Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы модификации транспортных свойств плазмалеммы растительных клеток ионами тяжелых металлов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Механизмы модификации транспортных свойств плазмалеммы растительных клеток ионами тяжелых металлов"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ имени В.Ф. КУПРЕВИЧА

УДК 581.2.02

г;ч од

-.-,.....гяз

ДЕМИДЧИК Вадим Викторович

МЕХАНИЗМЫ МОДИФИКАЦИИ ТРАНСПОРТНЫХ СВОЙСТВ ПЛАЗМАПЕММЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ИОНАМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1998

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений биологического факультета Белорусского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Юрин В.М.

кандидат биологических наук Соколик А.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

член-корреспондент HAH Беларуси Ламан H.A.

доктор биологических наук Сергейчик С.А.

Оппонирующая организация - Институт фотобиологии НАНБ

Защита диссертации состоится « 1998 г.

в /У часов на заседании совета по защите диссертаций Д.01.38.01 в Институте экспериментальной ботаники HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Академическая, 27

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа Академии наук Беларуси

Автореферат разослан « У*» ^oC^Cj^ 1998 г.

Ученый секретарь . Q/

совета по защите диссертаций ' ' ---- ц.В. Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Проблема прогрессирующего загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами ставит перед современной биологией ряд задач теоретического и практического характера. Одна из важнейших среди них - установление механизмов воздействия тяжелых металлов на растительный организм.

Изменения в свойствах биомембран считаются на сегодняшний день наиболее вероятным механизмом токсических эффектов ионов тяжелых металлов на живую клетку как in vitro, так и in vivo /De Vos and Schat, 1991/. Предполагается, что модификация плазматических мембран, происходящая при взаимодействии ионов тяжелых металлов с клеткой, в дальнейшем запускает комплекс реакций, вызывающих патологические изменения во многих физиологических процессах. Однако до сих пор механизмы первичных эффектов тяжелых метаплоз на плазматическую мембрану до конца не расшифрованы. Имеется ряд исследований, в которых при помощи косвенных методов было показано, что под действием тяжелых металлов растет проницаемость плазмалеммы /De Vos et al. 1989; Strange and Macnair, 1991/, но не установлено, с чем связан данный эффект, и как можно предохранить от него мембрану. Следует также отметить, что экспериментальный материал, касающийся механизмов действия тяжелых металлов на плазматические мембраны растений, получен в основном для условий in vitro, в то время как, для мембран животных, грибов и микроорганизмов показано, что эффекты тяжелых металлов in vitro отличаются от эффектов, регистрируемых in vivo /Kiss and Osipenko, 1994/.

Очевидно, что взаимодействие тяжелых металлов с плазмалеммой может проявляться во влиянии на конкретные процессы трансмембранного переноса веществ. Таким образом, для идентификации механизмов первичного действия этих токсикантов на растительную клетку необходимо изучить вызываемые ими изменения в функционировании отдельных ион-транспортных систем плазмалеммы.

В последние годы установлено, что процессы транспорта ионов через плазмалемму растительной клетки в основном реализуются посредством следующих систем: светостимулируемой электрогенной Н*-АТФазной помпы, К*-каналов, быстрых возбудимых Ca2*- и СГ-каналов, неселективной ионной утечки, а также специализированных систем транспорта N03", РО43" и CI", активирующихся в особых условиях /Tester, 1990; Юрин с со-авт., 1991; Tyermann, 1992/. На сегодняшний день данные о действии тяжелых металлов на большинство из вышеприведенных систем отсутствуют.

Среди тяжелых металлов наибольший интерес с точки зрения физиологии растений и агротехнологии представляют поливалентные металлы, относящиеся к микроэлементам. Показано, что такие физиологически важные катионы как медь (Си2*), железо (Fe3* (при pH выше 3.0 этот ион представлен оксо- и гидроксоформами), Fe2*), цинк (Zn2*) и никель (Ni2') в повышенных дозах токсичны для растения /Bergmann, 1992/. Значительный интерес представляют также некоторые тяжелые металлы, не являющиеся необходимыми для роста и развития растений, но содержание которых в окружающей среде постоянно возрастает в результате техногенного загрязнения. Примером металлов такого типа может

служить кадмий (Cd2*), особый интерес к которому в последнее время вызван е чрезвычайно высокой токсичностью для растений, животных и микроорганизмов постоянно растущим содержанием его в среде.

Учитывая приведенные выше факты, исследование влияния ионов тяжелых металл) (Cu2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2*, Cd2*) на системы ионного транспорта плазмалемм представляется важными и актуальными.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Настоящ; работа является составной частью научно-исследовательских тем Министерсп образования и науки Республики Беларусь: «Исследование взаимодействия тяжель металлов с плазматическими мембранами растений» (№ госрегистрации: 1996210' «Изучение регуляции протонных АТФаз плазматических мембран растительных клеток» (I госрегистрации: 19962100), «Исследование взаимодействия микроэлементов с системал ионного транспорта плазматических мембран растений» (№ госрегистрации: 19962099).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявлен! механизмов модифицирующего действия тяжелых металлов на свойства плазмалеми/ клеток Nitella flexilis путем исследования их влияния на функционирование отдельнь систем ионного транспорта.

Для достижения поставленной цели необходимо было решит следующие основные задачи:

1. Разработать методические приемы и экспериментальные условия, позволяющие изучи действие тяжелых металлов на отдельные транспортные системы плазмалеммы «лет Nitella flexilis с помощью электрофизиологических методов.

2. Выявить влияние ионов тяжелых металлов на неспецифическую ионную проводимост ионные каналы и электрогенную Н*-АТФазную помпу плазмалеммы. 6

3. Установить характер эффектов тяжелых металлов на плазмапемму в услови: воздействия на клетку различных экзогенных факторов.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервь продемонстрированы и проанализированы эффекты Cu2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2*, Cd2* i транспортные свойства плазмалеммы растений на уровне их воздействия на отдельнь системы ионного транспорта in vivo на одном объекте. Показано, что в основе первично токсического действия ионов меди и трехвалентного железа на растительную клетку леж! вызываемый ими рост неспецифической ионной проводимости, блокирование СГ-каналов ингибирование электрогенной Н*-АТФазной помпы плазмалеммы. Показано, что эффею роста проводимости и блокирования СГ-канапов могут быть предотвращены введением среду повышенных уровней Са2*, других поливалентных катионов и антагонистов Са' каналов. Получены свидетельства в пользу того, что вызываемые медью и трехвалентнь железом рост проводимости и блокирование СГ-каналов не связаны с процесса ti Свободнорадикального окисления липидов. Установлено, что в отличие от Си2* и оксс гидроксоформ иона Fe3*, ионы Zn2*, Ni2*, Cd2* и Fe2* не проявляют быстроразвивающеЙ! цитотоксичности, опосредованной изменением транспортных свойств плазмалеммы, Ч' свидетельствует о том, что первичный механизм токсичности этих металлов в растении i

связан с нарушением свойств плазмалеммы, а, по-видимому, обусловлен изменениями внутриклеточного метаболизма.

Практическая значимость полученных результатов. Знание закономерностей первичного модифицирующего действия тяжелых металлов на транспортные свойства плазмалеммы создает базу для целенаправленной селекции видов, толерантных к избытку тяжелых металлов, и позволяет обосновать ряд агротехнических подходов, направленных на предотвращение и ослабление эффектов этих токсикантов (например, известкование и т.д.). Апробированные в настоящей работе методические схемы, позволяющие провести быстрое детальное изучение влияния тяжелых металлов на плазмалемму, могут быть применены для анализа первичного действия различных токсических соединений на растительный организм.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

— Индуцируемое Си2* и оксо-, гидроксоформами Ре3*" увеличение проницаемости плазмалеммы растений вследствие роста ее неспецифической ионной проводимости, ингибирование электрогенной Н*-АТФззной помпы и блокирование СГ-каналов являются первичными токсическими реакциями, вызываемыми ионами меди и трехвалентного железа в растительной клетке.

— Эффект роста неспецифической ионной проводимости, вызываемый ионами меди и трехвалентного железа, предотвращается под действием повышенных уровней Са2\ гп2*, №2*, Сс)2*, Ре2*, Н*, антагонистов Са2*-каналов, при понижении температуры, ионной силы раствора и уровня фиксируемого на плазмалемме напряжения, но не изменяется при добавлении ферментативных антиоксидантов, аскорбата и гидроперекиси.

— Действие на транспортные свойства плазмалеммы ионов 2п2*, №2*, Сс12* и Ре2* проявляется в блокировании К*- и СГ-каналов и ингибировании Н*-АТФазной помпы; цитотоксичность этих тяжелых металлов не связана с прямым мембранотропным эффектом.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал, представленный в настоящей работе, получен при решающем участии автора. Обработка результатов экспериментов и их анализ также выполнены непосредственно автором работы.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на 51-ой научной конференции студентов БГУ (октябрь 1995г.), научной конференции сотрудников биологического факультета БГУ (май 1996г.), научной конференции, посвященной 75-летию БГУ (ноябрь 1996г.), научной конференции, посвященная 70-летию биологического факультета БГУ [ноябрь 1997г.), 2-ом съезде Белорусского общества физиологов растений (Минск, октябрь

1995 г.), 2-ом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков. (Минск, июнь

1996 г.), практическом курсе Европейского общества молекулярной биологии (ЕМВО) «Сигнальная трансдукция и структура клеточной поверхности» (Венгрия, август 1995г.), 5-ом международном Конгрессе по трейс-элементам в медицине и биологии (Франция, февраль 1996г.), практическом курсе Федерации европейских биохимических обществ (РЕВЭ) «Химия металлов в биологических системах» (Бельгия, май 1996г.), съезде Международного

общества бионеорганической химии (SBIC) «Гомеостаз металлов / Металлы медицине» (Бельгия, май 1996г.), съезде Европейского Железного Клуба (EIC) (Испань сентябрь 1996г.), на летней школе Общества чистой и прикладной биофизики (IUPA «Биофизика мембранного транспорта» (Польша, май 1997), лекционном курсе Федерац европейских биохимических обществ (FEBS) «Свободные радикалы, оксидативный стресс антиоксиданты. Патологическая и физиологическая значимость» (Турция, май-июнь 1997 и других научных мероприятиях.

Опубликованность результатов. Результаты работы по теме диссертац представлены в 10 статьях и 11 тезисах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общ характеристики работы, пяти глав, выводов, списка использованных источников. Спис цитируемой литературы включает 254 литературных источника. Работа изложена на 1 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 38 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

В работе использовались гигантские интернодальные клетки пресноводной харов водоросли Nitella flexilis /Юрин и др., 1991/. Клетки выращивались, препарировались подготавливались к эксперименту общепринятыми методами /Юрин с соавт., 1977/. качестве базового раствора для всех экспериментов служила искусственная прудовая во, (ИПВ): 10"3 М Na*, 10"4 М К*, 10ч М Ca2*, pH 5-6.

Электрические характеристики плазмалеммы изучались с помощью стандарта микроэлектродной техники /Костюк, 1960/. В экспериментах использовался режим фиксац потенциала на плазмалемме /Hille, 1992/. Охлаждение и нагревание экспериментальн камеры (-2 + 35 °С) производились с помощью термостолика, а температура раство регистрировалась с помощью термопары.

Для изучения характеристик СГ- и К*-каналов, их активацию производили быстр деполяризацией плазмалеммы от потенциала фиксации (ПФ) -150 мВ до уров! находящегося в диапазоне от -140 мВ до +100 мВ. По величинам максимального СГ-токг соответствующим значениям ПФ, строились вольт-амперные характеристики СГ-канал< При достижении стационарных значений тока регистрировались мгновенные вол: амперные характеристики К*-каналов плазмалеммы (МВАХ) путем фиксации импульс напряжения последовательно меняющейся амплитуды /Соколик, 1981/. Для исследован длительных изменений в проводимости плазмалеммы использовался режим фиксац периодически повторяющихся кратковременных гиперполяризующих импульс напряжения. Характеристики светостимулируемой электрогенной |-Г-ЛТФазы изучались п ее активации светом от лампы накаливания, обеспечивающей на поверхности клет освещенность 12 Вт/м2.

Для изучения неспецифической ионной проводимости плазмалеммы использовали специальные экспериментальные условия, позволившие максимально уменьшу

проводимость селективных транспортных систем, «'-каналы блокировались ионами Сэ* ¡5х10"3 М), светостимулируемая Н*-ломпа деактивировалась за счет выдерживания клеток в темноте. Введение одновалентных катионов (5х103 М 1>\ К*, Ма' или Сз*) создавало прирост тока утечки, что позволяло оценить и изучить характеристики ее проводимости.

Для обработки полученных результатов использовались стандартные методы вариационной статистики /Рокицкий, 1978/.

Основные результаты и их обсуждение

Действие ионов меди и трехвалентного железа на транспортные свойства плазмалеммы

На первых этапах наших исследований изучалось влияние тяжелых металлов на общие алектрофизиологические параметры плазмалеммы (разность потенциалов покоя (РПП) и проводимость). Растворы солей СиЭ04 и РеС13, начиная с концентраций 3-5x1045 М и }-5х104 М соответственно, вызывали быстроразвивающиеся и имеющие лавинообразный сарактер снижение РПП и увеличение проводимости (рис. 1). При десятикратном и более увеличении проводимости происходило прекращение циклоза, размягчение клеточной :тенки и в конечном итоге гибель клетки. Параллельно с ростом металл-индуцируемой проводимости (6м<,) происходило блокирование СГ-каналов (рис. 2). Блок слабо зависел от напряжения на мембране, имел схожую концентрационную и временную зависимости с рос-■ом Сш (рис. 3). В последующих экспериментах была предпринята попытка выяснить фироду взаимодействий Си2* и оксо-, гидроксоформ Ре3* с плазмалеммой, лежащих в юнове вме и ингибирования СГ-каналов.

Было обнаружено, что концентрации СивО.» и РеС13, индуцирующие рост проводимости, |е вызывают заметных модификаций свойств К*-каналов. Характеристики С№ не изменяюсь при фиксации различных значений ПФ, ее уровень одинаково возрастал при введении I среду повышенных доз К*, Сэ* и и*. Отсутствие у СМв потенциалозависимости и впективности свидетельствует о ее неспецифичности.

Процессы роста СМо и ингибирования тока СГ-каналов существенно зависели от емпературы; замедлялись или обращались при охлаждении клетки и ускорялись при ее ¡агревании. Температурный коэффициент (О10) скорости роста Сме был выше 3. В то же ремя, значение О,0 собственно бме, т.е. ее температурный коэффициент как проводника, оставлял 1,1-И,3. Это свидетельствует о том, что в основе вме лежат разветвляющиеся ¡епные реакции или мультиферментные превращения, а сама вме, по-видимому, бусловлена пассивным переходом ионов через мембрану посредством водных пор Ларшелл, 1981/. Для проверки последнего предположения был проведен анализ влияния а СМв химических агентов, способных устранять мембранные поры и дефекты.

Время, мин. Время, мин.

Рис. 1. Изменения в РПП (А, Б) и проводимости плазмалеммы (G) (ПФ- -150 мВ) (В, Г) ni добавлении CuS04 (А, В) и FeCI3 (Б, Г) (0 минут) и при отмыве в ИПВ (время начала о/ мыв а указано штрих-пунктирной вертикальной пинией). А, В: 1 - контроль (ИПВ); 2 - И М; 3 - 5x105 М; 4 - 2x10'4 M CuSOБ, Г: 1 - контроль; 2-3x10* М; 3 - 1СГ3 М; 4 - 3x10'3 FeClj.

На основе исследований, проведенных на клетках животных и микроорганизм! /Pasternak et al., 1992; Chatelain, 1994/, были испытаны часто используемые стабилизатор биомембран: Zn2\ Ni2*, Cd2*, FeJ+ (рис. 4), нифедипин и верапамил. Кроме того, бьи исследовано влияние на GMe ионной силы и рН раствора, которые, как известно, также сп собны стабилизировать мембраны /Pasternak et al., 1992/. Было показано, что все избра ные вещества, понижение рН и ионной силы раствора предотвращают или замедпяи

ВПЛОТЬ ДО ОСТаНОВКИ РОСТ GMe-

Обнаруженное протективное действие мембраностабилизирующих агентов подтверди; предположение о том, что природа G№ связана с образованием водных пор. Comaci литературным данным /Stohs and Bagchi, 1995/ одна из возможных причин так< модификации плазмалеммы - свободнорадикальное окисление липидов, катализируем< переходными металлами и способное увеличивать текучесть и проницаемость мембраь /Kumar et al., 1978/. В этой связи было исследовано влияния на ферментативнь антиоксидантов (супероксиддисмутаза, каталаза), гидроперекиси и аскорбата, т.е. вещест способных модулировать свободнорадикальные процессы, происходящие в биомембран;

/Gutteridge and Halliwell, 1694/. Супероксиддисмутаза и каталаза (до 50 мкг/мл), аскорбат и гидроперекись (10"8 - 10~2 М) не влияли на GMe и ингибирование СГ-каналов,' что свидетельствует о неучастии в этих эффектах свободнорадикальных процессов.

Г О -1 |, мкА/см2 Д

+20 мВ ~

I, мкА/см' 60

•40

А

. +20 мВ ■■'..О мВ . ;.-20 мВ

..........-40 мВ

-Э0мВ'-60мВ -120 мВ

+20 мВ 0 мВ -20 мВ

О - 1 □ -2 Д -3 -120

-i2Н£2г

Е, мВ U

-40

Р

-150 мВ -150 мВ 1с

J

\ D-tí 0 Í V>

Рис. 2. Действие 5x105 М Си2* на СГ-каналы плазмалеммы. А, Б, В - типичные кривые временного хода тока при деполяризации плазмалеммы от ПФ = -150 мВ до ПФ = -120, -90, -60, -40, -20, 0, 20 мВ (Г - протокол фиксации напряжения) в контроле (ИПВ + 5x1 Cí3 М 1С) и при 7 и 15-минутной экспозиции в медьсодержащем растворе соответственно. Д - типичные вольт-амперные характеристики СГ -каналов; 1 - контроль; 2,3- 7 и 15-минутная экспозиция в медьсодержащем растворе соответственно.

Эффект, отн. ед 1

1000

[соль металла], х 10

Рис. 3. Зависимость эффектов блокирования СГ-каналов (1, 3) и роста ме-талл-индуцируемой проводимости плазмалеммы (2, 4) от концентрации СиБ04 (1, 2) и РеС/3 (3, 4). Для СГ -каналов Эффект = (1г>2)/1<, где /, -величина пикового входящего СГ -тока в контроле, а 12 - аналогичная величина после 10-20 -минутной экспозиции клеток в растворе соли исследуемого тяжелого металла. Для Эффект = СМс/СМ1макс., где Сиемакс. - максимальная проводимость, индуцируемая металлом за 1020 минут.

[Ме2+] х 10'3

=1 ^ft —

Tt¿íi

■-1 — А.-2 Т| □ -3 0-4; +

/7

7 Д- 5 _

0.01 0.1 1 [Cu2+] х103М

Рис. 4. Изменение действующей концеь трации Си2* при предварительно/ выдерживании клеток в течение 45-6 минут до введения Си1* в средах различным содержанием двухвалентны катионов. Кривые 1, 2, 3, 4, соответствуют следующим катионал 1п2*, Сс?*, Са'*, Ре2*, Ы?*. В качеств действующей выбрана концентраць Си2*, при которой в течение менее 4 минут происходила инициализация

Как указывалось выше, G^ не изменяется при кратковременной фиксации плазмапемме различных уровней напряжения, однако было обнаружено, что, ее фиксировать напряжение непрерывно с момента введения в раствор соли тяжел< металла, то для разных уровней ПФ кинетические параметры развития Gm,, существен отличаются. Длительная гиперполяризация (ПФ = -220 - -200 мВ) ускоряла рост GM0 деполяризация (ПФ = -80 - -100 мВ) замедляла. Анализ кривых временного хода роста G полученных при различных уровнях ПФ, показал, что при любом ПФ этот рост претерпев; две основные фазы: медленную, во время которой наблюдается постепенное увеличен проводимости (обычно в 2-4 раза) (продолжительность от 2-4 минут при ПФ = -200 - -220 до 15-20 минут при ПФ = -80 - -100 мВ), и быструю, характеризующаяся резким увеличением на порядок и более (длительность от 2-3 минут при ПФ = -200 - -220 мВ до минут при ПФ = -80 - -100 мВ). Обычно проводимость плазмалеммы во время noeneflí быстрой фазы достигала уровня проводимости раствора, и клетка погибала.

Кинетические параметры второй (быстрой) фазы роста GMe схожи с аналогичны! полученными для медленного обратимого электрического пробоя мембраны клеток Nit< flexilis /Соколик, 1981/. Характеристики этой фазы мало изменялись при различных ypoBi длительнофиксируемого напряжения. Вид первой (медленной) фазы развития GMe зави( от ПФ: ее длительность росла с уменьшением величины ПФ. Эта фаза, по-видимо соответствует предпробойному состоянию, во время которого накапливаются мембранн дефекты (поры), выступающие в дальнейшем в роли «слабых» участков, подвергающи механическому повреждению под действием электрического поля во время пробоя настоящей работе показано, что время наступления быстрой (пробойной) фазы GUa ре увеличивается или уменьшается с понижением или повышением температ; соответственно, что характерно для развития пробойных явлений в мембранах /Wilheln al., 1993/. Кроме того, известно, что для электрического пробоя свойственна высо зависимость скорости его развития от содержания в среде поливалентных катионо

ионной сипы раствора /Song et al., 1993/, что было продемонстрировано в настоящем исследовании для процесса роста GMe.

Известно, что тяжелые металлы способны ингибировать АТФазы растений в условиях in vitro /Serrano, 1990/. В настоящей работе протестировано влияние меди и трехвалентного железа на светостимулируемую электрогенную Н'-АТФазную помпу in vivo (рис. 5). Эффект, усл.ед.

Рис. 5. Ингибированив светостимули-руемой электрогенной Н*-А ТФазной помпы плазмалеммы под действием меди и трехвалентного железа. Эффект = (Go • GJ/G0, где G0 и G, -светостимулируемая проводимость помпы до и после введения в раствор солей тяжелых металлов.

0.01

0.1

[ соль металла ], х 10"4 М

100

Для устранения эффекта роста неспецифической проводимости эксперименты по изучению действия меди и трехвалентного железа на Н+-помпу проводились на фоне 5x103 М 2а2*. Начально исследовалась реакция плазмалеммы клеток, неадаптированных к темноте, г.е. с Н*-помпой, находящейся в активированном состоянии. При введении в среду CuS04 и -еС1г высокий уровень проводимости и РПП, характерный для активированного состояния юмпы быстро падал до величин, свойственных для ее деактивированного состояния. Также фоводились исследования, в которых CuS04 и FeCI3 вводились в рабочий раствор во время максимальной светоактивации Н'-АТФазной помпы плазмалеммы клеток, адаптированных к 'емноте. В этих исследованиях были получены кривые дозозависимости эффекта (см. рис. >). Полумаксимальное ингибирование помпы наблюдалось при 1.5-2Х10"5 М и 4-6x10^ М юнов меди и трехвалентного железа соответственно.

О возможной природе модификации транспортных свойств плазмалеммы, индуцируемой ионами меди и трехвалентного железа Кинетические параметры поступления оксо- и гидроксоформ Fe3\ образующихся при астворении FeCI3, в растительную клетку не известны, поэтому нельзя однозначно становить, с какой стороны плазмалеммы это вещество действует. Для Си2* известно, что тот ион плохо проникает в цитоплазму (Си2' в концентрации 10"6 М - 10"4 М через 1 час бнаруживается только в клеточной стенке) /Kathsack and Sachert, 1969/, что дает снования предполагать, что описанные в настоящей работе эффекты обусловлены оздействием меди с наружной стороны плазмалеммы. Однако, следует отметить, что Си2* ожет проникать в цитоплазму через поры, реализующие GMe-

В результате проведенных исследований были установлены следующие свойства GMo: ■ отсутствие потенциалозависимости; • отсутствие селективности к одновалентным катионам;

— низкий температурный коэффициент GMe как ионного проводника (Ош = 1,1 - 1,3);

— высокий температурный коэффициент скорости роста GMe (Q10 > 3);

— подавление под действием H*, Zn2*, Ni2*, Fe2*, Cd2*, Ca2*;

— отсутствие реакции на анти- и прооксиданты;

— ускорение под действием высокой ионной силы раствора, торможение вплоть остановки под действием низких температур;

— схожесть в развитии и свойствах с обратимым электрическим пробоем биомембран. Анализ полученных результатов в свете современных литературных данны>

механизмах действия тяжелых металлов на живые системы показал, что Gm, ингибирование СГ-каналов может быть связано с модификацией ряда мишене( растительной клетке. Во-первых, в качестве возможной мишени меди и трехвапентк железа могут выступать локусы на мембране, содержащие в своей конститутив структуре поливалентные катионы (Ca2*, Zn2*, Fe2* и др.) /Bergmann, 1992/. Обладая бо высоким сродством к данным центрам, Си2* и Fe3* способны вытеснять или замещать в другие катионы, нарушая, нативные свойства мембраны /Williams, 1981; Bergmann, 19 Такое нарушение может приводить к образованию мембранных пор и, соответственн! росту неспецифической ионной проводимости. Следует отметить, что потеря натив целостности мембраны может вызвать ингибирование СГ-каналов вследствие высс зависимости их функциональных характеристик от состояния липидного окружения /Tes 1990/.

Возможным механизмом эффектов, вызываемых ионами меди и трехвалентного жел: является также модификация Са2*-канапов, приводящая к изменению внутриклеточн гомеостаза Ca2* (росту его цитоплазматической активности). Как известно, увеличение н центрации Ca2* в цитоплазме может запускать сигнально-регуляторные реакции, акту рующие гидролитических ферментов, разрушающие плазмалемму /Stohs and Bagchi, 19 Известно, что такая модификация может быть вызвана окислением «критическ сульфгидрильных групп Са2*-канапа как непосредственно ионом тяжелого металла, та гидроперекисью, образование которой катализируется тяжелыми металлами /Price et 1992/. В настоящей работе показано, что гидроперекись не влияет на эффек вызываемые ионами меди и трехвалентного железа, поэтому возможно они оказыв; прямое влияние на Са2*-канап. В рамках такого механизма действия хорошо укладывав протективное влияние на Gm,, двухвалентных катионов, антагонистов Са2'-канапов и Н*, веществ, блокирующих Са2*-канапы, но не понятно аналогичное действие Ca2*. Мо> предположить, что описанный механизм не является единственным, и, возможно, мед трехвалентное железо вызывают одновременно дестабилизацию липидного бисло? изменения в активации Са2*-канапов /Negre-Salvayre et al., 1992/. Также возможно, протективный эффект повышенных уровней Ca2*, других двухвалентных катионов и превосходит по силе мембраностабилизирующего воздействия деструктивное влияние мембрану Са2*-активируемых гидролитических систем.

Возможные механизмы взаимодействия ионов меди и трехвалентного железа плазмалеммой схематично представлены на рис. 5.

ЦИТОПЛАЗМА

ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА

Рис. в. Возможные механизмы модифицирующего действия меди и трехвалентного железа на транспортные свойства плазмалеммы:

_ НгО, любые электролиты и неэлектролиты

1 - замещение Са2' и / или других поливалентных катионов (Мена поверхности плазмалеммы;

2 - ингибирование Н*- помпы;

3 - блокирование СГ - канала;

4 - окисление «критических» сульф-гидрильных групп Са2'-канала, приводящее к его активации;

Наружный центр ингибирования Н* - помпы

5, 6 - повреждение мембраны и нарушение работы СГ - канала под действием Са2*-зависимых гидролитических ферментов;

ПЛАЗМАЛEMMA

7 - мембранные поры, ответственные за неспецифическую проводимость.

В наших экспериментах полумаксимальное ингибирование Н*-помпы медью наблюдалось ри ее концентрации 1,5-2хЮ"5 М, что сопоставимо с результатами, полученным in vitro для омпы, локализованной на плазмалемме высших растений (10"5 - 1СГ4 Щ /Serrano, 1990/. ^гласно современным представлениям по вопросу о механизмах ингибирования помпы яжелыми металлами /Kennedy and Gonsalves, 1987, 1989; Serrano, 1990; Pressley and abatini, 1996/ воздействие металла происходит со стороны цитоплазмы и проявляется ибо в замещении Мд2* в комплексе Мд-АТФ либо в образовании стойких комплексов с ульфгидрильными группами активного центра АТФазы. Однако обнаруженное в настоящей аботе ингибирование помпы развивалось уже через 1-2 минуты после введения в раствор онов меди и трехваленого железа в таких концентрациях, при которых диффузия их через пазмалемму должна занимать более часа. В этой связи, по-видимому, центр нгибирования помпы этими металлами должен располагаться на наружной стороне пазмалеммы. Аналогичное расположение данного центра известно для некоторых типов лектрогенных помп клеток животных /Kiss and Osipento, 1994/.

Действие Zn2*, Ni2*, Fe2* и Cd2* на транспортные свойства плазмалеммы

При экспозиции клеток, адаптированных к темноте, в растворах, содержащих Zn2*, Ni2*, з2* и Cd2* (10"® -10"2 М), в течение нескольких часов не происходило существенных (более ;м на 15-25%) изменений РПП, но наблюдалось снижение проводимости плазмалеммы. аким образом, реакция плазмалеммы была противоположна описанной выше для зухвапентной меди и трехвалентного железа. Эффект уменьшения проводимости азвивался быстро (1-3 минуты), начиная с 5x10"" -10"5 М Cd2*, 5х10"5 М - Ю"1 ГИ Zn2*, Ni2* и i2*. Его величина в несколько раз возрастала при повышении содержания К* в растворе.

Дальнейшие исследование позволили определить изменения в ион-транспортнь механизмах плазмалеммы, ответственные за наблюдаемое падение проводимости, обнаружить другие виды взаимодействий Zn2\ Ni2*, Fe2* и Cd2* с мембраной.

Было установлено, что ионы Cd2* и Zn2* способны снижать неспецифическую ионну утечку плазмалеммы: Zn24 и Cd2' на 30-35 % и 20-25 % соответственно, уменьшали прибав проводимости, вызываемую добавлением в раствор 5x10"3 М Na* на фоне заблокирована селективных ион-транспортных систем. Можно предположить, что в основе этого явлен| лежит понижение текучести мембранного бислоя. Подтверждением этому служит тот фа! что под действием 10"4 М Cd2' и Ni2' заметно падает текучесть плазматических мембр; высших растений (от 0,5 - 1 до 7 -10 % при температурах 5 и 25°С соответственно), а, к известно, такое воздействие приводит к снижению фоновой проницаемости мембран модификации работы ее ион-транспортных систем /Fodor, 1995/.

Исследование влияния Zn2*, Ni2*, Fe2* и Cd2* на ионные каналы плазмалеммы показал что начиная с уровня 5x10"6 - КГ4 М, эти катионы вызывают независимый от потенциа; блок К*-каналов Д- и Г-типов, снижая амплитуду тока и замедляя активацию. Концентрац! двухвалентных катионов, вызывающая блок, уменьшалась в ряду: Ni2*=Fe2*>Zn2t>Cc (табл.). В таком же концентрационном диапазоне происходило блокирование СГ-канал' (рис. 7). Ni2* и Cd2* вызывали независимый от потенциала блок. Fe2* и Zn2* до 10"3 блокировали СГ-каналы потенциапозависимо, а в более высоких концентраци потенциалонезависимо. Концентрация двухвалентного катиона, требующаяся для 5С блока СГ-каналов, уменьшалась в ряду: Fe2*>Ni2*=Zn2*>Cd2*.

Действие двухвалентных катионов на К*-каналы, описанное в настоящей работе, схоже описанным в литературе эффектом Cd2* на К*-каналы плазматической мембра» протопластов, выделенных их листьев высших растений (Samanea saman) /Moran et г 1990/: блокируются Г и Д-типы каналов, блок не зависит от потенциала.

Характеристики описанного в настоящей работе блока укладывается в рамки актив разрабатываемой во многих современных работах модели блокирования ионных канале вызываемого прямым взаимодействием поливалентного катиона с аппаратом канальнс гейтинга/Hille, 1992/. Согласно представлениям, положенным в основу этой модели, катис блокатор (Cd2*, Fe2*, Zn2*, Ni2* и т.д.) способен изменять амплитуду К*-тока и кинетк открывания-закрывания канала за счет конформационных изменений канальных молек} индуцируемых при модификации свойств определенных групп на ее наружной поверхносл

Обнаруженное в настоящей работе блокирование СГ-каналов под действием Cd2*, Fe Zn2*, Ni2*, может быть связано не только с влиянием на данный тип каналов, но также v модификацией участвующих в их активации Са2*-каналов /Берестовский, 1987/. Следу отметить, что характер блока при увеличении концентраций Fe2* и Zn2* до 103 - ЗхЮ"3 изменялся: наблюдался возврат смещенных под действием более низких уровней эт катионов активационных токовых кривых до значений напряжения, приблизитель соответствующих контрольным. Кроме того, в отличие от блока, индуцируемого Cd2* и Ni блокирование под действием Fe2* и Zn2* не бывало полным даже при высоких уровнях и> среде (данные катионы в виду их низкой цитотоксичности вводились в концентрации до 1

М). Можно предположить, что в столь высоких концентрациях Fe2* и Zn2* способны проникать через Са2*-каналы, которые согласно литературным данным блокируются этими катионами, но при миллимолярных уровнях, последних способны пропускать часть их в цитоплазму /Kiss and Osipenko, 1994/. Попадая в цитоплазму, Fe2* и Zn2*, активируют СГ-каналы, но менее интенсивно, чем Са2*, так как обладают более низким сродством к центру активации/Берестовский, 1987/.

Таблица

Концентрации катионов, вызывающие 50% снижение проводимости плазмалеммы при активации Г-и Д-типов tC-каналов (ПФ = -150 мВ и ПФ = -20 мВ соответственно)

Исследуемый Концентрация металла, Концентрация металла,

катион вызывающая 50% снижение вызывающая 50% снижение

проводимости плазмалеммы при проводимости плазмалеммы при

ПФ = -150 мВ, М ПФ - -20 мВ, М

Cd2+ 1,5-2x10'5 10"5- 1,5x10'®

Zn2* 10"4- 2х10ч 5x10"®-10"4

Fe2* 2-5x10^ 3-6x10"

Ni2* 5x10^ - 10"3 3-5x10"4

I, мкА/см

• - контроль д-10"5 М Cd2* о - 5x10"® М Cd2 а - 2x10"* М Cd2 □ -10"3 М Cd2* № о - контроль о -10"* М Zn2* A-3x10"MZn2' a - 10J MZn2* □ -3x10'1 MZn2' гШ

jjsr * п

—1—1—1—(— —t—i—i

Рис. 7. Изменения в вольт-амперных характеристиках СГ - каналов плазмалеммы под действием СсУ2*, Ге2*, 2п2* и Л//2*. Концентрации металлов указаны на рисунке. Контрольный раствор содержал ИПВ + 2х 10'3 М К'.

-60 -20 Е, мВ.

Действие Cd2*, Ре2*, гп2*, М2* на светостимулируемую электрогенную Н*-АТФазную помпу плазмалеммы изучалось на фоне повышенных уровней Се* (2,5х10'3 М) и Са2* (5х10~3 М) при рН 6,0, что было необходимо для минимизации влияния исследуемых двухвалентных катионов на К*-каналы плазмалеммы и для устранения вклада изменения поверхностного заряда мембраны в изучаемые явления /Юрин с соавт., 1991/. Использовались такие же

методические подходы как и при изучении действия на помпу меди и трехвапентж железа. В первом случае ионы тяжелых металлов вводились в момент максимапьи светоактивации помпы: 2x1o"3 - 2х102 М вызывало уменьшение проводимое плазмалеммы, индуцируемой светом, на 30-60 %. Последующее добавление 5х105 М Ci приводило к снижению проводимости до уровня, соответствующего моменту нача светоактивации. Введение в среду 2x1o-3 - 2x102 М Cd2*, Fe2*, Zn2* и Ni2* неадаптированных к темноте клеток вызывало снижение проводимости на 20-40 %, есл1 дальнейшем в раствор добавлялось 5x10"5 М Си2*, то проводимость падала до уров: соответствующего клеткам, адаптированным в темноте. Таким образом, полж ингибирования Н*-АТФазы под действием Cd2*, Fe2*, Zn2*, Ni2* не наблюдалось.

Время развития ингибирования помпы ионами Cd2*, Fe2*, Zn2* и Ni2* составляло 10 минут. Поскольку известно, что данные катионы в концентрациях, использованных в рабо быстро проникают через плазмалемму/Costa and Morel, 1995/, то, можно предположить,» они взаимодействуют с активным центром помпы со стороны цитоплазмы. Концентраь Cd2*, Zn2*, Ni2*, вызывающие полумаксимальный ингибирующий эффект, были практиче» одинаковы (3-4x10"3 М), а для иона Fe2* эта величина составляла 7-8Х10"3 М.

ВЫВОДЫ

1. Си2* и оксо-, гидроксоформы Fe3*, образующиеся при растворении FeCI3, начина; концентраций 5x10"® и 2x104 М соответственно, вызывают лавинообразный р< неспецифической проводимости, блокирование СГ-канапов и ингибирование ГГ-АТФазь помпы плазмалеммы растительной клетки in vivo. Эти реакции составляют первичн токсический эффект избыточных уровней в среде Си2* и оксо-, гидроксоформ иона Fe3* f растительной клетки. Скорость роста металл-индуцируемой проводимости плазмалем обнаруживает высокую температурозависимость (Q,0 > 3), что указывает на то, что в оснс этого процесса лежат разветвляющиеся цепные реакции или мультиферментн превращения. Температурный коэффициент собственно металл-индуцируеи проводимости не высок (Q,0 = 1,1-1,3), что свидетельствуют о ее пассивной прирс (водные поры).

2. Лавинообразный рост проводимости плазмалеммы, индуцируемый Си2* и оке гидроксоформами иона Fe3*, замедляется вплоть до остановки повышенными уровня Са2*, Zn24, Ni2*, Cd2*, Fe2*, H*, нифедипина, верапамила, при охлаждении клетки, понижен ионной силы раствора и уровня фиксируемого на плазмапемме напряжения, но изменяется при добазлении анти- и прооксидантов. Соответственно, наиболее вероять причиной этого эффекта является нарушение гомеостаза Са2* и других катионов растительной клетке, а не свободнорадикальное окисление липидов.

3. Вызываемое Си2* и оксо-, гидроксоформами иона Fe3* блокирование СГ-канапов зависит от потенциала, обнаруживает схожую с металл-индуцируемой проводимостью к центрационную, временную и температурную зависимость.

4. Ионы Zn2', Ni2*, Cd2' и Fe2*, начиная с уровня 5x10"6 - 10"* М, вызывают независимый от потенциала блок всех типов К*-каналов плазмалеммы. В этом же '.онцентрационном диапазоне они блокируют СГ-каналы плазмалеммы, причем Ni2* и Cd2* вызывают независимый от потенциала блок. Fe2* и Zn2* до уровня 10'3 М блокируют СГ-(аналы потенциалозависимо, а при более высоких концентрациях - потенциалонезависимо. В отличие от Си2> и оксо-, гидроксоформ иона Fe3*, ионы Zn2*, Ni2*, Cd2* и Fe2* не проявляют зыстроразвивающейся цитотоксичности, опосредованной изменением транспортных ;войств плазмалеммы, т.е. первичный механизм токсичности этих металлов в растении не :вязан с нарушением свойств плазмалеммы, а обусловлен изменениями внутриклеточного летаболизма.

5. Си2* и оксо-, гидроксоформы Fe3* вызывают полное, a Cd2*, Zn2*, Ni2* и Fe2* частичное 1Нгибироваиие светостимулируемой электрогенной Н*-АТФазной помпы плазмалеммы. Наиболее вероятное расположение сайта ингибирования этого фермента Си2* и оксо-, идроксоформами Fe3* - наружная сторона плазмалеммы, а для Cd2*, Zn2*, Ni2* и Fe2* - внут->енняя. Действие на помпу является одним из основных первичных факторов токсичности 1тих тяжелых металлов в растении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. The effect of Cu2* on ion transport systems of the ilant cell plasmalemma// Plant Physiology. - 1997. - Vol. 114, - № 8. - P. 1313-1325.

2. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Взаимодействие ионов тяжелых металлов с лазматическими мембранами низших растений // Весц1 АН Benapyci Сер. 6ian. навук. -996, - N2 3. - С. 30-34.

3. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Влияние ионов меди на функционирование Н*-ГГФазной помпы плазмалеммы растительной клетки // Доклады АН Б. - 1996. - Т. 40, ■ № 2. -:. 84-87.

4. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Механизмы модификации проводимости юмбран растительной клетки под действием ионов трехвалентоного железа // Доклады АН .. - 1997. -Т. 41,- №3. - С. 83-87.

5. Oniani J., Yurin V.M., Sokolik A., Kudriashov A., Chokhonelidze M., Demidchik V.V. On the techanism of membranotropic action of the heavy metal ions on the plant cells // Bull, of Georg. cad. of Sci. - 1996. - Vol. 154, - № 3. - P. 432-436.

6. Yurin. V.M., Sokolik A.I., Demidchik V.V., Kudryashev A.P. Use of biotests for monitoring Dilution of former military sites // Proceed, of the 3-rd Int. techn.-pract. conf. «Productive reuse of irmer military sites: environmental and economic aspects of demilitarization». - Minsk. - 1996. -. 469-477.

7. Юрин B.M., Ониани Д.А., Кудряшов А.П , Соколик А.И., Чохонилидзе М.О., Демидчик .В. О механизме мембранотропного действия ионов тяжелых металлов на растительные 1етки // Весц1 АН Benapyci, Сер. 6ian. навук. - 1997, - № 2. - С. 57-60.

8. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Действие ионов тяжелых металлов на зетостимулируемую электрогенную Н*-АТФазу плазматической мембраны растительной

клетки in vivo II Достижения современной биологии и биологическое образован! Труды науч. конф. - Минск, 1997. - С. 164-169.

9. Демидчик В.В. Исследование первичных механизмов токсического действия ион железа на растительную клетку // 36. навуковых артыкулау 53-й навуковай канф. студэн" Белдзяржушвератета. - Мшск.: БДУ, 1996. - С. 14-17.

10. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Изменение проницаемости плазматичеа мембран растений под действием поливалентных катионов II Актуальные пробле социально-гуманитарных и естественных наук: Матер, науч. конф. - Минск., 1996. - Т. 1. -226-228.

11. Лява А.Г., Демидчик В.В. Изучение механизмов мембранотропного действия цинка Матер. 54-ой науч. конф. студентов БГУ. - Минск: БГУ, 1997. - С. 14-17.

12. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. The effect of iron on ionic transport systems of plant cell plasmalemma II Abstr. of Europ. Iron Club Meet. - Jaca, 1996. - P. 67.

13. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. Effects of iron excess on ionic transport acn plant cell plasmalemma // Addendum to abstr. book of XXXV Europ. congr. of toxii «EUROTOX'96». - Alicante, 1996. - P. 12.

14. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. Mechanisms of heavy metal stress in the plant plasmalemma // Proceed, of Int. congr. of stress «Stress of life. Stress and adaptation fr molecules to man». - Budapest, 1997. - P. 178.

15. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. Effects of Cu2+ and Fe3f on ion transport syste of the plant cell plasmalemma // Proceed, of NATO-FEBS course «Free radicals, oxidative str and antioxidants. Pathological and physiological significance». - Antalya, 1997. - P. 123.

16. Yurin. V.M., Demidchik V.V., Kudriashov A.P., Sokolik A.I. Chemical safety managemen the territories of former military sites // Proceed, of 4th Int. techn.-pract. conf. on «Productive re of former military sites: environmental and economical aspects of demilitarization». - Minsk, 1£ -P. 108-109.

17. Demidchik V.V., Sokolik A.I., Yurin. V.M. The effect of heavy metal ions on light-stimuli electrogenic l-T-ATPase of the plant plasmalemma // Proceed, of 7th congr. of the Europ. soc for photobiology. - Stressa, 1997. -P. 134.

18. Демидчик B.B., Соколик А.И., Юрин В.М. Взаимодействие ионов Си2* с транспорта системами плазмалеммы клеток Nitella П Матер. 2-го съезда Белорусского общее физиологов растений. - Минск, 1995. - С. 99.

19. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Действие никеля на ионные кан; плазматических мембран растений // Тез. докл. 2-го съезда Белорусского общее фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирова биосистем». - Минск, 1996. - С. 45.

20. Демидчик В.В. Влияние ионов меди на функционирование транспортных сис плазмалеммы // Матер. 51-ой студ. науч. конф. БГУ. - Минск, 1994. - С. 9

21. Ониани Д.А., Кудряшов А.П., Чохонелидзе М.О., Демидчик В.В. Использова биофизических подходов для систем экологического мониторинга и скрининга // Тез. док; го съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем». - Минск, 1996. - С. 225.

РЭЗЮМЕ

Дзямщчык Вадз1м BiKTapaBÍ4

Мехажзмы мадыфшацьи транспартных уласцшасцей плазмалемы раслжных кпетак юнам1 цяжшх мяталау

Ключавыя словы: Nitella flexilis, цяжюя мяталы, мехажзмы ташчнасц!, ¡онныя каналы, блаюраванне, Н*-АТФазная помпа, кальцыявы гамеастаз

Мэтай работы было вызначынне механ!змау мадыфкацыйнага уплыву цяжюх мяталау на уласцтасц! плазмалемы кпетак Nitella fiexiiis шляхам даследвання ¡X удзеянняу на функцыянаванне асаб'ютых астэм юннага транспарту. Выкарыстоувапася стандартная м'|краэляктродная тэхнжа, экперыменты праводз'ш'юя у рэжыме фксацьн патэнцыялу на плазмалеме. Прадаманстраваны i праанал1заваны эфекты Cu2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2*, Cd2* на астэмы юннага транспарту плазмалемы раслшнай клетю /л vivo на адным аб'екце. Вызначана, што ¡оны медз1 ¡ трохвалентнага жалеза вышкаюць лавшаабразны узрост няспецыфннай юннай праводнасц1, блаюраванне СГ-каналау i ¡нпб1раванне электрагеннай Н*-АТФазнай помпы плазмалеммы. Эфект росту праводнасц1 з'яупяецца першаснай ташчнай рзакцыяй раслшнай клетю на гэтыя мяталы i можа прыводзщь да яе папбелК Вылучана, што узрост няспецыфтнай праводнасц1 папярэджваецца або замараджваецца павышзннем узроуняу Са2*, Zn2*, Ni2*, Cd2*, Fe2*, H*, антаганютау Са2*-каналау, пры знЬкэнн! тэмпературы, юннай моцнасц1 раствору i узроуня ф|шруемага на плазмапемме напружання, але не змяняецца пры дабауленж ферментатыуных антаксщантау, аскарбату i riflpanepaKici. Шчыцца, што ен не звязан з свабоднарадыкальным аюсленнем niniflay, а прадумоулены парушэннем унутраклетачнага гамеастазу Са2* i / або замяшчэннем фЫялапчна-важных катыенау на паверхш плазмалеммы. Удзеянне на транспартныя уласц!васц1 плазмалемы Zn2*, Ni2*, Cd2* i Fe2* праяуляецца у блаюраванж К*- и СГ-канапау, ÍHri6ipaBaHHÍ Н*-АТФазнай юмпы i знЬкэнж яе няспецьфчнай праводнасц|. У адрозшванн! ад юнау медз1 i трохвалентнага жалеза, яно не ляжыць у аснове цытатакачных эфектау гэтых мяталау.

Выжю работы ствараюць тэарытычную базу для мэтанаюраванай селекцьм вщау, галерантных да л1шку цяжюх мяталау, i распрацоую агратэхналапчных падыходау, ■1аираваных на папярэджванне i аслабленне эфектау гэтых такакантау.

РЕЗЮМЕ

Демидчик Вадим Викторович

Механизмы модификации транспортных свойств плазмапеммы растительных клеток ионами тяжелых металлов

Ключевые слова: Nitella flexilis, плазмапемма, тяжелые металлы, механизмы токсичност ионные каналы, блокирование, Н'-АТФазная помпа, кальциевый гомеостаз

Целью работы было выявление механизмов модифицирующего действия тяжель металлов на свойства ллазмалеммы клеток Nitella flexilis путем исследования их влияния h функционирование отдельных систем ионного транспорта. Использовалась стандарт« микроэлектродная техника, эксперименты проводились в режиме фиксации потенциала t ллазмапемме. Продемонстрированы и проанализированы эффекты Cu2*, Fe3*, Fe2*, Zrí Ni2*, Cd2* на системы ионного транспорта ллазмалеммы растительной клетки in vivo t одном объекте. Обнаружено, что ионы меди и трехвалентного железа вызывак лавинообразный рост неспецифической ионной проводимости, блокирование СГ-каналов ингибирование электрогенной Н*-АТФазной помпы ллазмалеммы. Эффект рос" проводимости является основной первичной токсической реакцией растительной клетки i эти металлы и может приводить к ее гибели. Установлено, что рост неспецифическс проводимости предотвращается либо замедляется повышенными уровнями Са2*, Zn2*, Ni' Cd2*, Fe2*, H*, антагонистов Са2*-каналов, при понижении температуры, ионной сил раствора и уровня фиксируемого на плазмалемме напряжения, но не изменяется п[ добавлении ферментативных антиоксидантов, аскорбата и гидроперекиси. Предполагаете что он не связан со свободнорадикальным окислением липидов, а обусловлен нарушение внутриклеточного гомеостаза Са2* и / или замещением физиологически-важных катионов t поверхности плазмапеммы. Действие на транспортные свойства ллазмалеммы Zn2*, N¡: Cd2* и Fe2* проявляется в блокировании К*- и СГ-каналов, ингибировании Н*-АТФазн( помпы и снижении неспецифической проводимости. В отличие от ионов меди трехвалентного железа, оно не лежит в основе первичных цитотоксических эффектов эт| металлов.

Результаты работы создают теоретическую базу для целенаправленной селекции видо толерантных к избытку тяжелых металлов, и разработки агротехнических подходо направленных на предотвращение и ослабление эффектов этих токсикантов.

SUMMARY

Demidchik Vadim Viktorovich

Mechanisms of the heavy metal ion-induced modification in transport properties of the plant cell plasmalemma

Key words: Nitella fl&xilis, heavy metal, toxicity mechanisms, ion channels, block, H'-ATPase 3ump, calcium homeostasis

The objective of the work was detection of modification mechanisms of the heavy metal action jn plasmalemma properties of Nitella flexilis cells by investigating their influence on separate ion .ransport systems. The standard microelectrode technique was employed. Experiments were :arried out in voltage-clamp mode. In vivo effects of Cu2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2* and Cd2* on ion ransport systems of the plant cell plasmalemma were demonstrated and analyzed. It was )bserved that copper and trivalent iron ions induce an avalanche-type increase of the nonspecific on conductance, Cl"-channel block and l-T-ATPase pump inhibition. Effect of the conductance jrowth is the primary toxic reaction of the plant cell to these metals and it can lead to the cell ieath. An avalanche-type conductance growth was prevented or delayed by elevated levels of Za2>, Zn2*, Ni24, Cd2*, Fe2\ H*, Ca2*-channel antagonsts and lowering the temperature, ion ;trength of the solution, potential fixed on the plasmalemma, however it can be altered by ■nzymatic antioxidants, ascorbate and hydroperoxide. This effect seems to be unrelated to a free adical oxidation of lipids, but it can be a result of the disruption of an intracellular Ca2* lomeostasis and / or replacement of physiologically-important cations from the plasmalemma ¡urface. Effects of Zn2\ Ni2*, Cd2* and Fe2* on plasmalemma transport properties were follows: jlocking the K*- and Cl'-channels, l-f-ATPase pump inhibition and nonspecific conductance iecrease. In despite of action of copper and trivalent iron ions they are not primary cytotoxic :ffects.

Results of the study create the theoretical basis for purposeful selection of species which are olerant to heavy metals, elaboration of agrotechnological approaches directed for preventing and owering heavy metal influence.