Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазматическая мембрана клеток суспензионной культуры корня сахарной свеклы: Выделение, барьерные свойства и АТФ-зависимый транспорт ионов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Плазматическая мембрана клеток суспензионной культуры корня сахарной свеклы: Выделение, барьерные свойства и АТФ-зависимый транспорт ионов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ГАЙВОРОНСКАЯ Людмила Михайловна

ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА КЛЕТОК СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КОРНЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: ВЫДЕЛЕНИЕ, БАРЬЕРНЫЕ СВОЙСТВА И АТФ-ЗАВИСИМЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ

03.00.12 — физиология растений <

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических.наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамен! Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева Рос сийской Академии наук.

Научный руководитель — доктор биологических нау! Ю. Г. Молотковский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, про фессор Н. П. Кораблева, кандидат биологических нау! Ю. В. Балнокин.

Ведущая организация — Московский государственный уни верситет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет, ка федра физиологии растений.

Защита состоится О^сс^^..... 1992 г. 1

«/С» часов на заседании специализированного советг К002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биоло гических наук при Институте физиологии растений им. К. А Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническа! ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти тута физиологии растений РАН.

Автореферат разослан 5 ноября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета — канд. биол. наук

Л. И. Сергеева

Актуальность проблемы. Нлазмплемма - важнейший структурный мент клеточного строения живой материи, играющий ключевую роль язнообразных биологических функциях. Будучи диффузионным барье-I, эта мембрана контролирует необходимый для поддержания жизни ыспорт в клетку и из нее неэлектролитов и ионов, что обуславли-т биологическую значимость соответвующих транспортцых систем. 'иеность ион-транспортных систем плазмалемш во многом определя-гомеостаз цитоплазмы, реакцию клетки на внешние воздействия и тие клеточные функции.

Несмотря на очевидную значимость ион-трансиортных систем плаз-юмми растений, долг'ое время их изучали в основном лишь на ин-:тных одноклеточных водорослях. Исследование плазматической мемб-н высших растений в сильной степени замедлялось отсутствием ■одов ее выделения, позволявших получать достаточно чистые прети с сохранением барьерных свойств мембраны и активности транс-шшх систем. Несовершенство методик, как и ограниченность инфор-[ии о механизмах переноса ионов через плазматическую мембрану юбенно вторично энергизовашюго), обусловили цель и задачи дис-ггационной работы.

Цель и задачи исследования: Целью работы было выяснение меха-1Мов транспорта ионов через плазматическую мембрану растений. В [зи с этим основными задачами работы было:

Подобрать и, если необходимо, модифицировать метод выделения плазмалеммы, пригодный для изучения ее ион-трансиортных систем. На данной экспериментальной модели определить барьерные свойства плазмалеммы по отношению к некоторым ионам и изучить содержащиеся в этой мембране АТФ-зэвисимые транспортные, системы.

Научная новизна: Налажена методика выделения из клеток сус-13И0ШЮЙ культуры сахарной свеклы внсокоочшценннх (обогащение ;) везикул плазмалеммы с одинаковой вывернутой ориентацией этой 1браны, способных удерживать трансмембранные градиенты ряда ионов , К4, Ыа+, С1~). Показано существование в изолированной плазма-[еской мембране электрогенной Н^АТФазы, потенциалзависимых -каналов, а также системы трпнсмембратюго С1~/НСО^- обмена. Ус-ювлено, что активность протонной АТФазы находится под контролем шсмомбранного протонного градиента и, что трансмембрашшй пере: протонов этим ферментом сильно стимулируется при открывании в измалемме С1~-каналов.

плазмалемме С1 -каналов.

Научно-практическое значение работы. Усовершенствованная н: методика применима для выделения высокоочищенных препаратов везш плазмалеммы с вывернутой ориентацией мембраны из различных рас1; тельных объектов. Использованнные в работе подходы и получеш результаты могут быть полезными при изучении трансмембранного nej носа ионов и метаболитов на клеточном и субклеточном уровнях. Щ мененные экспериментальные приемы представляют интерес для выяа ния механизмов минерального питания и разработки критериев устой' вости растений к экстремальным факторам.

Апробация работы. Основные результаты были представлены на бининском семинаре "Ионный обмен и физиология корня" (Москва, 19t на III Международном симпозиуме "Структура и функции корней" (Ни1. 1987), на VI конгрессе федерации общества .физиологов расте (Сплит, 1988) и на II съезде Всесоюзного общества физиологов рас ний (Минск, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введен! обзора литературы, описания методов исследования, изложения noj ченных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы

Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, соде жит 27 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 196 наш даваний, из которых 182 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В работе использована суспензионная культура клеток саха| свеклы.

Получение фракции плазматических мембран. Все процедуры по i делению препарата плазмалеммы проводили при 2°С. В работе на pai личных стадиях выделения мембран использовали среды:

(A) - G00 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА в 15 мМ трис - HCI буфере, рН 7, (Б) - 400 мМ сахарозы, 7,5% поливинилпиролидона, 0,5% бычьего сш

роточного альбумина, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ фенилметилсульфонилф: рида, 2,5 мМ метабисульфита калия, в 50 мМ хепес- трис буфе рН 7,8;

(B) - 400 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА в 15 мМ хепес - трис буфере,

рН 7,8;

- 400 мМ сахарозы в 5 мМ хепес - бис трис-пропане, pH 7,3.

Для экспериментов брали 7-дневную культуру, находящуюся в конце ■арифмической фазы роста. Клетки фильтровывали через бязь, прош-ш средой А и разрушали в течение 30 секунд в гомогенизаторе С-302 (Польша) в среде В при соотношешш вес клеток /объем среды ¡ном 5-7 г/мл. Гомогенат, отфильтрованный через 2 слоя бязи, 1трифугировали 15 минут при 10 000g. Осадок, содержащий неразрушим клетки, клеточные стенки, ядра и митохондрии, отбрасывали, а тернатант центрифугировали 30 минут при 80 000g. Полученный в зультате этого осадок ресуспендировали в среде В и вновь центрировали 30 минут при 80 000g. Новый осадок ресуспендировали в уде Г и добавляли к смеси ПЭГ 4000 - декстрэн Т 500 (приготовлен-i на среде Г) содержащей по 6,3% (вес/объем) каждого полимера до эазования фазовой системы. Последнюю для лучшего разделения энер-то перемешивали и центрифугировали 3 минуты при 1500g. Верхнюю зу, содержащую везикулы плазм,алеммы, центрифугировали 30 минут л 80 000g. После ресуспендирования осадка (ПМ I) в среде Г про-ДУРУ разделения повторяли. Полученные после повторного разделе-я в фазовой смес и и осаждения везикулы плазматической мембраны М II) ресуспендировали в среде Д.

Изменения градиента концентрации протонов через мембрану (дрН) енивали по изменению оптической плотности зонда акридинового анжевого (АО).

Трансмембранную разность электрических потенциалов (Affl) регис-ировали по изменению оптических свойств зондов - бис-1,3-дибутил-рбитуровая кислота-(5)-пентаметин-оксонола (ДиБа-С^-Сб)), 3,3'ди-опилтио-дикарбоцианиниодида (JöiC-Cg-CS)), бис-(3-пропил-5-оксо-оксазол~4-ил)пентаметин оксонола (оксонола VI) и 3,3-дипентил-2' -оксакарбоциаЕШна (ДиО-Cg-(3)).

Активности маркерных ферментов - цитохром с-оксидазы, НАДН-тохром с-оксиредуктазы и НАДФН-цитохром с-оксиредуктазы определи спектрофотометрически, регистрируя редоке изменения цитохро-с (лЛssd-ssb)- ПРИ исследовании фосфогидролазной активности пре-ратов шюзмалеммн гидролиз АТФ, п-нитрофенилфосфата (п-НФФ) и озиндифосфата проводили 30 минут при 28° С. Реакцию запускали до-[влением Ugf'+-AW и останавливали трихлоруксусной кислотой. Коли-ство неорганического фосфата измеряляли по методу Ретбуна и Ветла-I [Rathbun, Bet lach, 19691, о - белка по Бредфорду tBradford,

1976]. Активность каждого фермента определили в 3-5 опытах; максимальное отклонение от средней величины не превышало 10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поиск эффективных методов выделения плазмалеммы. Для выполнения поставленной задачи был необходим препарат плазмалеммы из однородных по размеру везикул вывернутой ориентации, способных удерживать трансмембрэшше градиенты ионов. К началу работы не было ясно, удовлетворяют ли этим критериям существующие методы, из которых, следовательно, требовалось выбрать и, если нужно, модифицировать наиболее подходящие. Были испытаны различные способы выделения плазмалеммы (рис.)). Из них наиболее известен метод Ходжеса, с помощью которого мы выделяли мембраны из проростков кукурузы и суспензионной культуры клеток сахарной свеклы. Полученные препараты мембран были на 75% обогащены плэзмалеммой. Тем не менее они не имели транспортной активности АТФазы и, следовательно, непригодны для решения поставленной задачи.

Применительно к животном клеткам разработаны эффективные приемы выделения плазмалеммы, которые мы адаптировали к растительным протопластам. Последние иммобилизовывали на частицах сефадекса и разрушали. Листки плазмалеммы отделяли от сефадекса озвучиванием и фильтрованием. Другой опробированный нами метод основан на связывании лектина с поверхностью протопластов, разрушении их и дифференциальном центрифугировании листков плазмалеммы, более тяжелых за счет лектина. Оба метода отличает быстрота, что важно для сох-раннения нативннх свойств мембраны. К сожалению, чистота препаратов оказалась недостаточной, а ультразвуков:»! обработка при втором ме тоде нарушала барьерные свойства мембран.

Нам пришлось вернуться к выделишш плазмалеммы из фракции мпк росом, но уже не в градиенте плотности сахарозы, а в двухфазной полимерной системе 11Э1 - ДЕКСТРАН. Этот мотод ранее применялся Риде л 1УШ(2е11 а1., 1ьв2] и Ешида 11)'ог,/п<:11 сч а.1., 1 УвЗ). Мз их публикаций, однако, певоможно судить о пригодности препаратов дл* изучения ион-транспортных систем. Поэтому мы воспроизвели обе модификации. Оказалось, что выделение но методу Видел дает препарат 90.5 чистоты, но неспособный к образованию ЛТФ--зависимого лрН. Модификация метода Ешида обеспечивала сохранение барьерных свойств препара та, который, тем не менее был загрязнен посторонними мембранами

-И-

Fair,t. Испытанные мето.гл выделения, плазматической мембраны.

•

клетки

Промивка и плазмолиз в среде А Гомогенизация в среде В

гомогенат

15 мин, 10000 8

супернатант

30 мин, 80000 8

осадок i

Ресуспендиравание в среде В 30 мин, 30000 я

осадок ii

Перемешивание'

10 мин, 400 8

базовая ' , система I

ii ii

10 мин, 400 8

осадок да и

1|' ? 80000 8 р^ОСАДОК ; ,!• ш 1

Пере'мёшванив

Фаздвт.-. 30 мин, 80000 8 система И .

Ре сцепеиЗира&ание в среде Д

препарат везикул плазмалшш

Рис.2. Схема выдала 1шя »фракции плазмалеммы.

ция метода Ешида обеспечивала сохранение барьерных свойств препарата, который, тем не менее был загрязнен посторонними мембранами. Мы попытались разработать собственную модификацию, которая бы объединяла преимущества двух методов, и остановились на схеме виде ления, представленной на рис.2.

О чистоте препарата судили на основании электронно-микроскопического исследования, а также измерения активности ферментов-маркеров примесных мембран и изучения свойств АТФ-гидролазной активности.

Электронно-микроскопическая оценка препарата плазматичеокой мембраны. Фракция плазмалемда, полученная двумя последовательными разделениями в двухфазной полимерной системе, практически не содержала примеси немембранного происхождения. Препарат состоял из везикул, близких по размерам (диаметром 100 - 400 нм). На микрофотографиях срезов, контрастировании 2% уранил ацетатом и цитратом свинца, мембрана у 9555 везикул имела толщину 10,1 ± 0,7 нм, как и на срезах интактных клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. В обоих случаях хорошо видна слоистая структура плазмалеммы: два электронно-штатных слоя, и между ними электронно-прозрачный, за счет которого эта мембрана на 2-3 нм толще, чем другие. Описанные морфологические особенности были присущи по меньшей мере 9555 везикул нашего препарата.

Один из признаков плазмалеммы - ее способность специфически окрашиваться смесью периодной, хромовой, фосфорно-вольфрамовой кислот 1Яо1агиЗ е1 а1., 1972]. Это наблюдалось и нами на срезах клеток. Во фракцйй плазмалеммы 95% везикул окрашивалось контрастером, что подтверждает вывод о том, что препарат почти полностью состоял из плазматической мзмбракк.

. Удельные - активности маркерных .ферментов примесных мембран. Степень .загрязнения выделенных фракций неплазматичесними мембранами была оценена по удельным активностям (в расчете на белок препарата) ферментов.-"маркеров митохондрий, эндоплазматического . рети-кулумэ, тонопласта я .аппарата Гольджи СQua.ll, 1979]. Показано, что разделение, везикул'микросомальной фракции в двухфазной полимерной системе -'-сопровождается уменьшением удельных активностей этих ферментов в. верхней, обогащенной плазмалеммой фазе (табл.1). Актшэ-нОсть цитохром.с-оксидазы, свойственной-митохондриям, была в нашем препарате в 160. раз'меньше, .чем в. микросомзльной фракции.... НАДН-

щтохром с-оксиредуктаза - маркер эндоплазматического ретикулума была соответствешю в 12 раз менее активна. Активность родственного фермента НАДФН-цитохром с -оксидородуктазы, присутствующая как в митохондриях, так и в эндоплазматическом ратикулуме, уменьшалась в 11 раз. Загрязнение препарата фрагментами аппарата Гольдки, оцененное по активности латентной инозин-дифосфатазы, оказалось также небольшим.

Иными словами, активность ферментов примесных мембран была

низкой. •

Таблица 1

Удельные активности ферментов - маркеров мембран

( нмоль субстрата мш мг белка" )

Фракция

Фермент Микросомы ПМ1 гаи

Цитохром с-оксидаза , 64 4 (16)* 0,4 (160)

НАД-Н ое-дуктаза 56 12(4,7) .6 <И,2)

НАДФ-Н ре-'дуктаза •62 •13 (4,8) .г-: 6 (12,4)

Инозин-ди- 1 фосфотаза 4? 6 (7,8) 0,8 (58,8)

-в скобка* приведена степень очистки ( отношение удельной активности микросомальноЯ фракции к удельной активности указанной фракции)

АТФ-гидролазная активность препарата плазматической мембраны. Полученная фракция Плазматической мембраны была способна гвдролизовать АТФ. В отсутствие ионофоров скорость реакции составляла 10-25 мкмоль Фн х ч~' х мг белка"', Эта активность не была Обусловлена неспецифической кислой фосфэтазсй, так как скорость гидролиза ее субстрата - я-нитрофенилфосфата (д-НМ>) не превышала 1,БХ от скорости гидролиза АТФ. АТф-гидролазная активность подавлялась известными ингибиторами мембранных АТФаз - дациклогексил-ка^бодаимидом (ДЦКД) и даэталстяльбестролом, строго зависела от

-а- . ' ■'•■

и снижалась на 17% в отсутствие КС1. Это позволило заключить, что гидролиз ЛТФ полученным нами препаратом мембран обусловлен работой Mg'+-зависимой, KCÍ -стимулируемой АТФазы, предполагаемого ' маркера плазмалешы растительных клеток IQuall, 1979].

Существенной характеристикой любого' фермента является рН-оптимум его функционирования. Для нашего препарата эта величина составляла 6,5, как и у описанных в литературе fSze, (985; Serrana, 1990] АТФаз плазмалеммы растительных клеток. Отношение АТФ-гидро-лазной активности выделенных мембран при рН 6,5 к соответствующей активности при рН 9,0 было более 20, что близко к этому показателю у высокоочищонных. препаратов плазмалеммы грибов и бактэрий (Gaffeau.et al., 1981].

Гидролиз АТФ подавлялся специфическим ингибитором АТФазы плазмалеммы - ортованадатом. Олигомицин и азид, специфические ингибиторы митохондриальных АТФаз IQuall, 1979], не влияли заметно на АТФ-гидролазную активность полученного препарата. Неэффективным был и нитрат - ингибитор АТФазы'тонопласта. Изучение АТФ-гидролазной активности фракции подтвердило, что последняя представляет собой вы-сокоочшшнный. препарат плазмалеммы.

Таким образом, использованная нами методика выделения плазматической мембраны оказалась весьма эффективной и обеспечила высокую чистоту получаемрго препарата. Барьерные свойства составлявдих его везикулярных мембран оценивали по их способности удерживать трансмембранные ионные градиенты.

Проницаемость плазматической мембраны по отношению к ионам Н*. К+ и С1~ была оценена с помощью зондов, чувствительных к дрН ид®.

Как видно из рисунка 3, совместное добавление к везикулам плазмалеммы, нагруженным КС1 и помещенным в бескалиевую среду, ва-линомишша и п-трифтор-метоксикарбоншдианид-фэнилгидрозона (ФКФ) приводило к уменьшению оптической плотности акридинового оранжевого. Эффект, отражает закисление среда внутри везикул в результате обмена К+ на Н*. Это потвервдаэтея восстановлением исходного уровня оптической плотности суспензии после внесения в нее грамицидина D, разрушающего трансмембранные градиенты ионов К+ и Н4", или ниге-рищша обменивающего КПоскольку отдельно ни валияошпдт, ни ФКФ не влияли тга: рН внутри ВЭЗшул, можно сделать вывод об относительно низкой .проницаемости мекЙрдн для ионов К*"- и. К*.

Чтобы оценить проницаемость плазмалэммы для анионов их использовали в виде солей непроникающих катионов. В роли такого катиона был взят Оис трис-пропан. В этих экспериментах мы следили с помощью зонда ДиО-СБ~(3) за изменением на везикулярной мембране мембранного потенциала (со знаком минус внутри). Добавление БТП-солэй серной шш соляной кислот к суспензии везикул оставляли неизменной оптическую плотность зонда (Рис.4). Тем не менее, последняя снижалась

валиномииин

„i

©СФ

НИГВрИЦИН

лА-аа-вцо^.02

H

1 мин

Рио.З. Индукция ионофорами рбразования дрН в везикулах :■

ллазмалемыы, нагруженных KCl.

Состав инкубационной среда: 5 мкМ АО, 400 мМ сорбита,..

50 ыМ холин-основания, 5 мМ БТП-ХЕПЕС, pH 7,8. ''Добавки: 0,5 мкМ ФКФ, 0,5 мкМ валиномицкна, 10 мМ NHttCl, 0,5. ыкМ нигерицина, 0,5 мкЫ грамицидина D.

шйле внесения БТП-NOg в инкубационную среду, вероятно,, отражая бЬррзованиэ диффузионного потенциала ионов NOg. Аналогичные опыты с "калийными солями дали сходные результаты, свидетельствующие о не-•'цроницаемости плазмалеммы для ионов К+. Из изложенного следует, что анионы, способные проникать через плаэмалвмму, генерируют в указан-

пых условиях Дф на везикулярной мембране. Так, легко проникающий анион роданид, так же, как и нитрат вызывал качественно сходные спектральные изменения Ди0-С5-(3). Сравнение скорости таких изменений для различных анионов позволило установить, что их проникающая способность убывает в ряду:

ЗС1Г»*ГОз»СГ & НСО3.

Таким образом, везикулярная мембрана полученного препарата обладает барьерными свойствами для ряда ионов, что представляется

НРО4 л БО^".

отл-зд аттмд «ли«}] ка кж>)4

1 I I I

К2КРО4, КЛСОз. млономникн

|*шч

1Н\о.4. Кинетика образования диффузионного потенциала на везикулярной мембран© в присутствии некоторых ионов.

Состав инкубационной среди: 4 мкМ ДИО-С- -(3),

250 мМ сорблта, 25 мМ БТП-МЕС, рН 6,6. Добавки: по 10 мМ солей: БТП (А) калия (Б и В), по 1'мкМ валиномицина.

валшм для идентификации и выяснения особешюстей функционирования некоторых ион-транспортных систем в этой мембране.

АТФ-зависимая генерация дрН. Внесение М^-АТФ в инкубационную среду с везикулами плазмалеммы, содержащую акридиновый оранжевый, изменяло его оптическую плотность, что свидетельствует о за-кислении внутри везикул (рк'Ь.б.А). Скорость этого процесса линейно возрастала с увеличением концентрации белка и зависела от рН, достигая максимума при рН 6,5. Сдвиг рН внутри везикул снижался в присутствии агентов, снимающих трансмембранные градиенты протонов. Измеренная по методу Дуфаур 1Ш/оиг, 1982) величина дрН на везикулярной мембране в присутствии (/¿3+-АТФ и 50 мМ 01" составляла 1,35 ± 0,42 од.рН.

Очевидно, истинным субстратом Н^-АТФазы является комплекс М£^+-АТФ, потому, что транспорт протонов не наблюдался при добавлении к везикулам только или только АТФ. Процесс АТФ-зависимого

закисления внутри вазикул останавливался N,N' -дициклогексилкарбоди-имидом, известным блокатором проводимости протонного канала Н^-АТФаз. Таким же действием обладал ортованадат. Последний, как показано на различных объектах, является специфическим ингибитором Я^-АТФаз плазматических мембран IBoumxn et al., 1978; Gof/eau et al., 1981]. Отсюда можно считать, что запускаемое внесением АТФ образование дрН обусловлено активностью АТФазы, локализованной на

влазмалемме.

i . . ' , д лСГ Б

/имя

/мин

дикя и»" [¿'као'еош'т

•к*

Рис.5. АТФ-зависимая генерация трансмембранных ДрН (А) и Дф (Б> в везикулах плазматической мембраны.

Состав инкубационной среды: А - 15 мкМ АО, 40 мкМ ЭГТА, БО МЫ КС1, 300 мМ сорбита, 5 мМ БТП-МЕС, рН 6,5; Б - 4 мкМ оксонола-УТ, 300 мМ сорбита, 40 мкМ ЭРГА, 10 мМ М^О», 25 мМ БТП-МЕС, рН 6,5.

Добавки: 2,Б мМ Иа.-АТФ, 2,5 мМ М§Б0„,25 мкМ ДЦКД или 30 мкМ №3у6№> I мкМ грамицидина Б, 2 мкМ ФКФ.

АТФ-зависимая генерация дф- Добавление Мв2+-АТФ к инкубационной среде с везикулами плазмалеммы, содержащей оксонол-У1, вызывало уменьшение дА590_608 (рис.ББ). Поскольку при внесении гращцидана й в инкубационную среду величина ЛА590-6О8 увеличивалась до исходного уровня, наблюдаемое изменение оптических свойств зонда обусловлено возникновением дф.

Влияние ионофоров на скорость АТФ-гидролазной реакции препарата плазмаламмы. Способность везикул плазматической мембраны к гидролизу АТФ и генерации ¿4Ш4 в присутствии М^+-АТФ свидетельствует о существовании в мембранной фракции популяции везикул с вывернутой ориентацией их мембран. Следовательно, -цитолазмвтическая поверхность хотя бы у части везикул обращена в инкубационную.среду. Это возможно в случае вывернутой ориентации везикул, при которой цитоплазматическая сторона мембраны, "С локализованной на ней . АТФа- ..

зой, обращена наружу. Для оценки ориентации везикулярной мембраны мы использовали детергенты, неспецифически увеличивающие ее проницаемость. В наших опытах (таблица 2) тритон Х-100 повышал АТФазную активность везикул. Она, однако, но превосходила активности в присутствии ионофоров, разрушающих только трансмембранные градиенты протонов, и не изменяющих доступность внутренней поверхности везикул для АТФ. Отсюда можно заключить,что в препарате практически не содержатся везикулы с правильной ориентацией мембраны.

Таблица 2.ч

Влияние ионофоров и тритона Х-100 на АТФ-азную активность

везикул плазмалеммы.

Состав среды Активность, %

Контроль 100

То же + нигерицин 2,5 мкМ 233 :

+ нигерицин 2,5 мкМ 277

и валиномицин 2 мкМ

+ Тритон Х-100 О.ОП 262

Состав инкубационной среда в контроле: 400 мМ сахарозы, 50 Ш К01,

40 МКМ ЭГТА, 2,Б мМ М§30ц, 2,Ь мМ Иаг-АТФ» 60 мМ ТВП-МЕС, рН 6,3.

100% активность соответствует 22,3 мкмоль Ф„ час-* мг белка-'

н

Нигерищш, электронейтрильно обменивающий через мембрану ионы К+ на К*, шунтирует ориентировашшй перенос протонов АТФазой. Этим определяется его стимулирующее влияние на активность фермента. Внесение в среду совместно валиномицина и шг в рицина устананавли-вает равновесие по обе стороны мембраны по К* и что разрушает как дф, так и лрК. Ускорение гидролиза АТФ везикулами плазмзлеммы в присутствии ионофоров, по-видимому, свидетельствует о том, что процесс гидролиза сопрягши с трансмембранным переносом водородных ионов. Возникающей в реакции трансмембранный электрохимический градиент протонов' (¿1^+) тормозит ее и, следовательно, активность АТФазы находится под протонным контролем. Поскольку, нигерицин, выравнивающий концентрации Н* по оба стороны мембраны, значительно активировал АТФазу, а валиномицин, разрушающий дф, стимулировал процесс лищь незначительно, можно считать, что в нших эксперимен-

тах АТФаза везикул плазмалеммы генерировала преимущественно в форме дрН.

Известно, что ионы хлора способны существенно елиять на кинетику АТФ-индуцированного накопления протонов везикулами эндомемб-ран (Bennet, Spanewtck, 1983; Андреев, и др., 1987;. С целью выяснения возможности регуляции ионами хлора работы Н^АТФазы мы детально исследовали влияние анионов на АТФ-зависимую генерацию дрН И а® и определили возможные пути трансмембранного переноса С1~.

Влияние анионов на АТФ-зависимую генерацию дрН. Обнаружено, что анионы инкубационной среда влияют на скорость индуцированного АТФ закислэння внутривезикулярного пространства (рис. присутст-

Рио.б. Действие анионов на АТФ-зависимую генерацию ДрК в везикулах плазматической . мембраны

Состав инкубационной среды: 15 мкМ АО, 250 мМ сорбита, 2,5 мМ MgSO» мМ БТП-МЕС, рН 6,5- ■ и, кроме того, 20 мМ КяНР0„ (1) или KaS04 • (2), КНС03 (3), КС1 (4), KNO, (5), KSCN (6),

Реакцию запускали добавлением 2,6 мМ Иаа-АТФ.

вии легко проникающего аниона роданида рН изменялся о наибольшей скоростью. В случав более медленно проникающих NOg и С1~ она была соответственно в 1,6 я 4,1 раз меньше. С анионами So|~, НСОд и НР0^~ внутривезикулярное изменение рН не зарегистрировано. Причиной увеличения начальной скорости АТФ-индуцированного внутривезикулярного закисления в присутствии SON", С1~ или Год может быть стимуляция этими анионами активности АТФазы. Для проверки данного предположения было исследовано влияние ряда анионов на АТФ-гидролазную активность везикулярного препарата в - условиях, когда добавлением грамицидина D снят протонный контроль' активности АТФа-ан. Оказалось, что анионы не влияют на.скорость гидролиза АТФ, что . согласуется с представлением об отсутствии анион-чувствительного центра у Н^-АТФазы плазматической мембраны ISerrano, 19881.

По-видимому, в данных условиях, более вероятно, что стимули- • рувдее влияние ряда анионов на АТФ-зависимую генерацию .дрН" связано' с их поступлением во внутривезикулярное пространство, в „ результате чеш на мембране уменьшается дф. Это предположение подтверждает!, тот факт, что начальные скорости АТФ-здвисимой генерации дрН -уве- -личивались с возрастанием'концентрации' 01' в среде. Наличие' насы-:.

. .J4- - •

щаемой компоненты в данных условиях может отражать существование в мембране анионных каналов. В координатах Хейнса-Вульфа эта компонента описывается линейной зависимостью в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментена (кажущаяся Кщ = 3,75 мМ). Можно предположить, что трансмембранний перенос анионов хлора осуществляется через специфические каналы, которые, по-вкдимому, активируются при работе Н+-АТФазы й возникающей вследствие этого разности .потенциалов через плазмалалемму ("плюс" внутри везикул).

Диссипация мембранного потенциала анионами. В отсутствие про- ч никапцих ионов длительное время сохранялось постоянное значение ' потенциала, образованного в присутствии АТФ (рис.7А). Внесение калийных солей серной и угольной кислот не сказывалось на его величине, тогда как добавление роданида или нитрата вызывало быструю

иГИНОММГНН

Рис.?. Действие анионов на величину дф образованного на везикулярной мембране в присутствии АТФ (А) или валинсмицина (В).

' Состав инкубационной'среды: А- 4 мкМ оксонола VI,

250 Ш сорбита, 10 мМ М^См, 25 мМ БТП-МЕС, рН 6,5. Б - то же плюс 5 мМ КгБО». Добавки: 2,5 мМ Наг-АТФ, 10 мМ КЯОз .последовательно 2; 10 и 25 мМ БТП-С1, 10 мМ ВЗСИ, I мкМ грамицидина Б, I мкЫ валиномицина.

диссипацию мембранного потенциала, скорость которого определялась проникающей способностью липофильшх анионов. Внесение С1~ вызывало сходное1 по кинетике, но более медленное падение мембранного потенциала. Начальные скорости диссипации зависели от концентрации вносимого С1~. На основании этой концентрационной зависимости была

рассчитана кажущаяся К,,, = 3,75 мМ транспорта хлор-иона через плазматическую мембрану. Нетрудно видеть, что кажущиеся Кд,, характеризующие зависимости от концентрации анионов С1~ в среде начальной скорости формирования дрН и диссипации дф совпадают. Сходство зависимостей скорости генерации дрН (насыщаемая компонента) и'дФ от концентрации С1~ и их насыщение, причем при одной и той ке- концентрации, позволяет предположить, что оба процесса обусловлены транспортом этого аниона внутрь везикул через специфичные потенци-алчувствительные каналы.

Ионы хлора способны ускорять диссипацию искусственно созданного с помощью валиномицина диффузионного потенциала (рио.7Б). Это позволяет заключить, что дф независимо от способа его генерации является движущей силой для транспорта С1~ через плазмалемму.

Влияние блокаторов С1~ - каналов. Качественная оценка участия С1~-каналов в переносе хлор-иона через плазмалемму была получена в . результате применения блокаторов анионных каналов - ДиДС, фуросе-мида, этакриновый кислоты. Их предварительное добавление к суспензии везикул в среда, содержащей С1~, замедляло АТФ-зависимое образование дрН. Концентрации блокаторов, подавляющие скорость образования дрН на 6056, составляли для ДиДС, фуросемида и . этакршовой кислоты соответственно 20, 275 и 950 мкЫ и близки к указанным в литературе для покрытых клатрином везикул Ше et aZ., 1983) плазматических мембран клеток харовых водорослей и осморегудирукщих органов позвоночных IБереаповский и др 1987),

Наблюдаемое подавление скорости образования. дрН нельзя . объяснить только блокированием С1" каналов, поскольку одновременно наблюдалось частичное ингибирование фермента. АТФ-гидролазвая активность в везикулах, освобожденных от протонного контроля.добавлением грамицидина D, подавлялась на 50% и 25% при внесении соответственно 20 мкМ ДиДС и 1 мМ фуросемида. . _

Чтобы избежать побочного влияния блокаторов анионных каналов на активность АТФазы, их добавляли к суспензии везикул после формирования АТФ-индуцированного мембранного потенциала. При этом, активность АТФазы оказывалась достаточной, чтобы,поддерживать достигнутый уровень мембранного потенциала.в присутствии фуросемида и этакриноной кислоты. Последующее внесение С1~ вызывало . диссипацию дф, скорость которой заметно уменьшалась в присутствии фуросемида :

и этакриновой кислоты (рис.8).

Таким образом, Н^АТФаза в изолированной плазмалемме может образовывать соотношение между химической и электрической

компонентой которого зависит от состава инкубационной среды. В наших экспериментах образование АТФ-зависимого градиента рН определялось наличием в среде анионов способных проникать через мембрану.

Рис.8. Влияние блокаторов анионных каналов на кинетику АТФ-зависимой диссипации дф ионами хлора на везикулярной мембране.

Состав инкубационной среды: 4 мкМ оксонола VI, 250 мМ сорбита, 10 мкМ М^Оц, 25 мМ БТП-МЕС, рН 6,5.

Добавки: 25 мМ БТП-С1, 50 мкМ этакриновой кислоты, I мМ фу-росемида. Реакцию запускали добавлением 3,5 мМ Иа^-АТФ.

Известно, что на плазмалемме растительных клеток имеется значительный, направленный в наружную среду, трансмембранный градиент концентрации анионов хлора [В1ше1 et а.1., 19881. Пока остается неясным, какие механизмы поддерживают ассиметрию в распределении этого функционально важного иона. Согласно Гринштейну 1вг1пзге1пе1 , 19881 ионы хлора накапливаются в цитоплазме за счет работы С1-/НС0д антипортера. В нашей лаборатории показана возможность существования С1~/НС0д-обмена в плазмалемме протопластов из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы (Трофимова, 1992). В связи с этим, мы попытались обнаружить такой обмен в более простой системе - везикулах плазмалеммы, выделенных из того же растительного объекта.

НСОр - зависимая диссипация дрН в везикулах плазмалеммы, нагруженных С1~. Перенос везикул, прединкубироват.ых в среде с рН 7,2, в среду с рН 7,8 вызывал быстрое уменьшение оптической плотности индикатора акридинового оранжевого, свидетельствующее о возникновении трансмембранного градиента рН через плазмалемму (рис.9). Падение ¿^492-540 не обусловлено в данном случае возможным изменением оптических свойств рН-индикатора при связывании везикулами, поскольку внесение в среду протонофора ФКФ или антибиотика грамицидина Б, полностью восстанавливало исходное значение абсорбции индикатора.

АТФ

I

Рис.9. НС03-зависимое за-щелачивание внутреннего пространства везикул плазматических мембран. Состав инкубационной среды: 350 мМ сорбита, 40 мкМ ЭГГА 16 мкМ АО, 25 мЫ ХЕПЕС-БТП рН 7,8;

везикулы плазмалеммы (15 мкг белка), нагруженные С1 при рН 7,2 (кривая 1 и 2), либо прединкубированные при рН 7,2 (кривая 3). Добавки: 20 мМ N801, 20 мМ ЫаНС03, I мкМ ФКФ или I мкМ грамицидина Б.

Добавление N811002 к суспензии везикул, нагруженных КС1, вызывало увеличение ДА492-540' свидетельствующее о защелачивании среды внутри везикул. Этот эффект не связан с возможным Иа+/Н+-трансмемб ранным обменом, поскольку внесение ЫаС1 в суспензию не влияло на дрН. Более вероятно, что наблюдаемое повышение рН внутри везикул определяется поступлением НСОд в результате обмена внутривезику-лярного С1~ на бикарбонат инкубационной среды.

Следует учесть, что константа диссоциации угольной кислоты приблизительно на 11 порядков ниже, чем у соляной и рН внутриве-зикулярного пространства должен повышаться в зависимости от поступления анионов бикарбоната. Подтверждением С1~-зависимого поступления НСОд во внутривезикулярное пространство служит и то, что в ненагрукенных КС1 везикулах, при сохранении дрН (везикулы пред-инкубироганные при рК 7,2 без КС1) экзогенный НСОд не влиял на рН внутривезикулярного пространства.

Таким образом, внутривезикулярное защелачивание в среде, содержащей НСОд, зависит от направленного наружу градиента 01".

Кинетика НСО^-зависимой диссипации дрН в везикулах плазматической мембраны зависела от концентрации бикарбоната в среде. Увеличение концентрации вносимого в суспензию бикарбоната до 10 мМ ускоряло начальную скорость диссипации градиента рН. При дальнейшем возрастании концентраций НСОд скорость процесса не увеличивалась. Начальная скорость диссипации дрН достигала полумаксимального значения при 4,98 мМ НСОд.

Влияние ДиДС и фуросемида на НОО^-зависимую диссипацию дрН. Известно, что у клеток животных С1~/НС0д обмен чувствителен к 4,4' диизотиоцианостильбен-2,2' -сульфонату (ДиДС) и 4-ацетамидо-до-4,-изотиоционо-2,2,-стильбенсульфонату (СиТС), ингибиторам анионного транспорта 1Вгаиег 19891, которые способны взаимодейство-

вать нэ только с наружной, но и с внутренней поверхностью мембран IGabantchtk et al., 1978]. В наших экспериментах ДиДС замедлял защелачивание внутривезикулярного пространства, вызванное НСО^; 50% ингибирование наблюдалось при 0,9 мкМ блокатора. Поскольку фуросемид подавляет С1~/НС0д - обмен ICabantchtk et al., 1978; Lambert et al., 1988], мы исследовали влияние этого ингибитора на индуцированное бикарбонатом внутривезикулярное защелачивание. Действительно, обнаружено ингибирование процесса, которое достигало 50% при 0,3 мМ фуросемида.

Представленные экспериментальные данные содержат основные доказательства наличия С1~/НС0д обмена в плазматической мембране клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Его функциональные характеристики соответствуют характеристикам антипортеров клеток животных.

Завершая изложение, мы полагаем уместным подчеркнуть, что использование везикул плазмалеммы, как относительно простой модели, открывает новые возможности для исследования этой мембраны.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения плазмалеммы из клеток суспензионной культуры корня сахарной свеклы. Препарат представляет собой высокоочищенную (95%) фракцию везикул с вывернутой ориентацией мембран.

2. Установлено, что полученные мембраны способны удерживать трансмембранные градиенты ионов Н+, К+, Na+, С1~ и обнаруживают функциональную активность некоторых ион-транспортных систем.

3. В изолированной плазматической мембране выявлена электрогенная Н^-АТФаза, активность которой контролируется трансмембранным протонным градиентом.

4. Показано наличие в плазмалемме потенциалчувствительных С1~-каналов, активность которых может контролировать образование Н+-АТФазой трансмембранного градиента pH.

5. Установлено, что пассивная проницаемость изолированной плазматической мембраны убывает для исследованных анионов в ряду: SC1T»N03>>C1" ~ НСО3 Z HP0^~ z so|~.

6. В плазматической мембране обнаружена система, осуществляющая трансмембранный С1~/НС0д обмен (1^=4,98), ингибируемый фуро-семидом и ДиДС.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Гайворонская Л.П., Трофимова И.О., Политковский Ю.Г. Протонный контроль электрогенной Н+-АТФазы в везикулах плазматических мембран из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. // Докл. АН СССР, 1987, Т.292, N3, С.759-762.

2. Гайворонская Л.U., Тилонина В.Н., Трофимова N. С., Дэюбен-ко B.C. Получение и характеристика везикул плазматической мембраны с низкой протонной проницаемостью из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы.// Физиология растений, 1987, Т.34, N1, С.13-27.

3. Gajvoronskaya L.U., Troflmova U.S., Ttmonlna V.N. Active Ion transport in sealed plasma membrane vesicles from suspension cells of sugar beet root.// Abstracts of 3 rd International Symposium -"Structure and Function of roots," Nitra, 1987, P.43.

4. Gajvoronstiaya I.If., Troflmova U.S., Tlmonina V.N., Molot-kovaky Jur.G. Ion transport systems of plasma membrane involved in the cytosol pH regulation.// Adstracts of 6th congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, 1988, Split. 505.

5. Гайворонская I.U. Влияние CI" на генерацию H+ АТФазой дрН и дф в везикулах плазмалеммы из суспензионной культуры клеток сахарной свеклы.// Тезисы докладов Второго съезда Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990, С.43.

6. Гайворонская JI.U., иолошовсшй Ю.Г. Роль хлорных каналов в АТФ-зависимой генерации дрН изолированной плазматической мембраной.// Физиология растений, 1991, Т.38, N5, С.874-882.

7. Гайворонская Л.М., Иолошовсшй Ю.Г. С1~/НС0д-обмен в везикулах плазматической мембраны из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы.// Биологические мембраны, 1991, Т.8, N10, С.1034-1038.

/ccci■/e-fea**'-'^-

Объем 1 'Д п. л.

Заказ 1934.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127560, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44