Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированные полисахаридами изменения ионного транспорта через плазмалемму иммобилизованных растительных клеток

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Индуцированные полисахаридами изменения ионного транспорта через плазмалемму иммобилизованных растительных клеток"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ имени В.Ф. КУПРЕВИЧА

рге од

| / Г'".'- .

ЦС 577.15.02

РУДКОВСКАЯ Елена Евгеньевна

ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДАМИ ИЗМЕНЕНИЯ ИОННОГО ТРАНСПОРТА ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАЛЕММУ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Минск, 1998

Работа выполнена в Институте экспериментальной ботаники НАНБ и на кафедре физиологии и биохимии растений Белорусского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Юрии В.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик НАН Беларуси Конев C.B. доктор биологических наук Серова З.Я.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный технологический университет

Защита состоится «¿3 » апреля 1998 года в W часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.38.01 при Институте экспериментальной ботаники HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа НАН Беларуси.

Автореферат разослан «¿/» марта 1998

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Изучение влияния иммобилизации на мембран-,ie и внутриклеточные процессы является одной из актуальных задач современной миологии растений, поскольку иммобилизованные растительные клетки находят все лее широкое применение в биотехнологическом производстве полезных продуктов и грья, при конструировании биосенсоров, а также для промышленной очистки сточных д [Brodelius, 1985; Trevan,1988]. Большинство работ, выполненных к настоящему емени, показывают изменение скорости процессов вторичного метаболизма и еличение выхода метаболитов после включения растительных клеток в различные сители [Robinson et al., 1986; Gontier et al., 1994]. Для поддержания высокой биосинте-ческой активности большое значение имеет сохранение жизнеспособности иммобили-ванных клеток, которая зависит как от приемов включения в соответствующие сители, так и от природы самого носителя. Согласно исследованиям ряда авторов, иболее мягким способом иммобилизации может являться включение растительных епаратов в полисахаридные гели [Tamponnet et al., 1985; Броделиус, 1988]. В этой связи и систематическом изучении различных аспектов физиологии иммобилизованных лтггельных клеток первостепенное значение приобретают методы иммобилизации, бор материала носителя и разработка информативных способов регистрации метаболи-жой активности. Несмотря на значительное количество работ в этой области, логически не изучено влияние иммобилизации на транспортные свойства плазматиче-IX мембран, а между тем именно через плазмалемму осуществляется поступление »ичных субстратов и вывод продуктов биосинтеза. Помимо этого, состояние азмалеммы в значительной степени определяет уровень жизнеспособности клеток и ттации к условиям внешней среды. Знание характера и механизмов изменений шепортных свойств растительных клеток под влиянием различных полисахаридов ¡волило бы не только осуществлять направленное воздействие на клеточный метабо-;м с целью увеличения экскреции промышленно-цешшх продуктов, но и дополнить оставления о первичных механизмах адаптации растительных клеток к воздействию огенных факторов.

Таким образом, изучение процессов переноса веществ, в частности ионов, через амалемму иммобилизованных растительных клеток является актуальной и мало ледованной проблемой, решение которой позволит попять природу взаимодействия

молекул полисахаридов с плазмалеммой и механизм их влияния на физиоло] растительных клеток.

Связь работы с научным» программами. Диссертационная работа выполняла! рамках поисковых тематик Института экспериментальной ботаники HAH Беларус Биологического факультета Белорусского государственного университета.

Цель и задачи исследования. В рамках данного исследования предполагалось у новить различия в транспортных свойствах плазмалеммы иммобилизованных и сво( ных клеток водорослей и выяснить механизмы, ответствешпые за изменение ион проницаемости плазматической мембраны включенных в полисахаридные гели кле Поставленная цель включала решение следующих задач:

1. Разработать информативные методические приемы определения жи: способности иммобилизованных растительных клеток.

2. Сравнить жизнеспособность свободных и иммобилизованных в различных ге клеток водорослей.

3. Выявить различия в скорости поступления ионов NO3" и К+ в суспспди-ровашл иммобилизованные клетки Chlorella.

4. Определить основные закономерности влияния иммобилизации на плазмали растительных клеток на примере Chlorella vulgaris и Nitella flexilis.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Иммобилизация в полисахаридных гелях способствует увеличению жи: способности растительных клеток в процессе длительного хранения.

2. Включение в полисахаридные гели изменяет барьерно-транспортные свой! плазматической мембраны растительных клеток.

3. Влияние полисахаридного геля на транспортные свойства плазмалеммы опред ется увеличением неспецифической утечки и уменьшением разности потенциалов плазмалемме вследствие взаимодействия с мембраной отрицательно заряженных гр молекул носителя.

Научная новизна полученных результатов. Получены новые данные об акп рующем влиянии альгинатного и агарового гелей на транспорт нитрата через плазмале; клеток и ингибирующем воздействии альгинатного геля на скорость накопления I клетках микроводорослей.

Обнаружен механизм мембрапотрогаюго эффекта отрицательно заряженных пол харидов на плазматическую мембрану, состоящий во взаимодействии с липидной ф; бислоя и выражающийся в увеличении неспецифической проницаемости плазмалеммы

Впервые показано, что включение клеток в Са-алъгинатный гель повышает их жиз-пособность по сравнению с иммобилизованными в агаре и свободными клетками при ¡нении в различных условиях освещенности и температуры.

Предложены новые информативные методы оценки жизнеспособности иммобилизо-ных растительных клеток на основе определения скорости фотоиндуцированного пцелачивания среды и способности к делению клеток после длительного храпения.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные данные о влия-i полисахаридов на транспортные свойства плазматической мембраны помогут «направленному выбору носителя при иммобилизации растительных клеток и работке эффективных способов увеличения экскреции физиологически активных деств, что будет способствовать оптимизации биотехнологических процессов. Пони-ше характера и гцлгроды взаимодействия различных полисахаридов с плазматической ^браной дополняет представления о механизмах взаимодействия экзогешшх факторов пример, патогенных микроорганизмов) с растительной клеткой.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен при решающем стии автора. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация ультатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы были представ-:ы на Конференции молодых ученых Беларуси и Литвы (14-17 ноября 1992 г., ювежская Пуща), на I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (22-23 ;бря 1994 г., Минск), на 7-м Международном конгрессе по биотехнологии (17-23 фаля 1995 г., Ницца, Франция), на 13-й Школе по биофизике мембранного транспорта -18 мая 1997 г., Ладек-Здрой, Польша), на VI Международном совещании по инкапсуляции (29 августа-1 сентября 1997 г., Барселона, Испания).

Опубликованносгь результатов. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит го введения, общей характе-тики работы, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (4 главы), выводов писка литературы (252 источника). Работа изложена на 120 страницах машинописного ста, содержит 28 рисунков и 2 таблицы.

ОСНОВПОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования в работе использовали культуру микро-водоросли orella vulgaris и интернодальные клетки харовой водоросли Nitella flexilis. Клетки

Chlorella выращивали при 25° С в среде Тамийя [Tamiya, 1966]. На экспоненциальной роста суспензию клеток Chlorella осаждали центрифугированием (5 мин при 100С Осажденные клетки дважды отмывали в дистиллированной воде и выдерживали в теч суток либо в дистиллированной воде с целью активации входящих потоков калия, либ мМ фосфатном буфере (pH 6) для активации нитратного транспорта.

Плотность суспензии Chlorella определяли прямым подсчетом клеток с помо камеры Горяева, а также взвешиванием осадка клеток, получаемого после центрифуг вания определенного объема суспензии при 15000 g в течение 10 мин.

Водоросль Nitella flexilis выращивали в лабораторных условиях при комнатной ' пературе и естественном освещении в среде следующего состава (мМ): 0.1 КН2Р04, СаСЬ, 1 NaHC03, 0.1 Mg(N03)2, pH 7.2. Препарировшшые клетки 2-3 дня перед экст ментом выдерживали в темноте с целью инактивации протонной помы.

Иммобилизацию клеток проводили методом включения в 2%-ный агаровый или ный Ca- и Са/Ва-альгинатные гели [Броделиус, 1988].

О жизнеспособности клеток судили по скорости подацелачивания незабуфереи среды при смене темноты на освещение [Рудковская, Юрин, 1997], а также по способности к делению. Изменения кислотности среды регистрировали с помет ионселективного электрода ЭСЛ 63-07 и иономера ЭВ-74 («Измеритель», Беларусь), определения скорости роста клеток после храпения в темноте при температуре 4°С ч; суспензии высевали в среду Тамийя. Гранулы альпшата предварительно растворяли в М Na2HP04, гранулы агара разрушали механически. После трех дней выращиваню свету при температуре 30°С сравнивали концентрацию клеток с начальной.

Определение нетто-потоков NO3" через клеточную мембрану осуществляли уменьшению концентрации аниона в среде с помощью ионселективных электродов ! NOj'-Ol [Камман, 1980]. Измерения проводили при температуре 20+0.1°С (УТ-Н освещенности 1000 лк в 5 мМ Na-фосфатпом буфере (pH 6.0).

Для регистрации электрических характеристик плазмалеммы Nitella flexilis испол вали стандартную микроэлекгродную технику [Костюк, 1960]. Эксперименты проводи режиме фиксации потенциала на плазмалемме [Юрин и др., 1991] как в искусствен прудовой воде (ИПВ) (0.1 мМ KCl, 1 мМ NaCl, 0.1 мМ СаС12), так и при добавле раствора альгината натрия, в который дополнительно вносили 10 мМ СаС12 для пре вращения сорбции катионов полисахаридом. Опыты проводили в темноте, при комнат температуре и постоянном значепии pH 8.2. В ходе экспериментов снимали мгновен вольт-амперные характеристики и записывали и мембранный потенциал.

Поступление ионов калия измеряли по накоплению в клетках его радиоактивного ического аналога 86Rb+. Клетки хлореллы осаждали и ресуспендировали в буферной ie А следующего состава (в мМ): 1 KCl, 100 NaCl, 1 NaH2P04, 10 HEPES/трис (pH 7.0). перименты проводили при комнатной температуре и постоянном освещении (2500 лк). измерения потока S6Rb+ к 0.5 мл среды А, содержащей дополнительно 0.2 мкКи/мл >+, добавляли концентрированную суспензию клеток (конечная концентрация 4х108 щ). Накопление изотопа останавливали вакуумной фильтрацией через стекломикрово-жные фильтры GF/F (Whatman, Великобритания) с одновременной промывкой 15 мл шденной среды, содержащей (в мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 5 HEPES/трис (pH 7.4, С). Чтобы измерить входящие потоки S6Rb+ в иммобилизованные клетки, s6Rb+ (0.2 и/мл) добавляли в суспензию гранул (4x108 кл/мл). Скорость транспорта определяли меньшению содержания изотопа в среде. Для учета сорбции изотопа Са-альпшатным м в параллельном эксперименте использовали то же количество гранул, не содержа-клеток. Высушенные фильтры помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной кости, содержащей 6 г РРО и 0.075 г РОРОР на 1 л толуола. Радиоактивность образцов ¡деляли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Mark-Ш (Нидерланды). Концентрацию ионов К+ в растворах полисахаридов измеряли с помощью ионселек-юго электрода ЭМ-К+ -01 («Измеритель», Беларусь).

Статистическую обработку дашгых проводили методами вариационной статистики ицкий, 1973J.

Основные результаты и их обсуждение

Влияние иммобилизации на жизнеспособность клеток Chlorella

Сохранение жизнеспособности иммобилизованных клеток является первоочередной чей при их использовании в исследовательских и производственных целях. В этой и были проведены исследования по оценке жизнеспособности иммобилизованных ок, хранящихся в различных условиях (свет, темнота, температура), во время их 'бации.

Иммобилизация клеток Chlorella оказывала существенное влияние па их способность тению после длительного хранения при низких температурах (рис. 1а). В то время как |фициент делепия К (отношение числа посеянных клеток к числу проросших) эбилизоваииых в агаре и суспендированных клеток через десять дней хранения нал снижаться и к двадцатому дню хранешм клетки в обоих вариантах теряли

способность к эффективному воспроизводству, К клеток, иммобилизованных в С альганате, возрастал к десятому дню и сохранялся на стационарном уровне в течеи всего периода хранения.

Рис. 1. Изменение коэффициента деления клеток Chlorella в процессе хранени; темноте при 4°С (а) и скорости фотоиндуцированного подщелачивания средь процессе хранения клеток на свету при комнатной температуре (б): 1 - контроль - клетки, иммобилизованные в Са-альгинате, 3 - клетки, иммобилизованные агаре.

Сходная закономерность была выявлена при изучении жизнеспособности кле-C.hlorella, хранящихся на свету. Несмотря на то, что начиная со второго дня инкубах концентрация клеток в иммобилизованном препарате практически не изменялась протяжении всего периода хранения, в первые четыре дня скорость фотоиндуцировашг подщелачивания среды резко возрастала, в то время как в суспензии - не изменялась (р 16). В последующие пять дней в обоих вариантах скорость подщелачивания неуклет снижалась, оставаясь более высокой у иммобилизованных клеток.

Полученные результаты согласуются с ранее проведенными исследованиями ста дизирующего влияния иммобилизации в альгинате на фотосинтетическую активност стабильность хлорофилл-белкового комплекса у Botryococcus [Bailliez et al., 1986 Euglena [Tamponnct et al., 1985] в процессе длительного хранения. Скорость роста клстс альгинатных гранулах была существенно меньше, чем в свободных клетках [Bailliez et

а

б

О 10 20 30 Время, сут

0 2 4 6 8 10

Время, сут

)85; Robinson et al., 1986]. По-видимому, это связано не только с ограничением доступа С>2 внутри матрикса, но и с изменением метаболических и физиологических процессов в ¿мобилизованных клетках по сравнению с суспендированными. Возможной причиной 1ляется либо влияние факторов микроокружения: изменения величины водного лгенциала и повышения осмотического давления, вызванного присутствием полимера lattiasson et al., 1986], либо тесный межклеточный контакт, вызванный взаимодействием юпласта с альгинатом с участием Са2+, что способствует активации синтеза вторшшых ггаболитов [Haldimann et al., 1987]. Некоторые авторы полагают, что именно прямое аимодействие молекул полисахаридного матрикса с клеточной мембраной вызывает менения метаболизма иммобилизованных клеток [Bailliez et al., 1986; Santos-Rosa et al., '89; Gonticr et al., 1994]. Таким образом, исходя из полученных результатов и анализа [гературных данных, можно сделать вывод о том, что иммобилизация растительных еток в полисахаридных гелях, особенно в альгинате кальция, значительно стимулирует (Оцессы клеточного метаболизма и способствует длительному сохранению жизнеспо-бности клеток.

Транспорт нитратов в суспендированных и иммобилизованных клетках Chlorella

Поскольку нитраты являются исключительно важным элементом минерального тания и используются е первичлых и вторичных процессах обмена веществ, представ-гтось целесообразным исследование процесса поступления NCV в суспендированные и мобилизованные клетки. Кривая зависимости скорости поглощения нитратов от [щентрашш иона в среде имела куполообразный характер. При увеличении концентра-и NO3" до 10-15 мкМ скорость поглощения нелинейно возрастала, при более высоких яцептрациях нитрата - уменьшалась. В иммобилизованных клетках было выявлено зличение максимальной скорости (Vmax) поглощения NO3' по сравнению с контролем в ! раз в зависимости от материала носителя. Как видно из рис. 2, Vmax в клетках, мобилизовашшх в Са-альгинатном геле, превышала тот же параметр в суспензии в 3 ¡а, в Са/Ва-альгинатном геле - в 4.6 раза, в агаровом геле - в 3.8 раза. Одновременно ¿снялся яругой показатель - константа Михаэлиса (Км). В иммобилизованных клетках

увеличивалась по сравнению с суспендированными, но в иных в сравнении с зышением максимальной скорости пропорциях. Так, в суспендированных клетках Км = мкМ, в Са-альгинате - 5.18 мкМ, в Са/Ва-альгшгате - 12.5 мкМ, в агаре - 8.0 мкМ.

es и о

т 1

а 2

• 3

А 4

Рис. 2. Влияние hmmoui

и

о 2,0

лизации на скорость ш ступления NO3" в клетк Chlorella: 1- контрольш суспензия, 2 - С; альгинатный гель, 3 Са/Ва-альгинатный гея 4 - агаровый гель.

b. о

c.

1 1,0

о

10 20 30 40

[KN03], мкМ

Так как перенос N03" осуществляется пассивной и активной транспортными ci мами и регулируется многочисленными внутренними и внешними факторами, исследовали влияние освещешюсти, pH среды и ингибиторов метаболизма на транс нитратов. Целью этих экспериментов было не только сравнить поглощение N( суспензии и иммобилизованных клетках, но и оценить взаимосвязь транспорта N1 функционированием Н'-помпы.

И в суспендированных, и в иммобилизовашшх клетках наблюдали резкую ак цшо поглощения NO3" на свету. Ингибирование транспорта после длительной инкубах темноте быстро обращалось при включении света - через 2 часа освещения максима! скорость увеличивалась в 11 раз, достигая 60% от уровня первоначальной скоро« свету. Отсутствие качествешшх различий в активации светом транспорта NO3" позис предположить, что иммобилизация не затрагивает внутриклеточные механизмы регул поступления и ассимиляции нитратов.

В отличие от высших растений оптимум поглощения NO3" в клетках микроводор находится в нейтральной или слабощелочной области [Ullrich, 1992]. В наших экепер тах максимальная скорость поглощения увеличивалась в пределах значений pH от 6 причем в иммобилизованных клетках pH-зависимость была выражена сильнее.

При действии ингибитора фотосинтеза диурона и ингибиторов Н'-иомиы ванад диэтилстилбестрола (ДЭС) показатель 1С50 (концентрация ингибитора, при кот скорость поступления N03" в клетки равна половине максимальной) составлял 2 мк! мкМ и 5 мкМ соответственно, что свидетельствует о непосредственной связи транс) N03" с работой Н+-АТФазной помпы. Для всех использовашшх ингибиторов не

ыявлено достоверных различий в ГС50 для ингибирования транспорта шпратов в зободттых и иммобилизованных клетках. Таким образом, иммобилизация клеток тореллы в Са-альгинатном и агаровом гелях не влияет па характер метаболической ггуляции накопления N03'.

Столкнувшись с фактом значительной стимуляции пнтратного транспорта при иммо-ялнзации клеток, мы попытались выяснить механизм этою явления. Из рис. 3 видно, что сгивация нитратного транспорта зависела от времени с момента иммобилизации, [аксималышй эффект наблюдался на вторые - четвертые сутки после включения клеток в китель. В то же время, добавление в суспензию 0.4%-ного раствора свободного 1ьгината в 2.5 раза активировало максимальную скорость переноса нитратов через мзмалемму (см. рис. 3), что по величине сопоставимо с действием носителя.

При более детальном изучении воздействия составных компонентов геля - свободно-альганата и ионов Са2+ - на транспорт ЫОз" было показано, что увеличение концентрата Са2+ в среде (0.1-1 мМ) практически не влияло на скорость поглощения нитратов либо значительно шггибировало ее (рис. 46.). Зато альгинат натрия значительно сти-'лировал поглощение N03", но лишь до определенного предела (рис. 4а). Начиная с нцешрации полисахарида 1% Утах снижалась, а при концентрации 1.4% - ингибирова-сь на 95% (см. рис. 4а).

Полученные результаты позволяют предположить, что эффект активации нитратного анспорта связан с влиянием молекул альгината на транспортные характеристики азмалеммы. Активируя перенос шпратов при низких концентрациях, альгинат натрия

100

Рис. 3. Скорость поглоще-п ] ния NO3" клетками о 2 Chlorella после иммобшш-л 3 зации в разное время: 1 -

▼ 4

контроль; 2 - суспензия + 0.4%-ный свободный альгинат, 3 - 1ч после иммобилизации, 4-3 суток после иммобилизации.

5 10 15 20 25 [KN03], мкМ

при повышении его содержания выше 1% оказывает угнетающее воздействие на кле Возможно, что и тот и другой эффекты обусловлены увеличением неспецифическ

0,0

0,5 1,0 1,5 [Альгинат], %

а

Ö 40 к

'X

о 30

тН

"в в

S 20 л

4 о

5 10

Koirrp. 0.1 мМ 0.5 мМ 1 мМ

Рис. 4. Влияние свободного альгината (а) и ионов Са2+ (б) на максималы скорость поглощения N03" в суспензии клеток Chlorella.

проводимости мембраны. Так, снижение мембранного потенциала, связанное с увел] нием утечки, приводит к активации анионных каналов [Zimmermann et al., 1994] и, та образом, снижению оттока нитрата из клетки.

Дальнейшее увеличение неспецифической проводимости приводит к диссипа ионных градиентов, истощению энергетических запасов клетки, что полностью подав: высокоаффшшый транспорт NO3".

Влияние иммобилизации на транспорт калия в клетках Chlorella

Являясь основным катионом-осмолитиком в растительной клетке, калий непосре, венно участвует в регуляции тургорного давления, выполняя ряд важных фи: логических функций: рост клеток растяжением, движение замыкающих клеток yen настические движения листьев некоторых растений. Кроме того калий онреде: коллоидно-химические свойства цитоплазмы и представляет собой основной потеш лобразующий ион [Bentrup, 1990]. Учитывая эти факты, представлялось необходю выявить различия в поступлении К+ в иммобилизованные и суспендированные клетки.

В отличие от транспорта N03" кинетика поступления К+ в клетки Chorella носила шнейный характер, что отражает функционирование системы пассивного переноса ионов ;алия через мембрану при высоком содержании экстраклеточного калия [Malhotra, Glass, 995]. Скорость накопления К+ в клетках резко возрастала после прединкубации успензии клеток в дистншнгрованной воде, так как при этом в результате диффузии меньшалось внутриклеточное содержание К+, что вызывало в дальнейшем значительную ктивацию потоков К+ внутрь клеток. Добавление в среду 100 мМ NaCl мало влияло на корость накопления К+, что, возможно, объясняется высокой селективностью калиевых аналов и/или устойчивостью клеток Chlorella к солевому стрессу [Балнокин, Строганов, 989].

Иммобилизация в Са-альгинатпом геле уменьшала скорость накопления К: в клетках Itlorella па 20-25%, т.е. вызывала эффект, противоположный действию на транспорт итратов (рис.5а).

и а

ис. 5. Влияние иммобилизации (а) и экстраклеточного Са2+ (б) на скорость зкопления К" в клетках Chlorella: 1 - контроль; 2 - клетки, иммобилизованные в а-альгинате.

Как и в случае нитратного транспорта, изучали влияние составных компонентов >лисахаридного матрикса на скорость входящих потоков К4. Добавление в шпеубацион-то среду Са2+ (0.1-10 мМ) значительно активировало накопление К+ в суспензии клеток ис. 56). Альгинат натрия (0.01-1%) вызывал падение скорости накопления калия

клетками хлореллы. Степень подавления транспорта калия внутрь клеток целине] зависела от концентрации альгината в среде (рис. 6а). Для контроля степени адсорб1 полисахаридом ионов калия из среды мы исследовали влияние альгината натрия содержание К+ в растворе (рис. 66). При сопоставлении рис. 6а и 66 видно, что степ адсорбции альгинатом К+ намного меньше, чем ингибирование накопления К+ в клеп Таким образом, влияние иммобилизации на транспорт К+, по-видимому, опосредова

*40

О

¡30

Ъ

§20

ч о

510

+

а

й- * -г т

-

о 1 V**

о 2 \ **

д 3 Н**

V 4 • ** 1 t 1

1,00

-

У 0,50 0,25

б

0 0,00 Ю,01 0,1 1 [Полисахарид], %

O,0OD,Ol ОД 1 [Полисахарид], %

Рис. 6. Влияние полисахаридов на скорость накопления К* в клетках Chlorella (г концентрацию ионов 1С в среде инкубации, содержащей 100 мМ NaCI (б): алыинат, 2-декстран-сульфат, 3-КМЦ, 4-фиколл 400.

взаимодействием плазмалеммы с молекулами альгината в составе матрикса освобождающимися из него.

0

о

Мсмбранотропное действие полисахаридов

Для выявления возможных механизмов взаимодействия молекул носителя с плаз леммой изучалось влияние полисахаридов различной природы на накопление К+ в клст хлореллы. В отличие от нейтрального фиколла отрицательно заряженные декст{ сульфат и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) вызывали сходное с альгина (полианионом) ингибирование потоков К+ в клетки (см. рис. 6а). И хотя эффе

Кения скорости накопления К+ под действием альпшата или декстран-сульфата могут ^ частично обусловлены сорбцией ионов калия полисахаридами, КМЦ действует на эрану , не сорбируя ионов К+ (см. рис.66). Следовательно, именно заряд полисахари-нграет ключевую роль при взаимодействии с клеточной мембраной. В целях детализации механизма влияния альгината на транспортные свойства плаз-:ммы растительной клетки был проведен ряд электрофизиологических экспериментов петках Ше11аАехШ.ч. Добавление в раствор ИПВ 0.2-0.8% альгината натрия вызываю ггимое снижение разности потенциала покоя клеток Ш1е11а /1ехШз на 20-50 мВ, при (ентрации альгината выше 1% клетки через 20 минут инкубации погибали. Анализ >венных вольт-амперных характеристик (рис. 7) показал, что 0.8%-ный альгинат

а б

V, мВ V,mB

7. Мгновенные вольт-амперные характеристики плазмалеммы Nitella flexilis: а -нциал фиксации -20 мВ, б - потенциал фиксации -160 мВ; 1 -контроль, 2 - 0.8% ината Na, 3 - после отмыва в ИПВ.

:ственно увеличивал калиевую проводимость плазмалеммы как в режиме деполяриза-так и при гиперполяризащш, причем эффект сохранялся и после отмыва в растворе |. Полученные результаты означают, что альгинат вызывает увеличение неспецифиче-утечки плазмалеммы, т.е. имеет место прямой эффект полисахарида, состоящий в зыхлепии" литщдной фазы мембраны [Cohen et al., 1991]. Это приводит к деполяриза-иембраны, активации калиевых Д-каналов, возможно, активации Н+-помпы и системы

транспорта нитратов. Наблюдаемое увеличение проводимости калиевых каналов противоречит результатам экспериментов по измерению накопления 86Rb+, так величина входящего тока ионов определяется не только проницаемостью плазмалемл ионам К+, но и разностью электрических потенциалов на мембране. Хотя под действ альгината происходит увеличение проводимости плазмалеммы для К+, однако, одно менно наблюдается уменьшение электрохимического градиента для К+, что привод] заметному снижению входящего в клетку потока ионов 86Rb"\

При высоких концентрациях альгината происходит необратимое изменение ир< цаемости мембраны, что вызывает диссипацию ионных градиентов и приводит к ги£ клетки.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспрессный способ оценки жизнеспособности хранящихся на с: иммобилизованных клеток по данным регистрации фотоиндуцированных сдвигов среды; для клеток, хранящихся в темноте, предложен метод измерения их скор( деления при проращивании в культуральной среде. Предлагаемые методы характерна} ся высокой информативностью и достоверностью оценки жизнеспособности.

2. Иммобилизация клеток Chlorella в Са-альгинатном геле способствует их б( длительному хранению в темноте при низких температурах и поддерживает б< высокий уровень метаболизма при хранении на свету при комнатной температур« сравнению с суспендированными клетками.

3. Иммобилизация клеток Chlorella в Са-альгинатном геле активирует трана нитратов в 2-3 раза и снижает входящие потоки K+(85Rb ) па 20-25% но сравнеш суспендированными клетками.

4. Влияние иммобилизации на транспортные свойства клеток Chlorella обуслов: свободным альгинатом, но не экстраклеточным Са2+. В концентрациях 0,1-0,5% алы активирует транспорт нитратов в 2-2,5 раза и на 20-40% снижает накопление К+. Выс концентрации альгипата (более 1%) оказывают токсическое воздействие на растител] клетки.

5. Анализ влияния физико-химических факторов среды (освещения, pH, и биторов) на транспорт нитратов подтверждает представления о симлорте NO3' и ; клетку, причем иммобилизация не оказывает заметного действия на энергозавиы: транспортные системы плазмалеммы.

6. Отрицательно заряжешше полисахариды (декстран-сульфат и карбоксиметилцел-юлоза), но не нейтральный фиколл 400, вызывают сходное с альгинатом ингибироваше ако1шения К' в клетках Chlorella. Следовательно, именно заряженные полисахариды, омионенты гелей материала носителя, оказывают непосредственное влияние на ранспортные характеристики плазматической мембраны.

7. Механизм действия алъгината на плазмалемму связан с увеличением проводимо-ти неспепифической утечки, сопровождающимся снижением мембранного потенциала и ктивацией калиевых каналов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рудковская Е.Е. Поглощешге нитратов иммобилизованными клетками Chlorella ulgaris // Сб. трудов молодых ученых Беларуси и Литвы.-Минск, 1992.-С.28.

2. Рудковская Е.Е., Юрин В.М., Соколик А.И. Влияние иммобилизации на транспорт итратов в одноклеточных водорослях // Тез. докл. 1-го Респ. съезда БОФБ.-Минск, 1994.147.

3. Yurin V.M., Rudkovskaya Е.Е. The comparison of nitrate uptake in suspended and immobilized cells of Chlorella vulgaris // Proc. 7th Intern. Congress on biotechnology .-Nice, ?95.-Pt. Lvp 214.

4. Рудковская E.E., Соколик А.И., Юрин B.M. Изменение транспортных свойств яазмалеммы иммобилизованных клеток водорослей иод действием альгината // Доклады Н Беларуси.-1996.-Т.40.-№ 1.-С.85-89.

5. Рудковская Е.Е., Юрин В.М. Иммобилизованные растительные клетки: методы элучения, жизнеспособность, пермеабилизация // Известия Белорусской Инженерной кадемии,- 1997.-Т.1(3).-С.47-50.

6. Effect of free polysaccharides and immobilization in Ca-alginate gel on K+ transport in hlorella vulgaris cells / E.E. Rudkoskaya, A.A. Mongin, A.P. Kudryashov, V.M. Yurin // Proc. 3th School on biophysics ofmembrane transport.-Wroclaw,-1997.-P.132.

7. Rudkoskaya E.E., Yurin V.M. Immobilization affects transport properties of plasma embrane of algae cells // Proc. VI International Workshop on bioencapsulation.-Barcelona, )97.-Pt.34.

8. Effect of immobilization on K+ influx in algae cells / E.E. Rudkovskaya, A.A. Mongin, .P. Kudryashov, V.M. Yurin. // Cellular & Molecular Biology Letters.-1997.-Vol.2, № 4,365-369.

РЭЗЮМЕ

Рудкоуская Алена Яугеньеуна

Тндуцыраваныя нолкахарыда.\п змяненш iouiiara транспарта праз плазмалему ¡мабшЬаваных раслшных клетак

Ключавыя словы: Chlorella vulgaris, Nitella flexilis, ¡мабшзацыя, Са-альгшат, жь дяздольнасць, плазмалема, юнны трапспарт, полкахарыды.

Мэтай работы было вызиачэнне заканамернасцей змяпення юннай прашкальна! плазмалемы гмабшзаваных клетак пры уздзеяшй носьбгга. Для дасягнення мэ распрацава1Ш метадычныя прыемы, яюя дазваяяюць з дастатковай пэунаспю кантра. ваць б1ясштэтычную актыунасць раслпшых клетак у розныя прамежш часу пас шкапсушщш. Вызначана, што шабшзацыя у Са-альгшатным гел1 спрыяе захаваи жыццяздольнасщ i вышэйшаму узроуню метабал1зма у параунанш са свабодиыю клетк! у працэсе ix працяглага захоувашш. Пры вывучэшм транспарта NO3" пры данали юнселеюыуных электродау i транспарта K+(86Rb+) радьгазатопным метадам бь паказапа, што у шабшзаваных у Са-альгшатным гел1 клетках Chlorella павял1чваи паступленне штратау i зшжаедца накапленне калк, нрычым гэты эфект абумоуле менавка уздзеяннем малекул альгшата. Выкарыстоуванне пошсахарыдау рознай прыро выявша, што рашаючае значэннс пры узаемадзеянш з плазматычнай мембранай мае за] малекул носьбгга. Вынш электрафЫялапчнага апалЬа узаемадзеяшгя альгшата нлазмалемай Nitella flexilis сведчаць аб тым, што мехашзм яго дзеяшш звязань павял1чванвем праводнасц1 неспецыф1чнай уцечцы, якое суправаджаецца зшжэш трансмембраннага патэпцыяла i актывацыей кал1евых Д-каналау.

Атрыманыя даныя могуць выкарыстоувацца у б1ятэхналапчпых працэсах пры вы ры аптымальных для шабшзацьп клетак носьбгсау i распрацоуцы эфектыуных прые? пермеабшзацьп клетак i кантролю ix фЬшлапчнай актыунасщ.

РЕЗЮМЕ

Рудковская Елена Евгеньевна

Индуцированные полисахаридами изменения нонного транспорта через плазмалемму иммобилизованных растительных клеток

Ключевые слова: Chlorella vulgaris, Nitella flexilis, иммобилизация, Са-аш>пшат, знеспособность, плазмалемма, ионный транспорт, полисахариды.

Целью работы было установление закономерностей изменения ионной проницаемо-[ илазмалеммы 1шмобилизоваш1ых клеток под действием носителя. Для достижения ш разработаны методические приемы, позволяющие с достаточной степенью (ежности контролировать биосинтетическую активность растительных клеток в раз-шые промежутки времени после инкапсуляции. Установлено, что иммобилизация в Са-гинатном геле способствует сохранению жизнеспособности и более высокому уровню габолизма по сравнению со свободными клетками в процессе их длительного хранения. Ii изучешш транспорта NO3" с помощью ионселекгавных электродов и транспорта 86Rb+) радиоизотопным методом показано, что в иммобилизованных в Са-альгинатном е клетках Chlorella активируется поступление нитратов и снижается накопление калия, гчем этот эффект обусловлен именно действием молекул альгината. Примените шсахаридов различной природы выявило, что решающее значение при взаимодействии [тазматической мембраной имеет заряд молекул носителя. Результаты электрофизиоло-еского анализа взаимодействия альгината с плазмалеммой клетки Nitella flexilis детельствуют о том, что механизм его действия связан с увеличением проводимости пецифической утечки, сопровождающимся снижением трансмембрашюго потенциала сшвацией калиевых Д-каналов.

Полученные данные могут быть использованы в биотехнологических процессах при юре оптимальных для иммобилизации клеток носителей и разработке эффективш>к :емов пермеабилизации клеток и контроля их физиологической активности.

SUMMARY

Rudkovskaya Elena Evgenycvna

Polysaccharide-induced changes of ion transport through plasmalcmma of immobilized plant cells

Key words: Chlorella vulgaris, Nitella flexilis, immobilization, Ca-alginate, viat plasmalemma, ion transport, polysaccharides.

Hie objective of the work was a study of mechanism of influence of matrix on th permeability of immobilized plant cells membranes. To carry out the aim of the study methods permitting to control biosynthetic activity of plant cells within different time inte after encapsulation were developed. It was established that entrapment in Ca-alginate incri the viability and the level of metabolism in comparison to suspended cells during long storage. The investigation of NO/ transport using ionselective electrodes and K+(86Rb+) tran using radioisotope method showed that immobilization in Ca-alginate activated nitrate u and decreased potassium accumulation in Chlorella cells. This effect was mediated by alg molecules but not Ca2+ ions. Using different types of polysaccharides a critical role of negal charged groups in matrix-membrane interactions was evaluated. The electrophysiolc analysis of interaction of free alginate with Nitella flexilis cells provided the evidence alginate action was determined by increase of nonspecific leakage conductance follows decrease of resting transmembrane potential and activation of potassium outward reel channels.

The data obtained in the present study may be used in the field of biotechnolog choosing of optimal supports for cell immobilization and express-control of level oJ permeabilization and physiological activity in bioreactors.

Рудковская Елена Евгеньевна

Индуцированные полисахаридами изменения ионного транспорта через плазмалемму иммобилизованных растительных клеток

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 17.03.1998 Формат 60x84 1/16 усл. печ. л. /, 4 Уч.- изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 28

Институт физики им. Б.И. Степанова НАНБ 220072 г. Минск, пр. Скорины, 68 Отпечатано на ризографе ИФ НАНБ. Лицензия ЛП №20 от 20.08.97