02 в фотодеструкции пигментного аппарата хлоропластов. Защитная функция каротиноидов в хлоропластах растений, по-видимому, определяется преимущественно их способностью тушить триплетные молекулы

хлорофилла, а не '02. Полученные данные свидетельствуют о том, наиболее вероятными сенсибилизаторами образования '02 в хлоропластах являются коротковолновые формы хлорофилла и протохлорофилл, тогда как длинноволновые формы хлорофилла существенно менее активны.

8. Показано, что фосфоресценция синглетного кислорода наблюдается при фотовозбуждении широкого круга объектов: от водных растворов пигментов до моделей мембран и целых клеток. Фотосенсибилизаторами образования '02 могут служить экзогенные и эндогенные красители разной структуры (порфирины, фла-вины, фурокумарины, фталоцианины, и другие). В тоже время показано, что целый ряд природных водорастворимых и липофильных соединений являются высокоактивными тушителями '02 и участвуют в защите живых систем от повреждения '02. Это позволяет полагать, что '02 является естественным участником метаболизма живых клеток, а эффективность его образования и дезактивации имеет очевидное физиологическое значение. Методы, основанные на измерении фото-сенсибилизированной фосфоресценции '02_ могут быть использованы для первичного тестирования фотосенсибилизаторов, перспективных для использования в био-, нано, и медицинских технологиях и фармакологии, например, при разработке эффективных лекарственных препаратов и методов опухолевой и антимикробной фотодинамической терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Фотосенсибилизированная люминесценция кислорода при импульсном лазерном возбуждении. Кинетика затухания в водных растворах //Биофизика, 1983, т. 28, № 3. С. 497-498.

2. Krasnovsky A. A., Jr., Kovalev Yu.V., Egorov S.Yu. Singlet Oxygen and Photodestruction of Chloroplasts // Book of Abstracts of 16 Conference of FEBO, Moscow, 1983. P. 250.

3. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл, К. Вацек, П. Панчошка. Фотосенсибилизированная хлорофиллом люминесценция синглетного кислорода в пленках полистирола. Кинетика затухания после лазерной вспышки. Биофизика, 1984, т. 29, № 6. С. 921-922.

4. Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл., Кулаковская Л.И. Исследование механизма фотодеструкции хлоропластов: участие триплетного состояния хлорофилла. Физиология растений, 1985, т. 32, № 4. С. 668-673.

5. Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл. Тушение синглетного молекулярного кислорода компонентами сред, используемых для выделения и исследования фотосинтетической активности хлоропластов // Физиология растений, 1986, т. 33, № 1.С. 10-14.

6. Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл., Сухоруков В.Л., Потапенко А.Я. Фотосенсибилизированное фурокумаринами образование синглетного кислорода в водных и спиртовых растворах // Биофизика, 1986, т. 31, № 1. С. 154-156.

7. Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл., Назарова Н.В., Ярцев Е.И. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода в водных и спиртовых растворах // Биофизика, 1986, т. 31, № 2. С. 342-343.

8. Krasnovsky А.А., Jr., Sukhorukov V.L., Egorov S.Yu., Potapenko A. Ya. Generation and quenching of singlet molecular oxygen by furocoumarins. Direct luminescence measurements // Studia biophysica, 1986, v. 114, № 1-3. P. 149-158.

9. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Бабижаев М.А., Шведова А.А. Фо-тосенсибилизированная генерация синглетного молекулярного кислорода эндогенными веществами хрусталика глаза // Биофизика, 1987, т. 32, № 1. С. 169-171.

Ю.Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл., Донцов А.Е., Островский М.А. Тушение синглетного молекулярного кислорода экранирующими пигментами - меланинами и оммохромами // Биофизика, 1987, т. 32, № 4. С. 685-686.

П.Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл., Назарова Н.В., Ярцев Е.И., Пономарев Г.В. Фотогенерация синглетного кислорода водорастворимыми порфиринами // Биофизика, 1987, т. 32, № 6. С. 982-993.

12.Егоров С.Ю., Зинуков С.Ю., Камалов В.Ф., Коротеев Н.И., Красновский А.А. мл., Толеутаев Б.Н. Измерение кинетики фотосенсибилизированной люминесценции синглетного молекулярного кислорода с наносекундным разрешением // Оптика и спектроскопия, 1988, т. 65, № 4. С. 899-903.

13.Krasnovsky, А.А., Jr., Egorov, S.Yu., Nasarova, O.V., Yartsev E.I., Po-nomarev G.V. Photosensitized formation of singlet molecular oxygen in solutions of water-soluble porphyrins. Direct luminescence measurements // Studia biophysica, 1988, v. 124, No 2-3. P. 123-142.

14.Красновский А.А. мл., Неверов К.В., Егоров С.Ю., Редер Б. Фотофизические параметры феофорбида а: фосфоресценция и генерация синглетного кислорода // Оптика и спектроскопия, 1988, т. 64, № 4. С. 790-795.

15.Егоров С.Ю., Красновский А.А. мл., Сафронова И.А., Быстрова М.И., Красновский А.А. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода пигментами-предшественниками хлорофилла. Доклады АН СССР (биофизика), 1988, т. 299, № 5. С.1266-1270.

16.Egorov, S.Yu., Kamalov, V.F., Koroteev, N.I., Krasnovsky, A.A., Jr., Toleu-taev, B.N., Zinukov S.V. Rise and decay kinetics of photosensitized singlet oxygen luminescence in water. Measurements with nanosecond time-correlated photon counting technique // Chem. Phys. Letters, 1989, v. 163, № 5. P. 421- 424.

17. Егоров С.Ю., Красновский А.А. мл., Таубер А.Ю., Нижник А.Н., Нокель А.Ю., Миронов А.Ф. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода компонентами производного гематопорфирина IX // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989, т. 102, № 10. С. 439- 442.

18.Egorov S.Yu., Krasnovsky A.A., Jr. Generation of Singlet Molecular Oxygen ('02) by Monomeric and Aggregated Forms of Porphyrin // The International Conference on Photodynamic Therapy, 1989, Bulgaria, Sophia. Book of Abstracts. -Sophia: 1989. P. 191p.

19. Егоров С.Ю., Красновский А.А. мл., Вычегжанина И.В., Дроздова Н.Н., Красновский А.А. Фотосенсибилизированное образование и тушение синглетного молекулярного кислорода мономерными и агрегированными молекулами пигментов фотосинтезирующих бактерий // Доклады АН СССР (биофизика), 1990, т. 310, №2. С. 471-474.

20. Егоров С.Ю., Мааллем М., Красновский А.А. мл., Хачатурова Г.Т., Кри-чевский Г.Е. Фотосенсибилизированная генерация синглетного молекулярного кислорода дибензпиренхиноном // Доклады АН СССР (физическая химия), 1990, т. 315, № 5. с. 1152-1155.

21. Егоров С.Ю., Красновский А.А. мл., Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Пономарев Г.В. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода компонентами производного гематопорфирина IX // Бюлл. эксп. биол. мед., 1990, т. 109, № 4. С. 349-351.

22.Papkovsky D.B., Savitsky А.Р., Egorova S. G., Sukhin G.M., Chissov V.I., Krasnovsky A.A., Jr., Egorov S. Yu., Ponomarev G.V., Kirillova G.V. Photodestruction

in vitro of tumor cells sensitized by porphyrins and their conjugates with specific antibodies //Biomedical Science, 1990, v. 1. P. 401-407.

23.Krasnovsky A. A., Jr., Neverov K.V., Egorov S.Yu., Roeder В., Levald T. Pho-tophysical studies of pheophorbide a and pheophytin a. Phosphorescence and photosensitized singlet oxygen luminescence // J. Photochem Photobiol., B: Biology, 1990, v. 5, № 2. P. 245-254.

24.Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Laser-induced luminescence of singlet molecular oxygen. Generation by drugs and pigments of biological importance // SPIE Proceedings (Laser Applications in Life Sciences), 1990, v. 1403. P. 611- 621.

25. Егоров С.Ю., Курелла Е.Г., Болдырев А.А., Красновский А.А., мл. Тушение синглетного молекулярного кислорода карнозином и анзерином // Биоорганическая химия, 1992. Т. 18, № 1.С. 142-144.

26.Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Participation of chlorophyll triplet state and singlet molecular oxygen in chlorophyll photodestruction // Research in Photosynthesis. Ed. N. Murata, Proceedings of the IXth ICP, 1992. -Amsterdam: Kluwer Academic Press, 1992. Vol. 3.P. 111-114.

27.Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Quenching of singlet molecular oxygen luminescence by amino acids and nucleotides in aqueous solutions // Abstract of the 11th International Biophysics Congress, July 25 - 30 1993, Hungary, Budapest. -Budapest: 1992. P. 206.

28.Krasnovsky A.A., Jr., Egorov S. Yu., Neverov K.V., Safronova I.N. Molecular mechanisms underlying photodestruction of the photosynthetic apparatus. Spectoscopic detection of the triplet state and singlet oxygen formation in model systems and plants // Photochem. Photobiol. 1994, v. 59s. P. 21S.

29.Krasnovsky A.A., Jr., Egorov S.Yu. Quenching of singlet molecular oxygen by biomolecules in aqueous media // Proceedings of Laser Applications in Life Sci-ences-94, 26.06-2.07.1994, Minsk, Belarus. -Minsk: 1994. P. 21 lp.

30.Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Spectroscopic detection of singlet-oxygen photogeneration by chlorophyll and pheophytin in organic and aqueous media // Proceedings of «Visible and UV Light Stress», Paris, France, August 17 - 19, 1995. -Paris: FIAP Jean Monnet, 1995. P. 127.

31. Egorov S. Yu, E. G. Kurella, A. A. Boldyrev, A. A. Krasnovsky, Jr. Quenching of singlet molecular oxygen by carnosine and related antioxidants. Monitoring 1270

nm phosphorescence in aqueous media I I Biochemistry and Molecular Biology International, 1997,41, № 4. P. 687-694.

32. Егоров С.Ю., Красновский А.А., Баштанов M.E., Миронов E.A., Людни-кова Т.А., Крицкий M. С. Исследование фотосенсибилизации образования синг-летного молекулярного кислорода птеринами и флавинами методом разрешенного во времени измерения фосфоресценции кислорода при лазерном возбуждении // Биохимия, 1999, т. 64, № 10. С. 1325-1330.

33.Красновский А.А., Егоров С.Ю., Неверов К.И., Баштанов М.Е. Люминесцентная регистрация синглетного кислорода при лазерном возбуждении. //Тезисы I Евразийского конгресса, V Национальной конференции по медицинской физике и инженерии. 18-22 июня 2001 г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносова.

34. Sokolov V.G., Korsi L.V., Egorov S. Yu. Method of assessing blood oxygenation in microcirculation vessels based on Doppler approach. In: Optical Diagnostics and Sensing of Biological Fluids and Glucose and Cholesterol Monitoring // SPIE Proceedings 2001. Vol. 4263. P.98-105.

35.Butorina D.N., Krasnovsky A.A., Jr., Bashtanov M.E., Egorov S.Yu., Prieszev A.V. Kinetics of laser-induced phosphorescence of singlet molecular oxygen in aqueous porphyrin solutions // SPIE Proceedings, 2001, Vol. 4241. P. 317-323.

36. Красновский A.A., Баштанов M.E., Буторина Д.Н., Егоров С.Ю., Приезжее А.В. Исследование кинетических параметров синглетного кислорода в простых моделях биологических систем // «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», П Международный симпозиум под эгидой ЮНЕСКО, посвященный памяти академика Н.М. Сисакяна и Сисакяновские чтения. Дубна, 2002. Труды. Т. 1. -Дубна: 2002. С. 99-110.

37.Алексеева Н.В., Егоров С.Ю., Коссова Г.В., Озрина Р.Д., Яглова Л.Г. Основы применения радиоиндикаторного метода в биологии (учебное пособие). Рекомендовано Учебно-методическим объединением по классическому университетскому образованию в качестве учебного пособия для студентов университетов, обучающихся по направлению 510600 Биология и биологическим специальностям -М., Издательство Московского университета, 2005. 166 С.

Подписано в печать 15.12.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 2.0 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 564 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Егоров, Сергей Юрьевич

Список сокращений

Введение

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Фотосенсибилизируемые процессы в живых клетках, инициируемые с участием кислорода

Глава 2. Синглетный кислород, триплетные молекулы фотосенсибилизаторов и их роль в фотоокислительных процессах в живых клетках

Глава 3. Фотосенсибилизированное образование и дезактивация 'Ог компонентами биологических систем

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

Часть II. Методы и объекты исследования

Часть III. Результаты исследования и их обсуждение

Глава 1. Фотосенсибилизированная люминесценция хОг в клетках, тканях и моделях мембран

Глава 2. Эффективность фотосенсибилизированного образования ]Ог в моделях биологических мембран

Глава 3. Оценка скорости дезактивации ]Ог в биологических системах на основании оценки констант скорости тушения xOi компонентами мембран и цитоплазмы живых клеток.

Глава 4. Исследование первичных реакций фотодинамического повреждения хлоропластов при участии триплетных возбужденных молекул фотосенсибилизаторов и 'Ог

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотосенсибилизированное образование и дезактивация синглетного молекулярного кислорода и их роль в биологических системах"

Интенсивное освещение окрашенных пигментированных клеток и тканей живых существ способно вызывать их фотодеструктивные изменения и гибель, инициировать фотоокислительный стресс, фотоингибирование, вызывать мутации и другие повреждения нативных процессов жизнедеятельности. Наиболее вероятные интермедиаты первичной стадии фотоокисления - активные формы кислорода (АФК): молекулы синглетого ислорода, радикалы «Ог", «НОг, «ОН, перекись водорода, а также возбужденные синглетные и триплетные молекулы пигментов, радикалы и перекиси липидов и др. Эти существенно различные по химической активности молекулы способны разрушать органические молекулы, клетки и ткани, инициируя деструктивные процессы. Для понимания механизмов фотодинамических, фотоинформационных и фотопротекторных процессов и их места в метаболизме и жизнедеятельности организмов необходимо детальное исследование роли отдельных активных молекул в живых системах и их моделях.

Настоящая работа посвящена исследованию роли главным образом синглетного кислорода ('02) и возбужденных триплетных состояний молекул пигментов, которые с одной стороны, инициируют фотоокислительный стресс за счет участия в фотоокислительных деструктивных реакциях, а с другой могут определять многообразные фотоинформационные и фоторегуляторные процессы в живых клетках. [81еэ е1 а1., 2004-2005]. Предполагается, что именно необходимость предотвращения губительного действия фотоокислительного стресса, обусловленного указанными активными молекулами, привела к выработке эффективных фотопротекторных механизмов в клетках живых существ, которые особенно развиты в пигментированных, например, фотосинтезирующих, зрительных и других окрашенных клетках.

В классических фотохимических исследованиях [Kautsky, 1939; Теренин, 1943-1947, Foote, 1964-1979] высказано предположение, что основным путем образования одной из наиболее химически активных возбужденных 1 эВ форм кислорода -'СЬ - является перенос энергии от фотосенсибилизаторов в л возбужденном триплетном состоянии (Р) на молекулярный кислород. Однако прямых доказательств участия этого процесса в инициировании фото динамических реакций in vivo не было. Существенным успехом в исследовании роли 'Ог в инициации фотобиохимических процессов было открытие явления собственной фосфоресценции 'Ог в органических растворителях [Красновский, 1976] и воде [Красновский, 1979; Khan, 1979], которое позволило получать неинвазивным путём (без введения дополнительных химических акцепторов 'Ог) достоверную информацию о свойствах в системах любой сложности.

К моменту начала данного исследования (1982 г.) была накоплена обширная информация о свойствах 'Ог, полученная методом химических ловушек (акцепторов 'Ог). Однако достоверность этой информации во многих случаях вызывала сомнение в виду недостаточной специфичности химических ловушек и их способности вступать в реакции не только с 'Ог, но и с другими активными формами кислорода, свободными радикалами и электронно-возбужденными состояниями молекул. Измерения, основанные на регистрации фосфоресценции 'Ог, были выполнены главным образом с использованием ограниченного круга органических растворителей, в которых время жизни '02 наиболее велико (10 и более мс). Эти исследования убедительно показали важность фосфоресцентного метода для фотобиологических исследований (Красновский, 1976-1982). В частности, было установлено, что основные биологические пигменты: хлорофиллы, бактериохлорофиллы, порфирины и ретинали способны эффективно генерировать и тушить синглетный кислород в этих средах. Получены точные значения констант скорости тушения '02 жирными кислотами и липидами и многими органическими молекулами. Однако были сделаны лишь первые шаги в анализе фосфоресценции ]02 в органических средах с малым временем жизни 'Ог, воде, моделях мембран, а измерения in vivo полностью отсутствовали.

Таким образом, имевшаяся экспериментальная информация и новый исследовательский подход, основанный на измерении собственной фосфоресценции 'Ог, определили выбор стратегии исследования и сделали возможным выполнение настоящей работы. Имевшаяся информация показывала, что наиболее актуален анализ участия !Ог в таких процессах как фотодинамическая терапия опухолей с участием водорастворимых порфиринов, агрегатов и комплексов с моноклональными антителами, фотодеструкция фотосинтетического аппарата растений и бактерий, фотоиндуцированный катарактогенез, фотоинформационные и фоторегуляторные процессы, инициируемых флавинами и птеринами, фотопротекторные и фоторегуляторные реакции с участием широкого круга физиологически активных веществ и антиоксидантов и ряд других. С другой стороны, требовалось развитие экспериментальных подходов с целью проведения измерений в модельных системах, наиболее приближенных к живым клеткам и тканям, а также собственно in vivo, что требовало существенного развития методик проведения экспериментов и усовершенствования измерительной техники. Подробно цели и задачи этого исследования изложены в заключение обзора литературы.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Егоров, Сергей Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы новые методы и экспериментальные установки для изучения кинетических и спектральных характеристик '02 в водных растворах, суспензиях клеток и их моделях. Разработан комплекс методов для измерения времени жизни '02, квантовых выходов генерации '02 и констант скоростей тушения '02 биологически важными соединениями, компонентами живых клеток, лекарственными препаратами и другими веществами в водных средах на основе применения импульсных лазерных генераторов и измерения фосфоресценции '02 методами разрешенного во времени счета фотонов.

2. На основе исследования затухания люминесценции после лазерных вспышек определены кинетические характеристики фотосенсибилизированного '02, определены скорости затухания люминесценции и времена жизни в водных растворах (Н20 и Б20), органических растворителях, моделях биологических мембран и суспензиях клеток. Доказан существенный (в 21,6 раза) изотопный эффект в 020 по сравнению с Н20.

3. Водорастворимые порфирины и их полимерные производные способны эффективно фотосенсибилизировать образование '02 в водных растворах и моделях биологических мембран, причем эффективность генерации '02 выше в липофильной фазе, в которой мономерные звенья порфиринов менее ассоциированы. Эти имеют важное значение при разработке основанных на порфиринах противоопухолевых препаратов.

4. Хлорофиллы, бактериохлорофиллы природного происхождения и ряд их химических производных эффективно сенсибилизируют образование '02 в мономерном состоянии как в органических растворителях, так и в моделях клеточных мембран: мицеллярных растворах, суспензиях липосом, твердых полимерных пленках. Агрегация пигментов приводят к снижению эффективности фотосенсибилизирован-ного образования '02, что, по-видимому, связано со снижением эффективности образования триплетных состояний и переноса энергии на молекулы кислорода Тушение фотосенсибилизированного '02 хлорофиллом а, бактериохлорофиллами и их производными высокоэффективно, при этом вклад актов тушения, приводящих к разрушению указанных пигментов мал, что соответствует представлениям о фундаментальной фотопротекторной роли указанных липофильных пигментов in vivo.

5. Обнаружена высокая эффективность фотосенсибилизированной генерации '02 в водных растворах водорастворимых порфиринов, фурокумаринов, птеринов, флавинов, их производных, что указывает на возможность участия фотосенсибилизированного '02 в процессах, сенсибилизируемых этими фотосенсибилизаторами in vivo и in vitro, включая фотодинамическую терапию раковых и иных заболеваний, фотоповреждение кожных покровов, фотодинамические и фотоинформационные процессы.

6. На основе исследования тушения люминесценции *02 водорастворимыми соединениями, входящими в состав живых клеток установлено, что наиболее активны белки, некоторые аминокислоты (триптофан, гистидин), полисахариды, восстановленные пиридин-нуклеотиды и аскорбат, который может играть роль протектора насыщенных водой компонентов хлоропластов от окисления '02. Указанные вещества отвечают за существенное сокращение времени жизни и дальности пробега молекул '02 в цитоплазме и водных компонентах живых клеток.

7. Показано, что стационарная концентрация триплетных молекул хлорофилла коррелирует со скоростью фотодеструкции хлорофилла в хлоропластах и листьях нормальных и мутантных растений, существенно различавшихся по фотоустойчивости, что соответствует представлению об определяющей роли триплетных молекул хлорофилла и 'Ог в фотодеструкции пигментного аппарата хлоропластов. Защитная функция каротиноидов в хлоропластах растений, по-видимому, определяется преимущественно их способностью тушить триплетные молекулы хлорофилла, а не 'Ог. Полученные данные свидетельствуют о том, наиболее вероятными сенсибилизаторами образования 'Ог в хлоропластах являются коротковолновые формы хлорофилла и протохлорофилл, тогда как длинноволновые формы хлорофилла существенно менее активны.

8. Показано, что фосфоресценция синглетного кислорода наблюдается при фотовозбуждении широкого круга объектов: от водных растворов пигментов до моделей мембран и целых клеток. Фотосенсибилизаторами образования 'Ог могут служить экзогенные и эндогенные красители разной структуры (порфирины, флавины, фурокумарины, фталоцианины, и другие). В тоже время показано, что целый ряд природных водорастворимых и липофильных соединений являются высокоактивными тушителями ]02 и участвуют в защите живых систем от повреждения 'Ог- Это позволяет полагать, что является естественным участником метаболизма живых клеток, а эффективность его образования и дезактивации имеет очевидное физиологическое значение. Методы, основанные на измерении фотосенсибилизированной фосфоресценции 'Ог, могут быть использованы для первичного тестирования фотосенсибилизаторов, перспективных для использования в био-, нано, и медицинских технологиях и фармакологии, например, при разработке эффективных лекарственных препаратов и методов опухолевой и антимикробной фотодинамической терапии.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (96-03-34 100а, 98-03-32071а, 01-03-32821а, 04-03-32223а).

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему консультанту профессору Александру Александровичу Красновскому, впервые в мировой практике измерившему фосфоресценцию фотосинтетических пигментов и люминесценцию синглетного кислорода в конденсированной среде. Именно благодаря его исследованиям и открытиям, усилиям по внедрению этих методов и разработке ряда разделов фотобиологии, фотохимии и фотофизики стало возможным настоящее исследование. С огромной благодарностью автор вспоминает своего первого научного руководителя академика Александра Абрамовича Красновского, общение с которым оказало определяющее влияние на формировании автора как исследователя и преподавателя высшей школы. Автор благодарит профессоров Феликса Федоровича Литвина и Андрея Борисовича Рубина за полезные замечания, советы и критику, высказанные при обсуждении работы. Автор благодарит Ю.В. Ковалева за многолетнее сотрудничество и помощь в измерениях фосфоресценции. Особую благодарность хотелось бы выразить профессору Б.Б. Дзантиеву и В.А. Русову, благодаря наставлениям и советам которых сформировался интерес автора к биологии и экспериментальной фотобиологии.

С огромной благодарностью автор вспоминает помощь и поддержку, оказанную автору Натальей Николаевной Дроздовой во время многолетней совместной работы в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Автор выражает благодарность своим соавторам, совместно с которыми были проведены экспериментальные исследования, которые легли в основы настоящей работ, коллективам и руководству биологического факультета и кафедры физико-химической биологии Московского университета, Учебно-научного международного лазерного центра университета, Института биохимии РАН, оказавшим неоценимую помощь и поддерживавших автора в его работе. Эксперименты, проведенные в рамках данного исследования, были поддержаны грантами РФФИ, Международного научного фонда (18Р), предприятием «Флуор» (Беларусь). Автор благодарит Е.Г. Куреллу и Т.В. Пугачеву, а также профессора Б.Рёдер за совместную экспериментальную работу и за помощь, оказанную при проведении ряда измерений. Благодарю А.Ф. Миронова, А.Н. Нижника и Г.В. Пономарева за предоставление синтетических порфиринов, А. Майстера, X. Загромски и А. Фалуды-Даниель за семена мутантных растений.

283

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате наших исследований показано, что фосфоресценция '02 может обнаружена у широкого круга объектов, начиная от водных растворов пигментов и моделей мембран вплоть до целых клеток. Фотосенсибилизаторами образования '02 могут служить как эндогенные и экзогенные пигменты и красители, находящиеся в клеточных мембранах или растворенные в водной фазе (например, мономерные молекулы хлорофиллов, протохлорофилл, бактериохлорофиллы; водорастворимые порфирины, их ковалентные конъюгаты и полимеры, флавины, кинуренины, фурокумарины, лекарства, промышленные красители, фталоцианины и др.).

Полученные результаты также указывают на перспективность использования метода измерения фотосенсибилизированной фосфоресценции '02 для разработки тест-систем для отбора фотодинамических сенсибилизаторов и изучения их свойств. Широкий диапазон исследованных систем позволяет заключить, что предложенные методы могут представлять интерес для дальнейших фундаментальных исследований, а также для развития новых направлений в области изучения наноструктур и создания нанотехнологий (липосомы, мембранные структуры), при проектировании систем, работающих в условиях высокой освещенности или предназначенных для биологической или химической конверсии энергии света.

Хорошо известно, что в нативных живых системах возникновению и действию АФК препятствуют мощные фотопротекторные антиоксидантные системы и механизмы. Сюда можно отнести как механизмы, обеспечивающие высокий уровень эффективного преобразования оптической энергии по основному пути (например, при фотосинтезе - передача энергии возбуждения на реакционный центр и эффективная работа ЭТЦ), так и собственно фотопротекторы и антиоксиданты. Важно отметить, что эффективная работа биохимических машин клетки всецело зависит от сохранения и поддержания структурного порядка и целостности этих систем. Как показали измерения, проведенные с хлоропластами и листьями диких, мутантных и зеленеющих растений, генетические и структурные нарушения (отсутствие компонентов фотосистем, неполная сборка систем на ранних стадиях зеленения и т.п.) приводят к резкому росту выхода триплетного состояния хлорофилла, что, следовательно, пропорционально увеличивает выход и, как следствие, фотолабильность клеток. Одновременно, по-видимому, возрастает и выход других АФК за счет реакций с участием '02 и процессов типа I (Роо1е). Наши данные показывают, что фотогенерация !02, по-видимому, также может участвовать в действии фотодинамических гербицидов (протохлорофилл), фотоаллергических реакциях, возникать при фототоксических реакциях (флавины, птерины) и ряде других соединений, при развитии катаракты (кинуренины). Последнее подчеркивает, что использование оптических фотопротекторов, поглощающих ультрафиолет, и, возможно, лекарственных офтальмологических препаратов - тушителей !02 -важно для профилактики указанного заболевания.

Наши измерения, в согласии с данными других авторов, показали, что многие липо- и водорастворимые компоненты растительной клетки в той или иной мере участвуют в защите клеточных структур от фотоповреждения, выполняя функцию антиоксидантов. Среди таких соединений следует выделить каротиноиды и, как ни парадоксально, хлорофиллы и бактериохлорофиллы. Последние сочетают свойство эффективно генерировать '02 (квантовый выход около 70%), так и дезактивировать 102 с высокой активностью, близкой активности каротина. Среди водорастворимых соединений следует отметить соли аскорбата и восстановленные нуклеотиды, триптофан, гистидин, меланины и оммохромы, полипептиды, а-токоферол и ряд других. В то же время нами установлено, что защитное действие некоторых дипептидов (карнозин), по-видимому, не определяется их способностью тушить ]02, а вероятнее связано с другими свойствами таких соединений.

Для понимания взаимосвязи процессов возникновения '02 и его участия в повреждении живых клеток важным является тот факт, что время жизни тл (а, соответственно, и 1Л - дальность пробега '02 за это время) определены величиной этих параметров в воде - основном компоненте живых объектов. Время жизни '02 в Н20 существенно меньше, чем в большинстве известных растворителей и составляет по нашим оценкам 3,2±0,2 мкс, что близко к тл в липидах. Однако, высокоэффективные тушители *02 способны существенно сократить тл, ограничивая пробег '02 в определенных клеточных компартментах. Так расчеты, выполненные с использованием значений констант скоростей тушения '02 кд, полученных в нашей и других лабораториях [Красновский, мл., 1983-2004], показали, что 1Л в насыщенных эффективными фотопротекторами тилакоидах мембран хлоропластов и в цитоплазме близок или несколько выше толщины биомембраны, тогда как в воде и чистом липиде этот пробег, примерно, в 20 раз больше. Наиболее вероятно, что при коротком пробеге, мишенью '02 могут быть молекулы, находящиеся в ближайшей окрестности его возникновения (молекулы хлорофилла, каротиноиды, другие компоненты фотосинтетической системы). В связи с этим особенна важна способность каротиноидов и хлорофиллов тушить '02 без разрушения молекул тушителя (физический тип тушения).

Относительно высокий пробег '02 в водных и органических средах важен при рассмотрении фотосенсибилизированной генерации '02 для целей опухолевой и антимикробной ФДТ. В последнем случае краситель может быть адсорбирован на поверхности клеточной стенки или растворен в удалении от мембраны клетки, вызывая повреждение на расстоянии действия, производимого АФК (в частности, 'Ог). Наши измерения показали, что мономерные молекулы водорастворимых порфиринов эффективно генерируют 'Ог. Их ковалентные коньюгаты с моноклональными антителами к раковым антигенам также сохраняют высокую активность, что может быть использовано для повышения эффективности ФДТ. Важно отметить, что растворимые в воде димеры и олигомеры порфиринов в водной фазе почти не генерируют '02, тогда как в липидной фазе они высокоэффективны. Учитывая, что именно такие производные в настоящее время используются в ФДТ, этот факт важен для понимания механизма их фототоксического действия. Следует отметить, что перечисленные факты указывают на перспективность использования люминесцентного метода анализа 'СЬ для первичного отбора препаратов, перспективных для ФДТ, а также для повышения эффективности этого метода (например, при разработке методов ФДТ, основанных на прямом оптическом возбуждении молекул кислорода ИК-лазерами). Возможно, применение развитой в данном исследовании методологии к анализу действия слабых доз оптического излучения также окажется перспективным.

Значительный пробег 'Ог в водных растворах и мембранах подтверждает предположение о том, что эта возбужденная молекула может выполнять также функцию переносчика информации (медиатора) в живых клетках (Sies) [Klotz, Sies, 2002; 2003]. При этом важно, что ограниченность пробега 'СЬ десятками-сотнями нанометров определяет радиус дальнодействия этого медиатора, делая возможным передачу информации лишь в ограниченном пространстве вблизи источника 'Ог (фотосенсибилизатора или ферментативной или иной системы), локализованного, например, на внутренней поверхности мембраны клетки или клеточной органеллы.

Таким образом, среди изученных полифункциональных и широко распространенных биологически важных веществ многие способны сенсибилизировать образование или тушить х02, а некоторые сочетают эти свойства, а дальность пробега молекул ]02 говорит об их способности вызывать существенные повреждения. Можно считать, что уровень образования и дезактивации и триплетных молекул природных фотосенсибилизаторов является важной характеристикой биохимического и физиологического статуса живых клеток и тканей наравне с другими общепринятыми показателями. Целесообразно учитывать указанные характеристики при анализе устойчивости живых организмов к неблагоприятным воздействиям в условиях высокой освещенности, а также для характеристики вновь создаваемых генетически модифицированных клеток и организмов. Учитывая то, что фотосенсибилизированное образование '02 может существенно влиять на содержание активных форм кислорода в живых клетках, можно заключить, что фотозависимые процессы могут оказывать влияние на изменение и деградацию живых клеток, влияя на процессы жизнедеятельности и развития организмов, включая такие фундаментальные биологические процессы как апоптоз и феноптоз.

Важным фактом кажется то, что ключевые пигменты, отвечающие за преобразование энергии при фотосинтезе - хлорофиллы и бактериохлорофиллы - сочетают в себе способность генерации и тушения ]02. Можно предположить, что формирование фотосинтетического аппарата на основе пигментов с таким сочетанием свойств является важным фактом для понимания эволюции фотосинтеза. Таким образом, можно заключить, что {02, возникающий в процессе фотосенсибилизированных реакций, является вероятным фактором естественного отбора, а выработка устойчивости организмов к действию

0г участвовала в эволюции и формировании ряда клеточных структур современных представителей флоры и фауны.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Егоров, Сергей Юрьевич, Москва

1. Akhlynina T.V., Jans D.A., Rosenkranz A.A., Statsyuk N.V., Balashova 1.Y., Toth G., Pavo I., Rubin A.B., Sobolev A.S. Nuclear targeting of chlorine e6 enhances its photosensitizing activity//J. ofBiolog. Chem. 1997. Vol. 272. No. 33. P. 20328-20331.

2. Allen M. B. Absorption spectra, spectrophotometry and action spectra. In: Photophysiology. N. Y. 1964. Vol. I, h. 83-110.

3. Aloisi G. G., Elisei F., Moro S., Miolo G., Dall'Acqua F. Photophysical properties of the lowest excited singlet and triplet states of thio-and seleno-psoralens //Photochemistry and Photobiology. 2000. Vol. 75 P. 506513

4. Anderson I. C., Robertson D. S. Role of carotenoids in protecting chlorophyll from photodestruction. Plant Physics. 1960. Vol. 35. № 4. P. 531534.

5. Anderson S. M., Krinsky N. J., Stone M. J., Clagett D. C. Effect of singlet oxygen quenchers on oxidative damage to liposomes initiated by photosensitization or by radiofrequency discharge //Photochem. and Photobiol. 1974. Vol. 20. № l.P. 65-69.

6. Arnon D. I., Allen M. B., Whatley F. R. Photosynthesis by isolated chloroplasts. IV. General concept and comparison of three photochemical reactions// Biochim. et Biophys. Acta. 1956. Vol. 20. № 3. P. 449-461.

7. Arnon D. I., Chain R. K. Role of oxygen in ferredoxin-catalyzed cyclic phosporilation. // FEBS Letters. 1977. Vol. 82. № 2. P. 449-461.

8. Asada K., Kiso K., Yoshikawa K. Univalent redaction of molecular oxygen by spinach chloroplasts on illumination// J. of Biol. Chem. 1974. Vol. 249.№ 7. P. 2175-2171.

9. Aubry J. M., Rigandy J., Cuong N. K. Kinetic studies of self-sensitized photooxygenation in H20 and D20 of a water soluble rubren derivative. //Photochem. Photobiol. 1981. Vol. 33. № 2. P. 155-158.

10. Avron M. Photophosphorilation by swiss-chard chloroplasts// Biochim. et Biophys. Acta. 1960. Vol. 40. № 2. P. 257-272.

11. Axelsson L. The photostability of different chlorophyll forms in dark grown leaves of wheat. I. Stability to high intensity red light of forms appearing after photoreduction of photochlorophyllide// Physiol. Plantarum. 1976a. Vol. 38. № 4. P. 327-332.

12. Axelsson L. The photostability of different chlorophyll forms in dark grown leaves of weat. II. Reaction kinetics for the photodecomposition of the 684-form and 673-form. // Physiol. Plantarum. 1976b. Vol. 38. № 4. P. 333-336.

13. Axelsson L. The photostability of different chlorophyll forms in dark grown leaves of weat. // Physiol. Plantarum. 1981. Vol. 53. № 2. P. 131-138.

14. Axelsson L., Dahllen C., Ryberg H. The function of carotenoids during chloroplast development. V. Correlation between carotenoid content, ultra structure and chlorophyll bto chlorophyll aratio. // Physiol. Plantarum. 1982. Vol. 55. №2. P. 111-116.

15. Baker A., Kanofsky J.R. Direct observation off singlet oxygen phosphorescence at 1270 nm from LI270 leukemia cells exposed to protoporphyrin and light // ABB 1991.-Vol. 286. P. 70-75.

16. Ballou D., Palmer G., Massey V. Direct demonstration superoxide anion production during the oxidation of reduced flavin and of its catalytic decomposition by erythrocuprein// Biochem. Biophys. Res. Communs. 1969. Vol. 36. № 6. P. 898-904.

17. Barber J., Andersson B . Too much of a good thing: light can be bad for photosynthesis. // Trends Biochem. Sci. 2002. Vol. 17. P. 61-66.

18. Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication // BBA. 1973. Vol. 298. P. 1015-1019.

19. Beier R. C., Oertly E. H. Psoralem and other linear furocoumarins as phytoalexins in celery.// Phytochem. 1983. Vol. 22. № 11. P. 2592-2597.

20. Bensasson R.V., Frederiksen J., Rougee M., Lexa D., Harrit N. Correlations between the rate constant of singlet oxygen quenching by imidazole derivatives and anti-inflammatory activity in rats.// Mol. Pharmacol. 1992. Vol. 42. P. 718-722.

21. Bilski P., Kukielczak B.M., Chegnell C.F. Photoproduction and direct detection of singlet molecular oxygen ('02) in keratinocytes stained with rose Bengal // Photoch. Photobiol. 1998. Vol. 66. P. 657-658.

22. Blokhina 0., Virolainen E., Fagerstedt K. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. // Annals of Botany. 2003. Vol. 91. P. 179-194.

23. Blum H.F / Photodynamic action and diseases caused by light. 1964. NY: Hafner Publ. Co.

24. Bodannes R. C., Chan P. C. Ascorbic acid as scavenger or singlet oxygen. // FEBS Letters. 1979. Vol. 105. № 2, P. 195-196.

25. Boldyrev A.A., Severin S.E. Effects of carnosine, a specific component of striated muscle, on muscle and other tissues // Biomed. Sci. 1991. Vol.2. P. 91-94.

26. Boldyrev A.A., Kurella E.G., Stvolinsky S.L. Biological Role of carnosine metabolism in excitable tissues: speculations and facts //Patophysiology. 1994. Vol. 1. P. 215-219.

27. Borland, C.F.; McGarvey, D.J.; Truscott, T.G.; Codgell, R.J.; Land, E.J. Photophysical studies of bacteriochlorophyll-a and bacteriopheophytin-a— singlet oxygen generation // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1987. Vol. 1. P. 93-101.

28. Bowers P. G., Porter G. Quantum Yields of triplet formation in solutions of chlorophyll // Proc. Roy. Soc. L. 1967. Vol. A296. P. 435-441.

29. Bradley D.G., Kim H.J., Min D.B. Effects, quenching mechanisms, and kinetics of water soluble compounds in riboflavin photosensitized oxidation of milk. // J Agric Food Chem. 2006. Vol. 54. P. 6016-6020.

30. Breton J., Mathis P. Mise en evidence de l'etal triplet de la chlorophyll dans des lamellas chloroplastiques. // Comptes Rendus Acad. Sc. D. 1970. Vol. 271. № 13. P. 1094-1096.

31. Britton G. Carotenoid biosynthesis in higher plant // Physiol. Veg. 1982,v.20, № 4, p. 735-755.

32. Brown S.B., Shillcock M., Jones P. Equilibrium and kinetic studies of the aggregation of porphyrins in. aqueous solution. // Biochem. J. 1976. Vol. 153. P. 279-285.

33. Butler W. L. Energy transfer in developing chloroplasts. //Biochem. Biophys. Res. Communs. 1960. Vol. 2. № 6. P. 419-422.

34. Butler W. L. Chloroplast development: energy transfer and structure. //Arch, of Bioch. and Biophys. 1961. Vol. 92. № 2. P. 287-295.

35. Butorina D.A., Bashtanov M.E., Krasnovsky A.A., Jr., Priezzev A.V. Effect of blood plasma on laser-excited singlet oxygen phosphorescence in aqueous buffer solutions of water-soluble porphyrins // SPIE Proceedings. 2000. Vol. 4001. P. 385-389.

36. Butorina D.N., Krasnovsky A.A., Jr., Bashtanov M.E., Egorov S.Yu., Prieszev A.V. Kinetics of laser-induced phosphorescence of singlet molecular oxygen in aqueous porphyrin solutions // SPIE Proceedings, 2001. Vol. 4241. P. 317-323.

37. Byteva I. M., Gurinovitch G. P. Sensitized luminescence of oxygen in solutions. //J. of Luminescence, 1979. Vol. 21. № 1. P. 17-20.

38. Byteva I. M., Gurinovitch G. P., Golomb O. L., Karpov V. V. Photosensitized luminescence of singlet oxygen in polymeric films. //Chem. Phys. Letters. 1983. Vol. 97. № 2. P. 167-169.

39. Callahan P.M., Cotton T.M. Assignment of bacteriochlorophyll a ligation state from absorption and resonance Raman spectra//JACS. 1987. Vol. 109. P. 7001-7005.

40. Cannistraro S., Van de Vorst A., Jori G. EPR studies on singlet oxygen, production by porphyrins.// Photochem. Photobiol. 1978. Vol. 28. P. 257.

41. Canti G., Ricci L., Ferrario A., Franco P., Marelli O., Andreoni A., Cubeddu R., Nicolin A. Photodynamic therapy in vitro and in vivo with hematoporphyrin derivative and laser // Neoplasma. 1987. Vol. 34. P. 61-66.

42. Carraro C., Pathak M.A. Studies on the nature of in vitro and in vivo photosensitization reactions by psoralens and porphyrins //J. Invest. Dermatol. 1988. Vol. 90. P. 267-275.

43. Chahidi C., Aubailly M., Momzikoff A., Bazin M. , Santus R. //Photochem. Photbiol. 1981. Vol. 33. P. 641-649.

44. Chauvet J. P., Villan F., Viovy R. Photooxidation of chlorophyll and pheophytin. Quenching of singlet oxygen and influence of the micellar structure. //Photochem. Photobiol. 1981. Vol. 34. № 5. P. 557-565.

45. Chou P.T., Khan A.U. L-ascorbic acid quenching of singlet delta molecular oxygen in aqueous media: generalized antioxidant property of vitamin C. // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1983. Vol. 115. № 3. P. 932-937.

46. Chou P.T., Khan A.U. Solvation emission spectral peaks of singlet molecular oxygen. // Chem. Phys. Letters . 1984. Vol. 103. № 4. P. 281-284.

47. Chow W.S. Photoprotection and photoinhibitory damage // Adv. Molecular Cell. Biol. 1994. Vol. 10. P. 151-196.

48. Chuannong Z., Chi S., Deng J., Liang J,. Jori G., Milanesi C. Apoptosis of mouse MS-2 fibrosarcoma cells induced by photodynamic therapy with Zn(II)-phthalocyanine // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1996. Vol. 33. P. 219-223.

49. Cox G., S., Bobillier C., Wihtten D. G. Photooxidation and singlet oxygen sensitization by protoporphyrin IX and its photooxidation products. // Photochem. and Photobiol. 1982. Vol. 36. № 4. P. 401-407.

50. Critchley C. Studies on the mechanism of photoinhibition in higher plants, I. Effects of high light intensity on chloroplast activities in cucumber adapted to low light // Plant Physiol. 1981. Vol. 67. № 6. P. 1161-1165.

51. Crute J. J., Warn A. F., Bambara R. A., Murant R. S., Gipson S. L., Hils R. Inhibition of mammalian DNA-polymerase by hematoporphyrin derivative and photoradiation // Cancer Research. 1986. Vol. 46. P. 153-159.

52. Dahl T.A., Midden W.R., Hartman P.E. Some prevalent biomolecules as defenses against singlet oxygen damage // Photochem. Photobiol. 1988. Vol. 47. P. 357-362.

53. Dairou J., Vever-Bizet Ch., Daniel B. Self-association of disulfonated deuteroporphyrin and its esters in aqueous solution and photosensitized production of singlet oxygen by the dimers // Photochemistry and Photobiology. 2002. Vol. 75. P. 229-236.

54. Daub M. E., Hangarter R. P. Light-induced production of singlet oxygen and superoxide by the fungal toxin, cercosportin. // Plant Physiol. 1983. Vol. 73. №3. P. 855-857.

55. D'Auria M., Bonini C., Emanuele L., Ferri R. Singlet oxygen-mediated degradation of lignin Isolation of oxidation products from steam-exploded lignin from straw // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2002. Vol. 147. P. 153-156.

56. Davila J.; Harriman A. hotoreactions of macrocyclic dyes bound to human serum albumin //Photochem. Photobiol. 1990. Vol. 51. P. 9-19.

57. De Mol N. G., Beijerbergen van Henegouwen G. M. J. Relation between some photobiological properties of furocoumarins and their extent of singlet oxygen production. // Photochem. and Photobiol. 1981. Vol. 33. № 6. P. 815-820.

58. Dedic R., Svoboda A., Psenchik J., Lupinkova L., Komenda J., Hala J. Time and spectral resolved phosphorescence of singlet oxygen and pigments in photosystem II particles // Journal of Luminescence. 2003. Vol. 102-103. P. 313-317.

59. Devasagayam T.P.A., Werner T., Ippendorf H., Martin H.D., Sies H. Synthetic carotenoids, novel polyene polyketones and new capsorubinisomers as efficient quenchers of singlet molecular oxygen //Photochem. Photobiol. 1992. Vol. 55. P. 511-514.

60. Dhinsa R. S., Plumb- Dhinsa P.L., Reid D. M. Leaf senescence and lipid peroxidation: effects of some phytohormones and scavengers of free radicals and singlet oxygen. // Physiol. Plantarum. 1982. Vol. 56. № 4. P. 453457.

61. Dillon J., Spector A., Nakanishi K. Identification of P-carbolines isolated from fluorescent human lens proteins // Nature. 1976. Vol. 259. P. 422423.

62. Dougherty T. J. Photodynamic therapy // Photo-dynamic Therapy of Tumors and Other Diseases. 1985. Eds G. Jori., CPerria (Padova: Libreria Progetto) P. 267-279.

63. Dougherty T. J. Photosensitizers. Therapy and detection of malignant tumors //Photochemistry and Photobiology. 1987a. Vol. 45. P. 879889.

64. Dougherty T. J., Kaufman J. E., Goldfarb A., Weishaupt K R., Boyle D., Mittleman A. Photoradiation therapy for treatment of malignant tumors // Cancer Research. 1978. Vol. 38. P. 2626-2635.

65. Dougherty T. J., Potter W. R., Weishaupt K. R., An overview of the status of photoradiation therapy // Porphyrin Localization and Treatment of Tumors. 1984 Eds D. R. Doiron., C. J. Gomer. New York: Alan Liss. P. 301.

66. Dougherty, T. J. Studies on the structure of porphyrins contained in Photofrin II. // Photochem. Photobiol. 1987b. Vol. 46. P. 569-573.

67. Eales L. Porphyrins in clinical chemistry // The Porphyrins. 4. Physical Chemistry. Part B. 1979, Ed. D Dolphin. New York: Academic Press. P. 665-802.

68. Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Direct luminescence study of singlet molecular oxygen in systems of biological importance // Abstracts of the 11th Int. Congress on Photobiology. Kyoto. Japan. Sept. 7-12. 1992. -Kyoto: 1992. P. 261.

69. Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Laser-induced luminescence of singlet molecular oxygen. Generation by drugs and pigments of biological importance // SPIE Proceedings (Laser Applications in Life Sciences). 1990. Vol. 1403. P. 611-621.

70. Egorov S.Yu. and Krasnovsky A.A., Jr. Photogeneration of singlet molecular oxygen by plant cell pigments under laser pulses // Proceedings of XV Int. Pigment Cell Conference. London. 26-30 September, 1993. -London: 1993. P. 219.

71. Egorov S.Yu., Krasnovsky A.A., Jr. Generation of Singlet Molecular Oxygen ('02) by Monomeric and Aggregated Forms of Porphyrin // The International Conference on Photodynamic Therapy. 1989. Bulgaria. Sophia. Book of Abstracts. -Sophia: 1989. P. 191p.

72. Ehrenshaft M.,- Chung K-R., Jenns A.E., Daub M.E. Functional characterization of SOR1, a gene required for resistance to photosensitizing toxins in the fungus Cercospora nicotianae // Curr. Genet. 1999. Vol. 34. P. 478^85.

73. El-Agamey A., Love G.M., McGarver D.J., Martensen A., Phillip D.M., Truscott T.G., Young A.J. Carotenoid radical chemistry and antioxidant/pro-oxidant properties // Arch. Biochem. Biophys. 2004. Vol. 230. P. 37-48.

74. Emiliani C., Delmelle M. The lipid solubility of porphyrins, modulates their phototoxicity in membrane models // Photochem. Photobiol. 1983. Vol. 37. P. 487-490.

75. Engvall E. Enzyme immunoassay: ELISA and EMIT // Methods in Enzymology. 1980. Vol. 70. P. 413-439.

76. Epstein J.H. Phototoxicity and photoallergy //Semin. Cutan. Med. Surg. 1999. Vol. 18. P. 274-284.

77. Fabo E. On the nature of the blue-light photoreceptor: still an open question. // Blue-light syndrom. H. Senger ed. Berlin. 1980. P. 185-204.

78. Faludi-Daniel A., Amesz J., Nagy A. H. P 700 oxidation and energy transfer in normal maize and carotenoid-deficient maize. // Biochim. et Biophys. Acta. 1970. Vol. 197. № 1. P. 60 68.

79. Faludi-Daniel A., Nagy A. H. Lability of photosystem II in chloroplasts of carotenoid deficient maize leaves. // Proceedings of the 2nd international congress on photosynthesis research. Stresa,1971. Hauge. 1972. Vol.2. P. 1653 1658.

80. Faludi-Daniel A., Nagy A. H., Nagy A. The ratio of chlorophyll a to chlorophyll b in normal and mutant maize leaves. //Acta Botanica Academiae Scientiarum Hungaricae. 1968. Vol. 14. № 1 2. P. 17 - 27.

81. Firey P. A., Jones T.W., Jori G., Rodgers M.A.J. Photoexcitation of zinc phthalocyanine in mouse myeloma cells: observation of triplet states but not of singlet oxygen// Photochem. Photobiol. 1988. Vol. 48. P. 357-360.

82. Flint S. D., Jordan P. W., Caldwell M. M. Plant protective response to enhanced UV-B radiation under field conditions: leaf optical properties and photosynthesis. // Photochem. and Photobiol. 1985. Vol. 41. № 1. P. 95 99.

83. Foote C. S. Mechanism of photosensitized oxidation // Science. 1968. Vol. 162. № 3857. P. 963 970.

84. Foote C. S. Quenching of singlet oxygen. // Singlet oxygen. N. Y. 1979. P. 139-173.

85. Foote C. S., Chang Y. C., Denny R. W. Chemistry of singlet oxygen. X. Caratenoid quenching parallels biological protection. // J. Amer. Chem. Soc. 1970. Vol. 92. № 17. P. 5216 5218.

86. Foote С. S., Ching Т. -Y., Geller G. G. Chemistry of singlet oxygen, XVIII. Rates of reaction and quenching of a-tocopherol and singlet oxygen. // Photochem. and Photobiol. 1974. Vol. 20. № 6. P. 511 513.

87. Foote C. S., Denny R. W. Chemistry of singlet oxygen, VII. Quenching by p- carotene. // J. Amer. Chem. Soc. 1968. Vol. 90. № 22. P. 6233 -6235.

88. Foote C. S., Wexler S. Singlet oxygen. A probable intermediate in photosensitized autooxidation. // J. Amer. Chem. Soc. 1964. Vol. 86. № 18. P. 3880-3881.

89. Foote C.S., Definition of Type I and Type II Photosensitized Oxidation // Photochem. Photobiol. 1991. Vol. 54. P. 659.

90. Foote C. S. Light, oxygen and toxicity // Pathology of Oxygen. 1982. Ed. A Prator. New York: Academic Press. P. 21-44.

91. Foote, C.S. Photosensitized oxygenations and the role of singlet oxygen. //Acc. Chem. Res. 1968. Vol. 1. P. 104-110.

92. Foyer C., Rowell J., Walker D. Measurement of the ascorbic acid content of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination // . Planta. 1983. Vol. 157. № 3. P. 239 244.

93. French C. S., Young V. K. The fluorescence spectra of red algae and the transfer of energy from phycoerethrin to phycocyanin and chlorophyll. J. Gen. Physiol., 1951. Vol. 35, № 6, p. 873 890.

94. Friemel H., Brock J. / Grunlagen der Immunologic 1983. Berlin: Academie-Verlag. P. 49.

95. Fritz B. J., Ninnemann H. Photoreactivation by triplet flavin and photoinactivation by singlet oxygen of Neurospora crassa nitrate reductase. // Photochem. Photobiol. 1985. Vol. 20. № 41. P. 39 45.

96. Furbank R. T., Badger M. R., Osmond C. B. Photoreduction of oxygen in mesophyll chloroplasts of C4 plants. A model system for studing an vivo Mehler reaction. // Plant Physich 1983. Vol. 73. № 4. P. 1038 1041.

97. Furhob J. H. Smith K. M. / Porphyrins and metalloporphyrins. 1975. Ed. by K. M. Smith. Amsterdam. P. 771-810.

98. Galland, P. H. Senger. Flavins as possible blue-light photoreceptors, // G. H. Holmes (ed.). Photoreceptor evolution and function. 1991. London: Academic Press. P. 65-124.

99. Gantchev T, Gotchev G, Shopova M Hematoporphyrin type I (free radical) photosensitizing reactions in liposomes.// Stud Biophys. 1989. Vol. 131. P. 7-20.

100. Ghosh S. K. Destruction of chlorophyll in rice necrosis mosaic virus infected rice leaves // Indian J. Microbiol. 1982. Vol. 22. P. 37-40.

101. Goedheer J. C. Effect of changes in chlorophyll concentration of photosynthetic properties. I. Fluorescence and absorption of greening bean leaves. // Biochim. et Biophys. Acta. 1961. Vol. 57. № 3. P. 494 504.

102. Goodwin T. W. The biochemistry of carotenoids. London, N. Y.: Chapman and Hall. 1980. Vol. 1. 377 C.

103. Goosey J.D., Zigler J.S., Jr., Kinoshita J.H. Cross-linking of lens crystallins in a photodynamic system: a process mediated by singlet oxygen //Science. 1980. Vol. 208. P. 1278-1280.

104. Gorman A. A., Rodgers M. A. J. Lifetime and reactivity of singlet oxygen in aqueous micellar system: a pulsed nitrogen laser study. // Chem. Phys. Letters. 1978. Vol. 55. № 1. P. 152 154.

105. Gorman A. A., Rodgers M. A. Singlet molecular oxygen // Chem. Soc. Rev. 1981. Vol. 10. № 2. P. 205 231.

106. Grossweiner L. I., Blum A., Goyal G. C. Photophysics and photochemistry of hematoporphyrin., hematoporphyrin derivative and uroporphyrin I // Methods in Porphyrin Photosensitization 1985. Ed. D. Kessel. New York: Plenum Press. P. 181-192.

107. Gurinovich G. P., Salokhiddinov K. I. Luminescence of singlet oxygen generated in fluorescence quenching of aromatic molecules in solution. // Chem. Phys. Letters. 1982. — Vol. 85. № 1. P. 9 -11.

108. Hader, D.-P., Brodhun. B. // J. Plant Physiol. 1991. Vol. 137. P. 641-646.

109. Hall D. O. Nomenclature for insolated chloroplasts. // Natur. New Biology. 1972,

110. Halliwell B. Ascorbic acid and illuminated chloroplasts. In: Ascorbic acid: chemistry, metabolism and uses. //Advances in chem. series. P. A. Seib, H. Tolbert eds. Washington: 1982. Vol. 200. P. 263 274.

111. Hanamoto C.M., Castelfranco P.A. Separation of Monovinyl and Divinyl Protochlorophyllides and Chlorophyllides from Etiolated and

112. Phototransformed Cucumber Cotyledons // Plant. Physiol. 1983. Vol. 73. №1. P. 79-81.

113. Hanasaki Y., Ogawa S., Fukui S. The correlation between active oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids.// Free Radic. Biol. Med. 1994. Vol. 16. P. 845-850.

114. Harvaux M., Kloppstech K. The protective functions of carotenoid and flavonoid pigments against excess visible radiation at chilling temperature investigated in Arabidopsis npq and tt mutants. // Planta. 2001. Vol. 213. P. 95366.

115. Hasan, T., Ortel, B., Moor, A. C. E., Pogue, B.W. Photodynamic Therapy Of Cancer //Holland Frei Cancer Medicine. 2003 .BC Dekker Inc. Capter 40. P. 605-622.

116. Hasselt P. P., Berlo H. A. C. Photooxidative damage to photosynthetic apparatus during chilling // Physiol. Plantarum. 1980. Vol. 50. № l.P. 52-56.

117. Hasty N., Merkel P. B., Randlick P., Kearns D. R. Role of azide in singlet oxygen reactions: reaction of azide with singlet oxygen. // Tetrahedron Letters. 1972. Vol. 13. № 1. P. 49 52.

118. Havaux M., Tardy F. Thermostability and photostability of photosystem II in leaves of the chlorina-f2 barley mutant deficient in light-harvesting chlorophyll a/b protein complexes //Plant Physiol. 1997. Vol. 113. P. 913-923.

119. Heath R. L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. and Biophys., 1968. Vol. 125, № 1, p. 189 198.

120. Heber U. Freezing injury and uncoupling of phosphorylation from electron transport in chloroplasts // Plant Physiol. 1967. Vol. 42. P. 1343-1350.

121. Heber U., Bilger W., Bligny R., Lange O.L. Phototolerance of lichens, mosses and higher plants in an alpine environment: analysis of photoreactions // Planta. 2000. Vol. 211. P. 770-780.

122. Heber U. Irrungen, Wirrungen? The Mehler reaction in relation to cyclic electron transport in C3 plants // Photosynthesis Research. 2002. Vol. 73. P. 223-231.

123. Heber U., Lange O.L., Shuvalov V.A. Conservation and dissipation of light energy as complementary processes: homoiohydric and poikilohydric autotrophs. // J Exp Bot. 2006. Vol. 57. P. 1211-23.

124. Heelis, P., Kim. S.-T., Okamura, T., Sancar, A. The photo repair of pyrimidine dimers by DNA photolyase and model systems // J. Photochem. Photobiol B: Biol. 1993. Vol. 17. P. 219-228.

125. Hideg E., Ogawa K., Kalai T., Hideg K. Singlet oxygen imaging in Arabidopsis thaliana leaves under photoinhibition by excess photosynthetically active radiation // Physiologia Plantarum. 2001. Vol. 112P. 10-14.

126. Hillemanns P., Weingandt H., Baumgartner R., Diebold J., Xiang W., Stepp H Photodetection of cervical intraepithelial neoplasia using 5-aminolevulinic acid-induced porphyrin fluorescence // Cancer. 2000. Vol. 88. P. 2275-2282.

127. Hohl. N., Galland. P., Senger, H Altered flavin patterns in photobehavioral mutants of Phycomyces blakesleeanus.// Photochem. Photobiol. 1992b. Vol. 55. P. 247-255.

128. Hohl. N., Galland. P., Senger, H. Altered pterin patterns in photobehavioral mutants of Phycomyces blakesleeanus // Photochem. Photobiol. 1992a. Vol. 55. P. 239-245.

129. Horvath G., Faludi-Daniel A. Formation and compartmentation of leaf carotenoids in normal and mutant maize. // Proceedings of the 2nd international congress on photosynthesis research. Stresa, 1971. Hauge, 1972. Vol. 3. P. 2443-2449.

130. Houssier C., Sauer K. Optical properties of the protochlorophyll pigments I. Isolation, characterization, and infrared spectra //BBA. 1969. Vol. 182. №3. P. 476-491.

131. Hurst J. R., McDonalds J.D., Schuster C. B. Lifetime of singlet oxygen in solution directly determined by laser spectroscopy // J. Amer. Chem. Soc. 1982. Vol. 104. № 7. P. 2065 2067.

132. Imbrie C. W., Murphy T. M., Mechanism of photoinactivation of plant plasma membranes ATP-ase // Photochem. and Photobiol. 1984. Vol. 40. № 2. P. 243 248.

133. Iriyama K., Ogura N., and Takamiya A.A Simple Method for Extraction and Partial Purification of Chlorophyll from Plant Material, Using Dioxane //J. Biochem (Tokyo). 1974. Vol. 76. P. 901-904.

134. Ito T. Cellular and subcellular mechanisms of photodynamic action: the 102 hypothesis as a driving force in recent research. // Photochem. Photobiol. 1978. Vol. 28. № 4/5. P. 493 508.

135. Jen J. J., Mackinney G. On the photodecomposition of chlorophyll in vitro. II. Intermediates and breakdown products. // Photochem. and Photobiol. 1970a. Vol. 11. №5. P. 303 -308.

136. Jen J. J., Mackinney G. On the photodecomposition of chlorophyll in vitro. I. Reaction rates. // Photochem. and Photobiol. 1970b. Vol. 11. № 5. P. 277 302.

137. Jenny T. A., Turro N. J. Solvent and deuterium isotope effects on the lifetime of singlet oxygen determined by direct emission spectroscopy at 1.27 mem. // Tetrahedron Letters. 1982. Vol. 23. № 29. P. 1923 2926.

138. Jones L. W., Kok B. Photoinhibition of chloroplast reaction. I. Kinetics and action spectra. // Plant. Physiol. 1966. Vol. 41. № 6. P. 1037 -1043.

139. Jori G., Brown S.B. Photosensitized inactivation of microorganisms // Photochem. Photobiol. Sci. 2004. Vol. 3 . P. 403-405.

140. Juzeniene A., Juzenas P., Ma L.W, Iani V., Moan J. Topical application of 5-aminolaevulinic acid, methyl 5-aminolaevulinate and hexyl 5-aminolaevulinate on normal human skin. // Br. J. Dermatol. 2006. Vol. 155. P. 791-799.

141. Kalyanasundaram K., Neumann-Spallart M. Photophysical and redox properties of water-soluble porphyrins in aqueous media // J. Phys. Chem. 1982. Vol. 86. P. 5163-5169.

142. Kandler O., Sironval C. Photooxidation processes in normal green Chlorella cells. II Effects of metabolism. // Biochim. et Biophys. Acta. 1959. Vol. 33. № l.P. 207-215.

143. Kanofsky J. R. Near infra-red emission in the catalase-hydrogen peroxide system: a reevalution. // J. Amer. Chem. Soc. 1984. Vol. 106. № 15. P. 4277 4278.

144. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human plasma // Photohem.Photobiol. 1990. Vol.51 No. 33. P. 299-303.

145. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human red cell ghosts // Photochem. Photobiol. 1991. Vol. 53.No. 1. P. 93-99.

146. Kanofsky J.R., Sima P. Singlet oxygen production from the reactions of ozone with biological molecules.// J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 9039-9042.

147. Kats J. J., Norris J. R., Shipman L. L. Models for reaction-center and antenna chlorophyll. In: Chlorophyll proteins, reaction-center and photosynthetic members. J. M. Olson,G., Hind eds. N. Y.: Upton. 1976. P. 1655.

148. Kats J. J., Shipman L. L., Norris J. R. Structure and function of photoreaction center chlorophyll. // Chlorophyll organization and energy transfer in photosynthesis. Amsterdam. 1979. P. 1-34.

149. Kaufman S., Singletterry C. R. The critical range for formation by an oil-dispersible soap in hydrocarbon solvent. // J. Colloid. Sci. 1952. Vol. 7. № 5. P. 453-464.

150. Keene J.P., Kessel D., Land E.J., Redmond R.W., Truscott T.G. Direct detection of singlet oxygen sensitized by haematoporphyrin and related compounds // Photochem. Photobiol. 1986. Vol. 43. P. 117-120.

151. Kessel D. Hematoporphyrin and HPD: photophysics, photopchemistry and phototheraphy// Photochem. and Photobiol., 1984. Vol. 39, №6, p. 851 -859.

152. Kessel D. Porphyrin localizing phenomena // Advanced Experimental Medicine. 1983. Vol. 160. P. 115-127.

153. Kessel D. Sites of photosensitization by derivatives of hematoporphyrin // Photochemistry and Photobiology. 1986. Vol. 44. P. 489494.

154. Kessel D., Choi T. H. Tumor-localizing components of the porphyrin preparation hematoporphyrin derivatives // Cancer Research. 1983. Vol. 43. P. 1994-1999.

155. Khan A. U. Enzyme system generation of singlet (.Ag) molecular oxygen observed directly by 1.0 1.8 |um luminescence spectroscopy. // J of Amer. Chem. Soc. 1983. Vol. 105. № 24. P. 7195 - 7197.

156. Khan A. U. Theory of electron transfer generation and quenching of singlet oxygen ('X+g and 'Ag) by superoxide anion. The role of water in the dismutation of* 0"2 //J. Amer. Chem. Soc. 1977. Vol. 99. № 2. P. 370 371.

157. Khan A. U., Gebauer P., Hager P. Chloroperoxidase generation of singlet ('Ag) molecular oxygen observed directly by spectroscopy in the 1-to 1.6 \m region. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 80. № 17. P. 5195 -5197.

158. Khan A. U., Kasha M. Direct spectroscopic observation of singlet oxygen emission at 1268 nm excited by sensitizing dues of biological interest in liquid solution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. № 12. P. 6047 -6049.

159. Khavari-Nejad R.A., Inactivation of ribulose-l,5-hiphosphate carboxylase by flavin mononucleotid in light // Photosynthetica, 1984. Vol. 18. № 3. P. 350- 356.

160. Klimov V.V. Discovery of pheophytin function in the photosynthetic energy conversion as the primary electron acceptor of Photosystem II // Photosynthesis Research, 2003. Vol. 76. P. 247-253.

161. Klimov V.V., Krasnovsky A.A. Pheophytin as the primary electron acceptor in Photosystem II reaction centers // Photosynthetica. 1981. Vol. 15: P. 592-609.

162. Klotz L.O. Oxidant-Induced Signaling: Effects ofPeroxynitrite and Singlet Oxygen // Biol. Chem. -2002. Vol. 383. -P. 443 - 456.

163. Klotz L.O., Kroncke K.D., Sies H. Singlet oxygen-induced signaling effects in mammalian cells //Photochem. Photobiol. Sci. 2003. Vol. 2. P. 88-94.

164. Knowles A., Mautner G. N. The flavin-sensitized photooxidation of nucleotides. // Photochem. and Photobiol. 1972. Vol. 15. № 2. P. 199 207.

165. Knox J.P., Dodge A. D. Singlet oxygen and plants. // Phytochemistry. 1985. Vol. 24. № 5. P. 889 896.

166. Kobayashi K. Effect of sodum azide on the photodynamic induction of genetic changes in yeast. // Photochem. Photobiol. 1978. Vol. 28. № 4/5. P. 535 538.

167. Koch J. L., Oberlander R. M., Tamas I. A., Germain J. L., Ammodson D. B. S. Evidence of singlet oxygen participation in the chlorophyll-sensitized photooxidation of indoleacetic acid. // Plant Physiol. 1982. Vol. 70. №2. P. 414-417.

168. Koenig F., McGovern F.J., Larne R., Enquist H., Schomacker K.T., Deutsch T.F. Diagnosis of bladder carcinoma using protoporphyrin IX fluorescence induced by 5-aminolaevulinic acid. // BJU Int. Vol. 1999. Vol. 83. P. 129-135.

169. Kohen R., Misgav R., Ginsburg I. The SOD like activity of copper: carnosine, copper: anserine and copper : homocarnosine complexes // Free Rad. Res. Com. 1991. Vol. 12-13. P. 179-185.

170. Kohl F. G. Untersuchungen über das Carotin und sein physiologische Bedeutung in der Pflanze. Berlin: Gedruder Borntrager. 1902. P. 9-11.

171. Koka P., Song P.-S. Protection of chlorophyll aby carotenoid from photodynamic decomposition. //Photochem. Photobiol. 1978. Vol. 28. № 4/5. P. 509-516.

172. Kolnhäuser A. Molecular Aspects of Phototoxicity //Annals of the New York Academy of Sciences. 1980. Vol. 346. P. 398-414.

173. Kovalev D., Gross E., Ktinzner N., Koch R., Timoshenko V.Yu., Fujii M. Resonant Electronic Energy Transfer from Excitons Confined in Silicon Nanocrystals to Oxygen Molecules // Physical Review Letters. 2002. Vol. 89, No 13. P. 137401-1—137401-4.

174. Kramarenko G.D., Hummel S.G., Martin S.M., Buettner G.R. Ascorbate Reacts with Singlet Oxygen to Produce Hydrogen Peroxide // Photochem. Photobiol. -2006. Vol. 82. - No. 6. -P. 1634-1637.

175. Kramer H., Mathis P. Quantum yield and rate of formation of carotenoid triplet state in photosynthetic structures. // Biochim. et Biophys. Acta. 1980. Vol. 593. № 2. P. 319 329.

176. Krasnovsky A. A., Jr. Delayed fluorescence and phosphorescence of plant pigments. // Photochem. Photobiol. 1982. Vol. 36. № 6. P. 433 441.

177. Krasnovsky A. A., Jr. Photoluminescence of singlet oxygen in pigment solution. // Photochem. and Photobiol. 1979. Vol. 29. № 1. P. 29 36.

178. Krasnovsky A. A., Jr. Quantum yield of photosensitized luminescence and radiative lifetime of singlet (.Ag) molecular oxygen in solutions. // Chem. Phys. Letters. 1981. Vol. 81. № 3. P. 443 445.

179. Krasnovsky A. A., Jr., Kagan V.E., Minin А.А. Quenching of singlet oxygen luminescence by fatty acids and lipids. Contribution of physical and chemical mechanisms. // FEBS Letters. 1983. Vol. 155. № 2. P. 233 236.

180. Krasnovsky A. A., Jr., Kovalev Yu.V., Egorov S.Yu. Singlet Oxygen and Photodestruction of Chloroplasts // Book of Abstracts of 16 Conference of FEBO/Moscow. 1983. P. 250.

181. Krasnovsky A. A., Jr., Lebedev N. N., Litvin F. F. Phosphorescence and Delayed fluorescence of chlorophyll and its precursors in solution, leaves and chloroplasts at 77*K. // Studia biophys. 1977. Vol. 65. № 2. P. 81 89.

182. Krasnovsky A.A., Jr. and Egorov S.Yu. Study of chlorophyll triplet state and singlet molecular oxygen involvement in chloroplast photodestruction // Photosynthesis Research. 1992. Vol. 3.34. No 1. P. 173.

183. Krasnovsky A.A., Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies // Membr. Cell Biol. 1998. Vol. 12. P. 665-690.

184. Krasnovsky A.A., Jr. Singlet molecular oxygen: mechanisms of formation and paths of deactivation in photosynthetic systems // Biophysics. Vol. 39. No. 2. P. 197-211.

185. Krasnovsky A.A., Jr., Egorov S.Yu. Quenching of singlet molecular oxygen by biomolecules in aqueous media // Proceedings of Laser Applications in Life Sciences-94, 26.06-2.07.1994, Minsk, Belarus. -Minsk: 1994. P. 21 IP.

186. Krasnovsky A.A., Jr., Sukhorukov V.L., Egorov S.Yu., Potapenko A. Ya. Generation and quenching of singlet molecular oxygen by furocoumarins. Direct luminescence measurements // Studia biophysica, 1986. Vol. 114. № 1-3. P. 149-158.

187. Krieger-Liszkay A. Singlet oxygen production in photosynthesis // J. Experim. Botany. 2005. Vol. 56. P. 337-346.

188. Krinsky N. I. Biological roles of singlet oxygen. //Singlet oxygen. Wasserman, R. W. Murray eds. N. Y. 1979 P. 597-641.

189. Krinsky N. I. The biological properties of carotenoids // Pure Appl. Chem. 1994. Vol. 66. P. 1003-1010.

190. Krinsky N. I. The protective function of carotenoid pigments. //Photophysiology. N. Y. 1968. P. 123-196.

191. Krinsky N.I. Carotenoids as antioxidants.//Nutrition. 2001. Vol. 17. P. 815-817.

192. Krinsky N.I., Yeum K.J. Carotenoid-radical interactions //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 305. P. 754-760.

193. Krishnamurthy M. Sutter J. R. Kinetic and Equilibrium Study of the Monomer-Dimer Reaction of Tetrakis-(p-(trimethylammonio)phenyl) porphinato.silver(III) in Aqueous Medium // Inorg. Chem. 1985. Vol. 24. P. 1943.

194. Lambert, C.R.; Reddi, E.; Spikes, J.D.; Rodgers, M.A.J.; Jori, G. The effects of porphyrin structure and aggregation state on photosensitized processes in aqueous and micellar media//Photochem. Photobiol. 1986. Vol. 44. P. 595-601.

195. Latimer P., Bannister T.T., Rabinovich E. Quantum yields of fluorescence of plant pigments. Science, 1956. Vol. 124, № 3222, P. 585- 586.

196. Lerman S., Mandal K., Misra B., Schechter A., Schenck J. Phototoxicity involving the ocular lens: in vivo and in vitro studies. // Photochem Photobiol. 1991. Vol. 53. P. 243-247.

197. Lin C., Robertson D.E., Ahmad M., Raibekas A.A., Jorns M.S., Dutton P. L., Cashmore A.R. Association of flavin adenine dinucleotide with the Arabidopsis blue light receptor CRY1 // Science. 1995. Vol. 269: P. 968-970.

198. Lindig B. A., Rodgers M. A. J. Laser photolysis studies of singlet molecular oxygen in aqueous micellar dispersions. // J. Phys. Chem. 1979. Vol. 83. № 13. P. 1683- 1688.

199. Lindig B. A., Rodgers M. A. J., Schaap A. P. Determination of the lifetime of singlet oxygen in D20 using 9,10-anthracenedipropionic acid, a water-soluble probe. // J. of Amer. Chem. Soc. 1980. Vol. 102. № 17. P. 55905593.

200. Lindig B.A., Rodgers M.A.J. Rate parameters for the quenching of singlet oxygen by water-soluble and lipid-soluble substrates in aqueous and micellar systems. //Photochem. Photobiol. 1981. Vol. 33. P. 627-634.

201. Macpherson, A.N., Telfer A., Barber J., Truscott T.G. Direct detection of singlet oxygen from isolated Photoystem II reaction centers // BBA. 1993. Vol. 1143. P. 301-309.

202. Maisch T., Szeimies R. Jori G., Abels Ch. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology // Photochem. Photobiol. Sci. 2004. Vol. 3.P. 907-917.

203. Malkin S. Delayed luminescence. // Primary processes photosynthesis. Amsterdam. 1977. P. 349-431.

204. Manderfeld M.M., Schafer H.W., Davidson P. M., Zottola E.A. Isolation and identification of antimicrobial furocoumarins from parsley. //J. Food Prot. 1997. Vol. 60. P. 72-77.

205. Marsh K.L., Connolly J.S. Effects of solvent on the rate of bacteriochlorophyll a photo-oxidation // J. Photochem. 1984. Vol. 25. P. 183195.

206. Martin C.B., Wilfong E., Ruane P. , Goodrich R., Platz M. An action spectrum of the riboflavin-photosensitized inactivation of Lambda phage. //Photochem Photobiol. 2005. Vol. 81. P. 474-480.

207. Massey V., Palmer G., Ballou D. On the reaction of redused flavins and flavoproteins with molecular oxygen. // Flavins and flavoproteins. H. Kamin ed. Baltimore, London. 1971. P. 349-361.

208. Matheson I. B. C., Lee J. Chemical reaction rates of amino acids with singlet oxygen. // Photochem. and Photobiol. 1979. Vol. 29. № 5. P. 879881.

209. Mathews-Roth M. M., Wilson T., Fuijmori E., Krinsky N. Carotenoid chromophore length and protection against photosensitization. // Photochem. Photobiol. 1974. Vol. 19. № 3. P. 217-222.

210. Mathis P. Triplet-triplet energy transfer from chlorophyll "a" to carotenoids in solution and in chloroplasts. // Progress in photosynthesis research. Tubingen. 1969. Vol. 2. P. 818-822.

211. Mathis P. , Kleo. The triplet state of (3 -carotene and of analog polyenes of different length. // Photochem. Photobiol. 1973. Vol. 18. № 4. P. 343-346.

212. Mehler A. H. Studies on reaction of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents.// Arch. Biochem. and Biophys. 1951. Vol. 33. № 1. P. 65-67.

213. Mendes J., Casto-Poceiro J. Furocoumarins from Angelica pachycarpa.// Phytochem. 1983. Vol. 22. № 11. P. 2599-2601.

214. Merkel P. B., Kearns D. R. Radiationless decay of singlet oxygen in solution. An experimental and theoretical study of electronic-to-vibrational energy transfer.// J. Amer. Chem. Soc. 1972a. Vol. 94. № 21. P. 7244 7253.

215. Merkel P. B., Kearns D. R. Remarkable solvent effects on the lifetime of oxygen. //J. of Amer. Chem. Soc., 1972b. Vol. 94, № 3, P. 1029 -1030.

216. Merkel P. B., Nilsson R., Kearns D. R. Kearns D. R. Deuterium effect on singlet oxygen lifetime. A new test on singlet oxygen reactions. // J. Amer. Chem. Soc. 1972. Vol. 94. № 3. P. 1030 1031.

217. Merzlyak M.N., Hendry G.A.F. Free radical metabolism, pigment degradation and lipid peroxidation in leaves during Senescence // Proc.Royal.Soc.Edingurg. 1994. Vol. 102B. P. 459-471.

218. Merzlyak M.N., Solovchenko A.E., Smagin A.I., Gitelson A.A. Apple flavonolos during fruit adaptation to solar radiation: spectral features and technique for non-radiative assessment // J. Plant Physiol. 2005. Vol. 162. P. 151-160.

219. Mew D., Wat C. K., Towers G. H. N., Levy J. G. Photo-immunotherapy treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates // Journal of Immunological Methods. 1983. Vol. 130. P. 1473-1477.

220. Michaeli A., Feitelson J. Reactivity of singlet oxygen toward amino acids and peptides //Photochem. Photobiol. 1994. Vol. 59. P. 284-289.

221. Miflin B. J., Hageman R. H. Demonstration of photophosphorilation by maize chloroplasts. // Plant Physiol. 1963. Vol. 38. № l.P. 66-70.

222. Miller R. W., Rapp U. The oxidation of catechols by reduced flavins and denydrogenases, An electron spin resonance study of the kinetics and initial products of oxidation. // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248. № 17. P. 6048 6090.

223. Mishra R.K., Mishra N.P. , Kambourakis S., Orfanopoulos M., Ghanotakis D.F. Generation and trapping of singlet oxygen during strong illumination of a Photosystem II core complex // Plant Science. 1996. Vol. 115. P. 151-155.

224. Miskoski S., Garcia N.A. Influence of the peptide bond on the singlet molecular oxygen-mediated ('C^ 'Ag.) photooxidation of histidine and methionine dipeptides. A kinetic study. //Photochem. Photobiol. 1993. Vol. 57. P. 447-452.

225. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues //J. Photochem. Photobiol. B. 1990. Vol. 6. P. 343-347.

226. Moan J. The photochemical yield of singlet oxygen from porphyrins in different states of aggregation // Photochem. Photobiol. 1984. Vol. 39. P. 445

227. Moan J., Christensen T., Somer S. The main photo-sensitizing components of hematoporphyrin derivative // Cancer Letters. 1982. Vol. 15. P. 161-166.

228. Moan J., Rimington C., Evensen J F., Western A. Binding of porphyrins to serum proteins // Methods in Porphyrin Photosensitization. 1985 Ed. D Kessel. New York: Plenum Press. P. 193-206.

229. Monger T. D., Parson W. W. Singlet-triplet fusion in Rhodopseudomones sphaeroides chromatophores. A probe of the organization of the photosynthetic apparatus. // Biochim. et Biophys. Acta. 1977. Vol. 460. №3. P. 393 -407.

230. Moore T, A., Song P.-S. A model for biological quantum conversion involving the photooxidative dephosphorilati on of menadiol diphosphate. // Photochem. Photobiol. 1969. Vol. 10. № 1. P. 13-22.

231. Muller-Breitkreutz K., Mohr H., Briviba K., Sies H. Inactivation of viruses by chemically and photchemically generated singlet molecular oxygen // J. Photochem. Photobiol. B. 1995. Vol. 3. P. 63-70.

232. Nagano T., Fridowich I. Does the xanthine oxidase reaction generate singlet oxygen? //Photochem. and Photobiol., 1985. Vol. 41, № 1, P. 33-37.

233. Niedre M. J., Yu C. S., Patterson M.S., Wilson B.C. Singlet oxygen luminescence as an in vivo photodynamic therapy dose metric: validation in normal mouse skin with topical amino-levulinic acid //British Journal of Cancer. 2005 Vol. 92. P. 298-304.

234. Niedre M., Patterson, Wilson B.C. Direct near-infrared luminescence detection of singlet oxygen generated by photodynamic therapy in cells in vitro and tissues in vivo // Photochem. Photobiol. 2002. Vol. 75. P. 382391.

235. Nilsson R., Merkel P. B., Kearns D. R. Unambiquous evidence for the participation of singlet oxygen ('Ag) in photodynamic oxydation of amino acids. // Photochem. and Photobiol. 1972. Vol. 16. № 2. P. 117-124.

236. Nonell S., Redmond R.W. On the determination of quantum yields for singlet molecular oxygen photosensitization // J. Photochem. Photobiol. 1994. Vol. 22. P. 171-182.

237. Nultsch W., Benedetti P. A., Gualtieri P. Microspectrophotometric investigation of photobleaching in Anabaena variabilis cells and heterocysts and its prevention by sodium azide. // Z. Pflanzenphysiol. 1983. Vol. 111. № 4. P. 327-332.

238. Osmond B., Badger M., Maxwell K., Bjorkman O., Leegood R. Too many photons: photorespiration, photoinhibition and photooxidation // Trends in Plant Science. 1997. Vol. 2. P. 119-121.

239. Ostrovsky M.A., Sakina N.L., Dontsov A.E. An antioxidative role of ocular screening pigments //Vision Res. 1987. Vol. 27. P. 893-899.

240. Paietta J., Sargent M. L. Modification of blue light photoresponses by riboflavin analogs in Neurospora crassa. // Plant Physiol. 1983. Vol. 72, № 3, P. 764-766.

241. Palozza P. , Serini S., Nicuolo F.D., Calviello G. Modulation of apoptotic signaling by carotenoids in cancer cells // Arch. Biochem. Biophys. 2004. Vol. 230. P. 104-109.

242. Parker J.G. Optical monitoring of singlet oxygen during photodynamic treatment of tumors // IEEE Circ. Devices Mag. 1987. №1. P. 1021.

243. Parker J.G., Stanbro W. D. Optical determination of collisional lifetime of singlet oxygen 02 ('02) in acetone and deuterated acetone. // J. Amer. Chem. Soc. 1982. Vol. 104. № 7. P. 2067 2069.

244. Parker J.G., Stanbro W. D. Optical determination of the rates of formation and decay of 02 ('02) in H20, D2O and other solvents. //J. of Photochem. 1984. Vol. 25. № 5. P. 545-547.

245. Parson W.W., Cogdell R.J. The primary biochemical reaction of bacterial photosynthesis // Biochim. et Biophys. Acta. 1975. Vol. 416. № l.P. 105 149.

246. Pasternack R.F., Huber P. R., Boyd P., Engasser G., Francesconi L., Gibbs E., Fasella P. , Venturo G. C. Hinds L. deC. On the agrégation of meso substituted water soluble porphyrins // J. Am. Chem. Soc. 1972. Vol. 94. P. 4511-4517.

247. Pathak M.A., Joshi P. C. Production of active oxygen species ('02 and 02".) by psoralens and ultraviolet radiation (320-400 nm). // Biochim Biophys Acta. 1984. Vol. 798. P. 115-126.

248. Patterson, M. S., B. C Wilson, R. Graff In vivo tests of the concept of photodynamic threshold dose in normal rat liver photosensitized by aluminum chlorosulphonated phthalocyanine. // Photochem. Photobiol. 1990. Vol. 51. P. 343-349.

249. Pavlov A.R., Revina A.A., Dupin A.M., Boldyrev A.A., Yaropolov A.I. The mechanism of interaction of carnosine with superoxide radicals in water solutions // Biochem. Biophys. Acta 1993. Vol. 1157. P. 304-312.

250. Percival M.P., Dodge A. D. Photodynamic effects of rosa Bengal on sentescent flax cotyledons. J. Experim. Bot.,1983. Vol. 34, № 138, P. 47 51.

251. Petering, H.G., Schmitt, J.A. Studies in Pterine Chemistry. I. 2-Amino-4-hydroxy-6- polyhydroxyalkylpterines// J. Am. Chem. Soc. 1949. Vol. 71. P. 3977-3981.

252. Peters G., Rodgers M.A. J. Single-electron transfer from NADH analogues to singlet oxygen.// Biochim. et Biophys. Acta. 1981a. Vol. 637. № 1. P. P. 43-52.

253. Peters G., Rodgers M.A. J. Time-resolved determination of deuterium isotope effects on 02('Ag) lifetimes of solutions. //J. Amer. Chem. Soc. 1981b. — Vol. 103. № 22. P. 6759-6761.

254. Pflederer, W. // Folates and Pterins (Blaksley, R. L., and Benkovich, S. G. eds.) 1985. Vol. 2. New York : Wiley Interscience. P. 43-114.

255. Pirie A. Glutathione peroxidase in lens and a source of hydrogen peroxide in aqueous humour // Biochem. J. 1965. Vol. 96. P. 244-253.

256. Poppe W., Grosswiner L.I. Photodynamic sensitization by 8-methoxypsoralen via singlet oxygen mechanism.-. Photochem. and Photobiol., 1975. — Vol. 22, № 5, P. 217- 219.

257. Potapenko A. Ya., Moshnin M. V., Krasnovsky A. A., Jr., Sukhorukov V. L. Dark oxidation of unsaturated lipids by the photooxidized 8-methoxypsoralen.// Z. Naturforsch. 1982. B. 37c. H. 1. S. 70-74.

258. Powles S. B., Bjorkman O. Photoinhibition of photosynthesis: effect on chlorophyll fluorescence at 77k in intact leaves and in chloroplast membranes of Nerium oleander. // Planta. 1982. Vol. 156. № 2. P. 97 -107.

259. Rabinovich H.D., Fridovich I. Superoxide radicals,superoxide dismutases and oxygen toxity in plants. // Photochem. and Photobiol. 1983. Vol. 37. № 6. P. 679-690.

260. Rajagopalan, K.V. Novel aspects of the biochemistry of the molybdenum cofactor// Adv. Enzymol. Rel. Areas Mol. Biol. 1991. Vol. 64. P. 215-290.

261. Rebeiz C. A., Montazer-Zouhoor A., Hopen H. J.,Wu S. M. Photodynamic herbicides: 1. Concept and phenomenology. // Enzyme Microb. Technol. 1984. Vol. 6. № 9. P. 390-401.

262. Reddi E., Jori G., Rodgers M. A. J., Spikes J. D. Flash-photolysis studies of hemato-and corpo-porphyrins in homogeneous and microheterogeneous aqueous dispersions. // Photochem. and Photobiol. 1983. Vol. 38. № 6. P. 639-645.

263. Roder B. Photosensitizing properties of phorbides // J Photochem Photobiol B. 1990. Vol. 5. P. 519-521.

264. Rodgers M.A.J., Snowden P. T. Lifetime of '(>2 in liquid water as determinated by time resolved infrared luminescence measurements. // J. of Amer. Chem. Soc. 1982. Vol. 104. № 20. P. 5541-5543.

265. Rooney M. L. Ascorbic acid as a photooxidation inhibitor. // Photochem. and Photobiol. 1983. Vol. 38. № 5. P. 619 -621.

266. Rosen H., Klebanoff S. Formation of singlet oxygen by the myeloperoxidase mediated antimicrobial system. // J.Biol.Chem. 1977. Vol. 252. P. 4803-4810.

267. Rougee M., Bensasson R.V., Land E.J., Pariente R. Deactivation of singlet molecular oxygen by thiols and related compounds, possible protectors against skin photosensitivity. //Photochem Photobiol. 1988. Vol. 47. P. 485-489.

268. Ryabchikov Yu.V., Belogorokhov I.A., Vorontsov A.S., Osminkina L.A., Timoshenko V.Yu., Kashkarov P. K. Dependence of the singlet oxygen photosensitization efficiency on morphology of porous silicon // Phys. Stat. Sol. 2007. In press.

269. Sa E Melo M.T., Averbeck D., Bensasson R.V., Land E.J., Salet C. Some furocoumarins and analogs: comparison of triplet properties in solution with photobiological activities in yeast. // Photochem Photobiol. 1979. Vol. 30. P. 645-651.

270. Sagromsky H. Ein Beitrag zur physiologichen Charakteriseierung von der chlorophyll b-freien Mutant von Hordeum vulgare. // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1978. Bd. 173. H.2. S. 146-159.

271. Sanear A.J. Structure and function of DNA photolyase // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 2-9.

272. Sarna T., Duleba A., Korytowski W., Swartz H. Interaction of melanin with oxygen.//Arch. Biochem. Biophys. 1980. Vol. 200. P. 140-148.

273. Sconfienza C., Van de Vorst A., Jory G. Type I and type II mechanisms in the photooxidation in presence and absence of sodium dodecyl sulphate micelles//Photochem. Photobiol. 1980. P. 351-357.

274. Scurlock R., Rougee M., Bensasson R.V. Redox properties of phenols, their relationships to singlet oxygen quenching and to their inhibitory effects on benzo(a)pyrene-induced neoplasia //Free Radical Res. Commun.1990. Vol. 8. P. 251-258.

275. Seki T., Nozu K., Kondo S. Differential causes of mutation and killing in Escherichia coli after psoralen plus light treatment: monoadducts and cross-links.//Photochem Photobiol. 1978. Vol. 27. P. 19-24

276. Senebier J. Experiences sur Taction de la lumiere solaire dans la vegetation. / Geneve: Magnet, 1788. 446 P.

277. Senger Y. The effect of blue light on plants and microorganisms. // Photochem. and Photobiol. 1982. Vol. 35. № 6. P. 911-920.

278. Sheel I.D., Perone V. B., Larkin P. L., Kupel R. F. The isolation and characterization of two phytotoxic furocoumarins (psoralens) from diseased celery.// Biochemistry. 1963. Vol. 2. № 5. P. 1127-1131.

279. Shibata V.A. Spectroscopic studies chlorophyll formation in intact leaves. //J. of Biochem. 1957. Vol. 44. № 3. P. 147-173.

280. Shimizu O., Watanabe J., Imakubo K. Photon-counting technique facilitates both time- and spectral-resolved measurements of near-IR emission ofsinglet oxygen ('Ag) in aqueous solution. // J. Physics Soc. 1997. Japan. Vol. 66. No l.P. 268-269.

281. Shuvalov V.A., Amesz J., Duysens L.N.M. Picosecond charge separation upon selective excitation of the primary electron donor in reaction center of Rhodopseudomonas viridisll // Biochim. et biophys. acta. 1986a. Vol. 851. P. 327-330.

282. Shuvalov V.A., Duysens L.N.M. Primary electron transfer reactions in modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides //Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1986b. Vol. 83. P. 1690-1694.

283. Shuvalov V.A., Klevanik A. V., Sharkov F.V., Kryukov P. G., Bacon K.E. Pikosecond spectroscopy of photosystem I reaction centers // FEBS Letters. 1979. Vol. 107 . № 2. P. 313-316.

284. Shuvalov V.A., Klimov V.V. The primary photoreactions in the complex cytochrome-P890 P760 (bacteriopheophytin-760) of Chromatium minutissimum at low redoxpotentials//Biochim. et biophys. acta. 1976. Vol. 440. P. 587-599.

285. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G. Coupling of nuclear wavepacket motion and charge separation in bacterial reaction centers // FEBS Letters. 2003. Vol. 540 P. 26-34.

286. Sielewiesiuk J. Chlorophyll photodestruction in biomolecular lipid membranes. // Studia Biophys. 1983. Vol. 96. № 2. P. 117-120.

287. Sironval C., Kandler O. Photooxidation processes in normal green Clorella cells. I. The bleaching process. // Biochim. et Biophys. Acta, 1958. Vol. 29, № 2, P. 359-368.

288. Sironval C., Michel-Wolwertz M. R., Madsen A. On the nature and possible functions of the 673- and 684- nm forms in vivo of chlorophyll // Biochim. Biophys. Acta. 1965. Vol. 94. P. 344-354.

289. Skvonsen E., Snyder J.W., Lambert J.D.C., Ogilby P. R. Lifetime and diffusion of singlet oxygen in a cell. // Phys. Chem. Lett. 2005. Vol. 109. P. 8570-8573.

290. Slawinska D., Slawinski J., Ciesla L. The inhibition of peroxyradical-induced chemiluminescence by melanins. // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 1983. Vol. 15. P. 209-222.

291. Smirnoff N., Conklin P. L., Loewus F.A. Biosynthesis of ascorbic acid in plants: a renaissance. // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001. Vol. 52. P. 437^167.

292. Sobolev A.S., Jans D.A., Rosenkranz A.A. Targeted intracellular delivery of photosensitizers//Progress in Biophysics & Molecular Biology. 2000. Vol. 73. P. 51-90.

293. Soh N. Recent advances in fluorescent probes for the detection of reactive oxygen species. // Anal Bioanal Chem. 2006. Vol. 386. P. 532-543.

294. Song P. -S. Chemistry of flavins in their exited state. // In: Flavins and flavoproteins. H. Kamin ed. Baltimore, London, 1971. P. 37-61.

295. Song P. -S. Spectroscopic and photochemical characterization of flavoproteins and caratenoproteins as a blue light photoreceptors. In: Blue-light syndrom. H. Senger sd. Berlin, 1980, P. 157-186.

296. Song P. -S., Moore T. A. Mechanism of photodephosphorilation of menadiol diphosphate. A model for biquantum conversion. // J. of Amer. Chem. Soc., 1968. Vol. 90, № 23, P. 6507 6514.

297. Sparrow, J.R., Zhou, J., Cai, B. DNA is a target of the photodynamic effects elicited in A2E-laden RPE by blue-light illumination // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. Vol. 44. P. 2245-2251.

298. Spector A., Wang G.M., Wang R.R. Photochemically induced cataracts in rat lenses can be prevented by AL-3823A, a glutathione peroxidase mimic.// Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. P. 7485-7489.

299. Spikes J. D. Phthalocyanines as photosensitizers in biological systems and for photodynamic therapy of tumors // Photochemistry and Photobiology. 1986. Vol. 43. P. 691-699.

300. Srivasava J.S., Tsutsui M. Preparation and purification of tetrasodium meso-tetra(/?-sulfophenyl)porphine. An easy procedure. // J. Org. Chem. 1973. Vol. 38. P. 2103-2107.

301. Stratton S.P., Liebler D.C. Determination of singlet oxygen-specific versus radical-mediated lipid peroxidation in photosensitized oxidation of lipid bilayers: effect of beta-carotene and alpha-tocopherol. //Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 12911-20.

302. Stupishina Y., Cherezov S., Gusev N. The properties of water and hydrogen deuterium exchange under structural reconstruction of chloroplast proteins, // Studia Biophys. 1982. Vol. 91. № 1. P. 69-70.

303. Suzuki R., FuJita Y. Caratenoid photobleaching induced by the action of photosynthetic center II: DCMU-sensitivity. // Plant and Cell Physiol. 1977. Vol. 18. №3. P. 625-631.

304. Szigeti Z., Vagujfalvi D. Protection of chlorophyll against photobleaching by reduction. // Photobiochem. and Photobiophys. 1984. — Vol. 7. № l.P. 103-109.

305. Takahama U., Nishimura M. Formation of singlet molecular oxygen in illuminated chloroplasts. Effects on photoinactivation and lipid peroxidation. // Plant and Cell Physiol. 1975. v. 16. № 4. P. 737-748.

306. Takahama U. Supression of lipid peroxidation by p carotene in illuminated chloroplasts: evidence for (3- carotene as a quencher of singlet molecular oxygen in chloroplasts. // Plant and Cell Physiol. 1978. Vol. 19. № 8. P. 1565-1569.

307. Takahama U. Stimulation of lipid peroxidation and carotenoid photobleaching by deuterium oxide in illuminated chloroplast fragments: participation of singlet molecular oxygen in the reaction. // Plant and Cell Physiol. 1979. Vol. 20. № 1. P. 213-218.

308. Takahama U. Supression of carotenoid photobleaching be kaempferol in isolated chloroplasts. // Plant and Cell Physiol. 1982. Vol. 23. № 5. P. 859-861.

309. Takahama U. Effects of deuterium oxide and free radicals scavengers on carotenoid photobleaching in spinach chloroplasts. // Plant and Cell Physiol. 1983a v. 24. № 3. P. 495-500.

310. Takahama U. Supression of lipid peroxidation by quercetin and its glucosides in spinach chloroplasts. //Photochem. and Photobiol. 1983b. Vol. 38. № 3. P. 363 367.

311. Takahama U. O2- -dependent and -independent photooxidation of quercetin in the presence and absence of riboflavin and effects of ascorbate on the photooxidation. // Photochem Photobiol. 1985. Vol. 42. P. 89-91.

312. Takahama U., Oniki T. A peroxidase/phenolics/ascorbate system can scavenge hydrogen peroxide in plant cells // Physiologia Plantarum. 1997a. Vol. 101. P. 845-852.

313. Takahama U. Enhancement of the peroxidase-dependent oxidation of dopa by components of vicia leaves // Phytochemistry. 1997b. Vol. 46. P. 427-432.

314. Takahama U., Oniki T. Flavonoids and some other phenolics as substrates of peroxidase: physiological significance of the redox reactions //Journal of Plant Research. 2000. Vol. 113 P. 301-309.

315. Takahama U., Hirota S., Yamamoto A., Oniki T. Oxygen uptake during the mixing of saliva with ascorbic acid under acidic conditions: possibility of its occurrence in the stomach // FEBS Letters. 2003. Vol. 550. P. 64-68.

316. Tanielian C., Golder Z. Quenching of singlet oxygen by sensitizer in dye-sensitized photojxygenation. // Photochem. and Photobiol. 1981. Vol. 34. №3. P. 411-414.

317. Tanielian C., Golder L., Wolff C. Production and quenching of singlet oxygen by the sensitizer in dye-sensitized photo-oxygenations// J. Photochem. 1984. Vol. 25. P. 117

318. Tanielian Ch., Schweitzer C., Mechin R., Wolff Ch. Quantum yield of singlet oxygen production by Monomeric and aggregated forms of hematoporphyrin derivative // Free Radical Biology & Medicine. 2001. Vol. 30. -No. 2. P. 208-212

319. Telfer A., Dhami S., Bishop S.M., Phillips D., Barber J. P-Carotene quenches singlet oxygen formed by isolated Photosystem II reaction centres, // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 14469-14474 .

320. Thomas C., MacGiss R.S., Miller G.C., Pardini R.S. Photoactivation of hypericin generates singlet oxygen in mitochondria and inhibits succinoxidase // Photochem. Photobiol. 1992. Vol. 55. P. 47-53.

321. Thomas A.H., Lorente C., Capparelli A.L., Pokhrel M.R., Braun A.M., Oliveros E. Fluorescence of pterin, 8-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects //Photochem. Photobiol. Sci. 2002. Vol. l.P. 421-426.

322. Thomas A.H., Lorente C., Capparelli A.L., Martinez C.G., Braun A.M., Oliveros E. Singlet oxygen production by pterin derivatives in aqueous solutions //Photochem. Photobiol. Sci. 2003. Vol. 2. P. 245-250.

323. Thomas C., Pardini R.S. Oxygen dependence of hypericin-induced phototoxicity to EMT6 mouse mammary carcinoma cells // Photochem. Photobiol. 1992. Vol. 55. P. 831-837.

324. Touyz R.M. Reactive Oxygen Species, Vascular Oxidative Stress, and Redox Signaling in Hypertension What Is the Clinical Significance? // Hypertension. 2004. Vol. 44. P. 248-252.

325. Treadwell G. E., Jr., Metzler D.E. Photoconversion of riboflavin to lumichrome in plant tissues. // Plant Physiol. 1972. Vol. 49. № 6. P. 991-993.

326. Truscott T.G. The photochemistry of haematoporphyrin and some related species // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1986. Vol. 2. №12. P. 21772181.

327. Turay J., Hambright P. Data-Gupta N. Intermolecular association of natural and synthetic water soluble porphyrins // J. inorg. nucl. Chem. 1978. Vol.40. P. 1687-1688.

328. Vacek K., Naus J., Svaboda M., Vavrinec E., Kaplanova M., Hala J. Fluorescence polarisation spectra of chlorophyll amolecules in oriented polymer matrix. // Studia Biophys. 1977. — Vol. 62. № 3. P. 201 207.

329. Van der Rest M., Gingras G. The Pigment Complement of the Photosynthetic Reaction Center Isolated from Rhodospirillum rubrum // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249. P. 6446 6453.

330. Van Ginkel G., Raison J.K. Light-induced formation of.oxygen radicals in system containing chlorophyll. // Photochem. Photobiol.1980. Vol. 32. № 6. P. 793-798.

331. Vargas M.A., Maurino S.G., Maldanado J. M., Aparicio P. J. Photoinactivation of spinach nitrate reductase sensitized by flavin mononucleotid . Evidence for the involvoment of singlet oxygen. // Photochem. and Photobiol. 1982. Vol. 36. № 2. P. 223 228.

332. Vedaldi D., Dall'Acqua F., Gennaro A., Rodighiero G. Photosensitized effects of furocoumarins: the possible role of singlet oxygen.// Z Naturforsch C. 1983. Vol. 38. P. 866-869.

333. Vladimirov Yu. A., Olenev V. I., Suslova T.B., Cheremishina Z.P. Lipid peroxidation in mitichondrial members. // Advances in lipid research. N.Y. 1980. Vol. 17. P. 173-249.

334. Walter G., Shalygo, N.V. Location and fate of protoporphyrin IX accumulated in etiolated leaves and roots of Zea mays L. and Pisum sativum L. // J. Photochem. Photobiol. 1997. Vol. 40. P. 175-182.

335. Weishaupt K.R., Dougherty T.J., Potter W.R. // Purified hematoporphyrin derivative for diagnosis and treatment of tumors and method. 1984 PCT/W0.84/01382. CI. C07D209/58; 31/40.

336. Weser U., Pashen W., Yonnes M. Singlet oxygen and superoxide dismutase (cuprein). // Biochim. et Biophys. Acta. 1975. Vol. 66. № 2.P. 769 -777.

337. Wilkinson, F.; Helman, W. P.; Ross, A. B. Quantum yields for the photosensitized formation of the lowest electronically excited singlet state of molecular oxygen in solution //J. Phys. Chem. Ref.Data 1993. Vol. 22. P. 113262.

338. Wilson T., Fuijmori E., Krinsky N. I. Carotenoid chromophore lengh and protection against photosensitization. // Photochem. Photobiol. 1974. Vol. 19. №3. P. 217-222.

339. Yamashita K.K., Konishi K., Iton M., Shibata K. Photobleaching of carotenoid related to the electron transport in chloroplasts. // Biochim. et Biophys. Acta. 1969. Vol. 172. № 3. P. 511 524.

340. Yamauchi R., Matsushita S. Light-induced lipid peroxidation in isolated cloroplasts and role of a-tocopherol. // Agric. Biol. Chem. 1979. Vol. 43. № 10. P. 2157-2161.

341. Yoshikawa T., Naito Y., Kondo M. Antioxidant therapy in digestive diseases // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1993. Vol. 39. P. 35-41.

342. Zebger I., Snyder J.W., Andersen L.K., Poulsen, L., Gao, Z., Lambert, J.D.C., Kristiansen, U., Ogilby, P. R. Direct Optical Detection of Singlet Oxygen from a Single Cell //Photochem. Photobiol. 2004. Vol. 79. P. 319-322.

343. Zenk M.H. Untersuchungen zum Phototropismus der Avena Koleoptile: 1. Photooxydation in vivo. // Z. Pflansen-physiol. 1967. B.56. H. 1. S. 57-59.

344. Zeug A., Zimmermann J., Rôder В., Gabriela Lagorio M., San Román E. Microcrystalline cellulose as a carrier for hydrophobic photosensitizers in water // Photochem. Photobiol. Sci. 2002. Vol. 1. P. 198-203.

345. Zigman S. Lens UVA photobiology // J Ocul Pharmacol Ther. 2000. Vol. 16. P. :161-165.

346. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях (Обзор) //Биохимия. 2005. Т. 70. С. 246-264.

347. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. / М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004. 221 с.

348. Бекина Р. М., Лебедева А.Ф., Гусейнова В. Е. Активация адениннуклеотидами восстановления кислорода в электрон-транспортной цепи // Доклады АН СССР. -1981. Т. 257. № 3. С. 760-763.

349. Бекина Р. М., Шувалова В. А., Лысенко Г. Г., Мошенцева В. Н., Лебедева А. Ф. Исследование механизма фотоокислительных превращений органических кислот в хлоропластах // Физиол. растен. 1975. Т. 22. № 4. С. 680-687.

350. Бекина Р. М., Красновский А. А. Хранение изолированных хл opon ластов без изменения активности фотофосфорилирования. //Биохимия, 1968. Т. 33. Вып. I. С. 178-171.

351. Белл Л. Н. /Энергетика фотосинтезирующей растительной клетки. М.:Наука,1980. 333с.

352. Белогуров A.A., Зуев A.B., Завильгельский Г.Б. Репарация моноаддуктов и диаддуктов 8-метоксипсоралена у бактериофагов и бактерий //Молекулярная биология. 1976. Т. 10. С. 857 867.

353. Беляева О. Б., Карнеева Н. В., Стадничук И.Н., Литвин Ф. Ф. Динамика биосинтеза нативныхЗ форм хлорофилла от начальных стадий до завершения процесса зеленения этиолированных листьев. Биохимия, 1975, Т. 40 № 5, с.951-961.

354. Болдырев A.A. // Биохимические аспекты электрохимического сопряжения / 1977 М.: МГУ.

355. Болдырев A.A. Карнозин / М.: Издательство Московского университета. 1998. 320 с.

356. Брок И. Иммунологические методы / Под. ред. Г.Фримеля. -М. 1987. 390с.

357. Быстрова М.И Сафронова И.А., Красновский A.A. Изучение молекулярной организации агрегированных форм протохлорофилла в твердых пленках// Мол. биол. 1982. Т. 16. №2. С. 291-301.

358. Быстрова М.И Сафронова И.А., Красновский A.A. Сперальные эффекты превращения протохлорофиллида//Мол. биол. 1985. Т. 19. №4. С. 915-925.

359. Бытева И. M., Голомб О. Л., Гуринович Г. П., Карпов В. В. Участие молекулярного синглетного кислорода в процессе ускоренного выцветания красителей. Журнал прикладн. спектроскопии, 1982. Т. 36, № 5. С. 770-776.

360. Бытева И. М., Салохиддинов К.И. Тушение люминисценции кислорода акцепторами и донорами электронов. Оптика и спектроскопия, 1980, Т. 49, вып. 4. С. 707-713.

361. Варфоломеев С.Д., Зайцев C.B., Ильина М.Д., И.В. Березин Кинетика и механизм инактивации изолированных хлоропластов // Мол. биол. 1975. Т. 9. С. 893-902.

362. Васильев Р.Ф., Цаплев Ю.Б. Хемилюминесценция, создаваемая светом // Успехи химии. 2006. Т. 75. С. 1103-1118.

363. Венедиктов Е. А., Красновский А. А., мл. Генерация и тушение люминесценции синглетного молекулярного кислорода антрахиновыми красителями // Оптика и спектроскопия. 1982. Т. 52. № 3. С. 567-569.

364. Венедиктов Е. А., Красновский А. А., мл. Эффективность генерации синглетного молекулярного кислорода порфиринами// Журн. прикладной спектроскопии. 1982. Т. 36. № I. с. 152-154.

365. Волынец А. П., Прохорчук Р. А. /Ароматические соединения -продукты и регуляторы фотосинтеза. Минск: Наука и техника. 1983. 157с.

366. Воробьева Л. М., Красновский А. А. Фотохимически активная форма хлорофилла в листьях и ее превращения // Биохимия. 1956. Т. 21. вып. I. С. 126-136.

367. Воскресенская Н. П. Фотосинтез и спектральный состав света. /М.: Наука. 1965.311с.

368. Гамаюнова М. С., Кочубей С. М., Островская Л. К., Рейнгард Т. А., Силаева А. М. Фотохимические системы хлоропластов

369. Гостимский С. А., Ежова Т. А., Маторин Д. М. Генетический контроль фотосинтеза у Pisum sativum L. //Физиология растений. 1981. Т. 28. № 2. с.269-279.

370. Граник С. Механизм фотосинтеза. // Тр. V Международного биохим. конгр. 1962. М.: Изд-во АН СССР. С. 184-195.

371. Гуринович Г. П., Салохиддинов К.И. Генерация !Дё-кислорода при тушении синглетных и триплетных состояний многоатомных молекул. //Доклады АН СССР. 1981. Т. 261. № 3. С. 596-599.

372. Гуринович Г. П., Севченко А.Н., Соловьев К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. /Минск: Наука и техника. 1968. 517с.

373. Гуринович Г.П., Пецольд О.М., Бытева И.М. //Биофизика. 1974. Т. 19. С. 249.

374. Джагаров Б.М., Гуринович Г.П. Механизмы релаксоционных процессов в молекулах хлорофилла и родственных соединений// Возбужденные молекулы. Кинетика превращений / JL: Наука. 1982. С. 5988.

375. Джагаров Б.М., Салохиддинов К.И. //Оптика и спектроскопия. 1981. Т. 51. С. 841.

376. Джагаров Г. П., Сагун Е. И., Бондарев С. JL, Гуринович Г.П. Влияние молекулярной структуры на процессы безызлучательной дезактивации низших возбужденных состояний порфиринов // Биофизика. 1977. Т. 22. с.565-570.

377. Донцов A.A., Красновский A.A., мл., Егоров С.Ю., Островский М.А. Тушение синглетного кислорода меланином // II Всесоюзная конференция «Биоантиоксидант», 14-16 мая 1986 г., Черноголовка. /Тезисы докладов. Том II. Черноголовка (Моск.обл.). 1986. С. 85.

378. Донцов А.Е. //Журнал, эволюц. биохим. и физиол. 1981. Т. 17.1. С. 53.

379. Дроздова H.H., Вычегжанина И.В., Шубин B.B. Сравнительное изучение агрегации бактериофеофитинов//Биофизика. 1980. Т. 25. С. 423427.

380. Егоров С.Ю. Исследование первичных механизмов фотодеструкции пигментного аппарата хлоропластов растений // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук М.: МГУ. 1985.24 с.

381. Егоров С.Ю., Красновский A.A. мл., Сафронова И.А., Быстрова М.И., Красновский A.A. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода пигментами-предшественниками хлорофилла // Доклады АН СССР (биофизика). 1988. Т. 299. № 5. С. 1266-1270.

382. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл, К. Вацек, П. Панчошка. Фотосенсибилизированная хлорофиллом люминесценция синглетного кислорода в пленках полистирола. Кинетика затухания после лазерной вспышки// Биофизика, 1984, Т. 29, № 6. С. 921-922.

383. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Генерация синглетного кислорода в моделях биологических мембран // Труды V Всесоюзного совещания по фотохимии, Суздаль, 19-21 февраля 1985 г, ч. II. /Суздаль: 1985. С. 349.

384. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Люминесценция кислорода в водных растворах // Молодые ученые и основные направления развития современной биологии. М.: МГУ, Ч. 1. Депонировано в ВИНИТИ, 16 марта 1984, №1506-84Деп.

385. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Люминесценция синглетного кислорода в моделях биологических мембран // Труды 1 Всероссийской конференции фотобиологов. Пущино 28-30 мая 1996 г. /Пущино: 1996. С. 95.

386. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Тушение синглетного молекулярного кислорода компонентами сред, используемых для выделения и исследования фотосинтетической активности хлоропластов // Физиология растений. 1986. Т. 33. № 1. С. 10-14.

387. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл. Фотосенсибилизированная люминесценция кислорода при импульсном лазерном возбуждении. Кинетика затухания в водных растворах // Биофизика, 1983, Т. 28, № 3. С. 497-498.

388. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Кулаковская Л.И. Исследование механизма фотодеструкции хлоропластов: участие триплетного состояния хлорофилла // Физиология растений. 1985. Т. 32, № 4. С. 668-673.

389. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Бабижаев М.А., Шведова A.A. Фотосенсибилизированная генерация синглетного молекулярного кислорода эндогенными веществами хрусталика глаза // Биофизика. 1987. Т. 32. № 1.С. 169-171.

390. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Донцов А.Е., Островский М.А. Тушение синглетного молекулярного кислорода экранирующими пигментами меланинами и оммохромами // Биофизика. 1987. Т. 32. № 4. С. 685-686.

391. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Назарова Н.В., Ярцев Е.И. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода в водных и спиртовых растворах // Биофизика. 1986. Т. 31. № 2. С. 342-343.

392. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Назарова Н.В., Ярцев Е.И., Пономарев Г.В. Фотогенерация синглетного кислорода водорастворимыми порфиринами // Биофизика. 1987. Т. 32. № 6. С. 982993.

393. Егоров С.Ю., Красновский A.A., мл., Сухоруков B.JL, Потапенко А.Я. Фотосенсибилизированное фурокумаринами образование синглетного кислорода в водных и спиртовых растворах // Биофизика. 1986. Т. 31. № 1.С. 154-156.

394. Егоров С.Ю., Курелла Е.Г., Болдырев A.A., Красновский A.A., мл. Тушение синглетного молекулярного кислорода карнозином и анзерином //Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. № 1. С. 142-144.

395. Егоров С.Ю., Мааллем М., Красновский A.A. мл., Хачатурова Г.Т., Кричевский Т.Е. Фотосенсибилизированная генерация синглетного молекулярного кислорода дибензпиренхиноном // Доклады АН СССР (физическая химия). 1990. Т. 315. №5. С. 1152-1155.

396. Егорова С.Г., Иевлева Е.С., Киркин А.Ф., Коханова И.Д. Характеристика моноклональных антител к клеткам аденокарциномы легкого человека. // Цитология. 1988. Т. 30. № 9. С. 1129-1130.

397. Егорова С.Г., Новакова М., Мойсенович М.М., Могилевский И.Л. Характеристика моноклональных антител к меланоме кожи человека. // Вестник Московского университета. 1995. Сер. 17. Биология. Вып. 1. С. 66-68.

398. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов Л.В. Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами. // Физиология растен. 1982. Т. 29. вып.6. С. 1045-1052.

399. Зенькевич Э. И., Кочубеев Г. А., Кульба А. М. Спектроскопические и фотохимические свойства пигментов, связанных с белком//Биофизика, 1981. Т. 26. № 3. С. 389-393.

400. Зоров Д. Б., Банникова С.Ю., Белоусов В. В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота (обзор) //Биохимия.2005. Т.70. С. 265-272.

401. Иванов A.B., Захаров С.Д. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухлей //Квантовая электроника. -1999. Т. 29. №12. С. 192 -214.

402. Иванов А., Ревазова Е., Брызгалов И., Сорокина Ю., Себастиан Дж., Келлер Г., Ватсон Дж. Низкосиловое лазерное облучение стимулирует рост человеческой опухоли // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 2001а. Т. 132. № 8. С. 195-196.

403. Иванов A.B., Корочкин И.М., Захаров С.Д. Светокислородная терапия: принципы и возможности // Медицинская физика. 20016. №11. -С.25-26.

404. Иванов A.B., Захаров С.Д. Ионизирующее и неионизирующее (оптическое) облучение. Сравнение эффектов и закономерностей // Медицинская физика. 2001 в. №11. С. 24-25.

405. Иванов A.B., Решетников A.B., Дмитриев A.A., Градюшко А.Т., Швец В.И., Пономарев Г.В. // Материалы второго съезда фотобиологов России. Пущино. 8-12 июня 1998 . С . 362-364.

406. Кириллова Г.В. Синтез и свойства мезодиметиламинометил и ß-алкоксиэтил порфиринов. // Дисс. на соискание уч. степ. канд. хим. наук. 1983. М.:ИРЕА.

407. Клебанов Г.И., Чичук Т.В., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Роль продуктов перекисного окисления липидов в механизме действия лазерного облучения на лейкоциты крови человека // Биофизика. 2005. Т. 50. С. 862-866.

408. Койфман О.И., Семейкин A.C., Березин Б.Д. Методы получения и модификации простейших синтетических порфиринов// Порфирины: структура, свойства, синтез. /М.: Наука. 1985С.205-238.

409. Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П. Зрительная трансдукция и ионы кальция// Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 265-277.

410. Кормановский А. Я., Синещеков В. А., Иванов И. И. Разрушение нативных форм хлорофилла и смешанного пигментного комплекса хлорофилл каротиноид при действии синглетного кислорода. Научн. докл. высш. школы. Биологические науки. 1984а. № 2. С. 30-38.

411. Кормановский А. Я., Тунгарова Д. И., Иванов И. И. Фотодеструкция пигментов и а-токоферола в липосомах со встроенными пигмент- белковыми комплексами фотосистемы I. //Физиология растений. 19846. Т. 31. вып. I. С. 202-204.

412. Красновский A.A., мл., Баштанов М.Е., Дроздова H.H. Егоров С.Ю. Фотосенсибилизированная генерация мономолей и димолей синглетного кислорода в химических системах // Информационный бюллетень РФФИ. 1996. Т. 4. № 3. С. 586.

413. Красновский A.A. , мл., Егоров С.Ю. Генерация синглетного кислорода в моделях биологических мембран // Труды 5 Всесоюзного совещания по фотохимии. Суздаль, 1984 г. / Суздаль: 1984. Ч. II. С. 349.

414. Красновский A.A. мл., Неверов К.В., Егоров С.Ю., Редер Б. Фотофизические параметры феофорбида а: фосфоресценция и генерация синглетного кислорода // Оптика и спектроскопия. 1988. Т. 64. № 4. С. 790795.

415. Красновский A.A., Воробьева Л. М., Пакшина Е. В. Исследование активной формы хлорофилла у растений различных систематических групп // Физиология растений. 1957. Т. 4. вып.2. С. 124133.

416. Красновский A.A., Кособуцкая Л. М. Активная форма хлорофилла в коллоидных растворах вещества зеленых листьев и ее обратимые фотохимические превращения // Доклады АН СССР. 1955. Т. 104. № 3. с.440-443.

417. Красновский A.A., Кособуцкая Л. М. Различные состояния хлорофилла в листьях растений. // Доклады АН СССР. 1953. Т. 91. № 2. С. 343 346.

418. Красновский A.A., Кособуцкая Jl. M., Войниковская K.K. Активные и неактивные формы протохлорофилла и бактериохлоророфилла в фотосинтезирующих организмах // Доклады АН СССР. 1953. Т. 92. № 6 с.1201-1204.

419. Красновский A.A., мл. Люминесцентный анализ триплетных состояний хлорофиллов. // Acta Physica et Chemica. Szeged. Hungaria. Nova Series. 1977a. T. 23. F. 1. P. 147-154.

420. Красновский A.A., мл. Люминесценция при фотосенсибилизированном образовании '02 в растворах // В кн.: Возбужденные молекулы. Кинетика превращений. /Л.: 1982. С. 32-50.

421. Красновский A.A., мл. Люминесценция синглетного кислорода в растворах сенсибилизаторов. // Журн. прикладн. спектроскопии. 1980. Т. 32. № 5. с. 842-856.

422. Красновский A.A., мл. Определение излучательного времени жизни ^-состояния кислорода в растворах//Доклады АН СССР. 1981. Т. 257. №6. С. 1360-1362.

423. Красновский A.A., мл. Синглетный кислород в фотобиологических процессах. Дисс. на соискание уч. степени доктора биол. наук. /М„ МГУ, 1983, 317л.

424. Красновский A.A., мл. Синглетный кислород и механизм фотодинамического действия порфиринов // Успехи химии порфиринов. -2001.-С. 191-216.

425. Красновский A.A., мл. Фото динамическое действие и синглетный кислород // Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 305-321.

426. Красновский A.A., мл. Фотолюминесценция синглетного кислорода в растворах хлорофиллов и феофитинов // Биофизика. 1977. Т. 22. № 5. С. 927 928.

427. Красновский A.A., мл. Фотосенсибилизированная люминесценция синглетного кислорода в водных растворах // Биофизика, 1979, Т. 24, № 4. С. 747-748.

428. Красновский A.A., мл. Фотосенсибилизированная люминесценция синглетного кислорода в растворе // Биофизика. 1976. Т. 21. №4. С. 748-749.

429. Красновский A.A., мл., Венедиктов Е. А., Черненко О. И. Тушение синглетного кислорода хлорофиллами и порфиринами. // Биофизика. 1982. Т. 27.вып. 6. С. 966-972.

430. Красновский A.A., мл., Вычегжанина И.В., Дроздова H.H. Генерация и тушение синглетного молекулярного кислорода бактериохлорофиллом и бактериофеофитином а и b //ДАН. 1985. Т. 283. С. 474-477.

431. Красновский A.A., мл., Егоров С.Ю., Баштанов М.Е. Генерация и тушение синглетного молекулярного кислорода в водных и органических средах // Труды 2 всероссийской конференции фотобиологов, Пущино, 812 июня 1998. /Пущино: 1998. С. 97.

432. Красновский A.A., мл., Ковалев Ю. В. Фосфоресценция хлорофилла в листьях и клетках водорослей. //Биофизика. 1978. Т. 23. № 5. С. 920-922.

433. Красновский A.A., мл., Ковалев Ю. В., Лехоцки Э. Люминесцентный анализ триплетных состояний хлорофилла в листьях ячменя с блокированным биосинтезом каротиноидов// Доклады АН СССР. 1981. Т. 256. № 3. С. 726-730.

434. Красновский A.A., мл., Ковалев Ю. В., Фалуды-Даниэль А. Фосфоресценция и замедленная флуоресценция хлорофилла в мутантах кукурузы с нарушенным каротиноидным составом //. Доклады АН СССР. 1980. Т. 251. №5. С. 1264-1267.

435. Красновский A.A., мл., Лебедев H. Н., Литвин Ф.Ф. Обнаружение триплетных состояний хлорофилла и его предшественников в листьях и хлоропластах по фосфоресценции и замедленной флуоресценции при -196*. //Доклады АН СССР. 1975. Т. 225. № 1. С. 207210.

436. Красновский A.A., мл., Лебедев H. Н., Литвин Ф.Ф. Спектральные характеристики фосфоресценции хлорофиллов и феофитинов "а " и "в". // Доклады АН СССР. 1974. Т. 216. № 6. С. 14061409.

437. Красновский A.A., мл., Парамонова Л. И. Взаимодействие синглетного кислорода с каротиноидами. Константы скорости физического и химического тушения. // Биофизика. 1983. Т. 28. № 5. С. 725-729.

438. Красновский A.A., мл., Сухорукое В. Л., Потапенко А. Я. Фотогенерация синглетного кислорода плораленами //Бюлл. эксперим. медицины, 1983, Т. 96, № 9, с.59-61.

439. Красновский A.A., мл., Шапошникова М. Г., Литвин Ф.Ф. Участие синглетного кислорода в фотохемилюминесценции, фотоокислении и фотосенсибилизирующем действии хлорофилла "д". Биофизика, 1974, Т. 19, вып. 4. С. 650-654.

440. Красновский A.A., мл., Шувалов В.А., Литвин Ф.Ф., Красновский A.A. Фосфоресценция и замедленная флуоресценция протохлорофилловых пигментов. // Доклады АН СССР, 1971, Т. 199, № 5. С. 1181-1184.

441. Крицкий М.С., Телегина Т.А. Коферменты и эволюция мира РНК // Успехи биологической химии. 2004. Т.44 С. 341 —364.

442. Кузнецова Г. А. Природные кумарины и фурокумарины. /Л.: Наука. 1967. 248 с.

443. Кузнецова Н.П., Панков Б.С., Чубурова A.C. Порфирии /1981. М.: Медицина.

444. Литвин Ф.Ф., Архипов В.Н., Баштанов М.Е., Беляева О.Б., Егоров С.Ю., Игнатов Н.В., Красновский A.A., мл. Биогенез фотоактивных пигментных комплексов фотосинтеза // Информационный бюллетень РФФИ. 1996, Т. 4, № 4. С. 165.

445. Литвин Ф.Ф., Беляева О. Б., Гуляев Б. А., Синещеков В. А. Организация пигментной системы фотосинтезирующих организмов и ее связь с первичными фотопроцессами. // Проблемы биофотохимии. М. 1973, Т. 49. С. 132-147.

446. Литвин Ф.Ф., Беляева О.Б., Игнатов Н.В. Биосинтез хлорофилла и формирование реакционных центров фотохимических систем фотосинтеза // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 3 —42.

447. Маравин Г.Д., Пономарев Г.В., Шульга A.M. // Химия гетероциклич. соединений. 1987. №2. С. 214.

448. Мерзляк М. Н., Кормановский А. Я., Юферова С. Г., Румянцева В. Б. Окисление пигментов и липидов в изолированных хлоропластах синглетным кислородом, продуцируемым в газовой фазе. //Научн. докл. высш. школы. Биологические науки. 1980. № 12.с. 65-71.

449. Мерзляк М. Н., Плакунова О. В., Гостимский С. А., Румянцева В. Б., Новак К. Фотоокислительный механизм повреждения светочувствительного мутанта Pisum sativum L. Известия АН СССР, 1983, № 4. С. 578-588.

450. Мерзляк М. Н., Соболев A.C. Роль супероксидных анионрадикалов и синглетного кислорода в патологии мембран. В кн.: Итоги науки и техники. Серия биофизика. М., 1975. Т. 5. с. 118-165.

451. Мерзляк М. Н., Юферова С. Г. Окисление липидных компонентов в изолированных хлоропластах под действием света. //Физиология растений. 1975. Т. 22. вып. 5. С. 896-902.

452. Мерзляк М. Н., Юферова С. Г., Соболев A.C. Роль супероксидных анион-радикалов и супероксиддисмутазы в реакциях фотопереокисления липидов изолированных хлоропластов. //Биофизика. 1977.Т. 22.5.С.846-848

453. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. 1989. Т. 6. 167 с.

454. Метлицкий JI. В., Озерецковская О.Л. Биохимия иммунитета растений к инфекционным заболеваниям. //Биохимия иммунитета, покоя, старения растений. М. 1984. С. 9-40.

455. Миронов А.Ф. Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений // Итоги науки и техники. Совр. пробл. лаз. физ. М.: ВИНИТИ. 1990. Т. 3. 224с.

456. Митрофанова А. Н., Мамлеева Н.А. Бенько Е. М., Пряхин А. Н., Лунин В. В. Фотопревращение лигнина в присутствии адсорбированного сенсибилизатора// Журнал физической химии. 1996. Т. 70.С. 51511-1515.

457. Музафаров Е. Н., Руциева P. X., Акулова Е.А., Залетская О.Ю. Влияние флавонов на электронный транспорт и фотофосфорилирование в хлоропластах. //Физиология растений. 1980. Т. 27. вып. 4. С. 677-634.

458. Неверов К.В., Миронов Е.А., Людникова Т.А., Красновский А.А., мл., Крицкий М.С. Фосфоресцентный анализ триплетного состояния птеринов в связи с их фоторецепторными функциями в биохимических системах//Биохимия. 1996. Т. 61. С. 1627-1636.

459. Осипова О.П. Основные требования при выделении хлоропластов. //Методы выделения хлоропластов. 1970. Пущино. С. 7-17.

460. Островский М.А. Молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза и системы защиты от такого повреждения // Успехи биологической химии. 2005. Т. 45. С. 173—204.

461. Павлов А.Р., Ревина А.А., Дупин A.M., Болдырев А.А., Ярополов А.И. Взаимодействие карнозина с супероксидными радикалами в водных растворах // Бюлл. Экспер. Биол.Мед. 1990. Т. 110. С. 391-393.

462. Плетюшкина О.Ю., Фетисова Е.К., Лямзаев К.Г., Иванова О.Ю., Домнина Л.В., Высоких М.Ю., Пустовидко A.B., Алексеевский A.B., Алексеевский Д.А., Васильев Ю.М., Мерфи М.П., Черняк Б.В., Скулачев

463. B.П. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке //Биохимия. 2006. Т. 71.1. C. 75-84.

464. Потапенко А .Я., Малахов М.В., Кягова A.A. Фотобиофизика фурокумаринов//Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 322-338.

465. Рабинович Е. Фотосинтез: В 3-х Т. /М.: Изд-во иностранной литературы. 1951. Т. I. 648 с.

466. Рабинович Е. Фотосинтез: В 3-х Т. /М.: Изд-во иностранной литературы. 1953. Т. 2. 651 с.

467. Разумовский С. Д. Кислород элементарные формы и свойства. /М., Химия. 1979. 301 с.

468. Решетников A.B., Швец В.И., Пономарев Г.В. Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака // Успехи химии порфиринов. 1999 . СПб: НИИ Химии СПбГУ. Т. 2. Гл.4. С. 70-114.

469. Розенкранц A.A., Набатников П.А., Алиев P.A., Янс Д.А., Соболев A.C. Усиление цитотоксического действия при направленной доставке а-эмиттера астата-211 в ядра клеток гепатомы человека//Молекулярная медицина. 2004. № 1. С. 47-55.

470. Рубин А.Б. Биофизика /М.: Высшая школа. 1987. 319 с.

471. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза// Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 239-253.

472. Рубин Б. А., Корватовский В. Н., Брагинская О. Б., Пащенко В. 3., Першке X., Тусов В. Б. Динамика электронного возбуждения в пигментном аппарате фотосинтеза. //Молекулярная биология. 1980.Т. 14. № 3. С. 675-684.

473. Рубин Б. А., Мерзляк М. Н., Юферова С. Г. Окисление липидных компонентов в изолированных хлоропластах под действием света. Субстраты и продукты переокисления липидов. Физиология растений. 1976. Т. 23. вып. 2. С. 254-261.

474. Савицкий А.П. Фосфоресцентный иммуноанализ // Успехи биологической химии. -2000 Т.40. -С.309 —328

475. Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Березин И.В., Флуоресцентный иммуноанализ: порфирины как новые метки для иммуноанализа // ДАН СССР. 1987. Т. 293. С. 744-748.

476. Салохиддинов К. И., Бытева И. М., Джагаров Б. М. Длительность люминесценции синглетного кислорода в растворах при импульсивном лазерном возбуждении. Оптика и спектроскопия. 1979. Т. 47. №5. С. 881-886.

477. Салохиддинов К. И., Бытева И. М., Гуринович Г. П. Время жизни синглетного кислорода в различных растворителях. //Журн. прикладн. спектроскопии. 1981а. Т. 34. № 5.

478. Салохидцинов К. И., Бытева И. М., Джагаров Б. М., Гуринович Г. П. Исследование сенсибилизированной люминесценции синглетного кислорода в растворах в области 1278 нм. // Журн. прикладн. спектроскопии. 19816. Т. 35. № 2. С. 280-284.

479. Салохидцинов К. И., Бытева И. М. Влияние дейтерирования растворителя и внешнего тяжелого атома на время затухания люминесценции молекулярного кислорода.// Оптика и спектроскопия. 1983а. Т. 55. №3. С. 479-482.

480. Салохидцинов К. И., Джагаров Б. М., Егорова Г. Д. Прямое измерение времени жизни молекулярного кислорода в синглетном 'Ag-состоянии. генерируемого в воде сенсибилизатором порфирином. Оптика и спектроскопия. 19836. Т. 55. вып. I. С. 71-73.

481. Сидорин М.И. О выцветании хлорофилла в отмерших органах и тканях растений. //Труды института физиологии растений АН СССР. 1950. Т. 7. вып. I. С. 115-132.

482. Синещеков O.A., Литвин Ф.Ф. Фоторегуляция движения микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1982. вып. 17. с.62-87.

483. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Гилязова Д.Г. Подходы к направленной внутриклеточной доставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и придания клеточной специфичности//Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 351-379.

484. Соколов В.Г., Егоров С.Ю. Применение неинвазивных оптических методов исследования периферического кровообращения в практическом здравоохранении //Тезисы Международной конференции «Здоровье нации». /М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2005. С. 59-60.

485. Соловьев К. Н., Дворников С. С., Кнюкшто В. Н., Туркова А. Е. Фосфоренция и состояние хлорофилла в растворах. Журнал прикладн. спектроскопии. 1983. тю 38.№ 1. С. 87-95.

486. Странадко Е.Ф., Иванов A.B. Современное состояние проблемы фотодинамической терапии рака и неопухолевых заболеваний//Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 380-383.

487. Теренин А. Н. Фотоника молекул красителей. /Л.: Наука. 1968. С. 616.

488. Тюлина О.В., Каган В.Е., Болдырев A.A. Модулирующий эффект карнозина и родственных соединений на дыхательный взрыв лейкоцитов, активированных сульфатом бария // Бюлл. эксп. биол. мед. 1994. Т. 118. С. 463-466.

489. Уденфринд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицина. / 1965. М.: Мир.

490. Фрадкин Л. И., Доманский В. П., Самойленко А. Г., Шлык А. А. Пигментные системы фотосинтеза в течение первого часа деэтоляции листьев ячменя. //Доклады АН СССР. 1982. Т. 264.№ 3. С. 732-736.

491. Фрадкин Л. И., Шлык А. А. О переносе энергии между каротиноидами и зелеными пигментами. //Биоэнергетика и биологическая спектрофотометрия. /М. 1967. С. 130-140.

492. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода. // Свободные радикалы в биологии. /М. 1979. Т. I. с. 272-314.

493. Фут X. Фотосенсибилизированное окисление и синглетный кислород. // Свободные радикалы в биологии. М. 1979. Т. 2. С. 99-150.

494. Ходасевич Э. В., Мельникова JI. М. Арнаутова J1. И. Исследованние деградации хлорофиллов при "сезонном обесцвечивании хвои". //Хлорофилл. Минск. 1974. С. 357-373.

495. Шлык А. А. Метаболизм хлорофилла в зеленом растении. /Минск: Наука и техника. 1965. 396 с.

496. Шляпинтох В. Я. Свободные радикалы и хемилюминесценция. //Успехи химии. 1968. Т. 35. № 4. с.684-698.

497. Шувалов В. А., Красновский A.A. Изучение фотовосстановления кислорода хлоропластами методом хемилюминесценции люминола и хлорофилла. //Биохимия. 1975. Т. 40. вып. 2. С. 358-367.

498. Шувалов В. А., Красновский A.A. Люминесценция цинк порфиринов в микроорганизмах и растениях: фосфоресценция и замедленная люминесценция. //Молекулярная биология. 1971.Т 5 . вып. 5. С. 698-710.

499. Шувалов В.А. Преобразование солнечной энергии в первичном акте разделения зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. / М.: Наука. -2000.-50 с.

500. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Болгарина Т.И., Шкуропатова В.А., Долгова Т.А., Шувалов В.А. Механизм разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах//Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 2. С. 199-211.