Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли свободнорадикального окисления наранних стадиях катарактогенеза, индуцированного общим облучением организма.

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли свободнорадикального окисления наранних стадиях катарактогенеза, индуцированного общим облучением организма."



#

^ На правах рукописи

АСЕЙЧЕВ Антон Владимирович

Исследование роли свободнорадикального окисления на ранних стадиях катарактогенеза, индуцированного общим облучением организма.

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского Государствен» Медицинского Университета (Москва).

Научный руководитель: академик РАМН, доктор биологических наук, профессор ЮА.ВЛАДИМИРОВ

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук В.Н.АКИМОВ кандидат медицинских наук А.В.БИЗЮКИН

Ведущая организация - МНИИ заболеваний глаза им. Гельмгольца МЗ РФ.

Защита состоится ". . ."......1997 г.

в . . .на заседании специализированного совета по защите диссертаций К.084.14.04 при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117531, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан ". . ."......1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

И.В.БУРОМСКИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Около 90 % информации человек получает с юмощыо зрения. На сегодня наиболее распространенной причиной нижения и потери зрения является помутнение хрусталика — ;атаракта, частота которой для лиц старше 50 лет составляет 15% в ападных странах и 40% в развивающихся странах. По данным ВОЗ в 992 году в мире насчитывалось до 50 млн. слепых вследствие катаркты (Taylor А., 1992). Следует отметить, что начальные формы ка-аракты имеются у значительно большего количества людей. В по — ледние годы в связи с участившимися случаями облучения больших рупп населения (авариями на атомных станциях, радиационным агрязнением местности и т.п.) актуальным становится изучение атаракты, вызванной общим облучением организма.

В настоящее время консервативное лечение катаракты является галоэффективным, главным образом потому, что остаются невыяс — енными механизмы развития катаракты на ранних стадиях заболе — ания. У человека мы практически не имеем возможности исследовать агаше стадии развития катаракты, т.е. скрытый период до появления омутнений и период начальных помутнений. Ранние стадии удобно зучать на животных. Однако в большинстве моделей, которые редлагаются для изучения старческой катаракты (облучение глаз сивотных Уф светом, локальное облучение глаз или головы животного ысокими дозами ионизирующего излучения, инъекции селинита) атарактогенез сопровождается воспалительными реакциями и про — сходит очень быстро, т.е. совсем не так как при развитии наиболее аспространенной старческой катаракты.

Основное внимание данного исследования было уделено изу — ению катаракты, индуцируемой общим облучением организма жи — этных в сублетальных дозах. Развитие катаракты в данном случае роходит медленно, что позволяет исследовать ранние стадии забо — звания. Катаракту, иидуцированную общим облучением, важно зучать не только в силу актуальности проблемы последствий радиа — ионных аварий, приводящих к массовым облучениям населения, адиационному воздействию при общем облучении подвергается весь рганизм. Поскольку радиация является фактором ускоренного ста— 2ния, то катаракту, индуцированную общим облучением организма, ожно рассматривать в качестве модели старческой катаракты.

Эффективность радиационного воздействия на хрусталик непо — эедственно связана с идущим в нем универсальным патофизиологи — гским процессом свободнорадикального окисления. Ранее было жазано, что рентгеновское облучение значительно уменьшает ак — теность хрусталиковых восстановительных систем: отмечается по — гепенное уменьшение концентрации восстановленного глутатиона, иеньшение НАДФН, уменьшение уровня работы гексозомонофос— атного шунта (Giblin F., 1979, Reddy V., 1990). Также было обнару— ено, что перед формированием зрелой радиационной катаракты в зусталиках происходит связывание цитозольных протеинов с мем —

бранными протеинами за счет окисления белковых БН групп с образованием дисульфидной —Б—Б— связи (СагасН Я., 1987). В результате мембрана теряет нормальную структуру.

В исследованиях Деева с соавт. (Оеуеу А., 1991) было показано, что после общего облучения мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) в дозе 5 Гр развитию катаракты предшествовало падение уровня вБН, накопление продуктов перекисного окисления липидов, накопление флуоресцирующих нетриптофановых продуктов в ядре, снижение отрицательного заряда кортикальных белков, которое объяснялось их возможным дефосфорилированием.

Вместе с тем существует концепция, которая отводит ведущую роль в радиационном катарактогенезе не процессам свободноради— кального окисления, а повреждению хрусталикового эпителия. С точки зрения этой концепции ключевую роль в развитии радиационной ка — таракты играет непосредственное радиационное повреждение делящихся клеток эпителия хрусталика (Мешаш в., 1983). Клетки, появляющиеся в результате аномальных митозов, встраиваются в ме — ридианальные ряды (МР), располагающиеся на экваторе хрусталика. Дезорганизация структуры МР приводит к нарушению роста и укладки волокон хрусталика, что и ведет к развитию помутнений.

Таким образом остается невыясненным: какова степень влияния свободно — радикального окисления на развитие радиационной катаракты и, в частности, на развитие катаракты, индуцированной однократным общим гамма облучением.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было изучение роли свободнорадикальных реакций в патогенезе катаракты, индуцированной однократным общим гамма облучением организма экспериментальных животных. Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1)Исследовать возможное влияние общесистемного послера— диационного окислительного поврежения организма, оцениваемого пс интенсивности протекания свободнорадикальных реакций в крови облученных животных, на развитие свободнорадикальных процессов е хрусталике.

2)Установить возможную взаимосвязь между изменением показателей свободнорадикальных процессов в хрусталике и растворимостью хрусталиковых белков на ранних стадиях катарактогенеза индуцированного однократным общим гамма облучением.

3)Исследовать роль повреждения хрусталикового эпителия пру развитии катаракты, индуцируемой общим облучением организма.

4)Исследовать: приводит ли однократное общее гамма облучение I сублетальной дозе к развитию сахарного диабета с последующий* формированием катаракты по типу диабетической.

5)Изучить причины возрастания собственной нетриптофаново! (голубой) флуоресценции в хрусталиках на ранних стадиях развитиз катаракты.

6) Изучить влияние водорастворимых антиоксидантов анфеиа и тролокса на развитие катаракты, индуцируемой однократным общим гамма облучением.

Научная новизна результатов. Показано, что катаракта, индуцируемая однократным общим гамма облучением, не является диабетической по своей природе. Установлено, что при развитии катаракты, индуцированной общим облучением, изменение уровня восстановленного глутатиона носит универсальный двухфазный характер, причем на первоначальный подъем уровня восстановленного глутатиона в хрусталике существенное влияние оказывает, индуцированная облучением активизация процессов ПОЛ в плазме крови. Последующее же падение уровня СБН происходит синфазно подъему уровня ТБК—активных продуктов в самом хрусталике и свидетельствует о смещении равновесия факторов окисления и факторов антиокислительной активности в хрусталике в сторону окисления.

Падение уровня СБН в хрусталике взаимосвязано на молекулярном уровне с падением растворимости хрусталиковых белков и на клеточном уровне с процессом гибели хрусталикового эпителия. Показано, что гибель субкапсулярного эпителия в хрусталике имеет вторичный характер, вслед за развитием помутнений в заднем кор— гексе и происходит параллельно падению уровня СБН в хрусталике.

Показано, что синтетические водорастворимые антиоксиданты анфен и тролокс не задерживают развитие ранних стадий катарак— гогенеза, индуцированного общим облучением. Кроме того они не поддерживают, а даже снижают уровень восстановленого глутатиона в хрусталике, из чего следует важное заключение о том, что главным эффектом антикатарактальных препаратов должен быть эффект поддержки собственной глутатионовой системы хрусталика. Практическая значимость. Результаты проведенных исследований расширяют теоретические представления о молекулярно—клеточных механизмах катарактогенеза. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего исследования роли свободнорадикального окисления в развитии катаракты. Большое практическое значение имеет факт важности поддержания в нормальном состоянии системы восстановления глутатиона в хрусталике. В связи с этим очень важным следствием данной работы является то, что следует вести поиск таких антикатарактальных препаратов, которые могут поддержать работу глутатионовой системы хрусталика.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4 — и Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" в г. Москве в феврале 1992 г., на научной конференции "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" 25 апреля 1997 года в г. Москве. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, 33 рисунка и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение" и выводов. Список литературы включает 214 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Объектами исследования служили хрусталики глаз мышей линии BALB и гибридов Fl(CBAxC57B16). Хрусталики выделяли путем заднего подхода непосредственно после забоя животных, которых умерщвляли методом цервикального смещения. Целостность хрусталиков после выделения оценивали по методу предложенному в работе (Aseychev А., 1996).

Катаракту моделировали однократным общим гамма — облучением на источнике еоСо в дозе 350 рад (3.5 Гр) и 500 рад (5 Гр).

Глазное яблоко фиксировали 2 мин в жидкости Карнуа, и после — довательно по 2 мин в 96%, 96% и 70% этаноле. Фиксированные хрусталики хранились в 70% этаноле. Окрашивание отпрепарированных под бинокулярной лупой препаратов проводили гематоксилин — эозином или флуоресцентным ядерным красителем ДАФИ.

Фотографирование препаратов хрусталика проводили с использованием светового микроскопа Jevanal и флуоресцентного микроскопа Оптон.

Фотографирование мышиных хрусталиков in vivo проводили с помощью оригинальной установки на основе щелевой лампы ЩЛТ— УЧ,2.

Оценку развития катаракты проводили с использованием электро-офтальмоскопа. Для расширения зрачка животных использовали 1% раствор гидробромистого гоматропина.

Концентраиию восстановленного глутатиона: определяли по методу (Sedlac J., 1968)

Регистрация продуктов перекисного окисления липидов проводилась с использованием цветной реакции с 2—тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Asakawa Т., 1980)

Растворимые белки хрусталика получали путем центрифугирования гомогенатов хрусталика при 6600 g в течении 60 мин при температуре 0—4°С. Полученные супернатангы использовали кап водорастворимую фракцию белков.

Нерастворимые белки хрусталика получали путем центрифугирования гомогената хрусталика при 6600 g в течение 60 мин пру температуре 0—4° С. После центрифугирования супернатант сливали а осадок ресуспензировали. После этого суспензию повторно центрифугировали в тех же условиях в течение 30 мин. Супернатанп контролировали по поглощению при 280 нм на отсутствие белка, с осадок полагали состоящим из нерастворимых белков.

Концентраиию белка: определяли микробиуретовым методог« (Itzhaki R., 1964).

АО А плазмы крови определяли с использованием системы НЬ-Н202—люминол (Теселкин Ю.О., 1991). Для стандартизации измеренш АОА плазмы крови выражали в виде аксорбатного эквивалента, т.е

>аствора аскорбиновой кислоты определенной концентрации (С"аск ), жазывающим аналогичное влияние на латентный период ХЛ:

С\ск(мкМ)= Саск(мкМ) х (WtaCK) х 100 -аск ~ концентрация аскорбата в модельной системе (эталон). аск — латентный период в присутствии аскорбата „л — латентный период в присутствии плазмы

00 — разведение плазмы крови

Определение содержания ТБК~активных продуктов липидной героксидации в сыворотке крови осуществляли с помощью флуо— >есцентного способа (Гаврилов В.Б., 1987).

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметрах HITACHI MPF 2А" при комнатной температуре.

Тушение флуоресценции АНС и собственных нетриптофановых [элуорофоров хрусталика проводили с использованием ионов нитрата 2,5 М KN03) до конечной концентрации 0,6 М.

Определение гликозилированного гемоглобина в крови мышей [роводили с помощью стандартного набора Sigma (№442).

Проведение исследования влияния водорастворимых антиокси — ^антов тролокса (6 —гидрокси —2,5,7,8—тетраметилхроман—2 — :арбоновая кислота) и анфена (2,6—дитретбутилфенол аминоприо — ювой кислоты) проводили по следующей схеме. Животные были >азбиты на четыре группы: контрольная, облученная, облучен— гая+тролокс и облученная 4-анфен. Антиоксиданты инсталлировали ! оба глаза в виде 0.1% раствора в фосфатном буфере три раза в ^ень. Препараты применяли курсами по одному месяцу. Между курами лечения проводились двухнедельные перерывы. Весь срок экс — шримента составил 9.5 мес.

Обработка результатов Измеряемые величины представлялись

1 виде средних величин. В качестве разбросов использовалась стандартная ошибка среднего ст(п— l)/sqrt(n).

Статистическую значимость выборочных коэффициентов коррекции оценивали с помощью z — преобразования Фишера:

z = 0,5 (In(l + r) - (1 — г) ). критерием достоверности показателя z являлась величина

= ъ V (п-3) .

Нулевая гипотеза отвергалась на принятом уровне значимости

0.01) и числе степеней свободы к = п— 1, исходя из сравнения по —

1.ученного коэффициента \л. с критической точкой I, определяемой из •аблиц критических точек t — критерия Стьюдента.

Сравнение распределений производилось с помощью и — критерия Уилкоксона—Мана—Уитни и X—критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение.

1. Исследование различных факторов катарактогенеза, индуцированного однократным общим гамма облучением.

Одним из важнейших отдаленных последствий действия ионизирующей радиации на организм является развитие катаракты. Целые данной работы было изучение механизмов катарактогенеза, индуцированного однократным общим гамма облучением организма мышей. К возможным причинам, приводящим к развитию данного вида катаракты можно отнести:

1) развитие метаболических нарушений в организме облученного животного;

2) развитие в хрусталике универсального патологического процесса — свободнорадикального окисления;

3) повреждение эпителия хрусталика.

Исходя из этого на первом этапе работы ставилась задача исследовать возможные метаболические нарушения, которые могут привести к развитию катаракты.

1.1. Исследование возможности развития катаракты, индуцированной общим облучением по типу лиабетической-

Одним из возможных последствий действия общего облучения на организм является развитие сахарного диабета в результате повреждения поджелудочной железы. В случае развития сахарногс диабета катарактогенез идет по особому сценарию, характерному дл* так называемых "сахарных" катаракт (Вершинина С.Ф., 1993).

Ранее в нашей лаборатории широко использовалась модель однократного общего гамма облучения мышей гибридов Б1 (СВАхС57В1б^ в сублетальной дозе 5 Гр. В данной работе также предполагалось использовать эту модель. Возникает вопрос: не является ли катаракта развивающаяся в данном случае, диабетической по своей природе.

Для решения этой задачи в крови облученных в дозе 5 Гр мышс{ гибридов Р1(СВАхС57В16) исследовалось содержание гликозилиро — ванного гемоглобина как наиболее объективного показателя развита? диабета. Параллельно в хрусталиках облученных мышей определяло« процентное содержание растворимых белков в качестве наиболее надежного показателя катарактогенеза.

На протяжении 4-х месяцев после облучения происходилс уменьшение в среднем на 25 % доли растворимых белков в хрусталике что свидетельствует о том, что облучение индуцировало процесс катарактогенеза (рис. 1.).

При этом однако на протяжении 4 месяцев после облучения н< наблюдалось заметного изменения уровня гликозилированного гемоглобина в крови облученных животных (рис. 2.). Уровень гликозилированного гемоглобина у облученных животных был даже несколькс ниже чем в контроле.

Таким образом катаракта у мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) вызванная общим однократным гамма облучением в дозе 5 Гр., № имеет по крайней мере на протяжении первых четырех месяцев посл< облучения отношения к диабетической.

я о

и

о

а я а о

(Я

н и из Л

>я

Я я а

(О И

1.0

0.9

0.8

0.7 и

J

Рис. 1. Относительное изменение доли растворимых белков в хрусталиках мышей гибридов (СВАхС57В16) после их общего гамма облучения в дозе 5 Гр. Значения доли растворимых белков представлены как отношение среднего параметра облученных мышей к среднему параметру контрольных мышей.

0 40 80 120 Время после облучения, дни

а?

я я

о ю

а о § °

о о

а * я

£

Контрольные

Облученные

40 60 80 100 120 Время после облучения, дни

Рис.2. Динамика изменения процентного содержания глико— зилированного гемоглобина в крови у мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) после их общего гамма облучения в дозе 5 Гр. Для получения каждого среднего использовались образцы крови не менее чем от 5 животных.

1.2. Исследование роли свободнорадикального окисления в патогенезе катаракты, индуцированной общим облучением.

На следующем этапе работы проводилось изучение роли сво— юднорадикальных реакций в патогенезе, исследуемой нами модели катаракты.

Центральное место в концепции А. Спектора о развитии ката — >акты в результате окислительного стресса принадлежит повреждению ульфгидрильных групп (Брескя А., 1984, 1985). При этом особое ;начение в защите хрусталика от окислительного стресса отводится половому трипептиду глутатиону (СБН), который поддерживается в :русталике в востановленном состоянии. Будучи малой и, следовательно, мобильной молекулой СБН может взаимодействовать , с ютенциальными оксидантами прежде чем они успеют провзаимо — .ействовать с белками или мембранами хрусталика.

Было показано, что количество ОЗН уменьшается в старых и :атарактальных хрусталиках (ИесЮу У.И., 1990). В исследованиях Оеуеу А., 1991, Ситарчук И.А., 1994) было установлено, что на ранних тадиях развития катаракты, индуцированной однократным общим облучением также происходит падение уровня СБН.

Ранее в нашей лаборатории было показано (Асейчев A.B., 1994, Ситарчук И.А., 1994), что при развитии катаракты, индуцированной общим облучением, падению уровня восстановленного глутатиона в хрусталике облученных мышей предшествует его рост. На определенном этапе после облучения уровень восстановленного глутатиона (GSH) в хрусталиках в выборке облученных мышей имеет бимодальное распределение, со средними содержания GSH в каждой моде выше и ниже чем в контроле. Среднее же значение уровня GSH в определенный момент времени оказалось у облученных мышей даже выше чем в контроле.

В данной работе использовались две модели однократного общего гамма облучения: облучение мышей гибрид,ob Fl(CBAxC57B16) дозой 5 Гр и облучение мышей линии Balb дозой 3.5 Гр. Возник вопрос: будет ли повторяться характер изменения уровня GSH в хрусталиках в обоих моделях. Динамика уровня GSH для обоих случаев представлена на рис.3.

Как видно из представленных данных общая тенденция в изменении уровня GSH сохраняется на обоих моделях. Падению уровня GSH предшествует некоторый его подъем. Однако, в случае мышей гибридов Fl(CBAxC57B16) все изменения носят более быстрый характер (рис.3 А). Так к 60 дню после облучения происходит подъем уровня GSH, а к 120 дню — его падение. У мышей же линии Balb (рис. ЗВ.) подъем уровня GSH отмечен лишь к 150 дню после облучения (достоверно отличие от контроля с уровнем значимости а = 0.021), a падение происходит к 285 дню после облучения (достоверно отличие от контроля с уровнем значимости а = 0.026).

А В

ей

Время после облучения, дни

Рис.3. Динамика уровня восстановленного глутатиона (СБН) в хрусталиках облученных и необлученных (контроль) мышей гибридов Г1 (СВАхС57ВЬ6) после общего облучения в дозе 5 Гр.(А) и мышей линии Ва1Ь после общего облучения в дозе 3.5 Гр. (В). (*- обозначение достоверного отличия для р<0,05). Для каждого среднего значения использовались хрусталики, взятые от 5 до 15 животных.

Таким образом в обоих моделях однократного общего облучения уровень С5Н сначала имеет тенденцию к подъему, и только затем уменьшается. Данный результат подтверждает полученные ранее данные о двухфазном характере изменения уровня СБН в хрусталике после общего облучения. Вследствие полученных результатов возник вопрос: с чем связан двухфазный характер изменения уровня йБН в хрусталиках мышей после общего облучения. Было высказано предположение, что развитие свободнорадикалъных реакций на первом этапе после общего облучения приводит к активизации систем анти — окислительной защиты хрусталика. Поскольку при общем облучении радиационному воздействию подвергается весь организм интересно было понять: связана ли данная активизация защитных систем хрусталика, характеризуемая по уровню СЯН в хрусталике, с протеканием свободнорадикалъных реакций в организме.

Для решения данного вопроса было проведено исследование динамики уровня СБН у облученных в дозе 3.5 Гр. мышей линии ВаШ параллельно с определением двух параметров, характеризующих свободнорадикальные процессы в организме.

А В

200

S

S3

а 160 <

§ 120

Облученные

U Контрольные

—i

L

_1_

_1_

_L

J

О 50 100 150 200 Время после облучения, дни

С

О 50 100 150 200 Время после облучения, дни

А

Ч ев

38

и ®

* й

К ей

и и О

12

10

Облученные

_L

0 50 100 150 200 Время после облучения, дни

Рис.4. Динамика ТБК-активных продуктов в плазме крови (ТБКАП)(А), уровня АОА » в плазме (В), и ввН в хруста—

Контрольные Ликах (с) облученных и не-облученных (контроль) мышей линии ВаШ после общего гамма облучения в дозе 3.5 Гр.

Во—первых, определялся уровень ТБК—активных продуктов в плазме, характеризующий процессы ПОЛ в крови облученных животных. Во вторых, определялся уровень АОА (антиокислительной активности) в плазме, который характеризовал реакцию защитных

антиокислительных систем крови. Исследование свободнорадикальных реакций в плазме и в хрусталике облученных животных показало, что развитие процессов ПОЛ в плазме крови опережает изменения в хрусталике. На рис.4, представлена динамика уровня ТБКАП в плазме, уровня АОА в плазме и уровня СБН в хрусталике. Из рисунка видно, что процесс роста ТБКАП и АОА в плазме предшествует подъему уровня СБН в хрусталиках.

На влияние свободнорадикальных реакций в плазме на свобод— норадикальное окисление в хрусталике указывает существование линейной корреляции с 11=0.68 (для п= 38 достоверна на 1% уровне значимости) между уровнем ТБК—активных продуктов в плазме и уровнем вБН в хрусталиках, который определялся как среднее по контрлатеральным хрусталикам (рис. 5.).

11=0.68

01 ю

к

Л

<

О *

X

К ся О

12

10

Рис.5. Корреляция между содержанием ТБК-активных продуктов в плазме крови и уровнем СЗН в хрусталиках мышей линии Ва1Ь. (К=0.68, для п-38)

6 -

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 ТБКАП, нмоль/ мг липидов Как известно по корреляции можно охарактеризовать вклад изменения одного параметра в изменение другого по коэффициенту детерминации Б = II2, показывающему степень взаимного влияния изучаемых признаков. В данном случае Б=0.46, что говорит о том, что почти на половину изменения СБН в хрусталике обусловлены протеканием свободнорадикальных реакций в организме.

Таким образом, если подъем АОА в плазме можно рассматривать как активизацию защитных систем крови в ответ на развитие в ней свободнорадикальных реакций, то подъем уровня С5Н в хрусталике можно расценить как активизацию защитных систем хрусталика в ответ на развитие в нем процессов свободнорадикального окисления.

Если протекание свободнораднорадикальных реакций в организме оказывает заметное влияние на состояние глутатионовой системы хрусталика, то весьма вероятно, что протекание свободнораднорадикальных реакций в самом хрусталике также будет взаимосвязано с глутатионовой системой хрусталика.

Для изучения взаимосвязи между протекающими в хрусталике свободнорадикальными реакциями и изменениями уровня С£!Н была проведено параллельное исследование динамики уровня СБН и ТБК-активных продуктов в хрусталиках мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) после их общего облучения в дозе 5 Гр (рис.6.) При этом уровень вЭН и ТБКАП определялись в одном хрусталике. Как уже ранее отмечалось,

уровень СБН сначала поднимался к 60 дню после облучения примерно на 20%, а затем снижался вдвое по сравнению с контролем к 120 дню после облучения (рис.бА.). Уровень же ТБКАП в хрусталике сначала понижался к 60 дню после облучения, а затем происходил его рост (рис.бВ.) При сопоставление динамики уровня СБН и ТБК—активных продуктов обращает на себя внимание синфазный характер изменения этих параметров, что подчеркнуто на рис. 7., представленном в относительных единицах. Синфазность изменения уровня СБН и ТБК — активных продуктов хрусталика указывает на то, что процессы сво— боднорадикального окисления ответственны за состояние глутатио — новой системы хрусталика.

А В

ей

40 60 80 100 120 О 40 60 80 100 120 Время после облучения, дни Время после облучения, дни

С

0.7

0.6

0.5

0.4

Рис. 6. Динамика уровня ТБКАП (А), уровня С8Н (В) и доли растворимых белков (С) в хрусталиках облученных и необлученных (контроль) мышей. В каждой точке проводилось измерение параметров пе менее чем у 4-х животных. (*- указывает на достоверность отличий для р<0.05)

!

40 60 80 100 120 Время после облучения, дни

Таким образом развитие ПОЛ в крови, сопровождающееся подъемом в плазме ТБК—активных продуктов, активизирует глута — тионовую систему хрусталика, что с одной стороны приводит к повышению уровня восстановленного гутатиона, а с другой стороны приводит к истощению ресурсов глутатионовой системы и в конечном счете к ее срыву. Подъем же уровня ТБКАП в хрусталике свиде —

тельствует о нарушении равновесия окислительных и антиокисли — тельных систем в хрусталике в сторону окисления. При этом происходит падение уровня восстановленного глутатиона.

Относительное уровня GSH и

Рис.7, изменение

содержания ТБК-ахтивных продуктов в хрусталиках облученных мышей. Значения ТБКАП и (ХН представлены как отношение среднего па-р| раметра облученных мышей к среднему параметру контрольных мышей.

Время после облучения, дни

Согласно концепции А. Спектора именно смещение данного равновесия в сторону окисления приводит к окислению белков и мембран хрусталика и развитию катаракты. Возникает вопрос: что в большей степени влияет на развитие катаракты — активизация сво — боднорадикального окисления в хрусталике или срыв антиокисли — тельной активности хрусталика. Для решения этой задачи в хрусталиках облученных в дозе 5 Гр мышей гибридов Fl(CBAxC57B16) параллельно с измерением уровня GSH и ТБК—активных продуктов производилось измерение уровня растворимости хрусталиковых белков, что непосредственно свидетельствует о процессе катарактогенеза на молекулярном уровне. На рис. 6(C). представлены данные по динамике растворимости белков хрусталика после облучения. Как видно из графика уже в ранние сроки после облучения наблюдается заметное уменьшение растворимости белков хрусталика. Следует отметить, что точечные помутнения, характерные для первой стадии развития катаракты и, выявляемые при визуальном исследовании хрусталиков электроофтальмоскопом, были отмечены практически у всех облученных мышей через 2.5 мес после облучения. Это соответствует понижению растворимости белков хрусталика примерно на 20%.

Как видно их рис.6А,В. изменение уровня GSH и ТБКАП в хрусталике происходит в те же сроки, что и изменение растворимости, однако оценить влияние данных параметров на растворимость исходя из кривых динамики средних параметров затруднительно. Интерпретация кривых динамики средних параметров затрудняется поскольку развитие катаракты, индуцируемой общим облучением организма, происходит неравномерно у разных животных в популяции, что объясняется их индивидуальными отличиями (федоренко Б.С., 1995). Кроме того у каждого животного изучаемые биохимические параметры могут колебаться, проходя фазы подъема и спада. В результате на—

ожений этих колебаний картина процесса может "смазываться". Так анее было показано (Ситарчук И.А., 1994), что на определенном этапе осле облучения уровень восстановленного глутатиона (СБП) в хру— таликах в выборке облученных мышей имеет бимодальное распре — еление, со средними содержания СЭН в каждой моде выше и ниже ем в контроле. Однако при этом среднее по всей выборке оказалось лизким к контрольному значению. Поэтому изучение динамики ус — «дненных биохимических параметров в хрусталике в группе жи — ютных с высокой дисперсией изучаемых признаков часто оказывается гало информативно. Выходом из этой ситуации оказывается опреде — ение в хрусталике одного животного сразу нескольких биохимиче— ких параметров и исследование корреляционных отношений между [ими. Данная работа была выполнена на мышах. Недостатком мышей [вляется маленький размер их хрусталика. Поскольку из—за маленького размера мышиных хрусталиков отсутствовала возможность гзмерять все изучаемые параметры в одном хрусталике, то уровень ->БН и ТБК—активных продуктов определялся в одном хрусталике, а :тепеш> растворимости белков в контрлатеральном хрусталике. С ^лыо обоснования данного методологического приема был определен фовень СБН в контрлатеральных хрусталиках у одного животного. Для жсперимента были взяты беспородные мыши разного возраста. Сказалось, что между уровнями восстановленного глутатиона в сонтрлатеральных хрусталиках одного животного существует высокая сорреляция (рис.8.) с коэффициентом кореляции 11=0.997 (достоверна удя р<0.001). Наличие высокой корреляции позволило считать, что »фовни СБН в контрлатеральных хрусталиках у одного животного эдинаковы, и следовательно по состоянию одного хрусталика можно :удить о состоянии другого.

Рис.8, уровнями глутатиона теральных породных возраста.

Корреляция между восстановленного (СБН) в контрла— хрусталиках бес-мышей разного Коэффициент ли-

нейной корреляции К=0,997 (корреляция достоверна для р<0,001).

Уровень вБИ в правом хрусталике мкмоль/г белка

ТБКАП , нмоль на г белка

0.7

0.6

0.5

0.4

3

В

Щ1) = 0,52 Щр)=0,72

6

9

12

ввН, мкмоль на г белка

Рис.9. А. Корреляции между содержанием ТБК-активных продуктов (ТБКАП) и долей растворимых белков в хрусталиках мышей гибридов И |СВАхС57В16). Для п=25 К(1)=—0,51 (линейная), Шр)=-0,55 (полином 2-й степени). Корреляции достоверны для р<0.01.

В. Корреляции между уровнем ввН и долей растворимых белков хрусталика. Для п=35, К(1)=0,57, Щр)=0,72. Корреляции достоверны для р<0,01.

При изучении взаимосвязи между уменьшением растворимости хрусталиковых белков и процессами свободнорадикального окисления в хрусталике оказалось, что уровень восстановленного глутатиона в хрусталике и доля растворимости хрусталиковых белков связаны как средней линейной корреляцией с И=0.57 (рис.ЭА.), так и относительно высокой нелинейной корреляцией с коэффициентом корреляции Е.=0.72 (апроксимация полиномом второй степени). Коэффициент корреляции указывает 11=0.72, что уменьшение уровня восстановленного глутатиона и падение растворимости белка в хрусталике взаимосвязаны с коэффициентом детерминации Б=0.50.

При изучении взаимосвязи между уровнем ТБК—активных продуктов в хрусталике и долей растворимых белков оказалось, что ними существует линейная корреляция с коэффициентом корреляции И =—0.51 (Рис.9В.). Нелинейная аппроксимация не приводила к существенному увеличению коэффициента кореляции. Отосительно невысокая взаимосвязь данных параметров указывает, что на падение растворимости не столько влияет сам процесс свободнорадикального окисления, который протекает и в нормальном хрусталике, сколько повреждение антиокислительной глутатионовой системы.

Следует отметить, что при уменьшении уровня GSH от 11,5 до 7,5 мкМ/г белка не происходит существенного уменьшения растворимости белков. Лишь при уменьшении уровня GSH ниже порогового значения 7.5 мкМ/г белка наблюдается снижение растворимости, пропорциональное концентрации GSH в хрусталике.

1.2.1. Исследование причины возрастания собственной нетриптофа — новой флуоресценции хрусталика.

Одним из самых рашгах параметров развития катаракты является увеличение интенсивности собственной нетриптофановой флуоресценции хрусталика ("голубая флуоресценция"), с характерным максимумом возбуждения при 330 — 370 нм и испускания при 420 — 460 нм (Айтмагамбетов М.Т., 1989, Deyev А., 1991, Zigman S., 1981, Stiusio P., 1988). Большинство исследователей считают, что эта флуоресценция обусловлена появлением низкомолекулярных окисленных форм триптофана (Zigman S., 1988, Stiusio P., 1988). Следует отметить двойственный характер последствий накопления флуоро — форов в хрусталиках. С одной стороны они выполняют роль светофильтров, поглощая ультрафиолет, а с другой — накопление флуорофоров ведет к усилению генерации на свету активных форм кислорода и снижению антиокислительного потенциала хрусталика (Dillon J., 1995).

А В

а ш

I

о.

о! С

W

0.12

0.08

0.04

0.00

40 60 80 100 120 Время после облучения, дли

я о к ч

Ч)

ю

а

0.6

0.5

0.4

ь о ей Р.

41

№ «

Ч О tt

0.3

0.2

Облученные

Контрольные

40 60 80 100 120 Время после облучения, дни

Рис.10. Динамика К-параметра (А) и доли нерастворимых белков хрусталика (В) у облученных и необлученных (контроль) мышей гибридов (СВАхС57В16) после их общего облучения в дозе 5 Гр. Для каждого среднего парметра использовались хрусталики более чем от 4-х животных. (* - обозначено существование достоверного отличия для р<0,05)

Изучая кинетику изменения биохимических параметров в хрусталике мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) после облучения, нами было

отмечено, что вместе с накоплением нерастворимых белков в хрусталике параллельно происходит значительный рост нетршггофановой флуоресценции (рис.10.), которая характеризовалась с помощью так называемого К—параметра, представляющего собой отношение интенсивности нетриптофановой флуоресценции хрусталика (возбуждение при А.= 340 нм, испускание при X — 370 нм) к интенсивности триптофановой флуоресценции хрусталика (возбуждение при А.=310 нм, испускание при Л= 340 нм). Между ростом нетриптофановой флуоресценции и накоплением нерастворимых белков существовала взаимосвязь, характеризуемая линейной корреляцией с коэффициентом корреляции R=0.63 (п=27) и коэффициентом детерминации D= 0.4 (для п=27 корреляция достоверна для р<0.01). Представляло интерес изучить причины этой взаимосвязи.

Ранее в работе (Ситарчук И.А., 1994) было установлено, что уменьшение отрицательного заряда и растворимости кортикальных белков происходит в более поздние сроки чем рост нетриптофановой флуоресценции и наблюдаемый нами рост количества нерастворимых белков в хрусталике. Следовательно рост нерастворимых белков в самые ранние сроки после облучения происходит в ядре хрусталика. Кроме того в работе (Deyev А., 1991) было показано, что рост флуоресценции нетриптофановых продуктов также происходит в основном в ядре. Таким образом возник вопрос. С чем связано увеличение нетриптофановой флуоресценции: с накоплением нетриптофановых флуорофоров в хрусталике или с увеличением их квантового выхода например за счет связывания с нерастворимыми белками.

С целью решения данной задачи было проведено исследование нетриптофановой флуоресценции, связанной с растворимыми и с нерастворимыми белками хрусталика, для чего были изучены спектры флуоресценции нетриптофановых флуорофоров в растворимой и в нерастворимой частях гомогената у облученниых в дозе 5 Гр. мышей гибридов F1(CBA х С57В16) через 5 мес после облучения. Гомогенат целого хрусталика необлученных мышей содержал 73% растворимых белков, а гомогенат облученных мышей 47% растворимых белков.

Как видно из рис. 11(A). у облученных мышей через 5 мес. после общего облучения наблюдается подъем интенсивности нетриптофановой флуоресценции примерно в 2 раза по сравнению с контролем. Как видно из рис.11(В). в растворимой фракции гомогенатов облученных и необлученных мышей, разведенных до одинаковой концентрации, интенсивность флуоресценции в спектрах испускания у облученных мышей выше, но незначительно. Сходная картина наблюдается в спектрах испускания нерастворимой фракции гомогенатов хрусталиков облученных и необлученных мышей, разведенной до одинаковой концентрации (рис. 11(C).). При сравнении интенсивности флуоресценции в растворимой и нерастворимой частях гомогената можно заметить, что удельная интенсивность флуоресценции, приведенная на 1 мг белка, примерно в 4 раза выше во фракции нерастворимых белков. И поскольку нерастворимых белков в гомогенатах

облученных мышей (53%) в 2 раза выше чем в гомогенагах необлу— ченных (27%) подъем интенсивности флуоресценции в цельном го — могенате хрусталиков облученных мышей можно объяснить увеличением концентрации нерастворимых белков.

600

Облученные

420 440 460 480 Длина волны, нм.

500

800

600

400

200

420 440 460 480 500 420 440 460 480 500 Длина волны, им Длина волны, нм

Рис.11. Спектры испускания флуоресценции флуорофоров с нетршгго-фановой флуоресценцией (возбуждение при 370 нм) в гомогенатах хрусталиков облученных и необлученных мышей гибридов Р1(СВАхС57В16) через 5 мес. после общего облучения в дозе 5 Гр.

(A).В цельных гоомогенатах, разведенных до концентрации 1.5 мг/мл

(B).В растворимой фракции гомогенатов, разведенной до концентрации 1 мг/мл.

(C).В нерастворимой фракции гомогенатов, разведенной до концентрации 1 мг/мл.

Полученные данные можно было бы объяснить накоплением окисленных дериватов триптофана в самих белках. Однако ранее совместно с Ситарчуком И.А. было показано (Асейчев A.B., 1994), что при развитии катаракты, индуцируемой общим облучением организма

мышей в дозе 5 Гр, происходит накопление этих продуктов с течением времени и что в основном по своей природе — это низкомолекулярные продукты, относящиеся к фракции <1.5 кО.

Встает вопрос: с чем связано увеличение интенсивности собственной голубой флуоресценции хрусталика. Было высказано предположение, что рост флуоресценции обусловлен не увеличением концентрации флуорофоров в хрусталике, а с увеличением их квантового выхода за счет возможного комплексообразования с нерастворимыми белками. Вопрос о том: образуются ли участки связывания для низкомолекулярных флуорофоров в нерастворимых белках может быть решен с помощью модельного флуорофора АНС, квантовый выход которого резко возрастает при связывании с белками. Для проверки данного предположения был проведен эксперимент с использованием флуоресцентного зонда АНС в качестве модели низко — молекулярных нетриптофановых флуоресцирующих продуктов. Задачей эксперимента было изучить связывание АНС с растворимыми и нерастворимыми белками хрусталика. В качестве растворимых и нерастворимых белков в данном эксперименте использовались растворимая и нерастворимая части гомогенатов хрусталиков крыс. Данные по связыванию АНС приведены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры связывания 1 мкМ АНС с растворимой частью гомогената хрусталиков и 5 мкМ АНС с нерастворимой частью гомогената хрусталиков здоровых крыс: квантовый выход АНС в белке, число мест связывания на 1000 условных молекул белка (20 кР), константа связывания К, М1.

Белки хрусталика Квантовый выход АНС в белке Число мест связывания на 1000 условных молекул белка (20 кО) Константа связывания К, мкМ-1

Растворимые белки 0.38 ± 0.04 1.7 ± 0.3 35.7 ± 4.1

Нерастворимые белки 0.64 ± 0.02 22.2 ± 2.7 1.6 + 0.2

Данные по связыванию АНС с белками хрусталика свидетельствуют, что нерастворимые белки имеют в 13 раз больше участков связывания, правда с более низкой константой связывания. При этом квантовый выход при связывании с нерастворимыми белками в 1.68 раза больше. Увеличение гидрофобности нерастворимых белков по сравнению с растворимыми может приводить к связыванию низко — молекулярных флуорофоров с соответственным увеличением их квантового выхода, что возможно обуславливает рост собственной нетриптофановой флуоресценции хрусталика. Полученные данные позволяют высказать гипотезу, что в начале катарактогенеза рост нетриптофановой флуоресценции обусловлен не появлением новых флуоресцирующих продуктов, а с накоплением нерастворимых белков и формированием на них участков связывания гидрофобных молекул С этими участками вероятно начинают связываться нетриптофановые продукты хрусталика.

.3. Изучение процесса гибели субкапсулярного эпителия хрусталика фи развитии катаракты, индуцированной общим облучением.

Известно, что гибель герменативной зоны эпителия хрусталика [вляляется пусковым звеном радиационного катарактогенеза (Мегпат л.Л., 1983). Возможно предположить, что гибель наиболее метаболи — гески активных клеток хрусталика, клеток субкапсулярного эпителия, [вляется первичным звеном катарактогенеза.

А

О

и

м

о

Щ

¡J*

К N1

Ч а

О к я

„ «

« о

в ч ш Ш Ч

в М

¡3

И

га

В

М

н

О)

Ч

И

о о о тг

О о о

о о о

ГЧ

о о о

О 50 100 150 200 250 300 Время после облучения, дни

В

tí И

5 12

ю

2 ю

»

л

4 о

5 8

К

S

В 6 Ü

Облученные

-

-X F— W- I —-- N *

- Контрольные 1,1,1,1, , 1

<3

а я

tu Я"

о «

а

В л

ю «

И

„ п о

О 50 100 150 200 250 300 Время после облучения, дни

Рис.12. А. Изменение количества клеток эпителия на тотальном эшгге-иалыю-капсулярном препарате хрусталика (контроль обозначен - 1, облу-ение - 2), динамика средней бальной оценки помутнений хрусталика контроль обзначен Балл (К), облучение - Балл (О)) у мышей линии ВаШ после бщего однократного гамма облучения в дозе 3.5 Гр. Для подсчета количества леток использовалось от 3 до 9 препаратов.

В. Динамика уровня СКН в хрусталиках мышей линии ВаШ после общего блучения в тех же условиях. Для определения средних значений использо-алось от 5 до 15 хрусталиков. (* — обозначено существование достоверного тличия для р<0.05)

Для проверки данного предположения у облученных в дозе 3.5 Гр. мышей линии Ва1Ь проводилось изучение гибели субкапсулярного эпителия хрусталика параллельно с исследованием динамики развития катаракты, которую оценивали с помощью бальной оценки. Динамика средней бальной оценки в группах облученных и необлученных животных представлена на рис.12 (А). Как видно из рисунка после латентного периода, который длился 110 дней происходит рост средней бальной оценки, которая достигает значения близкого к 1 к 166 дню после облучения. В дальнейшем наблюдается про1рессирование развития катаракты у облученных животных и незначительный подъем средней бальной оценки в контроле.

Гибель субкапсулярного эпителия хрусталика оценивалась по количеству сохранившихся клеточных ядер на тотальном эпителиально—капсулярном препарате хрусталика. Данные по динамике гибели эпителия после облучения приведены на рис.12А. Достоверное уменьшении количества клеток у облученных животных по сравнении: с контролем отмечается через 285 дней после облучения М(контроль)=3141 ± 172 клеток/мм2 (л =8), N (облучение) =2388 ± 50Е клеток/мм2 (п = 9), достоверное отличие для уровня значимости а=0.019. Сохранность эпителия в облученной группе по сравнению с контролем через 285 дней после облучения составила 76.03%. Таким образом после однократного общего гамма облучения мышей линик Ва1Ь дозой 3.5 Гр через 9.5 мес после облучения большая часть животных достигает стадии катаракты 2 и при этом сохраняется примерно 76% клеток эпителия.

Обращает на себя внимание тот факт, что в срок через 171 деш после облучения, когда 95% всех мышей уже имеют степень катарак -ты, равную 1, общее количество клеток эпителия практически не изменяется. Исходя из этого можно сделать вывод, что смерть эпителия I данном случае носит вторичный характер, вслед за развитием ката-рактальных изменений в заднем кортексе.

Повреждение хрусталикового эпителия после облучения сопровождается его значительными морфологическими изменениями Морфологические изменения в эпителии хрусталика после общегс облучения представлены на рис.13. Как видно из рисунка 13(А,В фотоизображения препарата контрольной мыши, полученного через 9.1 мес после облучения, в нормальном эпителии заметна прежде всеп строгая упорядоченность расположения клеток и их одинаковы! размер. В тоже время на препаратах эпителия хрусталиков облученны: животных (рис.13С,В.) отмечается нарушение пространственной организации расположения клеток, появление многочисленных округлы: зон с отсутствием на них клеток. Для препаратов эпителия облученны: животных также характерно наличие клеточного полиморфизма, по -явления атипично больших и маленьких клеток (рис. 13С.О.).

Рис.13. Фотоизображения тотальных эпителиально-капсулярных препаратов хрусталика. Иллюстрация изменения эпителия хрусталика при развитии катаракты, индуцированной однократным общим гамма облучением мышей линии Ва1Ь в дозе 3.5 Гр в срок через 9.5 мес. после облучения. Фотосъемка проведена при помощи флуоресцентного микроскопа Оптон (использовался флуоресцентный краситель ОАР1) при увеличении х 80 и х 600. А,В - препарат эпителия необлученного животного (А-увеличение х 80, В -увеличение х 600).

С,О - препарат эпителия облученного животного, имеющего 2-ю стадию развития катаракты (С - увеличение х 80, О - увеличение х 600).

Как уже было ранее показано, падение уровня СБП при радиационном катарактогенезе ниже определенного порога сопровождается активизацией ПОЛ и накоплением нерастворимых белков. Возникает вопрос: как взаимосвязаны процесс гибели субкапсулярного эпителия и состояние глутатионовой системы хрусталика. Для исследования этого вопроса параллельно изучению гибели эпителия после облучения в хрусталиках мышей определялось содержание восстановленного глутатиона. Данные по изменению уровня СБН в хрусталиках облученных мышей представлены на рис. 12В. Как следует из рисунка падение уровня СБН происходит параллельно гибели клеток эпителия.

С целью выявления взаимосвязи между уровнем СБН в хрусталике и смертностью клеток субкапсулярного эпителия по результатам последнего эксперимента (через 9.5 мес после облучения) между

этими параметрами была построена корреляционная зависимость (ск рис. 14.). При этом уровень СБН определялся в хрусталике одноп глаза, а количество клеток хрусталикового эпителия в хрусталик! контрлатерального глаза. Оказалось, что между уровнем вБН и количеством клеток эпителия существует как линейная корреляция Я=0.64 (для п = 17 достоверна на 1% уровне значимости), так и нелинейная корреляция (полином 2-й степени) с коэффициентом корреляции И = 0.70 (для п= 17 достоверна на 1% уровне значимости).

Таким образом падение уровня СБН и гибель субкапсулярноп эпителия представляют собой два параллельных процесса, причег данные параметры связаны нелинейной корреляцией с достоточж высоким коэффициентом корреляции 11=0.70. Возможно предположить, что снижение уровня СБН в кортексе и в эпителии хрусталик, приводит к срыву защитных механизмов и гибели эпителия.

«

Ч <Й

Ф

& н

К й

И го Оч б

и

Й Ф

О л

ш и

Й

о

ш сз

н о К

а)

?

К

Ч

О

Й

4000

3000

2000

11(1)=0.64 Щр)=0.70

4 6 8 10 12 14 вэн, мкмоль на г белка чимости

Рис.14. Корреляци между количеством клето: эпителия иа тотально) эпителиально-капсулярном препарате хрусталика I уровнем восстановленног глусатиона (вБН) в хрусталике. Коэффициент линейной корреляции Н(1)=0.6ч Коэффициент нелинейно! корреляции (полином 2-1 степени) Й(р)-0.70. Для п=1 данные корреляции достоверны для 1% уровня зна

2. Исслелование влияния водорастворимых антиоксидантов тролокса ] анфена на развитие катаракты, индуцированной общим облучением.

На значительную роль в патогенезе радиационной катаракт! процессов свободнорадикального окисления указывает успешно применение антиоксидантов для задерживанияя ее развития. Использование интроперитонеальных инъекций предшественника вБН -изопропилового эфира глутатиона крысам после локального облучени головы животных приводило к значительному задерживанию развита катараты (КоЬауаБЫ Б., 1993). Эффективным для задерживания радиационного катарактогенеза у кроликов оказалось их кормлени после облучения жирорастворимым антиоксидантом альфа -токоферолом (ПЬопШ Т., 1989). В обоих случаях было обнаружен длительное поддержание применением антиоксиднтов уровня вое -становленного глутатиона на уровне контрольных значений.

В последнее время было показано, что достаточно высокой эффективностью обладают соединения из нового поколения водорастворимых антиоксидантов, являющихся химическими производными жирорастворимых антиоксидантов. В данной работе была предпринята попытка использовать два синтетических водорастворимых антиоксиданта — тролокс (6—гидрокси—2,5,7,8 — тетраметилхроман — 2 — карбоновая кислота) и анфен (2,6 — дитретбутилфенол аминоприоновой кислоты) для задержки катаракты, индуцируемой у мышей линии Ва1Ь однократным общим гамма облучением организма в дозе 3.5 Гр.

В процессе эксперимента изучалось влияние антиоксидантов на степень развития катаракты (бальная оценка), влияние на смертность животных, влияние на гибель субкапсулярного эпителия и в последний эксперимент (через 9.5 мес. после облучения) параллельно с определением количества клеток эпителия на препарате хрусталика из одного глаза, в другом глазу определялось содержание восстановленного глутатиона.

А

В

<а «

к ф

ег о

05 а} В А

Ю

Я К К fct CD ft О

О 2 4 6 8 10 Время после облучения, мес.

х я

а

Д ;

а1 __ § *

3 з

п д

° Й м 8 н и

о Н

и м

(г1 !Ч к

4 О

W

100

0 2 4 6 8 10 Время после облучения, мес.

Рис.15. Влияние водорастворимых антиоксидантов тролокса и анфена на степень развития катаракты (А) и на выживаемость мышей линии Ва1Ь (В) после их общего гамма облучения в дозе 3.5 Гр. 1 - необлученпый контроль, 2 - облученные животные без применения антиоксидантов, 3 облучение + анфен, 4 - облучение + тролокс. Кривые выживаемости мышей приведены с отчетом забора животных для исследований. Стрелочками в нижней части рисунка обозначены дни в которые производился подсчет выживших животных и их обследование с помощью электроофтальмоскопа. (* - обозначено достоверное отличие для р<0.05 между группами, где применялись антиок— :нданты и облученной группой, где аптиоксиданты не применялись)

Влияние облучения и применения антиоксидантов на скорость эазвития помутнений оценивалось визуально с помощью элек — гроофтальмоскопа и представлено на рис.15А. Используя метод дисперсионного анализа по результатам первых четырех осмотров (201 \ень после облучения) было подсчитано, что анфен и тролокс не

задерживают наступление 1 стадии развития катаракты. Вместе с тем по результатам всех осмотров, включая последние, было подсчитано, что тролокс задерживает развитие 2-й стадии помутнений с доверительной вероятностью Р = 97%. Для анфена доверительная вероятность оказалась недостоверной (Р= 19%). Таким образом можно сделать вывод, что тролокс задерживает развитие катаракты на поздних стадиях.

Данные по влиянию общего облучения и применения антиок— сидантов на уровень восстановленного глутатиона после всех курсов инсталляций анфена и тролокса представлены в табл.2. Как следует из представленных данных, применение антиоксидантов не сохранило, как можно было бы предположить, уровень восстановленного глутатиона в хрусталике. Более того, исходя из значений, представленных в табл.2., уровень восстановленного глутатиона в группах с применением антиоксидантов имеет тенденцию быть ниже чем в группе облученного контроля. Таким образом способность антиоксидантов поддерживать уровень восстановленного глутатиона можно рассматривать как критерий их эффективности.

Таблица. 2. Уровень восстановленного глутатиона и плотность клеток эпителия на тотальном эпителиально-капсулярном препарате в 4-х группах животных: интактные мыши, мыши, облученные в дозе 3.5 Гр, облученные мыши с применением анфена, облученные мыши с применением тролокса через 9.5 мес после облучения.

Параметр Группы животных

Контроль (п=15) Облученный контроль (п=12) Облучение + анфен (XI = 6) Облучение + тролокс (п=5)

Уровень СБН, в мкмоль на г белка а" а" 9.97 + 1.72 8.1 ± 1.85 а" = 0.026 6.7 + 1.57 а' = 0.002 а" = 0.206 7.33 ± 2.02 а* = 0.023 а" = 0.430

Плотность эпителия, количество клеток на мм2 препарата а" 3141 i 172 2388 ± 508 а =0.019 2481 ± 236 а =0.003 2648 ± 705 а'= 0.190

Данные приведены как среднее ± стандартное отклонение.

а' — критический уровень значимости при сравнении данных по всем облученным группам с контролем.

а" — критический уровень значимости при сравнении данных по облученным группам, где применялись антиоксиданты, с облученными животными, где антиоксиданты не применялись.

Сравнение выборок на идентичность проводилось с использованием непарамет— рического критерия Вилкоксона—Мана —Уитни.

Поскольку антиоксиданты не поддержали уровень СБН в хрусталике, то можно предполагать, что их применение не защитит от повреждения субкапсулярный хрусталиковый эпителий. Данные по изменению количества клеток эпителия через 9.5 мес. после облучения приведены в табл.2. Как видно из представленных данных во всех

руппах облученных животных наблюдается снижение количества слеток эпителия. С высокой доверительной вероятностью группа обручение -Ь анфен и облученный контроль имеют сниженное по равнению с группой необлученного контроля количество клеток :русталикового эпителия. Как и ожидалось применение антиокси — рантов не предохраняет хрусталиковый эпителий от повреждения.

Влияние антиоксидантов на смертность животных после общего >блучения представлено на рис. 15В. Смертность мышей в группе с [рименением анфена и тролокса значительно выше, чем в контрольной руппе и группе облученного контроля. Возможно это объясняется ■оксическим действием антиоксидантов. Таким образом несмотря на ■о, что применение тролокса оказалось эффективным для задержки торой стадии катаракты вопрос о его практическом применении :ледует оставить открытым в следствии обнаруженного токсического ффекта. Важно отметить, что антиоксиданты не только не подчеркивают, а даже снижают уровень GSH в хрусталике из чего следует, гго главным эффектом антикатарактальных препаратов должен быть ффект поддержки собственной глутатионовой системы хрусталика.

Выводы

1. Установлено, что на ранних этапах развития катаракты, ин— уцировашюй однократным общим гамма облучением, изменение ровня восстановленного глутатиона (GSH) в хрусталиках носит зухфазный характер: после подъема уровня GSH примерно на 20% ледует фаза уменьшения. При этом концентрация ТЕК —активных [родуктов в хрусталике изменяется в противофазе к GSH.

2. Показано, что после облучения мышей линии Balb в дозе 3.5 Гр вменение свободнорадикального статуса организма (рост ТБК — ктивных продуктов и антиокислительной активности в плазме) редшествует подъему уровня GSH в хрусталике. Между подъемом ровня ТБК —активных продуктов в плазме и подъемом уровня вое — тановленного глутатиона в хрусталике существует линейная корре — яция с R=0,68 (достоверна для р<0,01).

3. Установлено, что между снижением уровня восстановленного лутатиона в хрусталике и уменьшением растворимости хрусталиковых ¡елков существует высокая нелинейная корреляция (полином 2-й тепени) с коэффициентом корреляции R = 0,72. (р<0,01). При развитии >адотационной катаракты уровень восстановленного глутатиона 7.5 жМ/г белка в хрусталиках мышей гибридов Fl(CBAxC57BL6) является ритическим для сохранения белков хрусталика в растворимом со — тоянии.

4. Показано, что гибель субкапсулярного эпителия хрусталика во ремя развития катаракты, индуцированной однократным общим гамма блучением мышей линии Balb в дозе 3,5 Гр, носит вторичный ха — >актер вслед за развитием: 1 стадии помутнений.

5. В сроки от 5 до 9.5 мес после облучения снижение уровня GSH хрусталике коррелирует с гибелью клеток субкапсулярного эпителия

хрусталика (линейная корреляция с коэффициентом корреляци] R=0.64 (р<0,01) и нелинейная корреляция (полином 2-й степени) коэффициентом корреляции R=0,70 (р< 0,01)).

6. Показано, что через 5 мес после однократного общего гамм облучения мышей гибридов Fl(CBAxC57B16) в дозе 5 Гр нетриптофа-новая (голубая) флуоресценция, связанная с нерастворимыми белкам] хрусталика, в 4 раза выше, чем связанная с растворимыми белками Нерастворимые белки хрусталика обладают в 13 раз большим число! участков связывания для АНС, чем растворимые, однако имеют боле низкую константу связывания. Квантовый выход флуоресценции АН< в нерастворимых белках в 1.68 раза больше, чем в растворимых белках

7. При развитии катаракты, индуцированной однократным общи! гамма облучением мышей гибридов F1(CBA х С57В16) в дозе 5 Гр, н протяжении первых четырех месяцев после облучения не отмечен изменения степени гликозилирования гемоглобина, что свидетельствует о развитии данного типа катаракты по недиабетическому типу.

8. Водорастворимые антиоксиданты тролокс и анфен не предотвращают гибель субкапсулярного эпителия хрусталика и практичесю не влияют на уровень GSH в хрусталике при развитии катаракть: индуцированной однократным общим гамма облучением мышей лини) Balb в дозе 3,5 Гр. Применение тролокса и анфена не задерживав развитие 1 стадии катаракты. Применение тролокса достоверно задерживает формирование 2-й стадии катаракты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Асейчев A.B., Ситарчук И.А., Деев А.И., Айтмагамбетов М.Т Владимиров Ю.А. Изучение кинетики накопления и молекулярно] массы флуорофоров хрусталика в сроки, предшествующие развитии катаракты. Медицина., Ред.кол.А.Н.Тихонов, В.А.Садовничий и др. М Изд. —во Моск. университета, 1994, С. 22 — 27.

2. Асейчев A.B., Ситарчук И.А., Деев А.И., Владимиров Ю.^ Измерение поверхостного заряда белков методом избирательноп тушения флуоресценции ионами нитрата и цезия, флуоресцентны методы исследования в клинической диагностике. 1992. вып.4., 14.

3. Aseychev A.V., Tjurin— Kuzmin A.U., Deyev A.I., Stebeneva S.A Vladimirov Ju. A. The evaluation of hexose monophosphate shunt activit in isolated mouse lens using the registration of the ferrocyanid—ferricyani« system potential. Chem. Biol. Med., 1996, v.3, 2, pp. 20-27.

4. Deyev A.I., Sitartchuk I.A., Aseychev A.V., Fedorenko B.S Vladimirov Yu.A. Physical and chemical changes in murine lens at earl stage of cataract development initiated by whole body gamma—irradiator Phys. Chem. Biol. Med., 1996, v.3, 2, pp. 38-42.