Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость супероксиддисмутазы к действию лейкоцитарных оксидантов и возможность удаления генератора оксидантов миелопероксидазы из зоны его действия

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость супероксиддисмутазы к действию лейкоцитарных оксидантов и возможность удаления генератора оксидантов миелопероксидазы из зоны его действия"

На правах рукописи

РГ6 од

ХИЛАЖЕТЛИНОВА Лилия Рамильевна

УСТОЙЧИВОСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАШ .

к действию лейкоцитарных оксвдантов и юзыожность удаления генератора оксидантов

миел0пер0ксидазы и? зоны его действия

специальность 03.00.2Г - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата окологических наук

санкт-петербург - 1995

Ггбота выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Технологическом институте и■ в Гос НИИ Особо Чистых Биопрепаратов.

Научные руководители: Доктор химических наук, профессор

ГИНАК Анатолий Иосифович

Кандитат биологических наук, ведущий научный сотрудник ЯНКОВСКИЙ Олег Юлианович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

ЛЫЗЛОВА Сусанна Николаевна

Кандидат биологических наук, • старший научный сотрудник ■ ■ МОРОЗОВ Владимир Игоревич

Ведущая организация: ГНИИ антибиотиков и ферментов

(г. Санкт-Петербург)

Зашита состоится " 30 " июня 19Э5 г. в час. ауд. на заседании Диссертационного Совета Д 063.25.03 при Санкт-Петербургском Государственном Тенологическом институте. Адрес: 198013, С.-Петербург, Московский пр., 26, С.-Петербургский Государственный Технологический институт, Ученый Совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Замечания и отзывы по данной работе в 1 экземпляре, заверенном печатью, просим направлять по адресу: 198013, С.-Петербург, Московский пр., 26, С.-Петербургский Государственный Технологический институт. Ученый Совет.

Автореферат разослан «ь'ШЬХ- 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Д 063.25.09, к.т.н. . ¿¿С Лисицкая Т.Б.

ОБ!ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время более чем для 100 болезней человека установлено патофизиологическое значение активных форм кислорода (АФЮ (llalliwel, 1994). 0; шы из наиболее перспективных направлений для борьбы с ниш является создании лекарственных препаратов на основе зупероксидднсмутазы (СОД) -антиоксидантного фермента организма, т.к. он участвует в прерывании цепей генер ции А>.Á на начальном эт-^е их образования, катализируя дисмутацию супероксидных радикалов, включается в естественный путь катаболизма, и не обладает токсичностью, аллергенностыэ и др. показателями бионесовместимости. Однако, эффективность применения СОД в качестве терапевтического средства ограничена быстротой ее выведения .из организма, а также тем, что она является генераторов перекиси - предшественника ОН* и субстрата длядру.оп. мощного источника разнообразных кислородйых радикалов - шелопероксидазы {МПО).

Для пролонгирования действия СОД применяют химическую модификацию фермента различными агентами, чго позволяет во много раз увеличивать время ее пребывания в кровотоке. Общеизвестными критериями оценки таких модифицированных форм СОД .являются следующие показатели: 1) время полувыведения фермента из организма; 2) терм'устойчивость; 3) рН-устойчивость. Но для создания эффективного лекарственного препарата. на основе СОД этих критериев, как мы считали, недостаточно, т.к. 'з условия* очага воспаления действует лейкоцитарные оксиданты, наиболее разрушительными из которых являются ОН' и 0С1~. Однако, исследования устойчивости модифицированных фора СОД к действию этих оксидантов на проводятся.

Кроме того, для "яучиения эффективности СОЛ-терайик целесообразно, наряду с использованием модифицированных форм СОД, одновременно удалять генератор наиболее токсичных оксидантов -ШЮ из экстрацеллюлярного пространства очага воспаления, зоны деструктивного действия этого фермента.

Таким образом, .исследования, направленные на выявление возможных эндогенных механизмов удаления ШЮ из организма, а также на изучение устойчивости модифицировании- форм СОД к инактивации при 'действие лейкоцитарных оксидантов с целью

выявления наиболее устойчивых из них яьляются перспективными, актуг'хьными и представляют большой практический интерес, т. г. будут способствовать созданию новых терапевтических средств противовоспалительного действия.

Связь темы с планом научных работ. Диссертация выполнялась по проекту: "Разработка нового ферментного препарата медицинского назначения - супероксиддисмутазы" в соответствии с приказом Министерства Науки РФ К 0769Ф от 31.03.92.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа посвящена сравнительному анализу устойчивости различных модифицированных форм СОД и нативного фермента к действию лейкоцитарных оксидантов очага воспаления, что может служить новым критерием для отбора наиболее устойчивых к инактивации форм фермента, а также выявлению _ возможных эндогенных механизмов, опосредующих удаление наиболее разрушительного лейкоцитарного фактора - МПО из зоны ее деструктивного действия. В соответствии с этим были поставлены'следующие задачи:

- провести сравнительный анализ устойчивости нескольких модифицированных }орм СОД и нативного фермента к действию лейкоцитарных оксидантов: 0С1", Н202, ОН";

- получить биоспецифические сорбенты для очистки ФН и ^С: желатин-агарозу, лизин-агарозу, белок А'-агарозу;

- получить высокоочшценные препараты МПО, ФН (фибронектин) я № (иммуноглобулине); '

- получить биоспецифические сорбенты для изучения комплексообразования МПО с опсонинами плазмы крови человека: ФН-агарозу, МДО-агарозу, ^-агарозу.

- изучить комплексообразование между МПО и ФН, МПО и ^с с помощью метода количественной аффинной хроматографии.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ устойчивости различных форм СОД (нативной и модифицированных) к инактивации при действии оксидантов очага воспаления, и, таким образом, предложен новый, Яолее функционально обоснованный критерий для отбора наиболее устойчивых форм фермента.

Усовершенствованы известные методы выделения и очистки белков: МПО, ФН и ^С, что позволило получить более высоко очищенные по сравнению с аналогами препараты этих белков.

Предложена схема иммобилизации ФН на BrCN-активированной агарозе. Это позволит изучать его гомеостатическую функцию по удалению в составе комплекса продуктов деградации тканевых структур и белков, циркулирующих в организме, а также

йспользовать его» в частности, для целей аутогемотрансфузии. • »

Выявлено, что МПО является лиг ндом ФН и термоагрегирован-ного IgG (функционального аналога ИЮ, что намечает пути для удаления МПО из ас и ее деструктивного действия. Определены количественные параметры комплексообрааования между ¡¿НО и ФН, а также МПО и термоагрегированным IgG» а тленно константы диссоциации и количество участков связывания.

Практическая значимость. Предложены критерии устойчивости ряда форм СОД (нативных и модифицированных), более адекватно учитывающие такие условия в очг 'е воспаления, как высокие концентрации АФК1 Усовершенствованы ранее известные методы выделения и очистки ШЮ» ФН, IgG, что позволило получить более очищенные препараты этих белков. Предложена схема ^мобилизации ФН на BrCN-активированной агарозе, что позволит изучать его комплексирукяцую функцию по поддержанию внутреннего гомеортаза организма, а также для разработки рекомендация по Использованию ФН в эфферентной терапии. Обнаружено, что МПО является "игандом д"я ФН и термоагрегированного IgG, что свидетельствует о принципиальной возможности разработки Средств удаления МПО из зоны ее деструктивного действия а Ьрганизме и тем самым *лучшить эффективность СОД-терапии.

Апробация работы. Резул'тати работы были предстар'вны на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной г'О-летию Института им. Пастера (С. -Петербург, 1993), на Международных конференциях "Biotechnology St.Petersburg 94м и *Спид, рак и родственные проблемы" <С.-Петербург. 1995). Материалы работы отражены в трех статьях, принятых в печать.

Публикация работы. Основное содержание диссертации опубликовано в 4-х работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глач, выводов и сйиска литературы, включавшего 304 Йазваний,'в т.ч. 249 иностранных авторов. Работа содержит 177 страниц, в том числе 35 рисунков, 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

0-зор литературы состоит из 5 разделов, в которых рассмот рена деструктивная роль лейкоцитарных факторов при воспалении: НАДФН-оксидазной системы, генерирующей 0'~ и опосредующей возникновение других АФК (ОН*,10г, НО^) и МПО-системы (генератора 0С1~ и других оксидантов). Анализируются способы и подходы предотвращения повреждающего действия лейкоцитарных факторов, в том числе использование СОД, а также рассматриваются примеры применения этих способов в клинической практике.

Материалы и методы. В работе использованы белки, полученные в Институте особо чистых биопрепаратов и {»{ГУ: СОД, СОД, модифицированная глутаровым . альдегидом (СОД-ГА), альдегиддекстраном (СОД-АД) и полиэтиленгликолем- (СОД-ПЭГ).

Для изучения влияния АФК на нативную и модифицированные формы СОД использованы NaOCI (полученный по методу Карякин и др., 1974), Нг02, ОН*-генерирующая система Гег+-ЭДТА-НгОа (Visseis et.al., 1991). В качестве показателя устойчивости СОД к действию АФК использовали активность белка. Зависимость активности от концентраций оксиданта и времени инкубации определяли спектрофотометрическям методом (Костюк и др., 1990).

МПО, ФН и IgG выделяли по известным методикам !Янковский й др., 1988j Ruoslahti, 1988; Брок, 1987), дополненным и модифицированным нами. Биоспецифические сорбенты желатин-агароза, белок А-агароза, МПО-агароза, IgG-агароза получены по методу Ruoslahti (Ruoslahti et.al., 1982), лизин-агароза - по методу, описанному Chlbber (Chibber et.al., 1974). Иммобилизацию ФН на BrCN-активированной агарозе осуществляли с помощью разработанного нами метода в процессе выполнения настоящей работы.

Активность МПО определяли спектрофотометрическими методами (Klebanoff, 19Б7; Suzuki et.al., 1983). ФН анализировали методами радиальной иммунодиффузии и ракетного иммуноэлектро-фореза (Бэм, 1987). Количественное определение белка проводили с помощью методов Лоури (Lowri et.aU, 1951) и Брэдфорда (Bradford, 1976). Электрофорез в полиакриламидном геле ставили по Остерману (Остерман, 1981). Седиментационный анализ МПО проводили методом скоростной седиментации (Боуэнт 1973).

Экспериментальные данные обрабатывали статистически -

оценивали средние, определяли доверительные интервалы и достоверность разности (Ашмарин и др.,1975; Плохинский, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ■ 1. Выделение и очистка миелопероксидазы (МПО) из нейтрофилов крови человека. В настоящее время в литьратуре описан ряд методов, разработанных для выделения и очистки .МПО из различных источников. В данной работе для выделения и очистки МПО. из крови человека зе оснс 1у был принят метод, являющийся максимально упропгеппым и состоящий из экстракции МПО цетилтри-метиламмоний бромидом (ЦЕТАБ) и двух стадий очистки ЦЕТАБ-экстрактов: по заряду (ступенчатая ионообменная хроматография) и по размеру белка (гель-фильтрация). Для лучшего отделения ЦЕТАБа нами этот метод был несколько модифицирован и дополнен,

_а именно : 1) после процедуры гомогенизации введена очистка на колонке с карбоксиметилцглл лозой (КМЦ); 2) на стадии гель-фильтрацйи в качестве.элюирующего использовался раствор 0.15% (МН4)г504„ а затем введена дополнительная очистка трехступенчатым сульфатаммонийным осаждением. В результате дополнительно введенных процедур нам удалось максимально возможным способом избавиться от МПО-связанного ЦЕТАБа.

. 2. Выделение и очистка фибронектина (ФН) плазмы крови человека. Для получения тепарата ФН из плазмы крови человека за основу был принят метод очистки этого белка аффинной хроматографией на иммобилизованном желатине с дополнительней очисткс.1 ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, описанный ранее в литературе и получивший шиоокое распространение. Однако, он был подвергнут нами доработке, т.к. в ходе его использования выяснилось следующее. Во-первых было обнаружено, что препарат ФН содеряит в качестве основного контаминанта 1§С (1-2%). Поскольку способен взаимодействовать с ФН, использование такого препарата дАя аффиннохроматографического • анализа является некорректным.. Во-вторых, использование ионообменной хроматографии приводило к потере около 60-70% ФН. Поэтому вместо ионообменной хроматографии была использована аффинная хроматография на иммобилизованном гепарина Юдин из лигандов ФН), при которой наблюдалась потеря не более Ш ФН. Это также позволило . гябавг 'ься ^т фрагментированных форм белка,

сохраняющих желатин-связывающие домены, т.к. взаимодействие с гепари: м возможно только для двухцепочечной нативной молекулы ФН. Гепарин является лигандом для множества белков плазмы крови, поэтому его можно было применять для очистки ФН лишь посла использования иммобилизованного желатина. Ир.-; того, на первом этапе очистки использовали фильтрацию плазмы крови через колонку о лизин-агарозой. Это обеспечивало: во-первых, очистку от возможной примеси плазминогена (одного из лигандов ФН); во-вторых, защиту препарата ФН от возможной протеолити-чёской деструкции плазмином; в-третьих, позволяло избавиться от антиагарозных антител, присутствующих в плазме крови доноров, для удаления которых авторы метода-прототипа рекомендуют использовать перед желатин-агарозой колонку с немодифициро-ванной агарозой. Благодаря введенным модификациям, нам удалось получить высокоочищенный препарат ФН, превосходящий по степени чистоты аналогичный препарат фирмы "Sigma".

3. Вы^зление и очистка иммуноглобулина G (IgG) из сыворотки крови человека. Для получения препарата IgG из сыворотки крови человека была принята ст лдартная методика, включающая диализ сыворотки против HjjO, 40%-сульфатаммонийное осаждение и хрома-тографическую очистку на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой. Однако, степень чистоты полученного таким образом препарата недостаточна для его использования в аффинной хроматографии, т.к. в состав фракции входят антииммуноглобулины (до Ш. Поэтому для гарантированной очистки от этих белков мы использовали дополнительную колонку с IgG-агарозой, после которой провели доочистку еще и на колонке с иммобилизованным на агарозе белком А золотистого стафилококка - специфическом сорбенте для IgG. По данным литературы, при аффинной хроматографии белков из сложных биологических смесей, таких как сыворотка крови, вслед за бимолекулярным взаимодействием развиваются белок-белковые взаимодействия второй очереди, в частности фиксация на комплексе pA-IgG фибронектина, компонентов комплемента и т.д. По этой причине мы не могли использовать аффинную хроматографическую очистку на рА-агарозе без предварительного истощения сыворотки. В результате введенных в методику дополнений нами был получен высокоочищенный препарат IgG.

AtK too 60 so «0 10

5 a

го.

30 [HM,*M. ft<s й» . ftjv [Fa**],мМ

Рис Л. Зависимости активности С0"-ГА и С0Д.1О от концентраций

_ На

<,Б> и ОН' (В). - 3 мкМ (А,Б), 0.75 мкМ (В);

2 - СОД-ГА. Время инкубации 30 мин. Концентрация Н202 = 2 мМ (В).

SO too ■ ZOO 3DO [H0Ci]tKKM

4. Сравнительный анализ устойчивости нативной и модифицированных форм СОД к действию лейкоцитарных оксидантов. Зависимости активности СОД-ГА и СОДне от концентраций ОС Г, Н202 и ОН' представлены графически (рис.1). СОД-ГА не проявляет никакого улучшения устойчивости к инактивации гипохлоритом и гидро-ксильными радикалами по сравнению с нативным ферментом (ряс. 1.А и 1.В). Однако, при действии Н202 эта устойчивость явно проявляется (рис.1.Б). Сама по себе перекись не является сильным окислителем. Однако, она опасна тем, что является предшественником r'l-ради..алов, которые, очевидно, и проявляют

по-видимому, образующееся количество ОН' очень мало, чем и объясняются различия в устойчивости СОД-ГА к инактивации в случае воздействия Нг02 и системы Ге2+-ЭДТА-Н202. При максимальном значении I Нг021 - 30 мкМ активности СОД-ГА и С0Дна были одинаковы. Очевидно, это говорит о том, что при относительно высоких значениях концентраций Н202 количества образующихся ОН'достаточно для потери модифицированным ферментом устойчивости к инактивации.

А,г

90

40-

5 ю го.

Л

мМ

Рис.3. Зависимости активности

СОД-ПЭГ и С0Дна от концентраций

(А); Н202 (Б) и ОН' (В).

0С1

1 - С0Дна - 3 мкМ (А).

2 мкМ (Б), 0.75 мк!.! (В);

2 - СОД-ПЭГ. .

Время инкубации 30 мин. Тфкцентрация Н20 = 0.9 мМ (В).

50 т . 2пО 300 [Н0С1],нкМ

Зависимости активности с0дна и сод-га от времени инкубации с теми же окислителями представлены на рис.2. в целом, характер динамики инактивации сод-га соответствует характеру зависимости инактивации этого белка от различных концентраций АФК.

На рис.3 представлены кривые инактивации СОД-ПЭГ при действии 0С1", Н О, и ОН'. В противоположность СОД-ГА СОД-ПЗГ менее устойчива к действию 0С1", чем СОД (рис.3.Л). В случае обработки перекисью и системой Ге -эдта-н202 значения активности СОД-ПЭГ совпадают с таковыми для нативного фермента (рис.3.Б и З.В). 'Очевидно, модификация полиэтиленгликолем не

to

40

20

Рис.4. Зависимости активности СОД-ПЭГ и СОДаа от времени инк/оащш с 0С1 (А), Н202 (Б» ИОН* (В).

1.3 ■ СОДна - 3 мкМ (А,Б), 0.75 мкМ i В) ;

2.4 - дапэг.. Концентрацни:

0С1"= 1-ООмкМ (А); Нг02= ЮмМ (Б); Fe"?* 0.1мМ, Н2Ог= 0.9MÎ3 1В 1,2), Н202= о.ЭмМ (В 3,4).

Та2*- Ш.

15 .30 4S ..ÎO V, иии

дает преимуществ s устойчивости к действию Н702 по сравнению с ОН-генерирующей системой, в отличив от модификации г..утаровш альдегидом.

Зависимости активности СОД-ПЭГ л С0Дн^ от времени инкубации с оксидантрми приведены на рис.1. Характер инактивацщ СОД-ПЭГ в случае инкубации с 0С1" и повторяет характер ее инактивации при действии разли лых концентраций этих АФ1 (рис.4.А и 4.Б). В случае хе обработки Oii* инактивация С0Д-ПЭ1 происходила различным образа в зависимости от концентрацт ОН' в инкубационной среде (¡.ЛС.4.В), а именно, с увеличение;

сравнению с нативнш ферментом исчезало.

Зависимость активности СОД-АД от концентраций АФК представлена на рис.5 СОД-АД проявляет большую устойчивость при обработке ее ОС1", чем нативная СОД (рис.5.А), что отличает эту модифицированную форму белка от двух других. Лишь при значительных концентрациях 0С1" О 200 мкМ) активности СОД-АД и нативного фермента совпадают. По-видимому, против таких высоких значений окислителя и модифицированная и нативная формы фермента одинаково неустойчивы к деструктивным изменениям. При

А%

ш S0

ео ко 20

А.Х

зо

45 60

tjMHH

15

—г— »

ty бе t,M*H

нг°г

<Б)

Рис.6. Зависимости активное« СОД-АД а СОД,^ от времени иг<>бацш с ОС1 £AÎ, и ОН' (В).

1.Я - СОДла - 3 мкМ (А,Б), . 0.3 мкМ, (В);

' 2.4'-.СОД-АД* Концентрации: 0С1"= 100 мкМ (А) . Н202= 10 ММ (Б); 0.3 мМ„ На02« 2 МЫ (В 1,2) 3.5 Ш, Н,0,- 2'Mil (В 3,4)

обработке СОД-АД перекисью и •системой генерации ОН" от показала пониженную устойчивость к инактивации по сравнению < С0Дна в первом случае и равные с ней значения активн сти - в( втором.«рис.5.Б и 5.В)., Очьвидао, модкфик^лЦия СОД альдегид-декстраном неудачна в отношение устойчивости к небольши концентрациям ОН-, как это видно при обработке перекисью. Пр] инкубации же с ОН-генерирующей системой СОД^ не обладав' преимуществом перед СОД-АД.

На рис.6 приведены эави~имости активности СОД-АД и СОДК| от времени июсубаш..; с ОС Г, Н20г и ОН', ..арактер которых сос

вег-твует характеру -зависимостей от кокцзкгришш оксядан' он.

Таким образом из полученных результатов мохяо сделатъ следующие выводы. В зечисимости от характера кодификации белк° и природы оксяданта модифицированные формы проявляют различную устойчивость к инактиирующим воздействиям. Проведенные исследования открывают пег лхективы изучения ке::аниз:.:ов воздействия ЛСК на белок, что позволит вести более целенаправленный отбор устойчивых к их действию модифицированных форм ферментов. В частности, 5с лее ясчеризоггагс ресулътати :,;сгу? ?"Т'- получен:' при фракционирований продуктов модификации с оценкой их физ,гко-химических свойств (молекулярная масса, соотношение фермента и носителя), и оценки эффективности таких фракций как в отношении катализа О^-дисутации, так и пролонгирования in vivo. Однако, уже на основании данных, полученных в настоящем исследовании, свидетельствующих о том, что имеются различия в чуъствительности различных форм СОД к деструктивному действию оксидантоз существует принципиальная возможность достичь пут-!.: модификации нативгого белка более устейч^ых к дйЯстви« оксидантоз его производных. Ограничиваясь хе стандартными показателями стабильности (термо-, рН- устойчивости). 88B0SH0SH9 прогнозирояйть судьбу М0ДИ'!'[>Ц1фО?-.аИК<>ГО 'I.üpíl.?нта -« очаге воспаления.

Представленные результаты указывают на то. что эффективность действия СОЯ. (как натизного белка, так и модифицированных форм) может существенно зависеть от наличия в-ерзде !Ш0 < генератор* 0С1") и ОН', поскольку этечутаяия О" тедот к накоялеяго лерекзеи," являющейся кпк субстратом туп катализа MííO, Tai' а источником образования Ой' нри наличии,! доноров.электронов. Таким образом, можно предположить, что без-, удаления из среды такого мощного источника окси'дантов, как ■■'ПО, применение СОД как нативной ток и тех нояп'глвированны* 1'орм ее, которые были исследованы нами, ле будет кметг-болътлего успехе, в ттредотзррл^ентп* двструктн*1* п^сто!» по7** действие!! оксидаитов. Результаты следующей серии г-спориментог-говорят о принципиальной возможности удаления »того источник«» АФК из очага воспаления.

5. Иммобилизация ФН на BrCN-активированной агарозе.

Стандартный метод, используемый для »мобилизации белков был несколько модифицирован нами в отноше"ии ФН, т.к. этот белок в отличие от других, которые могут быт*, иммобилизованы непосредственным добавлением раствора белка к суспензии аггрозы, агрегирует, образуя жгутообразную -тгуктуру. Биология ФН, определившая его в качестве комплексирукцего агента различных поврежденных структур и неспецлфическим образом модифицированных белков, ведет, по-видимому, к тощ-, что молекула приобретет повышенную склонность к аутоассоциации. Модификация заключалась в том, что -раствор ФН смешивался с суспензией ВгСИ-активированой агарозы не едино;.'эментно, а посредством медленной подачи раствора белка г сосуд с перемешивающейся агарозой. Это было реализовано уже в процессе элюции ФН с гепарин-агарозы (в процессе очистки) пришивочным буфером. После пришивки белок в растворе не быо> обнаружен ни по оптической плотности (Егао), ни по ме.оду Брэдфорда. . А. значит, весь ФН был иммобилизован на ВгСИ-^лсгивированной агарозе.

6. Изучение возможности удаления МПО путем образования комплекса с опс'онинами плазмы крови. Бчбор нами фибронектина для изучения его ассоциации з МПО-был -»бусловлен его способностью убирать' продукты деградации модифицированных компонентов тканевь:.: структур, и белков, с гсутствуюшта в циркуляции в уело -виях нормы,•а также тем, что он явлтется опсоническим фактором широкого спектра, действия.' Иммуноглобулин С был выбран нами более произвольно,, как тоже белок-опсонин, хотя и нацеленный в качестве антитела на конкретную антигенную детерминанту. Основным заинтересовавшим нас качеством этих белков является наличие у лейкоцитов рецепторов к ним и способность этих белков осуществлять, таким образом, транспортную функцию для лейкоцитов: ФН транспортируем субстаь ши различной химической структуры, 'в кгчестве антитела) - антиген.

На рис.7 показано, что иммобилизованные бечки-опсонины ФВ и способны ассоциировать растчоримую МПО с константами 2.43 мкМ С К^ШГО-ФН) ) и 3.45 мкМ С ^(МПО-^С) I. Число связывающих участков для Ю на <ГЯ-агарозе (в^) равняется 13.05 мкМ, а на ^С-агароза - 7.22 м :М. Таким образом, К^ укладывается.в интервал значений данной величины, соответству-

% "

¿2"

V

ч \

\

Ряс. Л Графики Скэтчарда взаимодействия МПС с твердофазными ФН11) и 1ёС(2>« и взаимодействия ФН( 3) и термоагрегированного с твердофазноой ШО. р - концентрация свободных:

МПО (1,2), ФН (3) и 1бС (4) (мкШ; Я - концентрация связанных на сорбенте: ч , МПО (1,2), ФН (3) и (4) (мкМ).

хэдих специфическом^ белок-белковому взаимодействию. Однако, если сопоставить концентрацию МПО-связывахЯЦих участков с концентрацией ФН на колонке, то они приблизительно равны (с некоторым превышением концентрации этих участков). Учитывал' эмпирические данные о том, что в результате иммобилизаций белка, как правило, значительная часть ег.о лиганд-связывающиж сайтов оказывается недоступной, можно ожидать, что молекула Ф® обладает несколькими участками взаимодействия с МПО. Это в® является неожиданным. Ф.к. молекула ФН состоит'из двух ползпямт-тидных цепей - прлду.люв одного гена и содержащих практически идентичные домены для взаимодействия со многими лигандами-Концентрадия участков связывания для ШО на ^С-агароэе сосиа-вляет примерно 35.9'/. от концентрации иммобилизованного

Иммобилизованная ШО также способна ассоциировать растшо^ римый ФН, причем степень ассоциации усиливается - 0). 8® мкМ). В случае ге нативного ^С ко'ттлексообразованпе пс бъвкг обнаружено. Однако, с термоагрегированным иммобилизованная! МПО ассоциировалась (Кй = Т. 13 мкМ) (рис.?). Количества яасг^-ков связывания составляло 26.4'/. от концентрации иммобилизованной МПО для растворимого ФН и 22.7% для агрегированное© т

первом из этих случаев столь низкий процент участков связывания в сравнении с почти 100% для иммобилизованного ФН и жидко-фазной МПО, по-видимому, говорит о том, что при иммобилизашя МПО число участков, доступных для свгэыванйя с ФН уменьшается. Во втором случае число участков свгзьгчания также уменьшаете) (по сравнению с 35.9%), хотя и не в стопь большой степени.

Агрегированный ^С игчтирует многие характеристик! иммунного комплекса, поэтому можно предположить, что ^ з качестве антитела, связавшего объект фагоцитоза, также приобретает свойство фиксировать на себе МПО. В случае- ж< иммобилизованного 1§С свойство его свазывать МПО, по-видимому, является следствием демаскировки соответствующих участки молекулы этого белка в ходе его к^вилентной модификации пр! взаимодействии с матрицей агарозы.

Полученные данные о способности ФН и связывал растворимую ШО в условиях, бгизкил к физиологическим, указывают на существование естес твенного механизма удалени* МПО из внеклеточного пространстве., куда она поставляете! нейтрофцлами и где осуществляете:: опосредованное эта ферментом окислительное повреждение . -*каней собственного организма. .То есть, данные этой серии - э"сперименто1 свидет°льствуют о принципиаг.ной возможности совершенствовав антиоксидантной терапии, причем, я отличие от существующих е настоящее время ' подходов, 'налгавленных на ликвидации образованных ■ лейкоцитами окси/алтов, в данном случае предполагается удаление.самой причины их образования - ШО как генератора наиболее опасных агентрв: 0С1",'102 и ОН'.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоочшгчнные препараты белков: Ж), ФН и

с пбмощью модификации известных методов кх выделения я

очистки."

2. Предложены новые критерии устойчивости различных форм СОД (нативной и модифицированной), более адекватно учитывающие условия в очаге воспаления (высокие концентрации АФК). Наряду с традиционным, данный подход позволяет более корректно проводить сравнительные биохимические исследования нативной и пролонгированной форм СОД с ц. лью отбора наиболее устойчивых из

mu' ;> действ;- .p.ктоdo«, ijDaiimivv^;.¡ix л Г'рггк/акга пы: пятс^оп!;;.

3. Виянлени. ноодаозначностт зовгаеаяя устойчивости к инактшкщик под действие:.' оксидзнтов очага воспаления т различных пролонгированных форм СОД Е сравнении с нагивнни феркспгом, которые не улр.влчряптся известными Формально принятыми критериями ■ r4p;,;o-v pit- уотойчи&ссть) -

4. Выявлено, чгоо НПО является еще одшш дигандсм

rFiTT^nriUAi/TtmO _

^ uluqprrotiri ЧТО M'lO HH HMH'ic.n лИгЙНлСМ i'bDmOcil'pdi liDG-

ванного IgG (функционального аналога иммунного комплекса).

6. Показано, что способность взаимодействия МПО с СН и IgG может служить основанием для создания терапевтических средств удаления МПО из экстраиеллюлярного пространства очага воспаления, что позволит значительно улучшить эффективность Применения СОД-терапии.

Пс материала.'.? диссертации опубликованы следующие работы: 1, фрагк&т зибропоктии» i 70 ><Да; - арощгк? птдрс пязг. к«. стойко:; (-. и П/дтасо;! яеГгтрскннфитоскг /^а^лоле.'етвукт^х о vtioj.о]гср,;.;.с>1да-зо;1/ Янтавск;:?! 0. kj.. ¡' " , ьсро.пэтгс. й.А.. лилажст^ипо^а Л.Р.// Актуальные иробле.;... iiii-oKit'ici'iici; naT'O-TOj iii;. Ы.ть Иммунология и биотехнология и.-ПетегСург.-ШИЗМ им. П?с. ера - 1993 ' - С, 4П,

2 jr.vn L. v.. YanVcv-зку O.Yu., Khilazhetdincva 1.П.

et.al. Erysod: пен reeedy of ¡supcroiiid dismut.ase for nedicpi application// international Conferense "Biotechnology fit Petersburg' 9ч"- Vrozvm ?.m! abstracts. - Ш1: - P. ЗП.

:.;. Kavorovri ц Yn.. Ynnkovscy O.Yu., Khila-hetdinovs П. et.al. Conbined affinity chromatographic- method of the pbtaining of the individually purified proteins:' fibronectin and plasminogen// International Conferense "Biotechnology h'l. Petersburg' 94". Progrftw and abstracts, - Ш91 •• P.

л. Уэпкоуяку O.Yu., Klii lazhet.iiinova L.R. ; Govorova »J.Yu. •>!. TnleracUon siyelopcroxtdase i'iPO) with opsonic protein? ar a possible »echanisw of ,bo both : arising of leukocytes ami protection against IfPO-dependent tissue Injury// 3-rd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems": Program and Abstrabts. ■» St. Petersburg, 1995. - P. 82.