Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем

Буторина, Дарья Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем"

На правах рукописи

Буторина Дарья Николаевна

Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических

систем

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена на физическом факультете Mockobckoi о т осударст венного университета им М.В Ломоносова и в Институте биохимии им А.Н Баха РАН

Научные руководители-

профессор, доктор биологических наук A.A. Красновский, доцент, кандидат физико-математических наук

A.B. Приезжев

Официальные оппоненты-

доцент, доктор физико-математических наук А Ю. Чикишев,

с.н.с, кандидат физико-математических наук А В. Феофанов

Ведущая организация: Саратовский государственный университет

Защита состоится 23 июня 2005 года в 16-00 часов на заседании Диссертационного совета (К 501.001.08) при Московском государственном университете им. МВ Ломоносова по адресу Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, физический факультет, аудитория 1-ОСрД

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 23 мая 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.ф.-м.н

Г Б. Хомутов

JM^f

1. Общая характеристика работы

ßSY3 9S4

1.1 Актуальность темы

Исследование обраювания. де ¡активации, реакционной способности и бжшмической роли активных форм кислорода (АФК) - одна и! фундаментальных проблем биофизики и биохимии Основное состояние молекулы кислорода является тринлстным Это предопределявi относительную химическую инертность кислорода, поскольку его взаимодействие с органическими молекулами, обычно являющимися син1 летными в основном состоянии, запрещено по спину. Высокая химическая и биоло! ическая активность кислорода проявляется вследствие ею способности генерировать промежуточные активные формы, среди которых первичными являются супероксид-анион-радикалы, возникающие в результате присоединения одного электрона наружной незаполненной оболочкой кислородных молекул, и синглстный кислород, возникающий в результате электронною перехода молекулы кислорода из основного состояния в возбужденное синглетное 'Ag состояние. Первый тип АФК - резулыа! химической, а второй - физической активации кислородных молекул

Биологическая роль АФК исключительно высока Например, они определяют серию сишальных реакций в клетках в ответ на стрессовые во(дейсiкия [Тарчевский И A J, стимулируют каскад биохимических реакций, приводящих к запрограммированной смерги клеюк - anomojy [Скулачев В П J, вызывают деструк1ивные процессы в cei4aiKe глаза, в поверхносшых тканях животных и растений под действием света [Островский М.А , Davies M.J ], подавляют фоюсинтез [Красновский А А, Егоров С Ю.|, определяют реакции иммунитета и развитие mhoihx боле шей животных и человека | Hulten I, М | С другой стороны, фотостимуляция образования АФК приводит к 1ибели раковых клеток, что активно используется при лечении раковых заболеваний методом фотодинамической терапии (ФД7) [Briviba К , Ochsner М , Якубовская Р И., Соколов В В , Странадко Г Ф , Иванов А В.] АФК вызывают инактивацию вирусов и бактерий, что исполыуегся для лечения очагов гнойного воспаления и инфекционных заболевший [Mueller-Brcitkreutz К , Странадко Е Ф., Иванов А В ]

Настоящая работа посвящена исследованию образования и дезактивации сиш летного кислорода ('О?, 'А..), который по свойствам существенно отличается от друг их АФК и в наибольшей степени допускает исследование биофизическими методами аналию Синглетный кислород может возникать в гечновых ферментат ивных и неферментативных процессах, но основной путь его образования - перенос энергии на молекулярный кислород от возбужденных молекул пшмешов - Именно нот

БИБЛИОТЕКА

процесс лежит в основе широко распространенною класса фотодинамических реакций вюрою шпа, имеющих важное прикладное значение (boote С S.].

При вгаимодействии с ненасыщенными opi эпическими молекулами (химическими ловушками) сишлетный кислород образует характерные циклические пероксиды, а при спон1анной дезактивации излучае! инфракрасную фосфоресценцию в области 1270 нм Именно на этих свойствах основаны современные методы обнаружения и исследования 'Ог Химические методы относительно просты. Однако информация, получаемая этими меюдами. не все!да убедительна, гак как ловушки внося1 возмущение в изучаемые системы, вступая в реакции как с 'Ог, так и с другими АФК и активными интермедиатами иекислородной природы. Существенно надежнее - оптический фосфоресцентный метод, так как он не вносит искажений в и!учаемые системы (Красновский Л Л.]. Однако интенсивность фосфоресценции очень мала, и ее рмистрация связана с использованием относительно сложных высоко чувствительных фотомегрических приборов В насюящее время с помощью указанных меюдов накоплен обширный экснеримешальный материал о свойствах сипглетпого кислорода в химических сис1емах, главным образом, в органических раствориiелях и оксиде детерия Однако параметры синглетного кислорода в ее i еет венных условиях в водных pacieopax биологически важных соединений и биологических системах - мало исследованы, так как время жизни, с1ационарная концентрация сингпетного кислорода, а гакже квантовый выход его фосфоресценции в этих системах существенно меньше, чем в органических растворителях и оксиде дейтерия.

1.2 Цель работы

Цель работы состояла в исследовании кинетики генерации и де¡активации сипглетною кислорода при импульсном лазерном во!буждении фотосеисибилизаторов в водных растворах биологически важных соединений и моделях биологических систем, с гем, чтобы экспериментально показать, какие кинетические параметры характерны для синглетного кислорода в системе, моделирующей реальную клепку. Для измерений предполагалось использовать метод наносекундных измерений собственной ИК фосфоресценции синглетнок> кислорода на уникальном лазерном фосфоресченпюм спектрометре, разработанном в группе биохимии сши четною кислорода Института биохимии им А Н Ьаха РАН Кроме того, в paöoie предполагалось показать, что с помощью данных, получаемых в результате кинетической регистрации фосфоресценции синглетною кислорода, можно оценить фогодинамическую активность различных краси гелей, потенциально пригодных для практического применения

В соотве!ствии с )той целью были постелены и решены следующие задачи

1) Провести сравнительное исследование кинетики фосфоресценции 'о2 в насыщенных воздухом и кислородом растворах биологически важных фотосенсибилизаюров в ор! эпических растворителях и воде при импульсном лазерном во!буждепии с наносекундныч временным разрешением.

2) Исследовать кинетические параметры 'Ог в гетерогенных водных системах, исмолыуя для этой цели смеси этанола и воды и водно-мицеллярные растворы, приготовленные с использованием детергентов разной природы.

"!) Исследовать влияние туштелей сиш летного кислорода - азида натрия, аминокислот и белков - на кинетические параметры 'Ог в гомогенных и 1е1ерогенных водных системах при концентрациях тушителей, соответствующих эффективности гугнения !02 компонентами живых клеток в биологических системах.

4) Фосфорсспснтным методом исследовать фотодинамичсскую активность водорастворимых красителей разных классов (порфиринов, хлоринов, фталоцианинов, родамипов, бактериохлоринов), представляющих интерес в связи с 1еоре1ическими и прикладными проблемами фоюбиоло1ии и фотомедицины.

1.3 Научная новизна

Впервые путем регистрации ИК фосфоресценции систематически исследована кинетика образования и дезактивации синглстното кислорода при импульсном лазерном возбуждении широкого круга биологически важных пигментов и красителей в насыщенных воздухом водных растворах. Во всех случаях кинетическая кривая состоит из двух фаз - нарастания и затухания. Установлено, что фаза нарастания соответствует скорости переноса энергии от триплет ных молекул красителей-фотосенсибилизаторов на кислород, а фаза затухания скорост и дезакт ивации синглетного кислорода

Подробно исследованы кинетические параметры синглетного кислорода в водных ютерогенных системах, моделирующих гетерогенность биологических систем. Установлено, что скорости затухания и нарастания, а также кванювые выходы фосфоресценции синглетного кислорода определяются локализацией синиетною кислорода в структурных компонентах гетерогенных систем, причем сродство синглетного кислорода к воде меньше, чем - к липофильным детергентным мицеллам

В гомогенных и гетерогенных системах детально исслсдовагго тушение синглетного кислорода азидом натрия, соединением, широко применяемым в фотобиохимических экспериментах Установлено, что константа скорости тушения синглетного кислорода этим соединением сильно зависит от растворителя и заряда мицелл детергента Впервые

"жспсримешалыю показано, что при достаючно высоких концентрациях а!ида, К01да время жиши синглетного кислорода меньше времени жизни трипле!ного состояния краенгеля-фотосенсибили¡аюра, чго характерно для биоло1 ических систем, наблюдается инвертирование кинежческих кривых фосфоресценции, т е. фаза нарастания определяется скоростью дезакгивации сишлетною кислорода, а фаза за1ухания - скоростью переноса энергии от триплез ных молекул красителей-фотосенеибилизаюров на кислород

Впервые исследовано вгаимодействис синыетною кислорода в водных растворах с фипгофаном, бычьим сывороточным альбумином и плазмой крови Показано, что эти тушители не юлько ле¡активируюг сишлетный кислород, но и препятствуют его генерации некоторыми норфиринами, чю указывает на способное!ь альбуминов играть роль протекторов крови oí фоюдинамического действия эндогенных порфиринов

1.4 Практическая ценность

Показана возможность определения времени жизни триплетною состояния красителя, времени жиши синглетного кислорода и коне i ант скорости тушения сишлетною кислорода раишчными биологически важными соединениями в результате анализа кинетической кривой фотосенсибилизированной фосфоресценции синглетного кислорода мри возбуждении паносскундными лазерными импульсами в насыщенных воздухом водных и нсводных растворах пшментов и красителей разной структуры Предложенный подход применим при любом соотношении времени жизни триплетного сооояния красителя и времени жи«ни синт летного кислорода

Разработана методика фотодинамического скрининга фоюсенсибилизаторов в водных и других средах для нужд фотомедицины и различных задач фотохимии и фоюбиохимии, основанная на использовании результатов регис¡рации кинетических кривых фосфоресценции синглетного кислорода при лазерном импульсном возбуждении Проведено 1естирование фото динамической активности широкого круга фотодинамических красителей для прикладных задач фотодинамической 1ерапии рака, фотодинамической очистки воды и фотобактерицидного применения.

1.5 Защищаемые положения

1 В кинетике образования и дезакшвации фосфоресценции сишлешого кислорода при наносекундиом лазерном возбуждении широкою крута биологически важных птменюв и красителей в насыщенных воздухом водных и нсводных pací ворах фаза

нарастания соответствует скорости переноса энерг ии от тринлетных молекул красителей-фотосенсибилизаторов на кислород, а фаза затухания - скорости дезактивации сииглетного кислорода.

2 Аналогичная двухфазная кинетика фосфоресценции !02 характерна для гетерогенных водно-мицеллярных систем, моделирующих гетерогенн>ю систему клегок В тгих системах параметры кинетических кривых существенно зависят от распределения между компаршенгами системы красителя и Ч)2. который локализован преимущественно в гидрофобной фазе мицелл.

3 В водных растворах, содержащих азид натрия, который снижает время жизни синглетного кислорода до значений, характерных для биолотических систем (несколько «иен не), кинетическая кривая фосфоресценции 'О2 инвертируется- время нарастания определяется скоростью дезактивации 'О2, а время затухания - скоростью переноса энергии на кислород от молекул красителя в триплетом состоянии Ою показывает, чк> время жизни 'Ог в таких системах можно определив по времени нарастания кинетической кривой фосфоресценции Аналогичное инвертирование вкладов процессов, определяющих кинетическую кривую, можно ожида1Ь в живых клетках и тканях.

4 При взаимодействии синглетного кислорода в водных системах с аминокиежначи, белками и плазмой крови последние тушат 'О2 и блокируют ею фогогенерацию порфиринами, вероятно, за счет комплексообраювания или экранирования красителей.

5 Метод ре1ис|рации 'Ог по ею фосфоресценции применим для тестирования фотосенсибитезирующей активности водорастворимых красителей, представляющих ишерес для прикладных ¡адач фотобиологии и фотомедицины.

1.6 Апробация диссертации

Материалы диссертации были представлены на семинаре кафедры Общей физики и волновых процессов М1 У им. М.В. Ломоносова (Москва, 2003 г.), на конкурсе работ ИИЬИ РАН (Москва, 2003 г.), на Международной конференции по химиии порфиринов и их соединений (Суздаль, 2003 г), на Международном биофизическом конгрессе (Вена, 2003), 5-ой школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Звенигород, 2002 г), на Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2001 г.), на X Международном семинаре «Лазерная физика» (Москва, 2001 г.).

1.7 Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ

1.8 Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов иссчедования, результаюв исследования и их обсуждения, выводов и списка лшера1уры, включающего 197 источников Работа изложена на 118 страницах, иллюсгра! ивный материал представлен 30 рисунками и 22 таблицами

/. 9 Личный вклад

Все представленные в диссертации результаты получены автором лично или при ею определяющем участии.

2. Содержание диссертации

Во ВВЕДЕНИИ обоснована актуальность темы и сформулирована цель диссертационной рабош

В ПЕРВОЙ ГЛАВЕ диссертации представлен обзор литературных данных. Рассмофены вопросы строения и свойств молекулы кислорода Описаны механизмы, кинетика фотосенсибилизированно! о образования и дезактивации 'СЬ в растворах Описаны методы регистрации '02, применяемые в настоящее время в различных лабораториях, рассмотрены их преимущества и недостажи. Представлены лигературные данные по характеристикам 'Ог в молельных системах в растворах

фотосенсибилизаторов, в моделях биологических мембран Приведена моден,, описывающая кинетические харак1еристики 10? в гетерогенном растворе в условиях П0сюянн01 о облучения.

Предс1авлены данные об образовании и расходовании 'О2 в растворах белков, аминокислот, в плазме крови, в суспензиях клеток в D2O, которые были получены разными группами к моменту написания диссертационной работы Рассмотрено взаимодействие фотосенсибитизаторов с компонентами клеток Описаны предшествующие данной работе исследования фосфоресценции 'Ог в водных растворах и биологических системах.

Во ВТОРОЙ ГЛАВЕ диссертции описаны материалы и методы исследований, которые применялись при выполнении диссертационной работы

Ма1ериалы. В качестве фотосенсибилизаторов в работе исполыовали порфирины -тетранатриевую соль тетра-4-сульфона1офенилпорфирина (7СФП. Aldrich, USA), а также мезотефа (4-Ы-метилпиридиниум) порфирин ПМПП), мезо-тетра сульфофенил порфин-4-пиридил тетратосилат, хлорины, родамины, фталоцианины, бактериохлорины

(красители были любезно предоставлены научно-фармацевтическим центром ОАО "Белмедпрепараты" и проф БМДжагаровым (Минск), проф Г В Пономаревым (Москва), д.х н НА Кузнецовой и чл.-корр РАН ГН Ворожцовым (ФГУП ГНЦ НИОПИ1С, Москва), проф. А Ф Мироновым (МГАТХТ, Москва).

В качестве растворителей использовали этанол (96%, Кристалл. Орел), оксид дейтерия (Изотоп. С-Петербург), дистиллированную воду или фосфатные буферные растворы (рН=5,8-9) Для моделирования гетерогенной среды использовали детергеггты-тритон Х-100 (Merck, Germany), додецилсульфат натрия (ДСН)), цет илтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (ДиаэМ, Москва) В качестве тушителей синглегного кислорода исполыовапи азид натрия (Merck, Germany). L-триптофан (ДиаэМ, Москва).

В экспериментах с плазмой крови использовали плазму крови быка и человека. Плашу выделяли из бычьей крови, стабилизированной ЫагОДТА, 7 мкМ, путем центрифуг ироваггия 10 мигг при 1000 g. Для измерений использовали плазму крови со сроком хранения максимум 120 часов при температуре +4 °С Плашу человека получали ог здоровых доноров путем естественного осаждения форменных >леменгов крови, кровь стабилизировали ЫазЭДТА. 7 мкМ. Для экспериментов использовалась плазма со сроком хранения не более 72 часов при температуре И °С.

Для моделирования раствора белковых молек>л использовали бычий сывороточный альбумин (ICN и Rcanal, 67000) Альбумин растворяли в фосфатном буферном растворе (рН-7,4) в концентрации 40 т/л 1акая концентрация соответствует естественному содержанию сывороточного альбумина в плазме крови. Затем раствор разбавляли буферным раствором до получения необходимой концентрации

Методы. Фосфоресценцию сиггглетною молекулярного кислорода регистрировали с помощью спектрометра, работающего на основе метода коррелированного счета одиночных фотонов Упрощенная схема установки представлена на рис 1 Исследуемый образец возбуждали лагером на парах меди («Фемта», Физический институт РАН Троицк), или азотным лазером (ЛГИ-505, Москва), либо лазером на парах золота (Mechatron, Москва) Параметры во!буждак>щего излучения ггредегавлены в таблице 1 Чтобы и ¡бежать попадания на образен инфракрасною излучения or лагера. возбуждающее лазерное излучение проходило через стеклянные фильтры. Излучение лазера с помощью системы линз коллимировали на кварцевую кювету с образцом При работе использовали два вида кювет: с длиной оптического пути 10 мм (луч возбуждающего излучения падал под углом 90° к поверхности кюветы) и 2 мм (луч возбуждающего излучения падал под углом 45° к поверхности кюветы) Оптическая плотность исследуемою образца на длине

потны возбуждения в большинстве измерений была около 0,2, в отдельных экспериментах не превышала 1.

Таблица^ Параметры лазеров ииючьзпванных для возбуждения фотосенсибилизатора

Параметры Лазер на парах меди Азотный лазер Jldicp на парах золота

Длина волны и ¡лучения, им 510,5 578,2 337 628

Часто 1а импульсов лазера, I ц 12200 700 16600

Длительность импульса, не 15 20 15

Энергия импульса на исследуемом образце, мкДж 24-53 30-50 54

Диаметр пучка на поверхности кюветы, см 0,9 0,6 0,5

Стеклянные оптические фильтры перед образцом СЗС21, СЗС14 УФС2 ОЗС5 или два СЗС5

Фильтры перед монохроматором ИКС7 ИКС7 ИКС7

Рис 1 Блок-схема установки для измерения чюмипесценции методом коррелированного во вре мени счета фотонов

лачер

1 - черкало 2- лиге» 3 - фильтр ■1 - образец

5 - ФЭУ-старг

6 - монохромат ор т - ФЭУ-стоп

Фосфоресценцию pei-истрировали под прямым углом к возбуждающему излучению Монохроматор МС-80 выделял излучение на 1270 нм, ширина щели монохроматора соотве1ствовала спектральному диапазону 18 нм Чтобы уменьшить вероятность

попадания на фотоумножитель рассеянного света флуоресценции красителей, перед входом монохроматора устанавливали граничный светофильтр ИКС-7, пропускающий только инфракрасный свет в области более 900 нм. Сигнал, выделенный чонохромагором. pei истрировал ФЭУ - 83 (С-1), охлаждаемый до - 60°С жидким азотом.

Импульс лазера регистрировали вспомогательным фотоумножителем «Старт» (ФЭУ-58), который при регистрации лазерною импульса, осуществлял запуск интегрированного в компьютер цифрового преобразователя («Парсек» Дубна) Кинетику фосфоресценции измеряли, используя принцип коррелированного во времени счета одиночных фотонов С момента поступления сигнала от <ЮУ-«Старт» цифровой преобразователь начинал формировать импульс, амплитуда которого была пропорциональна интервалу времени между возбуждающим лазерным импульсом и первым зарегисфированным ФЭУ-«Стоп» сигналом люминесценции, который через предусипитель также поступал на цифровой преобразователь. Порог дискриминации сигналов, поступающих с <ЮУ-«Стоп», устанавливали так, чтобы не пропускав сигнал ■электрической наводки oi лазерного генератора, но регистрировать импульсы ФГ)У Импульс «Стоп» прекращал формирование сигнала преобразователя. Амплшуда сигнала, сформированного преобразователем, в момент поступления сигнала «Стоп» была пропорциональна времени, прошедшему с момента лазерной вспышки до импульса «Стоп». Этот сигнал регисфировался во временном канале, соответствующем прошедшему временному промежутку. Число зарегистрированных в каждом канале импульсов служило показателем интенсивности люминесценции Зависимость числа импульсов в каждом канале от времени после лазерной вспышки составляла кинетическую кривую люминесценции.

Число импульсов при регисфации сигнала фосфоресценции за секунду не превышало 103. Количество импульсов за счет теплового шума ФЭУ не превышало 20 в секунду. Наименьшая использованная длительность временного канала при регистрации кинетической кривой составляла 0,02 мке, наибольшая - 0,14 мкс.

Чтобы показать, что peiистрируемый на 1270 нм сигнал принадлежал синглетному кислороду, контролировали спектр излучения в диапазоне 1200-1320 нм. Спектр получали nyieM интегрирования кинетических кривых фосфоресценции в диапазоне от 0,5 до 20 или 40 мкс, полученных для разных длин волн.

Измерения оптической плотности проводили на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3400 Флуоресценцию красителей в водных растворах и в водных растворах с плазмой per истрировали с помощью спектрофлуориметра Pcrkin Ытпег MPF-44.

В ТРЕТЬЕЙ ГЛАВЕ диссертции представлены резулыагы, полученные при выполнении работы

В параграфе 3.1 описаны кинетические параметры сишлежого молекулярного кислорода, которые были получены в растворах фотосенсибилизатора в воде и этаноле В качестве фогосепсибили гатора выбрали ТСФП, так как он наиболее устойчив к лазерному вомействию вьвывагощему фосфоресценцию '02, и его агрегация не приводит к существенному уменьшению квантового выхода фосфоресценции 'Ог На рис. 2 и 3 представлены кинетические кривые и спектры фосфоресценции 'Ог, полученные в насыщенных воздухом растворах ТСФП в этаноле и в воде при pif 6 В обоих случаях спекфы фосфоресценции имеют максимум при 1273+2 нм, а наблюдаемая кинетическая кривая состоит из двух фаз - нарастания и затухания, что соответствует теоретической зависимости, описывающей изменение концентрации синглетного кислорода:

/(/) = /„ Гехр(-к, f)-exp(-*ml OK«, (1)

тде 1(1) - интенсивность фосфоресценции в зависимости от времени, /» амплитуда фосфоресценции, kj и /с,у— константы затухания и нарастания соответственно, п гепловои ni) м фотоумножителя, ! - время. Полученные кинетические кривые фосфоресценции 'о? доетаточно точно аппроксимируются ггой зависимое шо

Рис 2 Кинетическая кривая (!) и спектр (2) фосфоресценции '(>2 в насыщенном воздухом растворе ТСФП (15 мкМ) в этаноле посте лазерного импульса Кинетическая кривая получена а раультате накопления сигнаш от 2,4-1(/' лазерных импу!ьсов, кресты -Оанные измерений сп юшная линия аппроксимация кинетической кривом Спектр соответствует суммарной интенсивности

фосфоресценции в интервале 1-45 мке после лазерного импульса

Время мке

Рис 3 Кинетическая кривая (1) и спектр (2) фосфоресценции 'О; в насыщенном воздухом водном растворе ТСФП (15 мкМ, pH 6) после лазерного импучьса Кинетическая кривая получена в результате накопчения сигнала от 1,8-107 лазерных импульсов, кресты данные измерений, сплошная линия аппроксимация

кинетической кривой Спектр соответствует суммарной

интенсивности фосфоресценции в интервале 1 - 20 мкс поспе лазерного импульса

Время, мкс

В растворе ТСФП в эшноле максимум интенсивности наблюдается через 1,2 мкс после лазерной вспышки, а постоянные времени нарастания и загухания (kr ~ 1 /г,ш. и kj~ 1 /Zd). полученные из регрессии кинетической кривой зависимостью С!), составляют соответственно 0 5±0,1 и 11010,5 мкс Время нарастания в пределах точности измерений соответствует времени жизни тринлетного состояния ГСФП (rj в насыщенном воздухом этаноле, полученному методом импульсного фотолиза по затуханию триплет-триплетного поглощения ТСФП (0,4+0,1 мкс) и. следовательно, характеризует кинетику переноса энертии на кислород от триплет ных молекул порфирина (тгт - .,) Время затухания совпадает с временем жизни 'Ог (тл~ гл) в этаноле.

В воде максимум фосфоресценции 'Ог наблюдается через 2,6+0,1 мкс после лазерной вспышки Времена нарастания и <ai ухания. полученные и< регрессии кинегичсской кривой, равны 2,0 ± 0,1 мкс и 3,15 ± 0,2 мкс соответственно, что согласуется с прежними измерениями нашей лаборатории [Нгоров СЮ 1988, 19891 и данными других авторов [Shimizu О. 1997, Niedre М 2002] Так же, как в этаноле, время нарастания в пределах

I погрешности измерений cooiветствует времени жизни тринлешого состояния ТСФП в

насыщенном воздухом водном растворе, полученному методом импульсною фоюлиза по !а1>ханию тринлег-гриплетного поглощения ТСФП (2 мкс), и, следовательно.

характеризует кинетику переноса энергии на кислород от триплет ных молекул порфирина (W ri) Время ¡атухания совпадает с временем жизни 'О2 в воде (Zj ~ гл) Увеличение времени нарастания фосфоресценции и времени жизни триплетного состояния 'ГСФ11 в воде по сравнению с этанолом связано с большей в 6,7 раз концентрацией кислорода в этаноле по сравнению с концентрацией кислорода в воде

1,2 -,

1200 1240 1280 1320 Длина волны, нм

Эффективность образования сишлетного кислорода в водном растворе ГСФП не зависит от pi! (в диапазоне 5,8-9), плотности мощности возбуждающего излучения (в диапаюне 0,32—1,6 Вт/см2) и концентрации порфирина (в диапазоне 13—48 мкМ)

R Параграфе 3.1 описаны кинетические параметры Ч); в коллоидных водно-дет ергентных системах Для изучения кинетических параметров сишлетною кислорода в гетерогенных системах, использовались водные растворы ТСФГ1, содержащие де1ерген!ы тритон Х-100 (ГХ-100), додецилсульфат натрия (ДСН) и цетилтримстиламмоний бромид (Ц1ЛЬ) IX-100 - неионогенный де!ергент, те его молекулы не имеют электрического ¡аряда, а молекулы ДСН и ЦТ ДБ несут соответственно отрицательный и положительный заряды В воде использованные детертенты образуют мицеллы. Средние молекулярные массы мицелл составляют для ТХ-100 90 кД, что соответствует 140 молекулам дегертента, для ДСП - 23,2 кД (80 молекул детергента), и для Ц1АБ -61,7 кД (215 молекул детер|ента.). Молекулы ТСФП в водном растворе отрицательно ¡аряжены, поэтому в мицелдярном растворе ТХ-100 молекулы ТСФП локализованы как в мицеллах, так и в водной фазе. В отрицательно заряженные мицеллы ДСН молекулы порфирипа, вероято, не проникают, поэтому они локализованы в водной фазе вне мицелл. В растворе положительно «ряженного Щ АБ, по-видимому, все молекулы порфирина локализованы на поверхности мицелл.

Добавление 1 Х-100 в водный pací вор порфирина приводило к незначительному увеличению тпк и сметному увечичению tj (рис 4, табт 2) Добавление ДСН и ЦТ АБ в водный раствор 1СФП не приводило к изменению ггш,. тогда как шачение также существенно возрастало (табл 2) Одновременно при добавлении детергентов пропорционально возрастал квантовый выход фосфоресценции, рассчитанный путем интегрирования кинетических кривых фосфоресценции Сопоставление этих данных позволяет полагать, что в детергентных растворах так же, как в воде, фаза нарастания определяется кинетикой переноса энергии о г триилетною порфирина на кислород, а фаза затухания кинетикой дезактивации '02. Следовательно, т„к = т,, a zj= тл.

1.6 -

Vоо] -

Длина волны им

Время, мкс

Рис 4 Кинетические кривые (1-3) и спектр (4) фосфоресценции ! О} в насыщенном воздухом водном растворе ТСФП в отсутствии детергента (1) и в присутствии 1% (2) и 80% Тритона Х-100 (3,4) Концентрации ТСФП 15 мкМ, кривые получены в резучьтате накопления сигнала от 6106 лазерных импульсов

Табшиа 2 Кинетические параметры фотосенсибмштированной ТСФП фосфоресценции синс'иетного кис порода в водных растворах ТХ-100, ДСН и ЦТАБ

Дет ер ген I Концентрация детергента, М (%) 2/7 уеч мкс Га ~ ТА, мкс

Нет 0 2,0+0,2 3,15±0,2

Тритон Х-100 0,016(1%) 2,9+0,2 4,1 ±0.5

Гритон Х-100 0,16(10%) 2.7+0,2 4,4±0.5

Тритон Х-100 0,32 (20%) 2,7±0.3 4.7+0,5

ДСН 0.01 (0,3%) 2,0±0,10 3,2+0 7

ДСН 0,4(11,5%) 2,0+0,1 4,0+0,3

ДСП 1 (29%) 2,0±0,1 5,8±0,2

ЦГАБ 0,4(11,5%) 2,0+0,15 4,6+0,2

ЦТАБ 0.8 (23 %) 2,1 ±0,2 5,6±0,2

Наиболее вероятно, что увеличение тЛ в присутствии детергента - следствие того, что молекулы '02 проводят значительную часть времени в мицеллах, где время жизни '0-> (яачи гельио больше, чем и воде.

Ре ¡ультаты скриниша красителей различных типов представлены в Парат рафе 3.2. Показано, что в результате интегрирования кинетических кривых фосфоресценции можно оценить относительные квантовые выходы генерации синглетного кислорода, а из анализа кинетических кривых рассчитывать время жизни триплетного состояния красителя и время жизни синглешого кислорода Это позволило использовать разрешенный во времени метод регис!рации фосфоресценции сингле! нот о кислорода для тестирования

фошсснсибилизирующей активности широко! о круга красителей (порфиринов, хлоринов, роламинов, фталоцианинов, бактериохлоринов), пригодных для применения в прикладных облас!ях фотобиологии и фотомсдицины с целью выявления фотосенсибилизаторов наиболее эффективных в водных растворах

В Параграфе 3.3 представлены рсз> платы изучения тушения фосфоресценции сингле!ною молекулярного кислорода неор|аническими (азид натрия) и ор| аническими (трипюфан, альбумин, плазма крови) соединениями. Добавление амда натрия (до 2 мМ) в спирювые растворы ГСФП приводило к уменьшению времени за1ухания т^ и интегральной интенсивности фосфоресценции, рассчитанной как площадь под кинетической кривой, но не влияло на величину гП1Г Во всем интервале концентраций гушигеля Тл»г, Тушение подчинялось уравнению Ш герна-Фольмера.

(Гл)оАл = /„// = !+ (2)

ще /о и (х-)г, интенсивность и время жизни фосфоресценции '<Ь в отсутствии азида натрия, кд - конс[анта скорости дезактивации синглетного кислорода азидом натрия, [(Л -концентрация азида натрия. Константы скорости тушения в этаноле, рассчитанные из значений тд и интегральной интенсивности фосфоресценции, оказались одинаковыми в пределах точности и шерений и равными (2.0±0,3)х108 М"'с"'

В насыщенных вомухом водных растворах ГСФП азил натрия (в концентрации до 3 мМ) также вызывал уменьшение интегральной интенсивности и времени затухания фосфоресценции. Падение интенсивности подчинялось уравнению 11!герна-Фольмера с констнтой скоросш (4+0,6)-108 М 'с'1 Однако при анализе кинетики фосфоресценции 'СЬ в волном растворе с атидом натрия мы наблюдали, что изменение концентрации азида натрия в интервале 3-12 мМ не приводило к изменению времени затухания, которое всегда составляло 1.9±0,2 мке Эта величина совпадает с временем жизни тринлешшо состояния ТСФП. При этом время нарастания уменьшалось до нескольких со!ен наносекунд и соответствовало тушению по шкону Штерна-Фольмера (габл 3). Отсюда можно заключи 1ь, что азил нагрия не тушит триплетное состояние ГСФП, но тушт синглетпый кислород Рсисое уменьшение хл в его присутствии приводит к инвертированию кинетики фосфоресценции 'Ог. Нарастание кинетической кривой после лазерного имп>льса оиредетяется деактивацией 'Ог (тпя, ~ Гд), а даухание определяется скоростью взаимодействия триплешых молекул ТСФП с кислородом (г^ - г,)

Таблииа 3 Время нарастания и затухания фосфоресценции 'Ог поме шзерного импульса в водном растворе 7СФИ (15 мкМ) при розничных концентрациях азида натрия

Концентрация азида натрия, мМ z¡¡, мкс Trise, мкс

0 3,15±0,2 1,9+0,2

3 6 1,9±0,2 1,3+0,4

1,9±0,2 0,8±0,3

9 1,8±0,2 0,6±0,2

12 1,9+0,2 <0,4

Для анализа тушения 'СЬ азидом натрия в гетерогенных системах были исполыованы растворы, содержащие около 10% детергента, что примерно соответствует средней концентрации липидов в клетках Тушение фосфоресценции, рассчитанное по уменьшению интегральной интенсивности фосфоресценции, соответствовало уравнению Штерна-Фольмера (рис. 4).

Концентрация, мМ

Рис 4 Тушение фосфоресценции 'Оз азидои натрия Зависимость Штерна-Фочьмера дчя

интегральной интенсивности фосфоресценции 'О2 от концентрации азида натрия в насыщенных воздухом водных растворах ТСФП ñei детергента - 2 ив присутствии ТХ-100 (10%) -1, ДСН (10%) - 3 или ЦТАВ (5%) ■ 4 /» I? интеграчьния

интенсивность фосфоресценции ' О? в отсутствии и присутствии азида натрия соответственно

Увеличение концентрации азида натрия в гетерогенных системах сопровождалось режим уменьшением времени нарастания фосфоресценции сишлешою кислорода, которое примерно соогветствовало тушению интегральной интенсивности фосфоресценции Время мгухания уменьшалось в сущеовенно меньшей степени, причем минимальное шаченис г</ несколько превышало ¡начение в растворе, не содержащем детер) еш Оабл 4)

Таблица 4 Впияние азида натрия на времена нарастания и затухания фосфоресценции сингчетного кислорода в насыщенных воздухом водных растворах ТХ-100, ДСН, ЦТАБ, содержащих тушитечь - азид натрия

I ри т он Х-100 (концентрация в растворе 10%) ДСН (11,5%) ЦТ АН (5%)

Концентрация, азидг мМ ,мкс то (+10%) мкс Концентрация, азида, мМ тгьс(х20%), мкс та (±10%), мкс Концен трация, азида, мМ т„«(±20%) мкс и (±10%), мкс

0 2,6 4,4 0 1,8 4,0 0 2 4,6

1 2 1,7 3,9 0,25 1,8 3,4 0,25 - -

1 3,8 0,5 1,4 3,1 0,5 - -

3 3,5 0,75 1,1 2,9 1 0,5 1,9

Сравнение этих данных позволяет заключить, чго тушение фосфоресценции 'Ог азидом натрия в детергентных растворах приводит к такому же инвертированию кинетики, как и в водных растворах без детергента. При высоких концентрациях детергента фаза нарастания определяется кинетикой дезактивации 'Ог, фаза затухания - кинетикой переноса энергии от триплетных молекул порфирина на кислород Представляет интерес также анализ значений констант тушения 'Ог в детергентных растворах Из рис. 4 видно, что в воде без детергента и в присутствии 10% ТХ-100 тангенс угла наклона прямых одинаков В растворах, содержащих около 10% ДСН и ЦТАБ, тангенс угла наклона заметно больше, чем в воде. Однако время жизни 'Ог в не содержащих детергенты растворах больше, чем в воде, поэтому расчет констант скорости тушения '02 показывает, что наименьшая константа характерна для раствора ТХ-100, которая в 1,5 раза меньше, чем в воде. Константа скорости тушения в растворе ДСН совпадает с константой в воде Константа с растворе ЦТАБ вдвое больше, чем в воле (табл 5)

Таблица 5 Константы скорости тушения синглетного кислор(н)а азидом натрия в водных растворах, содержащих детергенты

Детергент и е1 о кф М"1 (тд)О. мкс ^•10'*, М"'с"'

концентрация (±10%) (±5%) (±15%)

Нет 1300 3,15 4,1

ТХ-100 (10%) 1100 4,4 2,3

ДСН (10%) 2000 4,0 5,1

ЦТАБ (5%) 5100 4,5 11,5

ку— константа Штерна-Фо ¡ьмера, соответствующая тангенсу уг ш нак.юна прямых указанных на рис 4, (т^ц время жизни '(>2 в отсутствии азида, кч - константа скорости тушения 10? азидом

Различие констант скорости тушения определяется характером взаимодействия азида с милеллами детер)ентов Можно предположить, что азид проникает в неионогенные мицеллы ТХ-100 и гушит 'СЬ как внутри мицелл, так и водной фазе. В мицеллы ДСП, молекулы которого «ряжены отрицательно, отрицательно заряженные молекулы 1СФП и ионы азида, вероятно, не проникают, поэтому тушение *02 осуществляется только вне мицелл в водной фазе. В растворах ЦТАБ, молекулы которого несут положительный заряд, молекулы ГСФП и азида, вероятно, адсорбированы на поверхности мицелл, поэтому локальная концентрация тушителя в месте генерации 'О2 значительно больше средней

Таким образом, в условиях сильного тушения 'Ог азидом натрия, который не |ушит триплетные молекулы порфирина, но существенно уменьшает время жизни 'О2 до значений, характерных для живых клеток, наблюдается инвертирование кинетических фаз -нарастание соответствует дезактивации 'Ог (т„и = хл), а затухание - скорости переноса энергии от триплетного порфирина на кислород (т<* = т,). Отсюда можно предположить, что в живых клетках '02 локализован в значительной мере в липофильных структурах, а время ею жизни следует измерять но кинетике нарастания фосфоресценции после лазерной вспышки

Ьелки считаются основными мишенями фотодинамического действия. Известно, что и( всех аминокислот наиболее эффективным тушителем синтлетного кислорода является трип гофан. Ранее тушение 'О2 триптофаном исследовали в оксиде дейтерия, т е в условиях, далеких от естественных. В работе исследовалось тушение 'Ог триптофаном в Н2О при рН 6 Для поддержания постоянной концентрации кислорода, растворенного в исследуемом растворе, через раствор дополнительно пропускали газообразный кислород Константа тушения триптофаном, полученная с помощью уравнения Штерна-Фольмера из измерений времени затухания фосфоресценции 'Ог, составила (4,6±0,6) К)7 1/М с Константа тушения триптофаном, оцененная из падения интенсивности фосфоресценции '02. была примерно в 2 раза выше, причем тушение фосфоресценции 'Ог было сильнее, чем тушение флуоресценции IМПП Таким образом, можно заключить, что триптофан с одной стороны, дезактивирует сингтетныи кислород, а с друюй, снижает эффективность образования 'О; порфиринем за счет снижения выхода триплетного состояния красителя Это показывает, что взаимодействие молекул порфиринов с молекулами триптофана приводит к снижению эффективности образования синглстного молекулярного кислорода, возможно за счет комплексообразования.

В растворах бычьего сывороточного альбумина или плазмы крови также наблюдалось значительное уменьшение эффективности образования '02 При регистрации фосфоресценции на 1270 нм без прокачки исследуемою раствора кислородом добавление

1% (обьемного) бычьей плазмы крови в буферный раствор рН 7,4, содержащий 5-15 мкМ красителя порфиринового типа, приводило к десятикратному падению интенсивности фосфоресценции '()2 и увеличению времени затухания кинетической кривой до 10 мкс. Время нарастания кинетической кривой сокращалось Показано, что что обусловлено расходованием кислорода, растворенного в исследуемом растворе на окислительные процессы Для сведения к минимуму уровня окислительных процессов во время лазерного обтучения мы применили проточную систему, с помощью которой исследуемый раствор про i екал через 5 мм кювету со скоростью 2-1,5 мл/с Через кювету дополнительно барботировали чистый кислорот Измерение флуоресценции триптофана на 355 нм показало, что в результате облучения разрушалось около 10% триптофана, чю юворит о юм, что во время регистрации фосфоресценции '02 не происходило значительной химической деструкции белков и насыщение рас тора кислородом не уменьшалось

В водном растворе, содержащем 9 и 22% плазмы крови при дополнительной продувке кислородом и проюке исследуемого раствора, был зарегистрирован ситат фосфоресценции 'о Концентрация ТСФП в этих растворах была равна около 5 мкМ Характерные времена затухания кинетической кривой на 1270 нм составляли 7,1 + 0,5 мкс и 8,3 ± 0,5 мкс при концентрации плазмы 9% и 22% соответственно Сигнал фосфоресценции '02 в буферном растворе ТСФП, не содержащем плазму, был интенсивнее в 4 раза, чем в растворе, содержащем 22% плазмы крови, и время нарастания кинетической кривой в растворе с плазмой составляло 1,5 ± 0,2 мкс (рис. 5) Контроль флуоресценции красителя и триптофана до и после измерений показал, что интенсивность флуоресценции красигеля и тришофана не изменилась, т.е. значительного окисления не происходило.

Учитывая, что но теоретическим оценкам время жизни синглет ного кислорода в плазме крови составляет около 1 мкс [Kanofsky J.R. 1990, Красновский А.Л. 1990], а в 20% растворе плазмы крови - порядка 2 мкс, время нарастания кинетической кривой в pací воре, содержащем 9-22% плазмы крови, соответствовало времени жизни синглстного кислорода, а время затухания - времени жизни триплежою сосюяния порфирина. Наиболее вероятно, что в присутствии плазмы наблюдалось инвертирование кинетических кривых фосфоресценции, подобное тому, которое наблюдается в присутствии значительной концентрации азида натрия

Рис 5 Кинетические кривые фосфоресценции 'О2 в вобноч растворе ТСФП (рН 7 4) без плазмы (1) и с 22% плазмы крови быка (2) при отсутствии окиспения

10 15 20

Время, мкс

Ре'.кое паление интенсивности фосфоресценции ' О) в присутствии альбумина или плазмы можез бьпь вызвано локализацией красителя в локусах белков, труднодоступных для кислорода, а также образованием комплексов красителя и молекул белкой или аминокислот Таким образом, белки плазмы за счет образования комплекса с красителем обладают способное!ыо защищать компонент крови от фоюсенеибилитировашюго окисления норфиринами.

В ЗАКЛЮЧЕНИИ и ВЫВОДАХ представлены основные решлыаш диссертационной рабо1ы.

1 Пу!ем регистрации ИК фосфоресценции сишлетною молекулярной) кислорода систематически исследована кинетика образования и дезактивации синглетного кислорода при импульсном лазерном вотбуждении широкою кру!а биологически важных пжмешов и красителей в насыщенных воздухом водных растворах. Кинетическая кривая состоит из двух фаз - нарас!ания и затухания Фаза нарастания в основном определяется скоростью переноса энергии от триплетных молекул красителей-фоюсенсибилизаюров на кислород а фаза затухания - скоростью де«активации сишлетною кислорода

2 На основе кинетических и¡мерений фосфоресценции '(Ъ проведено 1ес!ирование оффек!ивности (енерации синыешою кислорода в водных системах широким круюм красителей, в связи с перспективной их применения в прикладных областях фотобиологии и фоюмедицины.

3 В юмоюнных и гетерогенных системах дечалыю исследовано 1ушение синглстного кислорода азидом натрия Установлено, что константа скорости тушения синпетнот кислорода этим соединением сильно зависит от растворителя и заряда мицетл детергента

4 В водных растворах, содержащих азид натрия, который снижает время жизни синглетного кислорода до значений, характерных для биологических систем (несколько сотен наносекунд), кинетическая кривая инвертируется- время нарастания определяется скоростью дезактивации 'О?, а время затухания - скоростью переноса энергии на кислород о! молекул красителя в триплетном состоянии Это показывает, что в таких системах время нарас!ания кинетических кривых соответствует времени жизни '02

5 Показано, что в гетерогенных водно-мицеллярных системах при концентрации детергента выше конценгрании мицеллообразования, моделирующих гетерогенную систему клеюк. 'Ог имеет большее сродство гидрофобной фазе мицелл, а его кинетическое поведение определяется относительным распределением между мицеллами и водой и структурой водной фазы.

6 Исследовано взаимодействие синглетною кислорода с аминокислотами, белками и плазмой крови в водных системах Определена константа скорости тушения сиж летного кислорода триптофаном в водных растворах Установлено, что наряду с тушением 4)j аминокислоты, белки и плазма крови блокируют фотосенсибилизированное порфирипами образование 10;> Таким образом, они могут рассматривания как эффективные протекторы клеток и ткани от фоторазрушений.

Таким образом, экспериментально с помощью разрешенного во времени метода риистрации фосфоресценции сиш летного молекулярного кислорода получены кинетические параметры хараюерные для синглетною кислорода и фотосенсибилизатора в системе, моделирующей реальную клетку Кроме того, в работе показано, что с помощью данных, получаемых в результате кинетической регистрации фосфоресценции синглетною кислорода, можно оценить фотодинамическую активность различных красителей, потенциально пригодных для практического применения

3. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 ) Butorina I) N , Bashtanov M Г . Krasnovsky А А , Priezzhev А V "Effect of blood plasma on laser-excited singlet ox>gen phosphorescence in aqueous bufïer solutions of water-soluble porphy.ins." Proceedmgs ofSP/E, vol. 4001, pp. 385-389, 1999

2) Butorina D N, Bashtanov M.E., Egorov S Yu , Krasnovsky A.A., Priezzhev A V. "Kinetics of singlet oxygen phosphorescence in aqueous solutions of porphyrin " Proccedmgs of SPIE, vol 4241, pp. 317-323,2000

3) Буторина ДН, Красновский A A, Ьашганов М.П., Егоров СЮ, Приезжсв А В «Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем » Сборник трудов Международного симпозиума «Проблемы

биохимии, радиационной и космической биологии», I том, стр 99-110, 2001

4) Butorina D N , Krasnovsky А.А, Bashtanov М.Е, Egorov S. Yu, Priezzhev A V. "Kinetic investigation of singlet molecular oxygen phosphorescence in solutions of photosensitizer". X International "Laser physics" Workshop, Moscow, 3-7 july, 2001.

5) Буторина Д.Н., Красновский A A, Баштанов M.E., Егоров С.Ю, Приезжее А В. «Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем.» 2 Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Дубна, 29 мая - 1 июня, стр 65-66,2001.

6) Буторина Д.Н., Красновский А А , Приезжее А.В. «Кинетика образования и дезактивации синглетного молекулярного кислорода в водных растворах порфиринов при импульсном лазерном возбуждении.» 5-ая школа-конференция молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений, Звенигород, 16-22 сентября, стр 36-37, 2002

7) Буторина Д.Н., Красновский мл. А А , Приезжев А.В. «Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в водных растворах порфиринов Влияние детергентов и тушителя - азида натрия.» Биофизика, т. 48, N 2, стр. 201-209,2003.

8) Slivka L., Krasnovsky A., Butorina D., Alekseeva V , Kuznetsova N., Marinina L., Sawina L., Kaliya O., Lukyanets E., Vorozhtsov G. "Bromrhodamines - new singlet oxygen photosensiti/ers for oxidative water and wastewater treatment." CUTEC - Serial Publication. Vogelpohl Alfons ed.. N 57, pp. 594-599, 2003.

9) Krasnovsky A.A., Butorina D.N. "Kinetic behavior of singlet oxygen in simple models of biochemical systems. Laser-induced oxygen phosphorecence in water; dependence on detergents and sodium azide." Programme and Book of Abstracts, 10th Congress of the European Society for Photobiology, Vicn, September 6-11, p. 74,2003.

10) Буторина Д. H., Красновский А. А., Саввина JI. П., Кузнецова Н. А «Бромированные родамины - эффективные фотосенсибилизаторы образования синглетного молекулярного кислорода в водных и спиртовых растворах.» Журнал физической химии. N 5, стр.915-919, 2005.

11) Пархоц М.В , Лапина В.А, Буторина Д.Н., Собчук А.Н., Лепешкевич С В . Петров П.1 , Красновский А.А, Джагаров Б.М. «Спектральные и фотохимические характеристики сенсибилизаторов хлорина еб и фотолона в присутствии меланина.» Оптика и спектроскопия, т. 98, № 3, стр. 417-425, 2005

€10217

РНБ Русский фонд

2006^4 6162

ООП МГУ Заказ 80- 80-05 ,

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Буторина, Дарья Николаевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общие представления об электронной структуре кислородных молекул и механизмах их активации

1.2 Механизмы, кинетика образования и дезактивации 'Ог

1.3 Методы регистрации и исследования синглетного кислорода

1.4 Синглетный кислород в модельных и биологических системах

1.5 Связывание красителей с белками и аминокислотам

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем"

Исследование образования, дезактивации, реакционной способности и биологической роли активных форм кислорода (АФК) - одна из фундаментальных проблем биофизики и биохимии. Основное состояние молекулы кислорода -триплетное. Это предопределяет относительную химическую инертность кислородных молекул, взаимодействие которых с органическими молекулами, обычно являющимися синглетными в основном состоянии, запрещено по спину. Высокая химическая и биологическая активность кислорода - следствие его способности генерировать промежуточные активные формы, среди которых первичными являются супероксид-анион-радикалы, возникающие в результате присоединения одного электрона наружной незаполненной оболочкой кислородных молекул, и синглетный кислород, возникающий в результате электронного перехода молекулы кислорода из основного состояния в низколежащее синглетное 'дё - состояние. Первый тип АФК - результат химической, а второй - физической активации кислородных молекул.

Биологическая роль АФК исключительно высока. Например, они определяют серию сигнальных реакций в клетках в ответ на стрессовые воздействия [1], стимулируют каскад биохимических реакций, приводящих к запрограммированной смерти клеток — апоптозу [2], вызывают деструктивные процессы в сетчатке глаза [3], в поверхностных тканях животных и растений под действием света, подавляют фотосинтез [4], определяют реакции иммунитета и развитие многих болезней животных и человека [5, 6]. С другой стороны, стимуляция образования АФК приводит к гибели раковых клеток, это активно используется при лечении раковых заболеваний методом фотодинамической терапии (ФДТ) [7-12, 13-16]. АФК вызывают инактивацию вирусов и бактерий, что используется для лечения очагов гнойного воспаления и инфекционных заболеваний [17,18].

Настоящая работа посвящена исследованию образования и дезактивации синглетного кислорода ('Ог, 'Аё), который по свойствам существенно отличается от других АФК и в наибольшей степени допускает исследование биофизическими методами анализа. Синглетный кислород может возникать в темновых ферментативных и неферментативных процессах, но основной путь его образования - перенос энергии на молекулярный кислород от возбужденных молекул пигментов - фотосенсибилизаторов. Именно этот процесс лежит в основе широко распространенного класса фотодинамических реакций второго типа, имеющих важное прикладное значение [1922].

При взаимодействии с ненасыщенными органическими молекулами (химическими ловушками) синглетный кислород образует характерные циклические пероксиды, а при спонтанной дезактивации излучает инфракрасную фосфоресценцию в области 1270 нм. Именно на этих свойствах основаны современные методы обнаружения и исследования 'Ог - химические и оптические методы [23-25]. Химические методы относительно просты. Однако информация, получаемая этими методами, не всегда убедительна, так как ловушки вносят возмущение в изучаемые системы, вступая в реакции как с 'СЬ, так и с другими АФК и активными интермедиатами некислородной природы. Существенно надежнее - оптический фосфоресцентный метод, так как он не вносит искажений в изучаемые системы. Однако интенсивность фосфоресценции синглетного кислорода очень мала, и ее регистрация связана с использованием относительно сложных высоко чувствительных фотометрических приборов [25-28]. В настоящее время с помощью указанных методов накоплен обширный экспериментальный материал о свойствах синглетного кислорода в химических системах, главным образом, в органических растворителях и оксиде дейтерия. Однако параметры синглетного кислорода в естественных условиях - в водных растворах биологически важных соединений и биологических системах - мало исследованы, так как время жизни, стационарная концентрация синглетного кислорода, а также квантовый выход его фосфоресценции в этих системах существенно меньше, чем в органических растворителях и оксиде дейтерия.

Цель работы состояла в исследовании кинетики генерации и дезактивации синглетного кислорода при импульсном лазерном возбуждении фотосенсибилизаторов в водных растворах биологически важных соединений и моделях биологических систем, с тем, чтобы экспериментально показать, какие кинетические параметры характерны для синглетного кислорода в системе, моделирующей реальную клетку. Для измерений предполагалось использовать метод наносекундных измерений собственной ИК фосфоресценции синглетного кислорода на уникальном лазерном фосфоресцентном спектрометре, разработанном в группе биохимии синглетного кислорода Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Кроме того, в работе предполагалось показать, что с помощью данных, получаемых в результате кинетической регистрации фосфоресценции синглетного кислорода, можно оценить фотодинамическую активность различных красителей, потенциально пригодных для практического применения.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1) Провести сравнительное исследование кинетики фосфоресценции 'Ог в насыщенных воздухом и кислородом растворах биологически важных фотосенсибилизаторов в органических растворителях и воде при импульсном лазерном возбуждении с наносекундным временным разрешением.

2) Исследовать кинетические параметры 'Ог в гетерогенных водных системах, используя для этой цели смеси этанола и воды и водно-мицеллярные растворы, приготовленные с использованием детергентов разной природы.

3) Исследовать влияние тушителей синглетного кислорода - азида натрия, аминокислот и белков - на кинетические параметры 'Ог в гомогенных и гетерогенных водных системах при концентрациях тушителей, соответствующих эффективности тушения *Ог компонентами живых клеток в биологических системах.

4) Фосфоресцентным методом исследовать фотодинамическую активность водорастворимых красителей разных классов (порфиринов, хлоринов, фталоцианинов, родаминов, бактериохлоринов), представляющих интерес в связи с теоретическими и прикладными проблемами фотобиологии и фотомедицины.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Буторина, Дарья Николаевна

Выводы

1. Путем регистрации ИК фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода систематически исследована кинетика образования и дезактивации синглетного кислорода при импульсном лазерном возбуждении широкого круга биологически важных пигментов и красителей в насыщенных воздухом водных растворах. Кинетическая кривая состоит из двух фаз - нарастания и затухания. Фаза нарастания в основном определяется скоростью переноса энергии от триплетных молекул красителей-фотосенсибилизаторов на кислород, а фаза затухания — скоростью дезактивации синглетного кислорода.

2. На основе кинетических измерений фосфоресценции 'Ог проведено тестирование эффективности генерации синглетного кислорода в водных системах широким кругом красителей, в связи с перспективной их применения в прикладных областях фотобиологии и фотомедицины.

3. В гомогенных и гетерогенных системах детально исследовано тушение синглетного кислорода азидом натрия. Установлено, что константа скорости тушения синглетного кислорода этим соединением сильно зависит от растворителя и заряда мицелл детергента.

4. В водных растворах, содержащих азид натрия, который снижает время жизни синглетного кислорода до значений, характерных для биологических систем (несколько сотен наносекунд), кинетическая кривая инвертируется: время нарастания определяется скоростью дезактивации 'СЬ, а время затухания - скоростью переноса энергии на кислород от молекул красителя в триплетном состоянии. Это показывает, что в таких системах время нарастания кинетических кривых соответствует времени жизни 'Ог.

5. Показано, что в гетерогенных водно-мицеллярных системах при концентрации детергента выше концентрации мицеллообразования, моделирующих гетерогенную систему клеток, 'Ог имеет большее сродство гидрофобной фазе мицелл, а его кинетическое поведение определяется относительным распределением между мицеллами и водой и структурой водной фазы.

6. Исследовано взаимодействие синглетного кислорода с аминокислотами, белками и плазмой крови в водных системах. Определена константа скорости тушения синглетного кислорода триптофаном в водных растворах. Установлено, что наряду с тушением 'Ог аминокислоты, белки и плазма крови блокируют фотосенсибилизированное порфиринами образование 'Ог. Таким образом, они могут рассматриваться как эффективные протекторы клеток и ткани от фоторазрушений.

Таким образом, экспериментально с помощью разрешенного во времени метода регистрации фосфоресценции синглетного молекулярного кислорода получены кинетические параметры, характерные для синглетного кислорода и фотосенсибилизатора в системе, моделирующей реальную клетку. Кроме того, в работе показано, что с помощью данных, получаемых в результате кинетической регистрации фосфоресценции синглетного кислорода, можно оценить фотодинамическую активность различных красителей, потенциально пригодных для практического применения.

Проведенные в данной работе измерения имеют важное значение для интерпретации результатов, получаемых в биологических системах, а также в связи с техническими перспективами использования синглетного кислорода в качестве естественного зонда, характеризующего уровень фотоокислительных процессов в биологических системах, в которых он является основным окислителем.

Благодарность

В заключение я хотела бы выразить искреннюю благодарность и глубокую признательность моим научным руководителям - профессору Александру Александровичу Красновскому и доценту Александру Васильевичу Приезжеву за руководство, внимание, обсуждения и помощь, оказанные мне при выполнении работы и подготовке рукописи. Я благодарю сотрудников группы биохимии синглетного кислорода Института биохимии им. А.Н. Баха за полезные советы, помощь и поддержку, а также сотрудников других организаций за помощь и сотрудничество в работе.

Заключение

В работе исследованы кинетические параметры процессов фотосенсибилизированного образования и дезактивации синглетного кислорода в органических средах, водных растворах и моделях биологических систем. Исследования основаны на применении метода разрешенной во времени регистрации инфракрасной фосфоресценции 'Ог при импульсном лазерном возбуждении и выполнены с помощью наносекундного спектрометра, работа которого основана на методе коррелированного по времени счета одиночных фотонов.

Получены и проанализированы кинетические параметры образования и дезактивации 'Ог после лазерного импульса в насыщенных воздухом или кислородом водных растворах ТСФП. Показано, что нарастание кинетической кривой фосфоресценции синглетного кислорода определяется скоростью переноса энергии от триплетных молекул фотосенсибилизатора к молекуле кислорода, а затухание - скоростью дезактивации синглетного кислорода молекулами среды. При большей концентрации кислорода в водном растворе происходит сокращение времени нарастания кинетической кривой. На кинетические характеристики 'Ог в водном растворе не оказывают влияние концентрация красителя, рН раствора (если при этом не изменяется способность молекул красителя к агрегации) и плотность мощности возбуждающего излучения в пределах 0,32-1,6 Вт/см2.

Показана возможность применения метода коррелированного счета фотонов для регистрации синглетного кислорода по его фосфоресценции на 1270 нм для тестирования фотосенсибилизирующей активности порфиринов, родаминов, бактериохлоринов, хлоринов и фталоцианинов в связи с их использованием для фотодинамической терапии рака и фотобактерицидным действием.

Проведен анализ кинетических параметров синглетного кислорода в водных гетерогенных растворах, образованных различными типами детергентов. В присутствии детергентов наблюдается существенное увеличение времени жизни 'Ог, что происходит из-за локализации 'Ог не только в водной фазе, но и липофильных мицеллах, что подтвердил проведенный расчет для гетерогенной системы при различном объемном содержании компонент. Он показал, что концентрация молекул !Ог в Тритоне Х-100 в 2,6±0,6 раз больше, чем в воде.

В условиях сильного тушения '02 азидом натрия, который не тушит молекулы порфирина в триплетном состоянии, но тушит '02 и существенно уменьшает время его жизни до значений, характерных для живых клеток, наблюдается инвертирование фаз кинетической кривой фосфоресценции 'Ог — фаза нарастания соответствует дезактивации '02, а фаза затухания - переносу энергии от порфирина в триплетном состоянии на кислород. Исходя из этого, можно полагать, что в живых клетках время жизни '02 также следует определять по кинетике нарастания фосфоресценции после лазерного импульса.

Исследовано влияние на фосфоресценцию '02 и ее кинетические параметры присутствия аминокислот и белков. Получена константа тушения '02 триптофаном в воде и оксиде дейтерия. Подобраны экспериментальные условия, при которых не происходит значительного окисления биомолекул, содержащихся в исследуемых растворах. Показано, что связывание молекул красителя и триптофана приводит к снижению эффективности образования синглетного кислорода. При протоке исследуемого раствора и дополнительном поступлении кислорода была зарегистрирована кинетическая кривая фосфоресценции синглетного кислорода в буферном растворе ТСФП (рН=7.4), содержащем 22% плазмы крови быка. Максимум интенсивности этой кинетической кривой почти 4 раз слабее, чем в окрашенном буферном растворе, не содержащем плазмы крови, что может быть вызвано локализацией красителя в локусах белков, труднодоступных для кислорода, а также образованием комплексов красителя и молекул белков или аминокислот. Возможно, что белки плазмы за счет образования комплекса с красителем обладают способностью защищать компоненты крови от фотосенсибилизированного окисления порфиринами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Буторина, Дарья Николаевна, Москва

1. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002.

2. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: Добро и зло.// Соросовский Образовательный Журнал, N 3, с. 4-10, 1996.

3. Островский М.А., Федорович И.Б. Фотосенсибилизированное окисление как механизм повреждающего действия света на сетчатку глаза.// Химическая физика, т. 15, стр. 73-80,1996.

4. Егоров С.Ю., Красновский А.А., Кулаковская Л.И. Исследование механизмафотодеструкции хлоропластов: участие- триплетного состояния хлорофилла.// Физиология растений, т.32, вып. 4, стр. 668-673, 1985.

5. Davies M.J., Truscott R.J.W. Photo-oxidation and its role in cataractogenesis.// Journal of Photochemistry andPhotobiology B: biology, vol. 63, pp. 114-125, 2001.

6. Hulten L.M., Holmsroem M., Soussi B. Harmful singlet oxygen can be helpful.// Free Radical Biology & Medicine, vol. 27, N 11/12, pp. 1203-1207, 1999.

7. Черницкий E.A., Воробей A.B. Сенсибилизируемые фотоповреждения клеток.// Успехи современной биологии, т. 101, N 1, стр. 100-112,1986.

8. Bensasson R.V., Jori G., Land E.G., Truscott E.G. (eds). Primary Photoprocesses in Biology and Medicine.-Plenum Press, New York, 1985.

9. Приезжев A.B., Тучин. В.Б., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989.

10. Ю.Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Издательство Саратовского университета, 1998.

11. Briviba К., Klotz L.-O., Sies Н. Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems.// Biological Chemistry, vol. 378, pp. 1259-1265, 1997.

12. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 39, pp. 1-18, 1997.

13. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и клинического применения в России.// Российский химический журнал, том 42, №5, стр. 5-9, 1998.

14. Кузнецова Н.А., Калия О.Л. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии.// Российский химический журнал, том 42, №5, стр. 36-50, 1998.

15. Якубовская Р.И. Современные представления о молекулярных механизмах канцерогенеза и опухолевой прогрессии как основа для разработки новых методов терапии злокачественных новообразований.// Российский онкологический журнал, № 6, стр. 42, 2000.

16. Mueller-Breitkreutz К., Mohl Н., Briviba К., Sies Н. Inactivation of viruses by chemically and photochemically generated singlet molecular oxygen.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 30, pp. 63-70,1995.

17. Странадко Е.Ф., Иванов A.B. Современное состояние проблемы фотодинамической терапии рака и неопухолевых заболеваний.// Биофизика, т.49, вып.2, стр. 380-383, 2004.

18. Foote C.S. Mechanism of photosensitised oxidation.// Science, vol. 162, 3867, pp. 963970,1968.

19. Foote C.S. Definition of type I and type II photosensitized oxidation.// Photochemistry and Photobiology, vol. 54, N 5, p. 659, 1991.

20. Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible to near-IR radiation on cells.// Journal of Photochemistry and Photobiology, vol. 49, pp. 1-17, 1999.

21. Владимиров Ю.А., Клебанов Г.И., Борисенко Г.Г., Осипов А.Н. Молекулярно-клеточные механизмы низкоинтенсивного лазерного излучения.// Биофизика, т. 49, вып. 2, стр. 339-350,2004.

22. Hideg Е., Ogawa К., Kalai Т., Hideg К. Singlet oxygen imaging in Arabidopsis thaliana leaves under photoinhibition by excess photosynthetically active radiation.// Physiologia Plantarum, vol. 112, pp. 10-14, 2001.

23. Krasnovsky А.А. Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies.// Membrane cell biology, vol. 12(5), pp. 665-690, 1998.

24. Красновский А.А Фотодинамическое действие и синглетный кислород.// Биофизика, т. 49, вып. 2, стр. 305-321, 2004.

25. Schweitzer С., Schmidt R. Physical mechanisms of generation and deactivation of singlet oxygen.// Chemical Review, vol. 103, pp. 1685-1757,2003.

26. Kasha M., Brabham D.E. Singlet oxygen electronic structure and photosensitization.// Singlet oxygen. Ed. By H.H. Wasserman, R.W. Murray. Academic Press, New York, pp. 1-38, 1979.

27. Mulliken R.S. Interpretation of the atmospheric oxygen bands. Electronic levels of the oxygen molecule.// Nature, vol. 122, № 3075, pp. 505, 1928.

28. Герцберг Г. Спектры двухатомных молекул. М.:Наука, 1963.

29. Gilmore F.R. Potential energy curves for N2, NO, O2 and corresponding ions. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer, vol. 5, pp. 369-389, 1965.

30. Мак-Глин С., Адзуми Г. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М.: Мир, 1972.

31. Минаев Б.Ф. Квантово-химическое исследование механизмов фотосенсибилизации, люминесценци и тушения синглетного 'Ag кислорода в растворах.// Журнал прикладной спектроскопии, т. 42?3, N 5, стр. 766-772, 1985.

32. Clennan E.L. Synthetic and mechanistic aspects of 1,3-diene photooxidation. // Tetrahedron, vol 47, p. 1343, 1991.

33. Foote C.S., Clennan E.L. Active oxygen in chemistry. // Ed. C.S. Foote, J.S. Valentine, A. Greenberg, J.L. Lieberman. Glasgow, Blackie Academic and Professionals, pp. 105-140, 1995.

34. Singlet Oxygen, ed. A. A. Frimer.- New York, 1985.

35. Chou P-T., Khan A.U. Emission spectral peaks of singlet molecular oxygen.// Chemical Physics Letters, vol. 103, N 4, pp. 281-284, 1984.

36. Красновский А.А. (мл). Сииглетный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения.// Итоги науки и техники (современные проблемы лазерной физики), том 3, стр. 63-135,1990.

37. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты.// Вестник РАМН, том 7, стр. 43-51, 1998.

38. Капелько В.И. Активные формы кислорода, антиоксиданты и профилактика заболеваний сердца.// Русский медицинский журнал, том. 11, № 21, стр. 1185-1188, 2003.

39. El-Missiry М.А., Abo-Steif М. Photosensitization induces reactive oxygen species and oxidative damage in human erythrocytes.// Cancer Letters, vol. 158, pp. 155-163,2000.

40. Klotz L.-O., Kroencke K.-D., Sies H. Singlet -oxygen-induced signaling effects in mammalian cells Л Photochem. Photobiol. Sci., vol.2, pp. 88-94,2003.

41. Захаров С.Д., Иванов A.B. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей.// Квантовая электроника, т. 29, N 3, стр. 192-214, 1999.

42. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита.// Соросовский образовательный журнал. Биология. № 1,стр. 1-7, 1999.

43. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Изд. МГУ, 1998.

44. Saito I., Matsuura Т., Inoue К. Formation of superoxide ion via one-electron transfer from electron donors to singlet oxygen Л Journal of American Chemical Society, vol. 105, pp. 3200-3206,1983.

45. Kanofsky J.R. Near infrared emission in the katalase hydrogen peroxide system: a reevalution.// Journal of American Chemical Society, vol. 106, N 15, pp. 4277-4278, 1984.

46. Grossweiner L.l. Singlet Oxygen: Generation and Properties (статья на сайте http://www.photobiology.com/educational/len2/singox.html).

47. Ермолаев B.JL, Бодунов Е.Н, Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. JI.: Наука, 1977.

48. Мулдахметов З.М., Минаев Б.Ф., Кецле Г.А. Оптические и магнитные свойства триплетного состояния. Алма-Ата: Наука, 1983.

49. Schmidt R., Bodesheim М. Efficiencies of Ог and O2 'Ag formation in the primarysteps of triplet state photosensitization in solution.// Chemistry Physics Letter, 213, pp. 111-116, 1993.

50. Pandey R.K., Bellnier D.A., Smith K.M., Dougherty Th.J. Chlorin and porphyrin derivatives as potential photosensitizers in photodynamic therapy.// Photochemistry and Photoiology, vol. 53, N 1, pp. 65-72, 1991.

51. Roeder B. TetrapyrolesrA chemical class of potent photosensitizers for the photodynamic treatment of tumors.// Lasers in Medical Science, vol. 5, 99, pp. 99-106, 1990.

52. Лукьянец Е.А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии.// Российский химический журнал, том 42, №5, стр. 9-17, 1998.

53. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов.// Российский химический журнал, том 42, №5, стр. 23-36, 1998.

54. Dolphin D. The Porphyrins, vol III. Academic Press, Inc, 1978.

55. Roeder B. Photosensibilisatoren fur die photodynamische therapie.// Angewandte Lasermedizin, vol. 2, pp. 99-105,1993.

56. Теренин A.H. Фотоника молекул красителей. Л.: Наука, 1967.

57. Bagdonas S., Rotomskis R. Investigation of spectroscopic properties of meso-tetra-sulfonatophenil)porphine (TPPS4) in aqueous solutions of different acidity .//Lithuanian Journal of Physics, v. 38,1, pp. 75-78,1998.

58. Frolov D., Bagdonas S., Kelbauskas L., Dietel W., Streckyte G., Rotomskis R. Spectroscopy of TPPS4 and protonation properties. // Lithuanian Journal of Physics, vol. 41,4-6, pp. 484-494,2001.

59. Tanielian C., Wolf C., Esch M. Singlet oxygen production in water: aggregation and charge-transfer effects.// Journal of Physical Chemistry, vol. 100, pp. 6555-6560, 1996.

60. Streckyte G., Rotomskis R. Phototransformations of porphyrins in aqueous and micellar media.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 18, pp. 259-263, 1993.

61. Nyman E.S., Hynninen P.H. Reaserch advances in the use of tetrapyrrolic photosensitizers for photodynamic therapy.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 73, pp. 1-28,2004.

62. Tanielian C., Schweitzer C., Mechin R., Wolff C. Quantum yield of singlet oxygen production by monomelic and aggregated forms of hematoporphyrin derivative.// Free Radical Biology & Medicine, vol. 30, N 2, pp. 208-212,2001.

63. DeRosa M., Crutchley R. J. Photosensitized singlet oxygen and its applications.// Coordination Chemistry Reviews, vol. 233-234, pp. 351-371,2002.

64. Fernandez J.M., Bilgin M.D., Grossweiner L.I. Singlet oxygen generation by photodynamic agents.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 37, pp. 131-140, 1997.

65. Garbo G.M. Purpurins and benzochlorins as sensitizers for photodynamic therapy.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 34, pp. 109-116,1996.

66. Katona Z., Grofcsik A., Baranyai P., Bitter I., Grabner G., Kubinyi M., Vidoczy T. Triplet state spectroscopic studies on some 5,10,15,20-tetrakis(methoxyphenyl)porphyrins.// Journal of Molecular Structure, vol. 450, pp. 41-45, 1998.

67. Kearns D.R. Singlet oxygen. Ed. by. H.H. Wasserman, R.W. Murray, N.Y. Acad. Press, pp. 115-137, 1979.

68. Kilger R., Maier M., Szeimies R-M., Baeumker W. Bidirectional energy transfer between the triplet Ti state of photofrin and singlet oxygen in deuterium oxide.// Chemical Physics Letters, vol. 343, pp. 543-548,2001.

69. Красновский А.А. (мл). Фосфоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотобиологических системах.// Биологические мембраны, том 15, 5, стр. 530-548, 1998.

70. Hurst J.R., Schuster G.B. Nonradiative relaxation of singlet oxygen in solution. // Journal of American Chemistry Society, vol. 105, pp. 5756-5760, 1983.

71. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии, М., Мир, 1986.

72. Паркер С.А. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972.

73. Левшин Л.В., Салецкий A.M. Оптические методы исследования молекулярных систем. Молекулярная спектроскопия. М.: издательство МГУ, 1994.

74. Турро Н. Молекулярная фотохимия: Пер. с англ. Турро Н.; Ред. Р.Ф.Васильев-М.: Мир, 1967.

75. Минаев Б.Ф. Теория влияния растворителя на радиационную вероятность перехода а'Дя Х32~ в молекуле кислорода.// Оптика и спектроскопия, том 58, вып. 6, стр. 1238-1241,1985.

76. Murov S.L.in Handbook of Photochemistry, Marcel Decker, New York, 1973.

77. Dedic R., Svoboda A., Poenik J., Hala J. Phosphorescence of singlet oxygen and meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphin: time and spectral resolved study.// Journal of Molecular Structure, 651-653, pp. 301-304,2003.

78. Bilski P., Chignell C.F. Optimization of a pulse laser spectrometer for the measurement of the kinetics of singlet oxygen Ог^Аг) decay in solution.// Journal of Biochemical and Biophysical Methods, vol. 33, pp. 73-80,1996.

79. Oelckers St. Singulettsauerstoff im Modellsystem photosensibilisierte Erythrozyten-Ghost-Suspension. Dissertation, HU zu Berlin, 1999.

80. Bilski P., Hideg К., Kalai Т., Bilska M.A., Chignell C.F. Interaction of singlet molecular oxygen with double fluorescent and spin sensors.// Free Radical Biology & Medicine, vol. 34, N 4, pp. 489-495,2003.

81. Hulea St.A., Smith T.L., Wasowicz E., Kummerow F.A. Bilirubin sensitized photooxidation of human plasma low density lipoprotein.// Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1304, pp. 197-209, 1996.

82. Фут K.-C. Свободные радикалы в биологии. Под ред. У.А.Прайера М:Мир, т. 2, стр. 96-150,1979.

83. Krasnovsky А.А. Jr., Neverov K.V. Photoinduced dimol luminescence of singlet molecular oxygen in solutions of photosensitizers.// Chemical Physics Letters, vol. 167, N 6, pp. 591-596,1990.

84. Баштанов M.E. Исследование фотосенсибилизированной пигментами генерации синглетного кислорода методами измерения замедленной флуоресценции и фосфоресценции.// Диссертация, М. МГУ, 2000.

85. Bashtanov М.Е., Krasnovsky А.А. Jr. Influence of solvents on the quantum efficiency of laser-excited delayed fluorescence of phthalocyanine sensitised by singlet oxygen.// Quantum Electronics, vol. 29(2), pp. 163-167,1999.

86. Fu Yu., Krasnovsky А.А. Jr., Foote C.S. Singlet oxygen dimol-sensitized luminescence from thermally generated singlet oxygen.// J. Phys. Am. Chem. Soc. vol. 115, N 22, pp. 10282-10285, 1993.

87. Murphy S., Kondo K., Foote C.S. Singlet oxygen sensitized delayed fluorescence: direct detection of triplet phthalocyanine as an intermediate.// Journal of American Chemical Society, vol. 121, pp. 3751-3754,1999.

88. Chou Р-Т., Frei Н. Sensitization of (^('^-»'Ag) emission in solution and observation of lA-3S chemilumnescence upon decomposition of 1.4-dimethylnaphthalene endoperoxyde.// Chemical Physics Letters, vol. 122, N 1-2, pp. 87-92, 1985.

89. Chou P-T., Chen Y-C., Wei C-Y., Chen S-J., Lu H-L., Wei T-H. Photophysical properties of ChC'Ag) and 02('Sg+) in solution phase.// Journal of. physical chemistry. A, vol. 101, N 46, pp. 8581-8586, 1997.

90. Weldon D., Wang В., Poulsen T.D., Mikkelsn K.V. Solvent effect on the 02(lSg+) -> (M'Ag) emission spectrum.// Journal of Physical Chemistry. A, vol. 102, N 9, pp. 1498-1500,1998.

91. Бачило C.M., Ничипорович И.Н., Лосев А.П. Регистрация поглощения a'Ag-> b'Sg+ кислорода в растворах.//Журнал прикладной спектроскопии, т. 65, № 6, с. 811814, 1998.

92. Лосев А.П., Бачило С.М., Ничипорович И.Н. Кинетика b'Sg+ -> a'Ag флуоресценции молекулярного кислорода в растворах.// Журнал прикладной спектроскопии, т. 65, № 1, с. 5-8,1998.

93. Ничипорович И.Н., Бачило С.М. Кинетика и тушение b'Eg+ -> a'Ag молекулярного кислорода в растворах.// Труды IX международной конференции по химии порфиринов и их аналогов, с. 177-178,2003.

94. Fuke К., Ueda М., Itoh М. Thermal lensing study of singlet oxygen reactions.// Journal of American Chemical Society, v. 105, 5, pp. 1091-1096, 1983.

95. Свешникова Е.Б., Минаев Б.Ф. Механизм безызлучательного перехода 'дё -3Zg" в молекулярном кислороде в растворе.// Оптика и Спектроскопия, т. 54, N 3, стр. 542-545, 1983.

96. Merkel Р.В., Kearns D.R. Radiationless decay of singlet molecular oxygen in solution. An experimental and theoretical study of electronic-to-vibrational energy transfer.// Journal of American Chemical Society, vol. 94, N 21, pp. 7244-7253, 1972.

97. Красновский А. А. мл. Фотосенсибилизированная люминесценция синглетного кислорода вводных растворах.// Биофизика, т. 21, N 4, стр. 748-749, 1976.

98. Красновский А. А. мл. Фотосенсибилизированная люминесценция синглетного кислорода в водных растворах.// Биофизика, т. 24, N 4, стр. 747-748, 1979.

99. Khan A.U., Kasha М. Direct spectroscopic observation of singlet oxygen emission at 1268 nm excited by sensitizing dyes of biological interest in liquid solution.// Proc. Natl Acad. Sci. USA, v. 76, N 12, pp. 6047-6049,1979.

100. Красновский А.А. мл. Возбужденные молекулы. Кинетика превращений./ под. ред. Красновского А.А., Л.: Наука, стр. 32-50, 1982.

101. Красновский А.А. Синглетный кислород в фотобиологических процессах. Диссертация на соискание степени доктора биологических наук. М.: Московский Университет, 1983.

102. Красновский А.А. (мл), Егоров С.Ю., Назарова О.В., Ярцев Е.И., Пономарев Г.В. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода водорастворимыми порфиринами.// Биофизика, том 32, вып. 6, стр 982-992, 1987.

103. Егоров С.Ю., Красновский А. А. мл. Фотосенсибилизированная люминесценция кислорода при импульсном лазерном возбуждении. Кинетика затухания в водных растворах.// Биофизика, т. 28, N 3, стр. 497-798, 1983.

104. Егоров С.Ю., Красновский А.А. мл. Тушение синглетного молекулярного кислорода компонентами сред, используемых для выделения и исследования фотосинтетической активности хлоропластов.// Физиология растений, т. 33, вып. 1, 1986.

105. Салохидцинов К.И., Бытева И.М., Джагаров Б.М. Длительность люминесценции синглетного кислорода в растворах при импульсном лазерном возбуждении.// Оптика и спектроскопия, т. 55, № 3, стр. 479-482, 1979.

106. Салохидцинов К.И., Бытева И.М., Гуринович Г.П. Время жизни синглетного кислорода вразличных растворителях.// Журнал прикладной спектроскопии, т. 34, №5, стр. 892-897,1981.

107. Parker J.G. Optical monitoring of singlet oxygen generation during photodynamic treatment of tumors.// IEEE Circuits and Devices Magazine, vol. 3, N 1, pp. 10-21,1987.

108. Lopez О., Maza A., Coderch L., Lopez-Iglesias С., Wehrli Е., Parra J.L. Direct formation of mixed micelles in the solubilization of phospholipid liposomes by Triton X-100.// FEBS Letter, vol. 426, pp. 314-318,1998.

109. A guide to the properties and use of detergents in biology and biochemistry. Calbiochem Corp., by Judith Neugebauer, Clarkson university, Potsdam, New York, 1988.

110. Lissi E., Rubio M. Ог(3£) and ОгС'Д) processes in microheterogenous systems.// Pure&Appl. Chem., vol. 62, N 8, pp. 1503-1510,1990.

111. Hongying Y., Fuyuan W., Zhiyi Z. Photobleaching of chlorins in homogeneous and heterogeneous media.// Dyes and Pigments, vol. 43, pp. 109-117, 1999.

112. Lissi Е.А., Encinas M.V., Lemp E., Rubio M.A. Singlet oxygen (1Ag)bimolecular processes. Solvent and compartmentalization effects.// Chemistry Review, vol. 93, pp. 699-723,1993.

113. Ortica F., Favaro G. Environmental effects on radiative and nonradiative transitions of some merocyanine dyes in homogeneous and microheterogeneous systems.// Journal of Luminescence, vol. 68, pp. 137-147, 1996.

114. Usui Y., Tsukada M., Nakamura H. Kinetic studies of photosensitized oxygenation by synglet oxygen in aqueous micellar solutions.// Bulletin of the Chemical Society of Japan, vol. 51(2), pp. 379-384, 1978.

115. Антонов В.Ф., Черныш A.M., Пасечник В.И., Вознесенский C.A., Козлова Е.К. Биофизика, М.: Владос, 2000.

116. Рубин А.Б. Биофизика, М.: Книжный дом «Университет», 2000.

117. Rodgers M.A.J. Time-resolved studies of 1.27 цт luminescence from singlet oxygen generated in homogeneous and microheterogeneous fluids.// Photochemistry and Photobiology, vol.37, pp.99-103, 1983.

118. Lee P.C., Rodgers A.J. Singlet molecular oxygen in micellar systems. 1. Distribution equilibria between hydrophobic and hydrophilic compartments.// Journal of Physical Chemistry, vol. 87, pp. 4894-4898,1983.

119. Moan Jo. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues.// Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology, vol. 6, pp. 343-347, 1990.

120. Lindig B.A., Rodgers M.A.J. Rate constants for singlet oxygen quenching: the effects of aqueous micelles.// Journal of Photochemistry and Photobiology, vol 33, pp. 627, 1981.

121. Rodgers M.A.J., Lee P.C. Singlet molecular oxygen in micellar systems. 2. Quenching behavior in AOT reverse micelles.// Journal of Physical Chemistry, 88, pp. 3480-3484,1984.

122. Hoebeke M. The impotance of liposomes as models and tolls in the understanding of photosensitization mechanisms.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 28, pp. 189-196,1995.

123. Черняева Е.Б., Степанова H.B., Литинская Л.Л. Механизмы взаимодействия фотосенсибилизаторов с клетками (вклад лазерных и оптических методов).// Итоги науки и техники (современные проблемы лазерной физики), том 3, стр. 136-210, 1990.

124. Камалов В.Ф., Степанова Н.В., Черняева Е.Б., Чикишев Ю.А. Избирательное воздействие лазерного излучения на раковые клетки и лазерная спектроскопия клетки.// Квантовая электроника, т. 126 № 10, стр. 1997-2023,1985.

125. Shimizu O., Watanabe J., Imakubo K., Naito S. Formation of singlet oxygen photosensitized by aromatic amino acids in aqueous solutions.// Chemistry Letters, vol. 26, pp. 203-204, 1997.

126. Rodgers M.A.J. Chemical Physics letters, vol. 78, p. 509, 1981.

127. Rougee M., Bensasson R. Determination of the decay-rate constant of singlet oxygen 'Дг in presence of biomolecules.// Compt. Rendue Sci. Paris., vol. 302, ser.II, N 20, pp. 1223-1226,1986.

128. Egorov S.Yu., Kurella E., Boldyrev A.A., Krasnovsky A.A. Jr. Quenching of singlet molecular oxygen by carnosine and anserine in aqueous solutions.// Translated from Bioorganicheskaya Khimiya, vol. 18, N l,pp. 142-144, 1992.

129. Michaeli A., Feitelson Je. Reactivity of singlet oxygen toward amino acids and peptids.// Photochemistry and Photobiology, vol. 59, N 3, pp. 284-289, 1994.

130. Michaeli A., Feitelson J. Reactivity of singlet oxygen toward large peptides.// Photochemistry and Photobiology, vol. 61, N 3, pp. 255-260,1995.

131. Roeder В., Kricheldorff K. Photodynamic action of pheophorbide a on tryptophan and human serum albumin. Comparison with hematoporphyrinderivative.// Studia Biophysica, vol. 114,N 1-3, pp. 171-182, 1986.

132. Rougee M., Bensasson R., Land E.J., Pariente R. Photophysical properties of chlorin a potential sensitiser for photochemotherapy.// Photochemistry and Photobiology, vol. 47, N 4, pp. 485-489, 1988.

133. Bisby R.H., Morgan Ch.G., Hamblett I., Gorman A. A. Quenching of singlet oxygen by trolox C, ascorbate, and amino acids: effects of pH and temperature.// Journal of Physical Chemistry A, vol. 103, pp. 7454-7459, 1999.

134. Michaeli A., Feitelson Je. Reactivity of singlet oxygen toward proteins: the effect of structure in basic pancreatic trypsin inhibitor and in rebonuclease A.// Photochemistry and Photobiology, vol. 65(2), pp. 309-315, 1997.

135. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода. М.: Советская наука, 1957.

136. Kanofsky J.R., Quenching of singlet oxygen by human plasma.// Photochemistry and Photobiology, vol. 51, No 3, pp. 299-303, 1990.

137. Hall R.D., Chignell C.F. Steady-state near-infrared detection of singlet molecular oxygen: a Stern-Volmer quenching experiment with sodium azide.// Photochemistry and Photobiology, vol. 45, N 4, pp. 459-464, 1987.

138. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human red cell ghosts.// Photochemistry and Photobiology, vol. 53,1, pp. 93-99, 1991.

139. Thomas J.P., Girotti A.W. Photooxidation of cell membranes in the presence of hematoporphyrin derivative reactivity of phospholipid and cholesterol hydroperoxydes with glutatione-peroxyase.// Photochemistry andPhotobiology, v. 47S, pp. 79S, 1988.

140. Thomas J.P., Hall R.D., Girotti A.W. Singlet oxygen intermediacy in the photodynamic action of membrane-bound haematoporphyrin derivative.// Cancer Letters, v. 35, pp. 295-302,1987.

141. Oelckers St., Sczepan M., Hanke Т., Roeder B. Time-resolved detection of singlet oxygen luminescence in red cell ghost suspensions.// Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology, vol. 39, pp. 219-223, 1997.

142. Firey P.A., Rodgers M.A.J. Photochemical properties of erythrocyte ghosts containing porphyrin.// Photochemistry and Photobiology, vol. 47, 5, p. 615-619, 1988.

143. Moan Jo., Berg K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen.// Photochemistry and Photobiology, vol. 53, N 4, pp. 549-553, 1991.

144. Квасников И. А. Термодинамика и статистическая физика. Теория неравновесных систем. М: издательство МГУ, 1987.

145. Truscott T.G. McLean A.J. Philips A.M.R., Foulds W.S. Detection of haematoporphyrin derivative and haematoporphyrin excited states in cell environments.// Cancer Lettes, v. 41, pp. 31-35, 1988.

146. Niedre M., Patterson M.S., Wilson B.C. Direct near-infrared luminescence detection of singlet oxygen generation by photodynamic therapy in cells in vitro and tissues in vivo.// Photochemistry and Photobiology, v. 75, pp. 382-391, 2002.

147. Davila J., Harriman A. Photoreactions of macrocyclic dyes bound to human serum albumin.// Photochemistry and Photobiology, vol. 51, N 1, pp. 9-19, 1990.

148. Jasaitis A. Jr., G. Streckyte G., Rotomskis R. Spectroscopic studies of photosensitizer-human serum albumin complexes and their photostability.// Proceedings ofSPIE, v. 2924/91, pp. 91-100, 1996.

149. Jasaitis A Jr., Streckyte G., Rotomskis R. Photophysics of sensitizer-protein complexes.// Lithuanian Journal of Physics, vol. 36, 4, pp. 299-302, 1996

150. Kubat P., Lang К., Anzenbacher P. Jr. Modulation of porphyrin binding to serum albumin by pH. IIBiochimica et Biophysica Acta, vol. 1670, pp. 40-48,2004.

151. Oenbrink G., Juergenlimke P., Gabel D. Accumulation of porphyrins in cells: influence of hydrophobicity aggregation and protein binding.// Photochemistry and Photobiology, vol. 48, No.4, pp.451-456,1988.

152. Parr G.R., Pasternack R.F. The intraction of some water-soluble porphyrins and metalloporphyrins with human serum albumin.// Bioinorganic Chemistry, vol. 76, pp. 277-282, 1977.

153. Reddi E., Ricchelli F., Jori G. Interaction of HSA with HP and its Zn and Fe derivatives.// Int. J. Pept. Protein res., vol. 18, pp, 402-408, 1981.

154. Rotenberg M., Cohen S., Margalit R. Thermodynamics of porphyrin binding to serum albumin: effects of temperature, of porphyrin species and of albumin-carried fatty acids.// Photochemistry and Photobiology, vol. 45, N 5, pp. 689-693,1987.

155. Зорин В.П., Хлудеев И.И., Зорина Т.Е. Распределение порфириновых сенсибилизаторов между белковыми и клеточными элементами крови.// Биофизика, т. 45, вып. 2, стр. 313-319,2000.

156. Borissevitch I.E., Gandini S.C.M. Photophysical studies of excited-state characteristics of meso-tetrakis (4-N-methyl-pyridiniumyl)porphyrin bound to DNA.// Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 43, pp. 112-120, 1998.

157. Физиология человека. Под ред. акад. П.Г.Костюка. М.: Мир, 1986, т.З.

158. Haag W.R., Mill Th. Rate constants for interaction of 'Ог ('Ag) with azide ion in water.// Photochemistry and Photobiology, vol. 45, N 3, pp. 317-321, 1987.

159. Справочник по растворимости. Ред. В.Б. Коган, -т. 1,1961

160. Guo J.-H., Luo Y., Kashtanov S., Rubensson J.-E., Shuh D.K., Aegren H., Nordgren J. Molecular structure of alcohol-water mixtures.// Physical Review Letters, vol. 91, N 15, pp. 157401-1 157401-4,2003.

161. Scurlock R.D., Nonell S., Braslavsky S.E., Ogilby P.R. Effect of solvent on the radiative decay of singlet molecular oxygen (a'Ag).// Journal of Physical Chemistry, vol 99, pp. 3521-3526, 1995.

162. Шенфельд H. Неионогенные моющие средства. M.: Химия, 1965.

163. Шинода К., Накагава Т., Тамамуси Б., Исемура Т. Коллоидные поверхностно-активные вещества. М.: Мир, 1966.

164. Pal P., Zeng Н., Durocher G. et.al. Phototoxicity of some bromide-substituted rhodamine dyes: synthesis, photophysical properties and application as photosensitizers.// Photochemistry and Photobiology, vol. 63, pp. 161-168, 1996.

165. Villeneuve L., Pal P., Durocher G. et.al. Spectroscopic and photophysical investigations on the nature of localization of rhodamine 123 and its dibromo derivative in different cell lines.// Journal of Fluorescence, v. 6, № 4, pp. 209-221, 1996.

166. Kuznetsova N.A., Gretsova N.S., Derkacheva V.M., Kaliya O.L., Lukyanets E. Sulfonated phtalocyanines aggregation and singlet oxygen quantum yield in aqueous solutions.// Journal of Porphyrins and Phthalocyanines, vol. 7, pp. 147-154,2003.

167. Li. M.Y., Cline C.S., Koker E.B., Carmichael H.H., Chignell C.F., Bilski P. Quenching of singlet molecular oxygen ('Ch) by azide anion in solvent mixtures.// Photochemistry and Photobiology, vol 74, N 6, pp. 760-764,2001.

Информация о работе

Буторина, Дарья Николаевна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в простых моделях биологических систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы