Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярно-клеточных механизмов ранних стадий катарактогенеза

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярно-клеточных механизмов ранних стадий катарактогенеза"

РГб од

'ПГ50

' ° министерство здравоохранения российской федерации российским государственный медицинский университет

на.лрапах рукописи удк 617. 514

ситарчук Игорь Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ • ИОЛЕКУЛЯРНО - КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ. РАШШХ СТАДИИ КАТАРАКТОГЕНЕЗА.

оз. оо. 02. биоФизика

.Автореферат диссертаиии на соискание ученой степени кандидата медипинских наук

Йосква. 1'993

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском Университете (РГМУ).

Научный руководитель:

академик РАМН, профессор, доктор биологических наук

В. й. ВЛАДИМИРОВ.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Л. Г. КОРКИНА.

кандидат биологических наук В. Е. ФОРМАЗВК.

Ведущая организация - МНИИ заболеваний глаза им. Гельигольца МЭ РФ. •

Завита состоится "..."..... .1993 г. в ... на заседании специализированного совета по эаците диссертаций К.064.14.04 при Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117531. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией ыояно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан ". . ."......1993 г.

Учений секретарь специализированного го&ета. кандидат медицинских |нук

О.Буромский

. ОЛИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, около 90 У. информация человек получает с помошыо зрения'. На сегодня наиболее распространенной причиной'снижения и потери зрения является помутнение хрусталика ■ катаракта, частота которой для лиц старше 50 лет составляет 1 я * г. западных странах и 40Х в развивавшихся странах.: По'данным воз >с мире имеется'до 17 млн слепых вследствие катаракты.'¡следует отметить. что начальные Формы катаракты имеются у значительно больше^ го количества людей. В последние гояы: в связи * с 'Участившимися случаями облучения больших групп населения Авариями' на атомных станциях и т. п. ) актуальным становится изучение^'катаракты, вызванной обшим облучением организма.- <;м - ■ ^ ? • .*•■ ^ ' ' , В настоящее время консервативное лечение катаракты1* является малоэффективным, главным образом потону, что остаются .неясными механизмы развития катаракта на - ранних стадиях заболевания. Лечение катаракты малоэффективно не только''-' котсму, .-что неясен патогенез, но и потому, что начинается'поздно.-' когда происходят необратимые изменения в ' хрусталикб.'- Сведения о ранних этапах катарактогенеза очень скудны, поскольку•исследователями используется трупный материал,'' которого недостаточно. Нет- подходящих моделей, возрастной катаракгы '••"■- > • *

В отличие от прозрачный хрусталиков катарактальиые характеризуются. помимо возросшего светира<;сеяния.: следуютими • типичными чертами:. 1) окислением сульфгидрйльнЫх Групп глутатиона й - бепкоз хрусталика (БресЮг'А . !'ЭЬ5, 1936>;• гг. возрастанием доли ;нера--стсорипых белков и Формированием высокомолекулярных' ¡белковых агрегатов. "(ВБа) 'с молекулярной массой от 4 до. 300-миллионов калькой ией21так л, . 1973)-вначале ' за : счеТ'; слабых иековалентных взаимодействий, а затек дисулЬФидных сшивок; 3) нарушением барьерных свойств мембран - выходом из клетки калия и резким увеличением ;внутги клетки ^¿нцёнтваций жатРия и-кальш1я :<1еМ^'Но С. . ' 1979*• ае<тп1ак и.,.Л !9?б), падением мембранного • потенциала (кагат I П.; 1991). . - - • • . . . ■

•л ' однако, • несмотря'«э. несомненную роль .таких факторов,.катэрак -тогеНеза как оки^яитёлыт: ябЕ^еждеии*'-'липИдов и болкоз. • «»ормиро-:вачйе агрегэтов; * структурно-фушаи^сналыше , нарушения , мембран причинно - следственная 'в-огимо^.вязь.этих- фактов.'смеется:....нчуста-новкенной к Особенности -оля. наиболее' распространенной.: ,

' случаев)", старческсй катагаяти.' "• Для устаноилс-чия }трй,. р.«аи»^свчзя лтёбует'"'-! - детальное Ж':лей!>еание?. сэныг^ р.щйих .стадий, ззбол^чэцчт. Г; этом ¡;.;ан'е особу/.- /зктуал;>ч'>сть . гч-;!': ър» тле"' ус.танорл;?11и:? ..^ои-/л-етйы/. пусл$лов«1тея».мс'сгг»-я. .«кз'ркэ . -. глнячб'мх? я&м-жи.гн». лро-

- г -

исходящих в хрусталике на начальных этапах развития катаракты.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Основной целью настоящей работы было установление конкретной последовательности Физико - химических изменений, происходящих на ранних (до появления видимых помутнений) стадий катаракты, вызванной обшим. облучением организма в сублетальной дозе. Исследовались следующие параметры:

- степень активации свободно - радикальных процессов (по накоплению ИДА);

- уровень антиоксидантной зашита (определение концентрации восстановленного глутатиона);

- модификация белков хрусталика (по накоплению нетриптоФано-вых ФлуороФоров и измерению поверхностного заряда белков).

-сорбаия белков на мембранах в нодельной системе белки хрусталика (кристаллины) -*. эритроциты.

научная новизна результатов. Проведено комплексное изучение ранних, предшествующих помутнению, стадий, развития катаракты, вызванной,оешим однократным облучением организма мышей в сублетальной дозе, что позволило установить временную последовательность Физико - химических изненений раннего катарактогенеза в данном случае. а именно, прослежена кинетика выхода системы регуляции уровня востановленного глутатиона из устойчивого равновесия, проходящего через колебание: нормальное состояние -гиперконленсаиия - декомпенсация.

Впервые пряным методом показано снижение отрицательного заряда кортикальных белксв хрусталика при развитии данного вида катаракты.

Установлено, что снижение отрицательного заряда белков1хрусталика обусловлено уменьшением количества групп с рК 7. г.

Показано, что пигменты-флуороФоры, накапливамаиеся в хрусталике после облучения, относятся в основном к нолекулан. инеюшим молекулярную массу около >0 кд. и к низкомолекулярным продуктам с молекулярной массой менее 1.5 кд.

Показано, что нерастворимые белки хрусталика, накапливающиеся при катаракте, обладают выраженной гемолитическои активностью.

практическое значение работы. Результаты проведенных исследований расширяют теоретические представления о молекулярно -клеточных механизмах катарактогенеза. Полученные данные могут сыть использованы для дальнейшего изучения роли 4изико - химиче- • ских изменений в хрусталике в развитии катаракты. Большое практическое значение имеет Ф*кт выхода из строя системы поддержания антиоксидчнтного статуса хрусталика, что предшествует структурным модификациям белкон и мембран хрусталика.

АПРОШШЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на

Международном съезде патофизиологов п г.Москве в мае 1991г.. на международном симпозиуме "Мембраны хрусталика и 'старение" 6-е октября 1991. з г. Гент. Бельгия, на 4 Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" в г. Москве в Феврале 1992-г.. а также на Симпозиуме стран Содруже-ства "Пути передачи внэклеточного сигнала", в мае 1993 г. в Москве.

структура и он>ем работы, диссертация изложена на пз страницах. содержит г таблицы. 33 рисунка и состоит из введения, глав "Обзор лйтературы". "Материалы и методы". "Результаты и их обсуждения". "Заключение" и выводов. Список литературы включает 196 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОКЫКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ служили хрусталики глаз мышей и человека. Нормальные и катарактальные хрусталики человека были предоставлении мнии глазных болезней им. Гельмгольиа. г. Москва, хрусталики мышеи линии Fi (СВА х С56В1/6) выделяли непосредственно после забоя животных, которых умерщвляли методом цервикального снешения.

радиационную катаракту моделировали однократным обним ганма -облучением мышей на источнике Со-60 в дозе 500 рад (5 Гр).

•определение степени развития радиационной катаракты производили измеряя светопррпускание хрусталика на установке с инфракрасным датчиком, • разработанной В.,Е. формазюком (В. Е. Формазюк. 1990).

концентрацию глутатиона определяли по нетоду iSedlac J. . 1968».

флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметрах "HITACHI MPF 2A" и "HITACHI MPF 44А" (ЯПОНИЯ). ИСПОЛЬЗУЯ ЦИЛИНДРИческие кварцевые кювета с внутренним диаметром 4 им. под пряным углом при комнатной температуре-

РЕГИСТРАЦИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ проводилась г. использованием цветной реакции с г-тиобарбитуровой киглотои (ТБК) по методу (Asahawa Т.. i960). Расчет концентрации мдл производился с учетом разведений на мг белка в исходном гомогенате. коэффициент экстинкиии МДА полагался равным 156000 1/<М сн).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАРЯДА БЕЛКА производилось посредством регистра- ' иии дсннановского потенциала, генерируемого заряженным белком юлев 0.. 19в9). Потеншпл измерялся двумя лотеиииометрическими хлорсеребряными электродами (OP-OBcOl\ FadelKls. Венгрия). СОЛГ'О-тиЕление н*жду электродами составляло f/коло 10 ком. входнбе сопротивление вольтметра 1 МОм.- к /ннентраиия белка при измерениях с с с та влил а с-5 мг/мл.

Измерение доннановского потенциала производилось следующим образом: сначала измерялся потенциал сравнения, т. е. оба электрода помешались во внешний раствор и в течение 5 мин програмно производилось 500 измерений разности потенциалов между электродами. Сред-н?е значение и дисперсия выводились на печатное устройство. Затеи один из электродов погружался в раствор белка и потенциал измерялся в течение 5 мин. затем снова измерялся потенциал сравнения. Этот цикл повторялся по меньшей нере два раза. Разность между средними .значениями потенциала белка и потенциала сравнения использовалась для расчета заряда белка:

zp = (Со(катион)/Ср) ( ex"p(EF/RT> - exp(-EF/RT)). где R - универсальная газовая постоянная (8.314 Дж/К моль). Т-абсолютная температура. Со- концентрация подвижных катионов или анионов. F - константа фарадея (96487 Кл/моль). Zp - заряд белка. ср - концентрация белка. Е - доннановский потенциал.

КОНЦЕНТРАЦИЮ БЕЛКА определяли никробиуретовым методой.

ГЕЛЬФИЛЬТРЛШШ гомогенатов белков мышиных хрусталиков проводилась на колонке сеФадекса G-50 ("Pharmacia". Швеция), диаметр колонки 1 см. высота 30 см. В качестве элюента использовался 1 мн трис-НС1 б м мочевина. рН 7. 4. Фильтрация проводилась при комнатной тенпературе. Скорость элюнии составляла 20 мл/см ч.

Калибровку колонки проводили смесью высокомолекулярного (н > юоооо д> голубого декстрана. ("Pharmacia". Швеция) и триптофана.

Оценочное (приблизительное) определение молекулярных насс фракций проводили по калибровочному графику, который может быть построен по уравнению:

10« Н i 4.79 - 0.42 Vr/Vo. где Vr - обьеи элюента. вышедший из колонки к моненту появления пика, a Yo - свободный обьеи колонки (вне гранул).

ГЕМОЛИЗ эритроцитов кролика проводился нерастворимыми белками кэгарактальных человеческих хрусталиков и хрусталиков облученных мышей. Нерастворимые белки получали путей повторного цнтрифугиро-вания при 10000 об. /нин в течение 40 мин при температуре 5 с. Осадок ресуспензировали и отбирали аликвоты суспензии для измерения концентрации и заряда белка.

Кровь брали из краевой вены уха кролика; Цельная кровь снеши-валась с 3. в* раствором цитрата натрия, приготовленного на забуфе-реннон Физиологическом растворе, в соотношении 9 : 1 по объему. Стабилизированная кровь центрифугировалась при чоо об./мин в течение 20 минут при комнатной температуре. СУпернатант осторожно сливали, а осадок использовали в эксперименте или хранили при температуре 4 С в течени«- суток.

Рабочую суспензии »ритропитоп дня постановки гемолиза готови-

ли путем разведения исходного осадка в 100-200 раз (концентрация . эритроцитов составляла 0.5-1'/ по объему), В рабочую суспензию добавляли исследуемый на гемолитическую активность белок. Для. предотвращения оседания эритроцитов и нерастворимых белков пробы периодически осторожно перемешивали путем переворачивания в закрытой пробирке.

Кинетику гемолиза регистрировали отбирая через определенные промежутки времени аликвоты. Аликвоту центрифугировали 10 мин при 1500 об./нин. а затем измеряли оптическую, плотность супернатанта при 420-нм. В качестве контрольной использовалась проба ье содер-. жашая белка (контроль на спонтанный гемолиз). Степень гемелиэз 'определяли в процентном отношении к полностью гекопнзировавгаеп суспензии, которую получали разведением исходной суспензии гипотоническим раствором.

обработка РЕЗУЛЬТАТОВ. измеряемые величины представлялись в виде средних величин. Разброс определялся по Формуле':

разброс = Ш(п-1)лгп) tin.pl. где 0(п-1) - среднеквадратичное отклонение, п - объем выборки, 4<п,р) - коэффициент стьюдента. Доверительная вероятность принималась равной 95/.

Для проверки нормальности расределяния определяли коэффициенты асимметрии и эксцесса по стандартным Формулам, сравнение рас- пределений производилось с использованием следующих критериев: {.-критерия стьюдента; и-критерия Вилкоксона-манна-Уитки; -серийного критерия (г-критерий) Вальда-Вольфовипа.

'Деление бимодальных распределений концентраций глутатиока у •облученных мышей на составляющие производилось по методу предложенному- в книге В. ¡0. Урбах "Математическая статистика для биологов V и медиков"., н. издательство лн ссср, 1963 г- .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

, .. . ^ УСТАНОВЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ИЗМЬНЕНИИ В ХРУСТАЛИКЕ НА РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ КАТАРАКТЫ. В клинике - начальной катарактой принято считать появление точечных помутнения в хрусталике,% При развитии катаракты, вызванной обшнм облуче-.. , нибм (5Гр). .'мышей сэетопропускание изсли?6ванных хрусталиков начинает прогрессивно снижаться через 2.5 иесяаа после облучений (Рис. 1 а), т. е. объективно, с. пэмошыо :инфракрасного датчика, предложенного ранее ¡В.,Е..формазюк, 19901. Фиксировалось появление , •• помутнений, Нашей целью являлось исследование Физике - химических Ь .параметров на стадии* . предпествушей появлению пом>гиении. На

- б - : ' ■ рис. 1 представлена динамика изменений исследуемых параметров с . течениен времени после облучения.

Измерение содержания восстановленного, глутатиона в гомогена-. те целого хрусталика показало резкое снижение его концентрации через два месяца после облучения, т.е. до появления точечных помутнений (Рис. 1Е). V необлученных животных уровень восстановленного глутатиона на этот срок составлял 9.8 */- 1.0 мкмоль на г, белка, а у облученных животных составлял 3. 3 +/- о. б мкмоль на г белка.

показано увеличение количества, продуктов НетгиптоФановой флуоресценции, с характерным максимумом возбуждения при .340 нм- и испускания при 420 нм (Рис. 1в).

В группах облученных -кышей отмечено возрастание среднего значения концентрации малон'ового диальдегида (ИДА) до 31.15 ♦/5.95 нноль на г белка через. 1.5 месяца, после облучения й до 23.34 */■■ 5.83 имоль ка г белка через два месяца после облучениям > контрольных животных среднее значение концентрации ИДА составило 10.49 +/- 4.2 нколь на г белка. Увеличение средних значений статистически достоверно показано по {.-критерию..- (0,001 < р < 0.01). Динамика изменения концентрации МДА показана на рис. 1Д.

сани по себе Факты повышения уровня продуктов нерекисного окисления липидов (КМ), увеличения нетрилтофановой Флуоресценции и падения уровня восстановленного глутатиона при развитии катаракта известны из литературы (Бабижаев. Деев 1965. 19Ь7 и др. ). В работах А. и. Деева и М. А. Бабижаева показано. что на ранних стадиях сенильпых катаракт человека между степенью помутнения хрусталика, уровнем конечных продуктов пе'рекисного окисления липидов (ИОЛ) и концентрацией востановленного глутатиона существует высо* кая корреляция. Логично предположить- что ; все указанные параметры: прозрачность хрусталика, уровень.продуктов перекисного окисления и концентрация глутатиона - взаимосвязанные параметры единого процесса.

в данной работе ставилась задача установить послёдователь-• ность изменений перечисленных параметров. Поэтому, в отличие от работ предшественников, нами исследовались самые ранние стадки катарактогенеза. По полученным данным на ранних стадиях развития ; катаракты.(до появления помутнений) происходит резкое возрастание ! уровня МДА. накопление Флуоресцирующих . продуктов и последующее падение уровня глутатиона. .

Однако, первым признаком начинавшегося катарактогенного г процесса явились изменения в концентрации глутатиона. Усредненное I значение ¡соьиентраиии глутатиона у облученных мышей через месж- | после облучения нг только но снижалось, но на го/, процентов про- |

0 20 40 во 80 100 120 , время после обпучакия, дни

Рис, 1. Относительные изиенеш-э фиаико-химичеср.йх параметров хрусталикли с Слученных мышей (0 Гр) по мере реэвшгш! радиационной катаракты. Величины п;>из<;д';чы та ¡относительных едшшцгис, т е. по отношению >. соотп«тстбух..щии эначьпиаа ьйлячии у необлучекны* яеиват|*ь>х^ тогй же воарлстл

вышало значение в контроле. Для проверки достоверности этого 1 Факта провели исследование распределения содержания глутатиона в группе облученных и необлученных животных.

ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЙ УРОВНЯ ГЛУТАТИОНА В ГРУППАХ. Представленные на. Рис. 2А гистограмма и функция распределения содержания глутатиона в группе, состоящей из пятнадцати необлученных (контрольных) мышей, демонстрируют, что распределение содержания глутатиона в контроле близко к нормальному. Асимметрия распределения практически равна нулю (Аз = -0.07), эксцесс поло-' хителькый и составляет о. 73. Положительный экспесс свидетельствует о преимущественном накоплении частот в центральных »близких к среднему) классах вариационного ряда, в качестве критерия нормальности распределения служат {.-критерии для -асимметрии и эксцесса. являющиеся отношениями выборочных коэффициентов аз и Ея к их ошибкам репрезентативности, сравнение полученных в эксперименте Ав и Ех с табличными (для п: 15 1.03 и 0.89. соответственно) показывает, что у контрольных животных распределение глутатиона ■ подчиняется нормальному закону, поскольку асимметрия и эксаесс не превышают критических значений. Среднее значение концентрации глутатиона у контрольных животных составило 7.03 ♦/- 0.61 мкноль -на г белка.

По сравнению с контрольными необлученными животными у облу- \ ' ченных шгдеи через 1. 5 месяца после облучения наблюдается изменение распределения содержания глутатиона (рис.ДБ). Распределение становится отг^ичным от нормального, так как значение зкиесса Ех =■ -1.31 превышает по абсолютному значению критическое значение (для п=18 Ех = 0.900). Среднее значение концентрации восстановленного глутатиона составило б. 76 1.46 мкноль на г белка, сравнение средних значений у неослучекных и облученных животных по г-кгитерию Стьюдента и проверка гипотезы о различии контрольной и опытной выбогок по и-критери» Вилкоксона - Наниа - Уитни не выявили статистически значимых различий. Применение '. серийного г-критерия Вллъда ■■ ВольФовииа. выявляющего любые различия в распределениях, показывает статистически достоверные (р = 0.025) различия именно в рас пределеннях , содержания глутатиона в контрольной к опытной (облученной) группах животных. •

Отклонение распределения от нормального всегда наводит на мысль о тон. что изучаемая совокупность не является однородной. Основываясь на этом предположении, была предпринята попытка вычислить парам?тры составлявших г.одссрокупнсстеи. Так. считая что является'Синодальным <в Г:>ль;-у этсто предположения свидетельствует :<н*чнмыи отгилчтелькый ' эк:;:-:-сс и внеании вид гистограммы частот - Рис. еб; и • г.рся;г. .-сжив равенство дисперсий

0.4

«а0-5

Е-о

аз

tr

0.1

0.0

3.6 4.5 б.б в.5 7.5 в.5 0.6 ЮЛ

Концентрация ОБН. мкмоль на г белка

10 12 14

Концентрация GSH, ыкиоль на г белка

г э 4 б в 7 в a ton 1213 Концентрация GSH, мкмоль на г белка

2 мее после облучения 1.5 мес после облучения контроль

1 а а 4 в в 7 в о Ю111313 Концентрация СЭН, мкмоль на г белка

Рис. 2. Гкстограмы и функции распределения содержания восстановленного глутатиона (иЗД) в хрусталиках необлученных (А) и облученных мышеА через 1.5 (Б) и 2 (В) Месяца после облучения в дозе 5 Гр. Сравнение функций распределения приведено на рис. Г. У необлученных животных наблюдается нормальное распределение; облученные животные демонстрируют бимодальное распределение, которое разложено на две нормальные составляющие: с повышенным и пониженным содержанием глутатиона.

N •" -(х-<х>)' '•

ф(х) = —ехр (——).

где N - объем,

л/ 2rr а

2а

среднее значение и О —среднеквадратичное отклонение совокупности или яолсовокулиооти;

о

подсовокупностей, ны нашли параметры составляющих подсовокупностей. Другими словами, исходное бимодальное распределение может быть представлено как сумма двух нормальных распределений со следующими параметрами: 1-я подсовокупность имеет объем в вариант, среднее 3.50 и среднеквадратичное отклонение 1.09 мкмоль глутатиона на г белка; 2-я подсовокупность содержит 10 вариант, среднее 9. 16 и среднеквадратичное отклонение 1.09 мкмоль глутати* она на г белка;. кривые распределений этих подсовокупностей изображены на Рис. 2 (Б и Г), можно сделать вывод, что в исследуемой группе присутствуют две подгруппы: одна - с пониженным, другая - с повышенным содержанием восстановленного глутатиона относительно контрольной группы (среднее значение в контрольной групе 7.03 нкмоль на г белка).

Была проверена гипотеза о различии контрольной группы животных и каждой из полученных подгрупп по критерию u. Выявлены достоверные различия в средних тенденциях как у подгруппы смешенной в область меньших концентраций глутатиона, так и у подгруппы с повышенным его содержанием.

Через 2 месяца после облучения распределение содержания ■глутатиона также не соответствует нормальному (Рис. 2В). т.к. инеет превышающий критическое значение (0.890 для р=0. 01) отрицательный эксцесс (Ex : -1.099). Среднее значение концентрации восстановленного глутатиона составило 5.63 ♦/- 1.45 мкмоль на г белка. Статистически достоверных различий контрольной и опытной выборок no t-критерию Стьюдента и по U-критерию. выявить не удалось. серийный критерий (г) показал достоверное различие в опытном и контрольном распределениях. Провели разделение исходной совокупности на подсовокупности. • В результате исходное бимодальное распределение представлено как сумма двух нормальных распределений со /следующими параметрами: J-я подсовокупность инеет объем ié вариант, среднее 3.60 и среднеквадратичное отклонение 1.05 мкмоль глутатиона на г белка; 2-я подсовокупность содержите вариант, среднее 9.45 и среднеквадратичное отклонение 1. 05 мкмоль глутатиона на г белка:. Кривые распределений зтих подсовокупностей изображены на Рис.г (В и Г), в исследуемой группе также как и через 1. 5 месяца после облучения присутствуют две подгруппы: одна - с пониженным, другая - с повышенным содержанием восстановленного глутатиона относительно контрольной группы.

Существенным отличием распределений облученных мшн-и с 1.5-мс-сячннм и 2-месячнын сроком поело о^луч«?нич яьляется наличие в далеким соотношении подгрупп. Так ч^геэ 1.*' нгсица после облучения д'.'ля жинотных С Повышенным СОЛ1-Г'ж.1НКеМ Г дут 1тион.1 '/.) преобладает над долей > г.г.нижьцным его содержанием (42/). Через ¿

месяца после облучения наблюдается обратное соотношение - доля животных с повышенным содержанием глутатиона (3bZ) меньше доли с пониженный содержанием <65'/.) (Рис. 2Г).

: Значения асинметрии и эксцесса, расчитанные в эксперименте для группы животных с 4-х месячным сроком после облучения не превышают критических табличных значения, что свидетельствует о нормальном распределении содержания глутатиона в данной группе. Среднее значение содержания восстановленного глутатиона в указанной групе составило з. 95 мкмоль на г белка.

Таким образом показано, что повышение уровня глутатиона через месяи после общего облучения животных можно рассматривать как Физиологическую реакцию на активацию свободнорадикальных процессов, играющих большую роль в развитии катаракты (A.Spec tor, 1965. 1986). Можно предположив, что еыход .системы регуляции уровня глутатиона из устойчивого равновесия происходит через колебание: нормальное состояние - гиперкомпенсация (повышенное содержание глутатиона, как реакция на окислительный стресс, . вызванный облучением) - декомпенсация (срыв компенсации, окончательное падение уровня глутатиона).

ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДЫ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ПРОДУКТОВ. Олнин ИЗ самых ранних параметров развития катаракты является увеличение количества продуктов нетриптоФановой Флуоресценции, с характерным максимумом возбуждения при 3')0 ни и испускания при 420 нм. Большинство исследователей считают, что эта флуоресценция обусловлена появлением окисленных Форм триптофана <Н. т. Айтмлгамбетов 1989. P. Stluso, 1988). следует, отметить двойственный характер последствий накопления ФлуороФоров в хрусталиках. С одной стороны они выполняют У*>ль светофильтров, поглошая ультрафиолет, а с другой -накопление ФлуороФоров ножет приводить к усилению' генерации на свету активных Форм ки-лорода и снижению антиокислительного потенциала хрусталика.

Происхождение нетриптоФановой Флуоресценции до настоящего времени вызывает много споров. Ранее в работе (Айтмагамос-тов И. Т.- 1989) на кафедре, биофизики РГМУ показано, что п данной модели катаракты Флуоресцирующие продукты представляют из себя вешества нелипидного происхождения. Более того, характерные спектры испускания флуоресцирующих продуктов практически совладает с таковыми для нетриптоФзйовых ФлуороФоров нормальных хг-усга-. ликов быка, которые,. как было - показано я работе (P. St 1 изо. 1988). являются- дериватами триптофана.

Оставался неясным вопрос: какои триптофан кодг-.ег-г-а« •» с я <л>ж-'дитмгоЯйй.'модификации - свободный .триптофан, или -:ри.1тоФэим;ие

остатки S полипе-л тидной цепи? Этот вопрос тесно сьясо r.<.is ■

- 12 7 .'-.... :

тапим: окислительная модификация триптофанилов происходит в ■ самом хрусталике или же за его пределами (например, в очагах хронических воспалений, возникающих после обшего облучения организма)?

Для того, чтобы выяснить характер Флуоресцирующих продуктов мы денатурировали белки хрусталиков мышей б М ночевикой и проводили их разделение на колонке сеФадекса с-50. Профили элюции гоногената хрусталиков облученных и необлученных мышей представ-, лены рис. 3, Продукты нетриптофановой Флуоресценции (возбуждение зчо ни. испускание 420 нм) распределились в элюате неравномерно, образовав два пика - высокомолекулярный и низкомолекулярный в гоиогенатах нормальных хрусталиков и три пика высоко-, средне-- и низкомолехулярный в гоиогенатах.облученных хрусталиков. При прак-. • тически одинаковой концентрации белка отмечается значительное увеличение количества Флуоресцирующих продуктов в хрусталиках облученных мышей.

Как видно из рис.3 и.4 ф'луорофоры. появляющиеся в хрусталике после облучения относятся в основном к молекулам..имеющим молекулярную масс/ около 5 кД и низкомолс-кулярным продуктам, с молекулярной массой менее 1.5 кд.

изучение заряда белкоз хрусталика, падение уровня : глутатио-иа. возрастание количества ида и флуоресцирующих продуктов сами . по себе не являются непосредственной причиной возрастания светорассеяния. /

С Физической точки зрения, рассеяние может происходить на объектах, по размерам сравнимых с длиной волны (больше 1/20 длины волны). Этим условиям удовлетворяют высокомолекулярные . белковые агрегаты, образующиеся в хрусталике при катаракте (Р. Веие1Ье1т, 5 986). В этой связи представляется интересным исследовать' заряд белков хрусталика, поскольку именно заряд белков играет определяющую роль в Формировании агрегатов.

Ранее (Деев А. И. , Айтмагамбетов К. Т.. 1991). было предположено уменьшение отрицательного заряда белков хрусталика по мере развития радиационной катаракты, это предположение ; основывалось на основании результатов полученных при тушении собственной Флуоресценции белков хрусталика анионами нитрата калия. Было показано достоверное увеличение константы тушения,е 1. З.раэа лги развитии катаракты, вызванной ббшим облучением мышей й дозе 5 Г'р. ' •

Однако, следует иметь ввиду, что константа тушения отражает только локальный 'заряд вокруг триптоф^чилов и. к тому же. 'зависит от времени жизни возбужденного состояния триптофанилов - белка, а также от стерических Факторов расположения-триптофанилов в белке.

Нами для измерения заряда белков был применен прямой, метол , основанный ка регистрации доннановского потенциала (в. олев. Чч

Объем элюции, мл

Рис 3. Профили элюцаи гомогенатов хрусталиков мышей в контроле и через 3 месяца -после облучения в дозе 5 Гр в 1 мм трис-НС), в М мочевине, рН 7,4 . на колонке оефадекса С-50. Условия регистрации флуоресценции ( лех=340 Лет=420 нм).

РвсЛ.Дкфферсвцяатный профиль олюцни гоиогентои хрусталиков мышей в контроле и через 3 месяца после облучения о доэп 5 Гр в 1 иМ трис-НС1, в М мочевине, рН 7,4 На колонке сефадекса й-50. Условия регистрации флуоресценции \ех=340 нм, X ет-420 пм.

al.. 1989). Этот метод позволяет измерять даже близкие к нулю заряди, причем как у растворимых, так и у нерастворимых белков. Измерение заряда происходит при низких ионных силах (10 мн Naci). в то время как при тушении Флуоресценции высокая концентрация тушителя создает больш/ю ионную силу. Главный отличием данного метода измерения заряда белка от метода, основанного на тушении Флуоресценции, является то. что при измерении доннановского потенциала определяется общий (суммарный) поверхностный заряд белка, а не локальный заряд вблизи триптоФанового остатка, влияющий на значение константы тушения Флуоресценции.

Как следует из рис. 1Г. 5 и б снижение отрицательного заряда кортикальных белков хрусталиков облученных мышей происходит иа го/ через с месяца и на 50'/. через 4 несяца после облучения.

Келки ядер хрусталиков облученных мышей обнаруживали более слабое снижение заряда - около 10'/- через 4 месяца после облучения

(рис. 5).

средний заряд растворимых белков кортекса. приходящийся на условную субьепиницу белка (20 кД) при рН 7. 4 составлял для мышиных хрусталиков: -й. г.

Для выяснения вопроса о природе заряженных групп исследовали зависимость заряда от рн (рис. 7 и 8). Как видно из приведенных данных рК групп, определяющих'заряд близко к 7. г. что соответствует значению рк фосфатидилсерина. С развитием радиационной катаракта количество этих групп снижается..что приводит к уплоше-нию кривой (рис. 7), т.е. уменьшению разности нежду, зарядами в кислой и щелочной областях (рис. 8).

Таким образом, такая существенная модификация белков хрусталика. как изменение заряда, начинается на ранних стадиях ката-рактогенного процесса (рис. 1 Г). и.■ по-видимому. . обусловлена нарушением процесса фосфорилирования белков хрусталика. Снижение отрицательного заряда белков хрусталика,способствует образованию в»1-1жс-мйл1'кулярннх белковых агрегатов. Интересно отметить, что по млрнич» С. 5 кудряшобп (1987) и А.С.Соболева (1962) регуляция Фис-Jopi!;!.u4.iання б-.-лков является наиболее радиочувствительным процессам к клетке. ■■ ' ... . ^

Однако, см но по себе образование агрегатов при высокой ; кон-цент; шии белка iболее £0 обменных процентов) с Физической точки • :utir.i- не должно вызывать увеличения светорассеяния., (f'.l<- г • 'U.fim. lvfio. В работе (Г.'-yev А. !. et al. . !99П высказа- -и г.гiчто агрегаты сортируется на мембранах, нарушая' • :•»: vчг. ч?чнсе растя >жение и.; барм-рнке свойства. при этом >•.::!' j ,'г:мемб» интенсивно г = :ссиьа>.г свет. . Б .пользу

:.ачт.' чте-пл? ра?№.т"и' 'ка^аРактя

Рис. б.Ипменение заряда белков, кортекса и ядра мышиных хрусталиков а ходе развития катаракты, вызванной общий у-облучениеы - мышей в дозе 5 Гр. Заряды приведены по отношению к контрольный (необлучепным) животным того же возраста.

Рис. в.Заряд белков кортекса хрусталиков мышей на различных сроках поело общего облучения. Средний молекулярный вес суб-ьединяцы белки принимался равным 20 кД. Концентрация белка составляла от 2 до 5 иг/мл.

ММ> Необлучевные

_ИЗ Облученные (2 нес.'

00000 Облученные (6 нес '

в в

рН

Рис. 7.рН-аависииости заряда белков кортекса

хрусталиков облученных (5 Гр) мышей на' различных сроках после облучения.

1В

15

ы 12

и

«ь

1 а 9

с<Г в

<

3

0

необлученные

облученные

) 2 4 а . .

Вреыл после облучения, мес. Рис, в.Кинетика изменения разности зародов белков кортекса • хрусталиков при рН 2 и 12 (Д '¿) у необлученных и облученных мышей, ". Доза облучения 5 Гр"

наблюдается нарушение барьерных свойств ненбран - выход из клетки калия и вход в нее кальция и натрия (G.Duncan. 1975. J. JedzmiaK. 1976). •

Для проверки этого предположения исследовали взаимодеиствие еелков нормальных и катаракталькых хрусталиком с эритрс1штани. которые являются удобной мишенью для исследования сорбции крупных частиц (пылей. токсинов и т. п.).

Эта часть работы выполнялась преимущественно на материале человеческих хрусталиков, что обусловлено необходимостью иметь достаточное количество белка для опытов по гемолизу. Для сравнения можно отметить, что диаметр человеческого хрусталика в г-ю раз больше диаметра мышиного. I

Сравнение гемолитической активности растворимых и нерастпо- ■ Римых белков человеческих хрусталиков показало, что гемолиз вызывают исключительно нерастворимые белки (рис. 9). Добавление растворимых белков не изненяло кинетики спонтанного гемолиза.

Степень гемолиза зависела от' заряда нерастворимых белков (рис. 10). А именно, по мере уменьшения заряда, (с -4.5 до -1.0) гемолитическая активность возрастала. Однако наблюдалось и некоторое снижение гемолитической активности в диапазоне от -1.0 до О. О на субьединииу белка 20 кд. Белки с зарядом по абсолютной величине более 5 практически не обладают заметным гемолитическим эффектом. Поэтому нерастворимые белки нормальных человеческих хрусталИкоз, имеющие средний заряч -б ед. , не .обладали гемолитическим эФФектон. '

На рис.11 изображена типичная кривая гемолиза суспензии эритроцитов кролика нерастворимыми белками человеческих хрусталиков. На кривой кинетики гемолиза отмечается три участка: "латентная" Фаза (медленное нарастание степени гемолиза), «аза ускоренного гемолиза и выход на "плато". Время перехода из одной Фазы в другую варьйровало в зависимости от концентрации и эагяда белка. Больпая часть опытов проводилась при концентрации белка 1 нг/мл. поэтому, как правило, наблюдались лишь первая и ьторая Фазы гемолиза.

Для определения характера гемолиза (т. е опенки вкладов 4изи-ческих и химических реакций) исследовалась зависимость степени гемолиза от температуры для нерастворимых белков катарактамьных хрусталиков человека (рис. 12) и нерастворимкх белков хрусталиков облученных мкаей (Рис.13). значения энергии активации и коэффициента 0)0 приведены в таблице

Как следует и? полученных данные (невысокие значения энергии активации» определяв!» вклад в ловрЕжле-ние эритроцитов вносят {изические Фактор«. вероятно. со рбиич крупных молек/л (г;-,-

<0 30

К О

§го и

tí_ttí хонтроль аиаОР нерастворимые А4&АА растворимые

О 60 100 150 200

Время, мин.

Рис. 9 .Гемолитическая активность растпорииых' и нерастворимых белков хрусталиков человека на стадии зрелой старческой ,' катаракты. «»0.12

000-о------2 о

Заряд усл. ед. белка Рис. 10.Стелет. гемолиза суспензии эритроцитов через 50 ъсин. после добавления суспензии нерастворимых белков хрусталиков,человека:в вависииости от заряда иа условную ед. белка (20 кД). Белка , 1 мг/ыл, эритроцитов 0.5 55. «о.во

40 во 30 100 -, '

Зромя, мин. ; \

Рис. И-Типичнпа кривая гемолиза суспензии эритроцитов кролика нерастворимыми белками катарактал^ных' хрусталиков человека. Концентрация белка 12' мг/ыл. концентрация эритроцитов 0.1.5(5 ."

-1в-

еЗ 0.7

н О

о К -'--1-* > .---1---

га зо з& 40 4в

Температура Рис. 12.Степень геиолиза суспензии эритроцитов нерастворимыми белками катарактального хрусталика человека в зависимости от температуры инкубации черва 106 мин. после начала опыта.

Температура инкубации РисЛЗ.Стерепь гемолиза сспевзии эритроцитов нерастворимыми белками хрусталиков облученных мышей в зависимости от температуры через 1.5 часа после начала гемолиза. Таблица 1.Значения Чю и энергии активации Е«»,. процесса гемолиза эритроцитов кролика нерастворимой фракцией белков человеческих кптарактальных хрусталиков и хрусталиков облученных (б Гр) мышей.

Еакт. сДж/иога

Человеческие хрусталики 1.00 в.15

Мышиные хрусталики 1.13 8.16

- 20 -

видимому, агрегатов белка) на мембрану.

таким образом, показано, что слабозаряженные нерастворимые белки действительно могут повреждать мембраны, сорбируясь на них.

Итак, полученные данные подтверждают высказанное ранее предположение шеуе'/ а. I.. \nadimirov Уи. А.. 1991) о том. что снижение заряда белков, возножно. за счет нарушения регуляции Фосюрилирования. ведет к помутнению не за счет образования агрегатов, а путем наруисния упорядоченного расположения мембран хрусталиков.

ВЫВОДЫ

!.на ранних стадиях (до появления видимых помутнений) развития катаракты, вызванной обшим облучением организма нарушается регуляция системы, поддерживающей оптимальный уровень глутатиона. Нормальное распределение содержания восстановленного глутатиона, присущее необлученным животным, у облученных животных, становится двухвершинным с появлением особей имеющих как повышенное, так и пониженное содержание глутатиона. С течением времени после облучения увеличивается доля животных с пониженным содержанием глута-• тиона. что приводит, в конечном счете., к нормальному распределению с пониженный содержанием'глутатиона (через 4 месяца-после облуче- -ния). Это позволяет предположить, что выход системы регуляции . уровня глутатиона из устойчивого равновесия происходит через'-колебание: нормальное состояние - гиперкомпенсация - декомпекса-иия. .' •

г.на ранних стадиях развития катаракты (через г месяца), вызванной обшм облучением организма, происходит'двукратное увеличение уровня нда в хрусталиках облученных нышей. ._'..

3.пигменты - флуороФоры. накапливающиеся в хрусталике после облучения, относятся в основном к молекулам, имеющим молекулярную, массу около ю кД и. в меньшей нере к низксмолекулярннк продуктан с Н < 1.5 КД. ." V "

4. Прямым методом, основанным на регистрации доннановского потенциала, показано снижение отрицательного- наряда кортикальных. белков хрусталиков облученных мышеи по мере' развития катаракты. Отрицательный заряд снижается на 20'/- через; 2 месяца , и, на 50'/ , чегез Ч месяиа после облучения животных в. дозе. 5 Гр.

средний заряд нз условную единицу белка 20 кД при рн .7,4 состамчл р норме для милей.-г. £. а для человека -8. о. •

«•. Измерение заряда в оаЕи;имости от ри показало, что РК :<агчжг-нккх групп г>г лкс-в «-ысиных и человеческих хрусталиков близко

к т. 2. С развитием катаракты, вызванной обшим облучением мышеи, наблюдается уменьшение количества этих заряженных групп.

б. Нерастворимые белки хрусталиков обладают выраженной гемолитической активностью. Невысокое значение энергии активации показывает, что гемолиз идет при определяющем вкладе Физических процессов. Растворимые белки хрусталиков не обладают гемолитической активностью.

Список работ опубликованных по теие диссертации.

1. Reduction protein negative charge of murine 1епз cortex at early stages of radiation-induced and hereditary cataract. <1991). Proc. Inter. Soc. for PathoPhvsiol. 1, Moscow, Abstracts. 9.3.17. p. 227-228, (Co-authors; Deyev A. I.. Altmagambetov M. T. ).

2. Sequence of Physlcaland chemical changes in murine lens with cataract development initiated by total gamma-Irradiation. (1991) EURAGE. Leiden. Lens Membranes .and Aging. Topics in aeing research in Europe, v. 15. Ed. G. F. J. H. vrensen. J. Clauwaert, p. 247-259. (Co-authors: Deyev A. I.. Vladlmlrov Yu. A.. Altmagambetov H. T. , KabatchenKo A. N. )

3. оценка заряда кортикальных белков хрусталиков мышей нетодом избирательного тушения Флуоресценции на ранних стадиях развития радиационной и наследственной катаракт. В кн. : Флуоресцентные методы исследования и клинической диагностики, вып. 4. май 1992 г. 4 Всесоюзное совещание "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", тезисы докладов. Москву. 1992. стр. 12. (Соавторы: Айтмагаибетов М. Т., Леев А. И.. Владимиров ю. а. >.

4. Измерение поверхностного заряда белков методон избирательного тушения Флуоресценции ионами нитрата и цезия, в кн. : Флуоресцентные методы исследования и клинической диагностики, вып.4. май 1992 г. 4 Всесоюзное совешание "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", тезисы докладов, носква. 1992, стр. 12. (Соавторы: Асейчев А. В.. Деев А. И.. Владимиров Ю. А.).