Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические особенности катарактогенеза у молоди семги

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические особенности катарактогенеза у молоди семги"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ.А.Н.БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

! III

На правах рукописи

ТОЙВОНЕН Лолита Владимировна

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАТАРАКТОГЕНЕЗА У МОЛОДИ СЕМГИ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук,

профессор В.С.СИДОРОВ

доктор биологических наук, ст.н.с. В.Б.МАТКШШЕВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук М.С.КРЩКИЙ

кандидат биологических наук А.И.ЛЕЕВ

Ведущая организация - Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова (г.Москва)

Защита состоится " 6 " 1995г. в ^час. ~ мин,

на заседании» Диссертационного совета К.002.96.01. по присуждению ученой степени кандидата наук при Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Адрес: 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2. -

Автореферат разослан " луо-^ 1995г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы ЯАН (Ленинский проспект, 33, корп.1).

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биохимические и экологические аспекты процессов жизнедеятельности, имея многочисленные точки соприкбсновения, особенно важны для понимания причин устойчивости организма в постоянно меняющихся условиях внешней среды. Изучению изменчивости содержания веществ в клетке в зависимости от разнообразных эколого-биохимических особенностей организма рыб посвящен целый ряд работ, значительное внимание в них уделяется экологическим аспектам биохимии ли-пидоб (Шульман, 1972; Шатуновский, 1980; Крепе, 1981; Сидоров, 1983).

Исследования в данной области важны не только для всестороннего раскрытия особенностей метаболизма у рыб, но необходимы также для решения некоторых практических задач. В частности, это касается проблемы катаракты у молоди лососевых рыб, создающей, серьезные трудности рыбоводным хозяйствам всего мира (Hoffman,1976; Moore,1984).

В последнее время на некоторых Карельских рыбоводных заводах при размножении хозяйственно ценных лососевых видов рыб возникло тяжелое заболевание глаз молоди рыб-"белогла-зие" (катаракта). ■ Исследование оптомоторной реакции остроты зрения молоди семги, выращенной на Кемском и Выгском рыбоводных заводах, показало, что слабое зрение имели до 30%, а полную потерю зрения- до 35Х всех выращенных рыб.

Изучение патогенеза заболевания позволило установить наличие у рыб ядерной формы катаракты. Реже наблюдаются другие формы катаракты и иные патологические изменения, такие как недоразвитие хрусталика и сужение зрачка. Катаракта появляется уже на первом году выращивания рыб (в возрасте 2-3 месяцев). Наиболее восприимчивы к данному заболеванию озерный лосось и палия.

Поскольку результатами предварительных исследований паразитарная природа катаракты в данном случае исключается, наиболее вероятной причиной ее возникновения является алиментарный фактор.

Определение в кормах тех компонентов, недостаток которых может вызвать катаракту, сопряжено с большой затратой времени и значительными материальными издержками, но в итоге необходимая строгость заключений не гарантируется. Изу-

- г -

чение биохимического статуса и обмена веществ у больных катарактой рыб по сравнению со здоровыми открывает новые возможности в решении проблемы оценки качества корма.

Кроме того, поскольку патогенез катаракты у рыб, животных и человека имеет однотипный биохимический базис (окислительное повреждение липидов и белков, деструкция мембран хрусталиковых волокон, образование высокомолекулярных белковых агрегатов), рыбы как объект исследования представляют дополнительный интерес. В связи с этим особую актуальность приобретает сравнительное биохимическое изучение не только хрусталиков, но и печени больных и здоровых особей.

Дели и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение биохимического фона катаракты у молоди семги. Решались следующие задачи:

- исследовать липидный статус хрусталиков семги и установить характерные для него особенности;

- проследить за изменениями биохимических показателей в хрусталиках рыб, пораженных катарактой;

- исследовать липидный статус печени семги й возможные метаболические нарушения в ней, связанные с болезнью.

- изучить состояние' свободно-радикальных процессов и систем "гашения"свободных радикалов- в хрусталиках и печени больной рыбы..

Фиксировались следующие биохимические параметры: - липидный комплекс хрусталиков и печени семги ( общие липиды.их основные классы - фосфолипиды, триацилглицерины, холестерин и его эфиры, а также отдельные группы фосфолипидов - фосфа-тидилхолин, лизофосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфин-гомиелин.фосфатидилсерин, кардиолипин, фосфатидная кислота); - жирнокислотный состав общих липидов в тканях хрусталиков и печени; - степень активации свободно-радикальных процессов ( па накоплению маланового диальдегида); уровень антиокси-дантной защиты ( определение концентрации восстановленного глутатиона, жирорастворимых витаминов А и Е); - активность в хрусталиках Са++-зависимого протеолитического фермента-каль-паина.

Научная новизна. Проведено комплексное биохимическое исследование хрусталиков семги, здоровой и пораженной ката-

рактой.

Впервые проанализирован состав мембранных дипидов хрусталиков рыбы и характер жирнокислотных спектров этих липидов в норме и при "белоглазии".Установлены значительные изменения в липидном комплексе хрусталиков больных рыб.

Впервые параллельно с исследованиями хрусталиков проведен биохимический анализ печени здоровой и пораженной рыбы. Выявлена связь между изменениями липидного состава, жирно-кислотных спектров, уровня малонового диальдегида в печени и хрусталиках семги.

В хрусталиках рыбы впервые оценена активность Са++-за-висимых протеолитических ферментов. При катаракте обнаружено снижение активности двух форм кальпаина.

Практическое значение работы определяется тем, что про-, веденные исследования подтверждают алиментарное происхождение "белоглазия" у семги, выращенной на искусственных гранулированных кормах. Выявленные изменения метаболизма в печени, в том числе - нарушения процессов перекисного окисления липидов, рекомендуют практикам обратить особое внимание на витаминную и жирнокислотную' сбалансированность кормов,а также на наличие в них перекисей. Полученные результаты, явля-' ясь свидетельством в пользу тогц, что окислительный стресс может быть пусковым фактором в патогенезе катаракты, указывают также на необходимость контроля за содержанием в кормах достаточной доли антиоксид антов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для состава липидов хрусталиков семги характерно высокое содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. При катаракте происходит количественное перераспределение липидных фракций и возрастает коэффициент ХЛ/ФЛ.

2. Нарушения липидного метаболизма, сопутствующие катаракте, возникают не только в хрусталиках, но и в печени больной рыбы, о чем свидетельствуют однотипные перестройки в фосфолипидах печени однолетней и двухлетней катарактальной семги.

3. В хрусталиках и в печени семги разного возраста ка-тарактогенез сопровождается интенсификацией окислительных процессов и снижением уровня антиоксидантной защиты.

4. В хрусталиках больной рыбы происходит снижение активности Са++-зависимого протеолитического фермента кальдайна, которой может способствовать помутнению линзы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XXIII Всесоюзной конференции "Биологические ресурсы водоемов бассейна Балтийского моря" /Петрозаводск, 1991/, VIII Научной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" /Петрозаводск, 1992/, Международном симпозиуме по зо-оиндикации и экотоксикологии животных в условиях техногенного ландшафта /Днепропетровск, 1993/, VI Симпозиуме по биохимии липидов /Санкт-Петербург, 1994/.'

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 35 рисунками. Список литературы включает 355 наименований, в том числе'249 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

. Объектом исследования служили однолетки и двухлетки семги,, выращенные на Выгском рыбоводном заводе (Карелия). Предметом исследования являлись печень и хрусталики здоровых и больных катарактой рыб. В качестве общего контроля использовалась рыба, содержащаяся на кормах, не вызывающих "белог-лазие". Из совокупности особей, получавших искусственный гранулированный корм РГМ, отбиралась катарактальная рыба, имевшая только зрелую ядерную катаракту, для чего хрусталики были подвергнуты биомикроскопическому исследованию. Кроме тога, у сеголеток семги из этих же бассейнов отбирались особи, не имевшие видимых признаков болезни и служившие поэтому контролем патологического состояния - нормой.

Для анализа липидов собранный материал гомогенизировали и фиксировали смесью хлороформа с метанолом. Липиды экстрагировали по методу фолча (Folch et al., 1957). Разделение

суммарных липидов и фосфолипидов на фракции проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии. Количественное определение общих фосфолипидов, триацидглицеринов и эфиров холестерина проводили гидроксаматным методом (Сидоров и др., 1972). Холестерин определяли по реакции с окрашивающим реагентом (Engelbrecht et al., 1974). Содержание индивидуальных фосфолипидов определяли по фосфору (Rouser et al., 1956). Жирнокислотный состав липидов изучали с помощью газожидкостной хроматографии (Цыганов, 1971). Неэтерифициро-ванные жирные кислоты определяли по методу Прохорова с со-авт. (1977), переводя их в медные соли с дальнейшим образованием окрашенных комплексов в присутствии реагента на медь.

Регистрация продуктов перекисного окисления липидов проводилась с использованием цветной реакции с 2-тиобарбиту-ровой кислотой (ТБК) (Владимиров,Арчаков, 1972).

Разделение и анализ жирорастворимых витаминов А и Е осуществлялся с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Руоколайнен и др.,1993).

Концентрацию глутатиона и белковых тиоловых групп определяли по методу Седлак (Sedlac J., 1968).

Концентрашт белка регистрировали методом Брэдфорд (Bradford, 1976), основанным на связывании с белками Кумасси синего G-250.

' Гельфильтрацию гомогенатов хрусталиков проводили на колонке с ультрогелем АсА-34 ("Pharmacia" .Швеция), используя аппаратуру для хроматографии (LKB). Калибровку колонки (2.5x95см) выполняли смесью белков с известной молекулярной массой (трипсин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулин) при скорости элюции 20 мл/час.

Активность кальций-зависимой протеиназы - кальпаина определяли стандартным методом анализа по гидролизу казеина (Murachl ct al.,1981).

Обработка результатов. Результаты проведенных экспериментов обработаны статистически с применением общепринятых статистических методов (Матшичев,1990), для сравнения выборок пользовались также непараметрическим критерием Внлкоксо-на-Манна-Уитни (Гублер,1978).

-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Установление алиментарной природы капараюш у полот семги. Эксперимент по выращиванию рыб на гранулированном корме РГМ, на рационах, содержащих различные пищевые добавки к основному корму, и при полной замене РГМ на свежую печень и селезенку показал, что на чистом корме РГМ до 60% семги оказалось больной, но при добавлении в диету различных витаминов и сухого молока, а также при полной замене стартового корма частота появления катаракты снижалась до 0,5-2,0% . Таким образом, было доказано алиментарное происхождение болезни на рыбоводных заводах Карелии.

Определение лхпщщого статуса хрусталиков глаз семги, имеющего ряд отличительных характеристик, стало одним из основных результатов представленной работы. Наряду с типичным для всех исследованных хрусталиков животных и человека (F.eldman,1968; ' Broekhuyse,1973; Obara et al., 1976) преобладанием в составе липидов холестерина и фосфолипидов,в последних у семги доминировали фракции фосфатидилхолина и фос-фатидилэтаноламина. Такое распределение характерно для фосфолипидов кролика и быка, в то время как у человека основным по содержанию является сфингомиелин (Cotlier et al., 1978;Rosenfeld,Spector,1981.).

. Лшщдный состав хрусталиков семги претерпевает ряд изменений, связанных с возрастом и катарактой. Увеличение ли-пидного содержания в линзе здоровых двухлеток происходило за счет фосфолипидов и холестерина (рис.1),что хорошо согласуется с литературными данными (Troche,Mandel,1959; Cenedel-1а,1982). Но в отличие от человеческих хрусталиков,развитие которых сопровождается повышением уровня сфингомиелина, у двухлеток семги выросло также содержание фосфатидилхолина. Кроме того, в сумме фосфолипидов отмечалось сокращение доли трудноокисляемых .фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина Срис.2), что наряду с вышеуказанными изменениями способствовала стабилизации липидного бислоя и повышало его защиту от процессов свободно-радикального окисления.

Подтверждением этого служит снижение в хрусталиках двух-годовиков уровня MSA по сравнению с сеголетками. Возрастание концентрации данного продукта свободно-радикального окисле-

300 г

МКГ/ХРУСТНЛИК

♦л тяг хл зхл

Рис.1. Содержание липидов в хрусталиках здоровых сеголеток и двухлеток семги: Ю- сеголетки;^^- двухлетки ОЛ - общие липиды; ФЛ - фосфолипиды; ТАГ - триацилг лицерины; ХЛ.ЗХЛ - холестерин и его эфиры

от сайт

ФХ С»М »ЭЯ Л»Х К ФК

Рис.2 Содержание фосфолипидов в хрусталиках здоровых сеголеток и двухлеток семги: Й§Щ- сеголетки;(Ц^|- двухлетки ФХ -фосфатидилхолин; ОШ -сфин-гомиелин;ФЭА -фосфатвдилэтано-ламин; ЛФХ -лизофосфатидилхо--чин; $С-фосфатидилсерин;ФК-фос-фатидная кислота

,НМ0ЛЬ/Г ткани

ННОЛЬ/Г ткяни„

хе^

Рис.3. Содержание ЩА в печени и хрусталиках сеголеток (1) и Двухлеток (2) семги: I I - контроль; !- катаракта.

ния (СРО) в катарактальных линзах как сеголеток, так и двухлеток (рис. 3), подчеркивает роль окислительного стресса в катарактогенезе, концепция которого была выдвинута А.Спекто-ром (1984).

Следует отметить, что у семги разного возраста изменения липидного и фосфолипидного спектра, сопутствующие "бе-логлазию", не были однотипными. Примечательным при этом оказалось увеличение коэффициента ХЛ/ФЛ для тех и других при катаракте: с 0.69 до 1.00 -у сеголеток, с 1.27 до 1.78 -у двухлеток. Возможно, п'овышение данного соотношения при ката-

- а -

ракте явлйется характерным, так как и для липидов мембран хрусталика человека отмечается его рост в пределах от 1.2 до 1.6 0?с£епГё1(1,5рес1ог,1981). Скорее всего, исключительную важность имеет не столько абсолютное содержание отдельных липидных фракций, сколько сохранение стабильности в количественных соотношениях между ними (Карагезян,1972). По-видимому, обнаруженные перераспределения в составе липидов могут приводить к дестабилизации мембранной упаковки, изменению ее микровязкости и повышению уровня перекисного окисления липидов.

В пользу пероксидации липидов свидетельствует также изменение ненасыщенности полиенов, входящих в их состав и являющихся основными субстратами свободно-радикального окисления. Изучение яирвонислоаного спектра хрусталиков сеиги выявило ряд интересных особенностей, среди которых наиболее существенно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот. Полученный результат представляется вполне закономерным ввиду характерного для фосфолипидного состава хрусталиков семги преобладающего содержания высоконенасыщенных фосфатидилхоли-на и фосфатидилэтаноламина.. С возрастом в хрусталиках семги происходит снижение относительного содержания фосфатидилэта-ноламина и уровня полиеновых жирных кислот. Так, у здоровых сеголеток на их долю приходилось 48% ' от суммы всех жирных кислот, а у двухлеток - 29%, причем основной вклад принадлежал докозагексаеновой кислоте — 37,32 и 10,7%, соответственно (рис.4). Возможно, именно этой разницей объясняется снижение в хрусталиках двухгодовиков концентрации малонового диальдегида в 3,7 раза, хотя не всегда между данными показа-

от ся»и

Рис.4. Суммарный жирнокислотный состав хрусталиков сеголеток(1) и двухлеток (2) семги: 1 I- контроль; катаракта.

НЯСШВМЕ

пшиЕновье

ИНЮШЕ

(1) Ш (1) (2) (1) М

телями существует видимая, корреляция (Козлов.1977). Таким

образом, в хрусталиках двухлетней семги отмечается корректировка спектра жирных кислот в сторону увеличения их насыщенности, обусловленная, скорее всего, функциональной необходимостью стабилизации жесткой структуры мембран клеточных волокон.

Что касается хрусталиков катаракхальной рыбы, то следует отметить отсутствие значительных перераспределений в зшр-нокислотяом спектре у годовиков, но повышение у двухгодови-ков докозагексаеноата в 1,7 раза. Связанное с этим изменение жидкостности мембраны, а также наблюдаемая у разновозрастной семги дестабилизация липидной фазы мембранного бислоя могли быть как следствием, так и причиной усиления перекисного окисления липидов, регулируемого не только указанными факторами, но также белок-липвдными взаимодействиями и наличием ингибиторов свободно-радикальных реакций (Каган и др., 1976).

Липидный сослав печени здоровой и бояыюй кап&раювой рыбы. Диетарная природа катаракты у семги послужила причиной особого интереса к липидному метаболизму не только хрусталиков, но и печени, тем более, что литературных данных по их параллельному биохимическому исследованию при данном заболевании обнаружено не было.

Наиболее интересным представляется результат, полученный при изучении группы нормы, в качестве которой была использована однолетняя семга, не имевшая видимых признаков помутнения, но содержавшаяся в том же бассейне и получавшая тот же корм, что и катарактальная рыба. Распределение в составе общих липидов указанных сеголеток отличалось от показателей контроля, а спектр фосфолипидиых фракций представлял собой промежуточное состояние между контролем и болезнью (рис.5). Тс же самое наблюдалось и в хрусталиках особей данной группы. Исходя, из практически полного совпадения жирно-кислотного статуса печени указанной семги с больной, что определяется пищевым рационом (Болгова,Сидоров,1980) и подтверждает алиментарное происхождение "белоглазия", можно •предположить ведущую роль в катарактогенезе патологических изменений в печени, поскольку жирнокислотный состав хруста^

ликов "условно" здоровой рыбы не соответствует катаракталь-ному и помутнение линзы еще не состоялось, возможно являясь более поздним по времени событием.

.% ОТ СЗХОЙ МЕССЫ

Рис.б. Содержание фосфолипидов в печени сеголеток семги: 1 I- контроль; ^- норма ; - катаракта.

с*н *ЭЯ А«Х

Печень здоровой семги характеризовалась одинаковой жирностью для сеголеток и двухлеток - 17,3+0,4 7. (от сухой массы) . Возрастные изменения в печени здоровой семги были связаны, прежде всего, с понижением содержания холестерина и количественными перераспределениями во фракции фосфолипидов, что в итоге привело к снижению процессов СРО, определяемых по концентрации МДА, в 5.5 раза (рис.3). Но как у сеголеток, так и у двухлеток катаракта сопровождалась уменьшением антиокислительной активности ткани печени, характеризуемой повышением МДА- При этом весьма существенным представляется факт возникших при заболевании однотипных прёраспределений во фракции фосфолипидов печени семги разного возраста. Направленность этих изменений говорит, возможно, о повышении жесткости липидного бислоя, которое возникло либо как результат усиления процессов перекисного окисления липидов, либо как компенсаторный ответ, препятствующий этому усилению.

Определяющая роль в механизмах компенсации у холоднокровных организмов принадлежит мобильности жирнокислотного состава липидов мембран (Крепе,1981; Сидоров,1983; Гурин, 1986). В связи с этим был проведен анализ шрвоиасжювого снетра печет здоровой и порахетой катарашск сснги, обнаруживший противоположную направленность возникших при белоглазки изменений у сеголеток и у двухлеток. Так, у первых суммы насыщенных и моноеновых кислот были понижены, а доля полиновых- повышена, у вторых, наоборот, наблюдалось возрастание суммы полиенов при незначительном снижении моноеновых

и насыщенных жирных кислот (рис.6).

от счимы_

50 г 40 30 I-20 г 10 г

оЕ-

Рис.6 Суммарный жирнокислотный состав печени сеголеток (1) и двухлеток (2) семги:

I I- контроль;

- катаракта.

НЯСЬЩЕННЫЕ

П0/ШШ£

т а Т^ ш ш

Особое внимание привлекает здесь докозагексаеновая кислота, на универсальное значение которой в адаптация* рыб указывалось в ряде работ. (Шульман, Юнева.1987; Рабинович, Рипатти.1987). Содержание докозагексаеноата у больных сеголеток было увеличено по сравнению с нормой в 2,7 раза, а у больных двухлеток его доля сократилась в 2.1 раза относительно здоровых,причем уровни данной кислоты в контроле разного возраста практически совпадали. Причиной указанных расхождений могли стать возрастные особенности, инициирующие действия механизмов компенсации возникшей патологии. Этот вопрос представляет самостоятельный интерес и требует всестороннего изучения.

Ввиду несомненного участия свободно-радикального окисления в патогенезе катаракты, а, возможно, и его ведущей роли, предметом предпринятых исследований стала также состояние аитрадикальвиж систем изучаема тнааей. Так как среди многочисленных факторов, определяющих интенсивность ПОЛ в организме, значительное место принадлежит витаминам, в представленной работе был проведен анализ содержания в печени и хрусталиках жирорастворимых витаминов А и Е. При изучаемой патологии в печени происходило снижение уровней как ретинола, так и альфа-токоферола (рис.7а), характеризующее снижение актиокислительной активности этой ткани, подтверждаемое накоплением, в ней МЦА. Если учесть одновременное с этим событием падение уровня одного из самых активных природных антиоксидаятов - восстановленного гмуташона: (рис.76), можно предположить, что нарушения липидного метаг болизма в печени, вызванные кормами, сопровождались усилени-

ем процессов СРО, снижением антиокислительного потенциала, циркуляцией продуктов окисления из печени с кровотоком к глазу, на сетчатку и хрусталик, вызывая цепной механизм окисления из-за их обогащенности полиенами.

ц-/г теяш „сан, нкгальл- ткяш

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

Л ЙТ*

ПР€НЬ

ЖСГЙЛИ<

Рис.7 Содержание в печени и хрусталиках молоди семги а -витаминов Е (1) и А (2); б - восстановленного глутатиона:|_\- контроль катаракта.

Обнаруженное падение уровня витамина Е и восстановлен-.ного глутатиона в хрусталиках семги можно объяснить как снижением содержания этих веществ в печени, так и их расходованием собственно в хрусталике. В любом случае эти явления способствуют деструкции мембран клеточных волокон, ведущей к нарушению ее барьерных функций,, ионному дисбалансу, набуханию клеток, проникновению в цитоплазму Са++ (Бабижаев.Деев, 1987; Владимиров и др. ,1991), нарушению Сан-зависимых каскадных систем регуляции.

Провеолиа, являющийся одной из его компонент, представлял особый интерес ввиду существенности его роли в разрушении модифицированных окислением белков и несомненного участия в катарактогенезе (БресЪог, 1986; Бг^азЬауа. 1988). В хрусталиках двухлеток семги было обнаружено присутствие нейтральных кальций-зависимых протеиназ цитозоля- кальпаинов I и II, различающихся по молекулярной массе и чувствительности к кальцию. Исходя из условий злюции, проведенной на колонках с Ультрогелем АсА-34, первая форма фермента имела молекулярную массу 110 кДа, вторая - 80 кДа (рис. 8). По полученным нами данным активности кальпаинов I и II в норме составляли, соответственно, 0.45+0.05 и 0.75+0.05 ед/мл. При "белоглазии" наблюдалось снижение указанных величин до 0.05+ 0.01 ед/мл у кальпаина I и 0.45+0.4 ед/мл у кальпаина II.Ус-

Рис.8 Хроматографичеасий профиль элюции кальпаинов I и II нормальньк (а) и катарактальных (б) хрусталиков семги на ультрогеле АсА-34 (2.5x95 см), У-22 мл/ч.

_ - профиль элюции цитоэольной фракции экстракта

хрусталиков, Е)-280нм: ___- активность ферментов, 0-750нм

тановленное в катарактальных хрусталиках двухлетней молоди резкое снижение активности двух форм фермента дает возможность заключить, что в линзах больных рыб повреждена система регуляции, в результате чего может происходить приводящее к помутнению хрусталика накопление окисленных белков. Другое возможное следствие, . вытекающее из понижения активности кальпаинов, состоит в сопряженном инактивировании ферментов, участвующих в цАМБ-зависимом фосфорилировании белков, что также приводит к катаракте (Владимиров и др., 1991).

ВЫВОДЫ

1. Характерной особенностью липидного статуса хрусталиков семги является высокое содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Созревание рыбы сопровождается возрастанием в хрусталиках абсолютного содержания холестерина, фосфатидилхолина и уменьшением относительного содержания высоконенасыщенного фосфатидилэтаноламина. что способствует стабилизации липидного бислоя мембран клеточных волокон.

2. Высокая ненасыщенность полиенов, входящих в состав фосфолипидов хрусталиков, понижается с возрастом, причем доминирующее значение в этих изменениях принадлежит докозагек-саеновой кислоте.

3. Созреванию рыбы сопутствует повышение антиокислительной активности ткани как хрусталиков, так и печени, характеризуемое уменьшением в них концентрации МДА.

4. Катарактогенез в хрусталиках семги разного возраста сопровождается увеличением коэффициента ХЛ/ФЛ, характеризуя дестабилизацию мембранной упаковки линзы.

5. Нарушение липидного метаболизма, вызванное катарактой, происходит не только в хрусталиках, но и в печени больной рыбы. В связи с этим представляется существенным факт однотипных перестроек в фосфолипидах печени катарактальной семги разного возраста на фоне сокращения доли холестерина у здоровых двухлеток по сравнению с сеголетками.

6. Анализ жирнокислотного спектра печени здоровой и пораженной катарактой семги указывает на противоположную направленность изменений, возникающих при "белоглазии" у двухгодовиков и одногодовиков.

Л

7. Катарактогенез у молоди семги сопровождается усилением свободно-радикального окисления и накоплением МДА в печени и хрусталиках семги разного возраста. Интенсификация окислительных процессов подтверждается снижением уровня ан-тиоксидантной защиты, определяемой по содержанию восстановленного глутатиона и жирорастворимых витаминов А и Е.

8. В хрусталиках больной семга происходит снижение активности Са++-зависимого протеолитического фермента кальпаи-на, способное индуцировать помутнение линзы благодаря нарушениям в системе фосфорилирования, с ферментами которого он сопряжен.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Тойвонен Л.В.. Нефедова 3.А., Кяйвяряйнен Е.И., Руо-колайнен Т.Д., Громова М.Д. Изменения белкового и липидного состава тканей сеголеток семги при белоглазии // Тез. докл. 23-й кон®. по изучению водоемов бассейна Балтийского моря. Петрозаводск. 1991. С.158.

2. Сидоров B.c., Румянцев Е.А., Тойвонен Л.В. Катаракта у молоди лососевых рыб // Биохимические особенности болезней рыб.. Петрозаводск:,Изд-во КНЦ РАН, 1991. С.48-66.

3. Тойвонен Л.В., Нефедова 3. А., Калиман П. А. Содержание МДА в хрусталиках здоровых и больных катарактой рыб // Тез. докл. 8-й конф. "Экологическая физиология и биохимия рыб". Петрозаводск. 1992. С.133.

4. Руоколайнен Т.А., Тойвонен Л.В., Нефедова 3.А. Сравнительный анализ витаминов А и Е в хрусталиках и печени здоровых и больных катарактой рыб // Там же. С.134.

5. Нефедова 3.А., Тойвонен Л.В. Биохимические особенности катаракты рыб, вызванной токсикантами // Тез. докл. 1-го междунар.симп. "Зооиндикация и экотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта. Днепропетровск: Вестник Днепропетр. Ун-та. 1993. N1. С.200-201.

6. Тойвонен Л.В., Нефедова З.А. Метод оценки перекисного окисления липидов в тканях рыб при катаракте // Биохимичес-•кие методы экологических и токсикологических исследований. Петрозаводск: Изд-во КНЦ РАН, 1993. С.181-185.

7. Руоколайнен Т.А., Тойвонен Л.В., Нефедова 3.А. Определение альфа-токоферола и ретинола в биологических субстратах с использованием микроколоночной ВЭЖХ. 11. Количественный анализ хрусталика глаза и печени рыб // Там же. С. 178-180.

8. Тойвонен Л.В. К проблеме участия перекисного окисления липидов в возникновении и развитии катаракты // Теоретические аспекты зкологичекой биохимии. Петрозаводск. 1994. С. 162-173.

Подписано к печати 27.04.95. Формат 60x84 /16. Буыага офсетная. Ротапринт. Уч.-изд. л. 1,0. Тирая 100 экз. Заказ * 16. У0П КНЦ РАН.

Карельский научный центр РАН г.Петрозаводск, ул.Душкинская, II