Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионов бикарбоната в функционировании фотосистемы 2 высших растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов бикарбоната в функционировании фотосистемы 2 высших растений"

Чч ' На правах рукописи

V

Баранов Сергей Викторович

Роль ионов бикарбоната в функционировании фотосистемы 2 высших растений

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пушимо 1998

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Климов В. В. доктор биологических наук Аллахвердиев С. И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Опанасенко В. К. доктор биологических наук, профессор Бурьянов Я. И.

Ведущая организация - Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, г. Москва

Защита состоится_ 1998 г. в_часов на

заседании Диссертационного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292 Московская обл., г. Пущино, ИБКРАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан_ 1998 г.

с

Ученый секретарь ^ /■

Диссертационного совета, . /.' П /

кандидат биологических наук7 [ ¡/1' Т. И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

К настоящему времени получено множество данных о строении функционировании фотосистемы 2 (ФС-2). Известно, что ФС-2 окси-гнных растений является главным источником молекулярного кислоро-а на Земле, необходимого для дыхания большинства живых организмов, еакционный центр ФС-2, ответственный за преобразование энергии све-а в электрохимическую - разделенных зарядов, находится в центре белового комплекса ФС-2 и выполняет химические реакции: первичное азделение заряда в димере хлорофилла реакционного центра (Р680), по-ледующая передача электрона от воды на пластохинон, с выделением ислорода как побочного продукта реакции (Vermaas et al., 1993; Diner & abcock, 1996). Фотохимически активный реакционный центр ФС-2 со-ержит шесть полипептидов, Dl, D2, гетеродимер цитохрома Ь559, мар-шцевый кластер, psbl, и продукцию гена psbW (Satoh, 1993; Lorkovic et I., 1995). Негемовое железо, расположенное между QA и QB, не участвует епосредственно в электронной передаче, но является необходимым для гого процесса. Бета-каротин, находящийся в реакционном центре ФС-2, ак полагают, участвует в процессе фотопротекции.

За основу механизма выделения кислорода принята модель, редложенная Жолио с соавторами (Joliot et al., 1969), представляющая эбой последовательное четырех стадийное накопление окислительных <вивалентов на донорной части ФС-2, т.н. S-состояния (S0-S4), с после-ующим одномоментным окислением воды и выделением кислорода, читается доказанным участие в этом процессе координированного мар-шца. Помимо марганца ко-факторами процесса выделения кислорода на энорной стороне ФС-2 являются ионы кальция и хлора. Процесс накоп-;ния окислительных эквивалентов инициируется фотохимической реак-ией поглощения кванта света реакционным центром ФС-2, возбуждение имера хлорофилла «а» (Р680) реакционного центра ФС-2, формирование эн-радикальной пары Р680+Фео+", перенос электрона через первичный <цептор электрона QA на вторичный акцептор - QB с замещением позднего окисленным хиноном пластохинонового пула. Одновременно с гими процессами происходит восстановление окисленного первичного энора Р680 за счёт окисления вторичного донора - Yz, который в свою 4ередь получает электроны от марганца. Несмотря на значительный эогресс в понимании такого фундаментального явления как фотосинте-1ческое окисление воды, многое остаётся не выясненным. В частности ногие стадии переноса электрона и ко-факторы данного процесса в ФС-до сих пор не выяснены.

Показано, что ионы бикарбоната связываются с негемовым же-;зом, способствуя транспорту электронов между хиноновыми акцепто-

рамп Qa п Qb (Diner, Petrouleas 1990). Наличие этого эффекта было показано на ФС-2 высших растений и многих оксигенных водорослях (Blubaugh & Govindjee. 1988; Govindjee & van Rensen, 1993). За данный, акцепторный, эффект отвечает высокоафинный пул бикарбоната («1 молекула на 1 реакционный центр ФС-2). Кроме этого существует ряд экспериментальных данных, указывающих на действие бикарбоната не связанное с акцепторной стороной ФС-2, а именно, т.н. донорный эффект (Stemler and Govindjee, 1973). Предпринятые ранее попытки интерпретировать данный эффект бикарбоната не привели к пониманию этого явления. поскольку опирались на неоднозначные экспериментальные данные (Stemler and Govindjee, 1974, Stemler, 1980, El-Shintinawy and Govindjee 1990). Так, предложенная Мецнером (Metzner, 1978) и Стемлером (Stemler. 1980) модель участия ионов бикарбоната как интермедиатора процесса фотосинтетического окисления воды, находится в противоречии с результатами изотопных экспериментов (Stemler & Radmer, 1975;Radmer& Ollinger, 1980).

Актуальным является детальное исследование данного вопроса, который позволит более точно говорить как о месте бикарбоната в процессе фотосинтетического окисления воды, так и о механизме в целом.

Цель и задача работы

Целью настоящей работы было доказательство существования эффекта бикарбоната на донорной стороне ФС-2 высших растений, всестороннее его исследование и оценка роли в функционировании водо-окисляющего комплекса фотосистемы 2. Основными задачами являлись выяснение места действия бикарбоната в пигмент-белковом комплексе ФС-2, а также, на основе полученных нами и имеющихся в литературе данных, попытаться сформулировать механизм действия бикарбоната в процессе выделения кислорода ФС-2.

Научная повита работы.

В результате проведенных исследований впервые найдено, что зависимость величины выхода переменной флуоресценции от концентрации формпата имеет двухфазный характер. Показано, что бикарбонатный эффект обусловлен действием бикарбоната на два участка ФС-2: акцепторный и донорный. Доказана значимость донорного эффекта для функционирования кислород - выделяющего комплекса. В экспериментах с реактивацией флуоресценции хлорофилла в безмарганцевых субхлоро-пластных препаратах ФС-2 показано, что Мп не способен в каталитических концентрациях реактивировать ДФ в отсутствие НС03\ Установлено, что связывание ионов Мп с безмарганцевыми частицами ФС-2 усиливается в присутствии ионов НСОз". Выявлено протектирующее действие ионов бикарбоната при фото и термоинактивации. Показано, что данный

J

ффект связан с действием бикарбоната на донорную сторону ФС-2. [родемонстрирована способность ионов НС03" влиять на S-переходы 1п-кластера в коровых комплексах ФС-2.

Научная практическая значимость работы

Полученные результаты имеют существенное значение в изуче-ии функциональной организации ФС-2 и понимании регуляции процес-а окисления воды и выделения молекулярного кислорода.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на первой город-кой конференции г. Пущино (Пущино 1996), международная научная онференция по фотосинтезу (Пущино 1996).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ

Структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспери-[ентальной части (Объект и методы исследования, результаты и обсуж-ение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературных данных составляет первую часть диссерта-ии. В нём изложены современные представления о структурно-|ункциональной организации фотосистемы 2.

Объекты и методы исследования описаны в экспериментальной асти работы.

В экспериментах использовались 02-выделяющие суб-лоропластные препараты ФС-2, выделенные из шпината с помощью ритона Х-100 (Berthold et al., 1981) с модификациями (Ford and Evans, 983). Кор'овые комплексы выделялись согласно методу, описанному анее (Haag, Irrgang et al., 1990).

Выделение 02 пигмент белковыми комплексами ФС-2 измеряли помощью электрода типа Кларка на постоянном свету. Фотоиндуциро-анные изменения выхода флуоресценции (ДФ) измеряли при помощи становки, описанной ранее (Карапетян и др., 1973).

Фотоиндуцированное изменение поглощения на вспышки при 20 им (ДА820) в наносекундной области регистрировали при помощи становки, описание которой приведено (Liu В., Napiwotzki A. et al, 992). Микросекундные изменения затухания сигнала ДА830 на серию

вспышек измеряли при помощи установки, описанной ранее (Raifarth F et al. 1997).

Изменение поглощения при 355 нм, связанной-с S-переходами i ответ на серию одиночных вспышек измеряли на установке, описанно{ ранее (Christen, G. et al. 1998).

Удаление из среды С02 достигалось несколькими путями: использование буфера с pH 6,2; продувание буфера воздухом, предвари тельно пропущенным через аскарит и КОН (конц.); разведение концентрированного образца в 2000 раз в обедненной С02 среде.

Результаты и обсуждение

Из обзора литературы видно, что основным местом действия бикарбоната в световых реакциях фотосинтеза является участок между пер вичным и вторичным акцептором электрона. Бикарбонат, являющийо лигандом негемового железа облегчает транспорт электрона от QA на Qt и его удаление или замещение моновалентными анионами (формиат, ацетат) приводит к блокированию переноса электрона на акцепторном участке и, как следствие, к нарушению функционирования ФС-2. Как пока

фотосистемы 2; 1 - частицы ФС-2, без добавок; 2- после добавления 10 мкМ ЫаНСО;; 3 - при добавлении 5 мМ №НСО, к образцам, содержащим 10 мкМ ЫаНС02; 4 - после добавления 80 мМ ЫаНС02; 5 - при добавлении 5 мМ ЫаНССЬ к образцам, содержащим 80 мМ ЫаНС02. А, включение измерительного света (480 нм, 0,15 Вт/мг; | и | -включение и выключение действующего света (>>600 нм, 100 Вт/м2).

;ано на рис. I добавление 80 мМ формиата к частицам ФС-2 приводит к 'величению как Ф0, так и максимального выхода флуоресценции Фмакс.), по сравнению с контрольным уровнем, что свидетельствует о 1астичном блокировании оттока электронов от С?А.

В тоже время, при добавлении микромолярных концентраций |юрмиата к препаратам ФС-2 наблюдается некоторое тушение перемен-юй флуоресценции (ДФ), рис. I. При добавлении к частицам ФС-2, со-[ержащнм формиат, 5 мМ бикарбоната натрия наблюдается полная об-ттимость формиатного эффекта.

Удаление бикарбоната из среды измерения приводит к уменьше-1ию выхода АФ, что аналогично добавлению формиата натрия. Эффекты, вязанные с удалением бикарбоната или добавлением формиата легко вращаются добавлением бикарбоната натрия (рис.1). Как видно из рис. 2 юбавление бикарбоната полностью снимает эффект формиата как на

1 10 100 1000 10000 100000 [Формиат], мк

Рис. 2. Зависимость выхода переменной флуоресценции хлорофилла в частицах ФС-2 от концентрации формиата натрия. 1- ДФ, перед добавлением 5 мМ бикарбоната натрия. 2- ДФ, после добавления 5 мМ бикарбоната натрия

кцепторной, так и на донорной стороне.

Таким образом, формиат действует на два различных участка >С-2. Этот двойной эффект нельзя объяснить влиянием №НС02 только

на акцепторный участок ФС-2. Вероятнее всего микромолярные концентрации формиата воздействуют на донорный участок ФС-2, вызывая уменьшение потока электронов на первичный донор электронов Р680 и, как следствие, уменьшение выхода переменной флуоресценции. Предполагаемый участок действия формиата не может находиться на участке —Р680, поскольку нами не было выявлено каких-либо изменений в кинетике затухания сигнала ДА820 в ответ на серию вспышек в присутствии формиата натрия в наносекундной области. Тот факт, что добавление 5 мМ бикарбоната обращает эффект 10-100 мкМ формиата натрия, свидетельствует о том, что формиат в таких низких концентрациях замещает или вытесняет ионы бикарбоната низкоафинного пула. В тоже время, что бы получить хорошо известный акцепторный эффект, связанный с наличием высокоафиинного пула бикарбоната на акцепторной стороне ФС-2, требуется не менее 50-100 мМ формиата (рис. 1 и 2).

12 3 4

Рис. 3. Эффект удаления и добавления бикарбоната на фотоиндуцированное изменение флуоресценции хлорофилла (ДФ), связанное с фотовосстановлением Од в безмарганцевых (трис -обработанных) частицах фотосистемы 2; 1 - безмарганцевые частицы ФС-2 в среде обедненной бикарбонатом; 2 - после добавления 0,2 мкМ МпСЬ (4 Мп/РЦ); 3 - при добавлении 0,2 мкМ МпС12 и 5 мМ бикарбоната натрия, 3' - при добавлении только 5 мМ бикарбоната натрия; 4 - после добавления 1 мкМ ДФК, 4' -при добавлении 1 мкм ДФК и 5 мМ бикарбоната натрия. включение измерительного свет? (480 нм, 0,15 Вт/м2; | и I - включение и выключение действующего света (Х>600 им, 100 Вт/м2).

В нашей работе мы предположили, что донорный эффект связан

[ЭДТА], мкМ

Рис. 4. Зависимость фотонндуцированного изменения выхода переменной флуоресценции от концентрации ЭДТА в безмарганцевых (трис -обработанных) частных ФС-2 измеренном в среде, обедненной СО;; I - ЭДТА добавлялся в среду нзмере-шя. содержащей 20 мкМ МпС1;: 2 - ЭДТА добавлялся в среду измерения, содержащей : мМ №НСО, и 20 мкМ МпС12.

1 2 3 4 5 6

ч ** с г г

N к к <

Рис.5. Кинетика фотонндуцированного изменения поглощения прп 680 нм, вязанного с фотоокпслением Р,.«,, в присутствии 0,1 мМ 51Мо в безмарганцевых частях ФС-2; I - без добавок; 2 - в присутствии 0.2 мкМ МпС1:; 3 - в присутствии 0,2 мкМ .1пСЬ и 5 мМ ^зНССЬ; 4 - при добавлении только 5 мМ ЫаНССЬ; 5 - в присутствии 1 1кМ ДФК; 6 - в присутствии I мкМ ДФК и 5 мМ ЫаНСОя

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 о,а

-20 0 20 40 60 80 100

время, мкс

Рис. 7. Кинетика фогоппдуцнрованных изменений поглощения при 830 им, связанных с фотовосстановлением Р(,Ж| в Кировых комплексах в среде, обедненной Са2\ в ответ на серию из 30 вспышек в присутствии I мМ РеСу как акцептора электронов; 1 - без добавок: 2 - после добавления 5 мМ ЫаНССХ

с взаимодействием бикарбоната с донорной частью ФС-2, а именно с марганцем. Действительно, как видно из рис. 3 добавление бикарбоната усиливает реактивацию АФ в безмарганцевых частицах ФС-2 экзогенным марганцем, но никак не влияет на реактивацию ДФ другими искусственными донорами электрона (дпфенилкарбазид).

Уменьшение связывания марганца ЭДТА в присутствии бикарбоната как видно из рис. 4 позволяет нам говорить об образовании комплексов марганец-бикарбонат. Такое комплексообразование приводит к снижению окислительно-восстановительного потенциала Мп(П) и Мп(Ш). Данные по измерению изменения выхода переменной флуоресценции на безмарганцевых препаратах ФС-2 подтверждаются экспериментами по измерению ДА680 им, ДА820 нм, рис. 5 и 6.

Таким образом, эти эксперименты показывают, что ионы бикарбоната являются необходимым компонентом восстановления активности тстиц ФС-2 после удаления и последующего добавления Мп. Реактивация переноса электронов через ФС-2 в присутствии ионов бикарбоната и каталитических концентраций Мп, так же как и отсутствие влияния МаНСОз при добавлении ДФК, ясно показывают, что бикарбонат необходим для допирования электронов от Мп центра на первичный донор Р680. Вероятнее всего бикарбонат переводит акваионы Мп в достаточно

1,0

0,8

I °'6 §

= 0,4

0,2

0,0

м

1

[ТутЧ/уЛ £' ¿¿г^ ■

-20

20 40 60 80 100 время, мксек

Рис. 8. Кинетика фотоиндуцированных изменений поглощения при 830 нм, связанных с фотовосстановлением Рш> в коровых комплексах в среде, содержащей 5 мМ СаС12. в ответ па серию из 30 вспышек в присутствии 1 мМ РеСу как акцептора электронов; 1 - без добавок; 2 - после добавления 5 мМ ЫаНССЬ.

легко окисляемую форму, образуя комплексы Мп(НС03)" и (или) Мп(НСОз)2- В результате такого комплексообразования не только уменьшается окислительно-восстановительный потенциал пары Мп(П) Мп(Ш), но и уменьшается положительный заряд Мп, что способствует его связыванию с каталитическим участком водо-окисляющего комплекса ФС-2. Последнее предположение подтверждают эксперименты по удалению экзогенного марганца путём центрифугирования и последующего ресуспендирования в среде не содержащей Мп. Фотоиндуцированное ДФ оставалось более высоким (2-3 раза) если центрифугирование выполнялось в присутствии 5 мМ ЫаНС03.

Несмотря на полученные данные по влиянию бикарбоната на реактивацию функции переноса электронов марганцем в безмарганцевых препаратах ФС-2, мы не можем перенести модель образования марганец-бикарбонатного комплекса на функционирование кислород выделяющей системы in vivo, поскольку снижение окислительного потенциала марганца приводит к невозможности окисления воды фотосистемой 2 (Козлов и др. 1995). В данном случае следует рассматривать безмарганцевые препараты ФС-2, их реактивацию Мп - бикарбонатным комплексом, как искусственную систему, где марганец не способен функционировать как ко-фактор водо-окисляюшего комплекса. Однако необходимость бикарбоната может заключаться в обеспечении сборки нативного Мп-кластера и его координировании. Известно, что при недостатке ионов Са2+ коро-

[Формиат], мкМ

Рис. 9. Скорость выделения кислорода коровыми комплексами ФС-2 как функция от концентрации добавленного форммата натрия; I - без добавок; 2 - в присутствии 5 мМ NaHCOi.

вые комплексы ФС-2, лишенные водорастворимых белков 18, 23 кДа, не способны нормально функционировать вследствие неактивного Мп-кластера (Debus, 1992). В этом случае падает скорость выделения кислорода возрастает амплитуда сигнала ДА8з0 на серию вспышек в микросекундной области, что свидетельствует об увеличении вклада рекомбинации P6s<TQa в тушение сигнала и уменьшении донирования с Yz на Р680. Как показано на рис. 7 добавление ионов бикарбоната к коровым комплексам ФС-2, предварительно обедненным СО2, несколько ускоряет

ыструю фазу кинетики. В то же время при добавлении СаСК вместе с меньшением амплитуды сигнала уменьшается и затем исчезает эффект обавления ШНСОз, рис. 8. Следует отметить, что в наших эксперимен-ах по влиянию ионов бикарбоната на функционирование ФС-2 мы не атрагиваем (за исключением экспериментов с большими концентра-шями форм пата) акцепторной стороны ФС-2 - при добавлении бикарбо-

Время, мин

Рис. 10. Эффект бикарбоната на величину фотопндуцированных изменений выхода флуоресценции препаратов ФС-2 при фотоингибировании; 1 - изменение ДФ образца, не подвергавшегося нпгибнрующему освещению в отсутствии добавок, 2 - изменение величины ДФ препаратов ФС-2 в присутствии 5 мМ NaHCOi при фотоингибировании, 3 - изменение величины ДФ препаратов ФС-2 при фотоингибировании, бикарбонат не добавлялся. Прерывистой линией обозначено ишеиенне величины ДФ образца при фотоингибировании в присутствии 100 мкМ МпСЬ.

ната не изменяется вклад в тушение сигнала АА83о рекомбинации P^Qa-Хорошо известно, что для максимальной скорости выделения кислорода требуется бикарбонат (Warburg,О. and Kripahl, G., 1958). Стимулирующий эффект NaHCOi на ФС-2 первоначально приписывали процессам происходящим на донорной стороне ФС-2, но позже с появлением работ Говинджи (Govindjee, 1975) главным местом действия бикарбоната считается акцепторный участок ФС-2. Добавление 100 мМ NaHС02 полностью подавляют процесс фотосинтетического выделения кислорода. Наши эксперименты по влиянию добавления NaHCOj к предварительно

обедненным С02 коровым препаратам ФС-2 показывают, что максимальная скорость выделения кислорода достигается в присутствие бикарбоната. Добавлением лишь 10-100 мкМ формиата вызывает падение скорости на 30 %, рис. 9.

Таким образом, примерная величина Ki формиата составляет около 10-50 мкМ (рис. 9), что на порядок меньше величины, характерной для действия формиата на участке QA— QB (ЫОмМ).

В таблице I приведены значения S-переходов, измеренные в тех же условиях, что и эксперименты по определению скорости кислорода. Измерение времени S-переходов показывает, что ВС замедляет S2->S3 переход, в то время как формиат его несколько ускоряет. Как можно ожидать из электростатических соображений, скорость электронного транспорта от Мп на Yz+ должна уменьшаться при увеличении окислительных эквивалентов на ВОК (Debus, 1992). Можно предположить участие ВС в стабилизации положительных зарядов на донорной стороне ФС-2, что ведет к стабильности и устойчивости всего Mn-кластера. На это также указывает и то, что времена S1 S2 и S2-^S3 переходов в контроле были много меньше чем литературные данные: 90 против 110 для S1 ->S2 и 202 против 350 для S2->S3 переходов (Dekker et al., 1984). Присутствие бикарбоната значительно увеличивает стабильность Мп-кластера, что продемонстрировано в наших экспериментах по фотоинги-бированию и термоинактивации. Показано, что добавление бикарбоната протектирует донорную сторону ФС-2 от действия стрессовых условий, рис. 10.

Таблица 1.

Зависимость времени перехода 5-состоянпй 51-52 и 52-53 коровых комплексов ФС-2 от присутствия в среде измерения бикарбоната и формиата натрия.

Образец Время перехода [мксек.]

s,->s2 s2->s3

Контроль 89.6±20 202.65120

Контроль + 0,6 мМ NaHC02 87.95135 173.5115

Контроль + 1 мМ NaHC03 100.5140 279.45+30

Контроль + 1 мМ NaHC03 + 0.6 мМ NaHC02 93.4125 223.67+30

Видно, что наличие в среде бикарбоната по своему действию шалогично присутствию донора электронов - Мп2+. Та же картина видна ча рис. 11, где представлены данные по влиянию бикарбоната на процесс гермоинактивации. Таким образом, эти данные подтверждают положение э том, что НС03" необходимый компонент функционирования ВОК и его этсутствие ведет к потере стабильности донорной стороны ФС-2 и, в ча-:тности, Мп-кластера.

Фотоингибирующая интенсивность света, пропущенного через красный светофильтр составляла 220 Вт/м". Среда содержала 50 мМ МЕБ-буфер, рН 6.2, 2 мМ К^СЬ и 35 мМ №С1; [Хл]=10 мкг/мл.

Время, мин.

Рис. 11. Эффект бикарбоната на величину фотоиндуцированных изменении выхода флуоресценции препаратов ФС-2 при термоинактнвацни; 1 - изменение ДФ образца, не подвергавшегося тепловой инкубации в отсутствии добавок, 2 - изменение величины ДФ препаратов ФС-2 в присутствии 5 мМ ЫаНССЬ при термоинактнвашш. 3 - изменение величины ДФ препаратов ФС'-2 при гермоннактивашш, бикарбонат не добавлялся, 4 -термоппактивация выполнялась в присутствии 100 мкМ МпС1г

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярный механизм фотосинтетического окисления воды пока изучен не полностью. Известно, что Мп, образуя кластер, является тем участком, где непосредственно происходит процесс окисления воды и выделение молекулярного кислорода. Однако в отсутствии таких ионов как Са2+, СГ и водорастворимых белков донорной части ФС-2 с м. м. 33, 24, 18 кДа, водо-окисляющий комплекс часто не в состоянии выполнять

свою функцию и легко уязвим стрессовым факторам, таким как свет. В нашей работе мы показали, что бикарбонат является не менее значимым компонентом нормального функционирующего водо-окисляющего комплекса ФС-2. Помимо поддержания Mn-кластера в работоспособном состоянии, что продемонстрировано нами в экспериментах по фото и термоинактивации, нам представляется возможным участие ионов НСОз" с процессе сборки Мп -кластера. Невозможность процесса реактивации переменной флуоресценции в безмарганцевых частицах ФС-2 каталитическими концентрациями Мп в отсутствие ионов бикарбоната и участие Мп-бикарбонатного комплекса в этом процессе может служить наглядным свидетельством того, что бикарбонат способен взаимодействовать с Мп ФС-2 in vivo.

Известно, что при S2-S3 переходе происходят значительные перестройки лигандного окружения Мп (Debus et. al., 1992), данное состояние может характеризоваться большей доступностью со стороны внешних воздействий. Эксперименты где наиболее выражен эффект добавления бикарбоната на S-переходы, подтверждают этот факт.

Хорошо известен тот факт, что реконструкция водо-окисляющего комплекса включает стадию фотоактивации, когда при действии слабого освещения и присутствии акцептора электрона Mn(II) окисляется до Mn(III), что способствует встраиванию марганца в ФС-2. Не исключено, что образующиеся комплексы [Мп(НС03)+]или [Мп(НС03)2] облегчают окисление Мп и встраивание его в белковый комплекс ФС-2.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что добавление бикарбоната натрия с высокой специфичностью восстанавливало электронный транспорт на донор-иой стороне ФС-2, блокированный формиатом натрия в микромолярных концентрациях. Эти данные свидетельствуют о необходимости ионов бикарбоната для донорной стороны ФС-2.

2. Обнаружено, что выход флуоресценции хлорофилла в препаратах ФС-2, связанный с фотовосстановлением хинона QA, уменьшается при удалении из среды измерения С02 на 25-30 %,

Электронный транспорт на донорной стороне восстанавливается полностью при добавлением бикарбоната натрия.

3. Впервые показано, что в безмарганцевых препаратах ФС-2 при недостатке ионов бикарбоната восстановление транспорта электронов с донорного на акцепторный участок ФС-2 наблюдается при концентрациях Mn2f порядка 1-10 мМ, в то время как в присутствии ионов бикарбоната требуется 0,2 цМ МпСЬ (2-4 атома на реакционный

центр). Эти данные указывают на возможное формирование Мп-бикарбонатного комплекса.

. Обнаружено усиление связывания экзогенного Мп с трис-обработанными (безмарганцевыми) частицами ФС-2 в присутствии ЫаНСОг,. Эти эксперименты позволяют сделать заключение об участии бикарбоната в процессе сборки функционально активного Мп-кластера.

>. Показана зависимость кислород-выделяющей функции минимального структурного комплекса ФС-2, способного к выделению кислорода, от присутствия ионов бикарбоната и формиата. В таких препаратах максимальная скорость выделения кислорода, наблюдаемая в присутствии 5 мМ бикарбоната натрия, уменьшалась на 30-40 % при добавлении 10-100 цМ N34002, дальнейшее уменьшение скорости выделения кислорода происходило при добавлении 50-100 мМ формиата натрия.

). Установлено, что при фото или термоинактивации величина выхода флуоресценции хлорофилла обусловленная процессами переноса электрона в С02-обедненых кислород-выделяющих или безмарганцевых препаратах ФС-2 была намного ниже, чем в препаратах в присутствии 5 мМ №НСОя. Такое действие указывает на то, что бикарбонат стабилизирует Мп кластер и существенно снижает эффективность различных ингибирующих факторов.

К На основании полученных данных выдвинуто предположение об участии бикарбоната в работе системы фотосинтетического окисления воды высших растении в связи с его влиянием: 1) на процесс реконструкции функции переноса электронов в препаратах ФС-2 с разрушенным кислород-выделяющим комплексом с помощью Мп2+ за счёт перевода акваионов Мп2+ в более легко окисляемую форму Мп-бикарбонатного комплекса, 2) на стабилизацию водо-окисляющего комплекса при действии экстремальных условий: света высокой интенсивности и высокой температуры, 3) на скорость выделения кислорода и связанные с этим процессом структурные перестройки Мп -кластера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Klimov, V.V., Allakhverdiev, S.I., Feyziev, Ya.M. and Baranov, S.V. (1995) FEBS Lett. 363, 251-255.

2. Klimov, V.V., Allakhverdiev, S.I., Baranov, S.V. and Feyziev, Ya.M. (1995) Photosynth. Res. 46, 219-225.

3. Баранов С.В. Влияние ионов бикарбоната на процессы, связанные с выделением кислорода фотосистемой 2 высших растений. // Сборник трудов городской научной конференции молодых учёных г. Пущино, 1996, с.8

4. Баранов С.В., Климов В.В. Действие бикарбоната ... // Тез. докл. Межд. Конф. «Биоэнергетика фотосинтеза». Пущино, 1996, с. 34

5. V.V. Klimov, S.I. Allakhverdiev, S.V. Baranov and Ya.M. Feyziev. Bicarbonate Requirement for the donor side of Photosystem II. // In "Problems and Trends of Photobiochemistry" - International Symposium, Moscow, 1997, p. 33.

6. Klimov, V.V., Baranov, S.V. Allakhverdiev, S.I. (1997) FEBS Lett., 418, 443-446

7. G. C. Dismukes, M. Zheng, G. Ananyev, S.Baranov & V. V. Klimov // EPR/ENDOR Spectroscopies applied to photosynthetic water oxidation -ACS meeting 1998 (в печати)

Научное издание Автореферат Баранова C.B.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции (Ж-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

17.08.98 г. 3. 8099Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 1,0.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Пущинского научного центра РАН. 142292 г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.