Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологии трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве"



На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ ВИКТОР ИВАНОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ В МОЛОЧНОМ СКОТОВОДСТВЕ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сонсканнс ученой степени доктора биологических наук

Дубровины - 2001

Работа выполнена do Всероссийском государственном ш^шсъ исследовательском институте животноводства.

Научные консультанты - Академик РАСХН

Эрнст Л.К.

- доктор биологических наук, профессор Сергеев Н.И.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Марзанов НС.

- доктор биологических паук, профессор Ерохин А, С.

- доктор биологических наук А(шлиь АН

Ведущая оргамаация - РАМЖ

Защита состоится «4 3 » 4л. '¿СIJ ¡0 -rf 2001 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 1Юб,013.01 во Всероссийском государственном НИИ животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, н. Дубровины, ВШК

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Автореферат разослан «*/У »^tfCtbp&QOX г

Ученый секретарь диссертационного Совета, -, канд. биолог, наук

У^Шгг^К^ъъ, Гуйанова

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы. Современные экономические условия требуют необходимости повышения интенсивности селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных пород, линий и гибридов скота, а метод трансплантации эмбрионов является важным фактором ускорения процесса качественного улучшения и обеспечивает более полное использование генетических ресурсов маточного поголовья.

Наибольшие успехи я области создания высокопродуктивного молочного скота достигнуты в СЩА и в Канаде н лидерство они удерживают в этой отрасли в большей степени благодаря внедрению в производство метода трансплантации эмбрионов, В странах Европы и Северной Америки около 70% быков-производителей, используемых для искусственного осеменения, получены методом трансплантации эмбрионов, и доля их продолжает увеличиваться.

Сдерживающим фактором более широкого внедрения метода трансплантации эмбрионов являются сравнительная трудоемкость и стоимость работ, но, тем не менее, ускоренное получение от коров-рекордисток быков для искусственного осеменения является главным источником доходов от применения трансплантации.

Одной из главных причин недостаточного распространения метода трансплантации эмбрионов в нашей стране — слабая экономическая защищенность метода. Это связано с высокой стоимостью работ, относительно низкими ценами на племенной скот в сравнении с зарубежными странами. Основной сдерживающей причиной является также небольшое число высокопродуктивных коров и отсутствие быстрой материальной отдачи от внедрения метода за счет повышения генетического потенциала стада.

В настоящее время накоплен большой научный материал и производственный опыт, позволяющий получать достаточно высокие результаты получения телят-трансплангатов. Но, несмотря на достигнутые успехи В разработке новых приемов гормонального вызывания суперовулящш у коров и телок-доноров, техники извлечения и пересадки эмбрионов, имеется много неиспользованных резервов.

Главным направлением совершенствования метода трансплантации эмбрионов является разработка новых способов, обеспечивающих получение наибольшего количества полноценных эмбрионов с желательным генотипом за счет вызывания множественной овуляции.

Потенциальные возможности трансплантации эмбрионов в практике воспроизводства стада молочного скота используются далеко не полностью. Нет перехода биотехпологических исследований из научной области к внедрению в производство.

Несмотря на интенсивные исследования с целью совершенствования и упрощения технологии трашдпа1шШЖ., эмбрионов и получения телят-трансплантатов этот меток остается ^дорогостоящим.~ На показатели затрат в

Г НАУ-'НЛ;; г-ч* .

трансплантации эмбрионов оказывают влияние и многие биологические факторы.

Непредсказуемость реакции яичников на гормональные препараты, высокая вариабельность показателей овуляции и числа зародьсшей. а также качество эмбрионов и их приживляемость снижает в целом эффективность применения этого метода в производстве.

Для успешного внедрения этого метода в практику селекции молочного скота необходимо получать стабильные результаты суперовуляции я ггриживляемости эмбрионов. При повышении этих показателей значительно будет снижаться и себестоимость телят-трансплантатов.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явились разработка и усовершенствование технологии получеши не менее 6 эмбрионов за одно извлечение на донора и достижения 50% приживляемости эмбриоиов при пересадке. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

Разработать новые методы вызывания с^еровуляции у коров и телок-доноров с использованием существующих гормональных препаратов с применением новых биологически активных веществ (угеротоних, миксоферон, ПДЭ).

Исследовать эндокринные и биохимические показатели в крови доноров и реципиентов для определения их эмбриопроду ктивгюств.

■ Усовершенствовать приборы для извлечения эмбрионов у коров-доноров и сконструировать приборы для извлечения у телок-доноров.

Изучить возможность многократного использования коров и телок в качестве доноров эмбрионов и причины их выбытия. Изучить гормональные профили у реципиентов разньк пород. Разработать технологию низкотемпературного замораживания и оттаивания эмбрионов с применением криопротеьтора этиленшпеоль.

Поставленные задачи решались при использовании животных различных пород в разных природных зонах.

1.3. Научная новизна. Усовершенствованы методы вызывания полиовулящт у коров и телок-доноров черно-пестрой, айрщирской, красной степной, ярославской и симментальской пород па основе применения современных гормональных препаратов и биологически активных веществ. Сконструирован катетер для извлечения эмбрионов. Изучены эндокринные факторы у доноров и реципиентов разных пород, возможность многократного использования в качестве доноров коров и телок случного возраста, а также разработана технология глубокого замораживания эмбрионов с криопротектором этилекглккодь. Новизна исследований подтверждена патентом на катетер для извлечения эмбрионов у телок-доноров.

1.4. Практическая значимость. Усовершенствование методов индуцирования полиовуляции у коров и телок-доноров позволяет получать стабильные результаты числа нормальных эмбрионов более 5 на донора. С использованием сконструированного катетера для извлечения эмбрионов у телок-доноров повышается извлекаемость эмбрионов более чем на 30%. Разработанные методические и технологические условия глубокого замораживания эмбрионов с криопротектором этиленгликоль снижают временные показатели замораживания и оттаивания эмбрионов, а также позволяют проводить пересадку эмбрионов в тех же пайэтак в условиях ферм, и« снижая процента их приживляемости. За разработку технологии трансплантации эмбрионов и внедрение в производство была присуждена премия Совета Министров СССР 30.11.1990 г.

1.5. Реализация результатов исследований. Полученные результаты использованы в 2-х инструкциях по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота и четырех методических рекомендациях ВИЖа, результаты исследований вошли в ежегодные и пятилетние отчеты отдела трансплантации и доложены на ученом Совете ВИЖа.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту.

Влияние различных факторов на результаты эмбриопродуктивн ости;

зависимость суперовуляции от гормональных и биохимических показателей крови у доноров разных пород; использование в качестве доноров телок случного возраста; влияние гормонального фона и биохимических показателей крови на приживляемость эмбрионов;

влияние крнопротсктора на жизнеспособность эмбрионов.

. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены на 11 международных, союзных, республиканских и зональных конференциях (Москва, Тарту, Львов, Харьков, Кирой, Петербург, Боровск, Ерест, Минск, 1989-2001 гг.).

1.8. Публикации. Научные результаты исследований опубликованы в 37 печатных работах, 2-х инструкциях и 4-х методических рекомендациях.

1.9. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 295 страницах, содержит 94 таблицы, 3 рисунка, состоит из введения, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждений, выводов и практических предложений.

Список литературы включает в себя 372 источника, из них 210 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Научные исследования проводили совместно с сотрудниками отдела трансплантации эмбрионов, отдела эндокринологии и лаборатории биохимии ВИЖа, а также в 1983-2000 гг. в хозяйствах Московской, Тульской, Волгоградской, Воронежской, Брестской, Волынской, Омской, Новосибирской, Херсонской, Витебской, Ярославской областях, Краснодарском крас иа коровах и телках черно-пестрой, красной степной, симментальской, швицкой, ярославской, айрширской породах. Продуктивность доноров составляла от 5 до 11 тысяч кг молока за лактацию.

В опытах использовали 1575 коров и телок-доноров, 4580 телок-рециписнтов, получено 7764 зародыша.

Гормональное вызывание суперовуляции проводили путем введения различных гонадотроиинов (ГСЖК, фоллигон, маретропин, сергон, ФСГ-п, ФСГ-е, фоллитропин) отечественного и зарубежного производства в сочетании с различными биологически активными препаратами, такие как сурфагон, фертагил, мнксоферон, ПДЭ, утеротоник, соматотропнн. Доза ГСЖК составляла 2.5 тысяч ед., ФСГ 50 и 32 мг.

Влияние повторных гормональных обработок на чувствительность яичников к гонадотропинам и устойчивость органов воспроизведения и многократному нехирургическому извлечению эмбрионов оценивали на 181 донорах. Животных обрабатывали ФСГ-п в дозе 50 мг по 4-х дневной схеме. После извлечения вводили простагландин в дозе 500 мкг, повторную гормональную обработку проводили не ранее, чем через 2 месяца после извлечения эмбрионов по мере нормализации яичников.

Осеменение доноров проводили ректоцервнкальным методом зачороженно-оттаяиной спермой, трехкратно при проявлении рефлекса неподвижности.

Для оценки стимулирующего действия гонадотропинов определяли число овуляций по наличию желтых тел н нсовулировапных фолликулов на 6-7 день после осеменения методом ректальной пальпации.

В экспериментах по нехирургическому извлечению эмбрионов применяли 2-х и 3-х канальные катетеры. Для извлечения эмбрионов у телок использовали катетеры фирмы «Рюш», «Минитуб» и катетер собственной конструкции. Учитывали проходимость катетера через шейку матки, объем введенной и удаленной жидкости и число извлеченных эмбрионов от числа овуляций.

Синхронизацию охоты у реципиентов проводили однократно и двукратно: анипростом, эстрофаном, эструматом, магэстрофаном. В качестве реципиентов отбирали в основном телок живой массой 360-350 кг и коров, не ранее чем через 2 месяца после отела. Пересадку проводили на 7-8 день астрального цикла при наличии на одном из яичников желтого тела.

Концентрацию гормонов в крови доноров и реципиентов определяли радиоиммунологнческим методом с использованием наборов «Стерон-П-125-

1», «Стерон-К-125-1», «Рио-Т-4-ПГ» института биоорганической химии и французских наборов «ЗВ-ЕЭТК» фирмы «Бопп ВютесИса».

Поиск эмбрионов и оценка качества проводили под инвертированным микроскопом МБС-9, Никон.

Рис. I

ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

Замораживали зародыши с использованием крио протекторов глицерин и этиленгликоль на программных замораживателях. В работе использовали общезоотехиические методы исследований, племенные записи, материалы зоотехнического и ветеринарного учета. Статистическую обработку проводили по Меркурьевой Е.К.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Вызывание суп«ровуляции у коров и телок-доноров.

Для использования в качестве доноров коров отбирали по следующим критериям: генетический потенциал, воспроизводительный статус, молочная продуктивность, возраст, состояние здоровья.

Важнейшим критерием отбора коров в качестве доноров эмбрионов является воспроизводительный статус.

После отела воспроизводительная система коров проходит восстановительный период, который продолжается до 90 дней, в зависимости от благополучия отела, продуктивности, возраста.

Уменьшение размеров матки до небеременного состояния, определяемого ректальной пальпацией, не может служить гарантией к готовности получения нормальных эмбрионов. Эмбриональная смертность у коров вызвана чаще всего неподготовленностью маточных структур к сосудистой системы матки, а также неподготовленностью антральных фолликулов вследствие преждевременных гормональных обработок после отела. Нами проведены исследования по определению влияния дня отела на уровень суперовуляции и выход нормальных эмбрионов (табл. 1).

Таблица 1

Влияние периода от отела до обработки доноров на уровень суперовуляции и

выход эмбрионов.

Показатель От 45 до 60 дней от отела Свыше 60 дней

Обработано животных 21 115

Реагировало суперовуляцией (п-%) 11-52.4 95-82.6

Количество овуляций на донора 7.8+/-0.7*** Ю.2+Л0.4***

Полож. доноров по извлечению эмб. (п-%) 7-63.6 77-81.0

Получе! [о эмбрионов всего 5.2+/-0.74* 7.0+/-0.3**

В том числе: нормальных 2.2+АО.З** 5.2+7-0.2**

д сгенерирован ных 1.8+АО.З 0.9+/-0.2

неоплодотворен ных яйцеклеток 1.2+/-0.2 0.9+/-0.1

** -р<0.01 *** -рО.ОО! Как показали результаты исследований, использование в качестве доноров коров после отела ранее 2-х месяцев нецелесообразно из-за низких

результатов суперовуляции. После двух месяцев после отела реагировало суперовуляцией на 30.2% больше коров, чем от 45 до 60 дней.

Превышение наблюдалось и по числу овуляций на донора и по выходу эмбрионов 7,8 - 10.2 и 5.2 и 7.0 соответственно.

Особенно растянута инволюция матки у высокопродуктивных коров, когда лактационная доминанта подавляет воспроизводительные функции.

Большинство сообщений о времени инволюции матки у коров основываются на ректальной пальпации. Однако, информации о размере и тонусе матки, полученной этим способом, недостаточно для определения степени восстановления эпителия эндометрия матки.

В практике трансплантации некоторые исследователи рекомендуют использовать в качестве доноров коров первотелок, наряду с коровами старшего возраста. Для выяснения возможности вызывания суперовуляции у коров разного возраста нами были проведены исследования, результаты которых приведены в таблице 2.

Результаты суперовуляции у первотелок были намного ниже. Реагировало суперовуляцией первотелок на 23.3% меньше, чем доноров старшего возраста. Уровень суперовуляции у первотелок был в 2,0 раза ниже, а выход эмбрионов в 3 раза, чем у коров старшего возраста. По-видимому, у первотелок после отела происходит перестройка организма на лактационную стадию, и лактационная доминанта подавляет воспроизводительные функции, поэтому инволюция матки и возобновление активности яичников после отела быстрее проходят у многотельных коров, чем у первотелок.

Таблица 2

Результаты гормональных обработок коров разного возраста.

Показатель Коровы

первотелки трех отелов

Обработано коров 15 18

Реагировало суперовуляциеи (п-%) 9-60.0 15-83.3

Количество овуляций на донора 5.6+/-1.3* 10.5+/-2.0**

Получено эмбрионов 2.8+/-0.8* 6.0+/-1.4«

В том числе: нормальных 1.6+/-0.6 4.8+/-0.8**

* -р<0.05 ** -р<0.01 С целью определения пригодности коров для гормональных обработок мы провели исследования ускоренной диагностики скрытых эндометритов по Ю.Н. Попову. Установлена прямая зависимость между рЬ маточной слизи у коров-доноров перед гормональной обработкой и качеством полученных эмбрионов. Лучшие результаты получены при рЬ в пределах 6.8-7.4, при уменьшении показателя рЬ или его увеличении число нормальных эмбрионов снижалось на 24.0 и 32,6% соответственно,

С целью подготовки необходимого числа животных в определенные сроки проводили синхронизацию охоты коров-доноров. Для этого использовали различные препараты и способы торможения фолликулогенеза с помощью прогестогенов и получили достаточно высокие результаты. Так, при

использовании имплантатов пропитанных норгестаметом в охоту пришло 96% коров. Однако, применение протесте генов трудоемко, Более доступным и простым способом синхронизации охоты коров-доноров является использование простагландннов. Для синхронизации охоты доноров применяли однократную и двукратную обработку простагландинами. При однократной обработке простагландин вводили коровам при наличии желтого тела у них на одном из яичников, а при двукратной - без учета дня цикла через 11-13 дней (табл. 3).

Таблица 3

Результаты синхронизации охоты доноров при однократной и двукратной

Показатель Однократная Двукратная

Обработано животных 96 127

Пришло в охоту 71 111

% от числа обработанных 73.9 87.4

В том числе (п-%) через 48 часов 58-81.8 85 - 76.6

через 72 часа 13-18.2 26-23.4

Не проявили признаков охоты (п-%) 25-26.1 16-12.6

При двукратной обработке первая инъекция вызывает лютеалнз только у животных с функционирующим желтым телом. Через 11-13 дней эти животные находились в той же стадии полового цикла, что и остальные в группе, которые в период обработки были на стадии проэструса, эструса и метэструса и не реагировали на обработку. Поэтому при второй инъекции простагландннами большинство животных имели функционирующие желтые тела и проявляли охоту через 48-72.

Синхронизация унифицирует время прихода животных в охоту, что дает возможность более точно подходить к определению срока для введения гонадотроп инов.

Дня определения активности синтетических простагландинов провели сравнительные исследования разных препаратов (табл.4).

Лучшие результаты были получены при использовании эструмата (89.7%). В этой группе 82.3% коров пришли в охоту через 48 часов после инъекции, что на 16.2% больше, чем в группе с акипростом. Наблюдается связь между числом коров пришедших в охоту чер«з 48 часов после инъекции простагландинов и числом коров пригодных для гормональной обработки.

Применение простагландинов ранее 9-го дня во всех случаях сопровождалось снижением процента прихода коров-доноров в охоту. При введении нростагландина на 9-й день эстрального цикла число животных

пришедших в охоту составило около 80%, на 8-й и 14-й день 69-64% соответственно.

Основную роль в механизме дютеолизиса играет снижение концентрации рецепторов в яичнике, просгагландин оказывается в роли лютеолитического агента и его концентрация зависит от уровня эстрогенов и прогестерона.

Таблица 4

Результаты синхронизации охоты у коров-донороа различными _простаглан ди нам и._

Препарат и доза

Показатель Эстрофан Эструмат Анипрост Магэстрофзн

2 мл 2 мл 4 мл 2 мл

Чехия интервет Россия Россия

Обработано животных 127 45 63 38

Пришло в охоту 111 39 47 32

% от числа обработанных 87.4 86.6 74.6 84.2

В т.ч. (п-%) через 48 час. 85 - 76.6 31-82.3 32-68.1 25-78.1

Через 72 час. 26-23.4 8-17.7 15-31.9 7-21.9

Не проявили признаков 16 -12.6 4- 13.4 16-25.4 6-15.8

охоты (п-%)

Отобрано (п-%) для 91-81.9 35 - 89.7 36-76.6 27 - 84.4

гормональной обработки

Высокая концентрация прогестерона способствует высвобождению эндогенного простагландина. В период полового цикла повышение уровня эстрогенов соответствует интенсивному росту фолликулов. Первый пик повышения уровня эстрогенов совпадает с днем начала охоты, второй — с середнной полового цикла. При втором подъеме уровня эстрогенов начинается секреция эстрока, что связано с регрессией желтого тела и ростом овуляторных фолликулов, такой механизм обуславливает благоприятные условия синхронизации охоты и последующей гормональной обработке. При обработке простагландинами раньше 9-го дня эстралыюго цикла рецепторы яичников значительно насыщены ЛГ, в этом случае образуется прочное соединение ЛГ с рецепторами и желтые тела оказываются нечувствительными к экзогенному просгагландину. При введении простагландина позже 13-го дня цикла снижение рецепторов обуславливается неполноценностью желтых тел, которые выделяют недостаточное количество прогестерона для сенсибилизации гипотадам нческих центров. Таким образом, синхронизация охоты у доноров позволяет не только готовить определенное число животных в нужные сроки, но в определенной степени прогнозирует способность животного положительно реагировать на гонадотропипы.

Большая вариабельность в реакции яичников и в числе нормальных эмбрионов, наблюдаемая после индуцирования полиовуляции разными

гоиадотропинами, обусловила проведение исследований различных вариантов обработок препаратами ГСЖК и ФСГ.

В наших исследованиях использовались по единой схеме 4 типа ГСЖК: фоллигон - производства Голландия, маретропин - Германия, сергон — Чехия, и российский ГСЖК Покровской биофабрики. Доза введения равнялась 2500 и.е. Препараты вводили на 9-11 день никла. По сравнению с другими днями цикла результаты снижались от 5 до 30%, как по числу овуляций, так и нормальных эмбрионов.

По количеству реагировавших животных превышение по всем препаратам было у фоллигона, но разброс по показателям был небольшой - от 2.8 до 11.0% (табл.5).

Главной особенностью ГСЖК является длительный период полураспада в крови донора, в среднем б суток. С одной стороны это хорошее качество, которое позволяет обходиться только одной инъекцией, а с другой стороны, в период охоты и осеменения доноров препарат продолжает действовать на рост фолликулов в яичниках, что отрицательно влияет на овуляцию и оплодотворение яйцеклеток. Для снятия пролонгированного действия ГСЖК была использована антисыворотка на ГСЖК от гипернммунизмроваиных коз, полученная в центре трансплантации.

Таблица 5

Уровень суперовуляцин и качество эмбрионов у доноров в зависимости от ГСЖК выпускаемых разными фирмами.

Показатель ГСЖК

Фоллигон Интервет Маретропи « ФРГ Сергон Чехия ГСЖК Россия

Обработано животных 68 45 32 38

Реагировало суперовуляцисй (п-%) 54 - 79.4 36 - 80.0 23-71.8 28-73.6

Положительных доноров по извлечению эмбрионов п-% 43-79.6 23 - 75.0 17-73.9 19-70.3

Среднее число овуляций 9.6+/-0.3 *** 10.4+7-0.3 9.8+7-0.4 *** 8.4+7-0.5 ***

Среднее число зародышей 6.9+/- 0.3 6.2+/-0.5 5.9+А0.2 6.1+7-0.2

В том числе: нормальных 3.7+/-0.2 *** 3.6+/-0.2 *** 3.4+/-0.2 3.2+/-0.3 ***

дегенерн ровэн ных 1.4+7-0.1 1.0 0.8 1.3

неоплодотворенных яйцеклеток 1.8+7-0.2 1.6 1.7 1.6

*** - р<0.001

Была определена оптимальная доза и срок введения антисыворотки. Оптимальная доза составила 1.5 мл, при введении донорам перед вторым осеменением. От доноров, которым перед вторым осеменением вводилась

антисыворотка, выход общего числа эмбрионов был выше на 18%, а по выходу нормальных эмбрионов преимущество составило 62.2%.

Многие исследователи определили зависимость активности яичников коров разных пород от обработки гоиадогропином ГСЖК. По данным Кысы И.С. (2000) эмбрионы мясных пород имеют более высокую активность яичников, чем молочные коровы. Разные результаты наблюдаются и среди пород одного направления продуктивности.

Проведенные нами исследования по определению активности яичников на обработку ГСЖК коров молочных пород черно-пестрой, айрширской, красной степной, ярославской и комбинированной породы - симментальской, показали, что хуже реагировали коровы ярославской породы (табл. б).

Суперовуляторная реакция яичников у доноров черно-пестрой породы, айрширской, симментальской и красной степной различалась только на 3.26.4%.

Процент оплодотворяемое™ яйцеклеток был ниже у черно-пестрой породы и составил 77.0%, у айрширской - 80.4%, симментальской - 79.3%, красной степной - 86.9%, у ярославской - 82.3%. По выходу нормальных эмбрионов преимущество было у красной степной породы и составило 4.1 эмбриона. Л более низкий показатель 2.8 эмбриона был у допоров ярославской породы.

Таблица 6

Результаты обработок доноров разных пород ГСЖК в дозе 2500 и.е.

Порода

Показатель черно- айршир симмен- красная ярослав-

пестрая екая тальская степная ская

Обработано 58 12 14 27 18

доноров

Реагировало 45-78.9 9 - 75.0 11 - 78.5 22-81.5 12 - 66.6

суперовуляцией (п-%)

Количество 10.4+/-и 9.1+/-1.6 8.7+/-1.8 .10.1+М.4 8.6+/-1.5

овуляций на донора *** ** *** **

Положительных по 39 - 67.2 8-66.7 9-64.2 17-62.9 11-61.1

извлечению (п-%)

Получено 6.1+/-1.2 5.1+/-1.5 5.8+/-1.4 6.1+/-1.2 5.1+/-1.6

эмбрионов всего *** * * ** *

В т.ч. нормальных 3.8 3.3 4.0 4.1 2.8

дегенерировали ых 0.9 0.8 0.6 1.2 1.4

и со плодотворен ных 1.4 1.0 1.2 0.8 0.9

яйцеклеток

*-р<0.05 ** - р<0.01 *** -р<0.001 В наших исследованиях были проведены испытания разных схем и доз ФСГ, которые показали, что оптимальной дозой ФСГ для суперовуляпии является доза 50 мг ФСГ по стандарту Армора. Прн обработках доноров в

[

основном применяли усовершенствованную схему введения ФСГ. Проведены также сравнительные исследования действия сывороточных и гнпофизарных гонадотропинов. Достоверное превышение показателей по числу овуляций и выходу нормальных эмбрионов при обработках ФСГ над ГСЖК составило 12.1 и 25.9% соответственно. После обработок коров-доноров ГСЖК восстановительный период яичников после извлечения был больше на 23,5 дня, чем после инъекции ФСГ.

Проведенный анализ экспериментальных данных вызывания суперовуляции у коров-доноров разными гипофизарными препаратами показал, что ФСГ-п американского производства и ФСГ-супер отечественного производства не имеют достоверных различий по общему числу (6.7 и 6.9), и выходу нормальных эмбрионов (5.0 и 5.2).

Были также проведены исследования по определению влияния гормональных обработок ФСГ на коров разных пород (табл. 7).

Таблица 7

Уровень еунеровуляцин при обработках ФСГ в зависимости от породы коров-

доноров

Порода

Показатель Черно- Айрширс- Симмен- Красная Ярослав-

пестрая кая тальская степная ская

Обработано 66 15 31 28 25

доноров

Реагировало 52-78.7 11-73.8 23-74.2 21-75.0 19-76.0

супер-ей (п-%)

Число овуляций 11.2+/-1.2 10.1+М.5 9.2+/-1.2 10.8+/-1.6 9.7+/-1.4

на донора *** ** ** *+

Получено эмб. 7.2+/-1.0 5.8+/-1.2 5.9+/-1.0 7.9+М.З 6.0+-/-1.2

на донора ** *+ **

В том числе 5.1 3.9 4.1 5.3 3.8

нормальных

% от общего ч. 70.8 67.2 69.5 67.1 63.3

дегенерировал. 1.0 1.2 0.8 1.2 1.6

% 13.9 20.6 13.5 15.2 26.7

Неоплодотворен, яйцеклеток 1.1 0.7 1.0 1.4 0.6

% 14.3 12.2 17.0 17.7 10.0

***-р<0.001 **-р<0.01

Установлено, что 73.3-78.7% доноров от числа обработанных реагировали суперовуляцией. По общему числу эмбрионов от донора отмечено преимущество красной степной породы, Превышение было по сравнению с черно-пестрой, айрширской, симментальской, ярославской породами на 8.9; 26.6; 35.3; 24.1% соответственно. Примерно такое же соотношение было и в числе качественных эмбрионов иа донора (4.8; 26.5; 22.7; 28.3%). Процент

нормальных эмбрионов от числа овуляций по донорам всех пород составлял 63.3-70.9%. Оплодотворяемость яйцеклеток по группам колебалась от 82.3 до 90.0%.

Таким образом, по уровню суперовуляции особых преимуществ между породами не было выявлено. Но выходу эмбрионов черно-пестрая и красная степная имели преимущество перед ярославской и айрширской породами.

Нами проведены испытания препарата ФСГ-п с добавлением разных доз ЛГ французского производства. Добавления 1.575 мг ЛГ в ФСГ оказалось не эффективным. Удовлетворительные результаты были получены при добавлении 0.525 и 1.05 мг ЛГ, Но достоверной разницы не было между контрольной и опытными группами по общему числу эмбрионов.

В последующих опытах было изучено влияние отечественного релизинг гормона сурфагон и препарата фертагил производства интервет. Эти препараты вводили в дозе 2 мл внутримышечно, результаты приведены в таблице 8. По числу реагирующих на гормональную обработку между контрольной и опытными группами разницы не было (78,1-73,3%). 11о выходу общего числа и качественных эмбрионов на донора превышение наблюдалось при использовании сурфагон а и фертагнла на 5.2 и 9.6 и 9,6 и 19,2% соответственно.

При этом в опытных группах снизилось число неоплодотворенных яйцеклеток на 10,5 и 10.6%.

Таблица 8

Результаты суперовуляции у коров-доноров при инъекции ФСГ

Показатель Гормоны

ФСГ ФСГ + Фертагил ФСГ + Сурфагон

Обработано коров 38 32 30

Реагировало суперовуляцией (п-%) 29-76.3 23-78.1 22-73.3

Число овуляций на донора 10.9+/-1.2** 11.8+/-1.7** 10.7+/-1.4**

Положительных доноров по Извлечению (п-%) 22 - 75.9 18-78.2 17-76.7

Число зародышей на донора 7.0+/-0.6** 7.3+/-0.7** 6.5+/-0.7**

В том числе: нормальных 4.2+/-0.4** 5.2+/-0.7** 4.7+/-0.6**

дегенерированиых 1.2 1.2 1.0

неоплодотворенных яйцеклеток 1.3 0.7 0.8

**-р<0.01

Таким образом, применение релизинг гормонов сурфагона и фертагила повысило выход эмбрионов за счет улучшения показателей овуляции и повышения оплодотворяемости яйцеклеток.

Основной причиной высокой вариабельности реакции суперовуляцин является большое разнообразие популяций антральных фолликулов в яичниках коров-доноров на момент начала стимуляции их экзогенными гормонами. Была

предпринята попытка регулирования численного н качественного состава популяции антральных фолликулов.

Предварительно, на 3-Й день цикла одной группе коров вводили по 10 мг ФСГ, другой - по 300 ед. фоллитропина, что составляло 5 и 4 часть от полной дозы, затем животных обработали полной дозой ФСГ по общепринятой схеме.

Результаты показали, что предварительная стимуляция доноров на 3-Й день цикла повышает число овуляций на донора на 18.0 и 16.7% по сравнению с контрольными животными. По общему количеству и числу качественных эмбрионов па донора превышение составляло 18,1 и 13.9%; 21,0 и 20,3% соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии предварительной обработки небольшими дозами ФСГ на 3-й день цикла на рост антральных фолликулов.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что соматотроппый гормон (соматотропин) выполняет важную роль в осуществлении контроля гипофиза за функцией яичников (Кузьмина Т.Н., 1998). Было также доказано, что при созревании ооцит-кумулюсных комплексов in vitro соматотропин стимулирует потенциал клеток к дальнейшему развитию до стадии морулы к бластоцисты, что указывает на возможность использования этого препарата при гормональных обработках коров-доноров.

Для изучения действия соматотропина на эффективность гормональных обработок были отобраны 3 группы доноров. Первая группа была контрольной, коровам второй группы на 2-й день цикла вводили внутримышечно бычий соматотропин в дозе 640 мг, производства «Monsanto» США. Животным третьей группы инъецировали соматотропин на 7-й день цикла перед гормональными обработками (табл. 9).

Таблица 9

Результаты использования соматотропина в разные дни цикла _до гормональной обработки_

Показатель Группы

Контрольная 1 2

Обработано животных 10 10 10

Реагировало супсровуляцней (п-%) 9 10 10

Число овуляций на донора 10.6+/-1.8 12.9+/-1.8 11.3+/-1.6 *4

Получено эмбрионов всего 6.5+М.4* 8.6+/-1.3** 7.3+/-1.5*

В том числе: нормальных 5.2+/-0.9 ** 7.3+/-0.9 ** 6.0+/-1.0

дегенерированных 0.7 0.9 0.6

неоплодотворен пых яйцеклеток 0.6 0.4 0.7

* -р<0,05 -р<0.01 Приведенные данные показывают, что самые эффективные результаты получены по второй группе, при введении донорам соматотропина на 2-ой день цикла, перед гормональной обработкой. По числу овуляций эта группа

превосходила контрольную и 2-ую опытную на 18.1 и 13.5%, по общему выходу эмбрионов на донора па 24.5 и 15.2%, нормальных эмбрионов на 28.8 и 17.2% по сравнению с другими группами. Дегенерация эмбрионов и оплодотворяемость яйцеклеток была примерно на одном уровне.

Результаты исследований показывают, что соматотроппый гормон стимулирует развитие яйцеклеток, и, видимо, клетки гранулсзы более чувствительны к соматотропину иа ранних стадиях фолликулогенсза. Поэтому, используя действие соматотропина, появляется возможность регуляции фолликулогенеза и совершенствование степени гормонального влияния на эмбриопродуктивность доноров. Кроме того, под влиянием экзогенного соматотропина происходят изменения в обмене вешсств: снижается депонирование энергетических и пластических субстратов, повышается их использование в фолликулогенезе.

Необходимость максимального использования биологического потенциала животных-доноров стимулирует поиск нестандартных решений для повышения выхода качественных эмбрионов. Для нормализации обменных процессов и профилактики вирусных инфекций был использован миксоферон -препарат, состоящий из смеси белков лейкоцитарного интерферона, полученный методом микробиологического синтеза.

Коровам донорам миксоферон вводили дважды в дозе I млн. ед. с интервалом 24 часа перед началом гормональных обработок (табл. 10).

Таблица 10

Стимуляция полиовуляции у коров-доноров препаратом супер-ФСГ

в сочетании с миксофероном и простагландииом

Показатель Группа

Контрольная (суиер-ФСГ) Опытная (супер-ФСГ + миксоферон)

Обработано коров - 27 24

Реагировало суперовуллиней (п-%) 21 - 77.8 20-83.5

Число овуляций на донора 10.4+/-1.5** 11.2+/-1.3**

Положительных доноров по извлечению эмбрионов (п-%) 16-76.2 18-85.7

Получено эмбрионов на донора 6.5+/-1.3** 7.3+/-1.0**

% от числа овуляций 62.5 65.2

В том числе: нормальных 4.5+/-0.7** 5.9+/-0.5***

дегс н ери рован н ых 1.1 0.8

неоплодотворенных яйцеклеток 0.9 0.6

% оплодотворяем ости яйцеклеток 85.5 91.2

**-р<0.01 ***-р<0.001

При использовании миксоферона заметно улучшились показатели полиовуляций: число реагировавших коров увеличилось на 9.7%, овуляций - на 7.2%. По сравнению с контролем, увеличилось общее число эмбрионов па

11.0%, и качественных эмбрионов на 23.7% (4,5 против 5.9). Увеличение выхода нормальных эмбрионов произошло за счет снижения дегенерации эмбрионов и повышения оплодотворяемости яйцеклеток. Особую проблему представляют животные со скрытыми формами эндометрита, имеющие небольшие очагн поражения слизистой оболочки рогов матки. Точная диагностика таких форм возможна только при гистологических исследованиях. По этой причине, при гормональных обработках от таких коров-доноров недополучают качественные эмбрионы вследствие их дегенерации.

Такие негативные явления могут происходить у 15-20% доноров, хотя всех коров санируют антибиотиками и сульфаниламидными препаратами с профилактической целью перед обработками. Одним из самых важных и неустраненных недостатков, присущих веем препаратам этих групп, это образование к ним устойчивых форм микробов. Поэтому, для профилактики и с лечебной целью, кроме санации (ГАМП), использовали польский препарат утсротоник, активным веществом в нем является хлоргндрат пропаполол, который оказывает лечебный эффект на воспалительные процессы в матке.

Препарат инъецировали двукратно в дозе 10 мл внутримышечно. В первый раз его вводили коровам-донорам перед началом гормональных обработок, повторно - за 30 минут до извлечения эмбрионов. Повторное введение утеротоника проводили для ограничения действия стрессовых факторов при нехирургнчсском извлечении эмбрионов (табл. 11).

Таблица 11

Эффективность применения супер-ФСГ и утеротоника при стимуляции

полиовуляции у коров-доноров

Показатель Группа

Контрольная ФСГ Опытная ФСГ+утерото ник

Обработано коров 25 22

Реагировало суперовуляцией (п-%) 19-76.0 16-81.8

Количество овуляций на донора 10.6+М.8** 11.3+/-1.8**

Положительных доноров по Извлечению (п-%) 13-68.4 15-83.3

Получено эмбрионов на донора 7.2+/-1.3** 8.6+/-1.2**

Процент от числа овуляций 67.9 77.8

В том числе: нормальных 4.9+/-0.8** 6.9+/-0.7**

дегенерированных 1.2 0.9

неоплод отворенных яйцеклеток 1.0 0.8

% оплодотворяемости яйцеклеток 84.7 90.7

**-р<0.01

Механизм действия основывается на том, что тормозящее действие адреналина на моторику матки у коров, освобожденного в значительном количестве из мозговой части надпочечников во время действия стрессовых факторов, осуществляется посредством р-адреноэргичееких рецепторов,

находящихся в мышечном слое матки (Раулушкевич С„ 1989). Возбудимость адреноэргнческих рецепторов обусловлена уровнем прогестерона в крови. При повышении концентрации прогестерона снижается динамика сокращений матки. Пропранодол, входящий в состав утерстоника, блокирует (5-адренгаргическис рецепторы.

Применение уте ротон и ка перед гормональной стимуляцией коров-доноров увеличило число коров, реагирующих на гонадотропины на 5.8% (76 против 81.8%). Существенно увеличилось число коров положительных по извлечению эмбрионов на 14.9% (68.4 против 83.3%), а также заметно увеличился общий выход эмбрионов (8.6 против 7,2) и число нормальных эмбрионов (6.9 против 4.9). Снизилось число дегенерированных эмбрионов (0.9 против 1.2) и увеличился процент оплодотворяемости яйцеклеток на 6.0%.

Таким образом, включение препарата утеротоник и миксоферои в общую схему гормональной стимуляции полиовуляции у коров-доноров повышает фолликулогенез и оплодотворяемость яйцеклеток, увеличивает число нормальных эмбрионов на 29.0%.

Кроме утсротоника, в наших исследованиях использовали ПДЭ, тканевый препарат, изготовленный из плаценты, в которой содержатся гормоны и биологически активные вещества, повышающие резистентность организма н нормализующие матку, оказывая лечебный эффект.

Перед гормональной обработкой коровам вводили двукратно, в дозе 20 мл, с интервалом 10 дней.

У доноров, обработанных ПДЭ, повысился выход качественных эмбрионов на 24.6% за счет снижения дегенерированных эмбрионов и увеличения процента оплодотворяемости яйцеклеток.

Эффективность сунеровуляторных обработок во многом зависит от гормонального статуса донора перед началом обработок. Поэтому определение состояния эндокринной функции яичников по концентрации гормонов в крови, возможно, позволит прогнозировать уровень суперовуляции у доноров. По содержанию гормонов в крови можно определить на какой стадии цикла находится животное.

Исходя их этого, нами проведены исследования по определению гормонального фона в периферической крови коров в разные функциональные стадии. Определена концентрация прогестерона, эстрад иола, тироксина, кортизола и тестостерона в стадии охоты и на 10-й день цикла перед гормональной обработкой (табл.12).

На 10-й день цикла наблюдалось увеличение концентрации прогестерона от 0.05 до 2.91 иг/мл, и снижение эстрадиола с 26.1 до 17.0 пк/мл, уровень содержания кортизола увеличился перед обработкой на 12.2%,

Нами изучена связь качества желтого тела с концентрацией прогестерона в крови доноров перед гормональной обработкой.

Качество желтых тел определяли визуально, ректальной пальпацией яичников н разделили на 3 класса: удовлетворительные - размеры менее 0,5 см; хорошие-от 0.5 до 0.8 см; отличные-0,8-1.2 см. При исследованиях выявлена

прямая зависимость между концентрацией прогестерона к качеством желтого тела. Самые высокие показатели суперовуляции получены при отличном желтом теле с концентрацией прогестерона свыше 2.5 кг/мл - 11,1 овуляций и 8.5 эмбриона. При снижении концентрации прогестерона до 1.0-2.5 нг/мл показатели снизились на 24.5%, а при концентрации до 1.0 нг/мл снизились на 37.7%.

Таблица 12

Гормональный фон в крови доноров перед гормональной обработкой _ ___ на 10-й день цикла___

№ Концентрация

животных Прогестерон нг/мл Эстрадиол пг/мл Кортнзол нг/мл Тироксин нг/мл Тестостерон нг/мл

2168 3.75 12.4 0.81 36.7 0.04

3269 3.43 17.9 1.42 50.5 0.08

2080 5.22 13.9 2.19 51,1 0.11

377 1.59 8.6 3.84 41.5 0.06

1324 2.43 27.4 2.88 37.4 0.06

4434 3.22 15.2 1.56 29.4 0.03

5026 2.07 22.5 2.11 31.4 0.08

1448 2.74 20.1 2.51 46.3 0.06

7312 3.13 13.8 1.79 43.1 0.05

6011 1.42 32.9 3.06 27.2 0.07

М+/-т 2.91+/-0.7 17.0+/-3.1 2.21+/-0.8 39.6+/-5.7 0.06+/-0.01

* ** * **

*-р<0,05 **-р<0.01

Мы также провели сравнительные исследования гормонального фона в крови перед обработкой гонадотропинами у коров-доноров после спонтанной И синхронизированной охоты. Животных отбирали с хорошо выраженной охотой, с выявленным рефлексом неподвижности. Результаты исследований представлены в таблице 13.

Таблица 13

Гормональный фон в крови коров-доноров перед обработкой с

синхронизированной и спонтанной охотой.

Показатель Единицы измерения Доноры

Спонтанная п=14 Синхронизиров. п=19

Прогестерон нг/мл 2.60 3.19

Эстрадиат иг/мл 16.7 14.9

Кортизон нг/мл 3.25 3.85

Тироксин нг/мл 34.64 38.18

Тестостерон нг/мл 0.067 0.066

По уровню прогестерона у доноров с синхронизированной охотой превышение было на 15% над донорами со спонтанной охотой, а по содержанию эсг радиола в крови показатели были выше на 10.8% у доноров со спонтанной охотой, что, по-видимому, связано с более низкой концентрацией прогестерона. Уровень тироксина и кортнзола в крови был выше у доноров с синхронизированной охотой на 15.6% и 9.3% соответственно, концентрация тестостерона была одинаковой.

Проведено определение влияния концентрации в крови прогестерона у коров разных пород перед гормональной обработкой (табл. 14).

Полученные результаты показывают, что уровень прогестерона в крови был выше у доноров черно-пестрой породы - 2.41 нг/мл, у симментальской -2.39 нг/мл, у красной степной-2.27 нг/мл. Ниже концентрация была у доноров ярославской и айрширской породы- 2.04 и 2.01 соответственно.

По количеству полученных эмбрионов показатель у доноров ярославской породы был ниже на 21,4% по сравнению с черно-пестрой, иа 24,5%, чем у краской степной, на 11.5%, чем у симментальской и на 8.8%, чем у айрширской породы. Процент выхода нормальных эмбрионов варьировал от 71.4 до 79.7%.

Таблица 14

Результаты стимуляции полиовуляции доноров разных пород н связь _эмбриопродуктивностн с концентрацией прогестерона_

Порода

Показатель Черно Симмен- Анршир- Красная Ярослав-

пестрая тальская ская степная ская

Обработано коров 10 10 10 10 10

Концентрация 2.41 2.39 2.01 2.27 2.04

прогестерона, нг/мл

Реагировало суперовул. 10 9 10 9 9

% от числа обработан. 100 90 100 90 90

Число овул. на донора 10.3 9.6 10.1 11.2 9.2

Число эмбр. на донора 7.9 7.0 6.8 8.1 6.2

В т.ч.: нормальных 6.3 5.0 5.1 5.9 4.7

% от общего числа 79.7 71.4 75.0 72.8 75.8

Таким образом, при исследовании концентрации прогестерона в крови доноров разных пород не обнаружили достоверной разницы в показателях по числу овуляций и выходу эмбрионов.

Исследуя гормональные профили коров-доноров в разные периоды года, в декабре и апреле, установили, что содержание прогестерона в крови в зимний период у доноров с высокой степенью овуляции был на 14,1% больше по сравнению с весенним периодом. По другим гормонам показатели были примерно равны.

Проведенные исследования позволяют сделать выводы, что определение концентрации гормонов в крови доноров дает возможность правильно оценить овариальную активность яичников. По гормональным показателям появилась

возможность прогнозировать способность доноров к проявлению суперовуляторной реакции. Но исследования гормонального фона не отражают объективного физиологического состояния животных, более точная оценка определяется по состоянию обмена веществ.

В связи с этим, нами проведены исследования по изучению влияния обмена веществ на уровень суперовуляции и качество эмбрионов у высокопродуктивных коров-доноров. Одним из условий полноценности кормления и состояния обмена веществ служит контроль биохимических показателей крови.

Перед началом гормональных обработок был проведен анализ раниона и химического состава кормов. Параллельно были проведены биохимические исследования крови по 29 показателям на анализаторе «Бекман».

Исследования показали, что у доноров с высокой степенью овуляции от 9 до 22, наблюдалось превышение по сравнению со слабо реагирующими коровами по следующим показателям: по каротину в 2 раза, по витамину «Л» на 8.2%, но общему белку на 20.3%, по АЛТ - на 14,7%, по креатин киназе на 33.3% (табл. 15).

Таблица 15

Биохимические показатели крови доноров в стойловый период перся

гормональной обработкой.

Показатель Единицы измерения 1 -4 овуляций 5-20 овуляций

Каротин мг % 0.173 0.349

Витамин «А» мг% 0.112 0.204

Общий белок г% 6.4 7.7

АЛТ и.е. 19.7 23.6

Холестерин мг % 109.8 121.4

Фосфолипиды мг% 141.2 157.6

Глобулины: а мг % 0,73 0.85

Р мг% 0.91 0.97

У мг % 1.79 1.94

Креатин киназе и.е. 15.0 22.0

Трнглицериды и.е. 87.2 115.2

Выявлена достоверная разница между содержанием в крови каротина н витамина «А» и количеством овуляций. Повышенная активность креатинкиказы, как простагландипзависимого фермента, также влияет на эмбриопродуктивность доноров. У доноров с высокой степенью овуляции уровень а и Р глобулинов был выше на 14.1 и 6,2% соответственно. У них на 10.1% больше содержалось холестерина, на 7.3% фосфолипидов. У коров с низким числом овуляцнй (от 1 до 4) десять биохимических показателей из 29 были достоверно ниже (р<0.05), чем в группе доноров с высоким уровнем овуляций. Поэтому биохимические показатели крови коров-доноров наряду с

известными способами прогнозирования суперовуляции могут быть использованы для оценки предрасположенности и пригодности коров для трансплантации.

При интенсификации молочного скотоводства возрастает уровень выбраковки коров, достигающий до 25-30% в год. В число выбракованных животных неизбежно попадают высокоценные в генетическом отношении коровы. Наряду с использованием здоровых лактирующих коров, через 2-3 месяца после отела используются в качестве доноров и высокоценные выбракованные коровы.

Выявление из числа выбракованных высокопродуктивных коров, реагирующих на гормональные обработки и способных выделять биологически полноценные эмбрионы, позволяет иметь дополнительный источник эмбрионов для формирования генофонда.

Особенно большое значение имеет выявление среди этих животных коров, способных многократно реагировать суперовуляцией на инъекции гонадотропинов.

Исследования по многократному использованию коров в качестве доноров эмбрионов проводились в 15 племенных хозяйствах разных регионов страны, И в экономическом, и селекционном плане наиболее выгодно использовать коров в качестве доноров несколько раз в год.

Для определения влияния многократных обработок и нехирургического извлечения эмбрионов на воспроизводительную способность доноров были проведены следующие исследования (табл. 16).

Из таблицы 16, видно, что с увеличением кратности гормональных обработок повышается число коров реагирующих полиовуляцией с 72.3% до 85-100%. У некоторых коров-доноров число эмбрионов снижалось с каждой последующей обработкой.

Предполагается, что у некоторых доноров повторные гормональные обработки истощают резервы первичных фолликулов, то есть уменьшается число фолликулов, чувствительных к гонааотронину, н это приводит к уменьшению суперовуляторной реакции.

Мы проанализировали причины выбытия коров из группы доноров многократного использования и установили, что выбраковка происходит из-за отсутствия реакции - 18.2%, отсутствия нормальных эмбрионов - 15.5% н по состоянию здоровья - 8.3% (табл. 16).

Одной из главных причин выбраковки является сокращение интервала между обработками. Сокращение интервала до 35-50 дней снижаю показатели суперовуляции более чем в 2 раза, а при последующих обработках этих доноров результаты резко снижались, и коровы выбраковывались из групп доноров. Оптимальный интервал между обработками составил 60-70 дней при нормализации яичников после предыдущего извлечения.

Выдающиеся доноры с высокой эмбриопродуктивиостью встречались во всех используемых породах. Этих коров использовали в качестве доноров 4-5 раз в течение года и от них получено по 30-50 качественных эмбрионов.

Таблица 16

Результаты суперовуляции и число эмбрионов у коров-доноров при

многократной обработке ФСГ

Крат- Кол-во Реагировало Овуляций Получено

ность жив-х суперовуляцией на эмбрионов

донора

1 181 140 72.3 8.1+/-0.5 6.6

2 105 90 85.7 8.6+/-0.6 6.4

3 77 62 80.5 9.7+/-0.8 7.3

4 53 47 88.7 9.4+/-0.6 7,8

5 43 38 88.4 9.6+/-1.0 7.8

6 31 29 93.5 8.6+/-0.9 6.3

7 25 25 100 10.4+/-1.1 9.0

8 18 15 83.3 8.9+/-1.5 8.5

9 14 13 92.9 10.5+/-1.9 7.6

10 13 12 92.3 9.7+А2.2 6.7

11 11 10 90.9 8.8+/-1.8 8.1

12 10 9 90.0 10.2+/-1.8 7.9

13 9 7 77.8 8.4+/-1.2 6.8

14 6 6 100 9.2+/-1.8 6.2

15 6 5 83.4 9.3+/-0.9 6.0

Попытки использовать более молодых телок не привели к желаемому успеху. При использовании в качестве доноров неполовозрелых телок получали в основном дегенерированные эмбрионы, а качественные эмбрионы плохо приживлялись у реципиентов. Исходя из этого опыта, в наших исследованиях использовали половозрелых телок с установившимся астральным циклом с жнвой массой 380-400 кг. Проблема, с которой мы столкнулись при нехирургическом извлечении эмбрионов, заключалась в трудности проведения катетера через цервикальный канал матки. Использование расширителей приводило к травмам канала шейки матки. Использование маточных релаксантов улучшало проходимость, но процент был небольшим. И только применение нового катетера для извлечения эмбрионов у телок нашей конструкции, повысило проходимость до 90-95%.

Для опыта было отобрано 17 телок в возрасте 16-18 месяцев с живой массой 380 кг. Продуктивность матерей составляла 7 тыс. кг и более за лактацию. При отборе телок для обработки определяли концентрацию прогестерона в крови и при ее низком уровне (ниже 1.5 иг/мл) не обрабатывали.

Из 17 телок все 100% проявили реакцию полиовуляции, среднее число овуляций составило 12.3+/-2.3 на донора, но положительных по извлечению телок-доноров было 16 или 94.1%. У одной телки не удалось пройти катетером

канал шейки матки. В среднем на донора получили 8.6 эмбриона, из них 5.8 качественных, которые впоследствии были пересажены реципиентам или заморожены. Из общего числа эмбрионов дегенерованных было 24.4%, а качественных эмбрионов было получено 67,4%, неоплодотворекных яйцеклеток 8.25%. Таким образом, применение ФСГ в дозе 32 мг по четырехдневной схеме обработки позволило получить от телок-доноров достаточное количество качественных эмбрионов.

Были проведены исследования по определению возможности многократного использования телок в качестве допоров эмбрнонов. Прн повторной гормональной обработке телки-доноры проявили реакцию супсровуляции в 2 раза ниже, чем прн первой обработке, а при третьей обработке реакция сунеровуляции еще понизилась. По количеству полученных эмбрионов также наблюдалось резкое снижение показателей при повторных обработках. Поэтому целесообразно использовать в качестве доноров телок случного возраста однократно, а затем после извлечения эмбрионов их необходимо плодотворно осеменить.

3.2. Извлечение н оценка качества эмбрионов.

Одним из важнейших звеньев в технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является извлечение эмбрионов у доноров.

В центре трансплантации ВИЖа применялись хирургические и нехирургические метода извлечения эмбрионов. Для нехирургического извлечения использовались 2-х и 3-х канальные катетеры отечественного и зарубежного производства.

Решающее влияние на эффективность вымывания эмбрионов оказывали владение техникой правильного введения катетера в рог матки и умение применять специальные приемы манипулирования с рогами матки во время промывания. При сравнении эффективности извлечения эмбрионов 2-х и 3-х канальными катетерами, установили, что проходимость 3-х канального катетера была хуже на 7.2%, потери промывной жидкости были выше на 18.8%. По числу эмбрионов, полученных от донора за одно извлечение, превосходство двух канального катетера составило 14.2%.

При использовании трехкапальных и двухканальных катетеров у коров-доноров встречалась непроходимость от 5 до 12%. При использовании в качестве доноров телок случного возраста процент непроходимости возрастал до 25-45%.

Для повышения проходимости канала шейки матки нами было сконструировано устройство для извлечения эмбрионов из матки телок-доноров и коров-доноров с трудной проходимостью, и получен патент па изобретение № 2041706 от 28,04.92 г. «Катетер двухканальный, цельнометаллический, диаметром 4 мм». Преимуществом катетера является простота применения. Непроходимость возникала только прн патологических спайках канала шейки матки.

Результаты нехирургнческого извлечения катетером нашей конструкции в сравнении с результатами извлечения резиновым катетером приведены в таблице 17.

Из таблицы 17 видно, что положительных доноров по извлечению в первой группе было больше на 34.1% из-за лучшей проходимости шейки матки. При сравнительно одинаковой реакции суперовуляции (12.3+/-1.8 и 11.8+/-2.1) от доноров первой группы получено качественных зародышей 93, а от второй группы только 36, то есть почти в 2.5 раза больше. Получено на одного донора в первой группе на 29.1% больше эмбрионов, чем во второй.

При извлечении эмбрионов у телок-доноров катетером нашей конструкции из 17 оперированных животных непроходимость наблюдалась только у одной телки, а при извлечении эмбрионов резиновым катетером у 4 телок не смогли пройти канал шейки матки и у двух телок-доноров после трудного прохождения капала в промывной жидкости обнаружена кровь.

Промывную жидкость при извлечении эмбрионов пропускали через эмбриональный фильтр или отстаивали в течение 20 минут и сливали верхнюю часть жидкости, оставляя 80-90 мл, и в этом объеме вели поиск эмбрионов под увеличением в 80 раз. Обнаруженные зародыши переносили в стерильную среду ФСБ с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка и проводили оценку' под 80-100 кратным увеличением.

Таблица 17

Результаты извлечения эмбрионов у телок-доноров катетерами разной _конструкции_

Катетер

Показатель Металлический Резиновый

2-х канальный 2-х канальный

(ВИЖ) (Германия)

Обработано телок 17 15

Реагировало суперовуляцией 17 15

Число овуляций на донора 12.3+/-1.8 П.8+/-2.1

Оперировано животных 17 15

Положит, доноров по извлечению 16-94.1 9-60.0

Число зародышей на донора 8.6+/-1.2 6.1+/-14

В том числе: нормальных 5.8+/-1.5 4.0

дегенериро ванных 2.1 1.4

неоплод отворенных яйцеклеток 0.6 1.0

Получено всего качественных эмб. 93 36

Качество эмбрионов оценивали на основании определения их стадий развития, состояния оболочек и внутренних структур. При оценке эмбрионов необходимо соблюдать оптимальные условия существования эмбрионов от извлечения до пересадки реципиентам. В этом плане наиболее важна физиологическая среда и температура. В практической работе использовали для

непродолжительного хранения фосфатно-буферную среду (ФСБ) с добавлением фетальноя сыворотки теленка.

Оценку жизнеспособности эмбрионов проводили на основании морфологических признаков. По морфологическим признакам определяли 4 стадии развития. Вое эмбрионы, пригодные для пересадки были в возрасте 6.5-8 дней и находились на стадии ранней морулы (Мо I), поздней морулы (Мо 2), ранней бластоцисгы {Бл 1) и поздней бластоцнсты (Бл 2). В зависимости от качества они подразделялись на отличные, хорошие, удовлетворительные и плохие.

Изучая развитие эмбрионов, в зависимости от срока после осеменения установили, что на 7-й день от доноров получали 22.8% поздних морул и 69.9% ранних бласгоцнст, 3.0% ранних морул, 43% поздних бластоцист.

Из общего количества 7764 эмбрионов при оценке их качества отнесено к нормальным — 5388 эмбрионов или 70.2%, 2376 эмбрионов оценены как неоплодотворенные яйцеклетки и дегенерированные эмбрионы (29.8%).

Проведены исследования по определению влияния вида гонадотропинов на развитие к качество эмбрионов у коров-доноров на 7-й день после извлечения (табл. 18).

При сравнении результатов оценки качества эмбрионов установили, что при обработке коров-доноров ФСГ выход эмбрионов отличного качества был выше на 9.1%, чем при обработках ГСЖК, а процент эмбрионов удовлетворительного качества ниже на 8.6%. При извлечении эмбрионов у доноров на 7-й день после осеменения при гормональных обработках ГСЖК и ФСГ эмбрионы были, в основном, на стадии развития поздней морулы и ранней бластоцнсты (89.4 и 92.2%) соответственно.

Таблица 18

Влияние типа гонадотропнна на развитие и качество эмбрионов у коров-

Показатель ГСЖК ФСГ

Исследовано эмбрионов 1947 3441

Оценка по качеству: отличные 248-12.9 791 -23.0

хорошие 964-49.5 1651-48.0

Удовлетворительные 735-37.6 999 - 29.0

Оценка по развитию: Мо 1 258-13.2 160-4.6

Мо2 833-42.8 1779-51.7

Бл 1 734 -37.6 1405-40.8

Бл 2 122-6.3 97-2.8

При гормональных обработках доноров ФСГ выход ранних морул был ниже на 8.6%, а поздних бластоцист на 3.5%. Таким образом, при гормональных обработках коров и телок-доноров гапофизарнымн гормонами, при извлечении на 7-й день после осеменения наблюдалось больше поздних морул и ранних бластоцист на 12.1%, чем при обработках ГСЖК. Это говорит о

том, что овуляция у доноров, при обработках ГСЖК, проходит более длительное время, чем при обработках ФСГ.

Основной задачей метода трансплантации эмбрионов является повышение уровня стельности после пересадки. Достижение высокого уровня зависит от правильной оценки стадии развития эмбрионов и от их качества. Установлено, что наилучшая приживляемость получена при пересадке отличных бластоцист (64.5%), что превысило процент приживлясмости отличных морул (Мо 2) на 6.7%, Разница между приживляемостью морул и бластоцист хорошего качества составляла 3.0%. Наименьший процент приживляем ости получен ири пересадках морул удовлетворительного качества (29.6%).

Низкая приживляемость отмечалась при пересадках реципиентам ранних морул, что, по-видимому, связано со сложностью оценки их качества.

Таким образом, использование для пересадки реципиентам эмбрионов на стадии развития поздней морулы и бластоцисты отличного и хорошего качества позволяет получать свыше 50% приживляемое™.

3.3. Пересадка эмбрионов.

Одним из важнейших условий получения высоких результатов считается правильное проведение отбора и подготовки реципиентов для пересадки.

В качестве реципиентов использовали телок в возрасте 18-20 месяцев с живой массой 360-380 кг и коров в возрасте 5-7 лет, через 60-70 дней после отела, не имеющих послеродовых заболеваний.

Сравнительные исследования показали, что результаты пересадок эмбрионов коровам ниже на 19.7%, чем при использовании в качестве реципиентов телок.

В некоторых случаях приходилось пересаживать эмбрионы мелковеспым телкам с живой массой 320-340 кг. При исследовании на стельность процент приживляемости у мелковесных телок был ниже на 22.4%, и составлял 30.4% от числа пересадок.

Исключительно важным моментом для успешной пересадки эмбрионов является точное установление времени охоты у донора и реципиента, так как эффективность пересадок зависит от того, насколько синхронно проявление рефлекса у донора и реципиента.

Проведено много исследований по выявлению роли точной синхронизации охоты между донором и реципиентом для получения высокого уровня стельности после нехирургических пересадок эмбрионов. Наиболее высокие результаты получены при точной синхронности охоты донора и реципиента (50-60%). Приемлемые результаты были получены при отклонении синхронности на +/-12 часов (40-50%). Было установлено, что результаты нехирургических пересадок снижаются с каждым днем отклонения от точной синхронности охоты между донором и реципиентом. Для пересадки свежеполучеиных эмбрионов на каждого донора готовится по 5 реципиентов,

при этом время охоты реципиентов должно совпадать с днем первого осеменения суперовулированного донора.

Отбор большого числа реципиентов по спонтанной охоте в определенные сроки практически невозможен, поэтому при больших объемах работ используется синхронизация охоты реципиентов.

Нами проведено сравнение показателей приживляемости эмбрионов со спонтанной и синхронизированной охотой у телок разных пород.

Анализ результатов приживляемостм эмбрионов показал, что синхронизация охоты не только не оказала отрицательного влияния на приживляемость, но и улучшила ее. По швицкой породе приживляемость эмбрионов с синхронизированной охотой была выше на 4%, по черно-пестрой — на 2.9%, по красной степной - на 1.6%, по симментальской - на 3.7%, чем при спонтанной охоте.

При проведении больших объемов пересадок эмбрионов применяли двукратное введение проегагландинов с интервалом 11 дней. В охоту приходило 91.7-95.4% телок в течение 48-72 часов.

Наряду с исследованиями по определению активности простагландинов, производимых в разных странах, была проведена работа по определению действия эстрофана на разные породы скота. Определена эффективность эстрофана при однократной и двукратной обработке. При однократной обработке эстрофаном пришло в охоту телок черно-пестрой, швицкой, симментальской, краской степной, ярославской 72.9; 70.0; 65.7; 73.2; 71.8% соответственно. При двукратном введении эстрофана процент прихода в охоту повысился и составил по черно-пестрой, швицкой, симментальской, красной степной и ярославской-93.8; 90.2; 87.9; 90.0; 86.5% соответственно.

Результаты пересадок определяются стадией развития эмбрионов, которая должна быть синхронной с регулируемой гормонами пролиферацией эндометрия у реципиента.

Нами была определена концентрация в крови прогестерона, эеградиола, тестостерона, кортизола и тироксина, и она составляла в среднем по группе 0.10 нг/мл; 27.6 пг/мл; 0.11 нг/мл; 10,4 нг/мл; 68.1 нг/мл соответственно. Перед пересадкой на 7-Й день цикла отмечено значительное повышение концентрации прогестерона (1.75 нг/мл против 0.10 нг/мл), а концентрация остальных гормонов снизилась почти в 2 раза.

Концентрация прогестерона в крови реципиентов связана с качеством желтого тела, а определение качества желтого тела зависит от мастерства и опыта специалиста.

Исследованиями влияния качества желтого тела перед пересадкой на приживляемость, установлено, что приживляемость эмбрионов у реципиентов с желтыми телами отличного качества была самой высокой и составляла 59.3%, у телок с желтыми телами хорошего качества была ниже на 5.9%, а удовлетворительного качества на 19-0%. Породные различия в приживляемости были незначительные.

Были также изучены биохимические показатели крови реципиентов перед пересадкой в зимний и летний периоды (январь-июнь). В зимний период у реципиентов содержание каротина в крови наблюдалось в 3 раза выше, чем в летний период, витамина «А» - ниже на 27.4%. Кроме того, в летний период снизилось содержание в крови альбуминов, АЛТ и амилазы. По остальным показателям разница была небольшая.

В последующих исследованиях было изучено влияние правостороннего расположения желтого тела на яичнике у разных пород на приживляемость эмбрионов при пересадке. Все пересадки проводились в тот рог матки, на стороне которого было желтое тело.

При отборе реципиентов для пересадки была вычислена частота правосторонней или левосторонней овуляции у разных пород и определена взаимосвязь расположения желтого тела с приживляемостью эмбрионов (табл. 19).

Таблица 19

Приживляемость эмбрионов в зависимости от функционирования правого или

левого яичника

Порода Число рецип-ов Правый яичник % приж. эмбрион. Левый Яичник % приж. эмбрион.

Черно-пестрая 358 76.5 54.5 24.5 49.8

Швицкая 269 67.8 58.0 32.2 52.4

Симментальская 157 55.0 48.3 45.0 47,7

Красная степная 180 70.9 49.1 29.1 43.0

Ярославская 65 65.4 62.1 34.6 57.9

Как показали результаты исследований, при пересадке эмбрионов реципиентам с правосторонним расположением желтого тела приживляемость была выше у черно-пестрой породы на 4.7%; у швицкой - на 5,6%; у симментальской - на 0.6%; у красной стенной — на 6.1%; у ярославской - на 4.2%.

Для выявления причины лучшей прнжквляемости эмбрионов у реципиентов с правосторонним расположением желтого тела, нами были проведены гормональные исследования по определению концентрации прогестерона и эстрад иол а в крови в зависимости от местонахождения желтого тела (табл. 20).

Результаты исследований показывали, что при правостороннем месторасположении желтого тела концентрация гормонов прогестерона и эстрадиола была выше, чем при левостороннем расположении независимо от породы реципиента.

Гистологическими исследованиями рогов матки, проведенными Яновским И. (1962), было обнаружено большее число кровеносных сосудов на единицу площади эндометрия правого рога.

Таблица 20

Концентрация гормонов в крови реципиентов перед пересадкой эмбрионов в _зависимости от месторасположения желтого тела_

Порода реципиентов Правостороннее Левостороннее

прогестерон нг/мл Эстрадиол пг/мл прогестерон нг/мл эстрадиол пг/мл

Черно-пестрая 1.91 16.2 1.70 14.6

Швицкая 2.03 14.7 1.87 14.5

Симментальская 1.82 16.0 1.79 17.6

Красная степная 1.77 18.2 1.68 18.0

Ярославская 1.79 14.3 1.64 14.2

Высокая степень васкуляризацин правого рога и повышенный уровень секреции прогестерона желтым телом правого яичника оптимизируют секреторную активность эндометральных желез и создают лучшие условия развития эмбрионов в дои мп лактационный период.

Проведенные опыты по изучению влияния премеднкации на приживляемость эмбрионов доказали, что без премедикации было больше затрудненных пересадок на 3.3%.

Нами был проведен анализ результатов проходимости шейки матки реципиентов разных пород. Как показали результаты, лучшая проходимость была у ш виц кой и симментальской пород, у них меньше встречались непроходимости (0.9 и 1.5%), и трудные перссадки (4.1 н 7.7%), чем у черно-пестрой и красной степной породы (2.4 и 2-8%) и (И.4 и 9.3%) соответственно.

Проведены также сравнительные исследования по изучению влияния отмывания эмбрионов в 0.25% растворе трипсина для предупреждения возможной вирусной контаминации. При этом приживляемость была выше на 8.1%, чем в контроле.

В 1987-1998 г.г. были проведены эксперименты по пересадке эмбрионов с инъецированными геном гормоном роста человека и быка, синтезированные в институте молекулярной биологии АН СССР. Количество генокопий варьировало от 500 до 2500, инъецированных в один эмбрион. Ген вводили в пронуклсус, бластоцель или во внутриклеточную массу в зависимости от развития эмбриона.

Всего было проинъецировано 39 морул, 32 бластоцисты и 2 зиготы (табл.21).

Число стельных реципиентов составило 23.2%. Соотношение стельности от перссадки морул и бластоцист практически было одинаковым.

Таким образом, микроинъекции генов в эмбрионы крупного рогатого скота оказали влияние на приживляемость свежел слученных и заморожен но-оттаянных эмбрионов и выявили возможность получения этим методом трансгенных животных

Таблица 21

Результаты пересадок эмбрионов с инъецированными генами

Ген гормона роста Ген гормона роста

Быка человека

Показатель Эмбрионы

Свежепо- заморож,- свежено- заморож,-

лученные оттаян. лученные оттаян.

Пересажено эмбрионов 11 33 11

В том числе: морулы 7 7 17 8

бластоцисты П 4 14 3

зиготы - - 2 -

Стельных реципиентов (п-%) 4-22.8 3-26.8 8-24.3 2-18,3

В том числе: от морул 1 1 3 1

бластоцист 3 2 4 1

зигот - - 1 -

3.4. Использование криоконсервирования эмбрионов в трансплантации.

Главная цель криоконсервирования с помощью холода - затормозил» обмен веществ и развитие эмбриона, не допуская гибели клеток трофобласта и эмбриобласта. Исследования показали, что эмбрионы на ранних стадиях развития до поздней морулы (Мо 2) очень чувствительны к охлаждению, плохо выживают даже после охлаждения до 0°С. Бластоцисты значительно устойчивее к охлаждению и поэтому более пригодны к низкотемпературному замораживанию.

Жизнеспособность эмбрионов при замораживании зависит от скорости охлаждения, криопротектора, проницаемости клеточных мембран.

Наиболее широко применялся для замораживания эмбрионов криопротектор глицерин.

Глицерин необходимо вводить в среду постепенно, ступенчато, в возрастающих концентрациях, что позволяет эмбриону приспособиться к изменению осмотического давления.

На первых этапах исследований по крноконсервированию эмбрионов использовали медленное охлаждение со скоростью 0.1-0.3°С/мнн до 60°С, затем переносили в жидкий азот (-196°), а оттаивали со скоростью от 2 до 10° в минуту. Выживаемость эмбрионов в разных опытах колебалась от 40 до 60%.

Потом был апробирован н использован ускоренный способ замораживания эмбрионов с применением глицерина и этилен гликоля. При этом способе эмбрионы охлаждали до -35" со скоростью 0.3°С/мин, затем погружали в жидкий азот, а оттаивали в теплой воде +25+37°.

В последнее время наиболее перспективным криопротектором считается этнлснгликоль. Его использование упрощает процесс кри©консервирования и сокращает время заморозки. Считается, что он не так губительно действует на мембраны клеток и менее токсичен.

Нам» было проведено ряд опытов по крноконсервированню эмбрионов с использованием 1.5 М этилен гликоля при сравнении с традиционным глицерином 1.4 М (табл. 22).

Замораживали обе {руппы эмбрионов в одном режиме, начиная с +20°С, охлаждали до -7°С со скоростью 1°С/мин при 7°С проводилась кристаллизация, затем до -35° охлаждали со скоростью 0.5°С/мин с последующим переносом в азот.

Процент жизнеспособности эмбрионов, независимо от криопротектора, был выше при замораживании ранних бластоцист. При использовании этиленгликоля отмечена тенденция повышения сохранности эмбрионов по сравнению с глицерином на 4-5%. По приживляемости эмбрионов после пересадки преимущество также было по этиленгликолю на 12.6%.

Таблица 22

Жизнеспособность и приживляемость эмбрионов в зависимости от их качества

и криопротектора

Качество эмбрионов Замор, эмбр. Глицерин - этиленгликоль

Оттаяно Жизне спос. % от числа оттаян. Стельн. Рецип. % стсльн.

Отличные 33 18-15 16-14 88.8-93.3 8-9 50.0-64.2

Хорошие 27 12-15 9-12 75.0-80.0 5-7 44.4-58.3

Удовлетвор, 0 0-0 2-2 7,4-7.1 0-1 0.0-50.0

Итого 60 30-30 27-28 90.0-93.3 13-17 48.1-60.7

Криоконсервирование эмбрионов применяется для создания банка эмбрионов, а также при дальней транспортировке.

Проведенные исследования по изучению влияния длительности хранения эмбрионов в жидком азоте на их приживляемость показали, что хранение от одного месяца до 3 лет не повлияло на приживляемость (49.6-48.6%).

Перевозка замороженных эмбрионов легко осуществима, и нет риска заноса инфекционных болезней. Кроме того, получение стельностей от замороженно-отгаянных эмбрионов значительно дешевле покупки животных.

Большой спрос на эмбрионы от высокопродуктивных доноров был в 1985-1995 годы. Эмбрионы, полученные в племенных хозяйствах Московской области, перевозили в разные регионы страны. Транспортировали эмбрионы в жидком азоте в сосудах Дьюара емкостью 5 литров. При транспортировке эмбрионов авиатранспортом сосуд Дьюара заполняли на V* объема азотом. В ближние регионы эмбрионы доставляли на поездах и автотранспортом. Кроме того, проводились пересадки импортных эмбрионов, которые доставлялись из Дании, Германии, США, Канады. Приживляемость этих эмбрионов не зависела от транспортировки и составляла в среднем 40-60%, в зависимости от качества

эмбрионов и реципиентов. Однако было замечено, что жизнеспособность их снижается на 25-50% из-за многократных температурных перепадов при перекладывании их из сосуда в сосуд.

Таким образом, использование криоконсервирования позволяет сохранить эмбрионы от выдающихся животных, а также генофонд локальных, исчезающих порол. В перспективе генофонд исчезающих пород может быть использован для восстановления ценных качеств, утерянных а других породах при интенсивной селекции. Кроме того, применение этого метода позволяет решать вопросы акклиматизации пород и получения гибридов для создания высокопродуктивных популяций в регионах с экстремальными климатическими условиями.

ВЫВОДЫ

1. Применение усовершенствованной технологии нехирургической трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве позволяет получать по 6-7 качественных эмбрионов на донора за одно извлечение и более 50% ириживляемости при пересадках реципиентам.

2. Использование в схемах обработки доноров ГСЖК с антисывороткой позволяет увеличить выход нормальных эмбрионов на донора. Применение усовершенствованных схем обработки доноров с включением биологически активных веществ (миксоферона, утеро тоника, ПДЭ и фертагила) увеличивает выход до 6.9-7.3 качественных эмбрионов на донора, снижает число дегенерировании х эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток почти в 2 раза.

3. Предварительная стимуляция доноров небольшими дозами ФСГ {10 мг) повышает суперовуляцию яичников на 18% и увеличивает выход нормальных эмбрионов на 25.3% на донора.

4. Величина суперовуляции и выход нормальных эмбрионов зависит от концентрации в крови прогестерона перед гормональной обработкой. При концентрации прогестерона более 2 нг/мл, независимо от породы донора, можно прогнозировать стабильные результаты эмбриопродуктивности. Для оценки предрасположенности и пригодности коров к гормональным обработкам необходимо определять биохимические показатели крови: витамина мЛ», холестерина и креати нки наз ы.

5. Установлено, что при многократном использовании коров как доноров эмбрионов необходимо соблюдать интервал между гормональными обработками, который должен быть не менее 6075 дней. Повторная гормональная обработка должна проводиться

после 2-3-х циклов спонтанной охоты, при нормализации размеров яичников и отсутствии остаточных желтых тел.

6. Использование высокоценных выбракованных коров, способных выделять многократно биологически полноценные эмбрионы, является основным резервом эмбрионов для формирования генофонда молочных пород крупного рогатого скота.

7. При однократном использовании в качестве доноров телок случного возраста можно получать более 5.0 нормальных эмбрионов за одно извлечение. При повторных гормональных обработках результаты суперовуляции снижаются.

8. При нехирургическом извлечении эмбрионов у коров-доноров лучшие результата получены при использовании двухканального резинового катетера. При извлечении эмбрионов у телок-доноров с помощью разработанного специального катетера эффективность извлечения эмбрионов повысилась более чем на 30%.

9. Применение фильтров для эмбрионов снижает затраты времени на поиск и оценку эмбрионов до 25 минут на каждого донора, причем результаты использования отечественных фильтров не уступают американским.

10. При использовании в качестве реципиентов телок с живой массой 360-380 кг приживляемость свежепол ученных эмбрионов на 19.7% выше, чем при пересадке эмбрионов коровам-реципиентам. При использовании для пересадки мелковесных телок с живой массой 320-340 кг увеличивается число затрудненных пересадок и снижается процент стельности на 22.4%.

11. Установлено, что синхронизация охоты у телок разных пород не оказывает отрицательного влияния на приживляемость эмбрионов. По швицкой породе приживляемость эмбрионов у реципиентов с синхронизированной охотой выше на 4%, у черно-пестрой на 2.9%, у красной степной - на 1.6%, у симментальской - 3.7%, чем при пересадках при спонтанной охоте.

12. Приживляемость эмбрионов у реципиентов определяется не только размерами желтого тела на яичнкке, но и его гормональной активностью по концентрации прогестерона. Определена прямая зависимость приживляемости эмбрионов в пределах 50% от качества желтого тела при концентрации прогестерона 1.75 нг/мл.

13. Результаты эмбриоперссадок не зависят от конструкции катетера. Отмечена зависимость процента приживляемости от местоположения эмбриона. Результаты выше на 7.5% при пересадке эмбриона в верхушку рога матки, чем при псресадках

в середину рога. Порода реципиента не влияет на приживляемость эмбрионов. Проведение премедикации несколько увеличивает показатели стельности (4.2 и 3.1%).

14. Обработка эмбрионов 0.25% раствором трипсина повышает приживляемость эмбрионов на 8.1%, а предварительная обработка реципиентов микеофероном - на 8.6%.

15. Криопротекторы глицерин и этнленгликоль обеспечивают сохранность эмбрионов до 80.0-933% от числа замороженных. Приживляемость замороженно-оттаяиных эмбрионов составляет в среднем около 50%. Срок хранения эмбрионов в жидком азоте не влияет на их жизнеспособность.

16. Установлено, что увеличение продолжительности хранения эмбрионов в питательной среде перед заморозкой в пределах 2 часов снижает жизнеспособность эмбрионов более, чем на 10%, а при хранении более 3-4 часов снижает жизнеспособность более, чем в 2 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров, оплодотворяемости яйцеклеток и выхода нормальных эмбрионов рекомендуется обрабатывать коров-доноров ФСГ в дозе 50 мг, телок-доноров - в дозе 32 мг с включением в общую схему миксоферона н утеротоннка.

2. Для нехирургического извлечения эмбрионов у телок-доноров предлагается металлический катетер, обеспечивающий максимальную проходимость первикального канала и исключающий травмирование эндометрия,

3. Племенным хозяйствам рекомендуется определять возможность получения качественных эмбрионов от выбракованных высокоценных коров в целях получения от них потомства.

4. Разработанные способы получения высокоценных племенных животных рекомендуются для получения быков-производителей по заказному подбору от лучших коров-доноров.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кириллова Н.И.. Лебедев В.И,, Бабенков В.Ю. Влияние кратности гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров на качество эмбрионов. Животноводство. № 10.1985, с. 45-46.

2. Лебедев В.И. Результаты синхронизации охоты у теток-реципиентов и пересадка эмбрионов. // Трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота. Тезисы докладов симпозиума, Таллин. 1986, с. 35-37.

3. Лебедев В.И. Результаты внедрения метода транс плантации в практику на примере опытного хозяйства «Дубровицы», Бюллетень научных работ № 87 // Биотехнология в животноводству 1987, с. 41-43.

4. Мадисон В Л, Лебедев Б.И., Салышкова И.М. Методические рекомендации по ведению учета при трансплантации эмбрионов. ВИЖ, 1987. 30 с.

5. Сергеев Н,И,, Мадисон ВЛ., Лебедев ВИ, Методические рекомендации по много краткому использованию коров-доноров. ВИЖ, 1988,16 с.

6. Лебедев В.И, Приживл демость эмбрионов в зависимости от продуктивности доноров. Бюллетень научных работ № 89. Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции &'х животных, 1988, с, 35-37.

7. Лебедев В.И., Петряков ЮН,, Мальцева ИВ. Эффективность пересадок замороженно-оттаяиных эмбрионов у телок с синхронизированной охотой. Бюллетень научных работ. Применение трансплантации эмбрионов в селекции с/х животных.№89, 1988,с.64-66.

8. Сергеев Н.И., Мадисон ВЛ., Лебедев В.И. Методические рекомендации по синхронизации охоты коров-доноров и телок-рсципиентов, Дубровицьг, 1989. 15 с.

9. Лебедев В,И., Шейки и HB., Ибрагимов Ю.Ю. Гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров разными препаратами, // Тезисы БелНИИЖ. Жодино. 1989,с. 69-71.

10. Мадисон ВЛ., Лебедев В,И., Ибрагимов Ю JO. Эффективность использования высокопродуктивных коров и племенных телок в качестве доноров эмбрионов. Сб, трудов ВНИИплем. Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения с/х животных, М. 1989, с. 103-106.

П.Сергеев НИ., Лебедев В.И., Ефремова М.Н, Трансплантация эмбрионов в практике скотоводства. Зоотехния, № 10,1991, с, 54-58.

12. Лебедев В,И., Шири ев В.М., Хилъкевич CJH. Применение пшофизарных гонадотропияов для вызывания суперовуляции у коров-доноров. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Дубровицы, 1990, с, 61-62.

13, Лебедев В.И., Щейкин И.В., Ибрагимов Ю.Ю. Воспроизводительная способносгь и вызывание суперовуляции у проблемных телок. Сб. ВНИИПлем. Биотсхнслогические методы в селекции. М. 1990, с, 57-59.

14. Сергеев Н.И.. Лебедев В.И., Ибрагимов Ю.Ю. Алмарданов А. Эффективность применения гипофизарных препаратов в практике трансплантации эмбрионов. Зоотехния,№ 7,1990, с. 69-72.

15, Мадисон ВЛ,, Лебедев В.И., Артюшина H.A., Сальникова И.М. Результаты . внедрения метода трансплантации эмбрионов в практику разведения

в ысокопрод}тстивного молочного скота. ВИЖ, Тезисы. Проблемы развития биотехнология в животноводстве. Дубровицы, 1990, с, 62-64.

16. Лебедев В.И. Использование в качестве доноров-эмбрионов телок случного возраста. Тезисы, Львов. 1990, с. 25-26.

17. Лебедев В.И. Эффективность обработок доноров разного возраста. Бюллетень научных работ № 104. Б иотехнологи че скис приемы в технологии трансплантации эмбрионов. 1991, с. 15-17.

18. Лебедев В.И. Взаимосвязь гормонального ста!уса доноров перед гормональной обработкой с эмбриопродуктианостью. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции. !! Использование гормональных препаратов в животноводстве. М. 1991, с. 49-50,

19.Сергеев Н.И.. Мадисон В.Л, Лебедев В.И., Плаксеев АА. Патент на изобретение «Устройство ятя извлечения эмбрионов из матки телок-доноров и коров-доноров с трудной проходимостью, № 2041706 от 28.04,92г.

20. Мали соя ВЛ., Лебедев В, И., Мадисон В.В., Дронин А.П., Назаров ЕЛ. Методические рекомендации по отбору и использованию высокопродуктивных коров-доноров. ВИЖ, 1993,26 с.

21. Лебедев В,И., Бушманов В.И. Взаимосвязь гормонального статуса доноров перед гормональной обработкой с эмбрионродуктивностью. Молочное и мясное скотоводство. № К 1993. с, 21-23.

22. Лебедев В.И. Эндокринные и биохимические тесты при отборе коров-доноров и телок-реципиентов, Харьков, 1995, с. 26-27.

23.Сергеев Н.И, Лебедев В.И,. Тяпугин Е.А. Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. Ох наука Северо-востока России. Т.Щ.,1995, с. 65-69,

24.Лебедев В.И, Садыков Ш.М. Влияние биохимических показателей на эм бри оп родуктивн ость коров молочных пород. Труды ВИЖа, 1998, вып 57. е. 208-210.

25.Сергеев Н.И., Савченкова И.П., Лебедев ВН. Некоторые проблемы трансплантации и клеточной инженерии в биотехнологии. Зоотехния, №8, 1999,е.22-23.

26.Лебеяев В.И., Сергеев Н.И., Гапеев А.В. Использование этиленглнколя и глицерина при замораживании эмбрионов. Зоотехния,№4,2000, с, 28-29.

27.Лебедев В.И., Сергеев Н.И„ Ерин С.Н. Эффективность применения ФСГ, миксоферона и ПДЭ при стимуляции полиовуляции у коров-доноров. Сб. Боровск, 2000, с. 214-216.

28.Лебедев В.И., Сергеев Н.И., Гапеев Д,В. Эффективность применения ФСГ, миксоферона и утеротоника при синхронизации охоты, стимуляции полиовуляции у коров-доноров и таток-реципиентов. Зоотехния, № 2, 2001, с, 24-26.

29.Тарадайник Т.Е., Лебедев В.И., Гапеев Д.В., Кинзеев В.Н. Пути снижения эмбриональной смертности при трансплантации ранних зародышей крупного рогатого скота. Материалы науч. практич. конф., Быково, 2000, с. 46-47.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132. Московская обд., Подольский р-н, п. Дубровины Тол. (8 - 27) 65-] 4-24, (К - 27) 65-14-07

Лицензия ЛРЯ° 021248 от 21,12.97

Сдано »набор 16,10,2001, Подписано в печать 16.10,2001 _ЗаказУа 25. Псч.л. 2. Тираж 100 экз._

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лебедев, Виктор Иванович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Фолликулогенез, гормоны и регуляция астрального цикла

2.2. Способы индуцирования суперовуляции у коров и телок-доноров

2.3. Методы извлечения эмбрионов у доноров

2.4. Морфологическая оценка качества эмбрионов, методы их пересадки и криоконсервирования

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование технологии трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве"

Производство молока, мяса и другой животноводческой продукции в соответствии научно обоснованным нормам потребления продуктов животного происхождения составляет основу продовольственной безопасности государства и социального обеспечения населения (145). Определяющее значение для реализации данного положения в организационно-хозяйственном аспекте скотоводства имеет высокоэффективный численный и породный состав структуры совокупного стада, соответствующий экономике каждого региона (137). Однако современное отечественное скотоводство характеризуют качественные структурные изменения: с начала 90-х годов происходит устойчивое сокращение поголовья крупного рогатого скота, сопровождающегося увеличением доли коров в стаде при одновременном уменьшении шлейфа. Отечественное скотоводство устойчиво приобретает экстенсивные формы ведения (66, 67, 68). В результате этого возникла ненормальная экономическая обстановка, ибо зависимость России от импорта молочных продуктов и мяса возросла до недопустимых размеров. За период 1991-1999 годов производство молока в стране сократилось на 43%, а говядины - более чем в 2 раза, что в расчете на душу населения ниже медицинских норм потребления. Рост импорта не решает проблему, а лишь создает нездоровую конкуренцию со стороны зарубежных производителей, реализующих не всегда качественный товар по демпинговым ценам (146, 137).

Эти условия аргументировали разработку институтами РАСХН программы развития животноводства России на период до 2010 года, которую в мае 2000 года одобрил Президиум Россельхозакадемии. Программа направлена на положительную коррекцию негативных тенденций в скотоводстве: производство молока планируется увеличить на 24 млн т (с 32 млн т до 56 млн т ). При стабилизации имеющегося поголовья на уровне 13 млн коров с удоем 2500 кг молока (все категории хозяйств) их продуктивность должна быть повышена до 4300 кг. В программе, наряду с принятием комплекса организационных, экономических и технологических мер планируется интенсифицировать использование генетического потенциала продуктивности пород скота, который на 35-45% в настоящее время остается невостребованным. Для повышения эффективности крупномасштабной селекции, обеспечивающий ежегодный рост удоев коров, следует увеличивать интенсивность отбора лучших быков по потомству. Параллельно планируется активизировать процесс структурных изменений породного состава, удовлетворяющих требованиям экономики каждого отдельного региона.

Принимая во внимание масштабы разработанной программы, становится очевидным, что традиционные методы воспроизводства не позволяют на должном уровне решать поставленные задачи. В этих условиях особую актуальность придают мероприятиям, направленным на улучшение организации воспроизводства на основе современных биотехнологических методов (67, 137, 160), уже в достаточной мере апробированных в скотоводстве и обладающих значением для других видов животных (121, 139). В первую очередь сюда относят биотехнический метод трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, в основе которого лежат принципы направленной регуляции репродуктивной функцией, впервые разработанные отечественными учеными (37, 38, 39, 81, 132).

Главной перспективой развития метода трансплантации является создание методик, обеспечивающих получение максимального числа потомков от коров с желательным генотипом за счет гормонального индуцирования множественной овуляции. Метод эмбриотрансплантации дает реальную возможность существенно интенсифицировать селекционный прогресс за счет использования генетического потенциала, представляющего собой резерв генофонда у коров, обладающих уникальными хозяйственно-полезными свойствами, что невозможно достичь, применяя традиционные методы воспроизводства (естественное и искусственное осеменение).

В селекционных программах использование метода эмбриотрансплантации нацелено на ускоренное воспроизводство по линии мать-сын, учитывая, что коровы через сыновей-производителей оказывают положительное влияние на генетический прогресс крупных популяций скота. Наибольшие успехи по созданию высокопродуктивных молочных стад достигнуты в Канаде и США, причем лидерство они удерживают именно благодаря эффективному использованию метода трансплантации эмбрионов. Достаточно сказать, что более 70% быков-производителей, занесенных в государственные книги учета, получены путем пересадки эмбрионов (333).

На современном этапе эмбриотрансплантация позволяет значительно сократить селекционный интервал: после соответствующих гормональных обработок вызывают суперовуляцию у половозрелых телок и извлекают пригодные для трансплантации реципиентам эмбрионы, получая после этого высокоценный племенной молодняк. Метод трансплантации в практике скотоводства применяют также для быстрого восстановления численности и широкого распространения редких и исчезающих пород животных, ускоренного создания выдающихся стад коров-рекордисток, как матерей будущих быков-родоначальников линий, создания банка криоконсервированных эмбрионов с последующей их пересадкой в стадах (315, 362, 178, 128). Очевидно преимущество метода при импорте и экспорте сельскохозяйственных животных (учитывая жесткие карантинные требования).

Таким образом, трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота обуславливает высокую эффективность целенаправленного использования генетического материала, что значительно повышает производительность труда в селекционной работе при выведении новых пород, линий и семейств животных.

Трансплантацию эмбрионов используют как уникальный метод исследований, касающихся фундаментальных (репродуктивная, физиология, биохимия, эндокринология, генетика) и прикладных (акушерство, гинекология) дисциплин. Активно используют технологию эмбриотрансплантации в программах исключения передачи таких заболеваний как лейкоза, бычьей диарее и др. (152, 235).

При трансплантации эмбрионов становится доступным, не требуя большого времени, выявление нежелательных рецессивных генов, что приведет к возможности их элиминации из популяций сельскохозяйственных животных. Разрабатываются методы культивирования ооцитов вне организма и их последующее оплодотворение in vitro или в яйцеводах самок того же самого или другого вида. Разделение эмбрионов с целью получения генетических копий и химер, а так же получение клонов животных методами генной инженерии и Т-ядер открывают особые возможности и перспективы. Разработаны для практического применения методики определения пола предимплантационных эмбрионов на стадии морулы путем хромосомного анализа или выявления H-Y антигена специфическими антителами (209).

На современном этапе исследования по биотехнологии воспроизводства крупного рогатого скота проводят, прежде всего, в направлении, связанном с непосредственной реализацией достигнутых результатов в сферу производства. Уровень знаний, полученный на основе достижений физиологии, эндокринологии, биохимии, фармакологии и других наук, позволяет в области биотехнологии трансплантации эмбрионов получить стельность до 70-80% от числа пересадок или до 3-4 телят-трансплантатов на одно извлечение, то есть показатели аналогичные практическим показателям, достигнутым в области технологий искусственного осеменения. Однако необходимо иметь в виду, что приводимый уровень эффективности характерен для экспериментальной работы, при условии безукоризненного соблюдения зоогигиенических норм содержания, кормления и эксплуатации животных, когда все технологические элементы выполняют высоко квалифицированные специалисты на здоровых животных, прошедших жесткий ветеринарный контроль. Реально, в производственных условиях показатели приживляемости не превышают, в лучшем случае, 50-55%. За последние 1.5-2 десятилетия накоплен огромный объем литературы, отражающий экспериментально-практическую работу в области новейших технологий воспроизводства. Тем не менее, реализация метода трансплантации, как в условиях производства, так и во многих научноисследовательских институтах встречает затруднения. Недостаточно надежны методы индуцирования суперовуляции, высока вариабельность результатов гормональных воздействий, недостоверна предсказуемость реакции яичников на гормональные препараты. При получении приемлемого числа эмбрионов на донора имеет место высокий процент дегенерации и отсутствия оплодотворяемости, наличия персистирующих и атрезирующих фолликулов в яичниках доноров. Еще остаются недостаточно совершенной техника извлечения, оценка качества, криоконсервации и трансцервикальной пересадки эмбрионов (143, 118, 119, 122).

Однако совершенствование и практическое применение метода эмбриотрансплантации необходимо как для решения первоочередных задач по преодолению негативных тенденций в животноводстве, так и для развития других биотехнологических направлений: генная и клеточная инженерия, использующая специальные векторы для интеграции чужеродной генной конструкции в пронуклеус зиготы; исследования по получению тотипотентных эмбриональных стволовых клеток с генными конструкциями с целью создания множественных линий с генетическим разнообразием; исследования по получению трансгенных животных и клонов; исследования по элиминации нежелательных генов (158). Следует учитывать, что перечисленные направления, при условии совершенствования, в ближайшие годы должны стать важнейшими факторами повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных (159, 160).

В этой связи исследованиям и механизмам внедрения научных достижений в практику скотоводства необходимо придать новый импульс. Назрела острая потребность в переосмыслении старых и определении новых, оригинальных подходов к исследованиям в избранной области знаний с созданием и использованием принципиально новых методик (208). Вместе с тем без создания современной теоретической концепции, но главное без систематизации, анализа и обобщения всего накопленного за последние двадцать лет экспериментального материала и производственного опыта невозможна перспектива модернизации и практического применения биотехнологического метода трансплантации эмбрионов с целью преодоления накопившихся в молочном скотоводстве проблем и дальнейшего развития отрасли.

Цель и задачи исследований. Для решения этих вопросов нами была поставлена цель исследований - разработать и усовершенствовать технологию получения не менее 6 эмбрионов за одно извлечение на донора и достичь 50% приживляемости эмбрионов при пересадке.

Для достижения поставленной цели сочли необходимым решить следующие задачи:

1. Разработать новые методы вызывания суперовуляции у коров и телок-доноров с использованием существующих отечественных гормональных препаратов.

2. Исследовать эндокринные и биохимические аспекты для определения тестов на эмбриопродуктивность.

3. Усовершенствовать приборы для извлечения эмбрионов у коров-доноров и сконструировать приборы для извлечения эмбрионов у телок-доноров.

4. Изучить влияние биологически активных препаратов (утеротоник, ПДЭ, оксилат, миксоферон) на результаты суперовуляции и пересадки эмбрионов.

5. Разработать технологию низкотемпературного замораживания и оттаивания эмбрионов с применением криопротектора этиленгликоль.

Научная новизна. Усовершенствованы методы вызывания полиовуляции у коров и телок доноров на основе применения современных гормональных препаратов и биологически активных веществ. Усовершенствованы и сконструированы новые приборы для извлечения и пересадки эмбрионов. Изучены эндокринные и биохимические факторы, влияющие на эмбриопродуктивность доноров, возможность многократного использования под доноров коров и телок случного возраста, а также разработана технология глубокого замораживания эмбрионов с криопротектором этиленгликоль. Новизна исследований подтверждена патентом на катетер для извлечения эмбрионов у телок и пятью рационализаторскими предложениями по усовершенствованию технологии трансплантации эмбрионов.

Практическая значимость. Совершенствование методов индуцирования полиовуляции у коров и телок доноров позволяет получать стабильные результаты по выходу нормальных эмбрионов более 6 на донора. С использованием сконструированного катетера для извлечения эмбрионов у телок-доноров повысился процент извлекаемости эмбрионов более чем на 30%. Разработанные методические и технологические условия глубокого замораживания эмбрионов с криопротектором этиленгликоль снизили временные показатели подготовки эмбрионов к замораживанию и оттаиванию, а также позволили проводить пересадку эмбрионов в тех же пайэтах в условиях ферм, не снижая процента приживляемости. За разработку технологии трансплантации эмбрионов и внедрение в производство была присуждена премия Совета Министров СССР 30.11.1990г.

Реализация результатов исследований. Полученные результаты использованы в 2-х инструкциях по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота и четырех методических рекомендациях ВИЖа, результаты исследований вошли в ежегодные и пятилетние отчеты отдела трансплантации эмбрионов на Ученом Совете ВИЖа.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены на 11 международных, союзных, республиканских и зональных конференциях (Москва, Тарту, Львов, Харьков, Киров, Петербург, Боровск, Брест, Минск, 1985-2000 г.г.).

Публикации. Основные научные результаты и положения, включенные в диссертацию, отражены в 37 публикациях, в том числе 2-х инструкциях и 4-х методических рекомендациях.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лебедев, Виктор Иванович

5. ВЫВОДЫ.

1. Применение усовершенствованной технологии нехирургической трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве позволяет получать по 6-7 качественных эмбрионов на донора за одно извлечение и более 50% приживляемости при пересадках реципиентам.

2. Использование в схемах обработки доноров ГСЖК с антисывороткой позволяет увеличить выход нормальных эмбрионов на донора. Применение усовершенствованных схем обработки доноров с включением биологически активных веществ миксоферона, утеротоника, ПДЭ и фертагила увеличивает выход до 6.9-7.3 качественных эмбрионов на донора, снижает число дегенерированных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток почти в 2 раза.

3. Предварительная стимуляция доноров небольшими дозами ФСГ (10 мг) повышает реакцию яичников суперовуляцией на 18% и увеличивает выход нормальных эмбрионов на 25.3% на донора.

4. Установлено, что величина суперовуляции и выход нормальных эмбрионов зависит от концентрации в крови прогестерона перед гормональной обработкой. При концентрации прогестерона более 2 нг/мл независимо от породы донора возможно прогнозировать стабильные результаты эмбриопродуктивности. Для оценки предрасположенности и пригодности коров к гормональным обработкам необходимо определять биохимические показатели крови: витамин «А», холестерина и креатининкенизы.

5. Установлено, что при многократном использовании коров под доноров эмбрионов необходимо соблюдать интервал между гормональными обработками, который должен быть не менее 60

75 дней. Повторная гормональная обработка должна проводиться после 2-3-х циклов спонтанной охоты, при нормализации размеров яичников и отсутствии остаточных, желтых тел.

6. Использование высокоценных выбракованных коров, способных выделять многократно биологически полноценные эмбрионы, является основным резервом эмбрионов для формирования генофонда молочных пород крупного рогатого скота.

7. При однократном использовании под доноров телок случного возраста возможно получать более 5.0 нормальных эмбрионов за одно извлечение. При повторных гормональных обработках результаты суперовуляции снижаются.

8. При нехирургическом извлечении эмбрионов у коров-доноров лучшие результаты получены при использовании двухканального резинового катетера. При извлечении эмбрионов у телок-доноров с помощью разработанного специального катетера эффективность извлечения эмбрионов повысилась более чем на 30%.

9. Применение фильтров для эмбрионов снижает затраты времени на поиск и оценку эмбрионов по 25 минут на каждого донора, причем результаты использования отечественных фильтров не уступали американским.

10. При использовании под реципиентов телок с живой массой 360380 кг приживляемость свежеполученных эмбрионов была на 19.7% выше, чем при пересадке эмбрионов коровам реципиентам. При использовании под пересадку мелковесных телок с живой массой 320-340 кг увеличивается число затрудненных пересадок, и снижается процент стельности на 22.4%.

11. Установлено, что синхронизация охоты у коров разных пород не оказывала отрицательного влияния на приживляемость эмбрионов. По швицкой породе приживляемость эмбрионов у реципиентов с синхронизированной охотой была выше на 4%, у черно-пестрой на 2.9%, у красной степной - на 1.6%, у симментальской - 3.7%, чем при пересадках при спонтанной охоте.

12. Приживляемость эмбрионов у реципиентов определяется не столько размерами желтого тела на яичнике, но и гормональной его активностью по концентрации прогестерона. Определена прямая зависимость приживляемости эмбрионов в пределах 50 % от качества желтого тела при концентрации прогестерона 1.75 нг/мл.

13. Результаты эмбриопересадок не зависят от конструкции катетера. Отмечена зависимость процента приживляемости от местоположения эмбриона. Результаты были выше на 7.5% при пересадке эмбриона в верхушку рога матки, чем при пересадках в середину рога. Порода реципиента не повлияла на приживляемость эмбрионов. Проведение премедикации несколько увеличивало показатели стельности (4.2 и 3.1%).

14. Обработка эмбрионов 0.25% раствором трипсина повышает приживляемость эмбрионов на 8.1%, а предварительная обработка реципиентов миксофероном на 8.6%.

15. Криопротекторы глицерин и этиленгликоль обеспечивают сохранность эмбрионов до 80.0-93.3%) от числа замороженных.! Приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов составляла, в среднем около 50%. Срок хранения эмбрионов в жидком азоте не влиял на их жизнеспособность. , )

16. Установлено, что увеличение продолжительности хранения эмбрионов в питательной среде перед заморозкой в пределах 2 часов снижает жизнеспособность эмбрионов более чем на 10 %, а

258 при хранении более 3-4 часов снижает жизнеспособность более чем в 2 раза.

259

10. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров, оплодотворяемости яйцеклеток и выхода нормальных эмбрионов рекомендуется обрабатывать коров-доноров ФСГ в дозе 50 мг, телок-доноров - в дозе 32 мг с включением в общую схему миксоферона и утеротоника.

2. Для нехирургического извлечения эмбрионов у телок-доноров предлагается металлический катетер, обеспечивающий максимальную проходимость цервикального канала и исключающий травмирование эндометрия.

3. Племенным хозяйствам рекомендуется определять возможность получения качественных эмбрионов от выбракованных высокоценных коров в целях получения от них потомства.

4. Разработанные способы получения высокоценных племенных животных рекомендуют для получения быков-производителей по заказному подбору от лучших коров-доноров.

2.6. Заключение.

Эстральный цикл у коров длится приблизительно 21 день с колебаниями, в большинстве случаев от 19 до 22 дней. У телок длина цикла на один день короче, чем у коров. Имеется много факторов влияющих на длительность цикла: длина светового дня, кормление, температурный фактор, стресс, порода (211).

Эстральный период у коров и телок делится на 4 фазы на основе физиологических и эндокринологических факторов: эструс, метэструс, диэструс и проэструс. При более упрощенном разделении цикл делится на фолликулярную стадию, представляющую собой рост наибольшего фолликула и овуляцию; и лютеальную фазу, характеризующуюся максимальным ростом и сохранением желтого тела и выделением прогестерона (174).

Главная роль увеличения прогестерона в кровотоке во время цикла - это индуцирование и поддержание роста железистого эпителия эндометрия, выделяющего гистотрофы для питания зародыша. Прогестерон также тормозит развитие и овуляцию крупных фолликулов.

Высокий уровень прогестерона, продуцируемого желтым телом, служит отрицательной обратной связью, удерживая гипоталамо-гипофизарную ось от выделения гонадотропинов, необходимых для развития фолликулов в яичниках.

Во время овуляции, которая происходит, примерно через 24 часа после эструса, клетки фолликула претерпевают лютеализацию и активно секретируют прогестерон. Это новосформированное желтое тело является мягким и кровоточащим, и весит только 0.1 г, а зрелое желтое тело 0.52-0.8 г.

Уровень прогестерона растет и достигает пика на 9-10 день цикла до 4-7 нг/мл. Выделение прогестерона продолжается вплоть до лютеальной регрессии, до 16-18 дня цикла.

В функциональном отношении желтое тело у коров и телок изначально запрограммировано на поддержание беременности и обеспечение проведения эмбриональных сигналов до 14-16 дня цикла. Эмбрионы, пересаженные не стельной корове до этого времени приводят к сохранению желтого тела и продолжению беременности. А эмбрионы, пересаженные после 14-16 дня реципиентам, приводят к лютеальной регрессии, так как эмбриональный сигнал не обеспечивает достаточно времени для предотвращения изменения гормонального фона, приводящего к регрессии желтого тела.

Последующий спад уровня прогестерона ведет к смещению отрицательной обратной связи с передней долей гипофиза, и результатом этого является высвобождение гонадотропинов. Таким образом, существует взаимосвязь, затрагивающая гипоталамус, переднюю долю гипофиза, яичники и матку (204).

При гормональной обработке донора гонадотропинами, возрастающий уровень гормонов считывается фолликулами посредством капиллярной сети. Фолликулы растут из одиночного слоя клеток, содержащих ооцит, через питание, обеспеченное гонадотропинами до состояния зрелых фолликулов. Это заполненное пространство окружено клетками гранулезы, отделенное от внешнего слоя теки базальной мембраной.

ФСГ и ЛГ связываются рецепторами теки и клетками гранулезы, активизируют фермент аденилатциклазу. Этот фермент, в свою очередь, преобразует богатую энергией АТФ в циклический АМФ. Циклический АМФ играет большую роль в синтезе фолликулярных стероидов. Два типа клеток фолликулов - теки и гранулезы - взаимодействуют для продукции эстрогена. Клетки теки, отвечающие на ЛГ, продуцируют тестостерон и передают его клеткам гранулезы, где он, вступая в химическую реакцию, преобразуется в эстроген. Эстроген действует на усиление роста фолликулов, играет большую роль в подготовке репродуктивного тракта для яйцеклеток и сперматозоидов, оказывает позитивное влияние на высвобождение гонадотропинов аденогипофизом.

ФСГ и ГСЖК, используемые для суперовуляции у коров действуют через те же рецепторы и тот же циклический АМФ, что и эндогенные ЛГ и ФСГ. Главное различие в том, что большие дозы гонадотропинов для стимуляции суперовуляции нарушают естественный механизм, в норме предназначенный для единственной овуляции. Большое число фолликулов, которые в норме претерпевают атрезию (что связано с недостатком гонадотропина), под действием экзогенных гонадотропинов развиваются и овулируют.

Уровень ЛГ увеличивается до максимума в начале эструса, он настолько высок, что нарушаются все рецепторы ЛГ на фолликуле, остается клетка без рецепторов эффективно блокирующих добавочное действие гонадотропинов. Без рецепторов, связывающих гонадотропины, циклический АМФ становится непригодным для генерации необходимых для синтеза эстрогена энзимов. Эта цепочка событий приводит к снижению продуцирования, как эстрогена, так и ЛГ.

Гормональная регуляция характеризуется резкой трансформацией клеток гранулезы и клеток теки предовуляторного фолликула в лютеинизированную форму. Эти клетки претерпевают дифференцировку в два типа лютеальных клеток. Крупные лютеальные клетки имеют гранулезное происхождение и продуцируют большую часть лютеального прогестерона, а также имеют рецепторы на простагландин Р2а. Эти клетки, по-видимому, ответственны за регрессию желтого тела.

Маленькие лютеальные клетки происходят из теки, и содержат рецепторы для ЛГ, а также они отвечают на ЛГ резким всплеском продукции прогестерона.

Суперовуляция остается самой непредсказуемой ступенью в процессе получения эмбрионов. Влияние на результаты суперовуляции оказывает очень много факторов. Это порода, возраст донора, кормление и лактационный статус, сезон года и стадия цикла перед началом обработок, тип и дозы гонадотропинов, инструменты для извлечения, мастерство оператора и так далее (71,25,211,250).

В большинстве случаев для суперовуляторных обработок используется фолликулостимулирующий гормон ФСГ, полученный из гипофиза свиней, который, как правило, содержит больше ЛГ, чем ФСГ.

Короткий период полураспада ФСГ влечет за собой необходимость двукратных инъекций с промежутком 12 часов. Обработки начинаются в среднелютеальную фазу на 8-12 день цикла донора (201, 73).

Доза ФСГ варьирует от 32 до 50 мг на донора и вводится по схеме со снижающим уровнем введения или постоянным (16, 14, 12, 8 или 10, 10, 10, 10, 10 мг). Простагландин вводится на 3-4 день обработки в дозе 500 мкг клопростенола. Через 36-48 часов у доноров наступает эструс. Интервал от введения простагландина да начала эструса на 12-24 часа короче у суперовулированных животных, чем у коров с естественной овуляцией.

В среднем на донора, обработанного по этой схеме, получают 8-12 овуляций. Количество овуляций определяется ректальной пальпацией, но, зачастую, бывает трудно определить точное число овуляций. Если число желтых тел превышает 5-6 в каждом яичнике, или имеются по несколько неовулированных фолликулов. Очевидно, большое число неовулированных фолликулов и желтых тел отрицательно влияет на процент извлечений из-за неблагоприятного соотношения эстрогенов к прогестерону.

Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) также широко используется для суперовуляции, так как требуется только однократная инъекция. Однако период полураспада его слишком продолжительный.

Дозы, применяемые для получения суперовуляции у доноров, варьируют от 2 до 3 тыс. и.е. Отношение ФСГ к ЛГ в ГСЖК колеблется от Г.й. до -/.'5, и зависит от стадии жеребости, в которой бралась сыворотка.

ГСЖК - трудно стандартизируемый гормон, он является чужеродным белком, антигенным фактором, способным ухудшить результаты суперовуляции при повторных обработках. Однако удовлетворительные результаты получены при 10-кратных обработках ГСЖК. ГСЖК можно вводить внутримышечно на 16 или 17 день цикла (101), но чаще вводят на 8-12 день цикла в дозе 2-3 тыс. и.е. через 48 часов назначают простагландин.

Инъекции ГСЖК первоначально оказывают лютеотропное действие, относимое к активности ЛГ. ЛГ считается ответственным за случающуюся время от времени преждевременную овуляцию крупного фолликула, присутствующего в момент инъекции ГСЖК. Возможно, преждевременно развившееся желтое тело угнетает следующие овуляции, вероятно, по причине его недостаточной зрелости для лизирования простагландином, назначенного 2 дня спустя; желтое тело еще секретирует достаточно прогестерона для того, чтобы заблокировать выход эндогенного ЛГ.

Использование под первое осеменение анти-ГСЖК повышает выход эмбрионов, блокируя дальнейший рост фолликулов.

Хориогонадотропин, введенный обработанным донорам в начале охоты не увеличивает суперовуляторную реакцию, однако он стимулирует овуляцию яйцеклеток.

Пока еще нет определенного мнения о продолжительности процесса овуляции у крупного рогатого скота при суперовуляторных обработках. При обработках доноров классическим комплексом препаратов СЖК + простагландин, овуляция продолжается 24 часа и более.

Фолликулам в яичнике коровы требуется 4-5 дней для созревания под влиянием экзогенных гонадотропинов. Использование простагландинов позволяет обеспечивать определенный контроль над временем созревания и овуляции фолликулов.

По данным многих исследователей выявлена зависимость числа овуляций и качества эмбрионов от гормонального профиля доноров перед обработкой.

Результаты исследований предполагают, что на основе предварительно установленного гормонального профиля доноров можно прогнозировать эффективность суперовуляторной обработки.

Эмбрионы, полученные путем гормонального вызывания суперовуляции, извлекаются из половых путей донора хирургическим или трансцервикальным методом. При хирургическом методе наиболее эффективно одновременно промывать матку и яйцепровод. От времени, прошедшего после овуляции, зависит и место нахождения эмбрионов. У крупного рогатого скота они выходят в матку через 4 дня. Трансцервикальным методом можно извлечь эмбрионы после выхода их в рога матки, наиболее предпочтительно извлечение на 6-8 день после осеменения доноров.

В некоторых странах предпочтение отдают хирургическим методам извлечения эмбрионов. Используют два метода извлечения: путем лапоротомии по белой линии и через боковой разрез в области голодной ямки. При хирургическом методе достигается более полное извлечение эмбрионов, но с другой стороны, недостатком этого метода является непродолжительное время использования донора в связи с возникающими спайками полового тракта (250).

Независимо от мнений многих специалистов о состоянии животных, в целом признавалось, что нехирургические методы должны шире применяться для извлечения и пересадки зародышей.

Современная техника нехирургического извлечения и пересадки эмбрионов по сообщениям многих исследователей проста в исполнении, требует минимума специального оборудования, исключает повреждение донора и реципиента. Результаты работ многих ученых подтверждают мнение, что полнота извлечения зародышей может быть сравнима с хирургическим методом по мере накопления соответствующего опыта и мастерства. Но полнота нехирургического извлечения не всегда может быть точно установлена, поскольку число стимулированных овуляций можно определить только с помощью ректальной пальпации желтых тел.

Извлечение эмбрионов проводят двух или трехканальными катетерами. По результату извлечений катетеры не отличаются, но предпочтение отдается двухканальному катетеру. Он проще в исполнении и исключает травмирование рогов матки.

Успешное извлечение 6-8 дневных эмбрионов зависит от глубины введения рабочей части катетера в рог матки, величины промываемой поверхности слизистой оболочки рога матки и интенсивности оттока промывной жидкости (153).

При нехирургической технике извлечения могут возникать различные затруднения: неправильное расположение катетера в просвете рога матки, непроходимость шейки матки, особенно у телок. Иногда возможна закупорка отверстий катетера маточной слизью, которая препятствует вытеканию промывной жидкости. При неумелой манипуляции с маткой и низкой квалификации оператора могут быть травмы и проколы стенок рогов матки.

Для сбора промывной жидкости с эмбрионами используют специальные сосуды, в которых эмбрионы отстаиваются 20 минут. Верхний слой жидкости сливается, а в оставшейся порции (80-100 мл) ведется поиск эмбрионов, чтобы ускорить процесс поиска применяют фильтрование через нейлоновый фильтр.

Четких критериев для оценки качества получаемых зародышей пока нет. Морфологическая оценка является одним из методов, которая наиболее реально позволяет оценить степень соответствия развития зародышей их возрасту.

Считают, что аномальные яйцеклетки появляются после суперовуляции чаще, чем при обычной овуляции.

По некоторым данным, условия в матке у доноров с суперовуляцией могут неблагоприятно отразиться на развитии зародыша. Это проявляется в увеличенном количестве появления зародышей с морфологическими аномалиями после 4-го дня, когда они перемещаются в рог матки.

Морфологическая оценка служит для отбора неоплодотворенных яйцеклеток, определения стадии развития зародыша и выявления поврежденных эмбрионов.

Нормальное развитие, заканчивающееся получением приплода, является окончательной оценкой полноценности зародыша (155).

Однако при пересадке эмбрионов их жизнеспособность определяется исключительно по морфологическим признакам. При этом учитываются целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность перевителлиногого пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствие стадии развития возрасту эмбриона.

Морфологическая разнокачественность эмбрионов определяется визуально, под микроскопом. При оценке по морфологическим показателям не всегда удается точно определить их полноценность. Предложено несколько способов проверки жизнеспособности эмбрионов путем специальных красителей.

Давно признано, что эффективность трансплантации эмбрионов возрастает с применением глубокого замораживания и хранения зародышей в жидком азоте (77, 75, 78).

Наиболее ранние попытки хранения замороженных зародышей предприняты Я0\У80П Ь. (323, 324) и продолжены \УПти1 е.а. (369, 370). Для криоконсервирования используется несколько криопротекторов - это и 1.5-2м диметилсульфоксид и 1.5м глицерин, а также 1.2м пропандиол. В настоящее время считается, что оптимальной стадией для замораживания является ранняя бластоциста, их выживаемость после заморозки составляет 80%.

Существует много путей изучения приемов замораживания и хранения зародышей, и они направлены на упрощение для практического применения.

Результаты многолетнего изучения показали, что выживаемость зародышей зависит от степени соответствия их развития и состояния матки у реципиента. Но и с учетом этого остается еще много невыясненных факторов, определяющих выживаемость зародышей. Иногда даже точная синхронизация охоты между донором и реципиентом не гарантирует оптимального уровня стельности. В ранних работах по пересадке эмбрионов почти всегда подбирали реципиентов по спонтанной охоте. В последствии синхронизация охоты с применением простагландинов позволила увеличить масштабы пересадок замороженно-оттаянных эмбрионов.

Английские исследователи добились очень высокого уровня стельности при хирургической пересадке до 90%. Этот высокий уровень был, достигнут жесткой отбраковкой аномальных эмбрионов и точной синхронизацией охоты доноров и реципиентов, а также одновременной пересадкой двух зародышей.

Первый успех в пересадке эмбрионов нехирургическим методом сопутствовал американским ученым в начале 50-х годов. Однако осуществить практическое внедрение этого метода в производственных масштабах удалось только в 80-х годах. Наиболее реальные результаты приживляемости эмбрионов получены в результате анализа многочисленных данных. Они составляют при нехирургической пересадке 49-57%. Однако многие считают, что по мере совершенствования необходимых инструментов для нехирургической пересадки, результаты будут повышаться и могут сравниться с результатами искусственного осеменения.

Анализ большого числа пересадок показал, что имеется ряд факторов, которые влияют на результаты приживляемости эмбрионов. Основными факторами считаются качество и возраст зародыша во время пересадки, место локализации эмбрионов в роге матки, качество реципиентов, соблюдение асептики, техническая квалификация специалистов, а также модификация инструментов.

Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является той областью физиологии размножения, которая позволяет стимулировать суперовуляцию у генетически высокоценных коров, извлечь от них эмбрионы и пересадить их другим, менее ценным реципиентам. Для более широкого внедрения в практику разведения скота необходимы дальнейшие разработки по усовершенствованию технологии получения и пересадки зародышей (103, 95, 42,11,13).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Материал и методы исследований.

Научные исследования проведены в 1983-2000гт совместно с сотрудниками отдела трансплантации эмбрионов, отдела эндокринологии и лаборатории биохимии ВИЖа, а также в хозяйствах Московской, Тульской, Брянской, Волгоградской, Воронежской, Брестской, Волынской, Омской, Новосибирской, Херсонской, Витебской, Ярославской областей, Краснодарском крае на здоровых коровах и телках черно-пестрой, красно-степной, симментальской, голштино-фризской, швицкой, ярославской, айрширской пород. Продуктивность доноров составляла от 5 до 11 тыс. кг молока за лактацию.

В опытах использовалось 1575 коров и телок доноров, 4380 телок-реципиентов, получено 7764 зародыша, в том числе 5388 нормальных эмбрионов.

Кормление, содержание и эксплуатация животных соответствовали нормам, разработанным в ВИЖе.

Концентрацию гормонов в крови доноров и реципиентов определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов «Стерон-П-125-1», «Стерон-К-125-1», «Рио-Т-4-ПГ» института биоорганической химии, и французского набора «БВ-ЕЗТИ» фирмы 8опп ВютесНса.

Гормональное вызывание суперовуляции проводили путем введения различных гонадотропинов (ГСЖК, фоллигон, маретропин, сергон, ФСГ-п, ФСГ-с, фоллитропин) отечественного и зарубежного производства в различных дозах по усовершенствованным схемам обработок и использованием различных биологически активных препаратов, таких как фертагил, сурфагон, оксилат, миксоферон, ПДЭ, утеротоник, соматотропин. Дозы ГСЖК составляли от 2 до 3 тыс. и.е., ФСГ от 32 до 50 мг.

Влияние повторных гормональных обработок на чувствительность яичников к гонадотропинам и устойчивость органов воспроизведения к многократному нехирургическому извлечению эмбрионов оценивали на 181 донорах. Животных обрабатывали на 9-12 день цикла ФСГ-п в дозе 50мг по четырехдневной схеме. После извлечения донорам вводили простагландин в дозе 500мкг. Повторную гормональную обработку проводили не ранее чем через 2 месяца после извлечения эмбрионов, по мере нормализации величины яичников.

Осеменение доноров проводили ректоцервикальным методом замороженно-оттаянной спермой двойной дозой, трехкратно при проявлении рефлекса недвижимости.

Использовали коров разных пород от 1 до 8 лактаций, телок отбирали по генотипу и развитию.

Для оценки стимулирующего действия гонадотропинов определяли число овуляций по наличию желтых тел и неовулированных фолликулов на 6-7 день после осеменения методом ректальной пальпации.

В экспериментах по нехирургическому извлечению эмбрионов применяли 2-х и 3-х канальные катетеры. Для извлечения эмбрионов у телок использовались резиновые катетеры фирмы «Рюш», «Минитуб» и катетер собственной конструкции. Учитывалась проходимость катетера через шейку матки, объем введенной и удаленной жидкости и число извлеченных эмбрионов от числа овуляций.

Синхронизацию охоты у реципиентов проводили двукратно и однократно: анипростом, эстрофаном, эструматом, магэстрофаном. В качестве реципиентов отбирали в основном телок живой массой 360-380 кг и коров, не ранее чем через 2 месяца после отела. Пересадку проводили на 7-8 день эстрального цикла, при наличии на одном из яичников желтого тела.

Поиск эмбрионов и оценку качества проводили под инвертированным микроскопом МБС-9, Никон. Классификация найденных зародышей проводилась при 80-кратном увеличении и подразделялась в соответствии со стадией развития на ранние морулы, поздние морулы, ранние бластоцисты, бластоцисты поздние. Классификация по качеству подразделялась на 5 категорий: отличные эмбрионы, хорошие, удовлетворительные, дегенерированные и неоплодотворенные яйцеклетки.

Свежеполученные эмбрионы, предусмотренные для пересадки, заправлялись в пайэты 0.25 мл фирмы ИМВ, заряжались в катетеры «Кассу» или «Нейштат», которыми проводилось пересадка.

Криоконсервирование эмбрионов проводили двумя методами:

1. В качестве криопротектора использовали 10% раствор глицерина в культуральной среде;

2. в качестве криопротектора использовался 1.5 м раствор этиленгликоля.

Замораживание эмбрионов проводили аппаратами "Planer 204", "Minicul" и программными замораживателями Харьковского производства РП-3, РУ-6.

Оттаивание эмбрионов, замороженных с криопротектором глицерином, проводилось четырехступенчатым методом, а с этиленгликолем -одноступенчато.

В работе применены общезоотехнические методы исследований, племенные записи, материалы зоотехнического учета, а также материалы ветеринарного учета. Цифровой материал обработан по Меркурьевой Е.К. (79), Меркурьевой К.К. (80).

3.2. Вызывание суперовуляции у коров и телок доноров.

Суперовуляция - это искусственно вызванная множественная овуляция фолликулов после воздействия экзогенных гормонов, при одновременном использовании лютеолитического эффекта простагландинов.

Процесс вызывания суперовуляции состоит из следующих этапов: отбор и оценка доноров, синхронизация охоты и определение индивидуальной схемы обработки, определения вида и дозы гонадотропина, стимуляция овуляции и осеменение доноров.

Теоретические основы гормонального метода вызывания множественной овуляции разработаны еще в 30-х годах под руководством М.М. Завадовского. В этих разработках было показано, что если ввести самке гонадотропные

ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ гормоны, то это приводит к стимулированию созревания дополнительного количества фолликулов. В качестве гонадотропина использовалась сыворотка жеребых кобыл СЖК.

Все процессы регуляции размножения охватывают гонадотропин фолликулостимулирующего гормона и лютеализирующий гормон. Гонадотропины оказывают непосредственное влияние на яичники, индуцируют рост и дифференцировку фолликулов. Клетки гранулезы содержат мембранные рецепторы, для ФСГ и клеток теки, под воздействием ЛГ секретируют в эстрогены. Ко времени предовуляторного повышения уровня ЛГ, клетки гранулезы сравнительно короткий срок находятся под контролем ФСГ и эстрогенов, и клетки теки, выделяют повышенное количество андрогенов, что является главной причиной атрезии большого числа фолликулов, которые не развиваются до овуляторной стадии.

Главный фактор, обеспечивающий созревание фолликулов, это способность фолликула реагировать на повышение содержания гонадотропина возрастанием образования эстрогенов. Потеря развивающимися фолликулами чувствительности на гонадотропин прерывает его развитие. Предовуляторный пик ЛГ вызывает глубокие изменения в секреции яичниковых стероидов. Уже перед овуляцией начинается лютеинизация клеток гранулезы, и они почти полностью теряют способность выделять андрогены, синтез эстрогенов блокируется и возрастает секреция прогестерона и его производных. Образующийся преовуляторный прогестерон также участвует в процессе овуляции. При этом образуется и повышается активность протеолитических ферментов, которые размягчают и растворяют стенку фолликула.

Несмотря на разработанные теоретические и практические принципы вызывания суперовуляции, индуцирование множественной овуляции остается все еще одной из самых сложных проблем метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота.

С целью дальнейшей перспективы повышения количественных и качественных показателей суперовуляции сложились следующие направления исследовательской работы:

1. Разработка тестов отбора коров для использования под доноров эмбрионов;

2. использование в схемах гормональных обработок биологически активных веществ;

3. предварительная оптимизация числа антральных фолликулов в яичниках доноров к моменту гормональных обработок.

3.2.1. Отбор коров и телок под доноров эмбрионов.

Отбор коров-доноров - это целенаправленный выбор племенных животных, хорошо реагирующих на гормональную обработку дающих биологически полноценные эмбрионы. Основным критерием пригодности коров в качестве доноров - это ее генетическая ценность и способность передавать высокие продуктивные признаки (73).

Коров, для использования в качестве доноров, мы отбирали по следующим критериям: генетический потенциал, воспроизводительный статус, молочная продуктивность, возраст, состояние здоровья.

Эффективно влиять на генетический прогресс в стаде при трансплантации можно лишь в том случае, если продуктивность донора превышает средний надой по стаду 3 тыс. кг молока за лактацию и более. При отборе коров-доноров руководствовались комплексом селекционных признаков: породность, экстерьер, конституция, морфофункциональные свойства вымени, легкость отелов, жизнеспособность приплода. Отдавали предпочтение животным с длительным сроком использования, а среди них -коровам, имеющих высокопродуктивных дочерей и положительно оцененных по качеству потомства сыновей.

Основное условие, определяющее гормональные физиологические функции и получение полноценного приплода, - это полноценное сбалансированное кормление с учетом физиологического состояния и продуктивность животных. Особенно важно обеспечить кормление коров-доноров в периоды запуска и после отела первые 3-4 месяца, поскольку эти периоды совпадают с максимальным увеличением массы плода и наивысшей молочной продуктивностью, на что расходуется большое количество питательных веществ. Низкий уровень кормления, несбалансированность рационов по общей питательности к жизненно важным элементам ведут к нарушению обмена веществ, воспроизводительной функции и снижению качества эмбрионов.

Важнейшим критерием отбора коров под доноров является воспроизводительный статус.

После отела воспроизводительная система коров подвергается 4 стадиям изменений (81, 25).

1. Лизис желтого тела и развитие в яичнике новых фолликулов регулируется нейрогуморальными связями.

2. Изменение размеров матки до небеременного состояния сопровождается частичным разрушением мышечных, сосудистых, соединительных и других тканей матки, очень сильно разросшихся во время беременности.

3. Разрушение и последующее новообразование покровного эпителия слизистой оболочки матки и маточных трубчатых желез, что обуславливает их секреторную функцию.

4. Полное удаление из матки клеточного детрита, накопившегося в результате разрушительных процессов и, главное, исчезновение из матки микроорганизмов (оздоровление матки).

Продолжительность этих стадий варьирует от 30 до 90 дней в зависимости от благополучия отела, продуктивности, возраста.

Уменьшение размеров матки до небеременного состояния, определяемого ректальной пальпацией, не может служить гарантией к готовности получения нормальных эмбрионов. У многих коров первая овуляция происходит через 25

35 дней после отела при еще увеличенной матке и незавершенной перестройке эндометрия. Следовательно, наступление первой охоты после отела не может служить критерием готовности матки к осеменению.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лебедев, Виктор Иванович, Дубровицы

1. Авакоянц Б.М. Гистохимические исследования яичников бесплодных коров. // Ж. Ветеринария. 1976. - № 7. - с. 86-88.

2. Ажгихин И.С. Простогландины. Медицина. 1978. 201 с.

3. Амстиславский С.Я., Максимовский Л.Ф. Методы биотехнологии в практике разведения животных. Ин-т цитологии и генетики.// Новороссийск. 1991. - 170 с.

4. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Использование этиленгликоля при замораживании эмбрионов.//Научн. конф.- Киев. 1996.- с. 304-305.

5. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В. Влияние различных способов криоконсервации и деконсервации на их жизнеспособность. // Научн. конф. Аскания-Нова. - 1997. - с. 6-7.

6. Безуглый А.Д., Мауссе Ф.С. Устойчивость эмбрионов коров различных стадий развития к резкому охлаждению. // Научн-техн. бюл. ВИЖ. -1998.-№75.-с. 166-170.

7. Бойко А.Г. Зависимость результатов суперовуляции у коров доноров эмбрионов от уровня активности АЛТ плазмы крови. // Алма-Ата. сб. 1991.-с. 8-9.

8. Бойко А.Г. Разработка биохимических тестов с целью повышения эффективности отбора коров-доноров эмбрионов. // Автореферат канд. диссерт. Дубровицы. - 1992. - 24 с.

9. Бриль Э.Е. Некоторые современные вопросы гормональной регуляции воспроизводительных функций у коров. // Животноводство. 1994. - № 5. - с. 27-32.

10. Ю.Бугров А.Д. Простагландины в молочном скотоводстве. Сб. науч.трудов. // Харьков. 1995. - с. 32-44.

11. П.Бугров А. Д. Итоги и перспективы использования технологии трансплантации эмбрионов в скотоводстве. // Научн. техн. бюл. 1998. -№75.-с. 15-26.

12. Бугров А.Д., Невинный Н., Бандура А. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. // Молочн. и мясн. Скотоводство. - 1987. - № 5.- с. 56-57.

13. Будевич И.И. Итоги работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в республике Беларусь. // Киев. 2000. - с. 82-84.

14. Будевич И.И., Плешкевич И.С., Жук Н.Ф. Усовершенствованная техника нехирургического извлечения и пересадки эмбрионов у крупного рогатого скота. // Зоот. наука. Белорусь. - 1989. - т. 30. - с. 18-22.

15. Будевич И.И., Сакончик П.Е., Кононаец А.Е. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота. // Жодино. 1989. - с. 101-102.

16. Буянов A.A. Патофизиологическое обоснование новых принципов применения гормональных препаратов при функциональных расстройствах яичников у коров. Вет. обеспечение крупных животноводческих комплексов. // JI. 1982. - с. 43-44.

17. Варнавский А.Н., Горбунов В.И., Ельчанинов В.В. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Прогрессивная биотехнология репродукции животных. // Биотехн. методы в селекции. ВНИИплем. -М.- 1990.-с. 128-132.

18. Волосков П.А., Михайлов Н.И., Чистяков И.Я. Алиментарно-трофические нарушения половой функции у животных. // Ж. Ветеринария. 1964. - № 4.-с. 81-82.

19. Воронцова П., Тарадайник Т., Дронин А. Опыт трансплантации эмбрионов. // Молочное и мясное скотоводство. 1988. - № 3. - с. 19-20.

20. Гавриков A.M., Басанов Е.Р., Кинзеев В.Н. Многократное использование коров в качестве доноров эмбрионов. // Ветеринария. 1993. - № 5. - с. 3941.

21. Гавриков A.M., Кинзеев В., Мукминов М. Влияние сезона года на результаты трансплантации эмбрионов. // Молочн. и мясн. скотоводство.- 1993.-№5.-с. 19-21.

22. Гавриков A.M., Масаев У., Алексеенко А. Некоторые аспекты замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. // Животн. науки. 1989. - 26.8. - с. 66-69.

23. Гавриков A.M., Сергеев Н.И. Усовершенствование нехирургического метода извлечения эмбрионов мясного скота. // Метод, рекоменд. М. -1994.-61 с.

24. Герасименко В.Г. Биотехнология. // Киев. 1989. - 344 с.

25. Горд он А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных.// М.: Агропромиздат. 1989. - 415 с.

26. Горячев B.C., Прокофьев М.И. Влияние простагландинов на воспроизводительную функцию коров. // Тезисы докл. Боровск. - 1980. -с. 104-105.

27. Давыдов В.У. Профилактика и лечение эндокринных нарушений у коров. //Л.: Знание. 1978.-35 с.

28. Даминов Б. Трансплантация эмбрионов. Всесоюзн. совещ. Генетика разведения. // Тезисы докл. Г.1. - ч. 2. - 1990. - с. 213-214.

29. Деменцова Т.Н. Разработка способов очистки и стерилизации фильтра для поиска эмбрионов. Биотехн. методы в селекции. // М. 1990. - с. 8184.

30. Деменцова Т.Н. Взаимосвязь состояния эндометрия матки с эмбриопродуктивностью у коров-доноров. // ВНИИплем. 1992. - М. - с. 29-32.

31. Дмитриев В.Б., Лебедев А.Г., Степанов Г.С. Синхронизация эстрального цикла у телок простагландином F2a и его влияние на гормональные взаимоотношения в системе гипофиз яичники. // Бюл. ВНИИРГЖ. -1979. - вып. 37. - с. 19-24.

32. Дуранов B.C., Попов В.Г., Зотова Г.М. Гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров. // Тез. докл. конф. «Использование гормональных препаратов в жив-ве». 1991. - с. 146-147.

33. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Трансгенные млекопитающие: изучение фенотипических эффектов гена гормона роста человека, индуцированного животным. // Биотехнология. 1987. - т.З - № 3. - с. 352-357.

34. Дьяконов Е.Ф., Горячев В.В. Совершенствование нехирургического метода получения эмбрионов у доноров КРС. // Сб. научн. трудов ВНИИРГЖ. 1980. - № 30. - с. 86-92.

35. Ельчанинов В.В. Функциональная асимметрия гонад как признак нестабильности развития популяции крупного рогатого скота. // Ульяновск. 1994. - с. 30-33.

36. Зиновьева H.A., Бремм Г., Эрнст JI.K. Исследование интеграции и экспрессии генных конструкций. // Междун. симп. молек. генет. и биотехнол. С.-Петербург: Пушкин. - 1994. - с. 4-5.

37. Зиновьева H.A., Эрнст JI.K., Бреш Г. Трансгенные животные и возможности их использования. // ВИЖ. 2000.

38. Иноземцев В.П., Балковой И.И., Сочнев В.В. Уровень и частота проявления гинекологических заболеваний у коров. // Сб. Научн. Тр. ВГНКИ.-М. 1995.-с. 88-102.

39. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Росагропром. ВАСХНИЛ. - М. - 1987. - 96 с.

40. Калашников А.П. Кормление и содержание молочного скота. // Молочн. и мясн. скотоводство. 1989. - № 3. - с. 36-41.

41. Калужский В.Е., Клинский Ю.Д., Чомаев A.M. Магэстрофан новый простагландин отечественного производства. // Зоотехния. - 2000. - № 10. - с. 25-26.

42. Каня Б.Ф. Пропронол фармакология и клиника. // Варшава. - Новости ветеринарии. - № 1. - 1983. - с. 31-38.

43. Клинский Ю.Д. Проблемы эндокринологии воспроизводства с/х животных и применение гормональных препаратов в животноводстве. // Тез. докл. Всесоюз. конф. Пушкин. - 1975. - с. 5-7.

44. Клинский Ю.Д. Исследования по эндокринологии животных. // Зоотехния. 1999. - № 8. - с. 26-27.

45. Клинский Ю.Д., Даровских В.Е. Простагландины и регуляция воспроизводительных функций с/х животных. // С/х за рубежом. Сер. Животноводство. 1974. № 2. с. 23-26.

46. Клинский Ю.Д., Сторожук A.C., Титинов М.М. Синхронизация половой охоты ренофоном и анипростом. / Докл. ВАСХНИЛ. 1992. № 2. с. 38-39.

47. Коновалов Н.Г. Действие препаратов простагландина F2a на секрецию гонодальных гормонов у телок. Труды ВИЖа. Вып. 57. 1997. с. 50-51.

48. Кауффольд П., Тамм И, Шихов И.Я. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота. Агропромиздат. 1990. 56 с.

49. Кузьмина Т.И. Влияние возраста доноров ооцитов на качество эмбрионов коров, полученных in vitro. Доклады РАСХН. 1998. № 1. с. 35-36.

50. Кузьмина Т.И. и др. Влияние бычьего пролактина на морфологию ядер кумулюса ооцитов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра. Развед. и генетика. 1999. вып. 31. с. 130-132.

51. Кусаинов А.К. Эффективность нехирургического извлечения эмбрионов КРС. Алма-Ата. 1990. с. 12-13.

52. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B. Эффективность трансплантации различных групп эмбрионов. Материалы научн. конф. Жодино. 1998. с. 93-94.

53. Лебедев А.Г., Тишин В.А. Моделирование предовуляторного пика синтетическим Гн-Рг у телок. Информ: листок № 146. ЦИТИ. Л. 1989. Зс.

54. Лебедев В.И. Эффективность обработок доноров разного возраста. Бюл. научн. работ № 104. 1991. с. 15-17.

55. Лебедев В.И., Бушманов В.И. Взаимосвязь гормонального статуса доноров перед гормональной обработкой с эмбриопродуктивностью. Молочн. и мясн. скотоводство. № 1. 1993. с. 17-19.

56. Лебедев В.И., Садыков Ш.М. Влияние биохимических показателей на эмбриопродуктивность коров молочных пород. Бюл. научн. работ. 1998., вып. 57. с. 208-210.

57. Лебедева И.Ю., Кузьмина Т.И., Лебедев В.А. Динамика содержания соматотропина в фолликулярной жидкости при созревании и атрезии антральных фолликулов яичников коров. Физиол. Журн. Им. Сеченова. 1996. т. 82. № 10. с. 91-97.

58. Лебедева И.Ю., Лебедев В.А., Кузьмина Т.И. Анализ связывания пролактина и соматотропина с клетками гранулезы коров. Сб. научн. труд. ВНИИГРЖ. С.-Петербург. 1999. с. 260-265.

59. Левантин Д.Л. О некоторых структурных изменениях в развитии животноводства отдельных стран. // Зоотехния. 1995. - № 9. - с. 27-31.

60. Левантин Д.Л. Некоторые проблемы развития скотоводства в России. // Молочное и мясное скотоводство. 1997. № 6. - с. 2-4.

61. Левантин Д.Л. Структурные изменения по использованию пород в скотоводстве. // Молочное и мясное скотоводство. 2001. - № 1.-е. 2-6.

62. Леткевич О. Эффективность использования простагландина при синхронизации охоты у телок. // Тезисы докл. конф. Минск. 1980. 4.1. с. 24-25.

63. Лиепа Л.Л. Важнейшие факторы, влияющие на приживляемость эмбрионов у телок-реципиентов. Тез. докл. конф. «Использование горм. препар. в жив-ве». -М. 1991.-е. 116-117.

64. Мадисон В.В., Мадисон В.Л. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. М.: Агропромиздат. 1988. - 128 с.

65. Мадисон В.Л. Результаты исследований по трансплантации эмбрионов и внедрения метода в практику воспроизводства высокопродуктивного молочного скота. Бюл. науч. работ. ВНИИЖ. 1991. - № 104ю - с. 7-11.

66. Мадисон В.Л., Лебедев В.И., Мадисон В.В., Дронин А.П., Назаров E.H. Методические рекомендации по отбору и использованию высокопродуктивных коров-доноров. Дубровицы. 1993. - 26с.

67. Мадисон В. Синхронизация охоты крупного рогатого скота препаратами nTF2a. Молочное и мясное скотоводство. 2000. - № 7. - с. 9-14.

68. Мазепкин С.А., Федюшкин А.Ф., Сукачева Л.П. Замораживание эмбрионов КРС. Тезисы докл. Дубровицы. 1990. - с. 59-60.

69. Малиновская В.А., Кувшинова B.C., Ситниченко Н.В. Получение эмбрионов от коров-доноров в племенном хозяйстве. // Биотехн. мет. селекции. М. 1990. - с. 43-48.

70. Малиновская В.А., Малиновский A.M. О продолжительности хранения эмбрионов в глубокозамороженном состоянии. Тез. докл. Быково. 1997. -с. 60-61.

71. Мальцева M.B. Транспортировка эмбрионов и сроки хранения в жидком азоте. Зоотехния. - 1990. - № 1.-е. 62-63.

72. Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных. М.: Колос. 1970. - 218 с.

73. Меркурьева К.К., Шагин-Березовский Д.Л. Генетика с основами биометрии. М.: Колос. 1983. - 400 с.

74. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственного осеменения животных. М.: Сельхозиздат. - 1962. - 696 с.

75. Митюков М.И., Степанов Г.С. Общие представления об эндокринных железах и гормонах. / Физиология эндокринной системы. Л. - 1979. - с. 3-29.

76. Нежданов А.Г., Соловьев H.A. Гормональная функция яичников в течении полового цикла. Ж. Ветеринария. 1986. - № 6. - с. 56-58.

77. Павлов В.А. Простагландины и перспективы их применения в животноводстве. Обзорн. информ. ВНИИТЭКС. М. - 1977. - 65 с.

78. Передера К.Б., Передера С.Б. Профилактика инфекционных болезней при трансплантации эмбрионов. Научн. техн. бюл. Харьков. - 1990. -ВНИИЖ лесостепи и полесье. - № 56. - с. 51-54.

79. Петросян С.А., Короханян С.Г., Данилов М.А. Морфологические и гистохимические изменения в яичнике бесплодных коров. Ж. Ветеринария. - 1976. - № 6. - с. 76-79.

80. Печкарев В.Н. Динамика ЛГ, ФСГ и прогестерона у коров после применения супергестерона. Акт. пробл. вет. мед. Троицк. - 1999. - с. 78.

81. Печкарев В.Н., Авдеенко B.C. Изучение биотехнологического действия синтетического РГ на секрецию ЛГ и ФСГ у телок после овариоэктомии. Воронеж. - 1999. - с. 126-127.

82. Полянцев Н.И. Применение биорегуляторов половой функции коров. -Зоотехния. 1999. - № 6. - с. 29-30.

83. Попов H.A., Ескин Г.В. Аллелофонд пород крупного рогатого скота по E.A.B. локусу. - М. - 2000. - 136 с.

84. Попов H.A., Иванов В.А. Пути разведения крупного рогатого скота молочноплеменных пород с использованием аллелей групп крови. -Дубровицы. 1999. - 65 с.

85. Попов Н.Ф. Профилактика бесплодия коров на молочном комплексе. -Ветеринария. 1981. - № 6. - с. 50-51.

86. Прокофьев М.И. Регуляция воспроизводительной способности у самок КРС. Тез. докл. конф. «Физиол. и биохим. Основы высокой продуктивности». - Боровск. - 1980. - с. 99-100.

87. Прокофьев М.И., Рябых В.П. и др. Вызывание суперовуляции у крупного рогатого скота с целью получения зародышей для трансплантации. В кн. эндокринология и трансплантация зигот с/х животных. М. 1982. - с. 42-53.

88. Прокофьев М.И. Регуляция размножения с/х животных. М.: Колос, - 1983.-255 с.

89. Прокофьев М.И., Белевич и др. Технология нехирургической трансплантации крупного рогатого скота. Животноводство 1982. - № 2. -с. 50-54.

90. Прокофьев М.И. Перспективы использования биотехнологии в животноводстве. // Зоотехния. 1999. - № 4. - с. 2-7.

91. Радченков В.П. О нейроэндокринной регуляции функций организма. // Гормоны в животноводстве. М. 1987. - с. 23-31.

92. Раулушкевич С., Дейнека Ю. Влияние блокировки (3-адренергического рецептора на инволюцию матки после родов. Варшава.- Новости Ветеринарии. 1989. - № 2. - с. 71-75.

93. Решетникова Н.М. Фолликулогенез крупного рогатого скота при гормональной регуляции с различными формами нарушений воспроизводительной функции. М. - 1989. - Сб. трудов ВНИИплем. - с. 73-84.

94. Решетникова Н.М., Рябых В.П., Кувшинова B.C. Взаимосвязь реакции суперовуляции у коров с гормональным уровнем. М. - Биол. воспроиз. - 1992. - с. 25-28.

95. Решетникова Н.М., Мороз Т.А., Малиновский A.M. Влияние трофобластического белка на выживаемость эмбрионов крупного рогатого скота. Труды ВИЖа. 1997. - Вып. 58. - с. 95-96.

96. Розен В.Б. Основы эндокринологии. М.: Высшая школа. - 1980. -343 с.

97. Рыльский Е.Х., Миронский В.Е. Сравнительная оценка уровня суперовуляции и качества зародышей при стимулированной и спонтанной охоте коров-доноров. Сб. научн. обеспеч. жив-ва Молдавии.- Кишинев. 1989. - с. 12-13.

98. Савченко О.Н. Половые железы. // Физиология эндокринной системы.-Л. 1979.-с. 341-371.

99. Савченко О.Н., Степанов Г.С. Гормональная регуляция функции половых желез. / Гормоны в животноводстве. М. - 1977. - с. 34-51.

100. Сальникова И.М. Эффективность пересадки свежеполученных и замороженно-оттаянных эмбрионов. Бюл. научн. работ. ВИЖ. - 1988. -Вып. 89.-с. 32-33.

101. Самоделкин А.Д., Дряглов В., Гавриков А. Усовершенствование режимов замораживания эмбрионов мясных коров. Молочн. и мясн. скотоводство. - 1997. - № 5. - с. 6-8.

102. Свитоюс А.Г. Уровень суперовуляции и качество эмбрионов в зависимости от концентрации прогестерона и иммуноглолулина в крови коров перед гормональной обработкой. Бюл. научн. работ. Вып. 104. -1991.-с. 55-60.

103. Середин В. А. О желтом теле, его персистентности и оплодотворяемости. Вестник ветеринарии. № 9. - 1998. - с. 72-86.

104. Сергеев Н.И., Никоян П.Е. Устройство для извлечения эмбрионов животных. Авторское свидетельство А 61. Д. 7/02. 1983. - № 30.

105. Сергеев Н.И. Новый метод воспроизводства высокопродуктивных животных. // Новое в животноводстве. 1985. - с. 87-101.

106. Сергеев Н.И., Гавриков A.M. Симпозиум по трансплантации. // Животноводство. 1986. - № 4. - с. 62.

107. Сергеев Н.И. Факторы, влияющие на эффективность нехирургической пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Бюл. научн. работ. ВИЖ. 1987. - Вып. 87. - с. 34-37.

108. Сергеев Н.И. Применение трансплантации эмбрионов в программах разведения и селекции крупного рогатого скота. // Бюл. научн. работ. -1988.-Вып. 89.-с. 3-6.

109. Сергеев Н.И., Гавриков A.M., Дронин А.П. Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота. Науч. труды ВИЖа. Вып. 57. 1988. -ч.З-с. 198-202.

110. Сергеев Н.И., Мадисон B.JL, Лебедев В.И. Методические рекомендации по многократному использованию коров в качестведоноров эмбрионов для трансплантации. Дубровицы. - ВИЖ. - 1988. -16 с.

111. Сергеев Н.И., Мадисон В. Л., Лебедев В.И. Методические рекомендации по синхронизации охоты коров-доноров и телок-реципиентов. Дубровицы. ВИЖ. - 1989. - 15 с.

112. Сковородин E.H. Прижизненное морфологическое исследование персистентного желтого тела. Вестник ветеринарии. 1999. - № 9. - с. 5255.

113. Смирнов O.K., Сергеев Н.И. Научные проблемы и пути внедрения трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Вестник с/х науки. -1980.-№ 11.-с. 73-83.

114. Смирнов O.K., Сергеев Н.И. Состояние и перспективы исследований по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве и овцеводстве. Дубровицы. - 1985. - с. 3-6.

115. Смолянинов Б.В. Вызывание множественной овуляции у коров при трансплантации эмбрионов. Науч. техн. бюл. Укр. НИИФИБ. 1989. -Вып. 2-е. 3-11.

116. Смолянинов Б.В., Бучко A.M., Кобулей Д.Э. и др. Индукция полиовуляции у коров при трансплантации. Боровск. — 1990. ч.2 - с. 134-135.

117. Советкин C.B., Назаров Е.А., Романенко Э Е. И др. Эффективность санирующих препаратов при трансплантации эмбрионов с/х животных. Тез. конф. М. 1991. - с. 241-243.

118. Соколовская И.И. Проблемы оплодотворения сельскохозяйственных животных. М.: Советская наука. - 1957. - с. 220229.

119. Соколовская И.И. Простагландины: свойства, значение, перспективы изучения и использования. Вестн. с/х науки. 1976. - № 4. -с. 71-81.

120. Соколовская И.И. Иммунорегуляция воспроизводительных процессов. Труды ВИЖа. 1997. вып. 58. - с. 75-76.

121. Соколовская И.И., Милованов В.К. Иммунология воспроизведения животных. М.: Колос. 1981. - 264 с.

122. Степанов Г.С., Дмитриев В.Б., Дьяконов Е.Ф. и др. / Гормоны в животноводстве. М.: Колос. 1997. - с. 58-66.

123. Стрекозов Н.И., Комаров Л.Л. Развитие рынка молока и молочных продуктов в России. // Зоотехния. 2001. - с. 2-5.

124. Техвер Ю.Т. Гистология эндокринных желез домашних животных. Тарту. 1972.-196 с.

125. Тяпугин Е.А., Хилькевич С.Н. Роль трансплантации эмбрионов в селекционной работе. // Молочное и мясное скотоводство. 1994. - № 4. -с. 8-11.

126. Тяпугин Е.А., Хилькевич С.Н. Восстановление репродуктивной функции у коров. // Ветеринария. 1994. - 1994. - № 6. - с. 28-32.

127. Тяпугин Е.А., Хилькевич С.Н. Стимулирование овариальной активности в послеродовой период. / Зоотехния. 1998. - № 7. - с. 24-26.

128. Хабибулин И., Васильева Е., Хорошев Е. Устройство для вымывания эмбрионов. Молочное и мясное скотоводство. 1988. - № 4. -с. 15-17.

129. Хилькевич С.Н., Тяпугин Е.А., Каниев В.Ф. и др. Избранные проблемы биотехнологии размножения. // Зоотехния. 1996. - № 3. - с. 26-28.

130. Хмельков В.Н., Невинный H.A. Приживляемость эмбрионов в зависимости от их качества и состояния желтого тела у реципиента. Тез. докл. конф. Применение биотехнологии в жив-ве. М. — 1988. - с. 45-47.

131. Хусеница Д., Вайда Р., Молняр JI. и др. К диагностике гибели эмбрионов коров. С/х биология. 1989. - № 2. - с. 104-107.

132. Черекаев A.B., Стрекозов Н.И., Погодаев С.Ф., Легошин Т.П., Чинаров И.И., Комаров Л.Л., Щеглов В.В. Перспективы развития скотоводства России. // Зоотехния. 2001. - № 3. - с. 2-3.

133. Черемисимов А.Г. Структурно-функциональные особенности яичников животных в норме и паталогии и профилактике болезней с/х животных. Всерос. конф.- Воронеж. 1993. - с. 96-97.

134. Шипилов B.C. Предупреждение бесплодия коров. Степные просторы. - 1974. - № 12. - с. 25-26.

135. Шириева Р.Б. и др. О регуляторных механизмах развития фолликулов и овуляции у крупного рогатого скота. Сельхоз. биология. -№2.-2001.-с. 56-59.

136. Шихов И.Я., Сергееев Н.И. Морфологическая оценка ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Арх. Анат. Гист. Эмбриол. 1981. -№ 11.-с. 96-102.

137. Шихов И.Я., Сергеев Н.И. Оценка качества яиц крупного рогатого скота при трансплантации. Архив экспер. вет. мед. Лейпциг. - 1982. -36.-№ 1. — с. 89-93.

138. Эрнст Л.К. Итоги и перспективы дельнейших исследований по трансплантации зародышей у крупного рогатого скота. // Эндокринология и трансплантация зигот с/х животных. М. - 1982. - с. 3-15.

139. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Бахидов К.И. и др. Индивидуальная реакция яичников при индуцировании суперовуляции. Докл. ВАСХНИЛ. 1984.-№6.-с. 22-24.

140. Эрнст Л.К. Перспективы применения биотехнологии в животноводстве. // Междун. с/х журнал. 1987. - № 5. - с. 87-91.

141. Эрнст JI.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов с/х животных.- M.: Агропромиздат. 1989. - 304 с.

142. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Семенова В.А. и др. Фенотипический эффект по гену гормона роста крупного рогатого скота. Доклады ВАСХНИЛ. 1990. - № 6. - с. 32-36.

143. Эрнст Л.К. Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. // С/х биология. 1993. -№ 2.-е. 3-14.

144. Эрнст Л.К., Некрасов А.А., Зиновьева Н.А. т др. Некоторые особенности трансгенных животных. Межд. симп. молек. генет. и биотехнол. Пушкин. - 1994. - с. 3-4.

145. Эрнст Л.К. Животноводство XXI век. // Новое в животноводстве.- Информ. бюл. ВИЖ. - 1998. - № 1(01) - с. 6-7.

146. Эрнст Л.К. Проблемы взаимодействия между генотипом и фенотипом у трансгенных с/х животных. // С/х биология. 2001. - № 2. -с. 3-9.

147. Ярных Е.В. Оценка физиологического состояния яйцеклеток и ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Ж. Ветеринария. - 1985. -№ 8. - с. 59-60.

148. Avery T.L., Fahnung M.L. Investigations associated with the transplantation of bovine ova. // Superovulation. J. Reprod. Fert. № 3, 1962, p. 212-217.

149. Ayalon N., Shemesh M. Pro-oastrus surge plasma progesterone in the cow. // J. Reprod. Fest. 1974, № 1, p. 238-243.

150. Baker A.A. Ovum transfer in the cows. Aust. 1973 J. Vet. № 49, p. 424426.

151. Baker R.D., Coggis E. Control of ovulation rate and fortification in prepuberal giets. J. Anim. Sci. 1968 № 27, p. 1607-1610.

152. Bellows K.H., Short R.F. Superovulation and multiple births in beef cattle. Anim. Reprod. 1982, № 34.1, p. 67-79.

153. Bennett J.P., Rowson L.E. The use of radioactive eggs in studies of egg transfer and transport in the female reproductive tract. Proc. 4 Congr. Anim. Repr. 1962, №2, p. 360-366.

154. Betterige K.J., Mitchell D. Embryotransfer in farm animals. Canada Depart. Agric. Monograph. 1977, 160 p.

155. Betterige K.J., Randal G.C., Mitchell D. Collection description and transfer of embryos from cattle. J. Reprod and Fert. 1980. 59. № 1, p. 101-107.

156. Bindon B.M., Roberts E.M. Control of ovarian activity in ewes with progestagens. J. Reprod. Fert. 1964, №. 7, p. 307-399.

157. Bilton R.J. Preservation of embryos of the large domestic species. ? Int. Congr. Anim. Reprod. Madrid. 1987, №. 2, p. 245-253.

158. Bilton R.J., Moore N. Effects of ice seeding and of freezing and thawing rate on the development of cattle embryos stored at -196°C. Theriogenelogy. 1989, p. 6-35.

159. Boland M.P., Crosby T.F., Gordon J. Induction of twin pregnancy in heifers using a simple non-surgical technique. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem Krakow. 1986, № 3, p. 241-243.

160. Booth W.D., Newcomb R. e.a. Plasma oestrogen and progesterone in relation to superovulation and egg recovery in the cow. Vet. Res. 1975, №. 97, p. 366-369.

161. Brand A., Akabwai D. Some aspects of non-surgical embryotransfer in cattle. Veter. Sc. Comm. 1977. №. 2, p. 23-37.

162. Brand A., Drost M. Embryo collection by non-surgical methods. Ottawa. 1976, p. 16-19.

163. Brand A., Gunning J.W., Drost M. Non-surgical embryotransfer in cattle. Luxemburg. 1978,p. 41-56.

164. Brem G., Krausslich H. Tierzuchterische Möglichkeiten des Embriostransfere. / Tierzuchter. 1996. № 9. s. 374-375.

165. Brinkley HJ., Hordon H.W. Is ovulation alone sufficient to cows formation of corpora lutea Endocrinology. 1964, № 74, P. 14-20.

166. Casida L.E. Prepuberal development of the pig ovary and relation to stimulation with gonadotropine hormones. J. Dairy. Sc. 1961, № 44, p. 23232329.

167. Christian R.E., Casida L.E. The effects of progesterone in altering the estrons cycle of the cow. J. Anim. Sc. 1948, № 7, p. 540-545.

168. Chupin D. Practische Anwendungen des Embriotransfers bei Rindern. Eleckvieh. 1986, № 3, s. 26-35.

169. Chupin D., Saumande J. New attempts to decrease the variability of ovarian response to PMSG in cattle. Anim. Biol. Siochim. 1979 № 5, p. 14891498.

170. Church R.B., Shea B.F. Some aspects of bovine embryotransfer. In.: Egg transfer in cattle. Seminar, Cambrige. 1976, p. 73-76.

171. Coldwell B.V. et al. Immunological methods in steroid determinations. New York Appeton. Century Crafts. 1970, 331 p.

172. Cole H.H., Hart G., Finkel J. Biological half-life of endogenous PMS following hysterectomy and studies on losses in urine and milk. Endocrinology. 1986, № 81, p. 927-930.

173. Critser J.K., Junsett F., Rowe R.F. Feminity in cattle and superovulatory response. Theriogenology. 1979: 11, № 1, 94 p.

174. Cummug J.A., Lawson R.A.S. Prostoglandins a world spelling revolution animal breeding. // J. Agr. (Victoria) 1993, № 10, p. 348-352.

175. Deriveane J., Ector F. Apercusur progestagenes et la sinchronisation de loestrus. Anim. Med. Vet. 1966. 110 № 4, p. 231-265.

176. Dhonalt D., Bouters R. Eitransplantatie and control of superovulation in bovine with a PMSG. Theriogenology. 1977, p. 529-534.

177. Dhonalt D., Bouters R. e.a. The control of superovulation in the bovine with a PMSG-Antiserum. // Theriogen. 1978, № 9, p. 318-324.

178. Diekman M.A., Malven R. Effect of ovariectomy and estradiol on LH patterns in ewes. J. Anim. Sc. 1998. № 37, p. 562-567.

179. Donaldson L.E. Effect of buteinizing hormone and embryo production n superovulation cows. Vet. Rec. 1985. № 117.9, p. 489-491.

180. Donaldson L.E. Effect buteinizing hormone and embryo production in superovulation cows. J. Veterin. Record. 1986, № 119, p. 625-626.

181. Donaldson L.E., Hansel W., Van Vleek L.D./ Luteotropic or luteinising hormone and nature of oxytocin-induced luteal inhibition in cattle. J. Dairy Sc. 1965. №48, p. 331-338.

182. Dowling D.F. Problems of the transplantation of fertilized ova. J. Agric. Sc. Camb 1997. № 39, p. 374-377.

183. Downeu B.P., Conlon P.D., Baker R.D./ Controlled farrowing program using a prostaglandin analogue. Canad. Sc. 1980, № 56, p. 655-659.

184. Edwards M. J. Observation or the anatomy of the reproductive organs of cows. / № 6 Veter. J. 1965, № 2, p. 25-27.

185. Egerszegi I. Comparison of follicular development and oocyte maturation in Mangalica and Landrace gilts. 17 th meeting of the Europ. Embryo Transfer Association. 2001.

186. Elsden R.P. Embryo transfer element for a prospective animal in cattle./ Irish. Vet. News. 1985, Dec., p. 37-43.

187. Elsden R.P., Hasler J.F., Seidel G.E. Non-surgical recovery of bovine eggs. Theriogenology. 1978, № 6, p. 523-532.

188. Elsden R.P., Lewis S. e.a. Superovulation in the cow following treatment with PMSG and prostaglandin F2a. J. Reprod. Fert. 1974, № 36, p. 455-456.

189. Elsden R.P., Nelson L., Seidel G. Superovulating cows with follicle stimulating hormone and pregnant more serum gonadotropin. Theriogenelogy. 1978, №9, p. 17-26.

190. Evans J., Hesseltine G. Standing napalumbar approach for surgical embryo transfer in cattle. Theriogenology 11, № 1, p. 31-47.

191. Fairelough R.J., Smith J.F.- Prolongation of the oestrus cycle in cows and ewes after passive immunization with PGF antibodies. // J. Reprod. Fert. 1991. 62. № 1, p. 213-219.

192. Flechon J., Heuman Y., Ozil J. Blastographie. Du development precore de l'embryon bovine superovule. Elevage et Insemination 178. 1980, p. 408421.

193. Folly S.C., Malpress F.H. The response of the bovine ovary to pregnant mares serum and horse pitnitary extract. Proc. Roy. Soc. London. 13. 1974, p. 132-164.

194. Foote R. The research for reproduction physiology of dairy cattle and management the last success and the future prognosis. // J. Dairy Sei. - 1996. - № 79. p. 980-990.

195. Foote R., Allen S., Heuderson B. Buserelin in a superovulatory regiment for Holstein cows. // Yield and quality of embryos in commercial herds. // Theriogenology. 1989. - № 31. - p. 385-392.

196. Ginther O.J. Internal regulation of physiological processes through local venoarterial pathways. // J. Anim. Sei. 1974. 39. № 3, p. 550-564.

197. Gordon A. Controlled breeding in farm animals. Pergamon Press. Oxford. 1983.415 p.

198. Graham E.F. Ova transfer. Proc. Sth Tech. Conf. Chicago. 1974. Feb. 1516, p. 21-28.

199. Greve T. Bovine egg transplantation, superovulation, non-surgical recoveries and transfers. Nord. Veter. Med. 1980. bd 32, № 2, p. 513-522.

200. Greve T. Embryo transplantation in cattle. Non-surgical recovery of embryos from repeat breeders. Act. Veter. Scand. 1993, № 21, p. 26-33.

201. Greve T. / Nord. Vet. Med. 1983. 35.1 p. 408-412.

202. Greve T. Non-surgical egg transfer in the cow. Theriogenology. 1987. 27 №1. p. 139-168.

203. Greve T. "Rendez-vous" in the oviduct: implications for Superovulationthand embryo transfer. 17 Sei. Meeting of the European Embryo Transferassociation. Lyon. 2001.

204. Greve T. Lehn-Jensen H. Fertility of high-yielding dairy-cows following superovulation and non-surgical recovery of embryo. Theriogenology. 1978. v. 9. № 4. p. 353-362.

205. Greve T. Lehn-Jensen H., Rasbech N. Embryo transplantation in cattle. Act. Veter. Scand. 1979. № 20. p. 135-144.

206. Guthrie H.D. Fertility after estrous cycle control using gonadotropin and prostaglandin F2a treatment of cows. J. Anom. Sei. 1979 № 49. p. 158-162.

207. Hafez E.S.E., Sugie. Gordon J. Superovulation and related phenomina in the beef cow. Superovulatory responses following PMS and FSH injection. J. Reprod. Fertil. 1963. № 5. p. 359-379.

208. Hahn J. Die unblutige Eigewinnung beim Rind unter Bereichsichtigung der Vorbereitung der Spendertiere und der Entwicklug der Eizellen im Eileiter Gebirmutter. Dtsch. Tierarztl. Wochenseha. 1978. 85. p. 140-145.

209. Hahn J. Embryo transfer beim Rind-dezzeitingez Stand und Ausblick. Dt. Tierarztl. 1990. H.6. s. 258-263.

210. Hahn J. Erwartunger, Möglichkeiten und Ergebniss der modernen Biotechnologie in der Fortpflanzung. // Mn. Veter. Med. 1993. Jq. 46. h. 21. s. 731-734.

211. Hahn J., Hahn R. Experiences with non-surgical transfer techniques. // In: Egg transfer in cattle. / Ed. Luxemburg. 1976. p. 199-204.

212. Hahn J., Hahn R., Gorlach A. Uber die Entwicklung und Benerteilung von Rinderembrionen, gewonnen aus superovulinten Spendertieren. Dtsch. Tierarztl. 1983. 10. s. 385-457.

213. Hahn J., Hahn R., Loder H. Successful non-surgical transfer of ova in cattle. Dtsch. Tieraerztl. Wocen. 1985. № 82. p. 429-431.

214. Hahn J., Schreider G. Effect of the donor on egg quality and transfer. Results. Boil. Anim. Biochim. 1979. 19. № 5. p. 1613-1617.

215. Hahn J., Schusler R. Embryo-transfer-Luchtprogramm Regensburg. Luchtwahl Resam. 1978. № 87. p. 1-5.

216. Halley S.m., Rhodes R.C., Randel R.D. e.a. Successful superovulation, non-surgical collection and transfer of embryos from Brahman cows. Theriogenelogy. 1979. v. 12. № 2. p. 97-108.

217. Hammond J. Problems concerning the transplantation of fertilized ova or "artificial pregnancy". Ann. Fac. Med. Montevideo. 1950. 35. p. 810-815.

218. Hammond D.R. The effect of pregnant mare serum gonadotropin (PMS) on ovarian function of beef heifers, as influenced by progestine, plane of nutrition and fasting. Austria. J. Argic. Re. 1970. 21. p. 153.

219. Hardin D., Randel W. Cloprostenol and effects on corpore lutea and serum progesterone in barman cows. / Tehas: Agr. Exper. Stst. 1992/ 3916. p. 23-25.

220. Hare W. Cattle twinning by egg in cattle. Can. Vet. J. 1986. № 7. p. 3755.

221. Hare W. Design and analysis of researcg on infectious disease transmission by embryos. // Theriogenology. 1990. - № 33. - p. 51-58.

222. Hasler J. / Theriogenology. 1987. 27.1. p. 139-168.

223. Hasler J.F., Bowen R.A., Nelson L.D., Seidel G. Serum progesterone concentrations in cows receiving embryo transfers. J. Reprod. Fert. 1980. 58. p. 71-77.

224. Hasler J.F., Hurtgen P.J. Influence of time of exposure to glycerol or ethylene glycol on the survival of frozen thawed bovine embryos. 1996. Theriogenology. № 45. p. 172-173.

225. Heaznschaw H., Restall B.J. Synchronisation of oestrus in cattle, sheep and goats using a prostaglandin analogue. Proc. Austral. Loc. Anim. Prod. 1994. № 10. p. 242-245.

226. Heuman G., Renard J. Production jumeaux par transplantation d'embrions cher les bovine de race a viandre. Anim. Vet. Med. 1978. +122. № 3. p. 157-163.

227. Henricks D.M., Rawlings N. Use of prostaglandin F2a to induce parturition in beef heifers. J. Anim. Sci. 1977. № 44. p. 438-441.

228. Hill C.B., Gimener T., Ellicott A. Ovulation in cows after PG F2a and PMSG treatment. J. Anim. Sei. 1976. № 46. p. 289-295.

229. Hill J., Lamond D., Henricks D. Estrus and ovulation in PG F2a FSH treated heifers. J. Anim. Sei. 1970. № 37. p. 315-321.

230. Hixon J.E., Hansel W. Evidence for preterencial transfer of PG F2a to the ovarion artery following intrauterine administration in cattle. // Biol. Reprod. 1994. 11. № 5. p. 543-552.

231. Hoffman B., Schams D., Bopp K. / Luteotropic factors in the cow: evidence for LH rather than prodactin. / J. Reprod. Fert. 1974. 40. № 1. p. 77-85.

232. Hofliger H. Das ovar des Rinder inden verschiedenen Lebensperioden unter besonders Berücksichtigung seiner funktionellen Feinstruktur. / Verl. S. Kander. Basel. 1948. p. 4.

233. Holler W. Die Ovulation beim Rind-Klinizche und Loboratoriumsdiag-nesen Moglich-Keiten der Einflussnahme. / Wein. Tierarztl. Mschr. 1992. 69. № 189. p. 245-250.

234. Holson W.C., Hansel W. Plasmas LH levels after ariectom corpus luteum removal and estradiol administration in cattle. / Endocrinology. 1972. 91. p. 185-190.

235. Holy L. Plantassig Zwilligsproduktion unter Nutzing des embriotramsfers beim Rind . Veterarst. 1984. 34.8.

236. Hunter R.H. Physiology and Technology of Reproduction in Female Domestic Animals. Academic Press. London. 1980. 320p.

237. Ishida T., Sakai Y. Criopreservation of bovine embryos in the medium with glycerol (1.4M) a suerose. / Japan J. Anim. Reprod. 1989. V. 35. № 3. p. 125-129.

238. Janeson H.E., Ojeda S.P., Milann S.M. Hypotalamic areas involved in prostaglandin induced gonadotropin release. Endocr. 1997. № 100. p. 15851595.

239. Janina H., Hansell W. Extraction and partial purification luteolitic Activity from Bovine Endemetrial Tissue. // Endocrinology. 1980. № 1. p. 261-270.

240. Janowitz U., Gorlach A. Durchbruch beim Auftamen von Embryonen. Tierzucht. 1994. 46. s. 24-25.

241. Kanagava H. One to two day preservation of bovine embryos. Japan. J. Veterin. Res. 1980. v. 28. № 1. p. 1-6.

242. Kauffold P., Alm H., Rommel P. Beitrage zuden Litologischen Gruntlagen der Eitranssplantation: Untersuchungen zur Zwischenalifbewarung und Kultiteirung befruchteter Eizellen fom Rind. Arch. Exper. Vet. Med. 1992. 32. s. 77-87.

243. Kazymowski T., Kotwica J. e. a. Luteal function in cows after inilateral infusian of PG F2a into the arterior uterine cycle. // J. Reprod. Fert. 1978. 54. p. 21-27.

244. Kummer V., Holook V., Vernin Z. Superovulation in cattle. Theriogenology. 1989. v. 14. № 5. p. 383-390.

245. Kummer V., Zrali Z. e. a. Superovulation in cattle. Effect of goat anti-PMSG seruserum. Theriogonology. 1997. v. 14. p. 383-390.

246. Kuzmina T., Lebedeva J. Schneider F. Somatotropin does not effect bovine granulöse cell luteinisation in vitro. Biotech. Agron. Envir. 1998. v. 2. p. 65-66.

247. Lamond D. The effect of pregnant mare serum dotropin (PMS) on ovarian function of beef heifers, as influenced by progestine, plan of nutrition and fasting. Aust. J. Agric. Res., 1980, 21, p. 153.

248. Lamond D.K. Hormonal induction of multiple ovulation in the bovine. J. Anim. Sei. 1992. 34. p. 901-903.

249. Laprise A. Le premier veau-eprouvette canadien Agriculture. Quebec. 1986. vol. 43. №2. p. 5-6.

250. Laster D.B. Disappearance and uptake of FSH in the rat, rabbit, ewe and cow. J. Reprod. Fert. 1992. v. 30. p. 407-415.

251. Lehn-Jensen H. Survival of cow blastocysts utilizing short freezing curves. / Nord. Vet. Med. 1981. 33. p. 523-529.

252. Lehn-Jensen H., Greve T. Deep freezing of cattle embryos utilizing different freezing curves cryoprotectors. Cong. Anim. Reprod. 1982. v. 5. p. 631-635.

253. Lenoir T., Lesive R. e. a. Pratique du transfert d'embryos de bovines. Bulletin des recherches agronomique gemblux. 1998. 13 (2). P. 149-160.

254. Lindell J.O. Post-partum release of prostaglandin F2a and uterine involution in the cow. // Theriogenology. 1989. 17. № 3. p. 237-245.

255. Lindell J.O. Effect of hysterectomy on the post-partum prostaglandin levels in the cow. / Act. Vet. Scand. 1982. 23. № 1. p. 144-146.

256. Lindner G.M., Wright J.R. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20. 1983. p. 407-416.

257. Looney C.R., Broek D.M., Funk D.J. Field experiences with bovine embryos frozen-thawed in etilene glycol. Theriogenology. 1996. 45. p. 170143.

258. Lonergan P. Factors influencing oocyte and embryo quality in cattle. 17th Sei. Meeting of the European embryo Transfer Association. Lyon. 2001.

259. Lovis T.M., Hafs U.D. Control of ovulation fertility and endocrine response after prostaglandin F2a in cattle. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1973. 143. № 1. p. 152-155.

260. Lovis T.M., Hafs U.D. Control of ovulation fertility and endocrine response after proctaglandin F2a in cattle. // An.: Biol. Bioch. 1975. 15. № 2. p. 407-417.

261. Marsch J.M., Lemaire W.S. The role cyclic AMP and prostaglandins in the action of luteinizing hormone. / Ganadotropins and gonadal function. Ed. Bi. Mkougdal. N.R. 1994. p. 376-390.

262. Martinez A.G., Matrovic M., Pessi H. Criopreservation of bovine embryos: slow and vitrification. Theriogenology. 1996. v. 45. № 1. p. 137-144.

263. Massipp A., Escors F., Coster R. Deep freezing of cattle in glass ampules on French straws. Therigenology. 1979. 12. p. 79-84.

264. Maxwell D.P., Massey J.M. Timing of ovulations in the superovulated bovine. Theriogenology. 1978. № 9. p. 99-103.

265. Maxwell D., Massey J., Kroemer D. Timing of ovulation in the superovulated bovine. Theriogenology. 1978. № 9. p. 97-108.

266. Medus C.A., Singh E.J. Embryo transfer as a means of controlling the transmission of ovarial infections. Theriogenology. 1991. v. 35. № 2. p. 435441.

267. Menget H. Die Anwendung biotechnischez verfahren in der Schafzucht der DDR. / Tierzucht. 186. 40. № 3. p. 136-138.

268. Moore N.W. The use prostaglandin F2oc ginen either intrauterine infusion of intramuscular injection for the control of oestrus and ovulation in cattle. An. Biol. Anim. Biochim. 1975. v. 15. p. 451-460.

269. Mourrause C., Matton P., Dufour J. Effects of feeding regines on ovariation foblicular population in heifers. J. Anim. Sei. 1990. 51. p. 302303. f

270. Narinder K., Bachbaus R. e.a. Effect of prostaglandin F2a themselves and estrumata on plasma progesterone levels in water buffaloes. // Theriogenology. 1980. № 4. p. 297-303.

271. Nelson L., Elsden R., Seidel E. Effect of synchrony between estrous cycles of donors and recipients on pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 1982. v. 17. № l.p. 101-109.

272. Nelson L.D., Seidel G.E., Elsden R.P. Superovulation of cows using follicle stimulating hormone prostaglandin F2a. Theriogenology. 1979. 11. № 1 p.104-112.

273. Nelson L., Seidel G., Elsden R.P. Superovulation of cows using follicle stimulating hormone and embryo transfer its uses and recent developments. Vet. Ree. 1985. p. 624-629.

274. Nett T.M., Niswerider G.D. Luteal blood flow and receptors for LH during PG F2a during early pregnancy. // Act. Vet. 1991. 77. p. 117-130.

275. Newcomb R. Fundamental aspects of ovum transfer in cattle. Vet. Ree. 1976. 99. №3. p. 40-44.

276. Newcomb A., Christie W., Rowsen L.E. Comparison of the fetal survival rate in heifers after the transfer of an embryo surgically to one uterine surgically and non-surgically to the other. J. Reprod. And Fert. 1978. 52. № 2. p. 395-397.

277. Newcomb K., Christie W.B., Rowson L.E. Fetal rate after the surgical transfer of two bovine embryos. J. Reprod. Fert. 1980. 59. p. 31-36.

278. Newcomb R., Rowson L.E. Conception rate after uterine transfer of cow. Egg in relation to synchronization of oestrus and age of egg. J. Reprod. Fert. 1975. 43. p. 539-541.

279. Newcomb R., Rowson L.E. Conception rate after uterine transfer of cow eggs in relation. J. Vet. Ree. 1975. 96. p. 468-469.

280. Newcomb R., Rowson L.E. e.a. The entry of superovulated eggs into the uterus. In. Egg transfer in cattle. / Ed. Luxemburg. 1976. p. 1-15.

281. Newcomb R., Rowson L.E.A. Ovum transfer state of the cow. / Ed. J. Sreenan. 1977. p. 65-68.

282. Nieman H. Embryo transfer Weche Worschritte die Forschung macht. Tierarzliche um sou. 1986. v. 41. 9. p. 625-633.

283. Nieman H. Criopreservation of bovine embryos in the field. / Embr. Transf. Newsteller. 1990. 8. p. 5-7.

284. Nieman H. Embryo transfer: Welche Forschritte die Forschung macht. / Tierzucht. 1994. 9. s. 8-10.

285. Nieman H., Doepke H.H., Sacher B. Tiefgefrieren von Rinderembryonen in Plastikstraws mit Ansverdung Zuchthygiene. 1991. 16. s. 201-205.

286. Oesterreih D. Beitraf zum transzervicalen EmbriotransferBein. Riind. Mh. Veter. Med. 1986. № 17. s. 585-587.

287. Okuda H., Gaoma W., Sato K. Effect of FSH and PGF on the reproductive performance in cows. Theriogenology. 1989. v. 29. p. 831-833.

288. Ott R. Serum progesterone concentrations in cow receiving embryo transfer. J. An. Vet. Med. Assoc. 1986. 188. p. 1417-1419.

289. Ozil J.P., Heuman Y., Renard C.H. An instrument for transcervical recovery of embryo from heifers. Theriogenology. 1979. v. 11. p. 173-183.

290. Paff R., Kaufman T. Embryos, genes and evolution of biology. Indiana. 1986. 406 p.

291. Paulyshym V. Effects of FSH dose on Superovulation repose in cull beef cows. Departm. Veterin. Canada. 1996. p. 48-51.

292. Pavel G., Andersen U. Zur Eignung eines neuen Filtersystems im Rachmen des Embriotransfers beim Rind. /Prakt. Tierzuchter. 1987. № 2. s. 49-51.

293. Philippo M., Rowson L.E.A. Prostaglandins and Superovulation in the bovine. Ahn. Biol. Anim. 1975. 15. p. 233-240.

294. Pichova M.D., Picha J. Endokrinni profil po aplikaci prostaglandini a jeno analogy. / Buol. Chem. Vet. 1981. 17. № 2. p. 157-169.

295. Puglisi T.A., Ramposen G.B. Corpus luteum function following subtotal hycterectomy in the prepuberal gilt. // J. Anim. Cri. 1978. № 3. p. 707-710.

296. Rail W. Ice-free criopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. / Nature. 1985. p. 573-575.

297. Refaal K., Seguin B. Effect of stage of diestrus and number of cloprostenol injections on intervals to estrus LH and ovulation in heifers. // Theriogenology. 1990. 14. № 1. p. 37-48.

298. Renard J.P. Heumann V. Variable development of superovulated bovine embryos between day 6 and day 121. Ann. Biol. Anim. Bioch. 19. 1979. p. 1589-1598.

299. Renard J.P., Heumann V. Alternative tests to asses viability of bovine embryos. Theriogenology. 1982. p. 100.

300. Renard J.P., Heumann V., Mesnil D. Unilateral and bilateral cervical transfer of bovine embryos at the blastocyst stage. Theriogenology. 1987. v. 7. №4. p. 189-194.

301. Ridel B. Rommel P. Untersuchungen über den Eifluss von a-ß-estradiol Gu-Rh und verschidener HCG-Dosen auf die Ergebuisse der Superovulation beim prapuberalen Riud. // Mh. Vet. Med. - 1980.- № 35. - s. 652.

302. Ridel B., Rommel P., Enrig F. Ergenisse der Superovulation beim prapuberalen Rind nach PMSG und HCG - Bechaudlung. // Mh. Vet. -Med. - 1980. - № 35. - s. 568.

303. Roche J.F. Effect of short-term progesterone treadment on oestrus response and fertility in heifers. J. Reprod. Fert. 1974. v. 40. p. 433-440.

304. Roche J.F. Syncronization of oestrus in cattle. Anim. Prod. 1976. v. 12. p. 79-88.

305. Rodriges D.C., Frene A.J., Granato H. Transplantes en bionarios en bovines recuperación owular noquirurgica y transferencia. Gac. Veter. 1978. T. 40. № 334. p. 623-632.

306. Rommel P. Embryo transfer beim Rind. Tierzucht. 1991. № 5. s. 207-208.

307. Rowe R., Critser J.K. Non-surgical embryo transfer in cattle. Theriogenology. 1979. v. 1. № 17. p. 114-121.

308. Rowson L.E.A. Methools of inducing multiple ovulation in cattle. J. Endocrin. 1951. v. 7. p. 260-270.

309. Rowson L.E.A., Bennett J.P. The problem of non-surgical egg transfer to the cow uterus. Vet. Ree. 1964. 76. p. 21-27.

310. Rowson L.E.A., Dowing D. An apparatus for the extraction of fertilized eggs from the living cow. Vet. Ree. 1949. v. 61. p. 191-197.

311. Rowson L.E.A., Lowson R.A., Moor R.M. Production of twins in cattle by egg transfer. J. Reprod. Fert, 1971. p. 261-268.

312. Rowson L.E.A., Lawson R.A., Moor R.M., Baker A.A. Egg transfer in the cow: syncronization requirements. J. Reprod. Fert. 1972. 28. p. 427-431.

313. Rowson L.E.A., Moor R.M., Lawson R.A. Fertility following egg transfer in the cow. J. Reprod. Fert. 1969. 18. p. 517-533.

314. Saumande J. La production d'embryons chez les bovines. Quelles vies de recherches saus des treatments de Superovulation. Prod. Anim. 1995. 8. № 4. p. 275-283.

315. Schilling E. Methoden zur Beurteilung der Eigmung von Rinderembrionen fur die Transplantation. Tierzucht. 1980. 32(7). S. 277-279.

316. Seguin B. Comporative luteolytic activity of estradiol and prostaglandin F2a in duestrus cows. Theriogenology. 1997. № 6. p. 445-452. 331. Seidel G.E. Application of embryo preservation and transfer. Colorado. 1985. p. 523-527.

317. Seidel G.E. Application of embryo preservation and transfer. Anim. Reprod. Colorado. 1985. 67.11. p. 786-796.

318. Seidel G.E. Surveys of international embryo transfer industry. // Embryo Transfer Newsletter. 1990. - № 8(4). - p. 16-17.

319. Seidel G.E., Seidel S.M. Bovine embryo transfer cows and success rates. Adv. Anim. Breed. 1978. 24. v. 8. p. 6-10.

320. Seidel G.E., Seidel S.M., Bower R.A. Bovine embryo transfer procedures. Colorado State University. 1980. p. 74-79.

321. Shea B.F. Evaluating the bovine embryo. Theriogenology. 15. 1981. p. 31-42.

322. Shea B.F., Hines D.J., Ollis G.W. e.a. The transfer of bovine embryos. Luxemburg. EUR. 1996. p. 145-152.

323. Shemesh M., Hansel W. Levels of prostaglandin in bovine endometrium, uterine, veous, ovariation and jugular plasma during the estrous cycle. // Proc. Soc. Exp. Boil. Med. 1989. 104. p. 412-413.

324. Singh G.B., Sharma R.D. Treatment of suboestrous buffaloes with prostaglandin F2a. // Vet. Res. 1979. 104. p. 412-413.

325. Snilman C.H., Seidel G.E. Progesterone and luteinizing hormone levels in superovulated prepuberal and postpuberal cattle. Biol. Reprod. 1983. 9. p. 116-124.

326. Sreenan J.M. Effect of long short-term intravaginal progestagen treatments on syncronization of oestrus and fertility in heifers. J. Reprod. Fert. 1975. v. 45. p. 479-485.

327. Sreenan J. Embryo transfer in the cow: the current level of technology. Dublin. 1986. Proceeding. V. 2. p. 926-934.

328. Sreenan J.M. Embryo transfer: its uses and recent developments. Veter. Rec. 1988. v. 122. № 26. p. 624-629.

329. Sreenan J.M., Beehan D. Methods of induction of Superovulation in the cow and transfer results. Luxemburg. In. Egg transfer in cattle. 1976. p. 1934.

330. Sreenan J., Doskin M. Evaluating the bovine embryo. Theriogenology. 1987. 27.1. p. 99-113.

331. Sreenan J.M., Doskin M.G., Dunne L. Embryo mortality the major course of reproductive wastage in cattle. // Stacarstovo. 1997. v. 51. № 2. p. 93-112.

332. Sugie T. Successful transfer of a fertilized bovine egg by non-surgical technique. J. Reprod. Fert. 1965. 10. p. 197-201.

333. Sugie T. Instruction vor ova collector and ova transplanter for artificial pregnancy techniques in cattle. Engl. Bull. F.K.H. Fujihira. 1973. p. 1-4.

334. Suzuki T., Shimokira T. Transfer of bovine frozen embryos by one step staw method Japan. J. Anim. Reprod. 1983. v. 29. № 3. p. 162-163.

335. Suzuki T., Shimokira T., Fujiyama M. Calves obtained after transfer of frozen-thawed bovine embryos criopreserved in various crioprotectants. Theriogenology. 1996. 45. p. 361-364.

336. Szell A., Shelton J. Sucrose dilution of glycerol from mouse embryos frozen rapidly liquid nitrogen vapour. J. Reprod. Fert. 1986. 76. p. 401-408.

337. Takahashi Y., Kanagava H. Effects of LH-ph analogue on the ovulation rate and embryo quality in heifers superovulated with PMSG and FSH. Jap. Journ. Veterin. Reserch. 1984. v. 32. p. 183-186.

338. Teblache H.M., Labuschagne J.M. Plasma progesterone in cattle. South Veterinary Association. 1981. № 3. p. 187-189.

339. Tervit H.R., Coofer M., Gold P., Hasrad J. Non-surgical embryo transfer in cattle. Theriogenology. 1990. № 1. p. 63-71.

340. Tervit H.r., Havic P.G. Egg transfer in cattle: effect of hormonal treatment on syncronization of oestrus and ovarian response. Proc. N.Z. Soc. Anim. Prod. 1995. 35. p. 78-82.

341. Testait J., Leslise P.C. Transplantation of dividing cow eggs by the vaginal route C.R. held. Seane. Acad. Sci. bovis. Scr. D. 1991. 272. p. 2591-2595.

342. Thatcher W. Material recognition of pregnancy in relation to the survival of transferred embryos. / Theriogenology. 1985. 23.1. p. 129-134.

343. Thibier M., Nibort M. Transfer embrionaire chez les bovin avec reterence perticuliere a l'interaction embrions pathogens. 1992. Ann Zoootechn. Vlo. 41. №3. p. 341-346.

344. Voelkel S.A. Direct transfer of frozen thawed bovine embryos. Theriogenology. 1992. 37. p. 23-35.

345. Warfield S.J., Seidel G.E., Elsden R. Transfer of bovine demi-embryos with and without the zona pellucida. J. Anim. Sc. 1987. v. 65. № 3. p. 756761.

346. Whittingham D. Sensitivity of mouse embrions to the rate of thawing. New York. 1081. p. 237-241.

347. Whittingham D. Reservation of embryos of the laboratory animals. // 9th Internat. Congr. On Anim Repr. And A J. Madrid, 16 bis 20 Juni. 1980. v. 11. p. 237.

348. Whittingham D., Leibo S.P., Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to -196°C and -269°C. / C. Sydney. 1992. 179. p. 411-414.

349. Wittingham D., Wood M. Survival of frozen mouse embrions after rapid thawing from -196°C. J. Reprod. Fert. 1979. 56. p. 11-21.

350. Willadsen S.M. Transplantation of sheep and cattle embrions after storage at -196°C. Amsterdam. 1990. № 52. p. 190-201.

351. Willadsen S.M., Poege C. Embriotransplantation in the large domestic species applications. J.R. Agric. Eng. 1980. p. 115-126.

352. Willet E., Black W., Casida L. Successful transplantation of a fertilized bovine ovum. 1951. Science. 113. p. 247.

353. Willet E., Buckner PJ. Refractoriness of cows repeatedly superovulated with gonadotropins. J. Dairy. Sci. 1983. p. 1083-1088.

354. Wilmut J. Animal breeding: a role of embryo preservation. Theriogenology. 1985. 23.1. p. 17-31.

355. Wilmut J., Rowson L. The successful low-temperature preservation of mice and cows embryos. J. Reprod. Fert. 1983. v. 33. p. 352-353.

356. Wischart D.F., Loung J.M. Artifical insemination of progestin treated cattle at predetermined times. Vet. Rec. 1996. 95. p. 503-508.

357. Wu J.T. Effect of oestrogen and progesterone on the development oviductal transport of pregnant rats. / Endocrin. 1991. 51. p. 569-574.