Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Препараты и методы, обеспечивающие эффективную трансплантацию эмбрионов крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Препараты и методы, обеспечивающие эффективную трансплантацию эмбрионов крупного рогатого скота"
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА
р д ( виж )
■ , .. И 1
На правах рукописи
СОВЕТКИН Станислав Васильевич
ПРЕПАРАТЫ И МЕТОДЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНУЮ ТРАНСПЛАНТАЦИЮ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Специальность 03.00.13 - Физиология человека и животных
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
п. Дубровины, Московская обл. 1994 г.
Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.
Официальные оппоненты :
1. Доктор биологических наук, профессор Ю.Д.Клинский ;
2. Доктор ветеринарных наук, профессор H.H. Михайлов ;
3. Доктор ветеринарных наук, профессор Ю.А.Малахов.
Ведущее научное учреждение:
Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии и биохимии питания сельскохозяйственных животных.
Защита состоится " ^А ^C-jU&^Uuj 1994 г. в
■i^C' часов на заседании специализированного совета Д 020.16.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.
Адрес института: 142012, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы.
С диссертацией в форме научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа.
Диссертация разослана " 'iQ" 1994 г.
Ученый секретарь специализированного совета,
доктор биологических наук П. А. Науменко
Актуальность про<?лод1Д. Успехи селекционно-генетической работы в животноводстве находятся в прямой зависимости от внедрения новых прогрессивных методов воспроизводства сельскохозяйственных животных, одним из которых является трансплантация эмбрионов. Это объясняется тем, что скорость генетических изменений (СГИ) прямо пропорциональна интенсивности селекции, ее точности, уровню наследуемости полезного признака и обратно пропорциональна интервалу между поколениями. По показателям интенсивности роста и продуктивности СГИ при трансплантации эмбрионов в животноводстве вше, чем при других методах селекции ( Smith С., 1986). Именно поэтому в ряде стран с развитый животноводством принята программа МОШ-шюжествен-кая овуляция.и пересадка эмбрионов, которая используется для получения быков-производителей от выдающихся родительских пар и сохранения генофонда редких и исчезающих пород животик (Эрнст JI.K., 1982; Михайлов Н.Н., 1990 ; GozBcxch ft. eí at, 1988 ; Ko/iCg l. etai, 1988; Smith C., 1988).
Новый биотехнологический метод воспроизводства открывает перспективы сохранения высокоценного генофонда животных неблагополучных по инфекционным болезням, особенно вирусной этиологии, кото-риэ нглболее часто встречаются у высокопродуктивных коров ei а2., 1982, 1983 ; Enejóme Н.Ъ. eto£¿982 ; А/аге U ct,
1985 ; Bowen J. гtot, 1983 ; Ohon C. et at ,1982).
Рэзультаты исследований,проведенные по возможности использования высокопродуктивных коров неблагополучных по отдельным инфекционным болезням в качестве доноров эмбрионов,оказались обнадеживавшими, однако, отдельные положения требовали дополнительных исследований с целью разработки соответствующих кетодических рекомендаций.
В технологии трансплантации эмбрионов важное кесто отводится разработке катодов, прэдупредцапгих возможность контаминации их патогенной и усяовнопатогекной клкро$ лорой, которые обеспечивает получете здоровых телят я профидактируют появление гикэкологичес-апх бояззетй, в частности эвдоезтритов, как у коров-доноров, так и у рзцшпзигов. йгзнно поэтому руководством международного общества по пбрзсадЕэ экбраонов (Мапиас of the Lritematcion а т-уа tza>is-Pe.~z ,1986) предусмотрен санитарный контроль гас качества. А.Д,Втгрсз в др. <1891) устанокии, что у коров-доиорсз
больных эццометритом, наблюдают частички или полную дегенерацию эмбрионов на разных стадиях их развития, при значительном числе не оплодотворенных яйцеклеток.
Повыпение эффективности трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных находится в прямой зависимости от качества используемых гормональных и санирующих препаратов, сред и питательных компонентов, входящих в юс состав. Поэтому разработка и внедрение в практику отечественных препаратов, аналогичных по качеству зарубежным, является практически важной и актуальной проблемой.
В последние годы практическое применение нашел метод получения эмбрионов вне организма,позволяющий более рационально использовать генетический потенциал самок сельскохозяйственных животных. В связи с этим представляется перспективным изучение факторов, влияющих на повышение оплодотворяемости яйцеклеток крупного рогатого скота с целью получения большего числа эмбрионов пригодных для пересадки.
Цель работы: Разработать некоторые теоретические основы и методологические способы повышения эффективности трансплантации эмбрионов, с использованием новых отечественных гормональных и санирующих препаратов, сред и питательных компонентов,¿ходящих в их состав, а также систему ветеринарно-санитарных требований,обеспечивающих получение здорового потомства от высокопродуктивных животных, неблагополучных по инфекционным болезням. Определить факторы, влияющие на получение большего числа эмбрионов при оплодотворении яйцеклеток коров вне организма.
9си<эвные задачи исследования'
- разработать промышленную технологию получения гонадотропно-го гормона из сыворотки крови жеребых кобыл (СШ) и усовершенствовать методы контроля гонадотропных препаратов в соответствии с международными требованиями;
- изучить эффективность применения гонадотропных препаратов (ФСГ и ГСШ) для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов
- создать питательную среду для культивирования и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных;
- изучить эффективность применения новых антимикробных препаратов для санации эмбрионов крупного рогатого скота ;
- предложить методы, обеспечивающие получение эмбрионов свободных от бактериальной и вирусной контаминации;
Актуальность проб^ену. Успехи селекционно-генетической работы в животноводстве находятся в прямой зависимости от внедрения новых прогрессивных методов воспроизводства сельскохозяйственных жи-. вотных, одним из которых является трансплантация эмбрионов. Это объясняется тем, что скорость генетических изменений (СГИ) прямо пропорциональна интенсивности селекции, ее точности, уровню наследуемости полезного признака и обратно пропорциональна интервалу между поколениями. По показателям интенсивности роста и продуктивности СГИ при трансплантации эмбрионов в животноводстве вше, чем при других методах селекции ( Smith С., 1986). Именно поэтов в ряде стран с развитым животноводством принята программа МОПЭ-шожествен-шя овуляция, и пересадка эмбрионов, которая используется для получения быков-производителей от ввдалцихся родительских пар и сохранения генофонда редких и исчезающих пород животных (Эрнст JI.K., 1982; Михайлов H.H., 1990 ; Gozßa.c/i П. et aß« 1988 ; König 1. et aß., 1988; Smith С., 1988).
Новый биотехнологический метод воспроизводства открывает перспективы сохранения высокоценного генофонда животных неблагополучных по инфекционным болезням, особенно вирусной этиологии, кото-ркэ наиболее часто встречаются у высокопродуктивных коров (Sinßh ei aß., 1982, 1983 ; Еa%£eso»->e И."Р. ütaE.je&Z ; Маге W.C/C>. U 1965 ; ßoNVßn J. etat, 1983 ; Ohon C. aß. ,1982).
Результаты исследований,проведенные по возможности использования высокопродуктивных коров неблагополучных по отдельным инфекционным болезшм в качестве доноров эмбрионов, оказались обнадеживающими, однако, отдельные положения требовали дополнительных исследований с целью разработки соответствующих методических рекомендаций.
В технологии трансплантации экбрионов важное место отводится разработке кэтодов, прздупреядаятх возможность контаминации их патогенной и услоаиотатогенной клкро^лорой, которые обеспечивают получение здоровых телят я профцлактируют появление гинекологических болзэгсзй, в частности эндонэтритов, как у коров-доноров, так и у рзцстпегаов. Игашо поэтов руководством меадаународного общества по порзсадзо экбраоноэ (Моиuaß afih е lntei)-iоtclohai еп?$--иуо tzansQe-i ,IS86) прёдускотрзн санитарный контроль их ка-чзства, А.Д,Вугрсв в др. <1281) устаносзла, что у коров-допореэ
а.
больных эвдометритом, наблюдают частичную иди полную дегенерацию эмбрионов на разных стадиях их развития, при значительном числе не оплодотворенных яйцеклеток.
Довыпение эффективности трансплантации эмбрионов сельскохозяй ственных животных находится в прямой зависимости от качества используемых гормональных и санирующих препаратов, сред и питательных компонентов, входящих в их состав. Поэтому разработка и внедрение в практику отечественных препаратов, аналогичных по качеству зарубежным, является практически важной и актуальной проблемой.
В последние годы практическое применение нашел метод получения эмбрионов вне организма,позволяющий более рационально использовать генетический потенциал самок сельскохозяйственных животных. В связи с этим представляется перспективным изучение факторов, влия щих на повышение оплодотворяемости яйцеклеток крупного рогатого скота с целью получения большего числа эмбрионов пригодных для пересадки.
Цель работы: {^работать некоторые теоретические основы и методологические способы повшения эффективности трансплантации эм брионов, с использованием новых отечественных гормональных и санирующих препаратов, сред и питательных компонентов,¿ходящих в их состав, а также систему ветеринарно-санитарных требований,обеспечивающих получение здорового потомства от высокопродуктивных живот ных,неблагополучных по инфекционным болезням. Определить факторы^ влияющие на получение большего числа эмбрионов при оплодотворении яйцеклеток коров вне организма.
Опновннв запачи исследования;
- разработать промшленную технологию получения гонад отропно-го гормона из сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) и усовершенствовать методы контроля гонадотропных препаратов в соответствии с меж дународними требованиями ;
- изучить эффективность применения гонад отрадных препаратов (ФСГ и ГСШ) для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов
- создать питательную среду для культивирования и транепланга ции эмбрионов сельскохозяйственных животных ;
- изучить эффективность применения новых антимикробных препаратов для санации эмбрионов крупного рогатого скота;
- предложить методы, обеспечивающие получение эмбрионов свобод ных от бактериальной и вирусной контаминации;
3.
- обосновать возможность использования высокопродуктивных коров, имеицих антитела к вирусам лейкоза и инфекционного риннотра-хеита (№1) в качестве доноров эмбрионов ;
- установить факторы, влияющие на оплодотворяемость яйцеклеток коров вне организма;
- разработать систему ветеринарно-санитарных мероприятий при трансплантации эмбрионов, обеспечивающую получение здоровых телят.
научная новизна; Впервые установлено наличие и форма содержания 14В свободном или связанном с ингибитором состоянии) фактора дифференцировки клеток в сыворотке крови у отдельных видов животных и амниотической жидкости коров, который ответственен за поддержание генетической стабильности в клеточных структурах, что особенно важно при культивировании эмбрионов, полученных вне организма. Ь зависимости от формы содержания и мезодермализуицей активности фактора дифференцировхи клеток в сыворотке >фови отдельных видов животных и амниотической жидкости коров,даны практические рекомендации по их применение в средах при культивировании и трансплантации эмбрионов.
В отличии от известных способов получения гонадотропного гормона из сыворотки крови жеребых кобыл 1ОДО, применение спиртово-буферного солевого раствора позволяет снизить потери гормона на на стадии осаждения основной массы балластных белков, при достаточно высокой степени его очистки, ото достигается созданием оптимальных технологических условий, препятствущих адсорбции гормона на поверхности осаждаемых белков, препарат по своим биологическим свойствам эффективен и не вызывает аллергических реакций у животных при его применении.
Изучены факторы, влияющие на оплодотворяемость яйцеклеток коров вне организма, и определены условия для получения большего числа эмбрионов.
Научная новизна работы подтверждена авторскими свидетельствами; № 1726453 "Способ получения гонадотрошша" ; № ¿424163 "Способ изготовления среды для вымывания и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота" ; № 1676669 "Основа питательных сред для вымывания, культивирования и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных".
Практическая значимость. Разработаны и внедрены в промышленное производство: технология получения препарата Тонадотропин очищенный - ГСЖ" ; фосфатво-буферная среда, сыворотка крови северных оленей, амниотическая жидкость крупного рогатого скота и комплексный санирующий препарат ГАМП для трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота.
Предложена и внедрена система мер, обеспечивающая сохранение высокоценного генофовда крупного рогатого скота и получение здоровых телят, включающая:
- ветеринарно-санитарнне требования к центрам и пунктам по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота ;
- положение "О порядке ввоза, хранения и использования эмбрионов сельскохозяйственных животных, поступающих в СССР по импорту";
- методические указания "О мероприятиях при использовании в качестве доноров эмбрионов высокопродуктивных коров, имеющих в сыворотке крови антитела к вирусу лейкоза';
- методика по предупреждению передачи возбудителей вирусной этиологии при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота;
- методика по контролю качества сыворотки крови, используемой в средах при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота ;
- наставление по применению комплексного санирующего препарата ГАМП для культур клеток и эмбрионов крупного рогатого скота;
- наставление по применению амниотической жидкости крупного рогатого скота для биотехнологических работ.
На основании проведения комплексных исследований, совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом животноводства, разработан и внедрен в практику ГОСТ 28424-90 "Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия".
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях и симпозиумах:
- Всесоюзная научно-техническая конференция "Применение биотехнологий в животноводстве, растеневодстве и ветеринарной медицине", Ленинград, 1988;
- Всесоюзная научная конференция "Научные основы профилактики и лечения патологии воспроизводительной функции сельскохозяйственных животных", Воронеж, 1968;
- Всесоюзная конференция "Эпизоотология, эпидемиология, сре-
детва диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, обидах для селовека и животных", Львов, Х^Ш;
- Европейская конференция "Трансплантация эмбрионов, лейкоз крупного рогатого скота", Мадрид, 1966;
- Всесоюзная научная конференция "Совершенствование государственного контроля ветеринарных препаратов", иосква,
- Российско-герьгшский сиылозиуы "Успехи биотехнологии в разложении с.-х. животных", Вша, ¿|убровицы, ;
- Ученых советах ВГ1Ш ветцрепаратов в гг.
Разработки по материалам диссертационной работы удостоены
црсыш! Совета министров СССР за г., демонстрировались на ЕДНХ СССР и ВВЦ Ва и удостоены пяти серебря!мых и одной бронзовой медалей (.удостоверения № 355^, ЛСсйЗ, 3658, £4б?8 и 132"/).
Публикация результатов исследований, ио материалам диссертации опубликовано ЗЬ работ, в т.ч. 3 авторских свидетельства н 3 зашшчитзжьных отчета.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: результаты научных исследований, позволившие разработать и внедрить в практику отечественные препараты, и некоторые теоретические вопросы повышения эоуэитивности трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, схстоху мер, оСзспечиващуо сохранение высокоценного гексфовда крупного рогатого скота, в той числе неблагополучного па ш^эгщиошзи заболевания* вируской этиологии.
Обьем и структура научного докяада. Научный доклад изложен на 50 страницах, содерзшт 17 таблиц и вклвчазт следующие разделы: общая характеристика работы, интервалы и иетоды исследований, результаты исследовании, выводы, практические предложения, список работ, оцублжозеккых по тзиз диссертациоииого доклада.
С 0 £ С 1' 3 £ Н Н !-! £ Л С С .'1 & Д О В ¿111 И £
►¿и&да..^ и входа
Рабога выполнена в гг. во Всероссийской государст-
венной наушо-иесдадоватедьскоц институте контроля, сгандарткза-цка а серягдокацш: вэсеркнарных препаратов, огдедькые раедэлы -ооз!:еза:о с отдеаон гранспяак5ац1ш змбриенсз сельскохозяйственных пилонах Всероссийского каукко-исшгедойагельского института кивот-кезодстаа и цзнарах (вунагах) по трансплантации зкбркокоз крупного рогатого снова области Ш13 "Пзтрозскоо" н ГПЗ "Заря-
Разработку технология получения генадотропного гормона из СЯК с 1974 по 1980 гг. проводили во Всесоюзном научно-технологическом институте биологической промшленности, а затем во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов (в период 1960-1991 гг.).
Проведены комиссионные испытания технологии получения гона-дотропного гормона из СЖ и эффективности его применения для сти-. цуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов в различных регионах страны по отношению известных гонадотропных препаратов, полученных из передней доли гипофиза свиней - $СГ (фирмы ЗсЬеы-^) США), грвфоллон (СССР), и сыворотки крови жеребых кобыл - фол-лиг он (Голлацция).
В опытные группы отбирали клинически здоровых животных с четко выраженным половым циклом в возрасте от 4 до 7 лет и молочной продуктивностью не ниже 7,0 тыс. кг молока в год. Всего в опытах -было использовано 138 коров-доноров эмбрионов.
Гормональную обработку животных и оценку качества эмбрионов проводили согласно инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (Ы. 1987).
Оценку качества гонадотропных препаратов определяли по реакции яичников у коров-доноров полиовуляцией (число желтых тел), количеству полноценных и дегенерированных эмбрионов, неоплодот-воренных яйцеклеток и приживляемости эмбрионов у реципиентов.
фи разработке среды для трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота подбирали соли отечественных марок в оптимальных соотношениях. Оптимальную концентрацию водородных ионов (рЫ) среды определяли культивированием мышиных эмбрионов на стадии 8-16 бластометров в течении 24 часов по методу Кауффолда (1987). В последующем,качество трех производственных серий среды определяли культивированием эмбрионов крупного рогатого скота, с последующей их морфологической оценкой и определением приживляемости их у реципиентов.
Отдельные показатели, характеризующие качество среды,устанавливали методом культивирования эмбрионов крупного рогатого скота и лабораторных животных (по Кауффсльду).
С целью научного обоснования возможности замены дефицитной и дорогостоящей фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота на другие питательные основы для использования в средах при
^зревании, оплодотворении яйцеклеток, культивировании и транс-глантации эмбрионов, проведены биохимические и радиоиммунологи-геские исследования сыворотки крови - северных оленей, овец, крупно-'о рогатого скота, амниотической жидкости коров и Детальной сыво-зотки крови крупного рогатого скота (<£ирмы " Se.~2.vo. США). Био-симическими методами определяли - общий белок, триглицериды, сводный гемоглобин, глюкозу, пировиноградную кислоту и концентрацию зодородных ионов СрЮ, радиоиммунологическими методами - эстриол, ¡строн, эстрадиол, коргизол и прогестерон (Ткачев Г.А. и др., [983).
Ростовые свойства сывороток крови животных различных видов «следовали на культурах клеток 1ВК, ТВ и РВТЯ .
Содержание дифференцирующего фактора в фетальной сыворотке {РС, сыворотке крови - северных оленей, крупного рогатого скота 1 амниотической жидкости коров определяли на раннеэмбриональных {летках шпорцевой лягушку ( Хепормэ по методу Сузуки
[1981).
Проведена серия опытов по сравнительной оценке биологического качества сыворотки крови животных различных видов и амниоти-геской жидкости крупного рогатого скота при дозревании и оплодотворении яйцеклеток, культивировании зигот с учетом стадии их развития. При культивировании эмбрионов крупного рогатого скота в градах, содержащих сыворотку крови северных оленей, проводили морфологическую их оценку, а в последующем определяли приживляе-яость их у реципиентов.
фи разработке научно обоснованных систем мер по профилактике передач возбудителей вирусных инфекций при трансплантации эмбрионов, исследовали коров-доноров, реципиентов и телят-трансплантатов в 6, 9 и 12 месяяном возрасте на наличие в сыворотке крови антител к вирусам лейкоза и инфекционного ринотрахеита на базе центров и пунктов по трансплантации эмбрионов ГПЗ "Петровское", ГПЗ "Заря Ко!5$гнизма" Московской области и производственного объединения "Волго-Дон" Волгоградской области.
Изучение локализации вируса ИРТ в тканях репродуктивных органов прозели на 8 половозрелых телках живой массой 270-300 кг, вэ гадящих в сыворотке крови антитела к этому вирусу. Сформированы 4 группы по 2 телки в каздоЯ. Еявотных заражали на слизистую ногах ходов, на слизистую влвуалкца, соответственно ю 2 ил Еярусосодерзагрй суспепзкоЗ в титре 10 Щ 60 мл.
Выделение вируса из тканей репродуктивных органов (яичники, ооциты, яйцеводы, рога и тело матки, шейка латки, влагалище) проводили гомогенизацией их в среде 199 в соотношении 1:10, Результаты исследований учитывали по наличию или отсутствию цитопатичес-ного эффекта в трех последовательных пассажах по отношению контрольной культуры клеток ГОК. Заражение культуры клеток ШК проводи ли над осад очной жидкостью после гомогенизации тканей репродуктивных органов.
Эффективность применения 0,25^-ного раствора трипсина, 0,3^-ного раствора гиалуронидаэы и специфической ангисыворотки для деконташнации эмбрионов от возбудителей вирусных инфекций исследовали на экспериментально зараженных ин вятро эмбрионов вирусом ИРГ в концентрации 10® ТЦЦ 50/ил.
Безвредность 0,25^-ного раствора трипсина отечественного производства проверяли при дозревании ооцитов, оплодотворении яйцеклеток и культивировании зигот, а также на эмбрионах полученных от коров-доноров с учетом их приживляемости у реципиентов.
Возможность передачи воз(будителей инфекционных болезней вирусной этиологии изучали на грушах животных, подобранных по результатам определения в сыворотке крови антител к вирусам лейкоза (в реакции-имцунод»ффузии-Н1Д), а инфекционного ринотра-хеита- (РИГА и РН). На основании серологических исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусам лейкоза и ИРТ сф ормированы 4 группы животных ; донор-серопозитивиый, реципиент серонегативный, донор и реципиент-серопозитивные ; донор-серонегативный, реципиент-серопозитивный; донор и реципиент се-ронегативиые.
Сыворотку крови телят трансплантантов, полученных от подопытных групп животных исследовали в 6, 9 и 12 месячном возрасте на наличие антител к вирусам лейкоза и ИРТ.
С целью научного обоснования применения новых комплексных санирующих препаратов при трансплантации эмбрионов, определена чувствительность 22 бактериальных изолятов,выделенных из сред после извлечения эмбрионов от коров-доноров к 16 антибактериальным препаратам (инструкция по применению дисков для определения чувствительности к антибиотикам, утвервденных Минздравом .СССР, 1984 г.).
Бактерицидную дозу новых санирующих препаратов ГАМП, Спермо-ан-ППК и известных Спермосан-3, канаыицин, пенициллин исследо-
[. pneumoniae ¿о(.9/49IK-I6), Is-------?....., зе
Lny.Stz, pneumoniae №U} 9s. ae z^iqinosa (и/сыо)) St. au-t&us Ю1108, как монокультуре, так и в'ассоциации, методом серийных раэ-)едений.
Безвредность санирующих препаратов ГАМП и Спермосан-ППК для эмб-жонов определяли методом оплодотворения яйцеклеток и культивировав-тая зигот крупного рогатого скота в средах, содержащих различные 10зы испытуемых препаратов.
Эффективность пргаизнения новых санирующих препаратов учитывали ю результатам трансплантации эмбрионов реципиент tn. В контрольных группах извлечение эмбрионов от коров-доноров и пересадку их реципи-зкгам проводили с внесением в фосфатно-буфериую среду пенициллина в дозе 100 ДД/см3 и без применения антибактериальных препаратов.
Оплодотворяющую способность спермы 32 быков-производителей.принадлежал;® Центральной станции искусственного осеменения, определяли по оплодотворению яйцеклетки крупного рогатого скота по методу Брак-кета (1981), не кзнзе чем в трехкратной повторности. Исследовано SSß эякулятов ка 4828 яйцеклетках. После каждого опыта экбрионы подвергали цит га огтезскому анализу с окраской лакмоидом.
Результаты по оплодотворению яйцеклеток ин витро сопоставляли с оплодотворением коров ин виво (по «отчетам,поступившим из хозяйств) за период 1985-1990 гг.
Изучена позмогхность использования спермотеста для определения стспсни токсичности срэд, полистироловых ташек Ц«три отетественно-го и зарубежного производства,по показателя!.! абсолютной выживаемости спергямз ( 5 ) и выживаемости спермиев в часах.
Статистическая обработка результатов исследований проводилась с прикзкэняоа биоизтриадских методов (Е.К.Меркурьева, 1964).
ВЗУЛЬТАШ КССДЕД0Е4НКЙ
' I. РАЗРАБОТКА. ШОДШВДШ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ГСШДОТРОПНОГО ГОР,ЮНА ИЗ СШгС И ПРОВЕРКА ЭШК-ХИШЮСШ ЕГО ПШШНЕНШ В ВЗТЕКЖЙИ И ШВОТ-HOBOJUш
1али на штаммах микроорганизмов
1.1. Совзщанствоваиие матаавяи ишдалршт (тнсибшаяитш
СВ9ЙРТР РЮ<?РОТКН ЗР9ВИ и. штваддр
Наряду °о специфической активностью важным показателем, определяющим биологическое качество гормональных препаратов, является отсутствие побочных реакций при их введении животно^.
Многолетняя практика применения СШ в животноводстве показала, что данный препарат вызывает у животных аллергические реакции немедленного типа, нередко с летальным исходом, особенно у высокопродуктивных коров. В то же время именно у этой части животные наиболее часто встречается гипофункция яичников,наступающий из-за различных нарушений технологии их содержания и кормления.
Для разработки промышленной технологии получения гвнадотроп-ного гормона из СЖ необходимо было усовершенствовать метод определения сенсибилизирующих свойств гормональных препаратов и установить минимальную гормональную активность препарата (м.е/мг белка) не вызывающую аллергических реакций у животных.
В опытах изучены сенсибилизирующие свойства двух серий СШ (Орской биофабрики) с гормональной активностью 280 и 300 м.е/см3.
В течение трех дней шести морским свинкам массой 300-400 г подкожно вводили по 0,15-0,2 см3 (10-14 мг белка) сыворотки крови крупного рогатого скота, а через 18 дней - разрешающую дозу СЖ -в объеме 1,5-2,0 см3 (100-140 мг белка). Опыты проведены в трех- ' кратной повториости.
Дри введении разрешающей дозы СШ у 40-50^ животных наблюдается выраженная аллергияеская реакция, а 50-60^ животных погибали от анафклассического шока.
Учитывая, что по антигенным свойствам сыворотка крови жеребых кобыл отличается от сыворотки крови крупного рогатого скота, нами были поставлены опыты с СЯК тех же серий по описанной выше методике.
Сенсибилизацию морских свинок проведши СШ. В каждом из трех опытов использовали от 5 до 10 евхиок массой 300-400 г.
Установлено, что введение разрешающей дозы С2К вызывает гибель животные в 90% случаев, вследствие большего накопление в ■ г, сыворотке крови специфических антител. Чувствительность метода,
увеличилась на ЗОЙ.
Серия опытов проведена по изучению алафилактогекиостж СШ тех же серий, исходя из дозы рекомендованой дня лечения гипо-
функции яичников для коров 5-8 м.е./кг живой массы. Сенсибилизирующая доза составляла 3-4 м.е., а разрешающая - 30-40 м.е. на животное. Контрольной груше животных в течение первьк 3-х дней вводили 0,2 см3 физиологического раствора, а на 1Ь день 2,0 см3 (Ж.
После введения разрешавшей дозы препарата у подопытных и контрольных животных учитывали степень проявления аллергических реакций:
- слабая (легкое возбуждение, почесывание, взъерошенная шерстка) ;
- умеренная (сильное возбуждение, чихание, учащенное дыхание) ;
- сильная (приступ судорожного кашля, нарушение координации движения, паралич конечностей, боковое положение, непроизвольное выделение мочи и дефекация).
В результате проведенных исследований установлено, что при введении разрешающей дозы СКК гибель животных наступала в 30% случаев, сильная реакция отмечена у 60% и умеренная -уЮ% морских свинок. В контрольной группе животных аллергических реакций не отмечено.
При паталогоанатомическом вскрытии павших животных наблюдается типичная картина гибели животных от анафилактического тока (нровоизлияние в легких и почках).
По разработанному наш способу очистки гонадотропного гормона, в лабораторных условиях получено от 3 до 7 серий препарата, из Ж с различной гормональной активностью. В сериях препарата определяли содержание обшего :белка во флаконе (биуретовкм: методам ) и общую гормональную активность (мышино-маточным тестом), а затем рассчитывали удельную активность препарата на I мг белка.
Установлено, что при гормональной активности СШ 80-120, 140-160, 180-220 и 240-300 м.е./см3 в готовой лекарственной форме гормональная активность препарата находится соответственно в пределах 10-21, 24-32, 44-67 и 73-104 м.е./мг белка.
Степень проявления аллергических реакций у морских свинок тосле введения им разрешавшей дозы гонадотропина очищенного -- ГСЖ с различной гормональной активностью представлены в таблице I.
Таблица I
Проявление аллергических реакций у морских свинок в зависимости от гормональной активности препарата ГСЖ
Гормональная активность препарата м.е./мг белка Количество опытов Число животных Алл ергичёская_|зеакуия_ слабая сильная
Коли- % чество „свинок____ Коли- % чество _свинок______
10-21 4 20 ~~8 40~ ~3 15~
24-32 4 . 20 5 25 I 5
44х-67 5 25 2х 8 _ -
73-104 4 20 _ - — -
Число
%
I
- реакция отсутствует х - анафилаксическая реакция при применении препарата с гормональной активностью 44 м.е./мг белка.
Из данных, представленных в таблице следует, что гонадотроп-ные црепараты, полученные из СЖ о гормональной активностью от
10 до 32 м.е./мг белка могут вызывать аллергические реакции с различной степенью тяжести у отдельных видов самок сельскохозяйственных животных с повышенной реактогенностью к белковым антигенам. Слабая аллергическая реакция может проявиться у отдельных животных при введении им препарата с гормональной активностью 44 м.е./мг белка. Гонадотропные црепараты ГСЩ с гормональной активностью от 50 м.е./мг белка и выше могут быть использованы для лечения некоторых видов гинекологических болезней, регуляции половой охоты и стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов без предварительной проверки их сенсибилизирующих свойств.
1.2. Разработка промышленной технологии получения гонадотропного препарата из СШ
Предложен ряд способов выделения и очистки гонадотропного гормона из СЖ - спиртовый, ацетоновый, ривально-спиртовый и дру> гие (П.И.Шаталов и др., 1975 ; Се^рос/аго^бг *2>. «Я 0^967, 1972 ; В.А.Першин и др., 1965). Однако, ни один из них не нашел применения при промышленном производстве гонадотропного гормона из СЖ, несмотря на достаточно высокую степень очистки конечного
фодунга от балластных белков.
Одной из основных причин, препятствующих внедрению указаниях способов очистки гонадотропного гормона получаемого из СЖ, шляется недостаточно высокий выход препарата от исходного содер-кания его в сырье при промышленном способе получения.
В лабораторных условиях, с использованием одних и тех же зерий (Ж (280-300 м.е./см3), нами проведено выделение гонадотропного гормона - спиртовым (а.Ю.Рышка, 1975 ; В.А.Першин и др., [985) и ривально-спиртовым способами. Получено по 6 серий препарата. Выход гонадотропного гормона от исходного содержания его в 2ирье при использовании спиртового метода не превышал 49%, ри-ванольно-спиртового - 42%. Удельная гормональная активность препаратов находилась соответственно в пределах 89-102 и 24-31 м.е./мг белка.
Установлено, что наиболее высокие потери гормона (39-52$) происходят на 1-ой стадии осадцения при отделении полиглобулин-альбуминового комплекса,
С целью снижения потери гонадотропного гормона СЖ на стации отделения его от основной массы белков, нами предложена спиртово-буфернал солевая смесь, состоятая из 10 М раствора уксусной кислоты (20,3%), 4 М раствора уксуснокислого натрия (10,2%) и 96% раствора этилового спирта (69,5%).
Нарушение оптимального соотношения компонентов, входящих в состав спиргово-буферной смеси сопровождается изменением выхода гормона из СЖ, удельной его активности на I мг белка и соотношения ЩСГ/ЛГ.
Установлено, что при реакторном изготовлении препарата использование спиртово-буферной смеси, охлажденной до 6°С, обеспечивает полную коагуляцию белка три pH 4,8-5,1 в течение 60 мин. при постоянной работе якорной мешалки (частота вращения не более 40 об/мин). Постоянное перемешивание белковой суспензии препятствует образованию обильного хлопьевидного осадка и сорбции на ней гонадотропного гормона.
После отделения белковой суспензии на проточной центрифуге или сепараторе, прозрачный центрифугат, содержащий до 85% гормона от исходного содержания его в С£К вновь помешают в реактор.
Осаждение гонадотропного гормона из центрифугата проводят после его охлаждения до 3-5°С 96° этанолом до конечной концентра-
ции его в растворе 72-73°.
На данной стадии очистка гонадотропного гормона от балластных белков составляет 87-91%.
Полученный осадок белка, содержащий гонадотропный гормон, суспензируют в 9-10 литрах физиологического раствора и доводят I Н раствором Na ОН до рН 7,5-7,6. Денатурированные белки отделяют на рефрижераторной центрифуге при температуре 5-7°С. Полученный недостаточный раствор, содержащий 69-76% гормона подвергают стерилизующей фильтрации, а затем лиофильной сушке. Потери гормона на стадии стерилизующей фильтрации не превышают 1%. В качестве наполнителя используют аминоуксусную кислоту.
Очистка гормона от балластных белков составляет 98-99%.
Установлено, что выход гонадотропного гормона из СШ не зависит от ее гормональной активности (от 100 до 300 м.е./см3). Однако, с целью предупреждения анафилаксических реакций у животных, особенно у крупного рогатого енота, нами рекомендовано использовать СЖ для получения препарата с гормональной активностью не менее 180 м.е./см3.
Результаты комиссионной проверки промышленной технологии получения гонадотропного гормона из СШ, проведенной в 1976 году на Херсонской биофабрике, показали преимущество предлагаемого нами способа. Выход гормона от исходного содержания в сырье был выше на 39fa по отношению к способу, предложенному Ф.Ю.Рышка и др., 1975 (Таблица 2).
Таблица 2
Сравнительная оценка технологии получения гонадотропного гормона из СШ
Наименова- Номер Актив- Взято СШ ние препа- серии ность
рата Умл __________________м-е-/мл ров___м.е.
Гонадотро- I пин - ГСШ
Гонц^отропин 2
Гравогормон 'по методу .Ю.Рышка;
1
2
200 200 200
200
150 30000
150 30000
150 30000
150 30000
Получено препа- Выход
рата гормона
---------- из СЖ
тыс. м.е. во
_м.е.,__флаконе_
17794 6200
25494 6200
10950 5800
9002. 5800
в
59,3 85,0 36,5
.30,0
С 1990 года Московский эндокринный завод приступил к серийному выпуску препарата 'Тонадотропин очищенный - ГСВК". Изготовлено в 1991-1992 гг. 16 серий препарата в количестве 370 тыс. овцедоз (I овцедоза - 1000 м.е.). Б 1994 году планируется выпустить I млн. овцедоз. Рекламаций на качество препарата на завод и ВГНКИ ветпрепаратов не поступало. Препарат выпускают лиофильно-высушенным во флаконах вместимостью 5,0 см3, стерильным с гормональной активностью 1200-1800 м.е. во флаконе, содержанием эстра-диола 97,6+6,1 пг/см3, белка 12,3+0,4 мг, соотношением ^Г/ЛГ 2,9+0,3:1,рН -7,2-7,3. Срок годности 3 года с момента выпуска препарата.
Подготовлена и представлена к утверждению в Госстандарт 2-ая редакция проекта ГОСТа "Гонадотропные препараты. Технические условия", в котором предусмотрен выпуск гормональных препаратов (ГСЖ, '(¿СГ и ЛГ) в соответствии с международными требованиями в интернациональных единицах (ИЕ) с использованием национальных стандартов.
1.3. 'Тонадотропин очищенный - ГОШ" для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов
Наряду с фолликулостимулируюишми препаратами (агСГ), получаемыми из передней доли гипофиза свиней, в отечественной и зарубежной практике широко применяют препараты ГСЖ, особенно при однократной гормональной обработке коров-доноров эмбрионов.
Оценку эффективности применения препарата 'Тонадотропин очищенный - ГСЖ" для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов проводили по отношению аналогичного препарата ГСШК фоллигон (Голландия) и гипофизарных препаратов - ФСГ (ФСГ-р, и грофоллон), согласно наставлениям по их применению. Препарат 'Тонадотропин очищенный - ГСЖ" испытывали в различных регионах страны в дозе 7,0-9,0 тыс. м.е. на животное.
Результаты сравнительной оценки эффективности црименения гонадотропных препаратов (4&СГ и ГСШ) представлены в таблице 3.
Таблица 3
Эффективность применения гонадотропных препаратов для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов
Показатель _______________С2ЕМ2й§йьные_препараты___________
Гонадотропин ^оллигон ФСГ-р Грофоллон
очищенный -ПЖ
Коров-доноров
Реагировало полиовуляцией от 5-6 желтых тел и более, %
Число желтых тел 8,70+0,94 на донора
Число эмбрионов и яйцеклеток на донора
в том числе:
59 83,1
5,50+1,07
качественных эмбрионов
дегенерирован-ных эмбрионов
3,86+0,75 0,92+0,36
25 69,2
5,71+0,63 2,85+0,73
2,25+0,67 0,40+0,21
41
84,2
40 85,0
6,65+0,58 7,00+0,87
5,13+1,79 6,70+0,94
3,64+0,50 3,60+0,43
0,95+0,34 2,80+0,39
Сравнительная оценка эффективности применения отечественного препарата ГСШ для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов показала, что при его применении число животных,реагирующих полиовуляцией было на 13,9% выше по отношению импортного препарата "Фоллигон". Ни в одном случае не отмечено проявлений анафилак-сических реакций у животных и патоморфологических изменений со стороны яичников (фолликулярные, лютеиновые киоты). Не выявлено существенных различий по времени повторного прихода коров в охоту по отношению групп животных,обработанных препаратами ФСГ.
Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат "Гонадотропин очинённый - ГСШ" не уступает по биологическим свойствам аналогичным импортным препаратам и может быть использован для обработки коров-доноров наряду с фолликустимулирушими препаратами (аСГ) гипофизарного происхождения.
Положительные результаты были получены нами и другими исслед! вателями при применении препарата "Гонадотропин очищенный" для ле> чения гипофункции яичциков у коров и регуляции половой охоты у др; гих видов самок сельскохозяйственных животных.
2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПИТАТЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕ/ШХ В СР£Щ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ
Изучены некоторые биохимические и биологические показатели, определявшие качество сыворотки крови у отдельных видов животных и амниотической жидкости крупного рогатого скота;и дана оценка эффективности их применения в средах для получения эмбрионов ин витро и ин виво.
2.1. Биохимическая и биологическая характеристика питательных компонентов
Одним из основных компонентов, определяющих эффективность сред, используемых при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, является сыворотка крови. Наиболее широко в средах для культивирования, замораживания и трансплантации эмбрионов применяют фатальную сыворотку крупного рогатого скота и альбумин бычьей сыворотки крови. Положительное влияние на развитие эмбрионов ин витро отмечено при применении в средах сыворотки крови человека, свиньи, овец, бычков-кастратов, коров в острусе, а также маточных секретов.
Следует отметить, что подбор питательных основ, используемых в средах для дозревания яйцеклеток, оплодотворения, культивирования эмбрионов проводится в основном эмпирическим путем, без глубоких биологических и биохимических исследований, которые необходимы для разработки объективных показателей оценки их качества, а также теоретического обоснования для внесения отдельных компонентов (биологически активных вешеств, в частности, гормонов) в среды, применяемые при трансплантации эмбрионов. С этой целью нагл! изучены отдельные биохимические показатели сыворотки крови животных некоторых ввдов и амниотической жидкости крупного рогатого скота. Полученные результаты обобщены в таблице 4.
Установленные в сыворотке крови сельскохозяйственных животных и амниотической жидкости крупного рогатого скота параметры по содержанию отдельных биохимических вешеств (глюкоза, молочная и лировиноградная кислота, стероидные гормоны, свободный гемоглобин, рН и т.д.), которые выполняют важную роль в поддержании биологи-
Таблица 4
Некоторые биохимические показатели питательных компонентов, используемых " в средах при культивировании и трансплантации эмбрионов
Показатель
Сыворотка крови
Легальная крс (п =9)
Северных оленей 9)
Крупного рогатого скота (п =5)_
Овец (п =5)
Амниотическая жидкость коров (п =7'
Общий белок, Г/5 Триглицериды, мг % Холестерин, мг % Глюкоза, мг %
кислота, мг
Лактат, мг %
Свободный гемоглобин, мг %
РН'
Кортизол (НГ/мв) Кор^икостерон,
Прогестерон (нг/Мл)
Тестостерон (НГ/мл)
Эстродиол (ПГ/мл)
4,78+0,27 следы 43,53+2,46 185,0 +32,10
1,64+0,10 184,13+19,23
66,00±2,41 7,50+0,08 3,76±0,29
2,40±0,Ю 0,Ц±0,02
0,Й1±0,01 9,36±0,98
6,91+0,24 5,72±0,09 45,75+3,80 21,37+4,71
1,30+0,03 179,15+16,97
140,31±П,47 7,56+0,05 57,19+2,69
13,08+0,73 0,67+0,12
0,63±0,02 12,67+1,84
9,54+0,17 6,27+0,26 99,17+6,99 198,90+6,07
0,23+0,01 167,11+15,04
8б,86±7,91 7,58+0,02 16,08+0,71
3,90+0,04 0,19+0,03
0,12+0,01 11,19+1,05
7,30+0,17 19,87+1,08 77,22+1,50 42,11+3,24
1,07+0,04 _х
78,57+19,66 8,03+0,05
0,39+0,07 следы 23,16+1,58 6,19+0,22
I,51+0,13 89,26+9,04
следы
7,29+0,02
6,84+0,21
2,93+0,07 0,33+0,06
0,15±0,02 13,18+0,69
х - не исследовано
ческой полноценности эмбрионов, особенно при получении их ин витро, могут являться критерием оценки их качества и научным обоснованием внесения добавок биологически активных соединений в питательные среды.
При дозревании, оплодотворении яйцеклеток и культивировании эмбрионов в среды вносили сыворотку крови северных оленей в объеме 20% с концентрацией свободного гемоглобина 60, 100, 140, 180, 220 и 240 мг %. Не выявлено статистически достоверных различий по числу оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов, достигших стадии развития 6-£ бластомеров, при концентрации свободного гемоглобина в сыворотке крови до 140 мг %. Достоверное снижение оплодотворенных яйцеклеток наблюдается в средах, содержащих сыворотку крови с концентрацией гемоглобина выше 220 мг %.
Сыворотка крови, содержащая свободный гемоглобин в концентрации 240 мг %, оказалась токсичной и для культуры клеток ГОК. Индекс пролиферации клеток в культуре после трех последовательных пассажей составил в среднем 0,97+0,16, отмечается также вакуолизация цитоплазмы и пикноз. При концентрации свободного гемоглобина ниже 160 мг %, ивдекс пролиферации клеток составил 2,51+ 0,14, без патоморфологических изменений культуры клеток (Р<0,01).
Показано, что для контроля качества сыворотки крови наряду с методом определения числа оплодотворенных яйцеклеток и развития эмбрионов, можно использовать и культуру клеток.
На биологическую полноценность эмбрионов, а следовательно и приживляемость их у реципиентов, большое влияние оказывает рН среды.
При культивировании мышиных эмбрионов на стадии развития ранней морулы, с морфологической оценкой "хорошие" и "отличные" в течение 24 часов цри 37°С в фосфатно-буферной среде с рН 6,4 ; 6,8 ; 7,0 ; 7,2 ; 7,4 ; 7,6 и 7,8 установлено оптимальное значение рН и возможность использования данного метода для оценки качества сред. Так, при значении рН среды, равном 7,0 ; 7,2 ; 7,4 и 7,6 стадии поздней морулы соответственно достигли 18,1$, 83,3%, 66,6% и 1Ъ% омбрионов. Оптимальным рН фосфатно-буферной среды для трансплантации эмбрионов является 7,2-7,4. Эти данные подтверждены и при культивировании эмбрионов крупного рогатого скота.
Известно, что необходимым условием при длительном культивировании клеток на внеклеточных матриксах является присутствие в них дифференцирующего фактора, который ответственен за создание условий, обеспечивавших генетическую стабильность клеточных линий.
При исследовании нативной сыворотки крови животных и амниотичес-кой жидкости коров наиболыцую мезодермализуюшую активность проявляет сыворотка крови северных оленей, а наименьшую - сыворотка крови крупного рогатого скота.
Сыворотка крови северных оленей в концентрации в средах 10% вызывает образование мезодермальных производных в эксплантатах до 80%, из которых 67% развиваются в туловипшо-хвостовые структуры. Кратковременное прогревание сыворотки крови северных оленей приводит к резкому снижению активности дифференцирующего фактора, тогда как в амниотичес-кой жидкости и фетальной сыворотке крови крупного рогатого скота к его повышению.
Амниотическая жидкость коров и фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота, после тепловой обработки и последующем добавлении в среду до 10% концентрации, обеспечивает индукцию клеток в 100% случаев. Из этого количества до 70% приходится на эпадермальные пузыри с мышечными волокнами и 30% - на туловипшо-хвостовые структуры. Активированная прогреванием сыворотка крови крупного рогатого скота в той же концентрации дает иццукцию клеток лишь в 20% случаев (эпидермальные пузыри с мезенхимой).
Проведенные наш исследования по изучению фактора диффере'нцировки клеток в сыворотке крови отдельных видов животных и амниотической жидкости крупного рогатого скота, способов его активации в зависимости 01 формы его содержания, раскрывает перспективы поддержания генетической стабильности в эмбриональных клетках, особенно у эмбрионов, получению ин витро. На важность этих исследований указывают работы КсуЬягогУ. е£с (1988), которые установили, что число хромасомных нарушений у эмбрионов, полученных ин витро, увеличивается по мере их культивирования и может достигать 36%.
2.2. Эффективность применения в средах различных питательных основ при получении эмбрионов ин виво и ин витро Среды,в состав которых входят недорогостоящие биологически полноце! питательные компоненты (сыворотка крови и другие биологические жидкое?
1вляготся одним из основных факторов,определяющих качество эмбрио-10В получаемых ив виво и ин витро,и в конечном итоге определяют :ебестоимость эмбриопересадок.
Нами изучена возможность применения в средах для дозревания, эплодотворения яйцеклеток и культивирования зигот сыворотки крови се-зерньк оленей и амниотической жидкости коров в сравнении с известным компонентом - Детальной сыворотки крови крупного рогатого скора. Установлены их оптимальные концентрации в средах, которая для амниотической жидкости составляет 15-20% к объему среды, а для исследуемых сывороток крови 20%. При снижении (менее 10%) или увеличении 1х концентрации (более 30%) в средах при дозревании, оплодотворении и культивировании зигот резко снижается число оплодотворенных яйцеклеток и число эмбрионов, достигших 6-8 клеточной стадии развития.
Для оплодотворения яйцеклеток ин витро использовали свежепо-пученную от одних и тех же быков еперцу, проверенную по оплодотворяющей способности ин витро (концентрация спермиев 2x10 /см3).
Дозревание и оплодотворение ооцитов проводили в среде 199, культивирование зигот в среде Вринстера в газовой смеси (5% 5% 0^, 90% 2) • Концентрация амниотической жидкости и сыворотки крови в средах составляла 20$.
Бее эмбрионы фиксировали и подвергали цитологическому анализу с окраской лакмоадом. 1Ьзультаты исследований представлены в таблице 5.
Таблица 5
Результаты применения в средах различных питательных
основ для оплодотворения яйцеклеток и культивирования эмбрионов
Питательный компонент Число ооци- Оплодотворенных яйцекле- Стадия развития зигот (число &ла-стегаров)
тов ток 2-клетки 4-клетки 6-8 клеток
Число %
Число % число % Число %
I 2 3 4 5 6 7 6 9 10
Эстралькая сшзоротка крови коров (Б серий; 254 194 54,8 112 57,7 42 21,6 40 20,7
-___I___2_______3__4_____5______6_____7_____8_____9__10_.
Сыворотка 1242 529 42~6~~ 355 67 Д ~104 19~7~~70 13~2 крови северных оленей ПО серий)
Амниотичес- 860 420 48,8 244 58,1 92 21,9 84 20,0 кая жидкость коров СП серий)
детальная 307 134 44,3 103 75,7 21 15,4 12 8,9
сыворотка
крови КРС
(¡фирма
" ¿ег.К'а")
-3 серии
Контроль__________________________________________
Результаты экспериментальных исследований показывают, что по своим биологическим свойствам эстральная сыворотка крови коров, сыворотка крови северных оленей и амниотическая жидкость, полученная от коров при убое на 3-4 месяцев стельности;не уступает Детальной сыворотке крови крупного рогатого скота.
В опытах, проведенных в нашей лаборатории совместно с сотрудниками сектора клеточной биотехнологии ШЭВ им.Коваленко установлено, что при культивировании 25 зигот кролика в среде Бринстера, содержащей 2С% аышотической жидкости, стадии морулы и бластоцисты достигают 88%> эмбрионов, тогда как с фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота - 69,Полноценность развития эмбрионов подтверждена цитологическими исследованиями.
На базе центра по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных ВИЖа показана эффективность применения в фосфатно-буферной среде нативной сыворотки крови северных оленей. При культивировании 29 эмбрионов на стадии морулы с морфологической оценкой удовлетворительные и условно-годные в течении 19-24 час. 22 (75,8^) из них достигли стадии бластоцисты с морфологической оценкой хорошие. После их пересадки реципиентам получена стельность у 10 (43,8^) животных, что подтвер-ндает высокие биологические свойства сыворотки крови северных оленей.
Установлена эффективность применения в средах для вымывания и пересадки эмбрионов амниотической жидкости крупного рогатого скота. От 37 доноров получено 261 эмбрион и яйцеклетки, из них с морфологической оценкой "отличные" и "хорошие" 179 (6й,5%), деге-
нерированных - 51 (1У.2Й). После пересадки 49 эмбрионов стельность определена у 31 (63,4^) реципиента.
Широкое практическое применение сыворотки крови северных оленей в средах для извлечения, культивирования, замораживания и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, показало, что приживляемость свекеполученных змбрионов у реципиентов составляет в среднем 53,5"?, а замороженных - 43,9^.
Результаты экспериментальных исследований и широкий производственной проверки применения в средах сыворотки крови северных оленей и амниотической жидкости крупного рогатого скота для получения эмбрионов ин вибо и им витро и последующей трансплантации, показали их эффективность по сравнению с дефицитной и дорогостоящей фетальной сывороткой крови.
3. Э£5ШИБН0СГЬ ПРИМЕНИЛ КОМПЛЕКСНЫХ САШЕУГЩИХ . ПРЕПАРАТОВ ПИ! ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБШОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.1. Микрофлора, выделяемая из сред, содержащих амбрионьт и ее чувствительность к отдельным антибиотикам
Изыскание санирующих препаратов, обеспечивающих высокое санитарное и биологическое качество эмбрионов и одновременно профилак-тирующих возможность проявления эндометритов у коров-доноров, реципиентов, является одним из решающих факторов повышения результативности эмбрйопересадок.
Целью наших исследований являлось разработка и внедрение в практику эффективных санирующих препаратов на основе определения чувствительности, ввделенных из сред, содержащих эмбрионов, бактериальных культур, как к отдельным антибиотикам, так и к комплексным препаратам.
Извлечение эмбрионов от 32 коров-доноров проводили фосфато-буферной средой, содержащей пенициллин в дозе 100 ЕД/см3. Одновременно у этих же коров определяли состав микрофлоры, выделенной из цервикально-вагинальной слизи.
Микрофлора, выделенная из сред после вымывания эмбрионов и из цервикально-вагинальной слизи, оказалась близкой по своему видовому составу, что позволяет предположить о возможности ее попадания в среду в процессе извлечения эмбрионов.
Из 52 образцов сред выделены 22 изолята микроорганизмов (4-
St, auteus, ¿-Siz.flaeca&s, 9-Е. coti, i-Pz.v^c^en-Li^-Ps.aeiii^nosi
которые проверены на чувствительность к 16 антибиотикам (пенициллин, оксациллин, ампициллин, карбенициллин, олеандомицин, мо-номицин, тетрациклин, новобиоцин, эритромицин, линкомицин, хлорам-фенол, стрептомицин, канамицин, гентамицин, полимиксин, диоксидин).
Результаты исследований показали устойчивость большинства изолятов микроорганизмов к антибиотикам пенициллинового ряда, что, по-видимому, объясняется длительным применением данной группы антибиотиков и появлением резистентных $орм бактерий.
Высокая чувствительность микроорганизмов установлена к гентами цину (77,3^), тетрациклину (59,1%), диоксидину (57,2*1) ,карбеш-циллику (54,6"?), полимиксину (57,It).
Наиболее элективным препаратом в опытах ин витро по отношению к синегнойной и килечной палочкам и протею оказались генташ-цин, диоксидин, полимиксин, карбенициллин, а к стрептококкам и стафилококкам - оксациллин, ампициллин, карбенициллин, эритромицин, линкомицин, олеавдоыицин, гентамицин.
Исследования чувствительности микроорганизмов ин витро к отдельным антибиотикам подтвердили низкую эффективность пенициллина для санации эмбрионов.
Учитывая высокую чувствительность бактериальных культур к генташцицу, ампициллину, полимиксину, в дальнейшей нашей работе изучены новые комплесные санирующие препараты - ГМП (гентамицин + ампициллин), Спермосан-ППК (пенициллин + полимиксин + канамицин). Контролем являлись известные препараты Спермосан-3, канамицин и пенициллин.
3.2. Оправдания бактврипиггннх- и базвовпных- поз новых комплексных санирующих препаратов
Микробиологическими исследованиями на отдельных штаммах микроорганизмов i.coii t-lLi} F-2ЪЪ^ к, р/пе-и rnoniae 2Q8<d/t/9}M, Богдан LI 702, Si2. pneumoniae 7 b ну, Sii.pneumoniae 13 Li, Ps. ae^ginosa (tiCUO)j St.auT.ens SOjioS
и бактериальных культурах, полученных из сред после извлечения эмбрк онов, установлено, что бактерицидная доза для препаратов ГАШ и Спермосан-ППК составляет соответственно 50 мкг/см3 и 50 Щ/см3 среды, тогда как Спермосан-3 не оказывал бактерицидного действия на энтеробактерии (K.c»eu>nont«e ) даже в дозе 800 ЕД/см3 среды.
Канамицин в дозе 6 мкг/см3 не обладал бактерицидным действием на большинство бактериальных культур. Балтрицидное действие пенициллина проявлялось на штаммах £. ьо<-1 и аигеи$ в дозе 400 ЕД/см3 среды, а на Рг. и Иг.рпеитоп^е в дозе
300 ЕД/см3 среды. На другие штаммы бактерий {У..рг7гитон1о,ег М-^лии, ote.-i.uql>->о5л.) пенициллин не оказывал бактерицидного дейст вия в дозе до 1000 ЕД/см3 среды.
Бактерицидная доза препаратов ГАМП на ассоциацию указанных выше микроорганизмов составила 100 мкг/см3, а Спермосан-ЛПК - 200 2Д/см3 среды.
Безвредные дозы препаратов ГАМП и Сппрмосан-ППК определяли летодом оплодотворения яйцеклеток и культивирования зигот в те-зение 72 часов, добавляя в среды различные дозы препаратов. За «сходные концентрации были взяты дозы препаратов, оказывающие бактерицидное действие на ассоциацию микроорганизмов (таблица 6).
Для определения степени безвредности препаратов при оплодотворении яйцеклеток использовали сперму от одного и того же Зыка. Контролем являлась среда баз антибиотиков.
Таблица б
Степень безвредности препаратов ГАШ и Спермосан-ПШС в средах для дозревания, оплодотворения ооцитов и культивирования зигот
Цоза Число Оллодотворен- Р к Стадия развития эмбриона
трепа- ных я^пеклеток конг- {число о..а,стомеров}_
эата кле-~ Число % Р°лю ~2~" 4 "б-З
ток число"*- чис- ^ чис- %
ло ло
I 2 3 4 5 б 7 8 9 10 II 12
ПАМП . .иг/см
:реды
[00 4 67 33 49,3 - 19 57,6 10 30,3 14 12,1
200 4 87 29 33,3 0,05 14 48,0 9 31,0 6 21,0
100 4 79 26 32,9 0,05 15 57,7 9 34,6 2 7,7
300 4 57 20 35,0 0,05 12 60,0 7 35,0 I 5,0
300 4 41 12 29,2 0,05 6х 66,6 3х 33,4х - -
{онтроль 4 76 45 59,2 21 46,7 10 22,2 14 31,1
Зпермосан , -ППК ЕД/с^л3
:реды
200 4 82 33 40,2 - 8 24,2 16 48,5 9 27,3
____1_ _2_ ___3__ __4__ ___5____ __6_____ __7__ ___8___ __9_ _10___ II 12
300 ' Г 41 16~" - 9 ~5бХ ~4 25,0 3 18,7
400 4 92 37 40,2 - 19 51,4 16 43,2 ■о А» 5,4
500 4 42 18 42,9 - О 50,0 3 16,7 6 33,3
600 4 56 14 25,0 0,01 10 71,4 3 21,4 I 7,2
800 4 55 12 21,8 0,01 8х 66,7 4х 33,3 0 -
Контроль 4 89 39 43,8 16 41,0 13 33,3 10 25,7
х - дегенерированию эмбрионы
Статистически достоверное снижение числа оплодотворенных яйцеклеток отмечено при концентрации ГАМП в дозе 200 ыкг/см3, а Спермосан-ППК 600 Е1Д/см3 среды, что указывает на проявление токсичности препарата.
Высокая токсичность этих препаратов установлена при концентра-ции'их в средах 800 мкг и 800 ЕДЛзм3.
Оценка токсичности препаратов ГАМП и Спермосан-ППК с использованием спермотеста дала практически совпадающие результаты, что и при оплодотворении яйцеклеток с последующим культивированием зигот.
Полученные данные свидетельствуют о возможности применения двух методов оценки токсичности препаратов.
Важным показателем, определяющим эффективность применения в средах санирующих препаратов, является микробное число в промывных средах, а также видовой состав выделенных микроорганизмов.
Среднее микробное число в промывных средах, содержащих ГАМП, Спермосан-ППК и пенициллин в дозах 100 мкг, 200 ЕД и 100 ЕД/см3 среды, составляет соответственно 1148+570, 691+_125, 2975+414 м.т./см3, а в контроле (без антибиотиков) этот показатель был достоверно выше и находился на уровне 4321+235 м.т./см3 среды (таблица 7).
Применение новых санирующих препаратов ГАШ и Спермосан-ППК позволяет получать от 22,6% до 40,($ эмбрионов, свободных от микробной контаминации. Эмбрионы, находившиеся в промывных средах, содержащих пенициллин, в 190% случаев контаыинированы бактериальной микрофлорой и по данноцу показателю находятся на уровне контроля.
В средах, содержащих ГАШ, Спермосан-ППК, пенициллин и без антибиотиков число микробных тел до 500 в I см3 соответственно сос-
Таблица 7
Микробное число в промывных средах при применении различных санирующих препаратов
Препарат (доза)
Число Иссле- Число ыик- Р
доноров довано робных3тел
эмбрио- образ- в I см сре-
нов цов ды
Количество Огепень микробной контаминации (м.т. в I см° сред без _____________2Е2ДЙ________________
котамина- -í=Í22™ 5I0-I00C. "ll00-5000 5100-10000
ции _ Коли-
%сло"!
Коли-чест-
во
Коли- % чест-во
Количество
ГАМП 100 мкг/см3 89 137 1148+570 0,01 31 22,6 67 48,9 4 2,9 21 15,4 14 10,2
Спермосан^ПЩ 200 ВД/см3 62 120 691+125 0,001 48 40,0 36 30,0 12 10,0 21 17,5 3 2,5
Пенициллин ТОО ЕЛ/ciP 20 40 2975+414 0,05 0 - 16 40,0 6 15,0 II 27,5 7 17,5
Контроль 21 39 4321+235 - 0 - 7 17,9 6 15,4 14 35,9 12 30,8
препаратов)
тавляет 48,9$, 30,ОЙ, 40,0%, 17,9%, а от 1100 до 10000 м.т./см3 35,655, 20,0%, 45,0% и 66,7%.
Эффективность санирующих препаратов определяется не только степенью микробной контаминации эмбрионов, но и ее видовыми составом.
Из образцов промывных сред, содержащих ГАШ и Спермосан-ППК, вцделены бактерии (дрожжеподобные грибы, килечная, синегнойная и сенная палочки, стрептококки, стафилококки) в инокультуре в 46,7% и 35,2% случаев, из них 39,7% и 28,8% представлены дрожже-п од об кыш грибами.
Применение в средах для извлечения эмбрионов только пенициллина не снижает обсемененность условно-патогенными микробами.
Без применения антибиотиков в 91,9% случаев из образцов промывных сред, содержащих эмбрионы, выделки? как грамполозкительные, так и грамотрицательные бактерии.
Учитывая, что использование новых комплесных санирующих препаратов, не обеспечивает в 100% случаев получение эмбрионов, свободных от бактериальной микрофлоры, нами проведены исследования по определению эффективности их применения в средах для промывки эмбрионов.
Установлено, что последовательная трехкратная промывка эмбрионов стерильной фюсфатно-буферной средой, содержащей санирующие препараты ГА"Я1 или Спермосан-ППК, после предварительной обработки их 0,25%-ным раствором трипсина позволяет полностью освободить эмбрионы от микрофлоры. Без применения санирующих препаратов не удается полностью освободить эмбрионы от микрофлоры^ даже после 5-крагной промывки их стерильной средой.
На основании проведенных экспериментальных исследований разработаны методические приемы, позволяпцие получать эмбрионы от коров-доноров, свободными от бактериальной микрофлоры, с причинением новых комплексных санирующих препаратов.
3.3. Санирующие препараты и приживляемость эмбрионов у реципиентов
Одним из основных показателей, определяющих эффективность применения санирующих препаратов в средах при трансплантации эмбрионов, является их приживляемость у реципиентов.
Таблица 8
Эффективность применения санирующих препаратов при трансплантации эмбрионов
Показатель
Санирутгдтий препарат (доза)
ГМП Слермосан- Пенициллин Контроль
100 мкг/см ШГ200 100 ВД/см17 (без саниру-ЕД/см3 гацих препа-
Число коров-доноров
Получено эмбрионов, всего
в среднем на донора
Морфологически полноценных эмбрионов, всего (% от числа извлеченных)
в среднем на донора
Дегенерированных эмбрионов, всего (% от числа извлеченных)
в среднем на донора
Пересажено эмбрионов
Стельных реципиентов
% от числа пересаженных эмбрионов
Исследования проводили на группе коров-доноров в возрасте от 4-х до 7 лет с молочной продуктивностью не менее 7,0 тыс.кг молока в год, принадлежащих ГПЗ "Петровское" Московской области.
Извлечение эмбрионов от коров-доноров проводили фосфатно-бу-ферной средой, содержащей санирующие препараты ГАЖ1, Спермосан-ППК, пенициллин и без антибиотиков (контрольная группа).
.фнные,представленные в таблице, указывают на то, что при применении в средах для извлечения эмбрионов новых комплексных санирующих препаратов, отмечается тенденция к снижению числа дегенерированных эмбрионов, при увеличении приживляемости их у реципиентов на 18,5% и 9,4% по отношению контроля.
Это, по-вццимоцу, объясняется тем, что присутствие в средах бактерицидных доз новых санирующих препаратов, препятствует накоплению в них ферментов, токсинов и других веществ, которые мо-
89 62 60 31
573 6,43+1,07 380 (66,3) 387 6,24+1,16 279 (72,1) 402 6,71+1,36 237 (59,0) 194 6,25+1, 118 (60,8)
4,26±0,93 193 (33,7) 4,50+0,65 103 (27,9) 3,96+0,84 165 (41,0) 3,80+0,69 76 (39,2)
2,17+0,36 142 83 58,5 1,74+0,29 174 86 49,4 2,75±0,57 208 88 42,3 2,45+0,41 60 24 40,0
гут продуцировать отдельные виды условно-патогенных бактерий и отрицательно влиять на биологическое качество эмбрионов, не вызывая видимых морфологических изменений.
Нельзя также исключать отрицательное влияние условнопатоген-ных бактерий на приживляемость эмбрионов у реципиентов, так как их пересадку осуществляют в лютеиновую фазу полового цикла, когда иммунобиологическая резистентность у животных понижена.
Это положение находит подтверждение в опытах по пересадке эмбрионов^сводобных от микрофлоры, контаминируованных - дрожже-подобными грибами .(род Кавдида), а также грамположительными и грамотрицательными бактериями.
Приживляемость эмбрионов без микрофлоры и контаминированных только дрожжеподобными грибами составила соответственно 56,1% и 59,0%, тогда как при контаминации эмбрионов ассоциацией условно-патогенных микроорганизмов линь 37,7% (таблица 9).
Таблица 9
Цриживляемость эмбрионов у реципиентов в зависимости от микробной контаминации
Санитарный показатель качества Пересажено Сгельньн_£ешпиентов_ эмбрионов эмбрионов Число ~%
Без микробной контаминации 57 32 56,1
(контроль)
Дрожжеподобные гриба 33 49 59,0
( род СатоНЫа. )
Ассоциация микроорганизмов 114 43 37,7
(стафилококк, стрептококк, кишечная и синегнойнал па-лочки+дрожжеподобные грибы)
Микробиологическими исследованиями 1159 замороженных эмбрионов^ поступивших из Канады в 1986-1997 гг, установлено, что из них конта-минированы синегнойной палочкой - 32, 15 - дрожжеподобными грибами и 29 эмбрионов ассоциацией микроорганизмов (синегнойная палочка + стрептококки ; си'негнойная + кишечная палочки), 94% эмбрионов были стерильными.
Приживляемость у реципиентов замороженно-оттаянных эмбрионов без бактериальной микрофлоры составила - 49,7%, контаминированных дрожжеподобными грибами - 47,1%, ассоциацией условнопатогенныш микроорганизмами - 29,4%.
Не исключено, что приживляемость эмбрионов у реципиентов зависит, кан от вида, так и от степени их контаминации условно-патогенной микрофлорой, а также состоянием иммунобиологической резистентности реципиента.
Вместе с тем, совершенно очевидна необходимость разработки системы мероприятий, предупреждающих микробную контаминацию эмбрионов.
4. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИШ, ИСКЛШАВцИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЗМБРИОНОВ
Новый биотехнологический метод воспроизводства сельскохозяйственных животных, раскрывает реальные перспективы сохранения' высокоценных редких и исчезающих пород животных,неблагополучных по инфекционным болезням, особенно вирусной этиологии. Решение этих практически важных вопросов, определяет комплекс методических приемов, позволяющих решить эту задачу.
4.1. Эпизоотическое состояние коров-доноров и
реципиентов в центрах и пунктах по трансплантации эмбрионов
В разработке научно обоснованных методов предупреждения передачи возбудителей вирусных инфекций при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота важное место занимает изучение благополучия животных по инфекционным вирусным болезням.
Наш в 1986-1988 гг. исследовано 187 образцов сыворотки крови, на наличие антител к вирусу лейкоза и инфекционного рино-трахеита СИРТ), полученных от 59 доноров эмбрионов, принадлежащих ГПЗ "Петровское", "Заря Коммунизма" Московской области и производственному объединению "Волго-Дон".
От каждой коровы-донора исследовали сыворотку крови на наличие антител к вирусам ИРТ и лейкоза трехкратно с интервалом один месяц. Результаты исследований представлены в таблице 10.
Таблица 10
Содержание антител в сыворотке крови доноров эмбрионов к вируса;.! ИРГ и лейкоза
Хозяйст- Число ва доно-
ров эмбрионов
Результаты исследований на ИРТ в РН на лейкоз в
положитель- отрицательная ная
положитель- отрицательная ная
число коров
число коров
число коров
число коров
ГПЗ "Заря 31 Коммунизма"
ГПЗ "Пет- 17 ровское"
ПО "Волго- II Дон"
6 19,3 25 80,7 19 61,3 12 38,7
5 29,4 12 70,6 7 41,2 10 58,8 4 36,4 7 63,6 6 54,5 5 45,5
Из 59 коров-доноров антитела к вирусу ИРТ выявлены у 15 (25,4%) в титре 1:4-1:32, а к вирусу лейкоза положительная реакция в РЗД установлена в сыворотке крови у 32 (54,2%) животных.
В сыворотке крови, полученной от 150 реципиентов (коров и телок), антитела к вирусу лейкоза обнаружены у 17 (11,3%).
Результаты исследований свидетельствуют о неблагополучии до-коров эмбрионов и реципиентов по инфекционным болезням вирусной этиологии.
Учитывая, что в центрах и пунктах по пересадкеаэмбрионов находятся, в основном, коровы-доноры с продуктивностью не ниже 7 тыс. кг молока в год, разработка системы методических приемов, обеспечивающих получение эмбрионов, свободных от вирусной контаминации, является практически важной проблемой, решение которой, позволит сохранить генофонд высокоценных, редких и исчезающих пород животных, неблагополучных по вирусным инфекциям.
Нами апробировано три метода деконтаминации эмбрионов от вирусов: обработка 0,3%-ным раствором гиалуронидазы, 0,25%-ным раствором трипсина, приготовленным на среде Хенкса, и иммуноспецифичес-кими сыворотками.
Исследования проводили на эмбрионах и яйцеклетках, экспериментально зараженных вирусом ИРТ в дозе 10® ТЦЦ 50/см3. В каждом из 6 опытов использовано не менее 7 эмбрионов и яйцеклеток.
%
%
Экспериментальная модель заражения вирусом ИРГ эмбрионов и яйцеклеток выбрана нами потому, что в отличие от вирусов-лейкоза, диареи-, блутанга и других, он прочно связывается с блестящей оболочкой эмбриона и удалить его не удается даже при 10-и кратной промывки стерильной фосфатно-буферной средой.
Установлено, что при обработке экспериментально зараженных эмбрионов и яйцеклеток 0,25^-ным раствором трипсина и 0,3%-ным раствором гиалуронидазы в течении 2-3 мин при температуре 37-38°С с последующей двухкратной промывкой фосфатно-буферной средой в 100% случаев удается освободиться от вируса.
При инокуляции отмытых эмбрионов и яйцеклеток в культуру клеток ГОК цитопатического действия не отмечается.
Применение специфической к вирусу ИРТ сыворотки крови, такясе обеспечивает полное удаление вируса, при последующей 3-х кратной промывке эмбрионов и яйцеклеток стерильной средой.
Методом люминесцентной микроскопии с использованием специфической сыворотки меченой ФИЦ подтверждены данные, полученные в культуре клеток (ПЭК и ТБ).
Данный метод может найти практическое применение для быстрой индикации вирусов на эмбрионах или яйцеклетках,вымываемых от коров-доноров неблагополучных по вирусным инфекциям.
Высокая эффективность применения 0,25%-ного раствора трипсина для деконтаминации эмбрионов от вируса ИРТ, доступность и низкая себестоимость по отношению других реагентов, позволила нам рекомендовать его для практической работы центров и пунктов по трансплантации эмбрионов. Для проверки безвредности 0,25%-ного раствора трипсина проведена серия опытов на 303 ооцитах, полученных из яичников коров. Перед дозреванием ооцитов их инкубировали в 0,25%-ном растворе трипсина при 37-38°С в течение 2, 4, 6, 8 и 10 мин. В контроле использовали ооциты без контакта их с раствором трипсина.
Установлено, что 2-8 минутная экспозиции ооцитов в растворе трипсина не оказывает отрицательного влияния на оплодотворение яйцеклеток. Количество оплодотворенных яйцеклеток составило соответственно 48,1%, 48,0%, 47,9%, 41,6% против 47,3% в контроле. Отмечена тенденция к снижению оплодотворяемости яйцеклеток на 14,2% по отношению контроля, после инкубации ооцитов в растворе трипсина в течении Ю- мин.
Цитологические исследования эмбрионов показали наличие в блас-
томерах ядер, а также отсутствие дегенеративных изменений в них.
Проверка безвредности обработки эмбрионов крупного рогатого скота 0,26%-ным раствором трипсина проведены в центре и пункте по пересадке эмбрионов ГПЗ "Заря Коммунизма" и "Петровское".
От 56 коров-доноров получена 253 эмбриона, из них II? после обработки 0,25%-нь;м раствором трипсина и последующей четырехкратной промывки фосфатно-буферной средой были пересажены реципиентам (коровам и телкам). Остальные эмбрионы пересажены реципи-- ентами без обработки раствором трипсина (контрольная группа). Результаты по цриживляемости эмбрионов представлены в таблице II.
Таблица II.
Приживляемость эмбрионов у реципиентов
Показатель
Число коров-доноров Получено эмбрионов Пересажено эмбрионов % стельных реципиентов
Опытная группа Контрольная группа
30 ¿6
117 136
105 124
50,6 45,2
Результаты исследований показали, что обработка эмбрионов 0,25/ь-ным раствором трипсина не оказывает отрицательного влияния на биологическое качество эмбрионов, которое подтверждается высокой приживляёмостью их у реципиентов, и данный метод может быть использован для предупреждения передачи возбудителей вирусных инфекций.
4.2. Локализация вируса ИРГ в репродуктивных органах у коров
Изучение локализации вируса ИРГ в тканях репродуктивных органов раскрывает пути возможной контаминации яйцеклеток и эмбрионов, полученных от зараженных животных вирусоносителей.
Важное значение в профилактике передачи возбудителей вирусшо инфекций приобретает изучение эффективности применения специфических вакцин в случае осложения эпизоотической обстановки в центрах и пунктах по трансплантации эмбрионов.
Результаты проведенных наш исследований показали, что интенсивность инфицирования репродуктивных органов вирусом ИРГ находится в зависимости от путей проникновения вируса в организм жиеотныз и времени, прошедшем с момента вакцинации. Так, в ходе эксперимент
установлено, что при заражении двух коров на слизистую носовых ходов вирус ИРТ выделен у одной из яичников, рогов, матки и слизистой влагалиша. У двух других коров, при внутривагинальном способе заражения в той же дозе вируса 10® ТЦД 50/см3, возбудитель был выделен в культуре клеток ГШ из всех тканей репродуктивных органов обоих животных.
Вакцинация двух коров спустя V дней после заражения животных вирусом ИРТ снижает инфицирование тканей отдельных органов. Вирус ИРТ выделен у одного животного из тканей яичника и тела матки.
У вакцинированных, а затем у зараженных через 24 дня животных интронозально, внутривенно и интровагинально той же дозой вируса ИРТ, его не удалось выделить ни в одном из образцов тканей исследованных репродуктивных органов.
Таким образом, было установлено, что степень поражения вирусом ИРТ тканей репродуктивных органов зависит от пути проникновения возбудителя в организм животных (респираторный или внутрива-гинальный), а своевременная вакцинация коров, в случае осложнения эпизоотической обстановки в районе центра (пункта) по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, может обеспечить специфическую залшту коров-доноров и реципиентов от ИРТ.
4.3. Возможность использования высокопродуктивных- ^оров. неблагополучны* по инфекционным вирусным болезням в качестве доноров эмбрионов
Из общего количества коров, неблагополучных по инфекционным вирусным болезням, большая часть приходится на лейкоз и инфекционный ринотрахеит, которая в основном представлена высокопродуктивными животными.
Поэтому разработка методических приемов, обеспечивающих сохранение высокоценного генофонда животных, является практически важной проблемой.
Доноры эмбрионов и реципиенты,в зависимости от содержания антител в сыворотке крови к вирусу лейкоза, были распределены на четыре группы. В первой находились серологически положительные коровы-доноры- и серологически отрицательные РЗД к вирусу лейкоза реципиенты. Во второй группе доноры эмбрионов и реципиенты -серологически положительные, а в третьей - серологически отрица-
тельные. Четвертая группа представлена , серонегативнымидонорами эмбрионов и серополокительными реципиентами.
Телят-трансплантатов, полученных от каждой группы животных, исследовали на наличие антител в сыворотке крови в б, 9 и 12 месячном возрасте. Результаты исследований в таблице 12.
Таблица 12
Результаты исследования сыворотки крови телят-трансплантатов на наличие антител к вирусу лейкоза в РВД в зависимости от их содержания в в сыворотке крови доноров и реципиентов
Группа Число доноров Стельных реципиентов Получено телят
серо- сероне-пози- гатив-тивных них серо-позитивных серо-негативных серопозитивных число % серонегативных число %
I 12 _ 39 0 39 100,0
2 II 17 0 8 47,1 9 52,9
3 0 7 0 16 0 16 100,0
4 0 9 21 0 4 19,0 17 81,0
Результаты исследований свидетельствуют о необходимости тщательной проверки реципиентов на наличие антител к вирусу лейкоза, в случае использования высокоценных коров, неблагополучных по лейкозу, в качестве доноров эмбрионов. Соблюдение этих требований ооеспечивает получение здоровых телят по данной инфекционной болезни.
Потенциальную опасность при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота представляет вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ).
Исследования проводили на трех группах животных. В первой группе коровы-доноры и реципиенты содержали в сыворотке крови антитела к вирусу ИРГ, во второй группе находились серологически положительные доноры и серологически отрицательные реципиенты. В третьей группе - серонегативные доноры эмбрионов и серопозитив-ные реципиенты. Результаты исследований представлены в таблице 13.
Таблица 13
Результаты исследования сыворотки крови телят-трансплантатов на наличие антител к вирусу ИРТ в РН в зависимости от их содержания в сыворотке крови доноров и реципиентов
Группа Число доноров Стельных реципиентов Получено телят
серо- серо-пози- негативных тивных серо-позитивных серо-негативных серопозитивных. число % __се^онегативных число %
I 9 - 13 - 2 15,4 II 84,6
2 9 - 0 19 0 - 19 100,0
3 0 16 17 О I 5,9 16 94,1
В группах, в которых находились серологически положительные в РН (реакции нейтрализации) доноры эмбрионов и реципиенты,титр антител в сыворотке крови телят к вирусу ИРТ находился в пределах от 1:8 до 1:32.
На пункте трансплантации эмбрионов ПО "Волго-Дон" исследован 61 реципиент, у 43 выявлены антитела к вирусу ИРТ и отмечены клинические проявления инфекционного ринотрахеита, выражавшиеся в проявлении радиалыго расположенной на вульве сыпи,, красноватого оттенка. От всех 43 реципиентов из носовой полости, при помоши стерильного ватного тампона отобраны пробы носовой слизи. Из трех образцов носовой слизи выделен вирус ИРТ в реакции нейтрализации (РН). Приживляемость эмбрионов у реципиентов (телок) с клиническими проявлениями ИРТ не превышала 19,1%.
Полученные данные указывают на возможность использования высокопродуктивных коров, неблагополучных по ИРТ, и получать здоровых телят, при пересадке эмбрионов серологически отрицательными к вирусу ИРТ реципиентам.
Практически важным при использовании высокоценных коров, имеющих в сыворотке крови антитела к вирусам лейкоза и ИРТ, является определение реакции яичников на введение гонадотропных препаратов, получении эмбрионов пригодных для пересадки и установлении их приживляемости у реципиентов.
Нами проведены исследования на высокопродуктивных коровах, содержащих в сыворотке крови антитела к вирусу ИРТ в реакции нейтрализации (РН).
Гормональную обработку доноров эмбрионов проводили препаратом агСГ-р в дозе 32 мг по 4-х дневной схеме с интервалом 12 часов. Пересадку эмбрионов осуществляли реципиентам,не содержащим в сыворотке крови антитела к вирусу ИРТ. Данные представлены в таблице 14.
Таблица 14
Реакция яичников на введение ■¡йСГ у коров-доноров с наличием или отсутствием антител в сыворотке крови к вирусу ИРТ
Пок азатель ____?§§кция_яичнико_коров___________
серопозктивных серонегативных
Число, коров-доноров 9 7
Титр антител 1:4 - 1:16 0
Число гормональных 24 21
обработок
Число желтых тел на Ь, 17+0,85 9,66+0,97
донора
Получено эмбрионов 5,94+0,64 8,38+1,05
и яйцеклеток
¿эмбрионов пригодных 5,12+0,63 5,96+0,78
для пересадки
Дегенерировалних 0,62+0,19 1,04+0,23
эмбрионов
Неоплодотворенных 0,20+0,09 1,38+0,55
яйцеклеток
Результаты исследований, представленные в таблице, указывают на отсутствие статистически достоверных показателей по реакции яичников у коров двух груш (опытной и контрольной) суперовуляцией (число желтых тел), количеством и качеством получаемых морфологически полноценных эмбрионов.
После пересадки морфологически полноценных эмбрионов, полученных от коров-доноров опытной и контрольной групп, реципиентам, не содержащим в сыворотке крови антител к вирусу ИРТ, приживляе-мость эмбрионов составила соответственно 41,5% и 37,5%. Разница статистически недостоверна (Р^ 0,1). Таблица 15.
Таблица 15
Приживляемость эмбрионов у реципиентов, полученных от серологически положительных и отрицательных коров к вирусу ИРТ
Показатель __Получено эмбрионов от доноров______
__________________________серопозитивных_____се^онегативных____
пересажено эмбрионов 77 48 Отельных реципиентов, {%)_________32_£41л5)__________18_[37_15]___
Полученные данные позволяют сделать заключение о возможности использования высокоценных коров, имеющих в сыворотке крови антитела к вирусам лейкоза и ИРТ, в качестве доноров эмбрионов.
На основании проведенных исследований разработан рад методических указаний, утвержденных Главным Управлением ветеринарии ХСР (Российской Федерации) и ГОСТ "Змбрионы крупного рогатого зкота. Технические условия", утвержденные Госстандартом СССР.
Научные разработки внедрены в работу центров и пунктов по трансплантации эмбрионов . крупного рогатого скота и обеспечивают ¡¡охранение высокоценного генофонда коров, неблагополучных по инфекционным вирусным болезням.
5. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕШ», ПОВШАЩИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ИН ВИТРО
5.1. Оценка оплодотворяющей способности спермы быков вне организма
Разработке биологических, биохимических и морфологических методов прогноза оплодотворяюшей способности спермы быков-производителей посвящено род исследований в нашей стране и за рубежом.
В последние годы появились отдельные сообщения о возможности эценки оплодотворяющей способности спермы быков при оплодотворении гйцеклеток коров ин витро {МШ^ъ Т>. ; ОИ^оЫй 0.<± ¡3^1988;
ЛепъН.М,е£а&;1968). Данные исследования позволили установить, 1то показатели подвижности спермиев и акросомной реакции спермиев «достоверно коррелируют со способностью спермиев к оплодотворению йцеклеток вне организма.
Нами за период 1986-1991 гг. исследована оплодотворяющая спо-¡обность спёрмы 32 быков-производителей, методом оплодотворения яй-
цеклеток коров ин витро. Проведено 287 опытов на 4828 яйцеклетках.
Результаты, полученные при изучении оплодотворяющей способности спермиев быков ин витро, сопоставляли с данными после первого искусственного осеменения коров и телок.
Для оплодотворения использовали свежеполученную сперму, разбавленную 1:19 глюкозо-цитратной средой.
От 9 быков исследовали оплодотворяющую способность свежепо-лученной разбавленной и замороженно-оттаяпной спермы. В каждом опыте концентрация спермиев с прямолинейным поступательным движением соответствовала 2x10^ в I см3 среды.
Не выявлено статистически достоверных различий при оплодотворении яйцеклеток ин витро, с использованием свежеполученной и замороженно-оттаянной спермы от одних и тех же быков.
Выявлено, что оплодотворяющая способность спермы быков ин витро снижается в летний период (июнь-август) в среднем на 12,9% по отношению к осенне-зимнему сезону.
По результатам оплодотворения яйцеклеток ин витро, оплодотворяющая способность спермиев быков'условно разделена на три группы: высокая - от 41% и более, средняя - от 31% до 40% и низкая - менее 30% оплодотворенных яйцеклеток.
Результаты определения оплодотворяющей способности спермиев 32 быков-производителей ин витро представлена в таблице 16.
Таблица 16
Оплодотворяющая способность спермиев быков вне организма
Быков в группе опытов Число яйцеклеток Оплодотворенных яйцеклеток число % М+111
16 154 1882 947 50,3+1,3
7 58 1920 683 35,6+0,8
9 55 1026 272 25,7+0,7
Данные, представленные в таблице,у называют на существенные индивидуальные различия в оплодотворяющей способности спермы быков-производителей яйцеклеток коров. У 16 быков сперма обладала высоко! оплодотворяюшей способностью - 50,3%, а у 9 низкой - 25,7%.
Установлена статистически достоверная разница ыевду оплодотворяющей способностью яйцеклеток спермиями быков первой и третьей групп (Р< 0,01) и низкая между второй, третьей и первой.
В сравнительном аспекте изучена оплодотворяющая способность спермы быков-производителей ин витро и ин виво. Данные по оплодо-
творяемости коров и телок ин виво получены на центральной станции искусственного осеменения. Результаты исследований представлены в таблице 17.
Таблица 17
Сравнительная оценка оплодотворяющей способности спермы
быков ин витро и ин виво
Быков Оплодотворяющая спо- Осеменено коров и телок _______
в труп- собность спермы бы- "всего плодотворно~послё % пе ков ин_витро (в %) 1-го осеменения__М±пт____
16 50~3+1^3 129943 87947 "б7~7+2Х~
7 35,6+0,6 81973 54093 65,9+2,4
9 25,7+0,7 51751 26962 52,1+3,8
Исследования показали на существенные различия по оплодотворяющей способности спермы быков ин витро и ин виво. Так, сперма быков с высокой и средней оплодотворяющей способностью, установленная при оплодотворении яйцеклеток ин витро, при искусственном осеменении коров и телок находится на одном уровне. Не выявлено четкой взаимосвязи по оплодотворявшей способности ин виво и ин витро в третьей группе быков-производителей. При искусственном осеменении коров и телок спермой 9 быков с низкой оплодотворяющей способностью ин витро, только у 3-х (33,3%) быков отмечена низкая оплодотворяющая способность спермы ин виво (от 34,8% до 48,1%). У остальных 6 быков оплодотворяющая способность спермы ин виво находилась в пределах от 54,6% до 69,2%.
Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что для получения большего числа оплодотворенных яйцеклеток, необходимо проводить предварительную оценку качества спермы по ее оплодотворяющей способности ин витро и подборе ооцитов с компактными кумулюсными клетками.
На оплодотворяемость яйцеклеток ин витро определенное влияние оказывают не только качество спермы быков, но и качество пластиковых чашек, в которых проводят дозревание ооцитов, оплодотворение яйцеклеток и культивирование эмбрионов.
Проверены на безвредность для эмбрионов и спермы быков два вида пластиковых чашек Петри, выпускаемых Ленинградским заводом (ТУ64-2-19-79) и фирмой сйоп (Дания). В качестве контроля использовали стеклянные чашки Петри отечественного производства.
Исследования .по оплодотворению, культивированию эмбрионов и выживаемости спермиев показали выраженную токсичность пластиковых чашек Петри как отечественного, так и зарубежного производства по
отношении контроля. Опдодотворяеиоеть яйцеклеток в пластиковых чашках иетри составляла в среднем 41,3%, а в стеклянных - 56,?%.
йсаользование сперма-теста позволяет более четко улавливать токсичность пластиковых чашек Петри. В отличии от оплодотворения яйцеклеток и последующего культивирования эмбрионов, спермо-тест более доступен, не требует специального оборудования и больших затрат.
Абсолютная выживаемость спермиев {$) к выживаемость спер-миев в часах в пластиковых чашках иетри была соответственно ниже на 34,5-43,$ и <±¿¿-52%, чей в стеклянных чашках Петри.
Цри экспериментальном заражении спермы быков вирусом МРТ в дозе 105"6 1'ДД/5и на 1 см3 среды и последующем применении ее для оплодотворения яйцеклеток ин витро установлено, что число оплодотворенных яйцеклеток не превышает а развитие эмбрионов прекращается на стадии 2-4-х бластометров.
полученные данные позволяют сделать заключение о необходимости контроля спермы на возможную ее контаминацию возбудителями вирусных инфекций с целью предотвращения ее применения для оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота.
Ьыполнение комплекса требований устраняющих отрицательное влияние (¿акторов при оплодотворении яйцеклеток коров вне организма, позволит более эффективно использовать данный метод для сохранения генетического потенциала животных.
ШЩОД
1. Подобраны оптимальные технологические условия для выделения гонадотропного гормона из сыворотки крови жеребых кобыл, обеспечивающие высокий выход гормона, до '/и% от исходного содержания в сырье и степень очистки от балластных белков на уровне , что исключает проявление аллергических реакций у животных при его применении, .установлена высокая эффективность препарата "Гонадо-трошш очищенный - ГС&К" для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов по сравнению с аналогичным зарубежным препаратом ГСаШ. - фолдигон^ индуцирование полиовуляции у коров составляет, соответственно, 83,1% и 66,2%, число желтых тел - 8,г/0+0,94 и 5,91+0,63, качественных вибрионов 3,86+0,75 и 2,25+0,6? на донора.
2. Выявлено наличие фактора диффвренцировки клеток в сыворотке крови северных оленей, крупного рогатого скота, фатальной сы-
воротке крови крупного рогатого скота, амниотической жидкости коров и, в зависимости от формы его содержания, обосновано их применение в средах для получения биологически полноценных эмбрионов нн виво и ин витро. пативная сыворотка крови северных оленей в среде в концентрации 10% вызывает образование мезодермадьных производных в эксплантатах раннеэмбриональных клетках шпорцевой лягушки до 80%, из которых 67% развивается в туловищно-хвостовые структуры. Кратковременное прогревание сыворотки крови северных оленей приводит к резкому снижении активности дифференцирующего фактора, тогда как в Детальной сыворотке крови крупного рогатого скота и амниотической жидкости коров наоборот к его повышению.
3. Среда, в состав которой входит сыворотка крови северных оленей или ашиотичеекая жидкость коров, взамен дорогостоящей и дефицитной фатальной сыворотки крови крупного рогатого скота, обеспечивает цркживдяеыость свежеполученных эмбрионов у реципиентов на уровне 58,0%, а замороженных 43,9%. Кратковременное культивирование эмбрионов со стадии моруды с морфологической оценкой условно-годные иди удовлетворительные в среде, содержащей 20% сыворотки крови северных оленей, позволяет получать до 75,¿^ эмбрионов, достигших стадии бластоцисты с морфологической оценкой хорошие и высокую степень приживляемости у реципиентов (43,£%).
Контроль качества сыворотки крови сельскохозяйственных животных и амниотической жидкости коров проводят методом оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота, пригодной для культивирования и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является сыворотка крови или аыниотическая жидкость коров, применение которых в средах в количестве 15-20% при дозревании ооцитов, позволяет получать не менее 40% оплодотворенных яйцеклеток.
4. На штаммах микроорганизмов и бактериальных изолятах, выделенных из сред после извлечения эмбрионов от коров-доноров, выявлена выоокая их чувствительность к генхамицину <77,3%), тетрациклину (69,1%), подимиксину (57,1%), диоксидину (27,2%), карбенициллм-ну (¿>4,0%) и низкая к стрептомицину (.0-9,1%), пенициллину и линко-мицину (13,6%), мономнцину (18,2%). Результаты исследований являлись теоретической предпосылкой для разработки антибактериальных комплексных санирующих препаратов.
5. Разработана рецептура и обоснована эффективность применения в средах для санации эмбрионов новых комплексных препаратов: ОДй
Сгентамицин+амдицилдин) и Сшрмасан-ШК (пеницшшш+полимиксин-»-канашдин) в дозах хио шсг/сыэ и Ьд/см3 среды соответственно, получение эмбрионов, свободных от бактериальной микрофлоры,достигается последовательной четырехкратной отмывкой их стерильной средой, содернащей препараты ГМ1 и Спариасан-ШК.
Ь. Усгановлена прямая зависимость мевду приаивляемостьв эмбрионов > реципиентов и контаминацией их различной шкрофдорой. при пересадке эмбрионов, свободных от микрофлоры, контаминиро-ванных дрокжеподобныш грибами или усдовнопатогенньщи бактериями, приживляемость их у реципиентов составляла соответственно 66,1%, и 27,4%.
V. определена эпизоотическая ситуация по инфвкционкоцу ри-нотрахеиту и лейкозу крупного рогатого скота в отдельных центрах и пунктах по трансплантации эмбрионов. Ъыявлено нзблагополучне коров-доноров и реципиентов по ИРГ ^¡¿6,4$) и лейкозу (54,2%). Разработана система вегеринарно-санигарных мероприятий, которая обеспечивает получение здоровых телят от высокопродуктивных коров, идопщих в сыворотке крови антитела к вирусам лейкоза и ИРГ. Она включает: подбор реципиентов, не содеряащих антител к возбудителям инфекционных болезней ; обработку- эмбрионов и раствором трипсина с последующей четырехкратной промывкой их стсрздь-ной средой, содержащей санирующие препараты, и проворед телят на инфекционные болезни.
и. Остановлены условия, способствующие повышашш овдодога®-ряеыости яйцеклеток вне организма, которые вкдэчаэт: исвоаьао&ЗЁие спорны быков с известной оплодотворяющей способностью ш* вигро, от 41$ и более ; контроль саер&ы ка шруенув и иикробцую тгееки-нацию; проверку срэд к инструмзнтоа ка безвредность дак гскзг сельскохозяйственных животных.
Кокялекс ветерккарно-саштариых требований и цзнгро^: и цушл'ом по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, а такие эцбраона^, ибступаащии в страну из-за рубеаа, срсдусшгр--" вааций проаерку коров-доноров и быков-драиэводктедей ка возОуда-теди икфекциошых бодззней, выборочный цоддюбиологечозкип и с;:ру-содогичзсхшй контроль качества экбрионоз, сбэсвзчиваз? с^здерси»
дешэ передача возбудителей инфекционных болезней и получение здоровых телят.
ДР^ИЧЬСКЙЬ шздшшш
I. В цзлях повышения эффективности трансплантации эмбрионов крушого рогатого скота предложены и внедрены в практику отечественные гормональные и санирушдее препараты, среды и питательные коштсненты, входящие в их состав, которые по своим биологическим свойствам соответствую? зарубегиым аналогам:
- Инструкция по изготовлению и контролю препарата 'Тонадотро-шщ очищенный - ГСдЛ" (утв. 25.i-u.tb) ;
- Технические условия 10.0?л2о-У1 на препарат "Гснадотро-ЕП1 очищенный - ГСЗйК" (утв. 01.0'/.VI);
- Наставление по применению гонадогрошша очищенного ЦОдК) для лечения, регуляции половой функции у самок сельскохозяйственных яивогных и стимуляции полиовудяции у коров-доноров эмбрионов (утв. i2.0b.ai) ;
- Технические условия 1и-и9-49-90 "Среда фосфатно-буферная для трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота" (утв.
гаиь.ш;;
- Наставление по применению среды фосфатно-буферной для трансплантации эмбрионов крушого рогатого скота (утв. 22.05.90) ;
- Технические условия 10-09-90-90 "Сыворотка крови северных оленей нативная, стерильная" (утв. 16.11.90) ;
- Наставление по применению сыворотки крови северных оленей нативной, стерильной (утв. 20.12.90) ;
- Инструкция но изготовлению жидкости амниотичсской крушого рогатого скота для биотехнодогических работ (утв. 17.05.о9);
- Технические условия 10,07.137-91 "Жидкость амниотическая крушого рогатого скота для биотехнологических работ" (утв. 06.06.91);
- Наставление по применению жидкости амниохической крупного рогатого скота для биотехнодогических работ (утв. 06.0b.91);
- Нэтодика но контроле качества сыворотки крови, используемая в средах при трансплантации эмбрионов крушого рогатого скота (утв. i0.0b.cS) ;
- Технические условия 10.07.057-93 препарат ГАМП (утв. 25.07.93) ;
- Наставление по применению препарата ГАМД для производства культур тканей, вирусов санации спермы и эмбрионов сельскохозяйственных животных (утв. 25.07.93).
2. Предложенная система ветеринарно-санитарных требований обеспечивает получение здоровых телят от высокопродуктивных коров, в том числе имеющих в сыворотке крови антитела к вирусам инфекционного ринотрахеита и лейкозами предупреждает возможность передачи возбудителей инфекционных болезней при пересадке эмбрионов.
Ветеринарно-санитарные требования к центрам и пунктам по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (утв. 08.01.87) ;
- Положение о порядке ввоза, хранения и использования эмбрионов сельскохозяйственных животных, поступающих в СССР по импорту (утв. 19.07.86) ;
- Ветеринарно-саштарные требования к племпредприятиям и станциям по искусственно^ осеменению животных (утв. 20.01.93) ;
- Методические указания "0 мероприятиях при использовании в качестве доноров эмбрионов высокопродуктивных коров, имеющих в сыворотке крови антитела к вирусу лейкоза (утв. 03.06.88) ;
- Методика по предупреждению передачи возбудителей вирусной этиологии при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (утв. 10.03.88) $
- ГОСТ 28424-90 "Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия", (утв. 05.01.90).
3. Разработаны методические приемы,способствующие получеша большего числа эмбрионов вне организма, которыми предусмотрено использовать сперму быков-производителей с высокой оплодотворяющеР способностью яйцеклеток коров ин витро и свободную от возбудителей инфекционных болезней. Применять для дозревания, оплодотворения яйцеклеток и культивирования зигот среды и чашки Пэтри^провэ-ренные на безвредность для гамет сельскохозяйственка кивотных.
Ветеринарно-санитарные требования к экспортируемы в Российскую Федерацию эмбрионов крупного рогатого скота, полученный '•кк витро'1 (утв. 07.10.93) ;
- Методика определения безвредности одноразовых полвсткроло-вых чашек Петри по тест-сперме быков (утв. 22.11.93).
Нормативно-техническая документация^ представленная в раздело, утверждена Главным Управлением езтерзкарэд СССР (РФ) и Госстоц^р-тоа СССР (Р*>).
сшсок
работ, опубликованных по теме диссертации
Советкин C.B., Шлыгин А.Н., Паршин Б.А., Копьшова Л.Г. Определение сенсибилизирующих свойств сыворотки крови жеребых кобыл. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. M., 1980, № 4, с. 14-16.
Шлыгин А.Н., Першин В.А., Жобояенко A.A., Советкин C.B., Копыло-ва Л.Г., Наторин Н.И. Влияние сепарирования на выход плазмы из цитратной крови жеребых кобыл. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. M., 1980, № 2, с.12-14. , "^клов Н.Ф., Шлыгин А.Н., Советкин C.B. Методы получения СШ. Ветеринария, 1983, № 9, с.51-52.
Шлыгин А.Н. г Першин В.А., Советкин C.B., Жаболенко A.A., Копы-лова Л.Г., Гонадотропная активность цитратной крови и ее компонентов. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. M., 1980, № 4, с.16-18. , Чуклов Н.Ф., Васин А.Д., Лихачев А.Г., Кадиров Г.П., Загреби-на В.П., Шлыгин А.Н., Першин В.А., Советкин C.B., Орлов В.А., Веденев А.Г. Усовершенствование метода контроля СШ. Ветеринария, 1981, № 3, с.50. , Советкин C.B., Шлыгин А.Н., Копьшова Л.Г. Некоторые физико-химические и биологические показатели препарата сывороточного гонадотропина. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. М., № 5, с.6-7. , Советкин C.B., Шлыгин А.К., Копылова Л.Г. Влияние различных температур на сохранение гонадотропной активности раствора сыворотки гонадотропина. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности 1979, № 6, с.11-13. Советкин C.B., %клов Н.Ф., Шлыгин А.Н., Бахитов К.И., Аллергические свойства препаратов СЖ. Ветеринария, 1984, № 4, с.45 , Шлыгин А.Н., Советкин C.B., Першин В.А. Некоторые вопросы воспроизводства практического применения гонадотропина СШ. Совершенствование методов воспроизводства и искусственного осеменения животных. M., 1983, с. 122-127. ). Советкин C.B., Шлыгин А.Н. Характеристика и эффективность при-иенения гонадотропина сывороточного в практике животноводства и ветеринарии* Совершенствование методов воспроизводства и искусственного осеменения Животных. M., 1963, с. 123-132.
11. Прокофьев M.И., Советкин C.B. Применение фоллитропина для он муляции у коров-доноров эмбрионов. Зоотехния, 1988, № 3, с. 48-49.
12. Осидзе Д.а., Богданов М.Е., Зайцева Л.Н., Зерашкова Т.А., Столбовская О.В., Советкин C.B., Хоперская O.A. Мезодермализ^ ший фактор в амниотической жидкости крушого рогатого скота. Доклады ВАСХНИЛ, 1988, Г1 I, с.36-38.
13. Советкин C.B., Зайцева Л.И., Богданов М.Е., Зершикова Л.Н., Столбовская О .В., Хоперская O.A., Пуненков В.В., Шарабрин ОЛ Ыезодермализуюший дифференцирующий фактор в сыворотке крови некоторых животных. Сб.научных трудов ВГНКИ ветпрепаратов. Контроль качества химиотерапевтичсских препаратов. M., 1987, с. 76-82.
14. Гуненков Б.В., Советкин C.B., Шарабрин О.И., Сухарев О.И., Осидзе Д.й., Коромыслов И.Е., <5арботко Г.З., Сергеев H.H., Букарова В.И. Способ изготовления среды для вымывания и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота. Авторское свидетельство №1424153, 1988 г.
15. Осидзе Д.й., Эрнст Л.К., Советкин C.B., Прокофьева Е.С., Су-раева Н.М., Назарова ¿.А. Основа питательных сред для вымывания, культивирования и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Авторское свидетельство I;J 1578859, 1988 г,
16. Советкин C.B., Прокофьев М.И., Исмагулов A.A., Назаров Е.А. Способ получения гонадотропного гормона из сьшоротки крови же ребых кобыл. Авторское свидетельство № 1725453, 1992 г.
17. Советкин C.B., ПрокофьевйЕ.С., Назаров.. Е.А., Долгохацкий АЛ Стимуляция суперовуляции у коров-доноров. Зоотехния, 1989,
!.» 4,' с.64-65.
18. Советкин C.B., Назаров Е.А., Долгохацкий А.И., Прокофьева Е.С О повышении эффективности трансплантации эмбрионов с помошью гонадотропньк препаратов. Сельскохозяйственная биология, I98S № 2, с. 40-43.
19. Советкин C.B., Назаров Е.А., Прокофьева Е.С. Многократное пр& менение £СГ для вызывания супзровуляции у коров. Зоотехния, 1989, № 10, с. 60-61.
20. Назаров Е.А., Дмитриев В., Советкин C.B., Прокофьев Е.С.»Препарат "Грофоллон" для стимуляции коров-доноров. Молочное к мясное скотоводство, 1991, № I, с. 26-28.
Советник C.B., Назаров Е.А., Гонадотропин очищенный - ГСШ для стимуляции полиовуляции у коров. Зоотехния, 1992, № 2, с. 32-33.
, Советкин C.B., Голубий Е.М., Прокофьев Е.С., Рэдькин П.С., Са-каян H.H., Сергеенко А.И., Т^уркевич Д.А., Фарботко Г.Э. Разработать и внедрить ветеринарно-санитарные требования и контроль препаратов, применяемых при трансплантации эмбрионов (зигот) крупного рогатого скота. Заключительный отчет, 1986, № госрегистрации 01850060395.
. Советкин C.B., Назаров Е.А., Осколков B.C., Макарова И.Е., Прокофьева Е.С., Романенко Э.Е. Разработать и внедрить новый санирующий препарат, обеспечивающий получение эмбрионоь от коров-доноров, свободных от бактериальной микрофлоры. Заключительный отчет. 1987, № госрегистрации OI860I075I6.
. Советкин C.B., Афдосьева И .К., Засадная 3.Ç., Прокофьева Е.С., Сергиенко А.И., Фомин ¡C.B. Разработать и внедрить методы декон-таминации от вирусов эмбрионов (зигот) крупного рогатого скота при их трансплантации. Заключительный отчет 1988, w госрегистрации 0I860I0I538.
. 1фццытев П.П., Крейдлина Н.И., Новгородов А.Н., Советкин С.В, КаспаРянц Е.С. Справочник по биологическим препаратам и лекарственным веществам, применяемым в трансплантации эмбрионов животных. Москва - Быково, 1989, с. 59.
. Балашов Н.Г., Советкин C.B., Рэдькин П.С., Гунеков В.В., Шараб-рин О.И. Сравнительное изучение некоторых биохимических показателей сыворотки крови сельскохозяйственных животных в связи с ее использованием при трансплантации эмбрионов. Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине. Тез.докл. Всесоюзной научно-технической конференции,- Ленинград, 1988, с. 64-66.
Советкин C.B., Фомин I.B., Засадная З.С., Авдосьева И.К., Прокофьева Е.С., Вдасенко Т.В., Сергеев Ы.И., Назаров Е.А. Изучение возможности использования высокопродуктивных коров, имеющих антитела к вирусу лейкоза, в качестве доноров эмбрионов. Научные основы и лечения патологии воспроизводительной функции сельскохозяйственных животных.. Тез.докл. Всесозюзной конф. - Воронеж, 1968, с. 107-108.
28. Советкин C.B., Лифшиц М.Б., Прокофьева Е.С., Сергеев Н.И.Базаров Е. Эффективность применения санирующих препаратов при транс плантации эмбрионов крупного рогатого скота.// Там же - с, 108110.
29. Советкин C.B., Прокофьева Е.С., Романенко Э.Е. Микробиологические и токсикологические исследования препаратов, используемых
в средах при трансплантации эмбрионов. Сб. науч.тр. ВГНКИ вет-препаратов, - LI., 1990, часть I, о. 35^41.
30. Советкин C.B., Прокофьева Е.С., Макарова И.Е. Эффективность при менения различных питательных основ в средах при оплодотворени яйцеклеток и культивировании зигот вне организма. // Там же -с. 30-34.
31. Sov&tkin S.V. Санитарный контроль качества эмбрионов. Tt-ans^e-zts Ы'emStyóns, peste potcine af-ticalne ßeucose ßa^itte e/-)zoe>t¿Que. /3е Conglzence ole Во/ Comrbíssio» ■¿éalónate, ole Л' O.J.B, рои-г /.'Еоиъоре. Maol-ild, /9gg} p.f?. íe-7i.
32. Фомин Ю.В., Засадная 3.C., Советкин C.B., Авдосьева И.К., Кос-тюк Б.В. Специфическая профилактика инфекционного ринотрахеита КРС при трансплантации эмбрионов. Материалы Всесоюзн.конф.-Львов, 1988, с. 465-466.
33. Засадная З.С., ¿омин Ю.В., Советкин C.B., Авдосьева И.К., Сергеев Н.И. Методы выявления вируса ИРТ на эмбрионах (ооцитах)
и способы его удаления. Тезисы докл. Всесоюзн.науч.конф.-Вороне; 1988, с. 27-28.
34. Фомин Ю.В., Советкин C.B., Афцосьева И.К., Засадная З.С,, Прокофьева Е.С. // Определение вирусном контаминации эмбрионов кру! ного рогатого скота методом иммунофлюоресценции при трансплантации. Тез.докл. П-й реслубл.науч.-практич.конф.-Львов, 1988, с.96.
35. Советкин C.B., Разработка препаратов, применяемых при воспроизводстве сельскохозяйственных животных и совершенствование методов их контроля.// Всесоюзная науч.конф. Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов.Москва, 1991, с. 19-21.
36. Советкин C.B., Назаров Е.А., Романенко Э.Е., Сергеев Н.И., Макарова И.Е., Осколков В.В, Эффективность санируших препаратов, при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных.// Там же - с. 241-243.
-
Советкин, Станислав Васильевич
-
доктора биологических наук
-
п. Дубровицы. Московской обл., 1994
-
ВАК 03.00.13
- Физиологическая оценка трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в хозяйствах Волго-Вятского региона
- Технология трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве
- Усовершенствование технологии криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота
- Совершенствование биотехнологических методов получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота
- ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ СЖК И ФСГ-П ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
