Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ГИПЕРПОЛЯРИЗОВАННОГО СОСТОЯНИЯ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК NITELLA FLEXILIS

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ГИПЕРПОЛЯРИЗОВАННОГО СОСТОЯНИЯ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК NITELLA FLEXILIS"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА . АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК '

имени В. И. ЛЕНИНА

АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИП ИНСТИТУТ

На правах рукописи МИСЮК Любовь Алексеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГИПЕРПОЛЯРИЗОВАННОГО состояния ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК МТЕЬЬА РЬЕХИЛЗ

03.00.02 — БИОФИЗИКА

' Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-Ленинград 1973

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ Б.И.ЛЕНИНА

АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукопиои

Ыиоюк Любовь Алексеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЮ1ЕРПОЛЯРИЗОВАННОГО СОСТОЯНИЯ ГШЗЫАШШ КЛЕТСК ЖііеІЇа

ОЗ.ОО.СЙ-ШОФИЗИКА

Аътореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1973

Работа выполнена в даборатории биофизики рзс тигельной клетки Агрофизического нау ч но-и с с л е до ва те лье кого института.

Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 19 габ-тащ-к 34 рисунка, Список питературы включает КІ наименование. из них 124- иностранных авторов.

Научный руководитель:

кандидат физико-ма тема тиче ских наук Г.А.Волков.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук* профессор В.В.Полевой* кандидат биологических наук ¿.Н.Зубов.

Ведущее учреждение — Московский Государственный университет имени Ы.В.Ломоносова, кафедра, биофизики.

Автореферат разослан " 8/ « 1973 г.

Защита состоится " марта 1973 г. на заседании

Учёного Совета Агрофизического научно-исследовательского института по адреоу; г.Ленинград, К-220, Гражданский проспект, д. 14, зад.заседаний.

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке института.

Просим Вас принять личное участие в работе Совета или прислать письменный отзыв в двух экземплярах, заверенный печать», в наис адрес.

Учёный секретарь Совета

А.В,Судаков

ВВЕДЕНИЕ

- Изучение вопросов поступления ионов в клетку и выхода их из see связано с исследование« механизмов работы внешней цитоллаэматической мембраны, которая является ответственной as поддержание ионной асимметрии внутри и снаружи влетай и играет решающую роль в генерации биопотенциалов. Важнейшим обоЙствои пдазш леммы клетки является неодинаковая проницаемость для различных ионов и даже для одного и того же иона в зависимости от её Функционального состоянии, внешний отражением которого может быть величина мембранного потенциала.

Регистрация значений мембранного потенциала клетки и его возможных изменений под действием различных факторов внешней среды дает возможность получить определенную информацию о проницаемости плазмалеммы к различным ионам.

Применение микроэлектродной техники позволило получить большой экспериментальный материал по исследованию ионных отношений и ответных реакций растительных клеток на различные воздействия на таком интересном объекте, каким являются интерно-дальные клетки пресноводных водорослей из сем. СИагасеае . .Однако результаты, приводимые различными авторами» весьма противоречивы как в эффектах, так и в объяснении причин, вызывающих эти эффекты. ( Watnez , 1962, Jiagai , 3a%aura * 1962, J@<2zг , Stay, 1964 , Андрианов, Курелла, Литвин , 1965, Шоре , 1965 , Viiiasaio, 1963, Spans wick , 1970,-<£>ennif , WePHS * 1970 , Xannoffe , fatz , ,

1970 ).

Серией исследований показано, что освещение растительных клеток приводит к ряду временных изменений мембранного потенциала, прежде чей последний перейдет на стационарный световой уровень. ( Uratttez ,1962, Jfagat , 9а¿aura , 1962, Волков, 1964 , Андрианов, Курелла, Литвин, 1965, Tiope , 1965 , Jfi$ki%axi , 1968 ). Отмеченная рядом работ временная гиперполяризация внешней цитоплазштической мембраны в ходе развития реакции клетки на освещение, полученная в настоящее время лишь у растительных клеток,представляет значительный интерне. Существующие точки зрения по поводу этого явления во многом противоречат друг другу и лишь частично могут объяснить причины, вызывающие гипержшфизвцию плазюлеммы.С SmiiA ,

19(&,19б8, 7(о/ге ,.1965, Яагге/t , 1966,1968, SpansurteA , 1970, 9cteea$hy t Xa'Mge , 1570 , 2>еп/гу ,

1970 ).

Настоящая работа предпринята с целью изучения гиларподяри-зоваиного состояния внешне8 цитошюэмзтической ыембраны клеток JQifffa /ftxtfis , t основных его характеристик и возможного выяснения механизмов, ответственных за его наступление.

ОБЪЕКТ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследований были выбраны интернодальние кпетки пресноводных зеленых водорослей Jfî-êeffa ffrxtfts ceiii" С/гаïaceûf ; Объект хорошо изучен и. является классический в gдектрофиапологических исследованиях.

Растение Jfiéeffa состоит из последовательно чередующихся узлов и междоузлий. Клетка между двумя узлами носит название ИВТерНОДЭПЬНОЙ И Представляет собой крупный цилиндр длиНОЙ до 50 мы и диаметром до 0,5 им. Единица объёма протопласта клетки имеет типичное строение и содержит клеточную стенну, плазмалемму, тоноплэст, эндопяаэштический ретикулуи, хлороплас-ты, митохондрииj тела Голъджи,.ядра и другие включения, характерные клеткам высших растений. Таким образом, клетку JYiéeffa можно считать аналогом паренхнкшх клеток высших растений. ( Угееп .1958, Cfta(nSft$ Легсег , 1964, Pte/Sfes ,

JVpîCft » С/гатёггь » 1964

Культура выращивалась в стеклянных сосудах, содержащих слой торфа и кварцевого песка и заполненных водопроводной водой. Часть клеток была выращена на кварцевом песке без добавления торфе, в этом случае сосуды заполнялись пи#о искусственной прудовой водой,, которая содержала HCtn -0,1/nli, jfaCf-l m ы, Cat£z - 0,1-0,2 m 11, либо раствором Уайта, разбавленный в 10 раз. Сосуды находились'При естественном освещении,но были защищены от прямого солнечного света.

Перед экспериментом отпрепарированная от других клетка (обычно 3-4-ея от верхушки )-В течение некоторого времени (12—16 час) выдерживалась в используемом в опыте раствере.

Результаты, приведенные в работе, получены методом внутри- , клеточного отведения разности потенциалов между внутренней и : внешней средой.клеток Jfi{pêfa , называемой мембранным потенциалом (Ш). Регистрация МП производилась с помощь» стек-.

г

лянной микропипетки с толщиной кончика 1,5-2 их» заполненной 2,5 1) раствором и соединенной с непоаяризувдимся

электродом. Цикрозлвктрод закреплялся таким образом, что свободно осуществлялась его подаче в трех направлениях. Ввод „ микроэлектрода в клетку, помещенную в плексигласовую нювэту, через которую осуществлялся непрерывный поток растворе, контрси-лнроввпоя визуально при помощи микроскопа ЫБС-2.

Референтный электрод изготавливался из таких же неполяризу-вдихся хлор-серебряных электродов, но вместо микропипетки к ним через агар-агаровий переходник присоединялась стеклянная трубка, заполненная агаром, приготовленным на 2,5 и растворе

НС? • Непрерывная регистрация Ш1 осуществлялась при помощи усилителей постоянного тока типа У 1-2 и ЭМУ-3 с запиоью на потенциометре ЭПП-09. Кювета с клеткой помещалась в затемненную камеру. Освещение клетки производилось осветителей ОИ-19.

Серия экспериментов была проведена при воздействии света на часть клетки Жирр{а с одновременной регистрацией ответной реакции внешней цитоплазматической мембраны затемненного и освещенного участка клетки. В этом случае отпрепарированная от других клетка помещалась в специальную кювету« имеющую два отсека, таким образом, что одна часть клетки находилась в одном отсеке, другая - во втором. Оба отоека кюветы были электрически изолированы друг от друга: промежуток между ними заполнялся ланолином. Устройство кюветы допускало для каждого отсека независимое, освещение я независимую подачу и слив питательного раствора. Внутриклеточные потенциалы отводились точно так же, как и в предыдущих экспериментах.

Абсолютные величины мембранных потенциалов и их смещение в ответ на смену раствора и на освещение в значительной степени различаются от клетки к клетке , однако характер изменений на каждое воздействие сохраняется даже в различные годы для подавляющего большинства клеток.С до от общего чиола просмотренных в эксперименте клеток)* В каждом отдельной эксперименте исследовалось не менее 20 клеток, и однотипные опыты повторялись в течение ряда лет.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

В темновых условиях в состоянии длительного равновесия со средой, которая представляет либо искусственную прудовую воду,

либо раствор Уайта для водных культур, разведенный в 10 раз, либо чистые растворы солей Л7У , jvhСf , Caf/t в концентрациях близких искусственной прудовой воде, Ш1 клетки Jtljeffa féextft's составлял величину от -120 до -170 из.

При освещении клетки ЫП в течение некоторого времени претерпевает определенные изменения, прежде чем перейдет на постоянный световой уровень. Одновременно с включением света начинается процесс деполяризации внешней цитоплазматической мембраны, укладывающийся в период от 5 до 15 минут, на величину от 15 до 40 мв. Данная фага изменений МП под действием света устойчива и отчётливо выражена в исследованиях, проведенных различными авторами ( jY¿'sÁS?a/f¿ , 1963, 1968 , Волков ,1964-, Волков, Мисюк, 1967» Андрианов, Курелла, Литвин, 1965,1968, ,1965).

В течение последующих 20-4-0 минут С реже до 2 часов ) монет . произойти сильная гиперполяризация шгазмалеадш «леток Jftéfffa , в результате чего Ш принимает очень высокие отрицательные величины ( до -250 ыв ) ( Волков, Мисюк, 1967,1968 ). Эта фаза изменения МП зарегистрирована на клетках Chata (3¿ope ,1965, JfishigaMi , 1968 ), на клетках Ztydtacíi'ttyfin afttcanurn ( J>iaven » 1966,1968) "и на ряде других объектов ( ¿Poofa , 1966, dbffaghtf , Xaííg.e ,1970, Яглпу , Z¿r¿-e*5 ,1970). Вслед за гиперполяризацией внешней цитоплазматической мембраны клетки наступает период постепенного перехода ЫП на постоянный световой уровень. Все смещения МП от начала освещения до выхода его на установившийся световой уровень укладываются , в основной, в период до 2 часов, реже процесс затягивается до Ъ часов.

При выключении света в любой момент развивающейся реакции плазмалеммы на освещение МП с различной скоростью переходит на исходный темновой уровень. Переход этот, подобно реакции на освещение, может включить несколько фаз временного характера .невысоких по величине и обратных первой по направлению,но мо- , жет и.непосредственно возвратиться к исходному теиновому уровню МП, Установившийся световой и установившийся темновой уровни МП могут быть либо одинаковыми по величине, либо различаться на 10-20.мв .причем в наших экспериментах световой более положителен.

Находясь в темновых условиях, ряд клеток показывал самопроизвольный переход ЫП на более деполяризованный уровень, отпнча-

ющийся ох установившегося темнового уровня МП на 30-45 ив. ( Мисга, Волков, 1968 ). Это явление можно сравнить с явлением " скачкообразной деполяризации " плазма л ешы, описанным Тасаки (1971). Результаты настоящих экспериментов и приведенных в литературе показали, что тешовой деполяризованные уровень Ш подвержен влиянию ионов К* во внешней среде в той же степени, как и нормзяышй уровень Ш1, следовательно плазмапем-ма кпеиси в тем новой деполяризованной состоянии, обладает высокой избирательностью к ионам К+ ( Таоаки Д971).

При включении света во время начальной деполяризации пдазиа-леммы клетки Jfi{e££a в ряде случаев происходит возбуждение клетки С Волков, Мисюд, 1965,1968). Явление это вполне объяснимо i если уменьшение Ш происходит достаточно быстро и на значительную величину, то МП может достичь того критического уровня,с которого начинается генерация потенциалов действия С Ocfa , 1961, 1962, fazatti ,1959 ).

Многофазноеть ответной реакции шшзиалешш клеток на освещение привела к исследованию отдельных участков изменения МП.

Наблюдаемую в начальный момент освещения.непродолжительную деполяризацию плазыалеммы клеток Jtfiietta и Chctta исследователи связывают с индукционными процессами фотосинтеза ( Van dp} l/ee/г »1950, Jfagai » Тагаша • 1962, Андрианов, Курелла, Литвин, 1965,1968 ). Вескиы аргументом в пользу подобной точки зрения являются результаты экспериментов, приведенные в работе Андрианова, Булычева, Куреллы, Литвина (1970) , в которой показано, что для фотоикдуцированных изменений Ш клеток необходимо наличие хлороппастов. Согласно результатам StAi/cfa ( 1966), изменение Ш под действием света наблюдается лишь в том случае, если свет поглощается хлороллэстаыи.

Следующая за начальной деполяризацией мембраны клеток tfifoffa ftext&'s при включении света фаза её гяперяодяриззции может начаться как с нориальиого тестового уровня Ш, так и е деполяризованного, при этом максимальный уровень Ш не зависят от исходного те«нового уровня. Обратный переход из гигсерпопяризоьан-ного состояния при выключении света MOS0T произойти непосредет- , веино в деполяризованное, минуя нормальный темповой уровень Ш.

ВеЕКчинз гиперполяризации плазмалеммы для одной и той же клетки но зависит от интенсивности освещения в широком диапазоне изменений последней. При освещенности НИЖ8 100 люкс реакция

5 '

гиперполяризации внешнее цигоппаэиатиче ской иембра ны вообще не наступает. Начинаясь с определенной пороговой величины освещенности, реакция изменяв! лишь скорость до снижения иакоюш явного уровня 101 с усилением или ослаблением освещенности з диапазоне от £00 до 4000 лк. Следовательноі у исследуемой реакции существует порог в отношении величины освещенности , перейдя которой , реакция развивается по закону« подобному закону "всё или ничего". Это подтверждается и экспериментами со ступенчатому вивченню освещенности в различные момент развивающейся реакции гиперполяризацин плазмалеммы: включение небольшой, но надпороговой величины освещенности запускает реакцию гиперполяризации внешней цитоплазматической мембраны; дополнительное включение света, значительно повысив оовещенпость,не ,изменяет уровня 1Ш, достигаемого при гипероо яяр иза ци и иеийра ны,

Явление гиперполяризации плазмалеммы под действием света наблюдаемся в растворах различного ионного состава: в растворе Уайта для видных культур, разведенном в 10 раз, который насчитывает около соней, в стандартной искусственной прудовой годе, в чисхнх растворах ИС€ , ЛЬґ/ и 6аС?г невысоких концентраций ( 0,1-1,0/пМ), в которых клетки ІЇііе??а нормально функционируют, в водопроводной воде. Следовательно* наличие в ощваадей среде ионов К+, Са**, не имеет значения для запуске реакции, хотя«вероятно,и мояет оказывать влияние на длительность и Форму изменения Ш при освещении.

Существование гиперполяриэоваиного состояния плазма лешы, характеризующегося уровнен Ш1, значительно превышающий исходное теїшовое и установившееся световое значение и обладающего рядрм важных свойств, такими как существование порога для раз-дракителя, независимость от последнего в широкой диапазоне величин, временный характер, имеющих принципиальное значение«представляет значительный интерес.

Известно, что в нормальной состоянии шгазівлемий клеток наиболее проницаема к ионам К+ и, таким образом, последний в основном определяет величину потенциала покоя (ПП) ( ОзіегАог/^^ 1927,1934 ), однако некоторое.участие в формировании величины ПП принимают и ионы Л&> , Са % С£~ { ьгігіс* , ,

1964,1965 , $ралэиг1ск , ВіоҐа-їїА , ШіЄГіа/гг& « 1967).

6

.Путем сиены ошваодих растворов различной концентрации не- -следуемых ионов во время установившегося светового или тайно- -вого состояния и в момент гиперпопяриззции внешней-цитоплазыа-тической мембраны было установлено, что плазмалемма клетки

. . находящаяся на гиперполяризоваиноц ; у ровна МП, на подвержена изменению внешней концентрации ионов К+ в.та- -кой степени, в какой это наблюдается во время установившегося твидового или светового уровня Ш. Так, при десятикратной увеличении ионов К* ( 0,1-1, От Ы) снаружи клетки, когда мембрана клетки гиперяоляризована, МП смещается в сторону положительных значений на 5 ив, в то время как такая же смена раствора, когда иеибрана клетки находится в нормальной состоянии, смещает Ш на 42-50 ив. Следовательно, нет оснований считать, что внешняя цитоплазматическая'мембрана клетки ^¿¿еРРа в гиперполя-

ризованном состоянии имеет такую же проницаемость к К* ,как и в установившемся световом или темновом состоянии. •

Совместное воздействие ионов К+ и + различных, концентраций при общей концентрации равной 1,1/ттМ приводит к такому же результату.

В исследовании (1962,1963) отмечалось , что ги-

перполяризация плазмалемш под действием света выражена лучше в растворах, в которых присутствуют ионы Са**. В наших экспериментах добавление в омывающий клетку раствор даже небольшого количества -Са С£* (0,1/яМ) во время гиперполяризации мам -брэны приводило к еще большей иегатинации ЫП ( « из 15-20 ив). Подобное же воздейстше во время установившегося темнового или светового состояния мембраны вызвало отклонение Щ в сторону более положительных значений, что вполне объяснимо, поскольку увеличение концентрации катиона во внешней среде клетки приводит к деполяризации мембраны. ( ■Уо^тагг - ,1943 ). Можно предположить, что в первом случае наличие ионов кальция в растворе каким-то образом изменяет проницаемость плазмалешт к некоторому иону.

Рассмотрев эффект влияния изменения концентрации ионов К+, Са** на величину гиперполяризованного уровня ЫП, есть основание считать, что ни один из них не является ответственным за переход плазмалемыы клеток , ЖМеМа в гиперпояяризован-ноо состояние.

Исследование, подобное описанному выше, было проведено для анионов €? ~ , НСО", СО™ , 5 0£7 Одним из основных анионов .

внутренней и внешней среды клетки является . Чтобы изменение концентрации ¿V" не сопровождалось изменением концентрации проникающих.в клетку катионов, в экспериментах использовался холин-хлорид;

Во всех случаях и когда мембрана клетки гиперполяриаовзва, и когда она находится в установившейся световом иди установив- ; иемся тайновои состоянии, увеличение концентрации внешнего хлора приводило к изменению 1Щ лишь в положительной направлении, причем в первой случае изменение Щ по величине значительно выше* чей в последних. Уменьшение абсолютной величины Ш при увеличении внешнего хлора зарегистрировано результатами исследований Щрре (1961), 5рап$аг<сА , $1оСаге» , Ше^а/пя » (1967).

; Анализ полученных результатов позволил высказать предполоке-■ ние, что гиперпо ляриз оваиное состояние плазмалеммы клетки качественно отличается от установившегося светового и установившегося темнового состояний.

Особенно показательными в этом отношении являются эксперименты по исследованию концентрационной зависимости величины 1Ш, находящегося на установившемся теиновом уровне и на гиперпоия-ризоваином от бикарбоната натрия б омывающем клетку растворе. Таблица I и рисунок I демонстрируют результаты этих экспериман-тов. .

Когда Ш находится в установившемся темновом состоянии, десятикратное увеличение концентрации бикарбоната'натрия приводит к уменьшению разности потенциалов на 13 ив. Такое же изменение • концентрации бикарбоната натрия во время: гиперполяризации плаз- .. иалеммы меняет величину МП на 36 мв в направлении противоположном предыдущему.

Результаты экспериментов показали* что плазмалемма клетки в установившейся темновом состоянии ведет себя, как если бы она была наиболее проницаемой к положительному иону* поступающему внутрь клетки, а в гиперполяризозанном состоянии -как наиболее проницаема к отрица те л ьн ому и ону, направляющемуся в клетку-или положительному иону, выходящему из .нее. В первом случае,.естественно, обсуждаться может ион ¿Уа*, во втором -.-,.-: либо ион НСО£, либо ион поскольку «вменение концентрации ;-. ионов бикарбоната в растворе влечет изменение рН среды.

, Изменение. концеитра ции ионов внешней среде в сочета-

нии с другими "'анионами ( ,¿04', С0д ), не оказывало на гипер-

8

поляризованный уровень Ш эффекта» наблюдаемого.с анионом НС03.

' Таблица I

Зависимость мембранного потенциала клетки

от концентрации , Л&НС03 в омывающем растворе в го «новом состоянии и во время гиперполяриза ции плазма деши

. Абсолютные величины Ш (ив)

Темновоо состояние Гиперп оляри зова нное

состояние

0,1^ и лансОд 1,0яЫ -ЙНСОд 0,1л.11 Ла НС0Э 1»0я и Л5НС03 -

187 180 198 242

180 166 195 226

175 163 189 230

166 143 - 200

172 160 183 224

182 170 193 239 ■

173 165 192

185 169 198 232

162 - 224

196 184 - 240

150 170 213

196. ■ 189 200 243

- ' . 152 - ' 209

190 172 - 241

165 156 180 217

172 159 ' 185 226

180 165 200 230

178 166 193 230.

185 177 198 227

.. 169 • ; 154. 190 224

I 178+9' . . 165+11 | 19118 227+11 .

Сравнительное исследование воздействия анионов 77~и НС03~ в даух-состояяиях плазмалемш ( установившемся световом или темновом и гиперпо1шризованном ) прнлело к заключению, что для

одной и той Кб клетки МП в гиперполяризованном состоянии в среда с анионом НСОд выше ( по абсолютной величине), чем в среде о анионом ¿V". Смена раствора с НСО" на раствор с Л^'во время гиперпопяризации плазмапеммы всегда' снижала уровень гиперполяризации мембраны, но такая же смена растворов из постоянной световой уровне почти не изменяла величины МП. .

Рис.1. Мембранный потенциал клеток JV¿ie{Са

в растворах с различной концентрацией бикарбоната натрия. По оси абсцисс - концентрация У&НСОг во внешней среде в т. и, по оси ординат - мембранный, потенциал клетки в мв . I - темновое состояние, 2 - момент гиперполяризации плазмалеммы.

Еще в ранних исследованиях действия,освещения на МП водорослей сем. высказывалось предположение о том, что необходимым условием увеличения разности потенциалов при освещении клетки является присутствие в среде, "ошвающ'ей клетку, ионов бикарбоната ( ШаСнег ,1962 ). Однако не было найдено никакой связи между явлением гиперполяризации плазмалемод и возможный использованием клеткой ионов бикарбоната.'"' /- и -'

В.клзссичёскоЙ литературе-по фотосинтезу-^ Рабинович; 1951, .' 1959, 0${еге1п£1 ^¿1950,1951 )приведейыгрезулы»ты,люназы-

веющие возможность использования ионов НС03 в фотосинтезе в качестве источника, углекислоты, особенно у годных растений в связи с адаптацией их к водному образу жизни. Следовательно, ион бикарбоната может поступать в клетку. .

Наши результаты показали, что^ряд"клеток, у которых при освещении не наблюдался переход мембраны на гаперпо7шризованный уровень Щ, после добавления во внешнюю среду ионов бикарбоната стал происходить эффект гиперполяризации плазмалеммы.

Как показали дальнейшие эксперименты, гиперполяризация внеш ней цитоплазма тигческой мембраны не так уж непосредственно связана о освещением клеши. Реакция, подобная реакции гиперполяризации плазмалеммы под действием света, был а^, по лучена на некоторых клетках в темновых условиях в ответ на резкое увеличение внешней концентрации ионов бикарбоната. Болеетого, ряд клеток одипаковым образом реагировал и на увеличение концентрации бикарбоната натрия в омывающем раствор и темноте, и на последующее включение* света* Эффект темновой гиперполяризации плазмалеммы при увеличении ионов бикарбоната в среде описан также в экспериментах , Spansur/cA, (1970).

Непосредственное увеличение рН омывающего раствора' на величину, соответствующую увеличению его при повышении концентрации ионов.бикарбоната, но за счёт внесения в раствор необходимого количества J&.ОН, не приводило к эффекту временной гипер поляризации плззыапенш, подобной той, какая получена с ионами бикарбоната.

В следующей .серии экспериментов гиперполяризация плазмалеммы была получена на части клетки. При освещении одшго участка клетки JfHpffa когда , другой учаотокнаходится в темноте были,зарегистрированы результаты, в которых в одних случаях на части клетки,-остающейся в темноте, наблюдался переход МП -на шперполяризованный уровень , в других случаях МП оставался на прежнем уровне». При этом увеличение длины освещаемого участ ка клетки.( посредством несимметричного.расположения клетки: относительно двух отсеков камеры ) приводило к возрастанию чис ла случаев, когда происходила гиперполяризация ппазшпешш на. затемненном участке. Одновременное освещение всей клетки вызывало мщерлоллриззци» мембраны в обеих частях чдеаки, • .

ОБСУЖДЕНИЕ

Причиной исследуемого аффекта ги перпо ляриза ци и пла зма леммы клеток ЖііеІРа, /Сехї£і$ может быть одно из следующих предположений: I. существование электрогенной лощш для какого-либо иона, в результате работы которой происходит перенос в ' клетку отрицательно заряженного иона или удаление из клетки положительно заряженного иона; ¿.'увеличение проницаемости плазма леммы к какому-то иону, в таком случае равновесный потенциал этого иона должен быть более отрицательным, .чем исходный Ш в темновоы состоянии клеткиI

Для объяснения временного характера гиперполяризации мембраны в первом случае необходимо допустить существование другого механизма, который через некоторое время после включения актив--ного транспорта начал.бы работать навстречу, чтобы компенсировать вызванный эффект. Во втором.случае увеличение проницаемости для.некоторого иона в силу каких-то причин должно быть временных, после чего должно возвратиться к первоначальному значении* . ; ...

Итак, одним из факторов, способных изменить величину Ш при освещении клетки, может являться активный транспорт ионов. Энергия, необходимая для поддержания работы такого транспорта,может производиться в процессе фотофосфорипирования ( Арнон,1962). Исследованиями Мас Яоббіе (1965,1966) установлено, что по-токн-иопов К* и Сі~ являются светозависимыми. При этом оказалось, что поток ионов К*, в клетку зависит от энергии АТФ,производящейся в результате работы первой фотосистемы! в то время как поток ионов С£~ не зависит от АТФ и ввязан непосредственно о цепью переноса электронов^ Однако целым рядом экспериментов путем,воздействия ингибиторов, специфически действующих на работу ■определенных звеньев фотосинтетической цепи электронного транспорта, было показано, что ни активный поток или и никакого другого иона не может быть ответственным за эффект. гиперпо ляриза дета плазма леміш клеток под действием света, по крайней мере', если активный транспорт осуществляется путями, рассматриваемыми Яае %о££іе , так как подавление того или другого источника энергии не снимало возможности перехода Ш на гиперполяризованный уровень. (Болков,Петрушенко,1969,1970).

Допустимо предположить, что активный транспорт ионов йог бы осуществляться еще каким-то иным путем, но таких данных в настоящее время нет*

Следующим серьезным аргументом, свидетельствующим против адектрогенного транспорта ионов, является временный характер , процесса гиперполяризациа плазмалеммы, поскольку светозавиои-мые потоки ионов остаются высокими относительно темнового сос— , тояния в течение всего периода освещения, а эффект гипёрпопя-ризации мембраны укладывается в период до 1,5 часов. Бремен -ность гиперполяриз ов ан ного состояния мембраны - фактор»признанный всеми исследователями, однако не приводится ни одного объяснения этой.особенности. < Лоре »1965, tfoofe ,1966» Smith ,.1968, йатгсп. ,1968, Юеапу, Wee#$ , 1970 ,. Tatfaghy . ХйИде , 1970., ZSzedtnSezy ,1970). Против активного фотоиндуцироваиного транспорта ионов, как . причины перехода ИП на гиперпо ляр из ова нный уровень, говорят и результаты о возможности получения гиперполяризации плазма-леммы на затемненном участке клетки при освещении соседнего участка. И, наконец, временная гиперцоляризация внешней, цитоплазма тиче ской мембраны, полученная в теивовых условиях при увеличении концентрации ионов бикарбоната во внешней среде, также свидетельствует против привлечения активного светозави-симого транспорта для объяснения гвпврполяризации пхззмаяеммы.

Рассмотрим второй механизм, который , по нааим представлениям, может быть ответственным за переход плазызлеымы клеток в гиперполяризованное состояние, заключающийся в увеличении проницаемости плазмалеммы к какому-то иону в данный момент. Результаты по исследованию концентрационных зависимостей величины 1Ш на гиперпопяризованном уровне показали, что последний зависит лишь от концентрации ионов бикарбоната в омывающем клетку растворе, что свидетельствует в пользу ионов бикарбоната или со-;, ответетвующего ИМ рн. . . I ■■ ' ■ . . ...

Связь гиперполяризации плазмалеммы под действием света с, % нормальным функционированием цикла Кальвина в фотосинтетичео-кой цепи электронного транспорта может.осуществляться через ; ' изменение концентрации.ионов бикарбоната или водорода внутри ' клетки. ( Волнов, Петрушеако, 1969 •)•>- ; .. .г

Предположим^ что плаамалемма в,исследуемом^состоянии обладает преимущественной проницаемостью к ионам бикарбоната по срав-

ненив с установившийся световым и темновым состоянием, когда она наиболее проницаемая к ионам калия. Тогда необходимо оценить и величину внутренней концентрации ионов бикарбоната в первом и втором случаев. Для этого можно воспользоваться формулой Гольдмана для МП, где наряду о ионами К+ и уй"1-учитываются анионы НСОд , а не €/', Тогда формула Гольдмана будет иметь вид: ' 1

г - МУ* УУЬГЖа У/ нся

^ Мо .... I

где Жа и с/А^- относительные коэффициенты проницаемости для ионов Ж^и- НСО~. Концентрацию К+ и Л/а + -внутри клетки принимаем как 114,3/»« и 14,5 т II соответственно,согласно исследованиям За%аг*га (1961). Не известны величины /НС03// и ¿¿УУа и для гиперполпризованного состояния

мембраны и для стационарного светового и темнового состояний. Эти величины можно получить, исходя из экспериментальных значений МП для нескольких концентраций бикарбоната натрия во внешнем растворе и составив систему урзвнений типа ( I ). Задавая в широком пределе значения одной из неизвестных величин, з именно, относительной проницаемости плазмалеммы к иону, изменение концентрации которого во внешней среде не определяет ха -рактера наблодземого сдвига МП ( это бикарбонат для стационарного темнового и светового состояния и натрий для гиперполпризованного ), можно установить две другие величины. При этом считаем, что для данного состояния клетки концентрация ионов в цитоплазме и значения относительных проницаемостей плазмалеммы для ионов и ВСОд . остаются постоянными , т.е. они не

зависят от величины ОД. Расчёт показал,,чхо в темновом и световом состояниях в широком диапазоне ( на три порядка ) изменений относительных проницаемостей плазмалеммы к бикарбонату и концентрации бикарбоната в цитоплазме клеток значения относительных проницаемостей к натрию меняется слабо, не более чем на Я05&. Во время гиперполяризации.ппаэыалешш характерна обратная зависимость: в еироком Диапазоне изменений относительной проницаемости для натрия в момент гиперполяризации мембраны значения относительной проницаемости для бикарбоната и его цитоплазматическая концентрация меняются мало! Произведенная оценка величины проницаемости плазмалеммы для клеток

к ковам бикарбоната во время гиперполяризации

мембраны оказалась равной примерно 10"® - КГ**' см.сак"^. по сравнению с ~ Ю-7 - Ю-® см.сек"1 в темновых условиях. При этом величина проницаемости для ионов принималась равной. Ю-5 - Ю-6 см.сек"1 { Лоре> ,1%5 ), а внутренние концентрации К* и Жа* как показано выше ( Таланта, 1961 );

Аналогичные величины проницаемости бикарбоната, рассчитанные с использованием формулы Гольдыана для потоков ионов были подучены для а/г/сали/п ( Яакеп , 1968 ),

для ( , 1968 ). Но авторы

полагают, что изменение проницаемости плазмалеммы, несущей отрицательный заряд, ддн аниона на столь высокую величину не возможной Это явилось у икс основным аргументом в пользу активного транспорта. Однако известен процесс, когда происходит сильное увеличение проницаемости пяазмалемкы ( у растительных клеток) для аниона се' - это процесс возбуждения» во время которого происходит возрастание величины проницаемости также примерно на четыре порядка: от ~ 10"® см.сев в состоянии покоя до 10*"^.см. сек" в период развития потенциалов действия* { Лпс/гЬу , Шре ,1964 ).

Таким образок, приведенные рассуждения позволяют допустить, что причиной наблюдаемого эффекта гиперпояяризации плазмалеммы может быть сильное увеличение проницаемости последней к ионам бикарбоната под действием светаV Следствием такого увеличения проницаемости будет сильная негативация.Ш , который стремится к равновесному потенциалу ионов НС0~ , согласно выражению р _ _ со А> [ХСОзЬ . V

Ьнго'э = V > ■

лежащему в области высоких отрицательных величии^

Как уже упоминалось, связь гиперполяризации лгаэмалеммы при освещении клетки с работой цикла Кальвина прежде всего может осуществляться через изменение внутриклеточной концентрации ионов бикэрбона или водорода, поэтому следует учитывать возможное участие ионов водорода в эффекте гиперполяризации плазма леммы.

Предположение о ведущей роли ионов водорода в эффекте ги— перполяризации мембраны у клеток Ска г а аи$1}а&$ высказывалось в исследовании "¡Норр (1965). Действительно,ыем?-брана клетки обладает высокой проницаемостью к ионам водорода. Согласно результатам УИ^аза^о (1968) , эта величина

15

составляет примерно Ю-3 см,сек-* ( если принять проницаемость калия 10~®см.сдк-*). Расчёты Ло/ге показали, ч торизма не кия велиодны Ш в сторону отрицательных значений ка 58 мв необходимо, чтобы внутренний рН клетки упал до 3,2, что мало вероятно. К сожалению, мы не располагаем оценками внутреннего рН.клетки во время гиперполяризации мембраны под действием света.

Рядом исследований зарегистрирован факт выхода ионов водорода из клетки при освещении ( , ХиНд* ,1970,

$Ыигаг4з , ЗЪоие?? ,1970, Яо6ет?$оп , 1968),.но результаты эти относятся к состоянию длительного освещения. При этом изменение концентрации ионов водорода в среде очень мало. Несмотря ка высокую величину проницаемости плззмалеммы для иояов водорода,.потоки его из клетки, согласно экспериментам 9iaftagfгy , (1970) на свету втрое ниже выходящих потоков натрия и в 18 раз ниже входящих потоков калия и хлора. Эти цифры дают возможность оценить участие водорода в общей проводимости внеиней цитоплззыатичесяой мембраны. Следует иметь в виду, что воздействие ионов водорода на плазмалемму может осуществляться и другими механизмами , например, путем изменения величины фиксированного заряда на мембране, что будет.отражаться на .проницаемости её к другим ионам (ЖУ/жа/а, 1968 , Хаппоуе » Загг • » 1970 ).

Следствием проведенного обсуждения является вывод о том, что в основе механизма перехода плазмзпеммы нз гиперполяризо-вакный уровень могут лежать пассивные процессы перераспределения проницаеыостей к иону КС0~ ( или Н*) в установившемся световом иди темновом состоянии и в гиперполяризованном. Что могло бы послужить причиной изменения проницаемости плазмалеммы к этим ионам при освещении клетки? Выдвинутая гипотеза относительно ионов бикарбоната предполагает, что.при переходе от темноты к свету клетка использует ионы ЕС0д-( в процессе фотосинтеза в качестве источника углекислоты ( или соответственного изменения рН в клетке ), и концентрация данных ионов в клетке практически падает до нуля. (Волков, Иисш, 1969 ). В среде же ион в данный момент представлен в достаточном количестве, таким образом, резко изменяется химический градиент ионоваНС0~ в системе: цитоплазма клетки - внешняя среда, что моает привести к изменению проницаемости плазшпешш к ионам НС0~. В ре -16

зулыате ион по градиенту концентрации начинает поступать в клетка. Через определенное время проницаемость к ионам Ш0~ возвращается к прежнему уровню. 8то может произойти, например, в результате работы некоторого инактивадионного механизма,подобного тому, который действует по отношению к ионам хлора в период возбуждения клетки. Подобным образом можно объяснить временность реакции гиперполяризации плазма леммы.

В пользу высказанной точки зрения о причинах, ответственных за возможное изменение проницаемости плазмалемыы к ионам НСО^ или ( Н+) , свидетельствуют и результаты, описывающие временную гиперполяризацию внешней цитоплазматической мембраны в тем-новьк условиях в ответ на изменение концентрации ионов бикарбоната в среде, которые получены в настоящем исследовании < Волков, Мискк, 196? ), а также описаны в статье &/гаа&иг1с& ( 1970 ).

Явление временной темновой гиперпопяризации плазмапеммы клеток при увеличении внешней концентрации ионов бикарбоната во внешней среде, по представлениям ^рапвиггск (1970), объясняется способностью этих ионов изменять рИ среды. Таким образом, автор считает/ что ведущую роль в формировании реакции гиперп'оляризации мембраны выполняют ионы водорода. Однако приведенные результаты экспериментов не совсем соответствуют сделанному выводу. Во-первых, оказалось, что внесение буфера, под-до ржива щего рН постоянным,производило гиперполяризующее действие вэ плазмалешу, Этот результат показал, что эффект гиперполяризации мембраны может происходить и без изменения рН среды. Во-вторых, автору не удалось получить смещения Ш при повышении внешнего рН на такое же высокое отрицательное значение, какое было получено при увеличении внешней концентрации ионов бикарбоната в таких же диапазонах величин рН.

Мы склонны в настоящее время сделать выбор в пользу . ионов бикарбоната, так как увеличение рН среды на то же значение,на которое изменяется рН при увеличении концентрации бикарбоната от 0,1/яМ до 1,0«И, не приводило к временной гиперпопяризации плазмапеммы, которая наблюдалась в случае действия ионов НСОз.

Явление гиперполяризации плззмалеммы клеток Ж^сО'а при освещении и факт возможного получения подобной реакции в темновых условиях при резком увеличении концентрации ионов бикарбоната в омывающем клетку растворе ( Волков, Мисюк, 1967,

I?

bpansuricK , I9?0 ) , no нашим представлениям, можно связать действием одного и того же фактора: изменение химического градиента коков бикарбоната ( иди водороде) в системе; дато -плазма клетки - внешняя среда. В первом случае, при освещении клетки изменение химического градиента ионов бикарбоната (клк; водорода ) происходит за счёт изменения его внутренней концентрации. Во втором случае, в темновизе условиях изменение химического градиента тех же ионов происходит вследствие изменения их Внешней концентрации.

Таким образом, можно предположить, что запускающим механизмом реакции гиперполяризации внешней цитоплазматической мембраны может быть изменение химического градиента ионов бикарбоната { или водорода ). Причем изменение проницаемости - процесс временный, чем и объясняется временный характер реакции гиперполяр иэации.

Принимая во внимание выдвинутую гипотезу, оказалось возможным объяснить не только аффект темноюго перехода Ш на гипер-поляризованный уровень, но и результаты экспериментов с освещением участка клетки, когда другая часть остаётся в темноте.

Если допустить, что при освещении части клетки уменьшение концентрации ионов бикарбоната будет достаточным по величине и быстрым как в освещенном, так и в неосвещенном участке этой клетки, то н на последнем будет наблюдаться переход МП ва ги-перпопяркзованиый уровень* В случае, когда у затемненного участка клетки переход Ш на гиперполяризованный уровень не наблюдается, вероятно, уменьшение концентрации ионов бикарбоната в этой части происходило слишком медленно или не достигал достаточной величины. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты экспериментов с освещением части клетки при несимметричном расположении клетки относительно двух отсеков кюветы: о увеличением длины освещаемой части клетки возрастала вероятность развития реакции гиперполяризации плаз-малеммы на затемненной части. Таким образом, тот или иной характер ответной реакции части клетки JITiieffa при освещении или затемнении одной из них зависит, вероятно, от соотношения скоростей изменения в них концентрации бикарбоната, т.е. от соотношения скоростей использования иона в клетке и поступления его в последнюю на свету и в темноте в результате

работы определенных химических реакций и скорости обмена с внешней средой, от скорости переноса »она в лроцзссе диффузии по градиенту концентрации в цитоплазме вдоль клетки от освещенного участка к неосвещенному и от скорости переноса иона движущейся цитоплазмой.

Предполагаемое объяснение - это лишь одка из возможных гипотез. Оно ни коим образом не,исключает других возможных толкований исследуемого явления. Отсутствие прямых измерений (рЮ/ , в момент гиперполяризации плазыалеммы заставляет вас иметь в виду другие возможности, а именно, изменение концентрации ионов водорода в клетке под действием света и выход ионов водорода.

Таким образом, основным выводом вышеизложенных результатов и обсуждений является заключение о том, что в основе процесса гиперполяризации плазма лешы лежит скорее пассивный транспорт ионов, чем активный. При этом действует пи ион бикарбоната в качестве определяющего гиперполяризацию плазма леммы или ион водорода, вероятно, не имеет принципиального значения, так как механизм действия в том и другом случае одинаков: изменение градиента химического потенциала иона, следствием чего может быть изменение проницаемости плазмалемш к этим ионам.

Анализ результатов позволил высказать мнение о существовании у растительных клеток гиперпопяризоваиного состояния внешней цитоппазматической мембраны, которое характеризуется наибольшей проницаемостью плззиалеимы к ионам бикарбоната, а величина МП клетки в данной состоянии определяется равновесным потенциалом ионов бикарбоната.

Исследуемая в настоящей работе реакция гиперполяризации плазмалемш клеток J\fi£e?ta обладает рядом общих свойств с явлением деполздизации в процессе возбуждения клетки, а именно, имеет порог относительно силы раздражителя, после перехода которого развивается подобно закону " все или ничего " , имеет свой потендиалопределящий ион ,носит временный характер. Полученный факт возможного изменения проницаемости к иону бикарбоната { или водорода ) на части клетки аналогичен факту локального изменения проницаемости плазыалеммы к ионам хлора при прохождении потенциалов действия ( , , 1958 ). Большое сходотво в важнейших свойствах процесса деполяризации ллазиалемыы и её гиперполяриззции представляет принципиальное значение. то

Наличие у раотительных плеток гиперполяриэованного состояния шиэмалеммы расширяет известную точку зрения о существовании у клеток лишь двух состояний: нормального ( это устзновив-вееся темповое и установившееся световое состояние плазма яешш в настоящих экспериментах ), характеризующегося наибольшей проницаемостью мембраны к ионам К+ , и деполяризованного во время возбуждения клетки, когда мембрана наиболее проницаема к ионам се\

Следует отметить, что для наступления реакции гиперполяри-эации внешней цитоплазматической мембраны необходим какой-то комплекс внутренних факторов, среди которых , вероятно, имеет значение интенсивность работы фотосивтетича ского аппарата отдельных клеток. Возможно этой особенностью объясняется наблюдаемый разброс в величинах амплитуды гиперполяризации мембраны и уровней Ш в гиперполяризованном состоянии у различных клеток. Вероятно, этой же особенностью можно объяснить и факт получения гиперполярвзовакного уровня Ш1 на затемненном участке клетки при освещении соседнего участка при.симметричном расположении клетки относительно отсеков камеры. Если фотосинтетический аппарат освещенной половины клетки работает с высокой интенсивностью, то вызовет такое же перераспределение в химических градиентах ионов бикарбоната ( или водорода ) и на затемненном участке, что приведет к гиперполяризации плазмалем-иы последнего. В обратном случае эффекта гиперполяризации мембраны на затемненном участке клетки не наблюдалось,

ВЫВОДЫ

1. При переходе от темноты к свету наблюдаются определенные временные изменения Ш клеток ^¿{еРРа , прежде чем Ш перейдет на постоянный световой уровень. Одной из фаз смещения Ш под действием света является временная гиперполяризация внешней цитоплазматической мембраны на величину от 30 до 90 мв над исходный теиновши уровнем МП.

2. Величина уровня Ш в гиперполяризованном состоянии при освещении клетки на зависит от исходного темнового уровня Ш для одной клетки и имеет порог освещенности, при переходе ко- ' торого в широком пределе не зависит от последней.

3. Переход плазыалеммы клеток в гипер-поляризовэнноа состояние не связан с катшчкем в среде ионов К+ , Са"1^ С£ 50^ в.концентрациях близких искусственной прудовой воде ( 0,1 + 1,0т Ы ).

4. Величина уровня временной гиперполяризации плазмалеимы при освещении зависит в значительной степени от концентрации ионов бикарбоната в среде. Определенную роль могут играть ионы водорода.

5. Возможной причиной перехода мембранного потенциала на гиперполяри з ова нный уровень может быть быстрое изменение градиента химического потенциала ионов бикарбоната (.или водорода ) в системе: цитоплазма клетки - внешняя среда. ■

6.' Переход внешней цитоплазматической мембраны клеток te?fa в гилерпояяриэовзиное состояние, по всей вероятности,

определяется временным увеличение)! её проницаемости к иону бикарбоната ( или водорода ).

*?. Существование гипераоляризоваиного состояния плазкалеимы дополняет известное положение о наличии у клеток лишь двух состояний: нормального и деполяризованного.

8. Реакция гиперполяризации плазма леммы обладает рядом общих свойств с реакцией деполяризации плззмэяешш в процессе возбуждения клетки.

По материала» диссертации опубликованы следующие работы;

X. " Раздражение растительной клетки и процессы регулирования" Тезисы доклада на симпозиуме " Физико-химические основы . авторагуляциа в клетках". Москва, 1965 ( совместно с Г,А. Волковым ).

2. " Гиперполяризация поверхностной цитоплазматической мембраны растительной клетки". ДАН СССР, 196?, 175(6) 1379-1381

( совместно с Г*А.Волковым).

3. " Раздражение растительной клетки и процессы регулирования'.' Сб. "Физико-химические основы авторегуляции клетки",Москва, МОИМ, 1968, 84-88 ( совместно с Г.А.Водковш ).

4» " Исследование.потенциала похоя отдельной клетки JYileffa ffeirtfiS . Ш Реакция клетки яа раздражение светом в связи о проницаемостью плаамалеммы к бикарбонату". Цитология, 1969, 11(8), 998-1005 С совместно с Г.А.Волковым).

5. " Биоэлектрическая реакция растительной клетки на освеще-ч ние", Электронная.обработка.материалов, 1971, Hi 2, 65-67 (совместно с Г.А.Волковым).

6i " Об интерпретации биоэлектрической реакции растения на раздражение на примере действия света". ДАН СССР, 1971, 197(6), 1435-1437 ( совместно с Г.А.Волковым).

7. н Вюэпектрическая.реакция растительной клетки на раздражение светом ". Сб." Исследование процессов обмена энергией и веществом в системе почва-растение-атмосфера'.'. Наука, 1972, 126-129 ( совместно с Г.А.Вонковым и В.В.Пет-рушенко).

8. " Исследование потенциала покоя отдельной клетки водоросли

JiiieCfa ffextfts .УI.Реакция клетки на раздра-.

жение светом при воздействии на часть клетки". Цитология, 1972,14(9),II27-II3I ( совместно с Г.А.Волковым ).

9. " Изменение мембранного потенциала клетки ftexifts под действием света ". Сб. "Харовые водоросли .. "(в печати), Каунас.

Результаты исследований докладывались на Всесоюзном симпозиуме по.физико-химической авторегуляции в клетках в Москве - в 1965 г. яа П и Ш Всесоюзном коллоквиуме по электрическим

свойствам растений в Кишиневе,в Кишиневе в 1969 г. и в 1971 г.

1/П-73 г. Заказ 485 Тираж 200 Бесплатно. Ротапринт. Тип.» 2

"Ленуприздат" Ленинград,I92104, Литейный пр., 55*