Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов деструктивного и регуляторного действия оптического излучения на дрожжевые клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов деструктивного и регуляторного действия оптического излучения на дрожжевые клетки"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ К. В. ЛОМОНОСОВА

РГб

БЕЛЕНИКИНА Наталья Серафимовна

уД Биологический факультет На правах рукописи 576.8.095.14:577.37.123.344

Исследование механизмов деструктивного и регуляторного действия оптического излучения на дрожжевые клетки

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КССКВА - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета МГУ.

Научный руководитель: доктор. биол.. наук., профессор Г_Я-Фрайкин.

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук Крицкий М.С.

доктор биол. наук, профессор Соболев A.C.

Ведущее учреждение:

Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится ¿М£Ь& 1994г. в

на заседании специализированного совета К.053.05.68 при Московском Государственном Университете.

Адрес: 119899, Москва, МГУ, Биофак.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

,1994г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биол. наук _

.Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы■ Современный этап развития фотобиофизики арактеризуется все возрастающим интересом к исследованию фотоиндуци-ованных процессов, обусловливающих деструктивное и регуляторное дей-твие оптического излучения на биологические системы. Эти процессы от-ажают влияние света как постоянного фактора окружающей среды на рганизмы и поэтому наряду с фотосинтезом и зрением имеют важное обще-иологическое значение.

Интенсификация работ в области изучения повреждающих фотобиологи-еских эффектов вызвана рядом обстоятельств и необходимостью решения рактлческих задач, которые можно разделить на две группы. Первая 1ключает вопросы фотоэкологии, остро стоящие в связи с повышением ■ровня загрязненности окружающей среды и увеличением вероятности про-'екания в биоструктурах фотосенсибилизированных деструктивных резкий, в том числе ответственных за канцерогенное действие солнечной >адиации. Вторая группа задач связана с разработкой и усовершенствованием способов направленного повреждения клеток при фотодинамической терапии рака видимым светом в присутствии сенсибилизаторов порфирино-зой природы.

Повышенное"внимание к проблеме фоторегулирования определяется гем, что познание молекулярных основ функционирования фоторецепторных -w^-тем будет способствовать, с одной стороны, решению актуальной обше-5иологической задачи, связанной с выяснением механизмов, осуществляю-дих в биосистемах восприятие и усиление внешнего сигнала и его реализацию в виде определенного физиологического ответа, а, с другой -созданию эффективных методов фототерапии некоторых заболеваний человека , направленного регулирования биосинтезов, управления ростом и развитием растительных и микробных организмов.

При исследовании повреждающих эффектов оптического излучения экологического диапазона основное внимание уделяется фотодеструктивным процессам, индушгруемым его коротковолновыми компонентами - средневолновым (290-320 нм) и длинноволновым (320-400 нм) ультрафиолетом (УФ) (Moan, Peak, 1989; Tyrrell, Keyse, 1990). Что касается видимого света, который без добавленных к клеткам сенсибилизаторов обнаруживает меньшую эффективность повреждающего действия, то о механизмах инициируемых им деструктивных реакций известно пока очень мало. В противоположность этому, среди фоторегуляторных эффектов наиболее изучены процессы, вызываемые видимым светом. К их числу следует прежде всего отнести опосредуемые фптохромом реакции фотоморфогенеза у высших растет«!, в проявлении которых активен свет красной-дальней красной области спектра (Sor.g, 1993), и разнообразные фотофизиологические ответы на синий свет, наблюдаемые у грибов и водорослей (фототропизм.

фототаксис, фотоиндуцированный каротиногенез и др.) (Крицкий, Чернышева, 1988,- Синещеков, Литвин, 1988). Имеются также данные о стимулирующем влиянии низкоинтенсивного монохроматического видимого света (как некогерентного, так и когерентного) на рост и метаболизм гетеротрофных микроорганизмов, клеток животных и человека (Феофилова с соавт., 1991; Каги, 1990), однако механизмы этих эффектов, в отличие от упомянутых выше, изучены недостаточно. Кроме того, остается практически не исследованным регуляторное действие на развитие клеток низкоинтенсивного света УФ-области спектра.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в выявлении и изучении природы фотоиндуцированных процессов, ответственных за повреждающие эффекты видимого света и регуляторное действие низкоинтенсивного УФ-излучения на дрожжевые клетки. В соответствии с этим были поставлены следующие основные задачи:

- идентифицировать эндогенный фотосенсибилизатор, опосредующий деструктивные реакции в клетках при воздействии оптического излучения видимого диапазона (400 - 600 нм) ;

- определить критическую мишень в клетке, фотосенсибилизированное повреждение которой обусловливает инактивирующий эффект видимого света;

- исследовать механизмы фотосенсибилизированных деструктивных ре-акц::.".:, лль« в основе повреждающего действия видимого света;

- найти режимы облучения, при которых возможна регуляция клеточного метаболизма низкоинтенсивным светом УФ-области спектра;

- установить природу первичных фотоактивных хромофоров, участвующих в фоторегуляторных процессах.

Научная новизна работы. В результате впервые проведенного комплексного исследования повреждающего действия видимого света на клетки дрожжей получены данные о механизмах фотосенсибилизированных деструктивных процессов, лежащих в основе эффекта фотоинактивации. Установлено, что в качестве эндогенного сенсибилизатора выступает свя занный с плазматической мембраной клетки порфирин, а критической мише нью служит плазматическая мембрана, фотосенсибилизированное нарушение барьерных свойств которой является основной причиной фотоинактивации клеток. Показано, что важная роль в инициации фотосен сибилизированных процессов перекисного окисления липидов в плазматических мембранах принадлежит синглетному кислороду.

Обнаружен фотосинергический летальный эффект при комбинированном (совместном) действии видимого света (400 - 600 нм) и длинноволновых УФ-лучей (337, 365 нм) на дрожжевые клетки. Установленный факт важен в экологическом аспекте, поскольку показывает, что эти компоненты сол нечнсй радиации, несмотря на относительно малую эффективность повреж-

аюцего действия, могут представлять со5ой (в силу взаимоусиления ин-;уп::руемых ими деструктивных процессов) значительно более активные актеры среды.

Обнаружено регулятеркое влияние на рост дрожжевых клеток низкоин-■енсивного монохроматического УФ-света в области 280 - 380 нм. Фотс-тикуЛ1фу1эзий эффект связан с УФ-индуцирсванкым синтезом серотинина, >бнарукившего способность выполнять функцию регулятора клеточных де-[ений. Вперзые показано, что механизм УО-индуцированного образования :еротонина в клетках включает фстомодуляцию активности декарбоксилазы

одного из ферментов, катализируюяих реакции его синтеза. Получены данные, позволявшие рассматривать кофактор дгкарбоксилазы - пиридок--.альфосфгт в форме аддукта, поглодавшего при 330-340 км, в качестве 1ерзичного фотоактиЕКОГс хромофора.

Практическая значимость работы. Полученные данные о механизмах югосенсибклизирэванного повреждения плазматических мембран клеток ;ак основе их инактивации видимым светом важны для пон:смания фотодина-кгческсго действия эндогенных и экзогенных перфириновых сенсибилизаторов в езязи как с некоторыми заболеваниями человека (например, зри-гропоэтическая перфкрия) , так и усовершенствованием методов ;ототерапии рака. Разработанный способ актизац:«: роста дрожжей, основанный на выявленной в фогобиологическом исследовании регуляторней сункцпи серотонина (способ занижен авторским свидетельством) , открывает перспективы для его использования в практике микробиологической :ромыдленности с целыо ускорения биотехнслогических процессов.

Публикации и апробация работы. Г.о материалам диссертации сдублировано 5 научных статей и получено авторское свидетельство на изобретение. Основные результаты исследования были доложены и/или представлены на 1-м, 3-5-м конгрессах ЕЕрэпейсксго фстсбиолспгческсго эбпес.ва (Гренобль, Франция, 1986г., Будапешт, Венгрия, 1989г., Ям-гтердам, Нидерланды, 1991г., Марбург, Германия, 1993г.), Международ--:ом симпозиуме "Яктивносвакные формы кислорода в биологических системах" (Варка, Болгария, 19о6г.), Международной конференции "действие физических факторов на биологические системы" (Москва, 1957г.), 19-м гжегедном съезде ЕВМБ 'Мутагенные и канцерогенные факторы окруу.акпей :реды" (Родос, Грешоя, 1989г.), 20-м ежегодном сьезде американского обдества фотсбислсгов ("арко-Айленд, Флорида, СИЛ, 1992г.!, 11-м Международном фстобнслогическок конгрессе (Кистс, Япония. 1992г.), Меже/народном биофизическом конгрессе (Вудапедт, Венгрия, 1993г.) и на сругих научных конференциях и семинарах.

Структур; :: гбъем работы. Диссертация состоит из введения, обзора -итергтуры, в г.стгрсм дак анализ современного состояния проблемы деструктивного и ре—.-дятс-ногс действ;^ сдтмческсгс излучения на бпелоги-

ческие системы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, ключения, основных выводов и списка цитированной литературы. Содерж ние работы представлено на с. маиинописного текста, иллюстрировг но 25 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.Основным объектом исследования служили кл€ ки дрожжей, fan^i ля ggillieiiiiunilri !ВСЕ-бТ6". В отдельных эксперимента использовали дрожжи Saccnaromvces cerevisiae: Cl-9-дикий штамм и дб его мутанта - дефинитный по эксшаионной репарашо: ДНК втамм rad 3-3 и дефицитный по пострепликативной репарации ДНК штамм rad 50-1. Kyj туры дрокжей выращивали по стадартной схеме (Орайкин с соавт. , 1990!

Модельные эксперименты проводили с экстрактами дрожжей, а также выделенными нами из клеток плазматическими мембранами (Страховская соавт., 1989; Беленикина с соаЕТ., 1991).

Определение активности декарбоксилазы проводили в дрожжевых экс трактах с добавлением 2 мМ ЭДТА и 0,1мМ пиридоксальфосфата (кофакто; декарбоксилазы). Реакцию начинали добавлением в инкубационную смесь 0,"7 мМ 5-окситриптофана, служащего субстратом для декарбоксилазы. 5 окситриптофан и продукт его ферментативного декарбоксилирования (се рогонин), содержащиеся в надосавочной жидкости, полученной центрифу гированием проб при 3000с 15мин, анализировали методом тонкослойной хроматографии. Для этого 5 мкл супернатанта наносили на пластинку с тонким слоем спликагеля (Silufol UV-254,"Kavalier") и проводили раз ление в системе этилацетат-изопропанол-аммиак (45:35:20 по обьему). Серотонин и 5-окситриптофан идентифицировали путем сравнения их хро тографических подвикностей с таковыми для соответствующих свидетеле проявляющихся визуально при концентрации 50 мМ. Локализацию 5-оксит рпптофанг и серотонина определяли при освещении пластинок УФ-светом ст лампы БУВ-30. Концентрацию 5-окситриптофана и серотонина измерял спектрофлуорикетрически по калибровочной концентрационной зависимости после их элюнрования с мест локализации на хроматографической п: стинке дистилированной водой и подкисления в 31J КС1/>.В0,5 =290 нм, /Чг=540 нм/.

О скорости нерекксного окисления лкпидов (ПОЛ) в изолированных плазматических мембранах судили по накоплению малоновсго диаяьдеиа (КЕА) , концентрацию которого определяли с помощью тиобарбитуровой к слоты (TBK), измеряя оптическую плотность комплекса КЗА-ТБК в как с;: ме спектра его поглощения при 532 нм (£=1,56.10' V~~ см"") (Girotti, 1985) .

Облучательные установки, источники света, дозиметрия. Облучение

логических объектов монохроматическим светом в области 280-650 нм

сследование спектров действия проводили на специальной термостати-

мой установке. Монохроматический свет от лампы ДРШ-1000 получали с

;ощыо дифракционного спектрографа (линейная дисперсия 1нм/мм) . Ин-

сивность монохроматического света варьировали в зависимости от ус-

2 2

1Ий эксперимента от 0,002 Вт/м до 5 Вт/м . Для выделения света види-[ области спектра (400-600 нм) использовали лампу ДРШ-1000 в ¡етании со светофильтрами ЖС-10+СЗС-21. Излучение фокусировалось на )ету с объектом, помещенную в закрытый термостатируемый держатель расстоянии 15 см от источника света. Интенсивность излучения на >вне образца составляла 60 Вт/м . Источником коротковолнового УФ-из-¡ения (254 нм) служила бактерицидная лампа БУВ-30. Интенсивность из-¡ения на уровне образца составляла 5 Вт/м2. В отдельных эксперимен-с в качестве источника излучения использовали лазер на азоте ~И-21) , генерирующий импульсы света с длиной волны 337 нм (1^^=10 .максимальная интенсивность в импульсе - 10s Вт/м2, f=100 Гц). Ин-■¡сибность света измеряли высокочувствительным термоэлементом Lger FT 16.1/622 (Англия).

Условия облучения биологических обьектов. Все исследуемые обьек-облучались в условиях постоянного перемешивания.

Облучение суспензий дрожжей (концентрация - 106 клеток в мл) про-дили в минеральной (солевой) среде. Концентрации клеток рассчитыва-на основании данных подсчета их количества в камере Горяева. Выжи-емость дрожжей определяли методом микроколоний.

Облучение дрожжевых экстрактов при изучении активации фермента карбоксилазы проводили при 4°С УФ-излучением (337 нм) лазерного мечника интенсивностью 50-150 Вт/м2.

'Облучение суспензий изолированных плазматических мембран в 0,6 И 1 при определении продуктов ПОЛ проводили при 22°С светом видимой ласти спектра (400-600 нм).

Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре РЭ-1307 в плоской |Вете. Фотоиндуцированное образование супероксидного анион-радикала

в клетках и плазматических мембранах измеряли с использованием •о спиновой ловущки-тайрона (Greenstock, Miller, 1975). Образцы облучи непосредственно в резонаторе радиоспектрометра видимым светом ,00-600 нм) от лампы КГМ-300 (интенсивность 50 Вт/м2) : суспензии кле-ж - в солевой среде, суспензии плазматических мембран - в 0,6 М KCl. in создания бескислородных условий воздух из кюветы откачивали форва-умным насосом.

Микрофпурриметрические измерения проводили на люминесцентном мик-зскопе Люмам И-3. О фстоповреждении плазматических мембран дрожжей

судили по изменению их прош—З-емссти к флуорохрому прикулину (Gracham, 1S70). Измерения проводили через 5 мик после добавления к клеткам прииулика (10*' !■:) .

Спектры поглощения и Флуоресценции снимали на спектрофотометре Kitachi-557 и спектрофлуориметре Hit.achi.-850 соответственно.

Реактивы. В работе использовали реактивы и вещества фирмы Sigma, и сргани.чйс.к.ие. стечественного производства специальной

очистки, применямые в хроматографических исследованиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава X.Изучение повреждающего действия видимого светана дрожжевые клетки

1. Общие закономерности фотоинактивации клеток

При изучении действия видимого света (400-600 нм) на клетки дрож кей выявлены дозк обучения (> 100 кЗж/м:) , вызывавшие инактивацию клеток без добавленных к ник сенсибилизаторов. Установленная сильная зависимость летального эффекта от кислорода свидетельствует о том, что процесс фотоикактиваиии клеток светом в области 400-600 нм осуще ствляется по фотодинакическому механизму с участием эндогенного(ых) сенсибилизатора(ов).

С-.ч- определения клеточной мишени, фотосексибилизировакное п; Ереждение которой ответственно за летальное действие видимого света, были проведены две серии экспериментов. В первой серии исследовали з ексимости от дозы облучения выживаемости клеток различных штаммов S. cerevisiae, отличавшихся по их способности репарировать повреждения ДНК. Установлено, что мутактные штаммы, характеризующиеся повышенно: чувствительностью к коротковолновому УФ-излучению, не отличаются от дикого штамма по своей чуЕстительности к видимому свету, т.е. отсутс вие у мута.чгких дггаммов систем репарации ДНК (эксцизионной либо ло-стрепликативной) не приводит к увеличению их чувствительности к дей< зка видимого света. Эти данные позволяют считать, что при облучении клеток видимым сЕетон оетосексибилизированного повреждения ДНК, вне сяшего вклад в летальный эффект, не происходит.

Вторая серия экспериментов была направлена ка выяснение роли пл матической мембраны в качестве критической кищеки. В этих экспериме тах 1-я» использовали характерное свойство флуорохрома примулина, кст рое заключается в там, что он не проникает в клетки с интактными плазматпческики мембрана::::, ко проникает Екутрь клеток при деструкг барьеров их проницаемости. Была установлена корреляция в дозовых за симсстях сотопкгуипрсв^кнсгс увеличения проницаемости г.лазматическ

;мбраны и степени фотоинактивации клеток. Эти результаты четко проде-энстрировали, что основной мишенью при фотосенсибилизированной инак-1вации дрожжей видимым светом являются их плазматические мембраны.

2. Природа сенсибилизатора в клетках дрожжей при деструктивном действии видимого света

Как известно, основные молекулярные компоненты мембран не погло-зют свет в области 400-600 нм. Следовательно, индуцируемые видимым ветом деструктивные процессы в плазматической мембране могут проте-ать только с участием сенсибилизатора, поглощающего в этой области, читывая, что при фотодинамическом действии в первую очередь поврежда-' тся те внутриклеточные структуры, которые находятся в непосредствен-ой близости от сенсибилизатора, можно было предположить, что эндоген-ый сенсибилизатор связан с плазматической мембраной клетки.

Проведенный спектрофлуориметрический анализ изолированных плазма-ических мембран дрожжей позволил выявить наличие в них флуоресцирую-его вещества с максимумом в спектре флуоресценции при 650 нм. Спектр озбуждения этой флуоресценции обнаружил главный максимум при 420 нм характерные менее интенсивные пики в области 500-650 нм, что типич-о для порфиринов (Gouterman, 1978). Поэтому можно считать, что свя-анное с плазматической мембраной соединение, флуоресценцию которого ы зарегистрировали, относится к соединениям порфириновой природы.

Для выяснения вопроса о возможной роли флуоресцирующего порфири-а как фотосенсибилизатора при повреждающем действии видимого света а клетки было проведено изучение спектра действия фотоинактивации леток. Полученный спектр действия обнаружил сходство со спектром воз-уждения флуоресценции порфирина, локализованного в плазматической :ембране, а также со спектром его поглощения после экстрагирования из >ракции плазматических мембран в хлороформ (данный спектр также типи-:ен для порфириновых соединений). Этот факт позволяет считать, что ¡игмент порфириновой природы, локализованный в плазматической мембра-ie, выполняет роль эндогенного сенсибилизатора при летальном действии шдимого света на дрожжевые клетки.'

3. Роль активированных форм кислорода в фотосенсибилизированной инактивации клеток и повреждении их плазматических мембран

Известно, что порфирины способны эффективно фотогенерировать об->азование синглеткого кислорода t^), который по современным представлениям является важным интермедиатом в повреждающих фотодинамических эффектах (Красновск!::':, 1988; Spikes, 1989).

На рис. 1 приведены полученные нами данные о влиянии одного 13 наиболее эффективных тушителей синглетного кислорода азида натрия

(ЫаЫ3) на степень фотоинактивации дрожжей. Видно, что Ыа сильно защищает клетки от летального действия видимого света. Этот факт может указывать на существенный вклад синглетного кислорода, генерируемого эндогенным сенсибилизатором, в фотоповреждение дрожжевых клеток видимым светом. Вместе с тем нельзя было исключить участия в инициации фотодеструктивных реакций каких-то других форм активированного кислорода. Фотошщуцмрованное образование одной из них (О^ ) нам удалось зарегистрировать в клетках с помощью спиновой ловушки - тайрона. Однако, как показали опыты по определению выживаемости клеток, добавление тайрона, в отличие от азида, практически не защищает их от фотоинактивации видимым светом (рис. 1). Эти данные позволяют считать, что хотя супероксидный анион-радикал фотогенерируется в клетках, вклад в эффект фотоинактивации он практически не вносит.

Результаты данного этапа исследования, выполненного на клетках, показывают, что при их фотодинамической инактивации главной мишенью служит плазматическая мембрана, а основным фотосенсибилизатором - связанный с мембраной порфирин. По всей вероятности, именно с его участием запускаются фотодеструктивные реакции в плазматической мембране, важным инициатором которых является синглетный кислород.

Согласно данным литературы (Черницкий, Воробей, 1988), изменение проницаемости.плазматических мембран клеток под действием видимого света при добавлении экзогенных сенсибилизаторов (в том числе порфири-нов) связано преимущественно с перекисным окислением липидов в мембранных структурах. В связи с этим мы исследовали процессы ПОЛ в плазматических мембранах дрожжей, имея в виду, что они могут инициироваться эндогенным мембраносвязанным сенсибилизатором.

Результаты экспериментов по определению в мембранах ТБК-активно-го продукта окисления липидов (МДА) приведены на рис. 2. Как видно, с ростом дозы облучения в мембранах происходит увеличение концентрации МДА,. что свидетельствует о развитии процесса перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ). На рис. 2 также представлены результаты изучения роли синглетного кислорода в инициадии процесса ПОЛ. Видно, что облучение плазматических мембран в присутствии приводит к замедлению кинетики накопления МДА, тогда как в дейтерированной воде, где время жизни х02 значительно возрастает, - к увеличению количество МДА, т.е. к интенсификации процесса ПФОЛ.

80 60

40

20

10

^_

0 1 2 3 4 5 хЮ^ Доза, Дж/м2

Рис. 1

2 х

Н20

Н20+№М,

О 2,16 4,32

Доза, Дж/м2 х 10"5

Рис. 2

Рис. 1 Влияние 10 мМ Иа^ (2) и 10 мМ тайрона (3) на выживаемость дрожжевых клеток, облученных видимым свемом (400-600 нм) (1).

Рис. 2 Зависимость концентрации МСА (С)

в плазматических мембранах от дозы облучения (400-600 нм).

Полученные данные позволяют считать, что 02, фотогенерируемый связанным с плазматической мембраной порфирином, играет важную роль в инициации процесса ПОЛ. Вместе с тем, поскольку азид натрия не полностью ингибирует ЛФОЛ, нельзя исключить участия в инициации этого процесса и каких-то других активированных форм кислорода. Одну из них мы попытались зарегистрировать методом ЭПР с помощью тайрона. Од".эко,- л изолированных плазматических мембранах, в отличие от целых, клеток, фотоиндуцированного сигнала ЭПР тайрона нам зарегистрировать не удалось. Поэтому можно считать, что фотосенсибилизированного образования в плазматических мембранах под действием видимого света не происходит, и он соответственно не учавствует в инициировании процесса ПОЛ.

При обсуждении вопроса о том, по какому еще механизму, помимо реакций с участием 102, реализуется инициация ПФОЛ в плазматической мембране, можно предположить, что имеет место тип I фотосенсибилизирован-ных реакций, при котором порфирин в фотовозбужденном триплетном состоянии может отнимать электрон (или атом водорода) от молекулы ненасыщенной жирной кислоты с образованием ее радикала. Взаимодействие этого радикала с кислородом приводит к образованию перекисного радикала, способного инициировать свободнорадикальное окисление лилидов (^гое^, 1990) .

Одним из важных следствий протекания ПОЛ является увеличение вязкости липидной фазы мембраны. Для того чтобы проверить, происходят ли такие изменения в плазматических мембранах дрожжей при облучении их видимым светом, мы использовали спиновый зонд 5-доксилпальмитат, по спектру ЭПР которого можно судить о его подвижности в липидной фазе мембраны и соответственно о ее вязкости. Спектр ЭПР этого зонда (10-4 М) в необлученных мембранах приведен на рис. 3. Отмеченное на спектре расстояние (2А1пах) характеризует подвижность зонда в мембране, причем ее величина связана обратной зависимостью с данным расстоянием.

Было установлено, что облучение мембран видимым светом приводит к заметному увеличению расстояния 2Ашах (рис. 4), т.е. к ограничению подвижности зонда в мембране вследствие повышения вязкости ее липидной фазы. При замене Н20 на Д20 такое изменение выражено значительно сильнее (рис. 4) , что наблюдалось и в случае протекания ПФОЛ в мембранах (см. рис. 2).

Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что видимый свет индуцирует процессы ПОЛ в плазматических мембранах дрожжей. Одк:ц-: из основных инициаторов этих процессов является синглетный кислород, фотогенерируемый связанным с мембраной сенсибилизатором (порфирин) . Сенсибилизированное порфирином фотоокисление липидов вызыва-

увеличение вязкости яипидной фазы мембран и приводит к снижению их зьерных функций. Очевидно, именно вследствие таких процессов наблю-этся резкое увеличение проницаемости плазматических мембран дрожже-< клеток, которое коррелирует со степенью их фотоинактивации.

А

/ 1

! \

0,52 мТ

\ I

1/

/V

У

2А,

Рис. 3 Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксилпальмитата в плазматических мембранах (концентрация белка 2 мг/мл). Условия записи: частота ВЧ-модуляции -100 кГц,

мощность СЗЧ - 2 мВт.

тах

0,20

0,15

0,10

Доза, Дж/т2 х 1(Г5

Рис. 4. Изменение пдвижности спинового зонда (5-доксилпальмитат) в плазматических мембранах в зависимости от дозы облучения (400-600 ям)

4. Фогосинергический эффект при действии видимого света и длинноволновых УФ-лучей на клетки дрожжей

В соответствии с нашими результатами при летальном действии видимого света в роли эндогенного сенсибилизатора может выступать связанный с плазматической мембраной клетки порфирин, и это обусловливает протекание сенсибилизированных им деструктивных реакций преимущественно в плазматической мембране. В случае же длинноволновой УФ-инакти-вации дрожжевых клеток одним из основных сенсибилизаторов служит локализованный в ядре НАДН, который сенсибилизирует деструктивные реакции, приводящие к повреждению ДНК (Фрайкин с соавт., 1989).

Эти данные позволили подойти к исследованию вопроса о том, как летальный эффект будет проявляться в условиях комбинированного (или совместного) действия на клетки длинноволнового УФ- и видимого света. Было установлено, что как при комбинированном, так и при совместном действии длинноволнового УФ и видимого света происходит неаддитивное суммирование повреждающих эффектов, вызываемых каждым видом оптического излучения в отдельности (фотосинергизм). Если учесть, что повреждающее действие на клетки длинноволновых УФ-лучей связано главным образом с повреждением ДНК, а видимого света - преимущественно с повреждением плазматических мембран, то наиболее вероятное объяснение обнаруженного фотосинергического эффекта заключается во взаимоусилении деструктивных процессов, протекающих в этих структурах.

Установленный факт синергического взаимодействия при действии на клетки длинноволновых УФ-лучей и видимого света представляется важным в экологическом аспекте. Он показывает, что такие относительно малоэффективные (с точки зрения деструктивного действия) компоненты солнечной радиации, как длинноволновый УФ- и видимый свет, при совместном действии могут вызывать достаточно сильные повреждающие эффекты.

Глава II. Изучение регуляторного действия монохроматического УФ-света в области 300-380 нм на дрожжевые клетки

1. Обнаружение эффекта стимуляции роста клеток

Найдены режимы облучения, при которых монохроматический УФ-свет в области 300-380 нм (313, 334 или 365 нм) регулирует скорость размножения клеток. Стимулирующее действие УФ-света наблюдалось только в том случае, если после кратковременного облучения клетки высевали на питательную среду через некоторый интервал времени (максимальный эффект фотостимуляции достигался при 1-1,5-ч интервале).

Типичные кривые, иллюстрирующие индуцированную УФ-светом (одной из длин волн) активацию роста клеток, показывают (рис. 5), что эффект

тостимуляции проявляется в виде сокращения лагфазы на кривой роста, ли за эффект фотостимуляции принять обратное отношение длительности г-фазы в опытной (т£ = — и контрольной (т£ = ^ - культу-х 1/т£/т£, то его величина составит -1,5, т.е. предварительное УФ-лучение приводит к сокращению лаг-фазы роста клеток в 1,5 раза.

, 4

/

/

ю. 5 Динамика размножения клеток: 1 - необлученные клетки,

- предварительно облученные УФ-светом (313 ям), доза - 300 Дж/м2,

- то же в присутствии парахлорфеьдалаланкна. Клетки до начала роста одерживали 1 ч в минеральной среде при 25°С. 4 - теоретический идеальный" рост культуры. 1:г - момент времени, в который реальная ультура достигает определенной концентрации клеток.

- то же для "идеальной" культуры.

При исследовании зависимости стимулирующего действия УФ-лучей 313, 334 и 365 нм от дозы облучения при одинаковой интенсивности 0,2 Вт/м*1 было установлено, что они имеют сходный характер: с ростом дозы облучения вначале наблюдается увеличение эффекта, достигающего максимального значения при определенной дозе (300 Дж/м2), а затем его уменьшение. В параллельных опытах мы показали, что аналогичной зависи мостью от дозы облучения характеризуется и эффект фотостимуляции роста дрожжей, индуцированный более коротковолновым УФ-светом (289 нм) . В отличие от соответствующих эффектов длинноволновых УФ-лучей он наблюдается при значительно меньших дозах облучения (3 Дж/м2) и только при очень низкой интенсивности (0,002 Вт/м2) . Это связано с высокой эффективностью повреждающего действия УФ-света 289 нм: при больших ин тенсивностях и дозах он вызывает торможение роста клеток и даже их гибель. Вместе с тем для эффекта фотостимуляции, вызываемого УФ-светом 289 нм, характерна та же особенность, что и для эффектов,индуцируемых длинноволновыми уф-лучами: он проявляется только при наличии темново-го интервала времени. Поэтому можно считать, что в основе всех эффектов, наблюдаемых при действии УФ-лучей в области 280-380 нм, лежит об щий механизм. Что касается более длинноволнового света (405, 436 нм), то, как было установлено, он не влияет на скорость размножения дрожже вых клеток.

На основании полученных дозовых зависимостей эффектов фотостимуляции, вызываемых УФ-лучами 289, 313, 334, 365 нм, была оценена их от носительная эффективность (рис. 6). За величину эффективности приним; ли обратное отношение доз УФ-лучей, вызывающих одинаковый эффект сокращения лаг-фазы (в 1,35 раза).

2. Изучение роли УФ-индуцированного синтеза серотонина в проявлении эффекта фотостимуляции роста клеток

Как отмечено выше, для реализации активирующего действия света н. рост дрожжей необходим определенный темновой интервал времени. В специальных опытах было установлено, что эффект фотостимуляции зависит от температуры при ее изменении в темновой интервал, причем эта зависимость характерна для ферментативных процессов. Эти данные позволил предположить, что в темновой латентный период происходит УФ-индуциро ванный ферментативный синтез какого-то промежуточного метаболита, способного выполнять функцию регулятора роста клеток. В этой связи з; служивают внимания полученные ранее данные, согласно которым облучение дрожжевых клеток УФ-светом области 300-380 нм приводит в последу) кий темновой период (2ч) к активации ферментативного синтеза серотонина из триптофана и к повышению его эндогенной концентрации (Гончаренко с соавт.-, 1930; Страховская с соавт., 1982). Процесс бло

кируется парахлсрбенилаланином (ингибитор фермента триптофанпжрокси-пазы), в присутствии которого содержание б клетках серотонина снижается .

Результаты опытов по влиянию пграхлорфенилаланина на проявление эффекта фотостимуляции размножения клеток приведены на рис. 5. Как видно, в присутствии ингибитора синтеза серотонина этот эффект исчезает. Установленный факт позволяет предположить, что активным метаболитом, участвующим в реализации стимулирующего действия УФ-света, является серотонин. Регулятсрная роль серотонина, зависящая от его внутриклеточной концентрации, подтверждается эксперимента:^ с необученными клеткам:. Было исследовано влияние на рост дрожжей двух ингибиторов ферментов, участвующих в метаболизме серотонина, парахлорфе-нилаланина и пиразидола. Последний является ингибитором фермента (моноакинооксидаза), катализирующего окислительное дезаминирование серотонина. Установлено, что в результате предварительной инкубации клеток с п;~ = зидслок, следствием чего может быть увеличение концентрации эндогенного серотонина, наблюдается стимуляция размножения дрожжей. 3 то ке время инкубация с парахлорфенилаламином, приводящая к уменьзению ссдержания серотонина в клетках, вызывает замедление скорости их размножения. Таким образом, ингибиторы, противоположно влияющие на концентрацию эндогенного серотонина, оказывают противоположное действие и ка скорость размножения клеток.

Были получена данные по влияние экзогенного серотонина ка рост дрожжевых клеток. Показано, что зависимость стимулирующего действия серотонина от концентрации (5-10"е - 5-10"'' К) имеет характер, сходный с зависимостью эффекта фотостимуляции от дозы УФ-СЕета. Этот факт служит еще едким указанием на связь фотостимуляции роста дрожжей с УС— индуцированным синтезом серотонина.

3. Активирующее действие УФ-света ка ферментативное превращение 5-о:-:ситрпптофака Е серстокнн

Ранее было установлено, что ингибиторы белкового синтеза (дуро:-;::-цин и цпклсгексимнд) ке влияют на фотсиндуцированный синтез серотонина в дрожжевых клетках (Фрайкин, 1S88). На основании этих данных предполагалось, что У^-индушгрованкое образование серотонина в клетках является следствием прямой фотоактивации ферментов, участвующих в синтезе серстонмка ;трилссфакгпдроксп.-аза, 5-су.ситриптофан декарбоксп.-а-за,' , а не УФ-ик—/ц^овакним синтезом их бе nove. Е исследованиях, проведенных Гс:-:чаре:-.:-:о с соавт. (15 = 1), была показана ¿отоаг.тпэац;:.-с-ермента гид-сксилазк. Ki: постав::.-;: перед собсй цель иссле-

довать влияние '.-"Г-света на активность фермента декарбоксилазы, кстс-ры:": катализирует геаг.ц:::-; превращения г-ог.ептрпптофака в серсток:::-:.

Результаты изучения действия длинноволнового УФ-света на реакцию декарбоксилирования 5-окситриптофана в дрожжевых экстрактах представлены на рис. 1. Как видно, кривые, полученные при трех интенсивностях длинноволнового УФ-излучения, имеют аналогичный характер: с ростом дозы облучения вначале наблюдается эффект фотоактивации декарбоксилаз-ной реакции, достигающий максимального значения при определенной дозе (~0,6-0,8 кДж/мг) , а затем его уменьшение с последующим переходом в эффект фотоингибирования.

По-видимому, форма кривых отражает наложение двух противоположных фотоиндуцированных процессов - активации реакции ферментативного декарбоксилирования 5-окситриптофана и ингибирование этой реакции. Из рис. 7 следует, что фотоингибирование ферментативной активности слабее выражено при меньших интенсивностях длинноволнового УФ-излучения, в связи с чем при этих интенсивностях удается наблюдать ббльшие по величине эффекты фотоактивации декарбоксилазной реакции.

Фотоактивацию реакции декарбоксилирования 5-окситриптофана наблюдали в экстрактах с рН 6,7, при котором фермент характеризуется низкой активностью в темноте. Важно было выяснить, в какой степени эффект фотоактивации будет проявляться в экстрактах с более кислыми рН, при которых активность декарбоксилазы в темноте выше. Проведенные эксперимент«.. показали, что с уменьшением рН экстракта эффект фотоактивации уменьшается и практически исчезает при значениях рН 5,5-5,8, при которых скорость декарбоксилазной реакции в темноте максимальна.

Таким образом, активирующее действие длинноволнового УФ-света на реакцию декарбоксилирования 5-окситриптофана проявляется в том случае, если значение рН среды сдвинуто в нейтральную область. Поскольку значение рН дрожжевого экстракта, измеренное нами в отсутствие буфера, составляет 6,6, наиболее вероятно, что фермент, катализирующий реакцию декарбоксилирования 5-окситриптофана, малоактивен в темноте и, следовательно, может быть активирован при облучении клеток длинноволновым УФ-светом. Очевидно, именно этим объясняется упомянутый выше факт фотоактивации синтеза серотонина в дрожжевых клетках под действием длинноволнового УФ-света (334 нм).

Согласно имеющимся в литературе данным, при фотоактивации ферментативных систем в качестве фотоактивных хромофоров ферментов могут выступать как их кофакторы, так и другие соединения, которые с каталитической активностью фермента непосредственно не связаны (Крицкий, 1986; Hug,. Hunter, 1991).

.¡v----

ЭОО 350 400

Длина волны, нм

Рис. 6. Спектр действия фотостимуяяюти роста клеток. За единицу эффективности принята величина, обратная дозе УФ-света 334 км, вызывающая эффект фотостимуляции в 1,3 5 раза

ДСа/До

Д103, Дж/м2

Рис. 7. Зависимости эффекта действия света кг декарбоксилазную реакцию от дозы длинноволнового УФ-облучекия (337 нм) экстракта (рН 6,7) при различных '.с-гтенсивнсстях излучения: 1 - 150, 2-75, 3-50 Зт/м2. За величину эффекта принято отношение уменьшения концентрации 5-окситр:дтто6ана в облученных (Дса) и несблучекных (До) пробах через 30 кик инкубации при 37&С.

Известно, что у ферментов, обладающих декарбоксилазной активностью, кофактором является пнрпдоксальфосфат, причем в зависимости от рН среды он может находится либо в виде внутримолекулярного альдимина с Е-аминогруппой лкзинового остатка белковой части фермента (шиффово основание). либо в виде замененного альдамика (аддукт шиффова основания с соседним гистидиновым остатком белка-X):

белок

белок

HN X

Чн-7 -0^,1 сн,ого,н-

рН<6.0^. -<-рН>6.0

•к н/\

хн

сн

ЧД/СН=0Р01Н"

н,с

/ N

н*

н,с

/

N

н*

Это в свою очередь обусловливает различия в спектрах поглощения соответствующих форм фермента, сдна из которых (активная) имеет мако' мум в области 410-430 км, а другая (неактивная) - в области 33034 0 нм. Переход фермента из неактивной формы в активную при сдвиге рН е кислу™'-Сласть связан с диссоциацией аддукта, образованием пиффова основания пиридоксальфосоата к протежированного гистидинового остатка.

Исходя из изложенного, а также учитывая полученные нами данные о зависимости эффекта фотоактиваиик дрожжевой декарбоксилазы от рК среды, можно предположить, что роль фотоактивкого хромофора в ней при действии длинноволнового УФ-света (337 нм) выполняет пиридоксальфос-фат в виде замещенного альдакина (аддукт!. А механизм фотоактивацли может заключаться ъ фотс-диссоциаавд: аддухта при поглощении света (337 нм) хромофором в неактивной форме фермента с образованием шиффе-ва основания ппридоксальфосфата, характерного для активной формы фер мента.

ЗАКЛВЧЕНИЕ

Из полученных б работе данных о повреждающем действии Бг:дикого света (400-600 нм) на дрожжевые клетки следует, что главной мишенью при ку. фотоинактивацик, происходящей с участием эндогенного сексибп" затсра, является плазматическая мембрана. Установленная близкая корреляция между дозоеыкп зависимостями гибели клеток к их окрашивания флусрохромом пр:с-г/л::ком вследствие фотоиндуиироБанногс изменения пр. нпцаемсстп плазматических кекбрак служит основанием для утверждения что нарушение барьерной функции этих структур - основная причина фот

шактивации дрожжей. Также можно полагать, учитывая данные литературы ¡Черницкий, Воробей, 1988), что в основе деструкции барьеров мембран-юй проницаемости лежат процессы фотосенсибилизированного ПОЛ.

Наши данные по интенсификации ПОЛ при замене Н20 на Д20 и его инги->ировании азидом натрия можно рассматривать как указание на важную >оль синглетного кислорода в качестве инициатора фотоохисяительных ре-1кций в липидных компонентах плазматических мембран. Если учесть, что ютогенерация в изолированных плазматических мембранах нами не арегистрирована, то можно считать, что этот кислородный радикал не чавствует в их фотосенскбилизированном повреждении. Маловероятно потому участие в фотосенсибилизированном процессе и более реакционно-пособного гидроксилыюго радикала ОН, который может образовываться з в катализируемых железом реакциях Хабера-Вайса (Girotti, 990). По-видимому, определенную роль в этом процессе играют фотосен-ибилизированные реакции типа I (см. выше). На основании зарегистриро-анного методом ЭПР ограничения подвижности спинового зонда (5-доксил-альмитат) в облученных видимым светом плазматических мембранах можно читать, что одним из важных следствий протекания ПОЛ является увели-ение вязкости липидной фазы мембраны. Помимо окисления липидов синг-етный кислород способен с высокими константами скорости (109 - _ ...

З10 М"1с"1) взаимодействовать с аминокислотными остатками мембранных елков (Красновский, 1988), вызывая нарушение их функций, что также эжет вносить вклад в повреждающие эффекты видимого света.

Согласно результатам, полученным при измерении флуоресценции тазматических мембран дрожжей, в них содержится один компонент, флуо-зсцирующий в видимой области (при 650 нм) , причем в спектре возбужде-гя его флуоресценции представлены максимумы, характерные для порфири-звых соединений. Спектр поглощения данного компонента в хлороформе, зторый также типичен для порфиринов, обнаруживает близкое сходство > спектром действия фотоинактивации клеток. Это позволяет считать, чо локализованное в плазматической мембране соединение порфириновой >ироды является основным фотосенсибилизатором при повреждающем дей-■вии видимого света на дрожжевые клетки.

Заслуживает внз:мания фотосинергический летальный эффект, обнаруживай нами при исследовании комбинированного (совместного! действия I клетки видимого света г: длинноволновых УФ-лучей (337, 365 нм). Вы-¡ление таких синергическ::х взаимодействий представляет интерес в эко->гическом аспекте. Очевг:;но, что длинноволновый УФ- и видимый свет, смотря на относительно к::зкуя (по сравнению со средневолновым УФ-из-чением) эффективность повреждающего действия, являются значительно лее активными факторам:: среди, чем было принято считать до сих пор,

во-первых, из-за взаимоусиления индуцируемых этими компонентами солнечной радиации деструктивных процессов в клетках и, во-вторых, в силу их доминирования на поверхности Земли.

При исследовании действия на дрожжи низкоинтенсивного монохроматического УФ-света в области 280-380 нм нами показана принципиальная возможность направленного регулирования роста клеток оптическим излучением данного, спектрального диапазона— Особенность фотостимулирующе' го эффекта заключается в наличии температурозависимого латентного периода, во время которого происходит УФ-индуцированный ферментативный синтез серотонина, обнаружившего способность регулировать скорость размножения клеток. Результаты модельных экспериментов с дрожжевыми экстрактами свидетельствуют, что механизм УФ-индуцированной стимуляции образования серотонина включает фотомодуляцию активности декар-боксилазы - одного из ферментов, участвующих в его синтезе. в этих же опытах получены данные, позволяющие считать, что первичным хромофоро: при фотоактивации декарбоксилазы является ее кофактор - пиридоксаль-фосфат в форме аддукта, поглощающего в области 330-340 нм. Процесс фс томодуляции ферментативной активности, сопровождающийся активацией синтеза серотонина, можно рассматривать как важный механизм фотореце дай и трансдукции светового сигнала при УФ-цндуцированной регуляции роста клеток.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. При исследовании повреждающего действия видимого света (400600 нм) на клетки дрожжей установлено, что их инактивация осуществля ется по фотодинамическому механизму с участием эндогенного сенсибшн затора, связанного с плазматической мембраной. По своим спектральньп характеристикам фотосенсибилизатор может быть отнесен к порфиринам.

2. Основной мишенью при летальном действии видимого света на кл« ки является плазматическая мембрана, фотосенсибилизированные реакци в которой приводят к деструкции барьеров ее проницаемости.

3. В инициации фотосенсибилизированных процессов перекисного окисления липидов в плазматических мембранах важная роль принадлежи синглетному кислороду.

4. При исследовании комбинированного (совместного) действия на клетки дрожжей видимого света и длинноволновых УФ-лучей (337, 365 н обнаружен фотосинергический летальный эффект. Предположено, что в с нове фотосинергизма лежит взаимоусиление фотосенсибилизированных д< структивных процессов, протекающих в разных внутриклеточных структ} pax.

5. Найдены режимы облучения, при которых низкоинтенсивный моно хроматический УФ-свет в области 280-380 нм оказывает регуляторное влияние на рост дрожжевых клеток.

6. Эффект фотостимуляции размножения клеток связан с УФ-индуииро-нным синтезом серотонина, обнаружившего способность выполнять функ-ю регулятора роста клеток. На основе этого свойства серотонина раз-ботан новый способ выращивания промышленных штаммов дрожжей.

7. Механизм фоторецепции и трансдукции сигнала при регуляторном йствии УФ-света включает фотомодуляцию ферментативной активности, провождающуюся активацией синтеза серотонина.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Фрайкин Г.Я., Беленикина Н.С., Поспелов М.Е., Тимофеев К.Н. Исследование роли активированных форм кислорода в фотоинактивации

дрожжевых клеток видимым светом. //Биофизика. 1987. Т.32.til

С.42-45.

2. Беленикина Н.С., Фрайкин Г.Я. Эффект фотосивергизма при дейст-ш длинноволнового Уф-излучения и видимого света на клетки дрожжей. 'Биофизика. 1989. T.34.R4 С.627-629.

3. Страховская М.Г., Иванова Э.В., Беленикина Н.С., Фрайкин Г.fi. этоактивация ферментативного синтеза серотонина из 5-окситриптофана экстрактах дрожжей. //Биол. науки. 1989. til С. 42-45.

4. Беленикина Н.С., Кирпичникова H.A., Фрайкин Г.Я. Фотосинерги-5ский летальный эффект при облучении дрожжей длинноволновым ультра-юлетовым и видимым светом. //Биол. науки. 1990. №3 С.42-46.

5. Беленикина Н.С., Страховская М.Г., Фрайкин Г.Я. Активирующее гйствие лазерного ультрафиолетового излучения на рост дрожжевых кле-ж. //Биофизика. 1990. Т.35.П4 С.618-620.

6. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Рубин А.Б. тособ выращивания дрожжей. Агторское свидетельство К1544796. //Бюл-;тень «Открытия. Изобретения.» 1990. №7 С.156.

7. Беленикина К. С., Кхгрпичвикова H.A., Тимофеев К.Н. , Фрайкин

.Я. Фотоокисление лппидов в плазматических мембранах дрожжей под дей-гаием видимого света.' //Биофизика. 1991. Т.36.114 С.599-602.

8. Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Фрайкин Г.Я. Активация роса дрожжей под действием ультрафиолетового света области 280-380 нм. /Микробиология. 1991. T.60.îi2 С.292-297.

9. Belenikina U.S., Strakhovskaya M.G., Fraikin G.Ya. Near-UV ctivation of yeast growth. //J.Photochem. Photobicl. В:Biol. 1991. .10 Iil-2 P.51-55.

Типаж 50 экэ.