Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование биотехнологических методов получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование биотехнологических методов получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота"

АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

рг6 оа

УДК 636.2.034.612.6.02 2 5 АИР 2000

ВЕСТФАЛЬ ЯКОВ АВГУСТОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И КРИОКОНСЕРВАЦИИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.01 - разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

ЖОДИНО - 2000 г.

Работа выполнена в племобъединении Норд Рейн Вестфалии «PUW Rinder-Union West» и Брестском госплемпредприятии

Научные руководители:

- кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Голубец Л.В.

- кандидат биологических наук Кыса И.С.

Официальные оппоненты:

- доктор сельскохозяйственных наук,

Оппонирующая организация - Гродненский сельскохозяйственный

институт

Защита состоится «12 » _2000 года в /О часов

на заседании совета по защите диссертаций Д. 05.14.01 при Белорусском научно-исследовательском институте животноводства по адресу: 222160, г. Жодино, ул Фрунзе, 11, БелНИИЖ, тел.2-35-23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского научно-исследовательского института животноводства

Автореферат разослан« 2. »__т^з 2000 г.

старший научный сотрудник Петрушко С.А.

- доктор сельскохозяйственных наук Казаровец Н.В.

Ученый секретарь совета по защи доктор сельскохозяйственных на}

В.Н. Тимошенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Одним из резервов увеличения продукции животноводства является повышение интенсивности воспроизводства стада на основе современных биотехнологий, к которым относится трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных.

Более 50% быков для станций искусственного осеменения в ведущих странах мира получены этим методом, около половины получаемых эмбрионов подвергается криоконсервации. Это говорит об исключительной важности данного метода в сохранении и распространении высокоценного генофонда сельскохозяйственных животных. Вместе с тем, несмотря на такие масштабы внедрения трансплантации эмбрионов в практику разведения и селекции крупного рогатого скота и достаточно высокую изученность данной проблемы, до 20...25% животных не реагирует на гормональную обработку. У 25...27% доноров не удается получить ни одного жизнеспособного эмбриона. При криоконсервации 15...20% клеток снижают свою жизнеспособность или гибнут, по прежнему остается высокой вариабельность и непредсказуемость ответной реакции доноров, как по общему выходу эмбрионов, так и по выходу биологически полноценных зародышей. Эти и другие вопросы определили цель и задачи наших исследований.

Связь работы с крупными научными программами, темам;. Исследования проведены с 1997 по 1998 г. в рамках государственного плана научно-иссле-довательской лаборатории трансплантации эмбрионов с.-х. животных и лаборатории генетики с.-х. животных БелНИИЖ по заданию 02 «Усовершенствовать биотехнологию получения эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве, обеспечивающую в среднем на донора 10... 12 овуляций, выход 5-6 полноцешшх эмбрионов с приживляемостью 55...60%. Разработать биофизические, биоморфологические и генетические методы оценки половых клеток с.-х. животных при их культивировании вне организма, позволяющие повысить эффективность трансплантации эмбрионов и оплодотворяемость ооци-тов на 10... 15%» (ВКГОКП№ госрегистрации 1997482).

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного была поставлена цель: усовершенствовать биотехнологические методы получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние различных типов и доз фолликулостимулирующих гормонов на уровень суперовуляции, количественный и качественный состав эмбрионов.

2. Дать сравнительную оценку эффективности индукции полиовуляции у коров и телок-доноров при использовании различных типов и доз гормонов.

3. Дать сравнительную оценку эффективности вызывания множественной овуляции у доноров разных пород.

4. Изучить эффективность использования в качестве криопротскторов: глицерина, этиленгликоля и сахарозы.

5. Изучить влияние различных биотехнологических факторов на при-живляемость замороженно-оттаянных эмбрионов.

Объект исследования. Доноры, реципиенты, эмбрионы, криопротекторы.

Методология и методы проведения исследования. Методологической основой проведенных исследований явилась совокупность биотехнологических и расчетно-аналитических методов исследований.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые на боль-шом фактическом материале установлено влияние комплекса биотехнологических факторов на показатели жизнеспособности и приживляемости за-мороженно-оттаянных и свежеполученных эмбрионов в зависимости от их качества и стадии развития. Определена эффективность использования при консервировании в качестве криопротектора этиленгликоля, а при оттаивании - сахарозы. На основании полученных результатов разработан способ крио-консервации эмбрионов крупного рогатого скота (заявка № а 199990903 от 5 октября 1999г.). Проведен глубокий анализ влияния разных типов и доз ги-пофизарных гормонов на уровень суперовуляции, оплодотворяемость коров и телок, число и качество эмбрионов, их жизнеспособность после вымывания. Определены дозы гипофизарных препаратов для стимулирования овуляции у телок-доноров эмбрионов. Дана практическая оценка эффективности новому фолликулостимулирующему гормону - фоллтропину (Канада).

Практическая (экономическая. социальная) значимость полученных результатов. Снижение дозы гормонов при вызывании множественной овуляции сокращает затраты на их приобретение, в зависимости от используемого препарата (без снижения его эффективности), на 854...3600 БМ на каждые 100 донорообработок.

Применение в качестве криопротектора этиленгликоля при замораживании, сахарозы при оттаивании, а также комплексный учет влияющих на этот процесс факторов позволяет повысить их приживляемость до уровня, соответствующего приживляемости интактных эмбрионов, упростить процедуру трансплантации эмбрион реципиенту до уровня искусственного осеменения и сократить время от оттаивания до пересадки в 3...5 раз. Издержки при этом сокращаются на 6510... 15610 БМ на каждые 100 эмбриопересадок.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- Эффективность получения эмбрионов у коров и телок-доноров в зависимости от типов и доз используемых гормонов.

- Влияние различных биотехнологических факторов на сохранность и приживляемость заморожешю-оттаянных эмбрионов.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа представляет собой законченную научно-исследовательскую работу, выполненную лично соиска-

телем. В выполнении отдельных элементов работы принимали участие сотрудники племстанции Клеве и Брестского госплемпреднриятия.

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований доложены и одобрены на конференции рабочей группы по трансплантации эмбрионов (Neustadt - 1994, Kleve - 1995), на международных конференциях (Киев -1994, Брест - 1995, Горки - 1996, Аскания-Нова - 1997, Жодино - 1998). По результатам исследований разработай способ криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота (заявка № а 199990903 от 5 октября 1999 г.)

Опублнкованность результатов. Материалы диссертации опубликованы в научно-производственных журналах Ruwreport и Herbuchzuch leistungspbfungcu besamung, научных трудах Белорусской сельскохозяйственной академии, в сборниках научных работ международных конференций в г. Жодино и Аскания-Нова.

По теме диссертации опубликовано всего 10 научных работ на 20 стр., в т.ч.: 2 статьи - в журналах, 4 - в сборниках, 1 - в материалах международных конференций, 3 тезиса.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики, собственных исследований анализа и обобщения результатов, выводов и практических предложений. Материалы диссертации представлены на 102 страницах машинописного текста, содержат 36 таблиц, 6 рисунков. Список литературы содержит 256 источников, в т.ч. 170 иностранных.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в центре по трансплантации эмбрионов на племстанции Клеве при Племобъединении Норд Рейн Вестфалии («RUW Rinder-Union West»), в госплемзаводе «Луч» Брестской области, Брестском ГПП с 1991 по 1997 г.г.

В качестве доноров использовались коровы черно-пестрой породы (п=499) с удоем от 8500 кг до 15000 кг молока и тёлки черно-пестрой породы (п=259) в возрасте 16... 18 месяцев с живой массой 350...400 кг, а также доноры мясных пород: герефордской (п=24) и абердин-ангусской (п=-29). Отбор доноров проводился по следующим критериям: количеству отелов у коров, репродуктивному статусу (выражешюсть охоты, наличие регулярного полового цикла, отсутствие гнойных выделений и задержания последа), физиологическому состоянию вымени, времени после отела (не менее 8 недель).

Стимуляция охоты у доноров проводилась за 24...26 дней до запланированной трансплантации эмбрионов однократным введением простагландинов «Estrumate» 2ml (500мкг) или «Pronilen» 2ml (15mg). Для последующего вызывания суперовуляции применялись следующие фолликулостимулирующие

препараты: фоллтропин (Канада) в дозах 400 и 280 мг; ФСГ-П (США) в дозах 50 и 40 мг, прегмагон (Германия) - 2500 и 1800 I.E., фолликотропин (Чехия) - 480 и 400 М.Е., фоллитропин (Литва) - 1200 и 1100 ЕД., ФСГ-супер (Россия) 50 и 46 ед. по Арм. стандарту.

В качестве реципиентов использовались коровы (п=458) и телки случного возроста (п=1441). Синхронизация охоты проводилась двухкратной инъекцией аналога простагладина с интервалом 11... 12 дней. Вторая обработка проводилась в день инъекции простагландина донорам. Однократная синхронизация реципиентов проводилась за 9 дней до вымывания эмбрионов синхронно с введением простагландина донорам.

В день пересадки эмбрионов реципиенты ректально обследовались на наличие и качество жёлтого тела. Обследованию подвергались только животные, у которых наблюдалась охота.

Вымывание эмбрионов проводилось с использованием резиновых катетеров фирмы «Neustadt». Для вымывания использовались фосфатпо-солевой буфер Дюльбекко. На промывание каждого рога матки использовалось 250 мл среды.

Поиск зародышей проводился под стереомикроскопом при 16-кратном увеличении. Классификация найденных зародышей проводилась при 60-кратном увеличении и подразделялась в соответствии со стадией развития и качеством.

Свежеполученные эмбрионы, предусмотренные для трансплантации, заправлялись в пайетты и заряжались в предварительно нагретые до 36°С катетеры, которыми проводилась пересадка. Реципиентам за 10 мин. до трансплантации внутримышечно инъецировалось 5 мл маточного релаксанта.

Криоконсервирование эмбрионов проводились двумя методами:

метод 1: в качестве криопротектора использовался 10%-й раствор глицерина на культуральной среде «ОСМ». Эмбрионы помещались на 10...15 мин. в 10%-й раствор глицерина, затем заправлялись в пайетты.

метод 2. В качестве криопротектора использовался этиленгликоль на культуральной среде «ОСМ». Эмбрионы на 10 мин. помещались в раствор криопротектора и заправлялись в пайетты.

Режим замораживания начинался с +4°С. Охлаждение проходило со скоростью 1,0°С/мин. до -5...6°С. При этой же температуре проводился сидинг с 5-ти минутной выдержкой. Дальнейшее снижение температуры проходило со скоростью 0,5°С/мин до -32,5°С с последующим переносом замороженных эмбрионов в жидкий азот.

Криоконсервация эмбрионов проводилась аппаратом «Cryocell -1200».

Оттаивание эмбрионов проводилось тремя методами:

1. Стандартный метод. Пайетты с эмбрионами, замороженными в 10% глицерине, оттаивались 10...20 сек. на воздухе, затем в водяной бане при

25...30°С (15...20 сек.). Удаление криофилактика проводилось 4-х ступенчатым методом.

2. Одноступенчатый метод (оттаивание в пайетте). Эмбрионы, замороженные в этиленгликоле, оттаивались 10 сек. на воздухе, затем в водяной бане при 30°С (15 сек.). Непосредственно перед трансплантацией пайетта встряхоталась. Такт! образом перемешивались культуралъная среда и крио-филазегик. Пересадка замороженно-оттаянных эмбрионов проводилась в той же пайетте без предварительного контроля их качества.

3. Одноступенчатый в присутствии сахарозы. Оттаивание эмбрионов проводилось аналогично первому методу. Удаление криопротектора проводилось в течение 2 минут в растворе 0,25... 1,5М сахарозы.

Полученный экспериментальный материал обработан общепринятыми методами вариационной статистики с использованием ЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эффективность гормональной обработки коров и телок доноров-эмбрионов в зависимости от их породы, типов и доз гопадотропинов

Количество животных, реагирующих на экзогенное введение гопадотропинов, было примерно одинаковым (от 82% - при использовании прегмагона, до 90% - при использовании ФСГ-П и фоллитропина). Среднее число овуляций колебалось также незначительно, за исключением сывороточного гона-дотропина (7,8 овуляций на донора).

Наиболее высокий выход эмбрионов на донора при максимальных дозах препарата так же, как и выход жизнеспособных эмбрионов, получен при использовании в качестве фолликулостимулирующего гормона фоллтропина (9,0 и 5,8 эмбриона) и ФСГ-П (9,5 и 6,7 эмбриона). У ФСГ-П разница по выходу жизнеспособных эмбрионов достоверно выше по отношению к прегма-гону (Р<0,001), фолликотропину (Р<0,05) и фоллитропину (Р<0,001).

Самый низкий выход жизнеспособных зародышей оказался в группе доноров, обработанных прегмагоном - 50,7%, в то время, как в других группах этот показатель колебался в пределах от 61,2% (фолликотропин) до 70,5% (ФСГ-П). В этой же группе наиболее высоким был выход дегенерироваппых и отставших в развитии эмбрионов, а также неоплодотворенных яйцеклеток -32,0 и 17,3%, соответственно.

Со снижением дозы гормона отмечается четкая тенденция увеличения выхода жизнеспособных эмбрионов: при обработке фоллтропином на 10,9%, ФСГ-П - на 4,8%, прегмагоном - на 7,5% и фоллитропином - на 10,5%, а также снижение числа дегенерированных и отставших в развитии зародышей.

Выход полноценных зародышей у телок-доноров в среднем по всем типам гормонов составил 5,1 эмбриона на донора. Уровень полиовуляции коле-

бался от 7,9 в случае использования прегмагона, до 11,2 при использовании ФСГ-П. Процент животных, среагировавших на гормональную обработку, колебался в пределах 75...92%. Снижение дозы гормонов при стимуляции суперовуляции не оказало достоверного влияния на показатели эффективности гормональной обработки.

В наших исследованиях в качестве доноров эмбрионов использовались 3 породы животных - черно-пестрая, герефордская и абердин-ангусская.

В группе герефордов отмечен наиболее высокий уровень полиовуляции -11,8 овуляций в среднем на донора, выход эмбрионов и яйцеклеток -10,2 (Р<0,001), в том числе нормальных эмбрионов - 6,9 (Р<0,05).

Коровы черно-пестрой и абердин-ангусской пород по овулирующей реакции яичников несколько уступали герефордам и имели в среднем по 9,6 и 10,1 овуляций на донора. Аналогичная тенденция наблюдалась по общему выходу зародышей - 7,2 и 7,3 соответственно, и нормальным эмбрионов - 5,6 и 5,3 в среднем на донора.

Влияние биотехно логических факторов на сохранность замороженно-оттаянных эмбрионов

Результаты исследований по изучению влияния криоконсервации эмбрионов в зависимости от концентрации этиленгликоля и сахарозы показывают, что наиболее эффективным этиленгликоль оказался в концентрации 1,5М. Уровень сохранности зародышей после оттаивания составил 95%, что на 7%; 5,5% и 14,7% выше по сравнению с концентрацией 1,0; 1,25 и 1,75М. При этом по отношению к концентрациям 1,0 и 1,75М эта разница достоверна (Р<0,05 и Р<0,001 соответственно).

Анализ сохранности эмбрионов в зависимости от концентрации сахарозы позволяет сделать вывод о том, что сахароза наиболее эффективна в концентрации 1,0М. Сохранность эмбрионов составила при этом 95,5%. При увеличении или снижении концентрации криопрогектора потери эмбрионов возрастали на 4,2...8,4%.

Аналогичные результаты получены при одноступенчатом оттаивании зародышей в пайетте. Сохранность эмбрионов при использовании 1,5М этиленгликоля превышала аналогичный показатель при использовании 1,0; 1,25 и 1,75М на 10,0; 8,3 и 16,7% соответственно.

Анализ результатов исследований по изучению эффективности использования в качестве криопротектора глицерина и этиленгликоля не установил достоверных различий между ними по сохранности эмбрионов - в среднем 88,1 и 89,3% соответственно.

Эмбрионы отличного и хорошего качества при их заморозке с использованием этиленгликоля и оттаивании в растворе сахарозы сохранили свою жизнеспособность в 100 и 90,7% случаев. Данный показатель при криокон-

сервации в глицерине составлял 95,9 и 88,1% соответственно. У эмбрионов удовлетворительного качества эти показатели составили 70,0 и 66.7%. Оттаивание эмбрионов удовлетворительного качества по стандартному методу, когда для замораживания использовался глицерин, достоверно снижало показатель сохранности с 70,0 до 41,4% (Р<0,05).

Анализ данных по сохранности эмбрионов в зависимости от способа замораживания, отгаивания и стадии развития выявил общую тенденцию повышения уровня выживаемости ранних бластоцист по сравнешпо с морулами и поздними бластоцистами. Отмечается также более высокая сохранность эмбрионов, замороженных в этиленгликоле по сравнению с эмбрионами, замороженными в глицерине, когда их оттаивание проходило в присутствии сахарозы.

Анализ зависимости сохранности эмбрионов ог их качества, стадии развития и криопротектора показывает, что наиболее высокая сохранность отмечена у бластоцист отличного качества, замороженных в этиленгликоле (96,8%) и глицерине (95,3%). Самая низкая выживаемость оказалось у морул и поздних бластоцист удовлетворительного качества, замороженных в глицерине (51,4 и 50,0%, соответственно).

Влияние биотехнологических факторов на приживляемость свежеполученных и замороженно-оттаянных эмбрионов

Приживляемость эмбринов, замороженных в 1,5М этиленгликоле была выше по сравнешпо с 1,0; 1,25 и 1,75М на 6,3; 7,3 и 12,5%, соответственно. Изучение влияния сахарозы при одноступенчатом оттаивании эмбрионов показало, что наиболее высокой эффективностью она обладает в концентрации 1,0М. Приживляемость эмбрионов составила 63,3%.

Приживляемость эмбрионов при одноступенчатом удалении криопротектора в пайетте с последующей пересадкой без предварительного контроля качества оказалось на 6% ниже по сравнению с трансплантацией эмбрионов, криопротектор из которых удалялся в присутствии 1,0М сахарозы (53,2 против 59,2%).

Анализ приживляемости эмбрионов в зависимости от криопротектора, стадии развития и их качества показывает (табл. 1), что наиболее высокую приживляемость показали эмбрионы отличного и хорошего качества на стадии поздней бластоцисты, когда в качестве криопротектора использовали этиленглшеоль (76,7 и 75,0%). Это на 15,4 и 9,3% выше по сравнешпо с ранними бластоцистами и на 17,9 и 22,1% по сравнению с морулами. Разница по уровню приживляемости бластоцист отличного качества была достоверной по отношению к морулам (Р< 0,01).

Сравнительный анализ приживляемости эмбрионов отличного качества при использовании для замораживания зародышей этиленгликоля и глицерина

Удовлетвор. Хорошее Отличное Качество эмбрионов

ы -р. и> о ы количество пересадок морула Стадия развития этиленгликоль Криопротектор

29,1 57,1 54,6 уровень стельности, %

- К) количество пересадок бластоциста1

54,5 59,6 * * уровень стельности, %

ю и> о количество пересадок бластоциста II

о О * * уровень стельности, %

00 о 00 количество пересадок морула глицерин

22,2 37,1 61,3 уровень стельности, %

1Л ю количество пересадок бластоцистаI

57,1 2 * * 62,9 уровень стельности, %

- о СТ\ количество пересадок бластоциста И

о о о 63,9 уровень стельности, %

иг м и» количество пересадок морула Интактные

47,9 56,5 77,1 уровень стельности, %

ОС ы 5 количество пересадок бластоцистаI

37,5 61,3 уровень стельности, %

ю 0\ количество пересадок а Ы 0

о о 00 * # ЧО * * уровень стельности, % Я

а

-о

я *

я а :э а о 2 О о ч

сг «

а

о\ ■о к о к о №

Я Я

* &

рэ Р?

.£

01 о н

а р>

ш 2 а\ = ■а о

я в § §

а тз о -! П>

О

•о

и

£ о\ Й я

я »>

я

показал увеличение на 12,8% (76,7 против 63,9%) приживляемости поздних бластоцист в случае применения этиленгликоля по сравнению с глицерином (76,7 против 63,9%). Аналогичные результаты получены при пересадке бластоцист хорошего качества (75,0 против 20,0).

Анализ данных табл.2 показал, что при использовании реципиентов с отличным желтым телом, приживляемость эмбрионов хорошего качества выше, если в качестве криопротектора при их заморозке использовался эти-ленгликоль (Р<0,05). Следует отметить достаточно высокий уровень приживляемости эмбрионов удовлетворительного качества, при их пересадке реципиентам с хорошим желтым телом, по сравнению с отличным и удовлетворительным как при использовании этиленгликоля, так и глицерина - 40 и 42,1%, соответственно. Отмечается стабильная тенденция снижения приживляемости эмбрионов отличного и хорошего качества по мере снижения качества желтого тела реципиента. Это характерно как для этиленгликоля, так и для глицерина.

При использовании этиленгликоля эмбрионы отличного качества, пересаженные реципиентам с отличным и хорошим желтым телом, показали достоверно более высокие результаты по сравнению с пересадкой реципиентам с удовлетворительным желтым телом - 62,8%, 58,4% против 36,0% (Р<0,01 и Р<0,05, соответственно). При заморозке в глицерине аналогичные результаты получены при пересадке отличных эмбрионов только реципиентам с отличным желтым телом (68,8% против 42,8%, при Р<0,01).

Анализ эффективности трансплантации эмбрионов на разных стадиях развития реципиентам с разным по качеству желтым телом не выявил достоверных различий в показателях приживляемости ни по одному из факторов влияния (табл. 3) между глицерином и этиленгликолем. Хотя следует отметить тенденцию снижения приживляемости эмбрионов всех стадий развития по мере снижения качества желтого тела. Исключение составляют поздние бластоцисты, пересаженные реципиентам с удовлетворительным по качеству желтым телом (83,3%) при использовании при заморозке этиленгликоля и ранних бластоцист при использовании глицерина (57,1%).

При применении этиленгликоля отмечена более высокая приживляемость поздних бластоцист по сравнению с морулами и ранними бластоциста-ми. Морулы, пересаженные реципиентам с отличным и хорошим желтым телом, дали достоверно более высокие результаты по сравнению с такими же эмбрионами, пересаженными реципиентам с удовлетворительным желтым телом (58,1; 53,6 и 23,1% при Р<0,001).

При использовании глицерина приживляемость поздних бластоцист, пересаженных реципиентам с отличным желтым телом, составили 70,6%. При пересадке реципиентам с хорошим желтым телом данный показатель снижался на 22,0% при достоверной разнице (Р<0,05).

Удовлетвор. Хорошее Отличное Качество эмбрионов

С\ со VI количество пересалок о X

31,2 66,2* ю 00 * * уровень стельности, % £ о га и 5 о

ел ы м ю количество пересадок X о •о

-Ь. О о VI VI и, 00 V * уровень стельности, % В С? о к о

ос <! ю количество пересадок £ О СО

25,0 42,8 36,0 уровень стельности, % ч от о •а о я т>

ю ы со количество пересалок о -1 X о 3 о ■а

20,0 -ь. VI Ъс * а сс ОС * * уровень стельности, % о о о о О

о о --4 40 количество пересадок X о ■а 1 с

42,1 45,2 55,3 уровень стельности, % Е О О ( о ч о п ■о я я

количество пересадок о са ч 3

о 14,3 42,8 уровень стельности, % У 03 о ■р

ы .и С\ ю 1ч) Ы количество пересадок о

69,2 60,8 ОС "Л. * * уровень стельности, % о о

ы о Оч количество пересадок хорошее 5 1

45,1 VI % и) о * уровень стельности, % ч СР о

и« м о количество пересадок ^ о в й

О 46,7 50,0 - уровень стельности, % В О •о

я

тз 5 я

ш

ь

¡3 О

о о н о»

и

« 0>

Ж -О

й о

О д

» са

ТЗ о

5 1

II

3 о

2 я

н "В

Р Й я н о

тз р

Н

И

о»

Я р

ю

из

Бластописта II; Бластоциста I 2 о ■о в Стадия развития

го и» ю ы количество пересадок о ¡ч

76,0 66,1 * 1л * 00 * ~_ уровень стельности, % о о

ю 00 о ы о количество пересадок X о •о н я о

62,9 с\ и! о * ^ * и» * "о уровень стельности, % о о у * о

с* ОС 1ч) 3\ количество пересадок 1 а

со Ъ 37,1 23,1 уровень стельности, % ч и -3 ■о о "О

и) количество пересадок о 5 5 0 го 1 -а

о р Ъч * 68,4 55,5 уровень стельности, % X О о о ч с о

из о ю ы количество пересадок X о тз п

48,6 48,7 уровень стельности, % Е о о о 5 о •а £

- сс количество пересадок о ю ¡4 о Ьа и

о 57,1 о уровень стельности, % ч я о •р

«-Л ■о О! количество пересадок о 3

88,7 00 ю V) * * * --1 * 40 уровень стельности, % о

Г„ К) и.о количество пересадок X о тз И

88,6 63,1 Оч уровень стельности, % Е о о Г С*

С. с количество пересадок £ о а

66,7 50,0 42,0 уровень стельности, % ч и о ■з

я

тз а

о ч а За

13 и

и »

к

ч

о 2 СТ1 ТЗ

к о

о о

б £

ч о

о о

ч Й л

Й о

» ч

тз я

Л> "а

■5 к

Д о

я 3 13

о

—1

о\

¡3

в р

тт

Результаты эмбриопересадок в зависимости от того, какого качества и в каком роге находилось желтое тело указывают на достоверное увеличение приживляемости эмбрионов при аппликации их в левый рог, когда там имелось желтое тело хорошего качества, а при заморозке применялся этиленгли-коль (68,9% против 46,6%).

При использовании в качестве криопротектора глицерина как и в случае с этиленгликолем пересадка эмбрионов в левый рог с хорошим и удовлетворительным желтым телом, повысила уровень приживляемости по сравнению с пересадками в правый рог на 7,2...7,3%, соответственно.

Сравнительный анализ эффективности криопротекторов показал, что когда в качестве криофилактика использовался этиленгликоль, а эмбрионы пересаживались в левый рог с хорошим и удовлетворительным желтым телом, уровень стельности составил 68,9% и 42,8% против 55,4 и 27,3% при использовании глицерина. При этом разница в показателях приживляемости при пересадке в левый рог с хорошим желтым телом была достоверной (Р<0,05).

Результаты исследований комплексного влияния на приживляемость эмбрионов криопротектора, качества эмбрионов и последующего способа оттаивания приведены в таблице 4. Установлено достоверное увеличение приживляемости зародышей хорошего качества, замороженных в этиленгликоле и оттаянных по стандартному методу, по сравнению с эмбрионами, замороженными в глицерине и оттаянными по аналогичному методу (59,0 против 44,3% при Р<0,05). Схожие результаты были получены и при пересадке эмбрионов, оттаянных в присутствии сахарозы (68,0 против 41,5% при Р<0,05).

Таблица 4

Приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и их качества

Криопротектор

этиленгликоль глицерин

Качество эмбрионов Способ оттаивания

стандартный с сахарозой стандартный с сахарозой

количе- уровень количе- уровень количе- уровень количе- уровень

ство пе- стельно- ство пе- стельно- ство пе- стельно- ство пе- стельно-

ресадок, сти, % ресадок, сти, % ресадок, сти, % ресадок, сти, %

п п п п

Отличные 327 59,5 98 56,9 308 62,1 95 63,3

Хорошие 98 59,0* 49 68,0* 136 44,3 37 41,5

Удовлетворит. 17 30,4 22 44,0 12 41,4 14 22,2

К этому следует добавить, что эмбрионы хорошего и удовлетворительного качества, замороженные в этиленгликоле, показали более высокую приживляемость при условии их оттаивания в присутствии сахарозы по сравнению со стандартным методом. У эмбрионов отличного качества результаты были практически одинаковыми - 59,5 и 56,5%, соответстветпю.

При заморозке в глицерине более высокий результат был получен при пересадке эмбрионов хорошего и удовлетворительного качества, оттаянных по стандартной методике - 44,3 и 41,4%. При использовании сахарозы - 41,5 и 22,2%, соответственно.

При анализе эффективности эмбриопересадок в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и стадии развития эмбрионов (табл. 5) не установлено достоверного влияния ни по одному из показателей, хотя прослеживается четкая тенденция увеличения приживляемости поздних бластоцист при условии их заморозки в этиленгликоле. При использовании глицерина аналогичная ситуация складывается с ранними бластоцистами. При этом следует отметить значительное превосходство по результатам пересадок поздних бластоцист при их заморозке в этиленгликоле по сравнению с глицерином независимо от способа оттаивания (67,5 и 68,9% против 58,3 и 57,5%, соответственно).

Таблица 5

Приживляемость эмбрионов в зависимости от способа оттаивания, _криопротектора и стадии развития_

Стадия развития Криопротектср

этиленгликоль глицерин

Способ оттаивания

стандартный с сахарозой стандартный с сахарозой

количество пересадок, п уровень стельности, % количество пересадок, п уровень стельности,0/» количество пересадок, п уровень стельности, % количество пересадок, п уровень стельности, %

Морула 320 54,5 83 50,0 236 51,5 68 47,8

Бластоциста I 93 63,7 57 64,8 173 61,1 53 67,9

Бластоциста П 27 67,5 31 68,9 49 58,3 23 57,5

Приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и качества желтого тела показывает, что наиболее высокие результаты были получены при пересадке эмбрионов реципиентам с отличным желтым телом: от 62,9% до 67,2% в зависимости от криопротектора и способа оттаивания. По мере снижения качества желтого тела снижалась и резуль-

тативность эмбриопересадок, а именно: при пересадке эмбрионов реципиентам с хорошим желтым телом уровень стельности составил от 50,4% до 58,7%, а реципиентам с удовлетворительным - от 25 до 38,1%. При этом эмбрионы, замороженные в этиленгликоле, независимо от метода оттаивания показали более высокие результаты приживляемости по сравнению с аналогичными пересадками эмбрионов, замороженных в глицерине (кроме пересадки эмбрионов, оттаянных по стандартному методу и пересаженных реципиентам с отличным желтым телом).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Эффективность вызывания суперовуляции у доноров зависит от типа и дозы используемых фолликулостимулирующих гормонов. Применение выео-коочищенных гипофизарных ФСГ позволило увеличить выход жизнеспособных эмбрионов на 33,9% по сравнению с использованием сывороточных го-надотропинов. Снижение дозы гонадотропных гормонов при индукции множественной овуляции не оказало отрицательного влияния на основные показатели эмбриопродукции допоров. Количество среагировавших животных, число овуляции и выход качественных зародышей на донора составили в среднем 83,7%, 9,6; 5,4, соответственно /2, 5/.

2. Использование телок в качестве доноров позволяет получать высокие показатели эмбриопродукции. Ответная реакция суперовуляцией, количество овуляций и число жизнеспособных эмбрионов составила в среднем на донора 84,4%, 9,5; 5,1, соответственно. Индуцирование полиоуляции у коров разных пород имеет существенные различия. У доноров гсрсфордской породы отмечен достоверно более высокий уровень суперовуляции (11,8), выход общего числа эмбрионов (10,2) в том числе жизнеспособных (6,9) по сравнению с донорами черно-пестрой и абердин-ангусской пород /1,3/.

3. Криопротекторы глицерин и этиленгликоль обладают высокими крио-загцитными свойствами. Сохранность и приживляемость эмбрионов при использовании 10% глицерина и 1,5М этилегликоля составляет в среднем 88,1...89,3%; 55,9% и 57,8%, соответственно.

Уровень стельности реципиентов при пересадке поздних бластоцист и эмбрионов хорошего качества, замороженных в 1,5М этиленгликоле, было на 12,4 и 16,7% выше по сравнению с криоконсервацией в 10% глицерине /2, 7/.

4. Использование этиленгликоля в концентрации 1,5М достоверно повышает сохранность эмбрионов по сравнению с 1,0 и 1,75М концентрацией (95,0 против 88,0 и 83,3%), а также позволяет производит трансплантацию эмбринов без предварительного контроля их качества. Приживляемость эмбрионов при этом составляет 53,2 против 59,2% в контроле /4,9,6/.

5. Одноступенчатое удаление криопротектора из эмбрионов в присутствии 1,0М сахарозы позволяет увеличить сохранность эмбрионов на 4,2...8,3%

по сравнению с использованием сахарозы в концентрации 0,25; 0,3; 0,5; 1,5М /8,10/.

6. Уровень стельности при пересадке поздних бластоцист достоверно выше по сравнению с морулами и ранними бластоцистами (73,7 против 65,4 и 57,4%, соответственно). Приживляемость отличных эмбрионов выше по сравнению с зародышами хорошего и удовлетворительного качества (67,5 против 54,1 и 42,1% при Р<0,001, соответственно). Эффективность трансплантации эмбрионов телкам-реципиентам на 10,9% выше по сравнению с пересадками коровам-реципиентам /1,2/.

Предложения производству

1. Гормональную обработку коров-доноров проводить ФСГ-П в дозе 50 мг, фоллтропином в дозе 280 мг, телок - в дозах 40 мг и 280 мг, соответственно.

2. С целью повышения эффективности криоконсервировации эмбрионов применять в качестве криопротектора при заморозке 1,5М этиленгликоль. Удаление криопротектора при оттаивании эмбрионов проводить одноступен-чато в присутствии 1,0М сахарозы.

3. Проводить прямую пересадку эмбрионов, замороженных в 1,5М эти-ленгликоле, без предварительного контроля их жизнеспособности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Geschlechtsbestimmung an Rinderembryonen und ihre Bedeutung für Embryontransfer. / E. Dopp, U. Janowitz, M Schwerin, A. Gorlach, J. West Га! - // Herdbuchzucht Leistungsprufunden Besamung, Januar 1992 - Nummer 78, S. 1114.

2. J. Westfal - Neues Tiefgefrierverfahren für den Embrytransfei RUWREPORT, Juni 1992, S. 45.

3. J. Westfal, U. Janowitz, L. Hermanns - Embryontransfer als Massnahme zur Sterilitatsbekamplung bei wertvollen Zuchtrmdem Tagung AET-d 9./10. Juni 1994, Institut für Tierzucht und Tierverhalten, Mariensee Neustadt, 1994, S. 19.

4. J. Westfal, U. Janowitz - Erfahrunger und Ergbnisse mit dem Direkttransferverfahren Tagung AET-9/10 Juni 1994, Institut für Tierzucht und Tierverhalten, Mariensce Neustadt, 1994, S. 15.

5. Vergleichende Untersuchungen zur Superovulation mit PMSG und Folltropin beim Jungrind. / U. Janowitz, P. Clatzel, A. Gotlach, J. Westfal // Jahrestagung der AET-d 1. und 2. Juni 1995 im Haus Riswick bei Kleve. Kleve, 1995, S. 44.

6. Сравнение двух способов криоконссрвирования эмбронов крупного рогат ого скота. / Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Вестфаль Я., Бабенкова JI.B., Сивая H.H., Пронько А. Ф.,. // Сборник научных трудов международной на-

учно-практической конференции (6-8 шоня 1996 г.). Актуальные проблемы интесивного развития животноводства. Горки, 1996г., с.131-132.

7. Дисекция деконсервированных эмбрионов. / Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. // Сборник научных трудов международной научно-практической конференции (6-8 июня 1996 г.). Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. Горки, 1996г., сЛ 33-134.

8. Влияние различных способов криоконсервации и Деконсервации эмбрионов на их жизнеспособность. / Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Вестфаль Я. // Матер1али Мжнарод. науков. виробнич. конференц., Аскашя-Нова, жовтень, 1997 р. Використання трансплантат i ем-6pioiroB в селекци i впворенш сшьськогосподарьских тварин. Кшв, Аскашя-Нова, 1997, с. 6-7.

9. Эффективность трансплантации различных групп эмбрионов. / Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Лущинская Н. Н., Радкевич В. В., Рошлау К., Вестфаль Я. // Сборник работ международной научно-практической конференции, часть И, 23-24.04.98 г. Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республики Беларусь. Жодино, 1998, с. 93-94. •

10. Совершенствование методов замораживания-оттаивания эмбрионов / Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Лущинская Н. Н., Рошлау К., Вестфаль Я. // Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республики Беларусь / Сборник работ международной научно-практической конференции. - Жодино, 1998, с. 89-90.

РЕЗЮМЕ

Весфаль Яков Августович

«Биотехнологические аспекты получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота»

Ключевые слова: донор, эмбрион, криоконсервация, криопротектор, реципиент, приживляемость, сохранность, пересадка, трансплантация, суперовуляция.

Объекты исследований: донор, эмбрион, реципиент, криопротектор.

Цель работы: усовершенствовать биотехнологические методы получения и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота.

Впервые на большом фактическом материале установлено влияние комплекса биотехнологических факторов на показатели жизнеспособности замо-роженно-оттаянных и свежеполучешшх эмбрионов. Определена эффективность использования в качестве криопротекторов этиленгликоля и сахарозы, применение которых позволяет снизить потери эмбрионов при криоконсервации на 9,3-22,3%. Определит дозы гипофизарных гормонов у доноров эмбрионов. Дана практическая оценка эфективности ФСГ разных фирм-изготовителей.

РЭЗЮМЭ

Весхфаль Якау Аугустав1ч

«Б1ятэхналапчныя аспекты атрьшання i крыакансервавання эмбрыёнау буйной рагатай жывёлы»

Ключавыя словы: донар, эмбрыён, крыакансерваванне, крыапратэктар, рэцытеит, прыжывальнасць, захаванасць, перасадка, трансплантацыя, супер-авуляцыя.

Аб'ект даследавання: донар, эмбрыён, рэцышент, крыапратэктар.

Мэта работы: удасканалщь б1ятэхналапчныя метады атрымання 1 крыакансервавання эмбрыёнау буйной рагатай жывёлы.

Упершышо на вялжш фактычным матэрыяле выяулены уплыу комплексу б1ятэхналапчных фактарау на паказчыи жыццяздольпасщ 1 прыжываль-насщ замарожана-атталых 1 евежаатрыманых эмбрыёнау. Вызначана эфек-тыунасць выкарыстання у якасш крыапратэктарау этыленглколю 1 цукрозы, ужываннс яих дазваляе пашзщь страты эмбрыёнау пры крыакансерваванш на 9,3 - 22,3%. Установлены дозы гшаф'!зарных гармонау для стымуляцьи су-перавуляцьп у донарау эмбрыёнау. Дадзена практычная адзнака эфек-тыунасщ ФСГ розных ф1рм-вытворцау-

SUMMARY

Jacob Weslfal

«Biotechnological aspects of receiving and cryoprotecting of cattle embryos»

Key words: donor, recipients, embryo, viability, cryoprotecting, cryoprotectants, embryo transfer, superovulation.

Object of research: donor, recipient, embryo.

Aim of research: to improve biotechnological methods of production and cryoprosevation cartel's embryons.

The effect of biotechnological factors on the viability trains of frozen-thawed embryos was studied. Ethylene glycol and saccharose as cryoprotectants were found to be efficient in decreasing embryo kosses by 9,3-22,3%. Doses of hypophyseal hormones to stimulate superovulation in embryo donors havejpeen determined.