Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках"

МНО "ФОРУМ" АГЕНСТВО БИОИИОРМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

на правах рукописи УДК 577. 3

Искаков Алмаз Айгпаевич МЕХАНИЗМ ГИБЕЛИ СВОБОДИОРАДИКАЛЫШХ СОСТОЯНИЙ В БЕЛКАХ

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1993

Работа выполнена б Ордена Ленина Институте Химической Зизики им. К а Семенова Российской Академии Наук

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор К. М. Львов

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В. Е, Холмогоров

доктор физико-математических наук О. А. Ким

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "3.^" декабря 1993 года в "/6" часов на заседании Специализированного Совета Д. 170. 01.01 при Агенстве биоинформагики и экологии человека МНО "Форум" по адресу 117807, Москва, ГСП-7, проспект 60-летия Октября 7/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агенства биоинформатики и экологии человека.

Автореферат разослан ноября 1993 г.

Ученый секретарь Специализировпнного Совета доктор биологических наук, профессор

Львов К. М.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Знание полной схемы деструкции биополимеров, подвергнутых различным вадчм деетруктирундах воздействий (облучение УФ светом, действие ¡р - радиации, механическая деструкция и т.д.), позволит понять те следствия, к которым приводит изменение структуры биополимера в процессе деструкции, к важнейшим классам биополимеров относятся белки, выполняющие разнообразные биологические функции. В настоящее время подробно исследована природа макрорадикалов в различных белках, их фото- и т^рмор^нкции, некоторые характеристики возникающих макрорадикалов. Установлены основньр закономерности кинетики реакции гибели макрорадикалов в белках. Исследован отжиг радикалов в глобулярных и фибриллярных белках. Однако остается открытым вопрос,каким образом происходит гибель свободнорадикальных состояний в белках, каков механизм этого процесса. Данная проблема актуальна и в том плане, что она завершает направление фундаментальных исследований свободнорадикальных состояний и их реакций, протекающих в аминокислотах, пептидах и белках при фотолиза, при действии УФ- и ¿"-радиации, механической деструкции, в некоторых биохимических реакциях и т. д. , проводившихся с конца 50-х годов как отечественными, так и зарубежными исследователями. В наши дни данная проблема тесно связана также с проблемами экологии, имеющими первостепенную важность для человеческой цивилизации. В частности, большое внимание привлекают вопросы выработки методов эффективной зашиты белковых структур от внешних излучений и факторов загрязнения окружающей среды, действию которых в живом организме подвергаются в частности и белковые молекулы, входящие в состав клеток. Таким образом, установление механизма гибели свободнорадикальных состояний в белках позволит создать це-

лостную картину механизма деструкции белков, протекающей под действием различных деструкгирующих факторов. Эта задача становится особенно актуальной в наши дни в связи с угрозой экологического кризиса.

Цель и основные задачи работы. Целью настоящей работы явилось установление механизма гибели свободных макрорадикалов в белках, подвергнутых при 77К УФ облучению. Для этого были поставлены следующие задачи:

--анализ природы макрорадикалов, непосредственно участвующих в реакции гибели.

--анализ всех экспериментально установленных закономерностей процесса гибели свободных макрорадикалов в белках для более глубокого понимания механизма гибели.

--анализ различных представлений о механизмах гибели свободных макрорадикалов в полимерах и белках.

--формулировка механизма гибели свободных макрорадикалов в белках, объясняющий все экспериментальные закономерности процесса гибели.

--экспериментальное и теоретическое обоснование механизма гибели макрорадикалов в белках.

—объяснение на основе предложенного механизма гибели влияния вторичной структуры и воды на кинетику гибели и термостабильность макрорадикалов в белках.

--определение эффективных значений энергии активации, предъэкс-поненциального множителя ступенчатой реакции гибели свободных макрорадикалов в белках.

—анализ механизма ступенчатости реакции гибели макрорадикалов в белках.

Научная новизна Предложен механизм гибели свободных макроради-

сало в в белках, подвергнутых при 77К УФ облучению. Проведено экспериментальное и теоретическое исследование механизма гибели. Установлен механизм влияния вторичной структуры и воды на скорость гибели мак-гарадикалов и термостабильность макрорадикалов в белках, влияния мо-текулярной подвижности белковой матрицы на потенциальный барьер ре-подии гибели макрорадикалов в белках. В рамках модели полихронной ки-1етики получены значения эффективной энергии активации и предъэкспо-^нциального множителя в ступенчатых реакциях гибели макрорадикалов з белках, предложен механизм ступенчатости реакции гибели макроради-<алов в белках.

Практическая значимость работы. Результаты данного исследования позволят представить общую картину механизма деструкции белков при действии различных деструкторующих факторов, встречающихся и в естественных условиях, глубже понять следствия, к которым приводит такая деструкция белков в составе клеток. Конечным фактом деструкции белков является образование устойчивых состояний с сопряженной 77-системой, стабильных к действию внешних воздействий. Возможно, что этот факт внес определенный вклад в отбор и закрепление в процессе эволюции делокализованных состояний, играющих, как известно, огромную роль в живых системах. Результаты этой работц могут быть полезны при рассмотрении биохимических реакций с участием белков, протекающих через образование свободнорадикальных состояний, при создании методов защиты белковых структур от внешних воздействий, в различных прикладных исследованиях^ связанных с изучением свободнорадикальных состояний белков и их реакций.

Главные положения, выносимые на защиту:

—предложен механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках в отсутствии кислорода, в которых парамагнитные центры были

• - 4 -

индуцировании при 77К УФ облучением.

--проведено экспериментальное и теоретическое исследование реакции гибели макрорадикалов в белках и модельных системах в связи с предложенным механизмом гибели.

Аппробация работы и публикации. Результаты работы обсувдались на научных семинарах лаболатории Радиоспектроскопии Отдела кинетики химических и биологических процессов ИХФ РАН, на меклаболаторных семинарах. Основные результаты диссертации докладывались таюке на XI Всесоюзном Совещании "Механизм и кинетика химических реакций в твердом теле" (Минск, 1992).

По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы в журнале "Биофизика" и тезисы доклада к вышеупомянутой конференции.

Механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках

Группы с неспаренным электроном, появляющиеся в белках при действии различных деструктирукщих факторов, обычно называю! свободными макрорадикалами или просто радикалами. При обсуждении вопроса о механизме гибели свободных макрорадикалов в белках мы будем опираться на многочисленные данные, полученные для УФ-облученных белков. Сформулируем основные положения, на которых базируется предлагаемый механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках.

1. Какие именно радикалы участвуют в реакции гибели?Известно, что при действии УФ-излучения на белки при 77К происходит ионизация ароматических аминокислотных остатков с образованием катион-макрорадикалов и э«актированных электронов. Электроны после термолизации захватываются разными группами молекулы белка с образованием анион-макрорадикалов. Анион-радикалы в фото- и термореакциях трансформи-

руются в концевые радикалы,образующиеся при разрыве пептидной цепи. И, наконец, последние при повышении температуры отрывают атом водорода от С^-атома соседнего участка пептидной цепи, что приводит к возникновению серединных макрорадикалов -N11-6^13-00-. Такого же типа макрорадикалы возникают в фото- и термореакциях при ^-облучении сухих белков и механической деструкции. Дальнейшее повышение температуры приводит к гибели серединных радикалов, при этом образования радикалов других типов не наблюдается. Реакции катион-макрорадикалов исследованы не достаточно подробно, однако было показано, что после реакции депротонирования они превращаются в нейтральные макрорадикалы. Итак, мы будем исходить из того, что в отсутствии кислорода в УФ-облученннх при 77К белках, не имеющих в своем составе серосодержащих аминокислотных остатков, в реакции гибели участвуют серединные макрорадикалы и макрорадикалы ароматических аминокислотных остатков.

2. Для правильного понимания механизма гибели радикалов в белках

важным является вопрос об их концентрации и взаимной локализации в

белковых макромолекулах. Известно, что в крупных белковых агрегатах,

облученных УФ светом при 77К, предельная концентрация макрорадикалов /з

составляет 10 на грамм сухого белка, что соответствует двум радикалам или одной ионизации на молекулярную массу 120 кДа. Полипептидная

л

о

цепь с такой массой укладывается в сфере с радиусом Г?-34 А. В сухих белках с малой массой М*15 кДа (РНКаза, лизоцим, гистоны) одна ионизация происходит на комплекс из 8-9 молекул. Таким образом, среднее

расстояние между парами макрорадикалов, каждая из которых образова-

о

лась при одной ионизации, составляет 68 А. Расстояние между макрорадикалами в парах, видимо, меньше.

3. Многочисленными экспериментами было показано, что кинетика реакции гибели макрорадикалов, УФ-индуцированных в белках, определя-

ется вторичной структурой бедка. Влияние структур других уровней не наблюдается. Было установлено, что в сухих белках и в замороженных водных растворов белков константа скорости гибели макрорадикалов, локализованных в Ы-спирали, в ^-структуре или в спирали коллагена, на два порядка больше, чем в участках пептидной цепи, не имеющих регулярной упаковки. При этом всегда формально вычисленная доля радикалов, связанных с той или иной вторичной структурой, равна доле пептидной цепи в этой структуре. Такое соответствие между кинетикой и вторичной структурой будет выполняться, если предположить, что свободные радикалы распределены "равномерно" по вторичной структуре белка.Распределение радикалов ароматики заведомо неравномерное, т.к. оно определяется распределением остатков ароматических аминокислот, которое сильно варьирует для разных белков. Ярким примером является коллаген, в котором все остатки ароматики сосредоточены в концевых пептидах, не входящих в тройную спираль и составляклцих всего 4 % от общей массы молекулы. В то же время радикалы этих остатков в облученном белке составляют половину всех радикалов. Напротив, анион-радикалы, видимо, распределяются "равномерно". Действительно, захват электрона является случайным событием и происходит с равной вероятностью в разных участках вторичной структуры белковой цепи. Другими словами, вероятность захвата электрона какой-либо акцепторной группой в молекуле белка не зависит от того, с какой вторичной структурой, регулярной или нерегулярной, связана эта группа Это приводит к "равномерному" распределению захваченных электронов по вторичной структуре. В этом случае вероятность образования анион-радикалов, например, в <з( -спиральных участках глобулярных белков, равна степени о(-спиральности белка, т.е. будет определяться только долей цепи, входящей в о(-спираль. Следовательно, если в процессе гибели свобод-

ных макрорадикалов в бедках лимитирующей стадией является трансформация серединных макрорадикалов, образующихся в фото- и термореакциях первичных анион-макрорадикалон, т<> Оудет наблюдаться соответствие между кинетикой гибели и вторичной 'труктугой белка.

4. Реакция гибели радикалов в бчлках протекает как реакция в твердой фазе. Особенностью твердофазных реакций является определяющее влияние на кинетику реакции свойств окружающей матрицы. Малая величина температурного коэффициента реакции гибели макрорадикалов в белках показывает, что определяющим в цепи их трансформации является физический процесс, что представляется естественным для реакций в твердой фазе.

Совокупность всех изложенных выше экспериментальных фактов позволяет сформулировать гипотезу механизма гибели свободных макрорадикалов в белках. Отрыв атома водорода от С^-атома при образовании серединного радикала приводит при низкой температуре к образованию конформационно-напряженного состояния серединного макрорадикала с повышенной свободной конфирмационной -п^рги-й. При повышении температуры с^р^динный макр^раликнл и ''•лижайпк-и окруянни^ должны структурно перестраиваться. Эта ¡^¡^стройки ькличант, по- видимому, несколько этапов. Сначала тетраэдрическая структура связей С^-атома пе-

з

реходит в тригональную. При этом зр -гибридизация связей С^атома пе-2

реходит в эр -гибридизацию. Затем в ходе перестройки происходит поворот С«<-атома в положение, когда его 2р -орбиталь становится параллельной 2р -орбитали атома N. что приведет к делокализации неспарен-ного электрона в ^"-систему плоской пептидной группы. Этот переход может вызвать перестройку связей И-атома. Б ходе этой перестройки звязь с атомом водорода ослабляется и он успевает уйти от И-атома [реакция 1).Освободившийся атом Н эффективно рекомбинирует с ближай-

шим нейтральным радикалом ароматического аминокислотного остатка?реакция 2).

H

I

/ ^с/ - ^ Ч/ + H (1)

I I

R «

- H + -Trp- —» -TrpH- (2)

Перестройка структуры связей С^-и N-атомов требует, чтобы существовала достаточная подвижность белковой цепи в районе серединного макрорадикала. В предлагаемом механизме гибели определяющую роль играет физический процесс-изменение структуры белковой цепи в районе Св(-атома. Следовательно, в этой модели температурный коэффициент реакции гибели должен иметь малую величину, что и наблюдается в эксперименте. Реакция (1) протекает гораздо медленнее, чем реакция (Р.), т. к. ее скорость определяется скоростью структурных перестроек в макромолекуле белка, а атом H отличается высокой мобильностью даже при низких температурах.Гибель радикалов в белках, подвергнутых при 77R УФ облучению, jp-радиации и механической деструкции протекает по одинаковому механизму. На это указывает совпадение кривых отжига макрорадикалов, индуцированных в одниих и тех же белках разными способами. В этом случае механизм трансформации серединных радикалов будет одинаковым для радикалов, индуцированных в белке разными способами. Однако реакции атомов H будут отличаться. В случае ^-облучения и механической деструкции атомы H реагируют, в основном, друг с другом.

Трансформация серединных макрорадикалов -НН-СР-СО- в белках

В серединных макрорадикалах в белках гибридизация С^-атома после

г г

отрыва атома водорода становится ближе к зр , чем к эр при темпера-

2

туре образования серединных радикалов Т=>160-220К. Переход в эр -гибридизацию осуществляется в результате' поворота боковой (?-группы за времена порядка времен корреляций тепловых колебаний боковых групп. Спиновая плотность неспаренного электрона, в основном, локализуется на 2р-орбитали С^-атома, перпендикулярной плоскости радикального фрагмента М-С^И-С. Белковые макромолекулы являются существенно гетерогенными системами. Б результате множества отдельных актов тепловых конформационных движений плоскость радикального фрагмента М-С^-С может оказаться в плоскости соседней пептидной группы №- или С-конца(3,4). Действительно, элементарные информационные перестройки в белках после химического возмущения (в данном случае химическим возмущением является образование парамагнитных центров в структуре белка) при размораживании молекулярной подвижности происходят по выделенным, кинетически доступным степеням свободы, которые задаются самой белковой структурой (концепция "белок-машина").При этом коллективные движения отдельных фрагментов в модифицированной белковой молекуле по выделенным степеням свободы, в отличие от белков в обычном, "невозмущенном" состоянии, могут происходить на расстояния, значительно превышающие амплитуды колебаний атомов. Важной является также степень корреляции флуктуаций. Вследствие резкого различия по порядку величины времен конформационной и электронно-колебательной релаксации така!я структура фиксируетс!я в конформации белковой молекулы. При этом 2р-орбиталь С*-атома окажется параллельной 2р-орбита-лям атомов С,0 и N плоской пептидной группы, образующих 7Г~систему.

Неспаренный электрон, находившийся на 2р-орбитали С^-атома, делока-лизуется по сопряженной системе 7Г-связей пептидной группы. Возникающие обменные взаимодействия между неспаренным электроном, делокали-зованным в 7Г-системе соседней пептидной группы, с 4 -электронами связи И-Н й ?Г-электронами пептидной группы приводят к некоторому распариванию электронов в парах и локализации их на пространственно равных МО, на которых при этом в-соответствии с правилом Гунда появляются атомные спиновые заселенности с разными знаками. На атоме водорода появляется заметная спиновая плотность неспаренного электрона, связь N-11 сильно ослабляется и становится возможной ее диссоциа-ция(3,4). Делокализация неспаренного электрона по системе ^Г-связей и отрыв атома водорода происходят, по-видимому, в едином акте. Спектр ЭПР атомарного водорода в эксперименте не наблюдается вследствие его высокой подвижности и химической активности при температуре гибели макрорадикалов. После ухода атома водорода на участке белковой

цепи образуется нерадикальная ТГ-сопряженная структура(3,4).

Н

I

I: I I: I

Ой О И

\ ^ I I

¡;

\

+ н

(4)

- и -

Видимо, есть вероятность сопряжения через С^-атом в тригональной конфигурации двух соседних пептидных групп:

О НО

Важную роль в процессе гибели макрорадикалов в белках согласно предложенному механизму трансформации серединных макрорадикалов должны играть энтропийные взаимодействия. Рассмотренный механизм представляет собой цепь сопряженных друг с другом электронных и конформацион-ных перестроек (электронно-конформационных взаимодействий).

¡V

Некоторые следствия из модели трансформации серединных макрора

дикалов в белках

1. Механизм влияния молекулярной подвижности белковой матрицы на потенциальный барьер реакции гибели макрорадикалов в белках. Подс-гройка плоскости С^-атома в плоскость соседней пептидной группы при-зодит к образованию 7Г-сопряженной структуры. Такая структура фиксируется в конформации белковой макромолекулы. Ее образование является случайным событием, т. к. осуществляется в результате тепловых флуктуация белковой цепи. Вследствие этого возникающая макромолекулярная информация может значительно отклоняться от статистически наиболее ¡ероятной при данной температуре конформации белковой цепи, обладаю-1ей минимумом свободной информационной энергии (для которой среднее склонение координат атомов при флуктуациях от положения равновесия >авно нулю). В этом случае, по-видимому, реакция гибели макрорадика-

лов в белках будет протекать по более высокому профилю свободной конформационной энергии и потенциальный барьер реакции может быть большим. Это подтверждается расчетами эффективной энергии активации реакции гибели макрорадикалов в белках, выполненных нами в формализме рекомбинационно-кинетического метода (ср.ниже).Так, для сухожилий с малой влажностью (15 %), 80 X которых составляет коллаген типа I, в области Т=313-373К было получено широкое распределение по Еэфф от Ешт=0 до Етах-33 ккал»моль'. В этом случае вся вода является связанной водой! Вода оказывает влияние на конформационную подвижность белков. Неравномерное распределение молекул связанной воды в коллагене при малой влажности обусловливает разную конформационную подвижность в разных участках белковой цепи молекулы коллагена. Это приводит к наблюдаемому распределению радикалов по высоте потенциального барьера реакции гибели, т.е. по Еэфф.В водном растворе белка, когда присутствуют все фракции воды, включая и свободную воду, конформацион-ная подвижность в разных участках будет одинакова. В этом случае распределение радикалов по высоте барьера, т. е. по Еэфф, будет отсутствовать. Действительно, как показали расчеты, в коллагене сухожилий с большой влажностью (80 %). Еэфф-1 ккал-моль при Т-193-233К и Еэфф=2 ккал» моль'при Т-233-253К и постоянна во всем диапазоне отжига. Вода повышает конформационную подвижность белков и это приводит к уменьшению высоты барьера, а, следовательно, и Еэфф.

2. Механизм влияния вторичной структуры белка на скорость гибели макрорадикалов в белках. Скорость гибели определяется скоростью структурной перестройки, протекающей с существенно разными скоростями в регулярной и нерегулярной вторичной структуре белка. Разная скорость структурной перестройки , приводящей к возможности осуществления перестройки химических связей в локальной • окрестности парамаг-

нитного центра, обусловлена разной степенью скоррелированности отдельных конформационных движений при тепловых флуктуациях белковой цепи в регулярной и нерегулярной вторичной структуре белка, что, в свою очередь, обусловлено разным характером пространственной упаковки пептидной цепи в этих вторичных структурах. В терминах теории случайных процессов флуктуации конформационного поля И( (:) происходят с разными временами корреляции в регулярной и нерегулярной вторичной структуре белка. В водных растворах глобулярных белков размораживание подвижности свободной воды при фазовом переходе приводит к резкому изменению времени корреляции конформационных флуктуаций (на 4-5 порядков) в неспирализованных областях глобулярных белков. Это приводит -с изменению на ту же величину скорости гибели радикалов, связанных с этими областями. В то же время скорость гибели в с(-спирали практически не изменяется. Следовательно, фазовый переход воды не влияет на степень корреляции при тепловых флуктуациях белковой цепи, упакован-•гой в о/-спираль.

3. Механизм ступенчатости реакции гиОди мак[ »'радикалов в белках. В рамках данной модели главным условием, приводящим к гибели макрорадикала, является образование сопряженной структуры о делокализо-)анным неепаренным электроном в результате тепловых конформационных хлуктуаций белковой цепи. Если при данной температуре вероятность та-:ого события близка к нулю (в силу кинетической недостижимости), то [анный парамагнитный центр не участвует в реакции. При повышении тем-[ературы происходит размораживание молекулярных движений по выделенным, кинетически доступным степеням свободы.Вероятность возникнове-ия сопряженной структуры может стать отличной от нуля и парамагнит-ый центр, локализованный на соответствующем участке белковой цепи, ринимает участие в реакции гибели. Через определенное время (харак-

терное время реакции при Т-сопбЬ) все подобные парамагнитные центры прореагируют. Наступает кинетическая остановка реакции. При последующем повышении температуры в реакцию вступают новые перамагнитные центры и т.-д.

Влияние вторичной структуры белка и воды на термостабильность макрорадикалов в белках

Процесс гибели макрорадикалов в белках в значительной мере определяется вторичной структурой белка и степенью его гидратации. В связи с этим нами изучалась зависимость термостабильности макрорадикалов в сухих белках и замороженных водных растворах белков от типа вторичной структуры белка.

Методика эксперимента. Были исследованы различные глобулярные и

фибриллярные белки. Образец с сухим белком или с водным раствором

-5" -4 2

белка (10 -10 М, 1,3 Н/м ,рН5-б) помешали в кварцевую трубку с внутренним диаметром 2 мм. УФ облучение производили при 77К сфокусированным светом ртутной лампы сверхвысокого давления ДРШ-500 через светофильтр У<К-1 (260-400 нм) и водный фильтр толщиной 80 мм. Для записи кинетики гибели парамагнитных центров при выбранной температуре образец выдерживали в специальном термостате с подогреваемой струей испаряющегося азота. Затем периодически прерывали отжиг радикалов при данной температуре и записывали при 77К спектр ЭПР. Таким образом получали кинетические кривые гибели радикалов во всем диапазоне отжига Анализируя кинетическую кривую, получали долю радикалов, участвующих в быстрой и медленной стадиях реакции гибели. Кривые отжига строили отдельно для радикалов, участвующих в быстрой и медленной реакциях гибели. При этом полное количество радикалов, участвующих в

этих реакциях, нормировалось к единиц». Таким образом были построены кривые отжига радикалов, связанных с разными типами вторичной структуры белков.

Результаты и обсуждение. На рис. 1 приведены кривые отжига макрорадикалов, связанных с разной по типу вторичной структурой белка. В разных вторичных структурах в реакции гибели участвуют макрорадикалы одной природы. Отжиг радикалов в регулярных вторичных структурах ( с(-спираль.^-структура, спираль коллагена) сухих белков протекает в разном темпрратурном диапазон^ (кривые 4,9.10). Так, для $3-структуры подвижность Фрагментов белковой ц^пи, необходимая для ооуществ-

Рис. 1. Белки в водном растворе: 1-спираль коллагена, 2-неспирали-зованная область глобулярных белков. 3- «/-спираль. Сухие белки: 4-о^-спи-раль, 5-фиброин шелка в глобулярной форме, б-аморфная часть фиброина щелка, 7-неспирализованная область коллагена, 8-неспирализованная область глобулярных белков, 9-спираль коллагена, 10-^-структура фиброина шелка.

ления структурной перестройки в районе серединного радикала, приводящей к освобождению атома водорода, может быть получена только при

температуре вше 60*0, тогда как для о4-спирали необходимая подвиж-

о

ность фрагментов достигается уже при температуре выше -60 С. Отжиг

радикалов в нерегулярных областях сухих глобулярных и фибриллярных

белков (кривые 5-8 ) протекает в одном температурной диапазоне. Вода

повышает конформационную подвижность белка и это, видимо, приводит к

выравниванию термостабильности макрорадикалов в разных вторичных

структурах в водных растворах белков. В этом случае отжиг радикалов

для всех вторичных структур (кривые 1-3) протекает в одной области

о

температуры и всегда заканчивается к О С. В соответствии с предложенным механизмом гибели макрорадикалов в белках сильное влияние вторичной структуры на термостабильность макрорадикалов в сухих белках определяется конформационной жесткостью этой вторичной структуры. В водных растворах белков влияние воды приводит к уменьшению конформационной жесткости и выравниванию конформационной жесткости разных вторичных структур. Это приводит к сдвигу кривых отжига для всех вторичных структур в низкотемпературную область. Из полученных результатов следует, что кривые отжига параллельны друг другу и ширина диапазона отжига во всех случаях одинакова. Это означает, что распределение состояний участков белковой цепи по энергии трансформации серединного макрорадикала одинаково для разных вторичных структур.

Восстановление люминесценции триптофана в модельных системах УФ-облученных при 77К водных растворов триптофана с алифатическими пептидами

Предлозкенный механизм гибели макрорадикалов в белках нуждается

в дальнейшей .экспериментальном исследовании. О этой целью были изучены реакции свободных радикалов в модельных системах водных растворов триптофана с алифатическими пептидами, УФ-облученных при 77R. Такие модельные системы были выбраны в связи с тем, что в отличие от белков в них удобнее наблюдать образование серединных радикалов, имеющих в этом случае характерный спектр ЭПР с разрешенной СТС.

Методика эксперимента. Были исследованы деухкомпонентные водные 2 -4

растворы (рН5, 1,3 Н/м ). Первый компонент- триптофан (10 М), в качестве второго компонента брались алифатические пептиды триглигли, -3 -I

алаглигли и глиала (10 -2«10N). Спектры ЭПР записывали при 77К на 3-х сантиметровом радиоспектрометре отражательного типа РЭ-1306. Для определения абсолютной концентрации свободных радикалов использовали эталонный образец моноокиси кремния. Отжиг образца производили в специальном термостате с подогреваемой струей испаряющегося азота.

Результаты и обсуждение. При достаточно большой концентрации алифатики основная доля эжектированных электронов, образовавшихся при фотоионизации остатков ароматики, захватывается молекулами алифатического пептида. Захват электрона аминогруппой -МН3 приводит к

»

дезаминированию и образованию концеЕого радикала типа CHR-C0-. Захват электрона карбонильной группой ^0-0 приводит к фотоиндуцированному

разрыву пептидной связи и образованию концевых радикалов типа »

-NH-CHR. При повышении температуры до Т>160К наблюдается реакция, в которой концевые радикалы отрывают атом водорода от С^-атома соседней молекулы с образованием радикалов типа серединных -NH-CR-C0-. При нагреве до Т>180К наблюдается гибель серединных радикалов.При этом образования парамагнитных центров других типов не наблюдалось. Согласно механизму гибели радикалов в белках радикал с неспаренным электроном на Сы-атоме претерпевает трансформацию, приводящую к ос-

вобовдению атома водорода. Атом водорода далее реагирует с радикалом триптофана и восстанавливает молекулу. Это приводит к восстановлению интенсивности люминесценции триптофана. Действительно, восстановление утерянной . в ходе УФ облучения при 77К люминесценции триптофана по мере отжига образца хорошо коррелирует с гибелью серединных радикалов (рис.2).

О -

-90 -70 -50 */С

-к -I

Рис. 2. Водный раствор триптофана (10 М) с глиала (10 М ), УФ- облученный при 77К. 1- кривая восстановления люминесценции триптофана 2- кривая гибели серединных радикалов.

Исследование свободнорадикальных реакций в белках рекомбинационно- кинетическим (РК) методом

Реакции гибели свободных макрорадикалов в белках являются ступенчатыми. Нами в рамках формализма РК метода была исследована медленная реакция гибели свободных радикалов, УФ-индуцированных при 77К в фиброине шелка и в коллагене сухожилий из хвоста крыс, взятых при

Аапр.мм

100

20

60

влажности 15 % и 80 %. Используемая методика не позволяет исследовать быструю фазу в реакции гибели.Волыни R0 % от сухого веса сухожилий составляет коллаген типа I, а ГО х приходится на долю других соединений. Все образцы откачаны. После регистрации спектра ЗПР наблюдали реакцию гибели радикалов, периодически помещая образец в соответствующий термостат на 5 мин и затем измеряли спектр при 77К. Реакцию проводили в течение 40 мин. Из модели полихронной кинетики следует, что если дисперсия константы скорости лимитирующей стадии обусловлена распределением реакционных центров по эффективной энергии активации Еэфф (или свободной энергии активации GaKT), то в случае прямоугольного распределения кинетические кривые спрямляются в координатах О -lrit, где Q ;п (Т)/п0-глубина превращения. Точки пересечения линий 9 -const с логарифмическими зависимостями определяют характеристические времена жизни макрорадикалов Ki-(o(t[)', где d =пв,если реакция в элементарной i-й "области", в пределах которой Kj-const,второго порядка, o^-l, рсли реакция первого п'ч'илкч. По данным точкам стро-

-I

1тся зависимости в арг^ниу^инских координчтчх lg1 <>т Т для разных степеней превращения Э .На рис.? (а.б,в) приведено семейство полученных таким образом аррениусовских зависимостей для сухого фиброина иелка и коллагена сухожилий. Значения эффективной энергии активации [Еэфф), определенные по наклону прямых в координатах lgt-Т .суммированы в табл. 1. Во всех случаях наблюдаются перегибы на аррениусовских зависимостях. В коллагене сухожилий с влажностью 15 % в области тем-1ературы Т-313-373К полихронность реакции гибели обусловлена распре-[елением одновременно по двум параметрам Еэфф и Коэфф, связанных юмпенсационной зависимостью. Так, распределение по Коэфф в области =313-373К лежит в пределах от Ко(0-1)~103с'до Ко(#-0)~10 с.'В ос-альных случаях полихронность реакции гибели обусловлена распределе-

¥ 2.4

2.0 1.6 1.2 0.6 0.4

- 20 -

¥

2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 Г*!«/

а) Фиброин шелка.

к*

1.5 1.1

0.7

0,3

3,6 3.2 2,6

2.4

2.0 1,6 1.2 0, в

2,4 2,6 2,8 3,0 Т-Ю

б) Коллаген сухожилий, влажность iS X..

——.—.—.—.—.—,—.—,—.—.—.—'—..I 1

3,9 4,1 4,3 4,5 4,7 4,9 5,1 Т-Ю

в) Коллаген сухожилий, влажность 80 %. Рис. 3. Аррениусовские зависимости для разных значений & : -1(0,8), 2(0,6), 3(0,4), 4(0,2); в- 1(0,7), 2.(0,5), 3(0,3).

- ?л -

Табл. 1. Эффективная энергия активации (ккал«моль') медленной реакции гибели макрорадикалов в фибриллярных белках.

1 1 Белок 1,0 0,8 0,7 т—л 10. б I 1 " 0, Г510,4 1 0,3 0,2 1 0,0|

| Фиброин шелка 1313-413 1 б б - 1 1 б 1 1 - 1 6 1 - б 6 I

1 1413-453 1 14 14 - ! |14 1 ! - |14 1 - 14 14 |

|Коллаген 1 1313-373 0 б - 1 |13 1 - ]20 - 27 33 |

(сухожилий, 1 1 1

1 1 1

|влажность 15% 1373-413 1 0 0 - 1 о 1 - | 0 1 - 0 0 1

¡Коллаген 1 1193-233 1 - 1 1 1 1 1 - 1 - 1 |

| сухожилий, 1 1 1

1 1 1

|влажность 1 80% 1233-253 1 2 - 2 1 2 I -1 2 2 I 1

тем по предъэкспоненциальному множителю. Например, для фиброина шел-а при Т=313-413К Но(0-1МО*с,' Ко(0-0)~1о'с~' а при Г-413-453К )(0-1МОГс \ Ко(0 =0)~10*с'.

Основные выводы

1. Предложен механизм гибели свободных макрорадикалов в белках, двергнутых при 77К УФ-облучению. Основным этапом в процессе гибели ляется электронно-конформационная трансформация серединных макро-аикалов. приводящая к освобождению атома водорода Ш-группы. Транс-

формация серединного макрорадикала в белках является сложным многостадийным процессом, скорость которого определяется скоростью структурной перестройки.

2. Получена хорошая корреляция между гибелью серединных радика-ло^-и восстановлением люминесценции триптофана.

3. На основе предложенного механизма гибели установлен механизм влияния вторичной структуры и воды на скорость гибели и термостабильность макрорадикалов в сухих белках и водных растворах белков.

4. Установлена связь между молекулярной подвижностью белковой матрицы и потенциальным барьером реакции гибели.

5. Предложен механизм ступенчатости реакции гибели макрорадикалов в белках, определены значения эффективной энергии активации, предъэкспоненциального множителя в ступенчатых реакциях гибели макроради^^алов в белках.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Львов K.M., Искаков A.A. Механизм гибели свободнорадикальных состояний в белках. //Биофизика. 1993. Т. 38. N 1. С. 7-11.

2. Львов К. М. , Искаков А. А. Исследование свободнорадикальных реакций в белках рекомбинационно-кинетическим методом. //Тезисы докл. XI Всесоюзного Совещания "Кинетика и механизм химических реакций в твердом теле". Минск. 1992. С. 205-207.

3. Львов К. М., Искаков А. А. Исследование свободнорадикальных реакций в белках рекомбинационно-кинетическим методом. //Биофизика. 1993. Т. 38. N 3. С. 411-416.

4. Львов К. М. ; Искаков А. А. Трансформация серединных макрорадикалов -NH-CR-C0- в белках. //Биофизика. 1994. Т. 39.№ I.

5. Львов К. М. , Искаков А. А. Влияние вторичной структуры и воды на термостабйльность свободных макрорадикалов в белках. //Биофизика. 1994. Т. 39. в печати.