Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов"

1 -91

ВНИИ ЭКСПЕВ'С.ЕИТЛЛЬНОЙ ЕЕТЕИ4НШИ ем. Я. Р. КОВАЛЕНКО Российская акадвжя сольскохозяйстатгщх-пзук

На правах рукописи

Гурьянов Николай Иванович

УСОВЕНИШСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК ККШ ЮТ, ШЧКОЭ, ЭМБРИОНОВ КОТОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ ПК! КУЛЬТИВИРОВАНИЙ КЛЕТОК И ВИРУСОВ

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой стелена 1сшдащата биологических наук

Казань - 1992

Работа выполнена в отдела культур клеток и питательных сред и лаборатории ш&унодогзш НИ ветеринарного института /г.Казань/.

Бауашй руководитель - доктор ветеринарных наук, лрсфсссор, лауреат иро;,вш Совета Министров СССР, оаслуэгашшй деятель науки ТССР Р.X.Юсупов

Официальные оппонент:

1. Доктор бЕолотлчэсзак 1105а:, профессор А.П.Простяков /ВГШ* веткрепаратов/

2. Кандидат биологических,наук Н.Е.Соколова/ШЭВ/

Ведущее учрсадеше ~ ЕНИ ¡1 технологический институт биологической прошшлешостп

Задпга состоится " ¿Г" и/ЛкЛ_1992 года в I400

часов па заседании свэциалнзирозшшого совета К 020.Я8.0Г во ВИН экспераизнталхной ветеринария ил. Я. Р. Коваленко. 109472, г. Москва, Кузьминки, ШЭВ.

С диссертацией иоено ознакомиться в библиотеке ВНИИ экспериментальной ветеринарии.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф„Г.Терешков

- j

s

, u!

| I. ОБЩАЯ ШШШШШ РАБОТЫ

с. .pT .i'O'nlj

I.I»' Актуальность течьг. в развитии соБрекевенх проблем 5яотехиолсгии значительное весго вашаст куяьжйфогояяе клеток 13 тканей животных и чэлозекз впэ оргаякзка (Соло:.-1.гв З.Д,, Эгктемироз Г.Л.,1963; Сергеев 3.A..IS7S; Дьяконов Д.П.,1933; тьяконов л.П. и Др., 1985, 1937; Evs^d £.Л. &t al,, 1935; /сJ.W, zt а!.. 1933). го'льтдшфускне клзткя г:спользуются ;ля реиешш мясгях паучках я цркхлоднах задач сельского хозяйства, медицины к биологии. Она являются объектом при 1зучелаи каяцерогея93& и дяффэреяцзроюш нлото-ч з вирусолога-leoKHX, йгохгаллеских и других дсследсванллх.

При работе с культуре»« клеток необходимо выполнять оцре-иелёяные требования к посуде, r,p::<5opat.:f палгдаргплк к парг-г-зт-заи вязшнеа среда, окружающей глет:™., зярапдааогиэ ¡л i'itfo . [{лежи ::агаотных 'Л человека для своего развития яу.-жштоя з и-гявяом белке» в культуральнкз среди пзоЗходаио добавлять й-толо-гаческие гэдкесгл, содеряа«ие юосяс^олелуллряыз бзли: и езя-заяше с яю® вещества, наиболее часто употребляемся бяодогк-геекои .жидкостью является сыворотка крови этвоэдых ( Тги/fsr W 1974; Голубев Д.Б. £ др., ГС73; ЛПам P., KW3;£vef« EX. et л /., 1985; J а у me £Ж ei a/., хззз; конкл д. и др., 1383). Чаще кспользуется сшоротка крови взрослого крупного ро-гаюто скота, но црц культивирования шиболез ценных лший кле-гок и гибридом припаяется оаворотка крови окфкоков крроз, но её широкое попользование ограничивается, прз.тдо всего, дефицитом, высокой стстаость», а такке шзкам уровнем технологии получения. Для увеличения обье:.*з производства я улучшошя качества енворегяа крови животных (особенно сыворотки крови эмбрионов коров) необходимо совершзяствсвакяе технологии её получения. з существую^« г-етодаках получения пильных сывороток кро-вя взрослых доотяых и их эмбрионов ( Лол д., гр53; Голубев Д.Б. и ДР.,1376;.Болотников и,А., Соловьев Ю.В., 1980; ТГа)йН £. ezf л/.,1932; Кйулея д.р. к др., Г983; №»нш 5.II. и др., 1983; хазипов Н.з. и др., 1985; franZ ft ct a/., 1?8Ь; Wittrrta.nn W. ct а/.» 1985; »эндрашова З.С. я ДР., 193?) не отражены должным образом отдельные этапы технологической цепи получения сыворотки, особо ото .касается способа взятая крови з отделения сыворотки, а существующий способ получения

сыворотки крови птиц (Болотников И.А., соловьев Ю.В.,Ю80) при годзн лишь в лабораторных условиях к не может быть примечен для пропиленного производства её в условиях мясокомбината, эт стало одной из прятан редкого использования сыворотки крови птиц, хотя в период становления культур клеток и тканей широко пряиенялесь плазма и сыворотка крови кур,

1.2. Цель я задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось усовершенствование технологий получения сшоро-ток кроза кур, бычков,'эмбрионов коров для культивирования кле ток тканей животных. В этой связи были поставлены следующие за дачи:

X.2.I. Разработать промиаленныЛ, пригодный для условий мяо оком бянато, способ получения цельной сыворотки крови птиц. 1,2.2» Усовершенствовать способы получения цельных сывороток крови крупного рогатого скота: бычков и, особенно эмбрионов кс роз, с целью увеличения производительности к улучшения качества конечно"! продукции.

1,1 3» Разработать простой и общедоступный способ получания из цельных сывороток кроза животных препаратов типа А о пониженным содержанием обаето белка (в том числе j -глобулинов),спо-бодаого гемоглсбигэ, обпдах дашвдов, в той числе обцего холест? ркяа, с полью поиска альтернативных заменителей "ельноЗ сыворотки крови ©мбраояов коров. ■

1-2.4, провост сравнительное изучение цодьных сывороток крови кур, быкоз, огфионов коров г препаратов глаз А. получениях из них, по некоторым физико-химическим к биохимическим показателям с целью установления раишчли мегду ними. 1.2.5. Провести сравнительное изучение цельных.сывороток крови кур, бычьей, эмбрионов коров и препаратов типа А, подученных из них, до ростовым свойствам при к. татюжровашш линий клеток НГУК-1, PK-I5 и Ve ГО .

1.3. Научная новизна работы. Впервые разработан способ по лучения цельной сыворотки крови птиц, позволяющий производить её на прокаленной основе в условиях мясокомбината. Для ооущес влеяия этого способа сделан столик для фиксации птицы и система для взятая Ярова - СВК-2. По данной разработке 12.04.88 г. была подана заявка на цре .полагаемое изобретение: "способ полу чекпя сыворотки крови птиц" и получено авторское свидетельство й I6II3S.. Разработан способ взятия крови из сердца эмбрионов

■ров о использованием устройств для его ооуахк? тарная. Прайму-гства предлагаемого оаоообд взятия кро?я у экбриолов коров л шокуггностн дгют возможность для увеллчоияя осъеш забираемо;! юза е сравнении с существующими с пес о бага в 1,5-3 разе, что, >ответственно, ведет к сиикеяяю себеотоикоста конечной прцдук-га. По отой разработке К.01.83 г, была подала заявка ш предлагаемое изобретете: "Способ взятия крови из сердца ялбрио-)в коров". Но заякг/ № 4636099/Г5 (008999) получено полохитз.и-за решение тжПЭ от 25.10,89 г. из выдачу авторского зтхтвп. кроме взятия крови проведено :овериенотвовл;и?е отде-гвяя, сбор? п стерилизации цельно:-; сыворотки крови 5м6рйовов проз. Усовершенствованы отдельное этапы получения сыворотки: рови бычьей, разработка способ получения из цеяыш: сыворогсгс рови кур, бичков к омбрнснов коров препаратов мпа А. которка о физшсо-хг.мическим показа т о лам к ростовда сво*ст2?.;4 могут ни» ал&щнштвивш ззкбнятеяяглг цельной ещороткг: кроля эибря-яов коров. По данной разработке оформлена заявка <5820232 048194) на предполагаемое изобретение: "Способ повышения ка-естза сызоротки крови животных для культивирования культур леток" от 27.04.90 Г.

Выполненная работа является частью плановых ■..__.

•вдела культур клеток и питательных срсд ВШВЛ (г.: > •!>-:ер государственной регион лцмз 018б0093|)?п.

1.4. Практическая ценность работы. . «ле тех-юлогии получения цельнчх сывороток крови кур, о»чао« а ¿мбрио-юв норов снижают затраты труда и создают возможность д;я уве-мчения объема их производства. Разработанная технология полумиля препаратов типа А - простой и общедоступный способ позы-юная качества сыворотки крови гнво-гяых для культивирования слеток,

1.5. Публикация результатов исследог.- чий, по теме диссертации опубликовано 3 статьи, подано 4 заявки на предполагаемые шобретения (по 2 из шх получены авторские свидетельства, а

ю 2-м - положительные решения) и оформлено б рационализаторе-шх предложений.

1.6. Внедрение результатов исследований. Результата 10НЯНХ исследований внедрена на казанской эдвскокбя.Ъте :: 20 ЗШШ (г.Казань) при получении дельных сывороток тг.их •I препаратов типа А дляздльтивировпяия перевив-; £>:..и:<' якякЧ к.:*-

ток, е тон числе гисридсм,,

1.7. с бьем и структур-] диссертация. Материала дассзртакш кзгзквяи на 207 страницей иаЕиастсяоро текста и состоят из ойцой заракхертхки работы, обзора литературы, собствеашх ксоледоззя»а, оСсуэдкда результатов исследоьонкй, выводов, црактачесрлх щ.одлс»ок$, сшока лствра*уры к сцравк?, о внедренной г угвер>с?,ввяо?. ааучно-абзшзчзской документации па результатам доследований. Гейст ^асоортада иллюстрировав 25 тсбж-цй«я и 32 расунша. Список яатераяура включает 235 ксадчаикоз, в ил. 169 иностранных,

1.8. Рогозина догоугегкя« ваягоук.и да здлагу:

1.3.1. Усовершенствованные способа получеюя целышх совороток

КрОЕП 1ШЩ, &ЧКСЗ Я сЦбрКОЛСВ КОрОО.

1.8.2. Обоснозагше способа получения из цельных сывороток крови кур, бычксв 11 шбркоаов коров цровератов 'яша А. Наогсобра-зке иозшкаах варшгтсв способа.

1.8.3. Регультати изучения цельных сывороток крови живоъчшх и их прегг-рртоз зкю Л по аекагорьм фшко-зшмачешш к биохЕМ-ческми иокезателям.

1.8.4. Результата изучения ростових свойств цельных сывороток крови глвоткых и их препаратов типа А на перевиваемых культурах клеток НГУ1М. РК-15 и У г Г о .

2. ПАТЕРМШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для получения цельной сыворотки служила кровь, аайарееьая из сердце нлшкчески здоровых киведашх, иостугшющгх ш конвейер, ¡три убое их на казанском мясокомбината, кровь брали У кур О живой массой от 2,0 до 4,5 кг, у бычков - о хт& кассой 300-400 кг к у эмбрионов коров с живой массой от 0,5 кг V. бодьга.

Получение дельных сывороток крови животных проводилось как по известным методикам: у кур (Болотников и.А., Соловьев Ю.В., 103 0), у бычков (пит. по Антонову Б.И. и др., 1986). У эмбрионов короэ (Хазипов Н.З. и др., 1985>, так и по моифщировая-ивм ппг.-и способам.

Наряду с цельными снвороткзкг крови животных в опита?. кс~ юльзовзлись проЕ5раты типа А с иизкш еодепкаииен обк;;го бэла, общих дзпвдов, в том числе общего холестерина, свободного 'е'/.оглобкна. Кчтерналом для их получения слуяияи гтедипо >отки крови кур, бачков и экфяояов коров, которые подвергали акорозке о последу вврга их отеааваяием, затеы собирали дквь ¡зетдыэ слои сывороток, начиная сверху, до границы раздела их : гемол'зпрсванними слоя*« и проводили стерилизующую йлльтря-

(!П0.

Определение прозрачное®: и контроль сыворотки m возмод-юо присутствие кошатиатоз - отгетярий, тзясоплази, вирусов [ по ростстпмулируккэй чктивнпстк проводились по оадзприляиа: ютэдикан (Методические реКойеядацгк но коарролз пачесивз -дд-:од сыворотки крови крупного рогатого схотэ, врпменлз^оЗ в децшюках а биологических целях, 1952). По обцзщвдшш! методикам в сыворотке определялось содержание обдего белка (Ичструк-П1я по. определении общего бежа в сыворотке крови по блуретс-зой реакции, 1972), свободного гемоглобина (Инструкция по определению гемоглобина крови гег.'дглобинцнанкднш методом, 1С74), збщих лишздов (Инструкция по определению общлх лкгкдев, 1932), общего хотестерина (Колб В,Г., йэкншншшв B.C., 1976) и РН жороткя (ыетодкческие ухгзашя по прп.;еяе;ш> фззйко-тачес-шх методов контроля медицинских биологических препаратов, С977).

Для изучения ростовых свойств сывороток крови зквотннх ^пользовались постояннее лини: клеток PK-I5, Ш7Н-1 л Vafo Культивирование клеток проводилось по общепринятой методике (ддаке Р., 1983). Та газ по общепринятой нетодпяе определялся шдекс пролиферации клеток, как показатель ростсткмулкрувдей активности сыворотки крови (Антонов Б.Й., я ДР.. 1986).

Электрофорез сывороточных белков проводили з пластинах линейного градиента полкакрилакидного геля ( 5 -г 1($) по методу, изложенному в книге Холода З.М, (1983).

а

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Оптимизация технологий получения цельных сывороток крови кивсгшх

Многогранные вопросы данного раздела изучалась цри получения сиворотск крови птиц, бычков, вибрионов коров, учитывая разносторонний подход при получении этих сывороток крови, тех-нолопш их получения списаны отдельно, ко, несмотря на различия, данные технологий имели ряд общих принципов: кровь для получения сыворотки фади у зшвотщи только из сердца (щ>едпоч тительне из правого предсердия); забор крови проводили закрывши (изолированными от внесшего воздуха) системами во флаковь ёмкостью 250 ил или в бутыли ёмкостью Ю литров, в которые наливали раствор С/ из расчета 3-4 мл на 100 мл крови -сыворотку крови фильтровали только в охлажденном виде при температуре б-Ю°С.

3.I.I. Усовершенствованно способа получения цельной сыворотки крови птиц

Наиболее оптимальным из существующих способов получения сыворотки крови птиц является способ, за:ш>чающ>'#1ся в фиксащп птицы, взяз-ии крови из сердца иглой в шцрзщ и переносе ее в пробирки, в которых происходит отстой сыворотки» сборе сывсро! кя и о^обоздешш её ст попавших эритроцитов методом центрифугирования, хранении ей при -20°С с последующим оттаиванием, удалением вкпаыпих криоглобулинов центрифугированием и использовании её в серологических и биохимических исследованиях (Болотников И.А., Соловьёв Ю.В., 1980).

Недостаток известного способа и устройств (столика для фиксации птицы, системы для взятия крови и системы для сбора сыворотки кроЕи) заключается в том, что они не позволяют производить сыворотку крови птиц для культивировался клетог в больоих количествах и высокого качества. Поэтому перед нами бала поставлена цель, состоящая в повышении производигельноси способа получения сыворотки крови птиц для широкого использования её при культлвяроь. йии клеток животных тканей и улучшен!

¡ё качества.

В предлагаемом способе получения сыворотки яри совладении асептики на всех этапах, птицу фиксировали на специальном сто-пике, кровь из сердца брали по стерильной закрытой системе в стеклянные флаконы ёмкосуью 250 мл в два этапа,- с:торотку от-целяли методом центрифугирования, а собирала стерильной систе~ мой во флаконы ёкиоетьй 250 мл, которкэ ставили в заморозку; после оттаивания сыворотку стерилизовали методом фильтрации через глубинные я мембранные фальтра.

Например, отноаеняе взятой крови к живо:"! вдссе кур по предлагаемому способу достаточно велико п составляло 5,50 ± ± 0,08/«, а по прогог'пу - лишь 1,98 ± 0,115»» IB® отделении сыворотки крови птиц методом центрифугирования крови во флаконах, заполненных до 65-75% их объзга в два этапа при 2000-2200 об/мин, выход сыворотки составлял 40-50», и по известному способу - лишь 17,12 + 0,92$. Разработашшй наш промыаленаьй способ получения сыворотки крови пищ позволяет производить за I чел/день яе менее 1,5 литров конечного продукта.

3.1.2. Усовершенствование способа получения

цельной сыворотки крови змбриовов коров

Известен ряд способов получения цельной сыворотки' крови эмбрионов коров (ромэнюк E.H. и др., 1983; Каулен Д.р. и др., 1983; Н.ЗДазипов и др., Г985; Ftanz Н. et <г/ .,1935; Wittmann W. eJ а/., 1935; К.С.Хаертшов и др.,1990). Общим недостатком этих способов является то, что пзятке крови проводится у 5-9 месячных эмбрионов без учёта эффективности обескровливания их. поэтому при совершенств зашит технологии получения сыворотки крови эмбрионов коров первостепенное вникляле было уделано'оптимизации взятия крови. Для сравнения взяты две известные технологии (Роыаннк H.H. и др., 1933; К.З.Хазилов и др.,1985).

3 способе взятия крови у эмбрионов коров кэрдяолуякцкю проводили иглами с внутренним диаметром 3 мл, длинои Г20-К0 км от двух устройств для взятия крови: CBK-I иди CY-C-2 через углубление в области краниальной части грудной кости, Кровь стекала нз эмбрионов по селиконовим трубкам в сгсрильнн-з <;жхо-яы в два этапа: на первой этапе кровь свободно сте. <лл из sr.6-

рвоаов, годаевелках за задиае конечное?« в вертикально;,: иоло~ кеких, a на втором этапе делали продольный юсса» тела эмбриона в каудо-крзййэльном направлении (начиная от задних конечностей), затем голову и гаев эмбриона поднимала ваша уровня проекция сердца, одновременно проводя кассе» головы п а:еи в крапво-каулальыси направлении, во флакош ёмкостью 25С мл наливали 5$~ный раствор ¡JaCl кз расчета Э-4 roí на ICQ мл крови.

В срязиятелышх ocasax нами показано, что 'процент взятой крови к кдеой ьаосе ко известной технологии (Н.З.Хозипов к др. 1985) незначителен (если учесть, что геореткче.сш объём крови равен 8? от нивой щсса плода коровы) к составлял у эмбрко яоз с ишоа массой: до 5 кг -03.С7+ 0,23, от 5 до 10 кг -2,8710» 16, садка 10 яг - 2,33^0,26, а коэффициент вариации про вшах 2?/!, что топора? о нестабильности результатов вря взятки крови. Процент взятой крови я кивоД гассе по другой известной технология (романея Е.Н. и др„ IS83) больше, чем по первой я составлял у экфкоиов с гилон массой: до 5 кг - 5,42+0,19, от Г ДО 10 кг - 4,58+0,11, свыше 10 яг - 3,83¿0,2I, но избежать существенных различий по проценту взятой крови, в зависимости at айвой массы эмбрионов, не удалось. Эти различия практически отсутствовали при взятии крови по предлагаемому способу, когрт процент взятой ярови составлял у эмбрионов с живой массой: до 5 кг - 5,55+0,23, от 5 до 10 кг - 5,2СМнО,18, свыше 10 кг -5,004), 13.

ДР»пш- недостатком известных технологий является то, что выход сызоротки составляет 56» от обьека крови. По предлагаемой технологии флаконы, заполненные кровью до 8Cf» их объема, помещали в холоднуи воду со льдом (температура 6~8°С), где их выдерживали до центрифугирования не менее 3-4 часов, а лучше 5-6 часов. Центрифугировали кровь 30-40 кинут при скорости 1800-2000 об/мин. Внход сыворотки, по сравнению с существующими способами, велик к варьировал от 60 до 75$ от объёма крови. Собранную сыворотку замораживали до накопления необходимого объ'ёУл, а затем, после оттаивания, стерилизовали фильтрацией через глубинные и миллияоровые фильтры.

3.1.3. Усовершенствование способа получения цельной сыворотки крови бычков

В качестве близкого аналога предлагаемого способа получения цалыюГ: CI'воротки крови бычков легла известная технология

её получения (пит. по В.'Л.Антонову и ДР.ЛРЗЗ!. оягвжзлшш технологии получения сыворотки крови бычков проводились, в основное, о далью у-.'зньЕсгля трудоемкости и увеличения в>:хо.;Г ер-воротки крови. ¡{ровь брзли у бнпков с жйпой узсссл 300-400 кг, подвешенных ча колыелерэ «»яс.чгелсяилта, то it-,ко к? сердца двумя видами закрытых стернльнчх систем в 10 литровые бутили, в которые наливали по 200 мл Е-'-ного раствора л/д С/ , Бутыли наполняли кровью наполовину их объём, пооло~чегчПх оставляя-! стоять при комнатной температуре П часа, а зато« комещмли в холодильную комнату аз 48 часов три темпор-туре 6~Ю°С под углом 55°, Наш установлено, что врсга заполнения кровью io-т;; литровых бутылей до 5-ти ¿¡провод отметки при взятии кропи из сердца бычков составляло £-1,5 кнчутн, а при взятии кров:: пз ярем-кол вены - 5~6 кьчут более,. 3 сравните— г.пх опытах уг.тзнов-лево, что выход сыворотки г.л крови, взято,, из яре-дао:; гены бычков, по известной технологии (цит. по БЛ1.Антонову и др.,1986) мал и составлял 26,00+1,24«. 3 шход сыворотки пз крот по предлагаемому способу - 00,"g+i,7fw. шсояйл энход сыворотки по предлагаемому способу имел место .ч в производственных условиях. Так,, например, з 30 бутылей било взято 150 литров крови, а после отстоя отсосано 63 литра сыворотки или* 42/5 от объема

кп02и.

3.1.4, ростстимулпруккзэя активность цельных сывороток крови животных, полученных по известным и модифицированным нами методикам, на культурах клеток PK-I5 и HOT-I

Проведены опыты по изучению ростотимулпрующей активности цельных сывороток крови кур, бычков и оглбрионов коров, полученных по известным и модифицированным asm способам, приведенным выяе, на культурах меток РК-Х5 и НГЛНЕ, Сыворотка крови жп-.вотных применялась в ХСЙ-ной концентрации в среде Игла МШ (РН 7,3) с глуташнем. посевная клеточная взвесь рассевалэсь по 2,5 мл в пробирки лейтена с посевной площадью 6 см^, плотность посева составляла 350о0 клеток/см2, установлено, что сыворотки крови кур, бычков н эмбрионов коров, полученные по известным методикам, х большей или меньшей степени уступали соответствующим видам сывороток крови, получением по модифицированным нами способам, по индексу пролиферации выращиваемых культур клеток.

Сыворотка кровг кур, полученная по известной методике, обеспечивала индекс пролиферации постоянных линий клеток от 4, Ой до 5,53, а по усовершенствованной технологии - от 5,59 до 7,73. Сиворотка крови эмбрионов коров, полученная по нечестной технологии, обеспечивала индекс пролиферации клеток от 5,03 до 5,59, а по усовершенствованной методике - от 5,28 до 6,35. Сыворотка крови бачкоз, полученная по известной технологии, обеспечивала индекс пролиферации культур клеток от 3,77 до 4,15, а 'по усовершенствованному способу - от 4,65 до 4,97.

3,2. Способ получения препаратов типа А из цельных сывороток крови животных

3.2.1. Предпосылки способа

Исходя из поставленной перед наш цели, заключительным звеном в её достижении являлась разработка простого и общедостугь-ного способа получения из цельных сывороток крови животных препаратов типа А с пониженном содержанием общего белка (в том числе ¿f-глобулинов), свободного гемоглобина," общих липидов, в том числе общего холестерина, которые когно було бы использовать в качестве альтернативных заменителей цельной сыворотки крови эмбрионов коров, как составной части питательных сред,используемых при культивировании клеток. Существуют технологии получения подобного типа препаратов из цельной сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота (/lay С., QrviHe Я. ,1933; Carfie/iier С. Я., Со па И.о. ,1985), но они громозки и слокни в исполнении, требуют импортного оборудования, а для осаждения | -глобулинов используются соли.

При изучении цельных сывороток крови животных но содержанию в них общего белка, свободного гемоглобина, обпзга липидов, в том числе общего холестерина, а также по прозрачности и рН установлено, что в целом они по этим показателям приближены к требованиям, предъявляемым по отечественным техническим условиям, хотя несколько больше в сыворотке крови эмбрионов коров общих липидов, в том числе общего холестерина, а в бычьей сиворотке -свободного гемоглобина, и более отдалены от требований, предъявляемых к сыворотке крови крупного рогатого скота по международной заявке Л 82/02900.

Проводя заморозку стерильных цельных сывороток крови живот-

них при -15 г20°С о последующи,! оттаиванием их при 4-20°С. нагл установлено, что они расслаивались, происходило своего рода фракционирование сывороток по ьысоте столба: верхние слои светлые легкоподвияные, а у дна флакона слои сыворотки тёмно-кр .с-ниа маслянисто трудноподвижнио. Основываясь на данном физическом тлении, нами изучены физикс-хи/лческие характеристики слоев цельных сывороток крови, бывших в заморозке, после оттаивания, Установлено, что концентрации общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том число общегр холестерина, в верхних слоях размороженных сывороток лрови яивотнел значительно меньше, чем в нюсних, Дашшй контраст ещё более у-лублядся при многократном эаморзаиванин и оттаивании сывороток без перемешивания кеяду заморозками. Следует стме'. :ть, что, используя явление рассчоеняя сшзороток крови после заморозки и оттаивания их, а затем, прибегая к сбору верхних рвет лих слоёз сыворотки, можно добиться ьолучеиил препаратов типа а с разный содержанием общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, т.е. существует многообразие вариантов их получения.

3.2.2. Варианты способа

Из трёх изученных вариантов лучаим оказался вариант X,

3.2.2.1. Вариант т

3.2.2.1.1. Способ получения

Технологический процесс по данному варианту способа рклэ-чал: одну заморозку цельных сывороток крови при -15-20°С в течение 24-48 часов с последующим оттаиванием их црн 4~20°С, сбор •светлых слоев сывороток, начиная сверху, до границы раздела их с силъногемолизироззнныда слоями, стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных препаратов.

Для данных опытов исподьзованм цельные сыворотки крови кур, бычков и эмбрионов коров серии 4—80, Из них, соответственно, удалено г, 5 части ЦЗО, 2 части <2(2?) и I часть (10$) по объему нижних силыюгемолиэироЕайных слоев сывороток после их оттаивания. >

3.2.2.1.2. физико-химическая характеристика препаратов типа А в сравнении с цельными сыворотками крови животных серии 4-08

Установлено, что в препаратах типа А, по сравнению о пен,-

кыю: сивсроткаг.ж крови, синены концентрации: обшзго белка ¿ Í,I9-I,.r;I раза, свободного гемоглобина в 1,54-2,31 раза, общих липидов в 1,84-2,06 раза, в том числе общего холестерина в 1,74-2,53 раза; у препаратов улучзззтся прозрачность, а рН несколько возраст"ет.

3.2.2.1.3. ростсишулирувдая актаваость препаратов

типа а, в сравнении с цельныка снвороткака крови животных серии 4-88, на перешваешх культурах клеток

Цельные сыворотки и их препараты брались в lQÍ-ной концентрации с среде Игла Ий! СрН 7,3) о глугамкяои. Для опытов взяты к^льт-'п'и! клеток PX-I5, ПГУК-1 и Vero . Посевная клеточная взвесь распевалась по 2 мл во флакончики ёмкостью 10 см3 с посевной площадью 3 cí.:<;. Плотность посева - 40С00 клеток/сг,^„Клетки выровжБяж в термостате щ¡и температуре 37°С и подсчитывали через каждые 24 часа после посева. Пики количества выросиих клеток отмечены через 72 часа после посева, установлено, что ростстимулирукцая активное:ь цельнкх сывороток крови животных по индексу пролиферации клеток нияе, чем у препаратов типа А, приготовленных из них. Гак, цельная сыворотка крови кур обеспечивала индекс пролиферации постоянных линий клеток от 6,00 до 8,03, а её препарат - от 7,76 до 8,88; цельная сыворотка крови эмбрионов коров - от 5,16 до 7,48, а её препарат - от Б, 60 до 8,31; цельная сыворотка крови■бычков - от 5,23 до 6,71, а еэ препарат - от о,77 до 7,70.

3.2.3. Фракционный состав белков у препаратов

типа А в сравнен!": с цельными сыворотками крови ¡киеотнкх

Ка основании полученных данных по определении оптической плотности элюатоз участков элзктрофореграмм, соответствующих зонам альбуминов, 0-, ¿'-глобулинов, проведен расчёт содержания объединённых фракций сывороточных белков в относительных %. Установлено, что в исследованных образцах сыворотки крови эмбрионов коров больше ольбувднов, которые составляли от 41,Г>2±0,12 до 43,03+0,24$. Почти столько же в них ф -глобулинов - от 39,80+0,19 до 40,83+0,55?». К долю /5-глобулинов приходилось от 11,91+0,38 до 13,13+0,27%, а ^-глобулинов от 4,23+0,03 до .г5,44+0,02% от общего белка. В образцах сыворотки

крови бпчков альбумины созтавляля от_33,82^0, ,3 .ю 41,70+0,13% ci -глобулины от 11,53+0,12 до 2,11+0,0"/% fi -глобулин от К,85+0,09 ДО 23,58+0,122, -глобуяини :>т 33,54¿0, --'2 до il,50j,0,4G». Эти результаты, в оииовяем. ооггаоуюгея о дангааи. В.М.Холода (1933). '

В образцах снвопотки крови ;;ур преобладали альбумины, ноте-рцх содержалось от- 37,20,1.0,30 до 13,38+0,08*, несколько ¡¿еньис

/ -глобулинов от 33,19_+0»19 до 42,3110,29% f- -глобулинов примерно 8, а -глобулинов около К.« от ебщого белка.

Слодует ответить, что з ирызразех типа А, но оразнэгснз о цельными сиворозЕсаш крови кпзотпых, возрастает отяоец?олы.ч-к ■ йоод<гЯТрацк,1 альбуминов и енкъзвгея- ксадб»трздк2 / -глобулинов, й/яцея'хреази -глобулпют» и fi -глсугицадв э оглосоте.тыш:г срецоитзх остаются практически о?,з лзздлвязя.

Проведённкс исследования покаг.я-:;, чгч препараты тля? аолученлно чо Щ).эдлзгоеглшу способу из це.пгшх сквороток ."реви животных, !"о.гут быть нспользова/ш у кзчостьз аглтернатпгг.их эаг.гнитолаГг хмельной окворогкг крови сн.'.Зрпоноз хороз при культе-вировашш клеток тканей ":ивотлых, л том числе и гкбридс;д„ Поп-годность препаратов типа А из це:;гл;:;х cusopoïox отови бычков и эибраопов коров' для культявгрозаяая гифядеж била покзоа-ю оот-pj^HiiKOKi ВВП! (г.15азань), что огражзпо в акта о комиссионной проверке от I? октября 1989 годе.

Следует отметить, что предлагаемый способ повьпепия качества сывороток крови hiîbo'ïhux. для культивирования клеток является универсальны:." и применяется in ми, кроме того, при получении препаратов типа А из целишх сывороток крови лоаадей.

Кро-дэ того, coai'.scTHiftîï с Ильясовой Г.Х. доследованиями, отражена!;от в годовых отчетах В'ШРИ (г.йззань) ?а I933--I9S0 г.г.,было показано, что культуры клеток НГУК-.Т и PK-I5, выращенные с применением стзороток крови хязохгшх п омбриопов, полученных по новой технологии (препараты типа л), высокочувствительны к вирусом классической чумы свиней, болззцн Аусоки сельскохозяйственных глпотннх.

к

4- ЗцВОДИ

4- £. Бчерьи--; раоработад пройшммвиыа способ получения СивО].ОХКК КрОХЖ иш; (г .с. й 1011339), позлояяявдй производить к* I чая/лот не менее 1,5 литра конечного продукта.

4.2. Снзорстка кров:- кур обеспечивает хороша рост пере-сзтешх культур клеток (НГУК-Г. РК-ЗЗ в Ч&Го ), индекс проли-■рфацк;: котпрых среде, включающей её, составлял 5,83-8,03.

•1,3. гсовври'йнсгковпа способ получения сыворотки крови бачков, шлмчапакЗ взлтае крови па сердца животных замкнутым: „ спотемь'.ц', и 5?-ного гаствора хлористого натрия для

I позгК'Кгнля резистентности эритроцитов к увеличения выхода сыво-1 ротки кровГГГ" ~~~ '

Д "4.4. Госгсходлздуодш активность сыворотки крови бычков по индексу прожггкгр.цп'/ пбгсвлваегаис клеток равняется 5,23 -6,71»

4.5. Изменяя, внесёшша в технологи» получения сыворотки крови эмбрионов коров, позволяют увеличить её производство в 2-3 раза го сравнению с чззестными способами (положительное решение ВШЖ'ПЗ по заявке 4636099/15 (008999) от 25.10.8'' г.).

' 4.6. Свворотка крозк эмбрионов короз, получаекая по усовершенствованному способу, характеризуется следующими показателями: ростстимулирующэя активность на перевиваемых линиях клеток по индексу пролиферации - 6,16-7,48, общий белок -3,16+0,10 г/дл, в том числе алъбумикц - 1,32 +0,04 г/дл, -глобулины - 1,26+0,04 г/дл, {¡> -глобулины - 0,42+0,01 г/дя,

/ -глобулины - 0,17+0,01 г/дл, свободный гемоглобин -30,5+2,9 мг/дя, общие яшвда - 70,0+2,3 кг/дл, общий холестерин - 38,2+2,9 ет/дл, РН 7,26+0,04, оптическая плотность - . 0,114+0,005 единиц.

4.7, Разработан способ повышена я качества сивороток крови кур, бычков, эмбрионов коров путём сщикения концентрации общего белка (в том числе ^-глобулинов), свободного гемоглобина, общих липидоз, общего холестерина (препарат типа а).

4.8. Индекс пролиферации перевиваешх культур клеток РК-15, НГУК-1 и Ve.ro , выращиваемых на среде с препаратами типа А, на 0,49-2,36 (чаще на 1,20-1,80) больше, чем с цельными сыворотками крови.

4.9» дрегаретн типа А, цолучешше кз оьшоротки крови кур

и бычков, по слоим фпзико-хишчсокпы и Оиохи. дческим, а теяае по ростовым свойствам, могут Сыть использованы при культивирования клеток тканей животных, в том числе гибридом, вместо сыворотки, крови эмбрионов коров,

'4.10. культуры клетск ЕГУК-1, Р1Ы5, выращенные с применением сывороток животных и эмбрионов, полученных по новой технологии, высокочувствительны к вирусам классической чумы свиней, болезни Ауески сельскохозяйственных животных.

практически ерщоежаш'

По результатам проделанной работы были оформлены рационализаторские предложения, принятые в НИН! (г,Казань); по некоторым разработкам цедани заявки яп предполагаемое изобретем;;-:.

Ток, по стерилизующей фальгрзщп кул; турзлышх питательных сред и сывороток крови ш:вот;шх, I? января 1936 года получепы удостоверения па рационализаторские ¡^едло-юнл«: .'5 21 - "Способ подачи стерильного воздуха в зону разлила фллътруегих гладкостей", й 22 - "Способ загрузки фильтрами стсркллзуыщего фильтр од ерка теля ¡йилшгор д^-т орпийной фильтрации кудьтуральвых питательных сред, растворов я онт:сротс,т'. » 23 - "Способ ведача стерильного воздуха для создания -давле^ил в «».".костях оке?*.:.® для стерилизации культурадьиых Кчтатедьчых сред, растворов и сывороток". ,

Реализация в практику этих рацпредложения позволила скл-ззть количество проростов газдйяглых сред а сывороток крови животных до 0-3».

удостоверение № 40 от 21 января 1587 года получено па рационализаторское предложение под наименованием: "Способ сбора сыворотки к^ови животных из флаконов и бутылей". Предложенный способ позволил проводить отсос спворотки крови наиболее полно и качественно, особенно это важно при сборе сыворотки крови эмбрионов коров.

удостоверение й 41 от 21 января 1907 года получено на ра-циояализаторск э предложение под наименованием: "способ уравновешивания центрифужных стаканов с флаконами к пробирками". 3 предложеь.шх стаканах для центрифугирования моано быстро и надежно уравновешивать флаконы с кровью. кроме того, яо данной разработке подана заявка но предполагаемое изобретение: "Стакан.

Г8

к цептрщуте для разделения биологических лсидкостей" (автора: Гурьянов Н.И., Гурьянова H.A., КРьшов Я.А.). На заявку ß 4Ö28I7I/I3 ( 056772) получено положительное ресенне ВНИИГПЭ . от 25.02.91 Г.

Удостоверение & 5 от ig июля 29Ö7 г. получено на рационализаторское предлояенае под нашоновзвиек: "Способ взятия крови у s'-'.бриоиов крупного рогатого скота".

По последней; разработке 12.01.89 г. подана заявка на предполагаемое изобретение: "Способ взятия крови из сердца эмбрионов коров" (авторы: Гурьянов Н.И., ррылов Я.А., Гурьянова В.А.). Rn гаявку ie 433G099/I5 ( 003999) получено положительное решение ЕСЙГПЭ от 25.10,89 г. Прзимущаства предлагаемого способа взятия крови у эмбрионов коров, в совокупности, дают возможность для увеличения объёма забираемой крови в 1,5-3 раза, что, соответственно, ведет к екккекк» себестоимости конечной продукции.

Вакное практическое и теоретическое значение имеет разработанный нами способ получения цельной сыворотки крови птиц.поз-бодявнян производить её на промышленной основе б условию: мясокомбината . По данной разработке, которая является принципиально новой и эффективной, 12.04.88 г. б-ura подана заявка па предполагаемое изобретение: "Способ получения сыворотки крови птиц" (авторы: Гурьянов Н.И., Хзертыноз С.Х., Гурьянова В.А.). По этой заявке получз.чо авторское сивдэтеяьство В I6II339, Предложенный способ дает возмошкш-ь получать за I чел/день не швее 1,5 литров сыворотки крева птиц, что открывает перспективу для широкого использования eö при культивировании клеток тканей яивотнкх.

Практическим предложением, ккеющад наиболее важное значение, является разработанный наш (Гурьянов Н.И., Юсупов Р.Х.. Коксин В-П,, Гурьянова З.А., Ильясова Г.Х.) простой и общедоступный способ получения из цельных сывороток крови гавотных препаратов типа А с пониженным содержанием общего белка (в той числа ¿'-глобулинов), свободного гемоглобина, общих яидидои, общего холестерина, которые по фазвко-хишческЕН показателям и ростовым свойствам могут быть альтернативными заменителями сыворотки крови эмбрионов коров. По это;} разработке подана заявка й 48202Ж/13 (048194) от 27.04.90 г, на предполагаемое изобретение: "Способ повышения качества сыворотки крови животных для культивирования культур клеток"..

СПИСОК РАБОГ,

опгацшовшш по мтешлам диссертации

Г. Гурьянов II. И., Гурьянова В. А, СтершЕзувадя ультра дня кулътурахышх гегсагельянх сред и сывороток крови suboxiuix // Научные ссяозы технологии црсшиленаого производства вэтяринпр-ных биологических препаратов, Косдза, 21-23 октября IS37 г..: Тез.докл.третьей Эееоовзя.коаф. - йоскяа, Ifö/. - 0,133-131.

2. А.сЗ 16ПЗЗЭ. Способ получения онпфоткн ¿.рот лкщ. Ун.Ii.Гурьянов, СЛ.Хэертынов, 3.А.Гурьянова, isgo,

. 3. А.с.3 1544955j Способ взятия крова ::э сердца гпбрноноз коров /п.И.Гурьщюв, Я. А.Прилов, В.А.Гурьяаовэ, 1?9Г,

4. Заявка ;; 4328T7L/.T3 (056772) о? 22.05.СО г. Стакан к центрифуге для разделения биологических жидкостей / Н.И.Гурьянов, Б.А.Гурьянова, Я.А.Крылов, получено поло;дгтедьдое ре'лзгаю ВШИГПЭ от 25.02.SI г.

5. Заявка W 4820232/ХЭУо48194 от 26.04.S0 г. Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей / КЛЬГурьянов, Р.Х.Юоупов, В.П.Кокспя, В.А.Гурьянсвэ, Г.Х.Ильясова, получено положительное решение ВЕШГПЗ от 28.П.91 г»

6. Гурьянов В.И., Юсупов Р.Х., Гурьянова В,А., Коксия з.П, Использование сыворотки крови кур для культивировать клеток тканей животных // ология. - IS9I. - В 3D. - С,67-63.

7. Гурьянов H.H., Юсупов Р.Х., Гурьянова В.А., коксин В,П. Свойства сыворотка крови плодов коров, ■ полученной по новой технологии // вирусология. - 1991. - й 12. - С.63-64,

Заказ V 40. Подписано в печать 12,03.92, Формат 60 х 84 /16 Бумага писчая. Печать офсетная. I п.'л. Тиран 100 эн.\ ¿ИЛЬМ. г. Казань.