Активация кислородзависимой биоцидной системы нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами

Эйсмонт, Юрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активация кислородзависимой биоцидной системы нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активация кислородзависимой биоцидной системы нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

эйсмонт

Юрий Александрович

АКТИВАЦИЯ КИСЛОРОДЗАВИСИМОЙ БИОЦИДНОЙ СИСТЕМЫ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ КОНТАКТЕ КРОВИ С ГЕМОСОРБЕНТАМИ.

Специальность:

03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в Научном Центре сорбционных технологии НИИ Эндокринологии Государственного Образовательного Учреждения Дополнительного Профессионального Образования «Санкт-Петербургская Медицинская Академия Последипломного Образования Министерства Здравоохранения РФ».

Научные руководители: доктор биологических наук

Олег Юлианович Янковский

доктор медицинских наук Сергей Иванович Кузнецов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Фаина Евгениевна Путилина

доктор биологических наук Елена Георгиевна Рыбакина

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт цитологии РАН

Защита состоится «_»_2004 года в_часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном Университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Автореферат разослан «_» 2004 года.

Ученый секретарь

доктор биологических наук, профессор

З.И. Крутецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Среди используемых в настоящее время экстракорпоральных методов де-токсикации важное место занимает гемосорбция (Лопухин Ю.М. и соавт., 1995; Картель Н.Т., 1998; Ветров В.В., 1999; Беляков НА и соавт., 2000). Лечебное действие гемосорбции обусловлено двумя эффектами - элиминацией токсических продуктов и неспецифическим воздействием ге-моконтактной процедуры, которая является пусковым моментом для активации гуморальных систем плазмы и клеточных элементов крови (Кулаев Д.В., 1995, Кузнецов СИ., 1998, Кузнецов СИ., 2003). Взаимодействие сорбентов различной химической структуры с кровью как с уникальной биологической средой вызывает характерные сдвига в самой крови. В частности гемосорбция является мощным активатором нейтрофильных лейкоцитов (Якубовская Р.И. и соавт., 1993). Ней-трофилы при контакте с гемосорбентом, запускают свои основные генераторы активных форм кислорода (АФК) - NADPH-оксидазу и миелопероксидазу (МПО). Включение при взаимодействии крови с гемоконтактными препаратами кислородзависимых биоцидных механизмов гранулоцитов с наработкой АФК может иметь как позитивные, так и негативные последствия для больного. При гиперпродукция АФК лейкоцитами крови, процедуру гемоперфузии через сорбенты необходимо проводить «под прикрытием» антиоксидантов (СОД, церулоплазмин) либо использовать комбинированные гемосорбепты, составной частью которых являются препараты специфически фиксирующие макромолекулы - продуценты АФК (экстрацеллюлярная МПО) или стимуляторы АФК -продукции нейтрофильными гранулоцитами. При отсутствии гиперпродукции АФК, образующиеся активные производные кислорода могут играть позитивную роль, принимая участие в редокс -регуляции клеточных функций (Янковский О.Ю., Слепенков СВ., 1995; Зенков Н.К. и соавт., 2001).

Цель исследования. Показать наличие активации нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами медицинского назначения через индукцию специализированных ки-слородзависимых биоцидных систем, а так же предложить способ воздействия на контактную гиперпродукцию активных форм кислорода путем введения антиоксидантов во время гемоперфузии либо используя селективные гемосорбенты для удаления экстрацеллюлярных кислородмодифици-рующих систем.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние гемосорбентов различной химической структуры на индукцию генерации активных форм кислорода лейкоцитами крови при контакте с ними в условиях in vitro и in vivo.

2. Оценить влияние антиоксидантов (супероксиддисмутаза и церулоплазмин) на изменение количества активных форм кислорода при гемоперфузии.

3. Проанализировать количественное соотношение наработки супероксидного радикала и ги-похлорита при контакте нейтрофилов с гемосорбентами.

4. Охарактеризовать специфические свойства сорбента фибронектин-агароза для связывания экстрацеллюлярной миелопероксидазы.

Научная новизна.

ложен способ определения биосовместимости гемосорбентов с учетом индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам (Патент РФ №2122734,1998).

Впервые исследовано влияние антиоксидантов (СОД и ЦП) на изменение количества АФК, генерируемых лейкоцитами крови в процессе контакта крови с гемосорбентами. Показана специфичность воздействия антиоксидантов на факторы, запускающие и поддерживающие процесс генерализованного воспаления, то есть на активные производные кислорода. В большей степени нейтрализующий эффект характерен для СОД. На основании выполненных исследований предложен способ проведения гемосорбции на фоне инфузии антиоксидантных препаратов (Патент РФ №2137508,1999).

Впервые выполнены исследования по количественной оценке продуктов активации NADPH-оксидазной и миелопероксидазной систем нейтрофилов при их контакте с гемосорбентами.

Охарактеризованы селективные сорбционные свойства иммобилизованного на агарозу 4Б ФН в отношении жидкофазной МПО. Высказано предположение о возможности использования сорбента ФН - агароза для элиминации экстрацеллюлярной МПО - источника реактивных производных кислорода (гипогалоидов и свободных радикалов).

Теоретическое и практическое значение работы. Работа является экспериментальным исследованием, которое вносит вклад в изучение прикладной научной проблемы, связанной с исследованием биосовместимости гемоконтактных материалов медицинского назначения. Работа расширяет теоретические представления об участии нейтрофильиых лейкоцитов крови в запуске кислородмодифицирующих систем клетки, в возможном создании дисбаланса в системе антиок-сиданты - прооксиданты в сторону последних на уровне целостного организма при гемоконтакт-ной процедуре. С теоретических позиций проведенные в работе эксперименты in vivo могут служить основой при создании экспериментальной модели для изучения синдрома системного ответа на воспаление (Systemic Inflamatory Response Syndrome - SIRS) и компенсаторного ответа организма на генерализованное воспаление (Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome -CARS). Результаты исследования расширяют представления о генезе процессов, разворачивающихся в результате гемоконтактной процедуры на поверхности сорбентов и в перфузируемой крови и связанных с активацией кислородзависимых биоцидных систем нейтрофильных лейкоцитов. В работе проанализирован спектр и количественные характеристики активных производных кислорода, что дает возможность предполагать появление определенных интермедиатов кислорода при гемоперфузии через различные виды гемосорбептов и целенаправленно воздействовать на них в случае гиперпродукции.

С точки зрения практической значимости в работе предложено два варианта проведения гемоперфузии с целью снижения негативных последствий гиперпродукции АФК. Во-первых, это проведение гемосорбции на фоне постоянного введения антиоксидантов - супероксиддисмутазы и церулоплазмина. Второе, - предложено использование селективного гемосорбента фибронектин -агароза, который специфически связывает и удаляет из циркуляции экстрацеллюлярную МПО -продуцента одного из наиболее агрессивных интермедиатов - НОС1.

Выполненное исследование позволит разработать оптимальные схемы проведения гемо-сорбции с учетом общего антиоксидантного статуса больного.

Основные положеивя выносимые на защиту.

1. Контакт лейкоцитов крови с гемосорбентами приводит к индукции генерации клетками активных форм кислорода, степень выраженности которой зависит от химической природы сорбента и условий проведения экспериментов in vitro и in vivo.

2. Проведение гемоперфузии у животных на фоне постоянного введения антиоксидантов (су-пероксиддисмутаза и церулоплазмин) приводит к снижению люминолзависимой хемилюми-несценции крови, что более выражено при инфузии супероксиддисмутазы

3. Взаимодействие нейтрофильных лейкоцитов с гранулами сорбентов сопровождается активацией кислородзависимых биоцидных систем клеток (NADPH - оксидазы и миелопероксида-зы), степень выраженности которой связана с химической структурой гранул.

4. Селективный сорбент фибронектип — агароза специфически связывает экстрацеллюлярную миелопероксидазу.

Апробация работы/

Материалы диссертационной работы были представлены на:

Научной конференции в честь 280-летия ШМКГ «Актуальные проблемы военно-морской и клинической медицины», - СПб, 1995; I Всероссийском Конгрессе по патофизиологии, - М., 1996; III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов, - СПб, 1996; Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты», - СПб, 1999; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», - СПб, 2001; Научной конференции «Дни иммунологии в Санкт — Петербурге -2001», - СПб, 2001; Научной конференции «Механизмы типовых патологических процессов», -СПб, 2003. '

Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в центральных журналах и 3 патента на изобретение.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на .139 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и рекомендаций по использованию научных выводов. Библиография включает 251 источников, из которых 42 отечественных и 209 зарубежных. Работа иллюстрирована _10_рисунками и 5_таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. Постановка экспериментов in vitro и учет активных форм кислорода in vitro и in vivo. Постановку реакции in vitro проводили по следующей схеме [Yonemaru M. etal., 1989]:

1. У В работе использовали либо цельную кровь, либо выделенную на градиенте плотности фи-колл - верографина фракцию нейтрофильных лейкоцитов.

2. В цельной крови подсчитывали количество лейкоцитов в 1 мм3. В наших экспериментах расчет индекса активации производили, учитывая количество нейтрофильных лейкоцитов, так как эти клетки вносят основной вклад в генерацию АФК. Количество выделенных на градиенте плотности нейтрофилов доводили до 106 клеток в 1 мл среды

3. Инкубацию крови (клеток) с сорбентами проводили непосредственно в кюветах люминометра. В кювету люминометра вносили: 100 мкл сорбента; 100 мкл гепаринизированной крови донора или взвеси клеток; 100 мкл раствора люминола; 700 мкл раствора Хэнкса без фенолового красного. (Параллельно ставили контрольную пробу без сорбента для оценки спонтанной ХЛ, соответственно увеличив объем раствора Хэнкса до 800 мкл.)

4. Учет реакции проводили на люминометре LKB - Wallac 1251 (Швеция) в термостатируемом режиме (t=37°C) при постоянном перемешивании содержимого кювет. Показатели ХЛ в каждой кювете регистрировали с интервалами в 40 секунд. Общее время просчета пробы - 60 мин.

5. В пробах регистрировали максимальный уровень ХЛ (Max(mV), время развития пика реакции (t (min) и интегральный показатель активации клеток - светосумму (LS). Уровень активации клеток в ответ па их контакт с сорбентами оценивали индексом ХЛ, который представляет собой отношение светосуммы ХЛ к количеству нейтрофшюв в 1 мм крови, умноженное на 1000 (LS/Nph x 1000).

Гемоперфузия в экспериментах па животных.

Гемоперфузию in vivo проводили на морских свинках. Животных в/б наркотизировали нембуталом из расчета 30-50 мг/кг. Свертывающую систему крови блокировали гепарином в дозе 500 Ед/кг. Подключение экстракорпорального контура осуществляли по схеме артерия -> вена. Для подключения внешнего контура катетеризировали общую сонную артерию и наружную яремную вену. В экстракорпоральный контур включали колонки с различными сорбентами. Объем колонок составлял 2,0 мл сорбента. Скорость гемоциркуляции в контуре задавали перистальтическим насосом, которая соответствовала 20 мл/час. Продолжительность гемоперфузии 1 час. Забор крови для регистрации параметров: кровь брали до гемоперфузии, через 30 и 60 мин после начала гемосорбции (до колонки и после нее), через 1 и 2 часа после завершения процедуры из артериального катетера.

Гемоперфузия на фоне введения аятиоксиданта..

Опыты с использованием антиоксиданта проводили на морских свинках по той же схеме, как и предыдущие эксперименты. В качестве гемоконтактного препарата была выбрана Агароза 4Б. Супероксиддисмутазу (церулоплазмин) растворяли в 2 мл физиологического раствора с гепарином и подавали на колонку перистальтическим насосом со скоростью 2 мл/ч в течение всей процедуры гемоперфузии. Доза препарата составляла для СОД - 50 мкг на кг массы животного, для церулоплазмина - 1250 мкг на кг массы животного. Результаты оценивали по тем же параметрам, что и в предыдущих экспериментах.

Определение ОСГ выделяемого нейтрофилами крови человека [Арутюнян А.В. и соавт., 2000).

Постановка реакции: Р-р Хэнкса -2,6 мл; Сорбент - 0,1 мл; Таурин - 0,1 мл; Взвесь нейтро-филов - 0,3 мл. Инкубация при 37 °С в течение 60 минут. Остановка реакции: NaN3 - 0,02 мл, Ка-талаза - 0,050 мл. Инкубация при 37 °С в течение 15 минут. Центрифугирование при 1,5 тысяч оборотов в мин в течении 5 мин. Измерение: в супернатант добавить KJ - 0,06 мл, измерение экс-тшщиипри X ~ 350 нм.

Определение продукции супероксид - анион радикала выделяемого нейтрофилами крови человека [Арутюнян А.В. и соавт., 2000].

Постановка реакции: Р-р Хэнкса -0,3 мл; Сорбент - 0,1 мл; Р-р цитохрома С - 0,3 мл; Взвесь нейтрофилов - 0,3 мл. Инкубация при 37 °С в течение 60 минут. Измерение: центрифугирование при 1,5 тысяч оборотов в мин в течении 5 мин, супернатант измеряют при X = 550 нм.

Расчитывают с учетом того, что 10 цмоль цитохрома С соответствуют 0,210 оп.ед. при X -550 нм, результат выражают в на клетку в час.

Рециркулирующая система для изучения связывания МПО с ФН-агарозой.

Для изучения ассоциации жидкофазной МПО использовали рециркулирующую систему, включающую перистальтический насос, контрольную колонку с ЧСА - агарозой (2 мл) для оценки уровня неспецифического связывания, опытную колонку с ФН-агарозой (2-мл). Опыт ставили при различных концентрациях МПО, вносимых по 0,5 -1.0 мл в разомкнутый контур системы путём всасывания перистальтическим насосом через приводной шланг с одновременным удалением из системы такого же объёма PBS. Раствор МПО циркулировал в течение ночи (16-18 ч) при 21°С.

Статистическая обработка результатов

Для выполнения статистических функций использовали пакет прикладных программ Statis-tica for Windows v. 5.0. Данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. При анализе двух независимых выборок использовали методику непараметрической статистики - критерий Вилкоксона. Статистически достоверными считали различия при р< 0,05. Этот же пакет программ был использован для оценки результатов количественной аффинной хроматографии при изучении взаимодействия МПО с иммобилизованным ФН с помощью метода прямолинейной регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Оцепка индуктивной активности сорбентов различной химической структуры в стендовых

условиях.

Стереотипным ответом лейкоцитов на воздействие стимулов различной природы является индукция генерации ими АФК. Эта реакция развивается в течение нескольких секунд и длится десятки минут. Сравнительные данные по спонтанной ХЛ нейтрофилов донорской крови при их контакте с различными сорбентами представлены на рисунке 1. Реакция лейкоцитов на контакт

Рис.1. Пик спонтанной хемилюминссценции (raV) при контакте нейтрофилов человека с различными сорбентами in vitro в бессывороточной среде.

с сорбентами различной химической структуры разнонаправлсна. Если угольный сорбент (СКН-2К) и гранулированный поперечносшитый аубазидал (ГПА) снижают пик ХЛ в 5-6 раз, то крупнозернистая гранулированная агароза (Лгароза 4Б) в 1,5 раза усиливает пик ответа по сравнению с контрольной пробой.

Регистрируемая реакция ХЛ является результирующей величиной двух противоположно направленных процессов. При взаимодействии нейтрофилов с фагоцитируемыми частицами или с несопоставимыми по размеру с клеткой объектами, происходит их активация, обеспечивающая как де-гранулядию, так и запуск систем, которые генерируют АФК (происходит "дыхательный взрыв").

' С одной стороны обязательно происходит генерация АФК, с другой - инактивация или поглощение образованных оксидантов, которые обладают высокой реактогенностью, самими сорбентами. В случае с СКН-2К и ГПА стимулирующий эффект выражен незначительно и преобладает фаза инактивации, в то время как Агароза 4Б является более мощным активатором, чем поглотителем АФК. При модификации агарозной матрицы различными белками происходит смещение суммарной реактивности в сторону инактивации АФК. Исключение составляет рекомбинантный Ig-связывающий белок G Streptococcus (Имасорб G-700), при взаимодействии с которым пик ХЛ более чем в 2 раза превышает контрольные зпачения.

Таким образом, активация лейкоцитов при их контакте с гранулами сорбентов в бессывороточной среде зависит от химической структуры самой матрицы и иммобилизованных на ней активных лигандов, а также от способности лейкоцитов к генерации АФК. На регистрацию АФК методом люминол-зависимой ХЛ существенное влияние оказывает эффективность нейтрализации продуктов "дыхательного взрыва" клеток сорбентами.

Индивидуальная чувствительность лейкоцитов доноров к различным гемоконтактным препаратам, регистрируемая методом люминол-зависимой ХЛ, представляет собой интегральный показатель, который отражает персональную реактивность клеточных и гуморальных систем крови индивидуума и реактогенную способность структурной организации конкретного гемоконтактно-го препарата. В данном разделе работы обследовано 7 доноров, кровь каждого контактировала in vitro с четырьмя различными сорбентами (СКН - 2К, ГПА, Агароза 4Б, Имасорб А-700). Среди них выделяются два донора с различной способностью индуцировать синтез АФК на данные сорбенты. Так один из доноров, наиболее интенсивно из всех обследованных, демонстрирует индукцию АФК на апробированные сорбенты. Лейкоциты его крови оказались наиболее чувствительны к Имасорбу А-700, в то время как сам агарозный носитель, угольный сорбент СКН-2К и ГПА обладают приблизительно одинаковой способностью индуцировать генерацию лейкоцитами АФК. Другой донор обладает наименьшей индивидуальной чувствительностью к гемоконтактным препаратам. В данном случае преобладает индуцибельная активность Агарозы 4Б. Индивидуальная реактивность остальных доноров находится в промежутке между этими полярными значениями. Однако способность сорбентов активировать клетки в направлении генерации ими АФК у большинства доноров падает в следующем ряду: Имасорб А-700 > Агароза 4Б > ГПА > СКН-2К.

Наряду с оценкой индивидуальной реактивности доноров была проанализирована чувствительность нейтрофилов человека к гемоконтактным препаратам. Группа насчитывала 10 доноров. Был расширен круг исследованных сорбентов, сконструированных на основе агарозной матрицы (Рис. 2.). Ковалентная иммобилизация на агарозе различных белков придает гемоконтактным препаратам определенную сорбционную специфичность и модифицирует полисахаридпый каркас,

Рис. 2. Чувствительность иейтрофилов доноров к различным сорбентам.

что должно отразиться на ХЛ активности нейтрофилов. Из исследованных препаратов только СКН-2К, ГПА и AT против белков лошадиной сыворотки, иммобилизованные на агарозе, в группе обследованных доноров имели индекс ХЛ ниже его спонтанного значения (контроля). ХЛ на ДАТс (противодифтерийный антитоксический иммуносорбент) соответствовала уровню контроля. Все остальные препараты характеризовались более интенсивным свечением.

Так как в перфузируемой крови процесс активации лейкоцитов является ведущим событием, в развитии других проявлений гемоконтактной процедуры, то можно допустить, что наиболее ранние показатели активации этих клеток могут служить критерием оценки индивидуальной чувствительности пациентов к контакту его крови с сорбционным препаратами. На основании этого нами предложен способ, который позволяет предварительно оценивать изменения реактивности лейкоцитов крови больного in vitro на конкретный сорбционный препарат перед проведением лечебной процедуры гемосорбции (Патент РФ №2122734,1998г.).

Способность сорбентов индуцировать генерацию активных форм кислорода in vivo.

В данном разделе работы оценивали изменение индекса ХЛ в процессе гемоперфузии у животных в спонтанном и индуцированном (форболмеристатацатом ФМА) режимах.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гемоперфузия крови сопровождается выраженной активацией клеток при применении любых из использованных сорбентов. Все исследованные препараты можно разделить на 3 группы: производные полисахаридов (Агароза 4Б, Агаро-за-БСА, Имасорб А-700, Сфероцел и ГПА), на основе поливинилового спирта (ПВС-1, ПВС-2) и угольные (СКН-2К, СКТ-6А, ФАС). В каждой группе можно выделить как высокореактогенные сорбенты, так и с более низкой индуцибельной активностью для клеток крови. Среди 3 группы наиболее реактогенным оказался СКТ-6А, что характерно в пробах крови до и после колонки. Препараты на основе ПВС оказывают активирующее действие на лейкоциты сопоставимое с воздействием угольных сорбентов, хотя к концу гемоперфузии отмечается тенденция к усилению их

индуцибельной активности во всех пробах крови. Контакт крови с агарозной матрицей вызывает наибольшую активацию лейкоцитов в пробах крови, взятых непосредственно после колонки. Модификация агарозы путем ковалентной иммобилизация белков (БСА и белок A S.aureus) приводит к изменению индуцибельной активности гемоконтшетных препаратов.

Таким образом, процесс гемосорбции индуцирует в организме хемилюминесцентный ответ лейкоцитов периферической крови, что является огражением активации этих клеток и стимуляции продукции ими АФК. Различные типы исследованных сорбентов отличаются по степени лейко-шгг-шщуцирующей активности в отношении уровней продукции клетками АФК. Индукция ХЛ лейкоцитами перфузируемой через сорбент крови сопровождается снижением количества этих клеток в циркуляции, что может свидетельствовать об усилении их адгезивных свойств. Удельный уровень стимуляции ХЛ лейкоцитов перфузируемой крови может служить критерием биосовместимости гемосорбентов и других гемоконтактных материалов.

Влияние антиоксидантов на процессы генерации АФК при гемоперфузии in vivo.

Результаты исследований показали, что гемоперфузия через любые сорбционные препараты in vivo в большей или меньшей степени сдвигает динамическое равновесие системы проокси-данты-антиоксиданты в сторону увеличения продукции АФК. Поэтому было бы целесообразно проведение гемосорбции на фоне антиоксидантной терапии. В качестве наиболее перспективного средства в настоящее время признана СОД. Действие СОД нацелено на инактивацию первичного продукта нейтрофилов - Of. Основным продуктом активации нейтрофилов при гемоперфузии является Of, поэтому применение СОД при эфферентной терапии будет патогенетически обосновано. Это положение иллюстрируется при анализе результатов проведенных экспериментов (табл.1.).

Проведение гемосорбции на фоне инфузии СОД приводит к снижению индексов ХЛ (спонтанной и индуцированной ФМА) практически на всех этапах регистрации АФК-продукции. На 30 мин гемоперфузии, регистрируемая АФК-активность в 2 раза ниже при использовании антиокси-дата в пробах крови до и после колонки. Аналогичное снижение

индексов ХЛ отмечается и на 60 мин процедуры в пробах после прохождения крови через колонки с агарозой. Интересно, что в эти же сроки в пробах крови взятых из системного кровотока (до колонки) индексы ХЛ в три раза ниже (р<0,05), чем у животных без СОД-терапии и практически соответствует уровню индексов ХЛ в контрольной группе.

Таким образом, применение СОД в процессе гемоперфузии через сорбенты приводит к инактивации АФК, что отражает индекс ХЛ.

Гемосорбция может вызвать сдвиг оксидантной системы и через миелопероксидазный катализ. В этом случае можно использовать другой антиоксидант - церулоплазмин. По сравнению с другими сывороточными белками церулоплазмин на порядок эффективнее ингибирует продукты миелопероксидазного катализа. Проведение в наших опытах гемосорбции на фоне инфузии ЦП (Табл2) приводит к снижению индексов ХЛ только в пробах крови, взятых непосредственно после катанки (и на 30-й, и на 60-й минутах проведения гемоперфузии). В пробах крови, взятых перед колонкой, индексы ХЛ не отличались от аналогичных показателей проведения гемосорбции без инфузии обоих антиок-сидантовДля проведения гемоперфузии были использованы такие весовые количества обоих антиок-сидантов, которые обеспечивали практически одинаковое подавление ХЛ в пробах после колонки. То есть, ЦП было взято в 25 раз больше, чем СОД, Поскольку СОД - это высоко специфический фермент именно для Of, то для уничтожения аналогичного количества Of требовалось бы увеличить дозу ЦП в

Таблица 1.

Влияние СОД иа хемнлюминесценцию лейкоцитов крови при гемоперфулш (ГП).

Сорбенты

Контроль | Агароза 4Б | Агароза 4Б + СОД

До ГП Спонтанная 6,8 ±0,91 п = 24

Индуцированная 8,6 ± 1,19 п = 24

30 мин до колонки Спонтанная 5,3 ± 0,71 п = 7 36,2 ±9,35 п = 6 17,1 ±1,83* п = 8

Индуцированная 8,6 ±1,80 п = 7 36,6 ± 9,35 п = 6 17,9 ±1,65* п = 8

30 мин после колонки Спонтанная — 100,0 ±12,13 п = 6 52,2 ±5,12* п = 9

Индуцированная - 100,1 ± 12,34 п = 6 52,4 ±5,39' п = 9

60 мин до колонки Спонтанная 6,3 ±0,76 п= 7 18,6 ±4,97 п = 5 6,1 ±1,01* п= 8

Индуцированная 10,3 ±2,44 п = 7 19,6 ±4,82 п = 5 7,1 ±0,94' п= 8

60 мин после колонки Спонтанная - 72,9 ±15,56 0 = 6 35,0 ± 7,70' п = 9

Индуцированная — 73,1 ± 16,46 п => 6 35,9 ± 7,63' п = 9

1 час после ГП Спонтанная 4,0 ±1,01 . п= 7 3,1 ±0,40 п = 5 2,7 ±0,35 п= 10

Индуцированная 6,6 ±1,39 п = 7 3,5 ±0,26 п = 5 3,9 ±0,41 п= 10

2 часа после ГП Спонтанная 2,9 ±0,71 п= 7 2,6 ±0,95 п= 5 1,8 ±0,22 п = 9

Индуцированная 4,5 ±0,72 п = 7 3,2 ±0,67 п = 5 3,8 ±0,80 п = 9

Примечание: » - различия достоверны по сравнению с группой «Агараза 4Б».

Таблица 2,

Влияние ЦП на хемилюминесценцию лейкоцитов крови при гсмоперфузии (ГП).

Время забора проб крови Сорбенты

Контроль | Агароза 4Б ( Агароза 4Б + ЦП

До ГП Спонтанная 6,8 ±0,91 п = 24

Индуцированная 8,6 ±1,19 п = 24

30 мин до колонки Спонтанная 5,3 ±0,71 п = 7 36,2 ±9,35 п = 6 32,71 ± 6,354 п = 8

Индуцированиа я 8,6 ± 1,80 п = 7 36,6 ±9,35 п = 6 32,69 ± 6,275 п = 8

30 мин после колонки Спонтанная - 100,0 ±12,13 п = 6 50,23 ± 5,900* п = 8

Индуцированная - 100,1 ± 12,34 п-6 40,94 ±6,017* п = 8

60 мин до колонки Спонтанная 6,3 ±0,76 п = 7 18,6 ±4,97 п=>5 20,9 ± 5,37 п = 7

Индуцированная 10,3 ±2,44 п = 7 19,6 ±4,82 п = 5 21,2± 5,36 п = 7

60 мин после колонки Спонтанная ~ 72,9 ± 15,56 п = 6 36,89 ± 4,685* п = 8

Индуцированная : 73,1 ± 16,46 п = 6 37,35 ±4,759* п=8

1 час после ГП Спонтанная 4,0 ±1,01 п = 7 3,1 ± 0,40 п = 5 2,53 ±0,148 п = 6

Индуцированная 6,6 ±1,39 п = 7 3,5 ± 0,26 п = 5 3,13 ±0,174 п = 6

2 часа после ГП Спонтанная 2,9 ±0,71 п = 7 2,6 ±0,95 п = 5 1,70 ± 0,032 п-7

Индуцированная 4,5 ±0,72 п = 7 3,2 ± 0,67 п = 5 2,56 ± 0,068 п = 7

Примечание: * - различия достоверны по отношению к Агарозе 4Б

60 раз (Васильев В.Б., 1996]. Следовательно, можно предполагать, что подавление свечения в пробах после колонки обеспечивается, в основном, благодаря ликвидации продуктов МПО-катализа (НОС1).

Обращает га себя внимание тот факт, что при контакте лейкоцитов крови с гранулами сорбентов запускаются обе системы генерации ЛФК в клетке (МЛОРН-оксидаза и МГЮ) (Габл.3). По сравнению с контрольными в опьпных пробах идет достоверное уватичешгековдетрациикак Ог, так и ОСГ на обоих видах сорбциошюго материала.

Таблица 3.

Уровень продукции нейгрофнльиыми лейкоцитами активных форм кислорода (Ог" и ОСГ)

при контакте с различными сорбентами.

АФК Контроль Сорбент

Уголь СКП-6АВЧ Агароза 4Б

ог (цмоль / кл) 4,56 х 10"'+0,326 х 10"' п- 7 8,67 х 10"'± 0,700 х 10"'' п = 7 36,63 х 10"'± 6,105 х 10"7' п-8

ОСГ (|ШОЛЬ / кл) 1,11 х 10'7± 0,112 х 10'1 п = 7 2,08 х 10"7 ±0,3 80 х Ю"7' п = 7 2,76 х 10"7 ±0,316 х 107" п = 6

* - различия достоверны по сравнению с контрольной группой.

И если продукты МПО - катализа возрастают приблизительно одинаково¡(2,08 • 1(Г7 ± 0,38 • 10"' и 2,76 -10Г'± 0316 -КГ') на угле и агарозе, то уровни супероксидного радикала существенно отличаются не только от контрольных значении, но и достоверно различаются между собой (8,67 ■ 10"' ± 0,7 • 10"' И 36,63 • 10"7±6,105 • 10"'). Реактивность агарозы в отношении индукции Ог" приблизительно в 4 раза выше по сравнению с угольным сорбентом СКН - 6А ВЧ. Эти результаты согласуются с нашими предыдущими данными, полученными in vitro, где продукция АФК регистрирова

лась методом люминолзависимой ХЛ Агароза показывала более высокие значения ХЛ по сравнению с любыми угольными гемосорбентами. Интереспо отметить соотношение продукции Ог"/ ОСГ в контрольных пробах равно 4,12, что очевидно отражает естественное соотношение АФК - продукции двумя специализи-рованпыми системами. Приблизительно такое же соотношение иптермедиатов сохраняется и при контакте нейтрофилов с углем СКТ-бЛ-ВЧ - 4,17. Совершенно другая картипа характеризует реактивность клеток в отношении Агарозы 4Б. Соотношение Of/ ОСГ составляет 13,57, что свидетельствует о предпочтительном варианте активации клетки вследствие контакта с гранулированным полисахаридом по NADPH - оксидаз-номупути.

Таким образом, анализ спектра активных производных кислорода, образующихся при контакте клеток крови с гемосорбентами, свидетельствует о возможности запуска преимущественно того или иного пути активации клеток в зависимости от химической структуры гемоконтактного препарата. Это дает основание назначать препараты выбора (антиоксиданты) для нейтрализации гиперпродукции АФК при эфферентной терапии, а так же при различных патологических процессах и состояниях с патогенетических позиций. '

Сорбент для удаления экстрацеллюлярной МИО.

Регистрируемый НОС1 генерируется преимущественно экстрацеллюлярной МПО. Нами предложен вариант элиминации из кровотока экстрацеллюлярной МПО с использованием биоаф-фишюго сорбента на основе иммобилизованного ФН. (Данное исследование было выполнено в сотрудничестве с Н.В. Леоновой и Л.Р. Хилажетдиновой).

Определяли концентрацию несвязавшегося фермента (р) в циркулирующей жидкости и сорбированной МПО (ф - после элюции с колонок.

Препарат иммобилизованного на агарозе ФН обладал следующими характеристиками: 4,2 мг ФН/мл геля, что с учётом объёма несвязанной жидкости в матрице сорбента (86%) составляет 4,9 мг/мл или 10,9 мкМ.

Параметры комплексообразования (константу диссоциации - К<] и концентрацию участков • связывания - ш0 определяли в координатах Скэтчарда для простейшей модели бимолекулярного взаимодействия (рис. 3). Полученная прямая с наклоном -1/К<| отсекает на оси абсцисс значение ть а на оси ординат - щ/ К<|. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что концентрация МПО - связывающих участков на сорбенте (Ш| - 13,1 мкМ) приблизительно соответствует (с даже некоторым превышением) концентрации иммобилизованного ФН (10,9 мкМ). Однако, как свидетельствуют эмпирические данные, в большинстве случаев при химической «пришивке» одного из участников белок - белкового взаимодействия, часть его связывающих участков оказывается не доступной для другого партнера. Это кажущееся противоречие, по-видимому, является следствием двухсубъедшшчной организации ФН, состоящего из двух практически идентичных полипептидных цепей. В таком случае у нативного жидкофазного белка должно присутствовать как минимум 2 связывающих участка, а на сорбенте доступны около 60% (принимая за 100 % - 2 х 10,9 мкМ).

у«иь х

а • 5.380 ± 0,066 Ь - - 0.413 ± 0,06004 Sigma • 0,014 г - - 0,998 ■ q ■ концентрация ассоциированной МПО

• р * концентрация свободной (жидкофаэной) МПО

• Параметры и константы уравнения прямолинейной регрессии: Y = q/p. X « q, b « Касс - 1/Kd, a/b - mt

Kd ■ 2,43 ± 0,32 мкМ mt - 13,05 ± 0.70 ukM p » 0.99 ' Концентрация иммобилизованного ФН: 10,9 мкМ

Рис 3. График Скэтчарда взаимодействия МПО с иммобилизованным ФН.

Таким образом, полученный результат четко указывает на способность иммобилизованного ФН концентрировать на себе жидкофазную МПО. Следовательно в перспективе представляется возможным использование таких препаратов для истощения циркулирующей крови от экстрацел-люлярного фермента, а также от ряда других стимуляторов продукции ЛФК в системном кровотоке.

Выводы.

1. Перфузия крови через гемоконтактные препараты приводит к активации лейкоцитов крови, в результате чего запускаются специализированные клеточные системы генерации активных форм кислорода, регистрируемых методом люминолзависимой хемилюминесценции. Метод ХЛ может быть использован в качестве индикатора степени биосовместимости при разработке, создании и производстве гемоконтактных препаратов.

2. Хемилюминесцентная активность исследуемых проб зависит от индивидуальной реактивности донора крови, от химической природы самого носителя, от структуры активного ли-ганда, модифицирующего гемосорбент и от условий проведения гемоконтактной процедуры (в цельной крови или бессывороточной среде).

3. Гемоперфузия через Агарозу-4Б на фоне постоянной инфузии супероксиддисмутазы характеризуется более низким свечением активироваппых клеток во все временные интервалы сорбциошгой процедуры у морских свинок in vivo. Гемоперфузия через Агарозу 4Б на фоне введения церулоплазмина приводит к снижению индекса хемилюминесцешпш только в пробах крови, полученных непосредственно после колонок с Агарозой-4Б.

4. Контакт нейтрофильпых лейкоцитов с гранулами Агарозы-4Б и угольного гемосорбента СКТ-6А-ВЧ запускает NADPH-оксидазную и миелопероксидазную системы продукции активных форм кислорода в клетках. Количество образованного при контакте гипохлорита на обоих сорбентах приблизительно одинаково, в тоже время как продукция супероксидного анион-радикала на Лгарозе-4Б в 10 раз превышает его образование на гранулах активированного угля СКТ-6А-ВЧ.

5. Твердофазный фибронектин, иммобилизванный на Агарозе-4Б, обладает выраженным аффинитетом к миелопероксидазе и концентрирует на себе жидкофазный фермент с константой диссоциации равной 2,43 мкМ.

Рекомендации по использованию научных выводов.

1. При проведении эфферентных методов лечения, в частности гемосорбции, необходимо осуществлять проверку индивидуальной чувствительности больного к гемоконтактным препаратам, что может быть сделано путем предварительного учета люминозависимой хемилюминес-ценции лейкоцитов его крови в пробах in vitro.

2. При повышенной чувствительности больного к гемоконтактным препаратам и в случае пгаер-продукции активных форм кислорода на гемоперфузию, необходимо данную процедуру проводить «под прикрытием» антиоксидантов.

3. В качестве антиоксидантов могут быть использованы как супероксиддисмутза, так и церуло-плазмин.

4. Специфичность антиоксидантного «прикрытия» необходимо выбирать с учетом спектра образующихся при конкретной гемопсрфузии активных производных кислорода.

5. Селективный сорбент фибронектин-агароза может быть включен в качестве компонента в общий сорбционный блок для удаления из циркуляции экстрацеллюлярной миелопероксидазы -продуцента наиболее агрессивных производных кислорода в очаге воспаления.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Кузнецов СИ., Янковский О.Ю., Буркова Н.В., Эйсмонт Ю.А.. Рынцын О.В., Чури-лова И.В., Канаев ПА, Болдырев А.Г., Тюкавин А.И. Продукция активных форм

кислорода (АФК) лейкоцитами как интегральный показатель биосовместимости ге-мосорбентов. // Эфферентная терапия, том 3, №2,1997, с. 46 - 50.

2. Янковский О.Ю., Кузнецов СИ., Рынцын О.В., Буркова Н.В., Эйсмопт Ю.А.. Канаев П. А., Тюкавин А.И. Способ проведения гемосорбции. // Патент № 2137598. Приоритет от 14.02.1997 г. Опубликован 20.09.99 г. Бюл. № 26.

3. Янковский О.Ю., Кузнецов СИ., Рынцын О.В., Буркова Н.В., Эйсмонт Ю.А.. Канаев ПА, Тюкавип А.И. Способ оценки индивидуальной чувствительности больных к ге-моконтактным препаратам для гемосорбционных процедур. // Патент № 2122734. Приоритет от 14.02.1997 г. Опубликован 27.11.98 г. Бюл. № 33.

4. Кузнецов СИ., Тюкавин А.И., Буркова Н.В., Эйсмонт ЮА. Крецер И.В., Канаев ПА Реакции органного и тканевого кровотока на гемоперфузию через сорбенты. // Эфферентная терапия, 1999. - т.5, №3.- с. 27 - 32.

5. Эйсмонт ЮА. Кузнецов СИ., Буркова Н.В., Янковский О.Ю. Снижение уровня активных форм кислорода при гемоперфузии на фоне введения церулоплазмина. // Конф.'Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". - СПб, 2001.- С.179- 181.

6. Кузнецов СИ., Буркова Н.В., Эйсмонт ЮА, Тюкавин А.И. Способ улучшения кровоснабжения тканей. // Патент № 2203098. Приоритет от 19.11.2001 г. Зарегистрирован 27.04.2003 г.

7. Янковский О.Ю., Эйсмонт ЮА Гидроксильный радикал — продукт и потенциаль-. ный эффектор кислород-зависимой антимикробной системы лейкоцитов. // Вестник

СП6ТУ, Сер. 3,2003, вып. 2.(№ 11), с. 98 -102.

Отпечатано в ООО «АкадемПринт». С-Пб. ул. Миллионная, 19 Тел.: 315-11-41. Подписано в печать 08.04.04. Тираж 100 экз.

•-8022

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Эйсмонт, Юрий Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1: АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА (АФК). СИНТЕЗ,

ИНАКТИВАЦИЯ И ГЕМОСОРБЦИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

Супероксидный радикал (Ог") и его генератор (NADPH - оксидаза)

Миелопероксидаза (МПО).

Механизм каталитического действия МПО.

ОСГ- ключевой эффектор биоцидного действия МПО.

Индуцибельная NO-синтаза лейкоцитов.

Лактоферрин (ЛФ) как потенциальный генератор НО\.

Деструктивная роль АФК лейкоцитов при воспалении.

Молекулярные основы повреждающего действия АФК.

Окисление липидов в биомембранах под действием

АФК лейкоцитов.

Окислительная модификация белков под действием АФК.

АФК как редокс-модуляторы функций клеток и компонентов гуморальных систем.

Редокс-факторы - модуляторы клеточных функций.

АФК - модификаторы гуморальных факторов воспаления.

АФК и апоптоз.

Участие АФК нейтрофилов в патологии,.

Система антиоксидантной защиты организма.

Индукция АФК при эфферентных методах лечения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Общая структура работы.

2.2. Природа гемосорбентов.

2.3. Постановка экспериментов in vitro и учет активных форм кислорода (АФК) in vitro и in vivo.

2.4. Гемоперфузия в экспериментах на животных.

2.5. Гемоперфузия на фоне супероксиддисмутазы.

2.6. Гемоперфузия на фоне церулоплазмина.

2.7. Определение общего количества лейкоцитов крови.

2.8. Определение ОСП выделяемого нейтрофилами крови человека при контакте с гемосорбентами.

2.9. Определение продукции супероксид - анион радикала выделяемого нейтрофилами крови человека при контакте с гемосорбентами.

2.10. Рециркулирующая система для изучения связывания МТГО с ФН-агарозой.

2.11. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ИНДУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ СОРБЕНТОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ В СТЕНДОВЫХ УСЛОВИЯХ.

3.1. Реактивность нейтрофильных лейкоцитов, выделенных на градиенте плотности.

3.2. Реакция клеточных элементов цельной крови на контакт с сорбционными препаратами in vitro.

3.3. Оценка индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам для гемосорбционных процедур.

ГЛАВА 4.СПОСОБНОСТЬ СОРБЕНТОВ ИНДУЦИРОВАТЬ ГЕНЕРАЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА (АФК) IN VIVO.

4.1. Индукция АФК лейкоцитами крови морских свинок при гемоперфузии через различные сорбенты.

4.2. Изменение динамики лейкоцитарного пула крови морских свинок в процессе гемоперфузии.

ГЛАВА 5.ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА ПРОЦЕССЫ ГЕНЕРАЦИИ

АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ ГЕМОПЕРФУЗИИ IN VIVO.

5.1. Супероксиддисмутаза (СОД) как антиоксидантный препарат при эфферентной гемокоррекции.

5.2. Церулоплазмин как антиоксидантный препарат при эфферентной гемокоррекции.

ГЛАВА 6. СОРБЕНТ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ МПО.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активация кислородзависимой биоцидной системы нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами"

Актуальность работы. Среди используемых в настоящее время экстракорпоральных методов детоксикации важное место занимает гемосорбция (Лопухин Ю.М. и соавт., 1995; Картель Н.Т., 1998; Ветров В.В., 1999; Беляков Н. А. и соавт., 2000). По мере совершенствования аппаратного оснащения стационаров и поликлинических отделений эфферентной терапии и более широкого внедрения в клиническую практику прогрессивных технологий, таких как различные варианты селективных сорбций (иммуносорбция, аффинная сорбция и др.) или стемаферез, методы экстракорпорального воздействия на организм вообще и гемосорбционные технологии в частности будут являться неотъемлемой составляющей арсенала современных методов лечения (Покровский С.Н., 2003; Адамов И.Ю. и соавт., 2003; Костюченко А.Л., 2003). Лечебное действие гемосорбции обусловлено двумя эффектами - элиминацией токсических продуктов и неспецифическим воздействием гемо-контактной процедуры, которая является пусковым моментом для активации гуморальных систем плазмы и клеточных элементов крови (Кулаев Д.В., 1995, Кузнецов СМ., 1998, Кузнецов С.И., 2003). Взаимодействие сорбентов различной химической структуры с кровью как с уникальной биологической средой вызывает характерные сдвиги в самой крови. В частности, гемосорбция является мощным активатором нейтрофильных лейкоцитов (Якубовская Р.И. и соавт., 1993). Нейтрофильные лейкоциты как эффекторные клетки острого воспаления первыми поступают в зону поражения и осуществляют свою функцию ранее других типов защитных клеток. Авангардная роль ней-трофилов в уничтожении инфицирующих микроорганизмов (патогенов) во многом обусловлена их оснащенностью наиболее мощными биоцидными факторами, среди которых доминируют специализированные генераторы активных форм кислорода (АФК): NADPH-oксидаза и миелопероксидаза (МПО). Эффективность микробоцидного действия нейтрофилов обеспечивается их кооперацией с гуморальными факторами крови при ведущей роли опсонических белков - фибронектин, иммуноглобулины и др. Именно нейтрофилы одни из первых реагируют при контакте крови с гемосорбентом, запуская свои основные генераторы АФК - NADPH-оксидазу и миелоперокси-дазу (МПО). Включение при взаимодействии крови с гемоконтактными препаратами кислородзависимых биоцидных механизмов гранулоцитов с наработкой АФК может иметь как позитивные, так и негативные последствия для больного. Все зависит от общего антиоксидантного статуса, т.е. от баланса про- и антиоксидантов всех уровней. При гиперпродукции АФК лейкоцитами крови вследствие гемоконтактной процедуры суммарный антиоксидантный статус будет сдвигаться в сторону усиления окислительных процессов. В данном случае процедуру гемоперфузии через сорбенты необходимо проводить «под прикрытием» антиоксидантов (СОД, церулоплазмин) либо использовать комбинированные гемосорбенты, составной частью которых являются препараты специфически фиксирующие макромолекулы - продуценты АФК (экстрацеллюлярная МПО) или стимуляторы АФК — продукции нейтрофиль-ными гранулоцитами. При отсутствии гиперпродукции АФК, образующиеся активные производные кислорода могут играть позитивную роль, принимая участие в редокс - регуляции клеточных функций (Янковский О.Ю., Слепен-ков С.В., 1995; Зенков Н.К. и соавт:, 2001).

Цель исследования. Показать наличие активации нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами медицинского назначения через индукцию специализированных кислородзависимых биоцидных систем, а так же предложить способ воздействия на контактную гиперпродукцию активных форм кислорода путем введения антиоксидантов во время гемоперфузии либо используя селективные гемосорбенты для удаления экстрацел-люлярных кислородмодифицирующих систем.

Задачи исследования:

2. Оценить влияние антиоксидантов (супероксиддисмутаза и це-рулоплазмин) на изменение количества активных форм кислорода при гемоперфузии.

3. Проанализировать количественное соотношение наработки супероксидного радикала и гипохлорита при контакте нейтро-филов с гемосорбентами.

4. Охарактеризовать специфические свойства сорбента фибро-нектин-агароза для связывания экстрацеллюлярной миелопе-роксидазы.

Научная новизна.

Впервые проведена всесторонняя оценка влияния различных гемосорбентов на генерацию АФК лейкоцитами крови при контакте с ними как в стендовых условиях, так и в экспериментах на животных. Показана индуктивная активность сорбентов в цельной крови и в безсывороточной среде, которая зависит от их химической структуры. На основании полученных результатов предложен способ определения биосовместимости гемосорбентов с учетом индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам (Патент РФ №2122734, 1998).

Впервые выполнены исследования по количественной оценке продуктов активации NADPH-оксидазной и миелопероксидазной систем нейтрофи-лов при их контакте с гемосорбентами.

Охарактеризованы селективные сорбционные свойства иммобилизованного на агарозу 4Б ФН в отношении жидкофазной МПО. Высказано предположение о возможности использования сорбента ФН — агароза для элиминации экстрацеллюлярной МПО - источника реактивных производных кислорода (гипогалоидов и свободных радикалов).

Теоретическое и практическое значение работы. Работа является экспериментальным исследованием, которое вносит вклад в изучение прикладной научной проблемы связанной с исследованием биосовместимости гемоконтактных материалов медицинского назначения. Работа расширяет теоретические представления об участии нейтрофильных лейкоцитов крови в запуске кислородмодифицирующих систем клетки в возможном создании дисбаланса в системе антиоксиданты - прооксиданты в сторону последних на уровне целостного организма при гемоконтактной процедуре. С теоретических позиций проведенные в работе эксперименты in vivo могут служить основой при создании экспериментальной модели для изучения синдрома системного ответа на воспаление (Systemic Inflamatory Response Syndrome -SIRS) и компенсаторного ответа организма на генерализованное воспаление (Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome - CARS). Результаты исследования расширяют представления о генезе процессов, разворачивающихся в результате гемоконтактной процедуры на поверхности сорбентов и в перфузируемой крови и связанных с активацией кислородзависимых био-цидных систем нейтрофильных лейкоцитов. В работе проанализирован спектр и количественные характеристики активных производных кислорода, что дает возможность предполагать появление определенных интермедиатов кислорода при гемоперфузии через различные виды гемосорбентов и целенаправленно воздействовать на них в случае гиперпродукции.

С точки зрения практической значимости в работе предложено два варианта проведения гемоперфузии с целью снижения негативных последствий гиперпродукции АФК. Во-первых, это проведение гемосорбции на фоне постоянного введения антиоксидантов - супероксиддисмутазы и церулоплаз-мина. Второе, — предложено использование селективного гемосорбента фиб-ронектин — агароза, который специфически связывает и удаляет из циркуляции экстрацеллюлярную МПО — продуцента одного из наиболее агрессивных интермедиатов - НОС1.

Выполненное исследование позволит разработать оптимальные схемы проведения гемосорбции с учетом общего антиоксидантного статуса больного.

Основные положения выносимые на защиту.

2. Проведение гемоперфузии у животных на фоне постоянного введения антиоксидантов (супероксидцисмутаза и церулоплазмин) приводит к снижению люминол-зависимой хемилюминесценции крови, что более выражено при инфузии супероксиддисмутазы

3. Взаимодействие нейтрофильных лейкоцитов с гранулами сорбентов сопровождается активацией кислородзависимых биоцидных систем клеток (NADPH - оксидазы и миелопероксидазы), степень выраженности которой связана с химической структурой гранул.

4. Селективный сорбент фибронектин - агароза специфически связывает экстрацеллюлярную миелопероксидазу.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на:

Научной конференции в честь 280-летия 1ВМКГ «Актуальные проблемы военно-морской и клинической медицины», - СПб, 1995; I Всероссийском Конгрессе по патофизиологии, - М., 1996; Ш Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов, - СПб, 1996; Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты», - СПб, 1999; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», - СПб, 2001; Научной конференции «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге -2001», - СПб, 2001; Научной конференции «Механизмы типовых патологических процессов», -СПб, 2003.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на 139 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, из 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и рекомендаций по использованию научных выводов. Библиография включает 251 источников, из которых 42 отечественных и 209 зарубежных. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 5 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Эйсмонт, Юрий Александрович

ВЫВОДЫ.

1. Перфузия крови через гемоконтактные препараты приводит к активации лейкоцитов крови, в результате чего запускаются специализированные клеточные системы генерации активных форм кислорода, регистрируемые методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Метод ХЛ может быть использован в качестве индикатора степени биосовместимости при разработке, создании и производстве гемоконтактных препаратов.

2. Хемилюминесцентная активность исследуемых проб зависит от индивидуальной реактивности донора крови, от химической природы самого носителя, от структуры активного лиганда, модифицирующего гемо-сорбент и от условий проведения гемоконтактной процедуры (в цельной крови или безсывороточной среде).

3. Гемоперфузия через Агарозу-4Б на фоне постоянной инфузии супероксиддисмутазы характеризуется более низким свечением активированных клеток во все временные интервалы сорбционной процедуры у морских свинок in vivo. Гемоперфузия через Агарозу 4Б на фоне введения церулоплазмина приводит к снижению индекса хемилюминесценции только в пробах крови, полученных непосредственно после колонок с Агарозой-4Б.

4. Контакт нейтрофильных лейкоцитов с гранулами Агарозы-4Б и угольного гемосорбента СКТ-6А-ВЧ запускает NADPH-оксидазную и мие-лопероксидазную системы продукции активных форм кислорода в клетках. Количество образованного при контакте гипохлорита на обоих сорбентах приблизительно одинаково, в тоже время как продукция супероксидного анион-радикала на Агарозе-4Б в 10 раз превышает его образование на гранулах активированного угля СКТ-6А-ВЧ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

1. При проведении эфферентных методов лечения, в частности гемосорбции, необходимо осуществлять проверку индивидуальной чувствительности больного к гемоконтактным препаратам, что может быть сделано путем предварительного учета люминозависимой хемилюминесценции лейкоцитов его крови в пробах in vitro.

2. При повышенной чувствительности больного к гемоконтактным препаратам и в случае гиперпродукции активных форм кислорода на гемоперфу-зию, необходимо данную процедуру проводить «под прикрытием» антиоксидантов.

3. В качестве антиоксидантов могут быть использованы как супероксиддис-мутза, так и церулоплазмин.

4. Специфичность антиоксидантного «прикрытия» необходимо выбирать с учетом спектра образующихся при конкретной гемоперфузии активных производных кислорода.

5. Селективный сорбент фибронектин-агароза может быть включен в качестве компонента в общий сорбционный блок для удаления из циркуляции экстрацеллюлярной миелопероксидазы — продуцента наиболее агрессивных производных кислорода в очаге воспаления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Экстракорпоральное кровообращение (независимо от вида проводимых при этом эфферентных процедур) инициирует развитие в организме генерализованного воспаления (whole body inflammation) или системного воспалительного ответа (whole body inflammatory response), который обусловлен образованием гуморальных и клеточных провоспалительных субстанций в ответ на контакт крови с ксеногенными материалами экстракорпоральных устройств [Wachtfogel Y.T. et al., 1993; Boeken U. Et al., 1998]. Следует отметить, что системное воспаление развивается не только и не столько при экстракорпоральном кровообращении, но оно наиболее выражено при ряде тяжелых патологий, таких как тяжелая травма (механическая, термическая), тяжелая инфекция (сепсис), критическая ишемия, панкреатит, шок и др. [Boeken U et al., 1998]. Механизмы, ответственные за развитие генерализованного воспаления, общие при любых патологических состояниях и реализуются прежде всего через активацию гуморальных и клеточных систем крови и сосудистого русла. Эти общие закономерности позволили в 1992 году на Чикагской конференции обозначить данное состояние как синдром системного воспалительного ответа (Systemic Inflammatory Response Syndrome — SIRS), на который, во избежании запредельного неконтролируемого системного воспаления, развивается компенсаторная реакция организма с преобладающим синтезом и секрецией в кровоток противовоспалительных субстанций (Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome - CARS). Тем не менее, синдром системного генерализованного воспаления постоянно присутствует и анализируется в работах, посвященных экстракорпоральному крообращению, в частности, при хирургических операциях на открытом сердце [Butler J. Et al., 1993; Engelman R. Et al., 1995; Boeken U. Et al., 1998; Baufreton C. Et al., 1999].

По сравнению с другими методами экстракорпорального воздействия на организм в плане индукции генерализованного воспаления, гемоперфузия крови через сорбенты должна обладать более выраженным эффектом, т.к. используемые для гемосорбции препараты обладают сильно развитой поверхностью и большой площадью контакта с клетками крови и компонентами ее гуморальных систем. По мнению Y.T. Wachtfogel и соавт. (1993) именно индукция системы белков контактной активации, которая является триг-герным моментом в запуске генерализованного воспаления, остается одним из основных препятствий широкого использования гемосорбентов в клинической практике. Процесс начинается с активации фактора Хагемана (XII) в результате контакта плазмы крови с чужеродной поверхностью гемосорбентов, что приводит к запуску ферментативного катализа во всех каскадных системах плазмы (свертывающая система, система фибринолиза, система комплемента, калликреин-кининовая система) [Маянский Д.Н., 1991]. Результатом активации каскадных систем является образование большого разнообразия промежуточных и конечных биоактивных молекул, которые через активацию клеток крови и сосудистого русла, приводят к образованию и синтезу физиологически активных соединений следующей очереди, а так же непосредственно способны осуществить сдвиги во внутренней среде организма в сторону развития признаков, характерных для генерализованного воспаления. Активация клеток иммунной системы и системы мононуклеарных фагоцитов сопровождается изменением баланса информационных макромолекул цитокиновой сети, включающей цитокины и ростовые факторы, в сторону провоспалительных компонентов. Показано, что во время и после завершения процедуры экстракорпорального кровообщения возрастают уровни IL-6, IL-8 [Hennein Н.А. et al., 1994], IL-1 [Стасюк E.A. и соавт., 1988; Кетлинский С.А. и соавт., 1991], у-интерфеона [Кузнецов С.И. и соавт., 1995]. Наряду с развитием дисбаланса в системе цитокинов и ростовых факторов происходят количественные и качественные изменения в других группах сигнальных молекул - нейротрансмиттерах, гормонах, аутокоидах, которые обладают ауто-, пара-, и эндокринным действием, что в конечном итоге может привести и в определенной ситуации приводит к генерализации процесса.

Экстракорпоральное кровообращение может вызвать процесс активации клеток крови не только опосредовано, через лиганд - рецепторное взаимодействие продуктов активированных гуморальных систем с клетками, но и но и непосредственно в результате контакта клеток крови с чужеродной поверхностью экстракорпоральных устройств (при гемосорбции - с гранулами сорбентов различной химической структуры, что очевидно будет определять специфичность и силу реакции).

В данной работе основное внимание было уделено оценке реактивности лейкоцитов крови, в частности нейтрофильных гранулоцитов, как популяции клеток, обладающих биоцидной функцией. Роль нейтрофилов в уничтожении патогенов во многом обусловлена их оснащенностью мощными биоцидными факторами, среди которых доминируют специализированные генераторы активных форм кислорода - NADPH-оксидаза и миелоперокси-даза (МПО). Эффективность действия нейтрофилов обеспечивается их кооперацией с гуморальными факторами крови при ведущей роли опсонических белков - фибронектин, иммуноглобулины и др. При контакте крови с гемо-сорбентом нейтрофилы реагируют стереотипным образом, запуская свои основные генераторы АФК - NADPH-оксидазу и миелопероксидазу. Стереотипность ответа нейтрофильных лейкоцитов путем индукции генерации АФК показана и при других видах эфферентной терапии с использованием экстракорпоральных устройств. Так проведение гемодиализа на аппарате «искусственная почка» приводит к накоплению в плазме крови (фракция липопротеи-дов) и мембранах эритроцитов продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Кубатиев А.А. и соавт., 1994]. Измерение напрямую АФК методом люминол-зависимой хемилюминесценции при гемодиализе с использованием купрофановой и полисульфоновой диализных мембран привело к регистрации аналогичных результатов. Причем выраженность лейкопении и хемилюминесценции клеток зависела от химической структуры мембран (реакция на купрофановую мембрану значительно выше, чем на полисульфоновую) [Rosenkhanz A.R. et al., 1994]. В наших исследованиях активация лейкоцитов при их контакте с гранулами сорбентов также зависела от химической структуры самой матрицы, иммобилизованных на ней активных лигандов и от потенциальной способности лейкоцитов к генерации АФК. На регистрацию АФК методом люКшнол-зависимой ХЛ существенное влияние оказывает эффективность нейтрализации продуктов "дыхательного взрыва" клеток сорбентами. Очевидно при гемоконтактной процедуре генерируемые лейкоцитами АФК будут участвовать в общем ансамбле биоактивных молекул различных классов, приводящих к нарушению гомеостаза и развитию системного воспаления, и сдвигать баланс окислительно-восстановительных реакций в сторону прооксидантов.

До недавнего времени АФК рассматривали как негативный фактор, приводящий к усилению процессов перекисного окисления биомолекул (липидов, белков, ДНК и др.) и требующий обязательного ингибирования наработки свободных радикалов как в норме, так и при патологических состояниях [Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И., 1985]. Однако, в последнее время появились факты, которые свидетельствуют о возможности модуляции функции клеток по окисительно-восстановительному принципу, то есть о ре-докс-регуляции клеточных функций [Зенков Н.К. и соавт., 1993; Янковский О.Ю., Слепенков С.В., 1995; Янковский О.Ю., 2000; Зенков Н.К. и соавт., 2001]. Степень выраженности ответной реакции организма на АФК зависит от их количества, которое образуется в результате того или иного воздействия либо заболевания.

Проведение гемосорбционной терапии в 20% случаев сопровождается развитием характерных осложнений, среди которых наиболее часто встречаются: коллаптоидные реакции, озноб, нарушение свертывающей системы крови, рекоматозное состояние [Лопухин Ю.М., 1985]. Очевидно, в развитие таких осложнений определенный вклад наряду с другими факторами вносят и активные производные кислорода в случае их гиперпродукции. По результатам проведенных исследований предложен способ предварительной оценки индивидуальной чувствительности лейкоцитов больного к гемоконтактному препарату, который предполагается использовать для лечебных целей. Проведение предварительной оценки индивидуальной биосовместимости больного с конкретным гемосорбентом, который планируется для проведения лечебных мероприятий, снизит количество осложнений, связанных с процедурой гемосорбции.

В работе освещен ряд принципиальных положений, которые в дальнейшем могут быть использованы в клинической практике. Во-первых, доказано, что гемоконтактная процедура с сорбентами запускает процесс генерации АФК in vivo и in vitro, степень выраженности которого зависит от химической структуры сорбционного препарата, условий проведения эксперимента и индивидуальной реактивности клеток крови донора. Практическая реализация данного положения - предварительная оценка in vitro биосовместимости конкретного больного с назначенным гемосорбционным препаратом. Во-вторых, анализ спектра активных производных кислорода, образующихся в результате контакта клеток крови с гемосорбентами, свидетельствует о возможности запуска преимущественно того или иного кислородзависимого пути активации клеток. В случае гиперпродукции АФК это дает основание назначать препараты выбора (антиоксиданты) для нейтрализации АФК при эфферентных методах лечения, а так же при различных патологических процессах и состояниях с патогенетических позиций. Гемоперфузия через сорбенты на фоне инфузии СОД характеризуется более низким свечением активированных клеток во все временные интервалы сорбционной процедуры in vivo. Гемоперфузия на фоне введения ЦП приводит к снижению индекса XJI только в пробах крови, полученных непосредственно после колонок с сорбентами. Данное положение практически реализовано через предложенный способ проведения гемосорбции на фоне постоянной инфузии антиоксидантных препаратов [Патент РФ №2137508,1999].

В-третьих, полученные результаты проведенных исследований четко указывают на способность иммобилизованного ФН концентрировать на себе жидкофазную МПО. Следовательно, в перспективе представляется возможным использование таких препаратов для истощения циркулирующей крови от экстрацеллюлярного фермента, а также от ряда других стимуляторов продукции АФК в системном кровотоке.

В четвертых, теоретические предпосылки и практические результаты работы позволяют высказать предположение о возможности использования АФК, получаемых в результате гемоконтактной процедуры (при отсутствии их гиперпродукции), как активных регуляторов физиологических функций и морфогенеза. Правомерность таких представлений подтверждена патентами РФ №2203098 от 19.11.2001 года и №2210391 от 08.02.2002 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Эйсмонт, Юрий Александрович, Санкт-Петербург

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные средства. — Л.: Наука, 1985. —230 с.

2. Адамов И.Ю., Афанасьева О.И., Кузнецова Ю.В. и др. Эффективность удаления патогенных компонентов в процедурах иммуносорбции. // Эфферентная терапия. 2003. - Т.9, №1. - с.51.

3. Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А,Г., Алешкина Т.Н. Белки острой фазы и их клиническое значение // Клин. мед. — 1988. Т.66, № 8. - С.39-48.

4. Аратюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободно-радикального окисления и антиоксидантной системы организма. (Методические рекомендации). // под ред. чл.-корр. РАМН Хавинсона В.Х., СПб. -2000. -103 с.

5. Беляков Н.А., Гуревич К.Я., Константинов Ю.В., Серков В.Ф., Кулаева Н.Н., Абдурахимов С.М. 5-летие курса эфферентной терапии открытие кафедры нефрологии и эфферентной терапии // Эфферентная терапия. - 2000 -Т.6, №1. - С. 8-17.

6. Васильев В.Б. Связь функций церулоплазмина со строением его медьсодержащих центров: Автореф. дисс. докт. СПб,НИИЭМ РАМН - 1996.

7. Ветров В.В. Экстракорпоральная гемокоррекция в акушерстве // Эфферентная терапия 1999. - Т.5, №3. - С. 21-26.

8. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. Биофизика (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., Т.29,1991,252с.

9. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. — М.: Медицина, 1985,240с.

10. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. // МАНК «Наука / Интерпериодика». — 2001. 343с.

11. И. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шегин С.М. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика. // Новосибирск. 1993. - 181с.

12. Картель Н.Т. Биосовместимость углеродных гемосорбентов // Эфферентная терапия 1998.- Т.4, №4 - С. 3-9.

13. Костюченко Э.А. Эфферентная терапия. // СПб: ООО «Издательство фолиант». 2003. - 432с.

14. Кубатиев А.А., Рудько И.А., Балашов Т.С., Ермоленко В.Н. Влияние диализных мембран на перекисное окисление липидов в эритроцитах больных терминальной почечной недостаточностью. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1994. - Т. CXVIII, №11.- с.460-462.

15. Кузнецов СЛ. Эффекторные механизмы гемоперфузии. // Эфферентная терапия, 1998. Т.4, №4. - С. 28-31.

16. Кузнецов СЛ., Канаев П.А., Аксенов О.А., Блинов Н.П. Способ индукции синтеза интерферона (его варианты). // Заявка на патент № 95111987, приоритет от 11.07.1995 г.

17. Кулаев Д.В. Специфическая гемосорбция. Кинетика и физиологические эффекты // Вестник РАМН. 1995. - №3. - С.59-63.

18. Кулинский В.И., Колеснеченко Л.С. Биологическая роль глютатиона // Успехи соврем, биол. 1990. - Т.110, вып.1. - С.20-33.

19. Лопухин Ю.М. Эфферентная терапия. К выходу первого номера журнала // Эфферентная терапия. 1995. - Т.1, №1. - С. 5-7.

20. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н. Гемосорбция. — М.: Медицина. -1985. -287 с.

21. Лопухин Ю.М., Парфенов А.С., Кунаев Д.В. Анализ механизмов лечебного действия гемосорбции // Эфферентная терапия. — 995. Т.1, № 1. - С. 14-18. <

22. Ляпков Б.Г., Ткачук Е.И. Тканевая гипоксия: клиникобиохимические аспекты // Вопр. мед. химии. — 1995. Т.41, № 2. - С.2-8.

23. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 344 с.

24. Маянский А.Н., Маянский Д.Н., Абаджиди М.А., Заславская М.И. Апо-птоз: начало будущего. // ЖМЭИ. 1997. - № 2. - С.88-94.

25. Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., Маянский Н.А. Проблемы управления фагоцитарными механизмами иммунитета // Ж. микроб, эпидем. и имму-нобиол. 1995. - № 3. - С.21-26.

26. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. // М.: Медицина, — 1991. — 272с.

27. Меньщикова Е.Б., Сафронов И.Д., Азбель Д.И., Зенков Н.К. Влияние УФ-облучения на метаболическую активность гранулоцитов крови человека // Вопр. мед. химии. 1991. - № 1. - С.56-58.

28. Метелица Д.Н., Арапова Г.С. Ферритин биокатализатор окисления ароматических аминов // Биохимия. - 1996. - Т.61, вып.2. - С.308-321.

29. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков B.C. Механизмы клеточной смерти: проблемы и перспективы // Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С.Новикова. СПб: Наука, 1996. - С.9-29.

30. Покровский С.Н. Сорбциониые технологии итоги и перспективы. // Эфферентная терапия. - 2003. - Т.9, №1. - с.42-46.

31. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Каюшин Л.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих и нитратредуктазная активность гемсодержа-щих белков II Вопр. мед. химии. 1995. - Т.41, № 7. - С.31-35.

32. Роговин В.В., Муравьев Р.А. Пирузян JI.A. Пероксидазосомы-83 // Изв. АН СССР. 1983. - №4. - С.510-529.

33. Стецюк Е.А., Осмоловская С.В., Ковальчук JI.B. и др. Активация моноцитов во время гемодиализа. // Тер. Архив. 1988. - №6. — с.57-60.

34. Стрелко В.В. Синтетические активные угли медицинского назначения // YII Международный симпозиум по гемосорбции: Тез. докл. — Киев, 1986.- С.6-7.

35. Турков М.Н. Супероксиддисмутаза: свойства и функции // Успехи совр. биол. 1976. - Т.18, № 3. - С.341-364.

36. Туркова Я. Аффинная хроматография. // М., 1980.

37. Шаронов Б.П., Чурилова Н.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохло-ри-том. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью // ДАН СССР. 1990. - Т.314, № 6. - С.1500-1502.

38. Якубовская Р.И., Иванова Л.М., Немцова А.П. и др. Влияние гемосор-бентов на структуру полиморфноядерных лейкоцитов человека. // Анестезиология и реаниматология. 1993. - №3. — с.55-58.

39. Янковский О.Ю., Слепенков С.В. Редокс-факторы как модуляторы клеточных функций И Вестник СПбГУ. сер.З, - 1995, вып.З, - С.78-84.

40. Янковский О.Ю., Довнар Т.Е. Роль протеиназ лейкоцитов и продуктов деградации белков в защитных реакциях//Ж.общей биол. 1985. - T.XLVI, № 1. - С.93-101.

41. Armstrong D.A., Buchanan J.D. Reaction of 02~, H2O2 and other oxidants with sulfhydryl enzymes // Photochem. Photobiol. 1978. - V.28, № 45. - P.743-755.

42. Aruoma O.I., Halliwell B. Action of hypochlorous acid on the antioxidant protective enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase 11 Biochem. J. 1987. - V.248, № 3. - P.973-976.

43. Asbeck B.S. Oxygen toxicity: role of hydrogen peroxide and iron //Antioxidants in Therapy and Preventive Medicine / Ed. by I.Emerit e.a. N.Y.: Plenum-Press, 1990. - P.235-246.

44. Babbs C.F.,Gregor MD.,Turek J.J.^Badylak S.F. Endothelial superoxide production in the isolated rat heart during early reperfusion after ischemia // Amer.J. Pathol. 1991. - V.139, № 5. - P.1069-1080.

45. Babior B.M. Production and utilization of reactive oxidants by neutrophils // Curr. Top. Cell. Regulat. 1985. - V.27. - P.327-334.

46. Babior B.M., Curnutte J.T., Okamura N. The respiratory burst oxidase of the human neutrophil // Oxygen Radicals and Tissue Injury / Ed. by B.Halliwell.- Bethesda, 1988. P. 43-48.

47. Baggiolini M., Dewald B. Regulation of Leukocyte Function. — New York, 1984. P.221-246.

48. Balazovich K.J., Almeida H.I., Boxer L.A. Recombinant human G-CSF and GM-CSF prime human neutrophils for superoxide production through different signal transduction mechanisms // J. Lab. Clin. Med. 1991. - V.l 18, №6. -P. 576-584.

49. Banci L., Carboni P., Orioli P.L. Molecular dynamics studies on mutant of CuZn superoxide dismutase: the functional role of charged residues in the electrostatic loop // Proteins. 1994. - V.18, № 3. - P.216-230.

50. Battell M.G.,Abbondanza A.,Stirpe F. Effect of histamine on xantine oxidase // Free Rad. Res.Commun. 1992. - V.16, suppl.l. - 17.16.

51. Baufreton C., Intrator L., Jansen P.G.M. et.al. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass using roller or centrifugal pumps. // Ann. Thorac. Surg. 1999. - V. 67. - P.972-977.

52. Beck-Speier J., Leuschel L., Luippold G., Maier K.L. Proteins released from stimulated neitrophils contain very high levels of oxidized methionine // FEBS Lett. 1988. - V.227, № 1. -P.l-4.

53. Black C.D.V., Samuni A., Cook J.A., Krishna C.M.,Kaufman D.C., Malech H.L., Russo A. Kinetics of superoxide production by stimulated neutrophils //Arch. Biochem. Biophys. 1991. — V.286, №. 1.-P.126-131.

54. Boeken U., Feindt P., Petzold T. et al. Diagnostic value of procalcitonin: the influence of cardiopulmonary bypass, aprotinin, SIRS, and sepsis. // Thorac. Cardiovasc. Surg. 1998. - V. 46. - P.348-351.

55. Bokoch G.M., Knaus U.G. The role of small GTP-binding proteins in leukocyte function // Curr.Opinion.Immunol. 1994. - V.6, № 1. - P.98-105.

56. Bolann B. J., Ulvic R.J. Decay of superoxide catalyzed by ferritin // FEBS Lett. 1993. - V.318, № 2. - P.149-152.

57. Boxer L. A., Allen J. M., Baehner R. L. Potentiation of polimorphnonuclear leukocyte motile function by 2,3-dihydroxybenzoic asid. // J. Lab. and Clin. Med. 1978. - V. 92, №5. - P.730-736.

58. Britigan B.E., Edeker B.L. Pseudomonas and neutrophil products modify transferrin and lactoferrin to create conditions that favor hydroxyl radical formation // J. Clin. Invest. 1991. - V.88. - P.1092 - 1102.

59. Brot N. Weissbach H. Biochemistry and physiological role of methionine sulfoxide residues in protein // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - V.223, № 1. -P.271 -281.

60. Bullen J.J., Armstrong J.A. Ths role of lactoferrin in the bactericidal function of polymoi phonuclear leukocytes. // Immu№logy. —1979. V.36, № 4. -P.781 - 791.

61. Butler J., Rocker G.M., Westaby S. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. // Ann. Thorac. Surg. -1993. V. 55. -P.552-559.

62. Chance B. Enzyme substrate compounds // Adv. Enzyr№l. —1951. — V.12. -P. 153 -190.

63. Chatham W.W., Blackburn W.D., Heck L.W. Additive enhancement of neu-trophyl collagenase activity by HOC1 and cathepsin G // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992. - V.184, №.2. - P.560 - 567.

64. Chen A.M., Skochdopole J., Koski N, Cole L. №nvolative mutagens in drinking water: production by chlorination and destruction by sulfite. // Science. 1980. -V. 207. - P.90 - 92.

65. Clark R.A., Klebanoff S.J. Myeloperoxidase H2O2 - halide system: cytotoxic effect on human blood leukocytes. // Blood. - 1977. - V.50, № 1.1. Р.65- 70.

66. Clark R.A., Klebanoff S.J. Neutrophil-platelet interaction mediated by mye-loperoxydase and hydrogen peroxydase. // J. Immunol. 1980. V. 124, №1. - P.399-405.

67. Cross A.R. Inhibitors of the leukocyte superoxide generating oxidase: mechanisms of action and methods for their elucidation // Free Radical Biol. Med. 1990. - V.8, № I - P.71 - 93.

68. Crowford D.R., Schneider D.L. Identification of ubiquinone 50 in human neutrophils and its role in microbicidal events // J.Biol.Chem. - 1982. -V.257, № 12. - P.6662 - 6668.

69. Csermely P., Sander P., Radies D., Somogyi J. Zinc forms complexes with higher kinetical stability than calcium, 5F BAPTA as a good example // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1989. - V.65, № 2. - P.838 - 844.

70. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects // J. Biol. Chem. 1987. - V.262, № 20. - P.9895 - 9901.

71. Davies К J. A. Protein modification by oxidants and the role of proteolytic enzymes // Biochem. Soc. Transact. 1993. - V.21. - P.346 - 353.

72. Davies K.J.A., Delsignore M.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. П1. Modification of secondary and tertiary structure // J. Biol.

73. Chem. 1987, - V.262, № 20. - P.9908 - 9913.

74. Davies К. J A., Delsignore M.E., Lin S.W. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of aminoacids // J. Biol. Chem. 1987. - V.262, № 20. - P.9902 - 9907.

75. Davies K.J.A., Fu S., Dean R. T. Protein hydroperoxides give rise to reactive free radicals // Biochem. J. 1995. - V.305, №2. - P.643 - 649.

76. Davies K.J.A., Lin S.W., Pacifici R.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein // J. Biol. Chem. -1987. V.262, № 20. - P.9914 - 9920.

77. Davies K.J.A., Ranjadayalan K., Wickens D. G., Dormandy T.L., Timmis A.D. Lipid peroxidation associated with successful thrombolysis // Lancet. -1990. V.335. - P. 741 - 743.

78. DeForge L.I., Preston A.M., Takeuchi E. et.al. Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress. // J. Biol.Chem. 1993. — V.268, №32. -P.25565-25576.

79. Dehoux-Zenou S.M., Guenounou M., Zinbi H. et.al. Behavior of aldehyde moieties involved in the activation of suppressor cells by sodium periodat. // J. Immunol. 1987. - V.138, № 4. - P. 1157-1163.

80. Doran J.E., Lundsgaard Hansen P., Rubli E. Plasma fibronectin: relevance for anesthesiology and intensive care // Intensive Саге Med. —1986. - V.12, № 5. - P.340 — 349.

81. Downey J.M., Omar В., Ooiwa H., McCord J. SOD therapy for myocardial ischemia // Free Rad. Res. Commun. 1991. - V. 12 - 13, № 2. - P. 703 -720.

82. Drozdz R., Naskalski J.W. Sznajd J. Oxidation of amino acids and peptides of reaction with MPO, chloride and hydrogen peroxide // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V.957. - P. 47 - 52.

83. Dubinina E.E., Babenko G.A., Scherbak I.G. Molecular heterogeneity of plasma superoxide dismutase // Free Radical Biol. Med. 1992. - V.l 13, № l.-P. 1-7.

84. Dunford H.B., Stillman T.S. On the function and mechanism action of peroxidases // Coord. Chem. Rev. -1976. V. 19. - P. 187 - 251.

85. Eaton J.W., Kolpin G.F., Swofford H.S. Chlorinated urban water: a cause of dialysis hemolytic anemia // Science. 1973. - V.181. - P. 463 - 464.

86. Eckle I., Kolb G., Havemann K. Inhibition of neutrophil oxidative burst by elastase generated IgG fragments // Biol. Chem. Hoppe - Seyler. - 1990. — V.371, № 1. - P. 69 - 77.

87. Eklund E.A., Gabig T.G. Purification and characterization of a lipid thiobis ester from human neutrophil cytosol that reversible deactivates the Ог~ -generating NADPH oxidase //J. Biol. Chem. 1990. - V. 265, № 15.- P. 8426-8430.

88. El-Hag A., Clark R.A. Immunosuppresion by activated human neutrophils: dependence on the myeloperoxidase system. // J. Immunol. 1987. — V. 139, №7. - P.2406-2413.

89. Engelman R., Rouson J., Flack J. et.al. Influence of steroid's on complement and cytokine generation after cardiopulmonary bypass. // Ann. Thorac. Surg. 1995. - V. 60. - P.801-804.

90. Fantone J.C., Ward P. A. Role of oxygen derived free radicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reactions // Amer. J. Pathol. -1982. - V.107, № 3. - P. 399 - 418.

91. Finazzi-Argo A., Conti P., Hoffman M. et.al. Activation of lymphocytes by H2O2. // Trends in Inflammation Research l(Proc. of the Int. Meet. Inflammation, Verona, September 24-31,1979) Basel e.a., 1980. P.220-223.

92. Fliss H., Menard M. Hypochlorous acid induced mobilization of zinc from metalloproteins //Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - V.287, №1. - P. 175 -179.

93. Foote Ch.S., Goyne Т.Е., Lehret R. Assessment of chlorination by human neutrophils // Nature. 1982. - V.301. - P.715 - 716.

94. Frei В., England L., Ames B.N Ascorbate is an outstanding antioxidant in human blood plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol.86. - P.6377-6381.

95. Fucci L., Oliver C.N., Coon M.J., Stadtman E.R. Inactivation of key metabolic enzymes by mixed function oxidation reactions: possible implication in protein turnover and aging // Proc. Nad. Acad. Sci. USA. - 1983. -V.80.№ 6. -P.1521 — 1525.

96. Gapany Grapanavidus M., Molho M., Tirosh M. Chloramine — induced pneumonities from mixing household cleaning agents // Brit. Med. J. - 1982. -V.67-P.1082-1091.

97. Gebicki S., Gebicki J.M. Formation of peroxides in amino acids and proteins exposed to oxygen free radicals // Biochem. J. 1993. - V.289, №3. - P.743 -749.

98. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Reversible oxidative activation and inactivation of protein kinase С by the mitogen / tumor promoter periodate // Arhives of Biochem. Biophys. -1991. V.285, №2. - P.382-387.

99. Gorman A.A. Singlet molecular oxygen // Chem. Soc. Rev. — 1981. V. 10, № 2. - P.205-231.

100. Greinder D.K., Rosenthal A.S. The requirement for macrophage T-lymphocyte prolipheration induced by generation of aldehydes on cell membranes. // J.Immunol. - 1975. - V.l 15, №4. - P.932-938.

101. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of the erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils // J. Biol. Chem. 1984. - V.269. - P. 6766 - 6772.

102. Gutteridge J.M.C. Iron promoters of the Fenton reaction and lipid peroxidation can be released from haemoglobin by peroxides // FEBS Lett. 1986. -V.201, № 2. -P.291 -295.

103. Gutteridge J.M.C. Lipid peroxidation: some problems and concepts // Oxygen Radicals and Tissue Injury / Ed. by B.Halliwell. — Michigan, 1988. P. 9-19.

104. Gutteridge J.M.C. The protective action of superoxide dismutase on metal -ion catalyzed peroxidation of phospholipids // Biochem. Biophys. Res. Com

105. Commun. 1977. - V.77, № 1. - P. 379 - 386.

106. Gutteridge J.M.C., Wilkins S. Copper salt dependent hydroxyl radical formation. Damage to proteins acting as antioxidants // Biochim. Biophys. Acta. - 1983. - V.758. - P. 38 - 41.

107. Halliwell B. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause, or consequence// Lancet 1994. - V.344. -P. 721 -724.

108. Halliwell B. Superoxide, iron, vascular endothelium and reperfusion injury // Free Red. Res. Commun. 1989. - V.5.№6.-P. 315 -318.

109. Halliwell В., Gutterifge J.M.C., Cross C.E. Free radicals, antioxidants and human disease: Where are we now? // J. Lab. Clin. Med. 1992. - V. 119, № 6. - P.598 - 620.

110. Halliwell В., Aruoma O.I., Wasil M., Gutteridge JM.C. The resistents of transferrin and ceruloplasmin to oxidative damage // Biochem. J. 1988. — V.256. — P.311—312.

111. Hammond В., Kontos H.A., Hess M.L. Oxygen radicals in the adult respiratory distress syndrome, in myocardial ischemia and reperfusion injury, and in cerebral vascular damage // Can. J. Physiol. 1985. - V.63, №1. - P.173 -187.

112. Handin R.I., Karabin R.s Boxer G.J. Enhancement of platelet function by superoxide anion. // J. Clin. Invest. 1977. - V.59, №5. - P.959-965.

113. Harrison J.E., Araiso Т., Palcic H.M., Danford H.B. Compound I of myeloperoxidase // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1980. - V.90, № 1. - P.31 - 40.

114. Hashinaka K., Nishio C., Hur S. J., Sakiyama F., Tsunasawa S., Yamada M. Multiple species of myeloperoxidase messenger RNAs produced by alternative splicing and differential polyadenylation // Biochemistry. 1988. - V. 27, №16.-P. 5906-5914.

115. Hayashi Y., Yamasaki I. The oxidation reduction potentials of Compound I / Compound II and Compound II / Ferric couples of horseradish peroxidases A2 ans С // J. Biol. Chem. - 1979 - V. 254, № 18. - P. 9101 - 9106.

116. Hennein H.A., Ebba H., Rodriguez J.R. Relationship of the proinflammatory cytokines to myocardial ishemia and dysfunction after uncomplicated coronary revascularization. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1994. - V.108. -P.626-635.

117. Heyworth P.G., Karnovsky M.L., Badwey J.A. Protein phosphorylation associated with synergistic stimulation of neutrophils // J. BioL Chem. 1989.- V. 264, № 25. P.14935 - 14939.

118. Hoffman M.R., Pizzo S.V., Weinberg J.B. Modulation of mouse peritoneal macrophage HLA — DR expression by a2 — macroglobuline <fast> forms // J. Immunol. 1987. - V.139, № 6. -P.1885 - 1890.

119. Hogg N., Singh R.J., Karoui H., Sharma M., Kalyanaraman B. The role of glutathione in the transport and catabolism of nitric oxide // Oxygen '95. The Ann. Meet, of Oxygen Soc. Nov.16 20, 1995. Pasadena. - 1995. - P.24 (A- 27 Abstr.).

120. Hunt J.V., Simpson J.A., Dean R.T. Hydroperoxide mediated fragmentation of proteins //Biochem. J. - 1988, - V.250, № I. - p. 87 - 93.

121. Hurst N.P. Molecular basis of activation and regulation of the respiratory burst // Annals Rheum. Diseases. -1987. V.46, № 1. - P. 265 - 272.

122. Ingham K.C., Brew S.A., Issacs B.S. Interaction of fibronectin and its gelatin- binding domains with fluorescent labelet chains of type I collagen // J. Biol. Chem. - 1988. - V. 263, № 10. - P. 4624 - 4628.

123. Ishibashi S., Okamura N., Yamagushi M. Regulation of active oxygen metabolism in neutrophils // VIII Biennial Meeting Intern. Soc. for Free Radical Research. 1 5 October 1996, Barcelona. -1996. - P.310 (310.3 Abstr.).

124. Jackett P.S., Aber V.R., Lowrie D.B. The susceptibility of strains of myco-bacterium tuberculosis to catalase mediated peroxidative killing // J. General. Microbiol. - 1980. - V.121, № 2, - P.381 - 386.

125. James P.E., Grinberg O.Y., Michaels G., Swartz H.M. Intraphagosomal oxygen in stimulated macrophages // J. Cell. Physiol. 1995. - V.163, №2. -P.241 -247.

126. Janoff A., White R;, Carp H. Lung injury induced by leukocyte proteases // Amer. J. Pathol. -1979. V.97. -P.lll -129.

127. Jones O.T.G., Jones S.A., Hancock J.T., Topley N. Composition and organization of the NADPH oxidase of phagocytes and other cells // Biochem, Soc. Transact. - 1993. - V.21. -P.343 -346.

128. Jonest P., Dunford H.B. On the mechanism of compound I formation fromperoxidases and catalases // J. Theoret. Biol. 1977. - V.69. - P.457 - 470. i

129. Kanofsky J.R., Wright J., Miles Richardson G.E., Tauber A.I. Biochemical requirements for singlet oxygen production by purified human myeloperoxidase // J. Clin. Invest. - 1984. - V.74. - P. 1489 - 1495.

130. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Superoxide enhances hypochlorous acid production by stimulated human neutrophils // Biochim. Biophys. Acta. 1990. -V.1052.-P.379-385.

131. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Superoxide modulates the activity of myeloperoxidase and optimizes the production of hypochlorous acid // Biochem. J.- 1988. V.252. - P.529 - 236.

132. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system // J.Bacteriol. 1968. - V.95. - P.2131 - 2138.

133. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: occurence and biological function // Peroxidases in Chemistry and Biology. Vol. 1 / Ed. by J. Everse. e.a. Boca Raton: CRC Press, 1991. - P.l - 35.

134. Klebanoff S.J. Oxygen metabolites from phagocytes // Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Second Edition /Ed. by J. I. Gallin e.a. -N.Y.: Raven Press Ltd., 1992. P.541 - 588.

135. Klebanoff S.J., Waltersdorph A.M. Prooxidant activity of transferrin and lac-toferrin // J. Exp. Med. 1990. - V. 172. - P. 1293 - 1303.

136. Kloner R. A., Przyklenk K., Whittaker P. Deleterions effects of oxygen radicals in ischemia / reperfusion. Resolved and unresolved issues // Circulation.- 1984. V. 80, № 5. - P. 1115.

137. Kolesnick R., Golde D.W. The sphingomyelin pathway in tumour necrosis factor and interleukin 1 signaling // Cell. - 1994. - V.77, № 33. - P.325 -328.

138. Korchak H.M. Weismann G. Changes in membrane potential of human granulocytes antecede the metabolic responses to surface stimulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V.75, № 8. - P.3818 - 3822.

139. Kortwis R.J., Granger D.H. Ischemia reperfusion injury: role of oxygen -derived free radicals // Physiology of Oxygen Derived Free Radicals / Ed. by A.E. Taylor e.a. - Bethesda, MD: Amer. Physiol. Soc., 1986. - P.217 -249.

140. Kukreja R.C., Weaver A.B., Hess M.L. Stimulated human neutrophils damage cardiac sarcoplasmic reticulum function by generation of oxidants // Biochem. Biophys. Acta. 1990. - V.990. - P.198 - 205.

141. Lander H.M., Milbank A.J., Taurus J.M., Hajjar D.P.,Hempstead B.L., Schwartz G.D., Kraemer R.T., Mirza U.A., Chait B.T., Burk S.C., Quilliam

142. A. Regulation of cell signaling // Nature. -1996. V.382, № 6581. - P.380-381.

143. Levine R.L. Covalent modification of proteins by mixed function oxidation // Curr. Topics in Cell, regulat. -1985. V.27. - P.305 - 316.

144. Lew D.P. Receptor signalling and intracellular calcium in neutrophil activation // Eur. J. Clin. Invest. 1989. - V. 19, № 2. - P.338 - 346.

145. Little C., O'Brien P.J. The effectiveness of lipid peroxide in oxidizing protein and non protein thiols // Biochem. J. - 1968. - V.106, № 2. - P.419 -423.

146. Lovstad K.A. Iron ion induced haemolysis: effect of ceruloplasmin, albumin and ascorbat (vit. C) // Int. J. Biochem. 1988. - V.15, № 8. - P.1067 -1071.

147. Lucchesi B.R. Complement, neutrophils and free radicals: mediators of reper-fusion inhury // Drug Res. 1994. - Vol.44, № За. - P.420-432.

148. Lunec J. Free-radical-mediated aggregation of human IgG stimulates neutrophils to generate superoxide radicals // Agents and Actions. 1984. - V. 15, №1/2.-P. 37-38.

149. Maier K.L., Mateikova E., Hinze H., Leuschel L., Weber H., Beck-Speier I. Different selectivities of oxidants during oxidation of methionine residues in the a-1-proteinase inhibitor // FEBS Lett. 1989. - V.250, № 3. - P.221 -226.

150. Marklund S.L. Regulation by cytokines of extracellular superoxide dismutase and other SOD isoenzymes in fibroblasts // J. Biol. Chem. 1992. -V.267, № 10. - P.6696-6701.

151. Marquez L.A., Huang J.T., Dunford H.B. Spectral and kinetic studies on the formation of myeloperoxidase Compound I and П: roles of hydrogen peroxide and superoxide // Biochemistry. -1994. V.34, № 6. -P.1447 -1454.

152. Marx G., Chevion M. Site specific modification of albumin by free radicals. Reaction with copper II and ascorbate // Biochem. J. - 1985. - V.236. -P.397 — 400.

153. Matoba Т., Kurita O., Yonezawa D., Changes in molecular size and chemical properties of gelatin caused by reaction with oxidizing methyl linoleate // Agric. Biol. Chem. 1984. - V.48, № 11. - P.2633 - 2638.

154. McCord J.M. The importance of oxidant—antioxidant balance // Oxidative Stress and Redox Regulation. Paris, 21 24 Mai, 1996. - P.7.

155. Metger Z., Hoffeld J.T., Oppenheim J.J. Suppression of fibroblast proliferation by activated macrophages: involvement of H2O2 and non-prostaglandin E product of the cyclooxygenase pathway. // Cell. Immunol. 1986. - Vol 100, № 2. - P.500-514.

156. Michaelis J., Vissers M.C.M., Winterbourn C.C. Human neutrophil colla-genase a-l-antitrypsin // Biochem. J. 1990. - V.270. - P.809 - 814.

157. Monboisse J.C., Borel J.P. Oxidative damage to collagen // Free Radicals and Aging / Ed. by I. Emerit, B. Chance Basel e.a.: Birkhauser Verlag, 1992, P.323-327.

158. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. - V.43, № 2. -P.109- 142.

159. Moore P.B. Dedman J.R. Calcium binding proteins and cellular regulation //1.fe Sci. 1982. - V.31, № 26. - P.2937 - 2946.

160. Moore R.B., Hulgan T.M., Green J.W., Jenkins L.D. Increased susceptibility of the sickle cell membrane Ca2+, Mg2+ ATPase to t - butylhydroperoxice: protective effects of ascorbate and desferal // Blood. - 1992. - V.79, № 5. -P.1334 -1341.

161. Mullane K.M. Leukocytes, free radicals and post ischemic cardiac disfunction // FASEB J. - 1988. - V.2, № 5. - P.A1267.

162. Nakamura J., Yoshida N., Yoshikawa T. et.al. Hydrogen peroxide-induced neutrophil endothelial cell interactions. // Frontiers of Reactive Oxygen Spe-sies in Biology and Medicine. // Ed. by K.Asada, T. Yoshikawa. Amsterdam e. a. 1994. -P.227-228.

163. Ohmori H., Yamamoto I., Akagi M., Tasaka K. Propeties of hydrogen peroxide-induced histamine release from rat mast cells. // Biochem. Pharmacol. 1980. — V.20, №5. - P.741-745.

164. Orrenius S., Nobel S., Dobbelsteen D., Slater A. Redox modulation of apop-tosis // Oxidative stress and redox regulation. Paris, 21 24 Mai, 1996. — P.21.

165. Petrone W.F., English D.K., Wong K., McCord J.M. Free radicals and inflammation: superoxide-dependent activation of neutrophil chemotactic factor in plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980. - V. 77, № 2. - P. 1159 -1163.

166. Piatt J., O'Brien P.J. Singlet oxygen formation by a peroxidase, H202 andhalide system // Eur. J. Biochem. 1979. - V.93, № 2. - P.323 - 332.

167. Piette J., Piret В., Bonizzi G., Merville M. P., Bours V. NF kB transcription factor activation: importance of the redox regulation // Oxidative Stress and Redox Regulation. Inst. Pasteur, Paris, May 21 -24, 1996. - P.45.

168. Poch В., Gansauge F., Gansauge S. e.a. Cytokine-release in whole blood under stimulation with oxygen radicals // Intensive Care Medicine . 1994. -V. 20, Suppl. 1. - P. 55.

169. Prasad K., Chaudhary A.K., Kalra J. Oxigen-derived free radicals producing activity and survival of activated polymorphonuclear leukocytes // Molec. and Cell Biochem. 1991. - V.103, № 1. -P.51 - 62.

170. Radi R, Bush K.M., Cosgrove T.P., Freeman B.A. Reaction of xanthine oxidase — derived oxidants with lipid and protein of human plasma // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. 286, № 1. - P. 117 - 125.

171. Ramos C. Spin trapping evidence for myeloperoxidase dependence hy-droxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // J. Biol. Chem. - 1992. - V.267, № 12. - P.8307 - 8312.

172. Razumas V., Gudavicius A.V., Kulys J.J. Redox conversion of peroxidase on surface modified gold electrode // J. Electroanal. Chem. - 1983. — V. 151, № 2. -P.311 - 315.

173. Reddy V.Y., Pizzo S.V., Weiss S.J. Functional inactivation and structural disruption of human a2-macroglobulin by neutrophils and eosinophils // J. Biol. Chem. 1989. - V.261, № 23. - P.13801 - 13809.

174. Reif D.W. Ferritin as a source of iron for oxidative damage // Free Radical Biol. Med. 1992. - V.l 2, № 5. - P.417 - 427.

175. Reiter B. The biological significance of lactoferrin // Int. J. Tiss. Reac.1983. V.5, № 1. - Р.87 - 96.

176. Renard P., Fememont R. Activation of NF kappaB by interleukin 1 in human cultured fibroblasts: study of the kinases involved // Oxidative Stress and Redox Regulation, Inst. Pasteur, Paris, May 21 - 24,1996. - P.47.

177. Richards D.M.C., Dean R.T., Jessup W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis // Biochem. Biophys. Acta. 1988. -V.946. - P.281 - 288.

178. Rollet-Labelle E., Grange M. J., Elbin C., Marquetti C., Pasquier C. Intracellular mechanisms of apoptosis in polymorphonuclear neutrophils // Oxidative Stress and Redox Regulation. Paris, 21-24 May, 1996. P.22.

179. Rosen A., Soderberg O., Nilsson J., Nilsson K. Thioredoxin, a redox — active protein, involved in regulation of В — type chronic lymphocytic leukemia survival and growth // Oxidative Stress and Redox Regulation. Paris, 21-24 May, 1996.-P.105.

180. Rosenkranz A.R., Tempi E., Traindl O. et.al. Reactive oxygen product by human neutrophils as an early marker for biocompability of dialysis membranes. // Clin. ExP. Immunol. 1994. - V.98. - P.300-305.

181. Sagone A.L., Husney R., Guter H., Clark L. Effect of catalase on the proliferation of human lymphocytes to phorbol myristate acetate. // J.Immunol.1984. V.133, №3. - P.1488-1494.

182. Salo B.C., Pacifici R.E., Lin S.W., Giulivi C., Davies К J. A. Superoxide dismutase undergoes proteolysis and fragmentation following oxidative modification and inactivation // J. Biol. Chem. 1990. - V.265, № 20. -P.11919-11927.

183. Sawai Т., Asada M., Katayama K. Translocation of cytosolic NADPH oxidase component to membrane in a cell free system // Frontiers of Reactive Oxygen Species in Biol, and Med. / Ed. by K. Asada, T. Yoshikawa. Aihsterdam e. a., 1994. - P. 45 - 46.

184. Sawyer D.T. The chemistry and activation of dioxygen species (02, 02~, and HOOH) in biology // Oxygen Complexes and Oxygen Activation by Transition Metals / Ed. by A.E. Martell, D.T. Sawyer. N.Y. - London: Plenum Press, 1988 - P.131 - 147.

185. Schultz J., Kaminker K. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal human blood. I. Content and localization // Arch. Biochem. Biophys. 1962. -V.96, № 3. -P.465 — 467.

186. Schuster M.G., Enriquez P.M., Curran P. Regulation of neutrophil superoxide by antichymotrypsin — chymotrypsin complexes // J. Biol. Chem. 1992. - V.267, № 8. - P.5056 - 5059.

187. Segelmark M., Persson В., Hellmark Т., Wieslander J. Binding and inhibition of myeloperoxidase (MPO): a major function of ceruloplasmin? // Blackwell Scien. Ltd. / Clinical and Experimental Immunol. — 1997. P. 167 -174.

188. Sepe S.M., Clark R.A. Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidase system. I. Characterization of a liposome model and injury by myeloperoxidase, hydrogen peroxide and halides // J. Immunol. 1985. -V. 134. - P. 1888 - 1896.

189. Sharonov B.P., Govorova N.Yu., Lyzlova S.N. Serum protein degradationby hypochlorite // Biochem. Internat. 1989. - V.19, № 1. - P.27 - 35.

190. Silverman L.M., LeGrys V.A. The acute phase response and clinical significant proteins // J. Med. Technol. 1987. - V.4, № l. - P.154 - 157.

191. Simpson T.A., Narita S., Gieseg S., Gebicki S., Gebicki J.M., Dean R.T. Long-lived reactive species on free-radical-damaged proteins // Biochem. J. 1992. - V.282, № 3. - P.621 - 624.

192. Slungaard A., Mahoney J.R. Thiocyanate is the major substrate for eosinophil peroxidase in physiologic fluids. Implications for cytotoxicity // J. Biol. Chem. 1991. - V.266, № 8. - P.4903 - 4910.

193. Smith R.J., Speziale S.C., Ulrich R.G., Bonmann B.J. Characteristics of aggregated immunoglobulin G as an immunologic phagocytic stimulus for granule enzyme release from human neutrophils // Inflammation. 1986. -V.10, № 2. -P.131 - 143.

194. Smolen J.E. Neutrophil signal transduction: calcium, kinases, and fusion // J. Lab. Clin. Med. 1992. - V.120, № 4. -P.527 - 532.

195. St\>ab F., Wolber R., Abeck D., Schachtschabel D., Hoppe U. Induction of signal transduction pathways in human keratinocytes by oxidative stress // Oxidative Stress and Redox Regulation. Inst. Pasteur, Paris. May 21 - 24, 1996.-P.183

196. Stadtman E.R. Covalent modification reactions are marking steps in protein turnover // Biochemistry. -1990. V.29, № 27. - P.6323 - 6331.

197. Steinbeck M.J., Khan A.U., Karnovky M.J. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with chemical trap // J. BioL Chem. 1992. - V.267, № 19. - P.J3425 -13433.

198. Stendahl O., Molin L., Lindroth M. Granulocyte-mediated relese of histamine from mast cells. Effect of myeloperoxydase and its inhibition by antiin-flamatory sulfone compounds. // Int. Archs. Allergy appl. Immun. 1983. -V. 70, №3. - P.277-284.

199. Stief T.W., Heimburger N. Inactivation of serine proteinase inhibitors (ser-pins) in human plasma by reactive oxidants // Biol. Chem. Hoppe-Syeler.1988 Vol. 369. - P.1337 - 1342.

200. Suzuki Y.J., Forman H.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction // Free Radical Biol. Med. 1997. - V.22, № 1/2. - P.269 -285;

201. Tal Т., Aviram I. Defensin interferes with the activation of neutrophil NADPH oxidase in a cell — free system // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1993. - V.196, № 2. -P.636 - 641.

202. Tamura H., Kitta K., Shibamoto T. Formation of reactive aldehydes fromLfatty acids in Fe / H2O2 oxidation system // J. Agric. Food Chem. — 1991. — V.39,№3.-P. 439-442.

203. Taylor K.L., Gruzman G.S., Burgess СЛ., Kinkade J.M. Assembly of dimeric myeloperoxidase during posttranslational maturation in human leukemic HL-60 cells // Biochemistry. -1990. V.29, № 6. - P. 1533 - 1539.

204. Test S.T., Lampert M.B., Ossanna P.J., Thoene J.G., Weiss S.J. Generation of nitrogen chlorine oxidants by human phagocytes // J. Clin. Invest. -1984. - V.74, № 4. - P.1341 - 1349.

205. Thomas E.L. Myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride system: effect of exogenous amines on antibacterial action against Escherichia coli // Infect. Immun. 1979. - V.25, № 1. -P.110 - 116.

206. Toledo Pereyra L.H. Liver transplantation reperfusion injury: factors in its development and avenues for treatment // Klin. Wochenschr. - 1991. - V.69. -P.1099 —1104.

207. Torok J., Marticsek J., Cseh K., Kalabay L., Meretei K., Jakab L. Effect of plasma fibronectin on the chemiluminescence response of human neutrophil granulocytes // Ann. Immunol. Hung. -1986. V. 26. - № 2. - P. 679 - 685.

208. Tzan M. F., Denison R.C. Oxidation of amino acids by human neutrophils //1.flammation. 1981. - V.5, № 4. - P.379 - 386.

209. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc coordination, function and structure of zinc enzymes and other proteins // Biochemistry. 1990. - V.29, № 24. - P.5647 -5659.

210. Vercelotti G., van Asbeck B.S., Jacob H.S. Oxygen radical-induced erythrocyte haemolysis by neutrophils (critical role of iron and lactoferrin) // J. Clin. Invest. 1985. - V.76. - P.956 - 962.

211. Vogt W., Hesse D. Activation of the fifth component of human complement by oxygen-derived free radicals and by methionine oxidizing agents: a comparison // Immunobiol. 1992. - V. 184, - P.384 - 391.

212. Wach F., Hein R., Adelmann-Grill B.C., Krieg T. Inhibition of fibroblast chemotaxis by superoxide dismutase. // Eur. J. Cell. Biol. 1987. — V. 44, №1. - P. 124-127.

213. Wachtfogel Y.T., DeLa Cadena R.A., Colman R.W. Structural biology, cellular interaction and pathophysiology of the contact system // Thromb. Res. 1993. - V.72, № 1 -P.l - 30.

214. Wachtfogel Y.T., Kucich U., Hack C.E. et al. Aprotinin inhibits contact, neutrophil, and platelet activation system during simulated extracorporal perfusion. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1993. - V. 106. - P. 1-10.

215. Watanabe H., Kabayashi A., Yamamoto T. Alteration of human erythrocyte membrane fluidity by oxygen derived free radicals and calcium // Free Radical Biol. Med. - 1990. - V.8, № 5. - P.507 - 514.

216. Wayne P., Croatto M., Hamilton J. The effect of interleukin 4 on the macrophage respiratory burst is species dependent // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992. - V.182, № 2. - P.727 - 732.

217. Wayner D.D.M., Burton G.W., Ingold K.U., Locke S.J. Quantitative measurements of the total, peroxyl radical trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation // FEBS Lett. - 1985. -Vol.187.-P.33 —37.

218. Weiss S.J. The role of superoxide in the destruction of erythrocyte target by human neutrophils // J. Biol. Chem. -1980. V.255, №20. -P.9912 - 9917.

219. Wickens D.G., Dormandy T.L. Effect of free-radical activity on human gamma-globulin // Agents and Actions. 1984. - V. 15, № 1/2. - P. 47 - 48.

220. Winterbourn C.C. Comparative reactivities of various biological compounds with MPO Н2Ог — chloride and similarity of the oxidant to hypochlorite // Biochem. Biophys. Acta. -1985. - V.840. - P.204 - 210.

221. Winterbourn C.C., Garcia R.C., Segal A.W. Production of the superoxide adduct of myeloperoxidase (Compound 1П) by stimulated neutrophils and its reactivity with hydrogen peroxide and chloride // Biochem. J. 1985. -V.228. - P.583 - 592.

222. Yamada M., Kurahashi K. Regulation of myeloperoxidase gene expression during differentiation of human myeloid leukemia HL — 60 cells // J. Biol. Chem. 1984. - V.259, № 5. - P.3021 —3025.

223. Yamasaki I. Peroxidase // Molecular Mechanisms of oxygen activation / Ed. by O.Hayaishi. Kyoto (Japan), 1974. - P.535 - 558.

224. Yankovsky O.Yu., Leonova N.V., Nurutdinova M.N., Lyzlova S.N. The ability of fibronectin (FN) to combine oxydized protein // VIII Biennial Meeting Intern. Soc. for Free Radical Research. 1-5 October 1996,

225. Barcelona. 1996. - 15.3 (Abstr.).

226. Yodoi J., Taniguchi Y., Sasada Т., Hirota K. Thioredoxin / ADF as the key redox regulate of signalling // Oxidative Stress and Redox Regulation, 21— 24 Mai 1996, Paris. -1996. P.56.

227. Yokota K. N., Yamasaki I. Analysis and computer simulation of aerobic oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide catalyzed by horseradish peroxidase // Biochemistry. -1977. V.16, № 9, - P.1913 -1920.

228. Zarling J.M. Effects of interferon and its inducers on leukocytes and their immunologic functions // Interferons and their applications / Ed. by Came P.E. and Carter W.A. Berlin e.a., 1984. V. 24. - P. 403 - 431.

229. Zeng J., Fenna R.E. X-ray crystal structure of canine myeloperoxidase at ЗА resolution // J. Mol. Biol. 1992. - V.226, № 1. - P.185 - 207.

230. Zopf D., Ohlson S. Weak affinity chromatography // Nature. - 1990. — V.346, № 6279 - P.87 - 88.

Информация о работе

Эйсмонт, Юрий Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Активация кислородзависимой биоцидной системы нейтрофильных лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы