Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние солей тяжелых металлов на клетки пресноводных растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние солей тяжелых металлов на клетки пресноводных растений"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

МУХАМАДИЯРОВ Ринат Авхадиевич

ВЛИЯНИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА КЛЕТКИ ПРЕСНОВОДНЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск — 1991

Работа выполнена в лаборатории биофизики мембран Научно-исследовательского института биологии и биофизики при Томском государственном университете им. В. В. Куйбышева.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор 1 В. А. Пегель |

кандидат биологических наук А. И. Микалашевич.

Научный консультант: старший научный сотрудник В. А. Новак.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. М. Гольд, кандидат биологических наук А. Я. Болсунов-ский.

Ведущая организация: Иркутский государственный университет.

Защита состоится «_»_Л991 года

в___часов на заседании специализированного сонета

Д 003.45.01 при Институте биофизики СО АН СССР по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО АН СССР.

Автореферат разослан «._»_______1991 года.

Ученый секретарь специализированного совгта канд. физ.-мат. наук

Л. Г. КОСОЛАПОВА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Растущее использование тяжелых металлов (ТЮ и их производных в хозяйственной деятельности, а также возрастающее внимание общества к состоянию окружающей среды, сделали актуальными исследования влияния ТМ на биологические объекты. Повышенные концентрации ТМ в среде способны оказывать неблагоприятное воздействие на биосистемы различного уровня организации (Бурдин, 1985; Коржанова, Дмитриева, 1989). Поэтому оценка последствий загрязнения среды ТМ, изучение механизмов их действия, развития растениями металл-резистентности приобретает важное значение (Лархер, 1978; Мур, Рамамурти, 1987). Знание особенностей и механизмов действия ТМ может оказаться весьма полезным при поиске и выборе адекватных методов биологической индикации их повышенного содержания в среде (Бурдин,1985).

С другой стороны, многие ТМ являются необходимыми составляющими клеток и известны как микроэлементы (Мецлер, 1980; Ле-винджер, 1985; Москалев, 1985) и их недостаток,также как и избыток, приводит к снижению жизнеспособности организмов. В соответствии с этим выяснение влияния ТМ на жизнедеятельность организмов имеет важное значение для подбора оптимального состава питетельных сред при биотехнологических методах их выращивания. Обработка растений растворами ТМ может служить также эффективным инструментом воздействия для получения объектов с заданными звойствами (Ловкова и др. 1984; УееЬ е^ а1.', 1984).

В литературе имеется большое количество данных, отражающих югогостороннее действие ТМ на растения. Показано, что они вызывают нарушение жизнедеятельности растений в целом, отдельных органов и клеток, ингиОируют активность многих ферментов.

Вместе с тем, многие аспекты действия ТМ изучены еще недостаточно. Отсутствуют ясные представления о механизмах дейс-

твия ТЫ на плазмалемму, хотя именно эти эффекты определяют последовательность событий, формирующих ответные реакции клеток ^ тканей в целом. Слабо изучено влияние ТМ на водные макрофиты, являющиеся потенциальными тест-объектами для оценки загрязненш водных сред.

В соответствии с этим,целью работы было выяснение роли ци-топлазматической мембраны в механизмах действия солей тяжелы) металлов на клетки пресноводных растений. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние тяжелых металлов на барьерную функцю плазмалеммы клеток водных растений. 2: Исследовать связь индуцируемых тяжелыми металлами изменений электрогенной и транспортной функций плазмалеммы с нарушением клеточного метаболизма. 3. Исследовать роль мембранотропных эффектов в токсическо! действии тяжелых металлов на клетки пресноводных растений.

Научная новизна. В работе впервые, путем комплексной регистрации ряда параметров (мембранный потенциал, светоиндуциро-ванная биоэлектрическая реакция, вольт-амперные характеристик! плазмалеммы, индукционные переходы флуоресценции хлорофилла, выход электролитов из клеток), исследованы механизмы токсического действия ТМ на мембранные и клеточные процессы водных растений. Показано, что снижение мембранного потенциала, амплитуд светоиндуцированной биоэлектрической реакции и электрическое сопротивления плазмалеммы, свидетельствующие о нарушении барЬ' ерной и транспортной функции плазмалеммы, всегда опережают времени изменение клеточного метаболизма, оцениваемого по изме' нениям индукционных переходов флуоресценции и, скорости цикли ческого движения хлоропластов з клетках. Установлено, что ток сический эффект ТМ на плазмалемму зависит от энергетическоп статуса клеток в целом и функциональной активности электроген

и транспортных систем плазмалеммы. В частности, свет и фу-кцин, активирующие транспорт и электрогенез, усиливают ток-зкий эффэкт ТМ. Показана аналогия эффектов ТМ и эагентов на клеточные и мембранные процессы. Обсуждается низм действия ТМ на клетки пресноводных растений, согласно рому модификация БН-групп белков плазмалемш и связанная с активация перекисного окисления липидов являются причиной последующих нарушений плаамалемных и клеточных процессов. Практическая ценность работы. Полученные данные могут ис-зоезгься при выработке методических подходов и методов био-ирования и биошдикации наличия в среде повышенных концент-:й ТЫ Исходя из мембранотропного действия ТМ для этих целей олее приемлимы методы основанные на регистрации параметров, лающих состояние плазмалеммы клеток. На основании получен-результатов предложен и апробован метод биотестирования ;ых сред на наличие ТМ и некоторых других токсичных веществ, ¡ванный на одновременной регистрации светоиндуцированной би-¡ктрической реакции и индукционных переходов флуоресценции юфилла листьев водных растений. Этот метод внедрен в прак-г научных исследований на кафедре коммунальной гигиены Кеме-:кого мединститута. Материалы диссертации используются при ши лекций и проведении практических занятий в Кемеровском шсгитуте.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на (еркциях молодых ученых в гг Томске (1980, 1983), Кемерове. 52, 1983, 1984), Пущино (1987), 3 Всесоюзном совещании рабо-группы по влиянию факторов окружающей среды на здоровье на-;ния (Кемерово, 1985), Кемеровском отделении обществе анато-, гистологов и эмбриологов (1984, 1990), Кемеровском отделе-Всесоюзного химического общества им. Д. И. Менделеева

(1988), Кемеровском областном обществе токсикологов (1990).

Публикации. Ifo результатам диссертации опубликовано 10 чатных работ, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из ] дения, четырех глав и выводов. Список литературы включает источников, в том числе иностранных -139. Работа изложена 173 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили листья высших водных рас ний - элодеи (Elodea canadensis Rich.), валиснерии (Valisne spiralis L.),- наяды (Najas microdon) и клетки междоузлий xs вой водоросли - нителлы (Mitella flexilis L.). Растения выра вали в аквариуме на водопроводной воде при искусственном ос щении и барботалое воздухом. Поскольку у всех исследовавши объектов получены качественно сходные результаты, ввиду луч наглядности, в работе, в основном, приведены -данные получен с использованием элодеи.

Состояние плазмалёммы при действии ТМ оценивали по р; параметров: а) выходу электролитов (ВЭ), б) величине мембран; то потенциала (МЦ), в) светоиндущрованной биоэлектрической ] акции (СВР), являющейся дифференциальной формой МП, г) крга вольт-амперных характеристик (ВАХ) плазмалёммы, д) редокс-; тивности плазмалёммы. Физиологическое состояние клеток оценга ли по: а) изменениям индукционных переходов флуоресценции (И хлорофилла, б) скорости циклического движения хлоропластов, морфологическим изменениям клеток и субклеточных органелл.

Регистрацию МП проводили внутриклеточным способом стекля ными микрозлетродами (Новак, Иванкина, 1975). ЖЗФ и СВР регис рировали одновременно от листа находящегося, в специальной пг

шой камере (Новак, Иванкмна, 1978). Регистрацию вольт-ампер: характеристик (ВАХ) проводили методом фиксации тока через гение листа с микроэлектродной регистрацией МП (Бовак и др., !5). Редокс-активность плазмалеммы определяли по скорости ¡становления феррицианида (Новак, Миклашевич, 1985).

Качественную и количественную оценку выхода электролитов 3) из клеток проводили по изменению концентрации электролитов >мывающей среде и содержанию в ней ионов натрия и калия. Дая-} нормировали на единицу сырой массы листьев.

Скорости движения хлоропластов оценивали с помощью светою микроскопа, измеряя время прохождения хлоропластами отрез-длинной 35 мкм.

Для электронно-микроскопических исследований листья фикси-зали глутаровым альдегидом и тетраокисью осмия и заливали в зн с использованием общепринятых методик (Уикли, 1975). Сре-, окрашенные уранил ацетатом и цитратом свинца просматривали электронный микроскоп ЭМВ-ЮОВ..

Содержание малонового диальдегида в тканях определяли фо-летрическим методом по реакции с тиобарбитурой кислотой гальная; Гаришвили, 1977), общее содержание меди по модифици-ванной методике с диэтилдитиокарбаматом свинца (Лазарев, 30).

При регистрации ВЭ растворы солей ТЫ готовили на дистилли-ванной воде, в остальных случаях на искусственной прудовой це (ИПВ), содержащей 2 Ш МаС1, 0,4 мМ КС1 и 0,1 мМ СаС1г-РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выход электролитов из клеток листьев элодеи при действии катионов тяжелых металлов

На рис. 1 показано влияние ТМ (хлорид кадмия, сульфат меди нитрат серебра) на ВЭ из клеток. Кинетические кривые ВЭ для

Рис. 1. Выход электролитов (ВЭ) из клеток листьев элодеи при действии АдШэ(1, 25 мкМ), Си30^(2, 100 мкМ), Сс1С1г(3, 100 мкМ). 4 - контроль (дистиллированная вода).

меди и кадмия характеризуются наличием ярко выраженной 30-ш нутной лаг-фазы, в то время как для ионов серебра такой фазы г наблюдается. Характерно, что для всех изучавшихся катионов нас людалось установление устойчивого стационарного уровня, которь для меди и серебра наступал примерно через один час, у кадмя через два часа инкубации. По результатам исследования применяв шиеся ТМ можно расположить в следующий ряд эффективности

Нд > Аг > Си > Сс1 (1). В зависимости от вида и концентрации тяжелого металла ВЭ сос тавлял от 30 до 70% от исходного содержания электролитов : клетках. В дальнейшем исследования проводили с использование: одного металла - меди. Выбор меди был обусловлен его промежу

>

Рис. 2. Зависимость выхода электролитов (1, 2) и светоин-[рованной биоэлектрической реакции (СВР, 3) листьев элодеи »нцентрации сульфата меди в среде.

1, 2 - выход электролитов на свету и в темноте, соответс- . шо. Время инкубации 60 минут. Объем раствора 2 мл, масса ;ьев 50 исходное содержание электролитов в листьях - 831 смоль/г сырой массы. СВР - проточная система, нижняя шкала концентрации.

чным положением в ряду эффективности и относительно широком гпространении в водном и воздушном бассейнах. Зависимость ВЭ концентрации меди имеет вид кривой с насыщением (рис. 2). рактерно, что ВЭ был всегда выше на свету, чем в темноте. Бо-э подробно зависимость ВЭ от света и концентрационная зависи-сть СВР будет рассмотрена нюке.

Одновременная регистрация ВЭ и поглощения меди из раствора

показали, что поглощение меди значительно опережает во врем начало ВЭ. Так при исходной концентнации СиБСЦ 100 мкм в тече первых 20 минут поглощалось 77,8±1,ЗХ меди, в то время как метный выход электролитов начинался после 60 минут. Это поз; лило предположить, что первоначально ионы меди взаимодейств; не с плазмалеммой клеток, а с функционально малоактивными гр; пировками в клеточной стенке. Для проверки этого предположе) исследовали влияние ионов кальция на медь-индуцированный ВЭ клеток. При этом ожидалось, что кальций будет эффективно кош рировать с ионами меди за обменные участки в клеточной стенге способствовать усилению их токсического эффекта за счет уско{ ния миграции металла к плазмалемме. Эксперименты показали, 1 в этих условиях действительно происходит сокращение длительнс ти лаг-фазы и более интенсивный ВЭ, чем в отсутствии кальщ При концентрации хлорида кальция в среде 5 мМ в течение пер£ 60 минут отмечалось 2-3 кратное усиление медь-индуцированнс ВЭ.

В связи с тем, что ТЫ связываются с клеточным материалов таким образом удаляются из среды, можно ожидать, что их эффе определяется не просто концентрацией тяжелого металла в сред а его дозой или количеством металла, приходящегося на едини массы ткани. На рис. 3 показаны данные о зависимости ВЭ от об ема среды инкубации при постоянной концентрации и постоянн дозе сульфата меди. При одинаковой концентрации меди в сре (20 мкМ) увеличение объема омывающего раствора с 2 до 20 м приводило к 8-10 кратному повышению ВЭ (кривая 1). Однако случае одинаковой дозы меди (4 мкмоль/г сырой массы) при анал гичном изменении объема раствора увеличение ВЭ составля 1,5-1,6 раза (кривая 2).

Таким образом, доза, по сравнению с концентрацией, являе

>

мкмоль/г

-1_)__>.

_I

10 20 Объем среда, т.

Рис. 3.. Зависимость медь-ин-дуцированного выхода электролитов из клеток листьев злодеи от объема среды инкубации.

1 - вариант с изменением объема среды при постоянной концентрация СиБО^(20 мкЫ);

2 - вариант при постоянной дозе меди (4 мкмоль/г сырой массы листьев).

Масса листьев - 50 мг. Время инкубации с СиБ0^-16 часов, исходное содержание электролитов в листьях - 127± 3 мкмоль/г.

казателем более адекватно характеризующим токсический эф-ТМ на клетки растений. Этот вывод имеет важное значение и с тем, что для экологического нормирования загрязнения ТМ, а так же в лабораторной практике, пользуются показал, основанными на концентрации. Такой подход, без учета эй зависимости эффекта ТМ, может вести к неверным выводам, лу в настоящей работе, при описании условий экспериментов шкнутых систем, указывается доза тяжелого металла, либо, г с концентрацией, указывается объем среды и масса листь-

;вет является фактором переводящим фотосинтезирующие клет-¡тений в более энергизованное состояние. Используя свето-:ловия для модификации энергетического статуса клеток исс-

<

Таблиц;

Влияние света и фузикокцина (ФК, 20 мкМ) на медь-инд ванный выход электролитов из клеток листьев злодеи.

Концентрация СиБО^- 100 мкМ. Масса листьев злодеи - ! исходное содержание электролитов в листьях - 132+6 мкмоль, рой массы. Время прединкубации с ФК - 60 минут в темноте'.

Фактор Выход электролитов

CuS04 .темнота (контроль) 100% (47+3 мкмоль/г

CuS04 ,СВ9Т 177+17%

CuS04+ ФК, темнота 162+8%

CuS0.+ ФК, свет 190+6%

ледовали медь-индуцированный ВЭ на свету и в темноте. 06i но, что в течение первого часа ВЭ на свету в два и боле! выше, чем в темноте (рис. 2).

Наиболее вероятной причиной усиления токсического ; ионов меди на свету является его связь с фотосинтетичесю цеесами. Ингибиторование фотосинтеза диуроном (2 мкМ) по! что в этих условиях на свету действительно происходит yi ние медь-индуцированного ВЭ практически до темнового : Качественных изменяй киненетических кривых ВЭ полученных еутствие диурона, по сравнению с контролем, не отмеченс подтверждает участие фотосинтетических процессов в arc светом медь-индуцированного ВЭ.

Усиление токсического эффекта меди ла свету мож связано как с изменением общего энергетического статуса i так "энергизацией" плазмалеммы, обусловленной фотосинтеи метаболизмом. Известно, что фузикокцин, обладающий гормо! ным действием на растительные клетки, активирует трала процессы в плазмалемме без изменения общего энергети* статуса клеток в целом (Marre, 1979). Обработка листьев

золе), однако, изменения Фет начинались позднее, чем изменения Емакс. Время перехода от Фмакс к Фет увеличивалось в зависимости от концентрации ТМ в 3-10 раз. Нарушения .ИПФ и СЕР для всех «¡пользовавшихся ТМ (Не, Ад, Си, СсЗ, Мп) имели качественно сходный характер и отличались, в основном, по силе действия. ¡¡ля характеристики изменений Фмакс и Фет, при действии повредца-ощих факторов, удобно выделять амплитуды фаз нарастания (А1 и АЗ) и снижения (А2 и А4) флуоресценции относительно исходного контрольного уровня (см. на рис. 5). Изменение этих показателей при действии тяжелых металлов приведено в табл. 2. Данные по действию других факторов, приведенные в этой таблице будут рассмотрены при обсуждении механизмов действия ТМ в разделе 3. По влиянию на ИПФ и СВР исследовавшиеся ТМ можно расположить в следующий ряд эффективности:

нг, Аг >си > са > ш (2).

Зависимость СВР от концентрации сульфата меди в среде, также как и для ВЭ, имеет вид кривой с насыщением (рис. 2, кривая 3). Однако чувствительность СВР к ТМ была значительно выше. Так,полунасьпцащая концентрация меди для СВР составляла около 10 мкМ, в то время как для ВЭ около 50 мкМ. Это различие, по-видимому, связано с различием в условиях экспериментов - проточная система при регистрации СВР и замкнутая при регистрации ВЭ. Учитывая рассмотренную выше дозовую зависимость эффектов меди и лимитированное содержание ТМ в условиях замкнутой системы, становится понятным более интенсивный эффект в проточной системе.

Тяжелые металы ингибиругаг циклическое движение хлороплас-тов в клетках. Так при действии 50 мкМ СиЗО^в течение первых 40 минут происходило замедление скорости движения хлоропластов с 8,25+0,87 до 2,67+0,22 мкм/сек и через 90 минут происходит их полная остановка Одновременно отмечаются морфологические изме-

О

ния протопласта. Наблюдается его сжатие и отставание от клето ных стенок, что визуально напоминает плазмолиз. Через 100 мин воздействия 100 мкМ СиЗО^'плаамолиз" отмечен у 68+3% клеток.

Применявшиеся ТМ вызывали также ультраструктурные наруш ния. Наиболее выраженными были изменения тонкой структуры хл ропластов. Наблюдалось их сжатие, нарушение организации лам лярных структур, появление в строме электронноплотного матери! ла. Возрастала электронная плотность клеточной стенки. В пери лазматическом пространстве клеток отмечалось появление мног< численных мембранных везикул. В отдельных клетках наблюдало« нарушение целостности плазмалеммы.

Таким образом, ТМ вызывают нарушения функциональной актш ность плазмалеммы и клеточных процессов, а также индуцирук структурные изменения органелл. Индукция тяжелыми металлами К характер изменений МП, ВАХ свидетельствует.о нарушении барьер проницаемост плазмалеммы. Нарушение характеристик, отражают? состояние плазмалеммы всегда опрежает изменения клеточных прс цессов. Дальнейшие исследования были посвящены изучению возмог« ных механизмов действия металлов. При помощи химического ил физического воздействия пытались промоделировать и затем моди филировать эффекты ТМ.

3. Возможные механизмы действия тяжелых металов на клетк

пресноводных растений Высокая биологическая активность ТМ определяется несколькими свойствами: а) способностью связываться с органическим соединениями клеток изменяя их структуру и химические свойства; б) способностью катализировать евободнорадикальные реакции разложения гидроперекисей липидов; в) способностью учавствовать ] окислительно-восстановительных реакциях, принимая и отдаваг электроны.

Рис. б. Выход электролитов из клеток листьев элодеи при йствии п-хлормеркурибензоата (1, 50 мкМ) и н-зтилмалеимида , 1мМ).

3 - контроль, дистилированная вода Объем раствора 4 мл, сса листьев 100 мг.

Известно, uto ТМ могут взаимодействовать с различными хи-мескими группировками биомолекул, но наиболее прочные комлек-[ образуют с SH-группами. С использовачием сульфгидрильных ре-ентов - п-хлормеркурибензоата (ПХМБ) и н-зтилмалеимида (НЭМ) елана попытка смоделировать этот аспект действия ТЕ Кинети-ские кривые ВЭ при действии ПХМБ и КЭМ (рис. 6> сходны по ха-ктеру с кривыми полученными при действии ТМ (см. рис. 1). нные,приведенные в табл.' 2,показывают, что ПХМБ вызывал изменив Ш1Ф и СВР клеток элодеи аналогичные таковым для тяжелых галлов. Кроме того, SH-агенты, также как и ТЫ, индуцировали

Таблица 3.

Содержание малонового диальдегида (МДА) в растительных тк, нях в зависимости от времени воздействия сульфата меди.

Объем раствора 1000 мл, масса листьев 1г.

I Содержание ГИДА, нм/г сыр, массы_I

Объект I Время инкубации с Си304 (100 мкЫ) I

___! О- I 30 мин. I 60 мин. ! 90 мин.1

злодея ! 4,49+2,961 17,95+2,09! 22,27+3,61! 22,21+4,62! валиснерия I 3,75+1,01! 15,08+3,53! 22,72+2,96! 21,14+2,061

сходные ультраструктурные изменения хлоропластов.

Таким образом, сульфгидрильные реагенты оказывают на во; ные растения качественно подобный с ТЫ эффект, что свидетельс] вует о возможном участии БН-групп в механизме их действия.

Активация процессов перекисного окисления липидов (ПО^ является одной из неспецифических реакций клеток на неблаго1 риятные воздействия. Особенностью тяжелых металлов является тс что они, кроме неспецифических механизмов активации ПОЛ, спс собны активировать эти реакции, катализируя разложение гидрош рекисей липидов. Усиление процессов ПОЛ в плазмалемме способ! привести к утрате ею барьерной функции (Владимиров, 1987; фвязи с этим исследовали влияние ТМ на ПОЛ в клетках. В к честве показателя использовали содеркение в клетках малоново: диальдегида (МДА), явлщегося одним из конечных продуктов реа ций. Данные, представленные в таблице 2>,показывают, что воздей твие меди приводит к увеличению содержания МДА в тканях водн растений, что свидетельствует об усилении свободнорадикально окисления липидов входящих в состав клеток.

Согласно литературным данным (Бе РШррхБ, Ра1ае1пу, 197 имеется принципиальная возможность востановления ТМ фермент тивными системами растительных клеток, и этот процесс мол

ь вовлечен в механизм токсического действия ТМ на клетки, зрения.окислительно-восстановительного потенцинала на по-шости клеток листьев элодеи показали, что действительно подается восстановление двухвалентных ионов меди. Это про; аналогичен известному феномену феррицианидредуктазной ак-юсти (Новак, Миклашевич, 1985) и, подобно ей, активируется юм и при обработке листьев фузикокцияом.

Для выяснения роли восстановления ТМ в механизме их токси-юго действия сравнивали эффекты одно- и двух-валентной меНами не обнаружено качественных отличий ВЭ при обработке 'ьев элодеи СигС1г (100 мкМ) и Си30^(100 мкМ). Мы не обнару-I также принципиальных отличий в кинетических кривых ВЭ при :твии одновалентной и двухвалентной меди в условиях актива-электрогенных и транспортных систем ллазмалеммы светом и [кокцином. Таким образом, результаты экспериментов не подт-;или важности восстановления ионов ТЫ на поверхности клеток ханизме их токсического действия.

В связи с тем, что экспериментально подтверждаются два южных механизма нарушения барьера проницаемости плазмалеммы «з нарушение структуры белков и через активацию в мембране , возникает вопрос о соотношении этих двух процессов. Известно, что глутаровый альдегид, взаимодействует преиму-венно с белковыми молекулами (Гаер, 1974), в то время как анец является эффективным катализатором разложения гидропе-сей липидов. Активность марганца в этих реакциях в 15 раз , чем у ионов меди (Карнодацкий, 1977), но по отношению к руппам белков он обладает меньшей реакционной способностью чинкий, 1977). Результаты сравнительно анализа эффектов анца, меди, глутарового альдегида и 1Ш1В на ИПФ и СВР, ставленны в таблице 2. Видно, что марганец в концентрации

1 ыМ мало влияет на ИПФ и СЕР, в то время как медь, начиная концентрации 10 мкМ вызывает быстрые изменения обоих показа! лей. Глутаровый альдегид, в отличии от марганца, оказывает С лее сильный эффект и практически полностью моделирует зффе меди. ПХМБ, так же как и медь, подавляет СВР и ИПФ. Следог тельно, есть основания считать, что взаимодействие ТЫ с cyj фгидрильными группами белков плазмалеммы играют ведущую рол! нарушении ее барьерной функции по сравнению с ПОЛ.

Учитывая наш данные об активации медью ПОЛ (табл. 5 можно полагать, что нарушение белок-лилидных комплексов мемб1 при действии ТЫ на белковые молекулы опосредует активацию ci бонорадикальных процессов в плазмалемме, которая, в свою о* редь, индуцирует структурные нарушения мембраны.

Для проверки предположения, что нарушение клеточных щ цессов при действии ТЫ на клетки опосредовано нарушен] свойств мембраны, были проведены эксперименты по моделирова! аффектов ТМ воздействиями увеличивающими проницаемость плаз: леммы. В качестве таких воздействий применяли обработку нис тиновым антибиотиком амфотерицином Б (ATE) и механическое ni ревдение клеток. Как показано в табл. 2 воздействие А' подобно ТЫ, приводило к снижению СВР, но в отличии от них JD незначительному изменению Фмакс и Зет (табл. 2). Ыеханичес: повреждение клеток вызывало изменение уровней ИПФ аналогич! возникающим при действии ТЫ (табл. 2).

Таким образом, это может рассматриваться как свидетеле того, что образование в плазмалемме каналов, обладающих изби тельной проницаемостью, путем обработки АТВ, лишь частично делирует эффекты ТЫ. При механическом повреждении клеток наб. дается более полная аналогия с эффектом ТЫ. Это позвол считать, что модификация клеточных процессов при действии

шзана со структурными нарушениями плазмалемш.

Резюмируя рассмотренные данные, можно представить действие I на клетки пресноводных растений в виде' последовательности юдующих процессов: взаимодействие с катионобменными участками клеточной стенке —> взаимодействие с сульфгидрильными груп-ш белков плазмалемш —> нарушение лидид-белковых комплексов ¡еточной мембраны —> активация в плазмалемме процессов пере-сного окисления липидов ~> утрата стабильности мембраны и разование в ней гидрофильных каналов --> утечка через образо-вшеся поры низмомолекулярных веществ из цитоплазмы и измене-е ее химического состава —> нарушения клеточных процессов в зультате изменений состава цитоплазмы и последующие, более убокие, структурные и функциональные нарушения.

РезулйРы исследования действия ТМ на клетки водных расте-й позволяют сделать вывод, что эти объекты могут быть исйоль-ваны для биотестировании водных сред на наличие токсичных нцентраций ТМ. Среди исследовавшихся растительных объектов иболее чувствительным является элодея. В ряду исследованных раметров наиболее пригодными для оценки загрязнения среды ТМ пяются интегральные показатели, отражающе состояние и функци-зльную активновть плазмалемш клеток, в частности ВЭ, МП, Р, ВАХ Из них особенно удобным оказался метод основанный на "истрации СВР. Метод обладает высокой чувствительностью, досрочно прост и не связан с повреждением клеток. Одновременная листрация ИПФ позволяет получать дополнительную информацию о ¡тоянии клеток. Универсальность метода позволяет использовать ) также и для определения гербецидов и некоторых других ток-шых веществ, находящихся в сточных водах химических предпри-[й (Мухамадияров, 1985; Иухамадияров, Барков, 1988).

/

выводы

1. Тяжелые металлы оказывают токсической действие на кле ки пресноводных растений, нарушая их жизнедеятельность, индуц руют: а) выход электролитов из клеток в среду, б) снижен мембранного потенциала и сопротивления плазмалеммы, в) измен ние индукционных переходов флуоресценции, г) активацию переки ного окисления липидов, д) тороможение циклического движен: хлоропластов и аналогичное плазмолизу изменение клеток, е) н копление злектронношютного материала в матрикее хлоропластов образование разрывов в плазмалемме. Ряд эффективности тяжел металлов имеет вид: Нд > > Си > Сс1 > Мг

2. В условиях замкнутой системы выход электролитов завис не просто от концентрации тякалого металла,, а от его дозы. Н личие 40-60 минутной лаг-фазы на кинетических кривых выхо электролитов, длительность которой сокращается до 15-30 минут присутствие хлорида кальция (5 мМ), а также то, что выход эле толитов наблюдается после того как значительное количество ме

. поглощается из раствора показывает, что клеточная стенка обл дает по отношению к тяжелым металлам буферным действием и сп собна снижать их токсический эффект.

3. Первым этапом действия тяжелых металлов на клетки явл ется нарушение барьерной функции плазмалеммы, характеризующие снижением мембранного потенциала и электрического сопротивлен плазмалеммы и выходом электролитов из клеток. Наблюдаемые мо фологические нарушения клеточных структур, а также изменен метаболической активности клеток опосредовано эффектами плазмалемме.

4. Показано, что свет, как фактор энергизации клеток в ц лом и плазмалеммы в частности, и фузикокцин, активирующий пла малемные процессы, усиливают индуцированный медью выход электр

литов. Это свидетельствует о зависимости эффектов тяжелых металлов от функциональной активности плаэмалемных систем. С другой стороны установлено, что медь не модифицирует редок-реакций плазмалеммы, как показателя ее электрогенной активности. Это позволяет полагай*, что наиболее вероятной причиной деполяризации мембранного потенциала и снижения электрического сопротивления плазмалеммы является увеличение ее проницаемости.

5. Показано, что сульфгидрильные реагенты (п-хлормеркури-бензоат и н-этилмалеимид) и глутаровый альдегид оказывают на индукционные переходы флуоресценции и светоиндуцированную'биоэлектрическую реакцию эффекты, качественно сходные с действием тяжелых металлов. Это сходство свидетельствует о вовлечении белковых БН-групп плазмалеммы в механизм токсического действия тяжелых металлов на клетки.

6. Обработка клеток амфотеррицином Б, образующим в плазма-лемме каналлы с избирательной проницаемостью, лишь частично моделирует эффекты тяжелых-металлов на индукционные переходы флуоресценции и мембранный потенциал. Механическое нарушение плазмалеммы позволяет получить практически полную аналогию действия тяжелых металлов на эти характеристики. Это подтверждает, что нарушение клеточного метаболизма, при действии тяжелых метает, связано с увеличением проницаемости плазмалеммы.

7. Физиологический эффект тяжелых металлов на клетки пресноводных растений может быть представлен следующей последовательностью событий: взаимодействие с клеточной стенкой -> взаимодействие с БН-группами белков плазмалеммы -> активация в ней перекисного окисления липидов -> утрата стабильности мембраны и образование в ней гидрофильных каналов -> утечка из цитоплазмы ионов и других низкомолекулярных веществ и, как следствие, мо-

дификация функциональной активности метаболических систем и дальнейшие, более глубокие структурные и функциональные нарушения клеточных процессов.

8. Показано, что в ряду изученных растений иаболее подходящим кандидатом на роль тест-объекта для оценки загрязнения водной среды тяжелыми металлами является элодея ввиду ниболыпей ее чувствительности. Для этого объекта изменения индукционных переходов флуоресценции и светоиндуцированной биоэлектрической реакции наблюдались при концентрации меди и ртути в среде менее 1 мкЫ. Метод регистрации светоиндцированной биоэлектрической реакции и индукционных переходов флуоресценции, обладающий экспрессивностью, высокой чувствительностью, экономичностью и универсальностью обнаруживает хорошие перспективы для использования в системах биомониторинга состояния водной среды.

Список публикаций по теме диссертации

1. Иванкина Е Г., Мухамадияров P.A., Веселова Г. Г. Токсическое действие солей - тяжелых металлов на ■ растительную клетку. В кн. Материалы третьей региональной конференции молодых ученых. -Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1980.-С. 113-114.

2. Мухамадияров Р. А. Влияние катионов тяжелых металлов на светоиндуцированную биоэлектрическую реакцию растений и морфологию клеток пресноводных растений. В кн. Тез. докл. областной научной конф. молодых ученых. Кемерово, 1982. С. 24-26

3. Мухамадияров Р. А. Изменение ультраструктуры клеток листьев элодеи при воздействии солей тяжелых металлов. В кн. Материалы 3 научной конф. молодых ученых г. Кемерово. -Кемерово, 1984. С. 65-66

4. Мухамадияров Р. А. Подавление светоиндуцированной биоэлектрической реакции и индукционных переходов флуоресценции со-

лями тяжелых металлов. В кн. Материалы 3 научной конф. молодых ученых г. Кемерово,—Кемерово, 1984. С. 66—68.

5. Мухамадияров Р. А. Применение биоэлектрических методов в виде критерия оценки качества загрязнения окружающей среды.— В кн. Материалы 3 Всесоюзного совещания рабочей группы по изучению влияния факторов окружающей среды на здоровье населения.—Кемерово, 1985.— С. 103-105.

6. Мухамадияров. Р. А. Кинетика выхода ионоа из клеток водных растений лри действии различных .концентраций ионов меди.— В кн. Материалы 4 научной конф. молодых ученых г. Кемерово.— Кемерово, 1985,—С. 59—60.

7. Мухамадияров Р. А., Подуэктова> С. Б. Влияние тяжелых металлов на клетки пресноводных растений. Ред. ж. Биол. ,науки. М., 1,988.— Дед. ВИНИТИ 12,01,88, № 140—В88. 17 с.

8. Мухамадияров Р. А., Новах В. А. Повреждающее действие тяжелых металлов на плазмалемм.у клеток элодеи. Ред. ж. Виол, науки. М., 1988,—Деп. ВИНИТИ 15.07.88, № 6638 — В88,— 17 с.

9. Мухамадияров Р. А., Ба.рков Л. В. Опыт применения биотестирования для оценки токсичности сточных вод одного из химических предприятий г. Кемерово. В кн. Тезисы докладов научно-практического совещания «Применение современных методов аналитической химии ,на предприятиях Кузбасса».— Кемерово, 1988.— С. 67.

10. Мухамадияров Р. А., Зинчук С. Ф. Влияние .ионов меди1 на содержание малонового диальдегида в клетках листьев высших водных растений,—М., 1980. Представлена НИИ гигиены им. Эрисмана,—Деп. ВНИИММТИ 17.05.90, № Д-19016,— 1 ;С.