Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum) на основе использования биотехнологических методов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum) на основе использования биотехнологических методов"

~ и о а правах рук°писи

- 1 ДЕК

поляков

Алексей Васильевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (Упит изКаГ^тит Ц НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте льна в 1980-1998 гг.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шамина З.Б.,

доктор биологических наук, профессор Козловская В.Ф.,

доктор биологических наук, профессор Анащенко A.B.

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится "3-Ь" с^цаЕрл 193В г. в Ц. часов на заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан

С. ио&Ър А 19g8r

Ученый секретарь Диссертационного Совета, /П

кандидат биологических наук МеликоваСА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лен культурный (Unum usitatissimum L., 2n=30) - одна из древнейших и важнейших технических культур комплексного использования, значение которой в мире неизменно высоко (Trump Т., 1980; Van Dam J.E.G. et al., 1994). Спрос на волокно и семена обусловлен уникальными и высокими свойствами этой культуры. Для того, чтобы льноводство было более эффективно, ведутся интенсивные разработки новых направлений использования льна э пищевой, медицинской, автомобильной, строительной и других отраслях промышленности, а также путей существенного повышения урожая волокна (до 2030 ц/га у льна-долгунца) и семян (до 40 ц/га у льна масличного). Для решения этих вопросов необходимы качественно новые сорта и нетрадиционные высокоэффективные методы селекции.

Одним из наиболее перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия, ускоренно получить выровненный по селектируемым признакам материал, идентифицировать, быстро размножить и, в конечном итоге, в сжатые сроки создать качественно новые, конкурентоспособные сорта.

Методами традиционной селекции созданы сорта льна-долгунца с высокой продуктивностью, высоким содержанием волокна, высокой устойчивостью к ржавчине и фузариозу. Однако большая часть сортов имеет низкое качество волокна, не обладает достаточной устойчивостью к полеганию, ряду болезней и насекомым. Кроме того, селекционный материал характеризуется генетическим однообразием (Кутузова С.Н., 1993; Жученко А. А, 1994). Низкий коэффициент размножения льна-долгунца, необходимость селекции на трудносовместимые признаки (высокая урожайность волокна и семян,, высокая урожайность и качество волокна и др.), а также полигенный контроль большинства хозяйственно ценных признаков, низкий коэффициент наследуемости и трудоемкость технологий их оценки на фоне недостаточного внимания к вопросу интенсификации селекционного процесса привели к тому, что традиционная селекция льна на сегодняшний день остается малоэффективным, трудоемким процессом.

Для решения селекционно-генетических задач лен, как объект биотехнологических исследований, используется в различных странах. Однако большая часть исследований находится на стадии методической проработки и не вышла за пределы лабораторных испытаний. 8 связи с упомянутыми выше проблемами возникает необходимость

оценить перспективы и разработать методы использования биотехнологии как инструмента селекции для повышения эффективности селекционного процесса и генетического улучшения культуры льна.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось усовершенствование селекционного процесса и создание линий льна-долгунца, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков, на основе разработки и использования биотехнологических методов.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методы создания генетического разнообразия путем культивирования соматических тканей, пыльников и незрелых зародышей, полученных при внутривидовой и межвидовой гибридизации, а также генетической трансформации. Предусматривалось разработать питательные среды и условия культивирования исходных эксплантов, каллусов и регенерантов.

2. Выявить эффективные способы генетической стабилизации популяций льна путем использования гаплоидов, полученных в культуре пыльников и при разных формах апомиксиса; разработать технологии массового получения гаплоидов и дигаплоидов в культуре пыльников, эмбрио--культуре, а также полиэмбрионии.

3. Исследовать новые возможности оценки генотипов in vitro.

4. Усовершенствовать процесс размножения льна in vitro с целью ускоренной передачи особо ценных геноисточников в селекционную практику.

5. Создать на основе биотехнологических методов линии льна-долгунца с высокими показателями хозяйственно,ценных признаков, представляющих интерес для селекционной практики и производства.

Научная новизна работы. Исследования по разработке и применению методов in vitro для решения селекционно-генетических вопросов льна являются современным направлением как в нашей стране, так и за рубежом.

В представленной работе впервые показана роль биотехнологических методов в усовершенствовании селекционного процесса льна-долгунца на этапах создания генетического разнообразия, получения константного, в генетическом отношении, селекционного материала, оценки его in vitro и размножения.

Разработаны и усовершенствованы технологии получения регенерантов в культуре ткани, пыльников и эмбриокультуре. Уточнены условия

для проведения генетической трансформации льна-долгунца А. tumefaciens на примере введения маркерного гена NPT-II. Впервые получены трансгенные формы льна допгунцового типа с повышенной устойчивостью к гербицидам группы хлорсульфурона, обусловленной наличием гена ALS. Разработана питательная среда для культивирования пыльников льна, по которой принято положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ.

Показано, что культивирование тканей и органов льна в условиях in vitro сопровождается образованием широкого спектра генетической изменчивости в последующих поколениях. При этом, впервые на культуре льна показана высокая значимость сомаклонов, близнецовых дигаплои-дов и регенерантов, полученных от незрелых недоразвитых зародышей самоопыленных генотипов, а также межсортовых и межвидовых скрещиваний для ускоренного создания линий, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков.

Впервые широко изучено распространение гаплоидии у льна и оценены различные способы получения гаплоидов, основанные на использовании индуцированного апомиксиса, эмбриокультуры, культуры пыльников. Показаны морфогенетические особенности различных типов экс-ппантов в зависимости от условий культивирования донорных растений, предобработки и условий культивирования эксплантов, а также способы их использования для решения селекционно-генетических вопросов.

Выявлены эффективные методы оценки селекционного материала на устойчивость к гербицидам в условиях in vitro и в вегетационных опытах, определены условия для оценки генотипов льна по проросткам на устойчивость к хлориду алюминия и болезням, вызываемым грибами Fusarium oxysporum и Colletotrichum lint.

Получены новые данные, свидетельствующие о взаимодействии генома и плазмона при образовании полиэмбриональных зародышей и культивировании льна в культуре in vitro.

Теоретическая и практическая ценность исследований. Результаты, представленные в диссертационной работе, развивают представление о значении биотехнологических методов в селекции льна-долгунца. Они показывают целесообразность комплексного использования технологий in vitro для повышения эффективности селекционного процесса.

Полученные углубленные шашга о гаплондии у льна вида L, usitatissimum L. подтверждают предположение о полиплоидном проке-

хождениит этого вида, позволяют понять и объяснить ряд таких явлеий, как генотрофия, быстрое вырождение сортов, которые характерны для льна. Показывают новые возможности ускоренного получения константного селекционного материала.

Данные о влиянии различных абиотических и биотических факторов на морфогенез эксплантов, прорастание семян подтверждают целесообразность использования растворов гербицидов, хлорида алюминия и культуральной жидкости ряда грибов для экспресс-оценки генотипов льна в условиях in vitro. Разработанные автором методы массового получения регенерантов в культуре пыльников, эмбриокультуре и культуре ткани, а также уникальные генотипы, характеризующиеся нетрадиционным комплексом и высокими показателями хозяйственно ценных признаков нашли широкое применение в селекционной практике в Российской Федерации и за рубежом.

Использование результатов исследования. Полученный селекционный материал (линии), а также методические и технологические разработки используются в селекционном процессе во Всероссийском научно-исследовательском институте льна, в Тверском государственном университете (Россия), в Институте лубяных культур (Украина), в Институте натуральных волокон (Польша), в Институте технических культур (Китай) и фирмах "Агритек" (Чехия), "Фонтен-Кани" (Франция), Ван де Билт Заден (Голландия) и ряде других учреждений.

Основные положения, вынесенные на защиту:

- генетическая трансформация, змбриокультура нежизнеспособных зародышей, получаемых при межсортовых скрещиваниях, сома- и гаме-токпональная изменчивость - эффективные способы увеличения генетического разнообразия льна;

- использование гаплоидов и дигаплоидов, получаемых методом ■ "grandiflorum" и полиэмбрионни, является перспективным способом генетической стабилизации признаков селектируемого материала;

- проращивание семян льна на селективных средах, включающих растворы гербицида Препарат 1, хлорида алюминия, культуральной жидкости грибов Fusarium oxysporum и Colletotrichum lini, позволяет дифференцировать генотипы льна по устойчивости к оцениваемым факторам;

- культура апикальных частей побегов при уточненных условиях культивирования исходных эксплантов, почек, побегов и регенерантов оправдана для ускоренного размножения in vitro особо ценного селекционного материала и сохранения генотипов, у которых затруднен процесс воспроизводства.

- использование методов биотехнологии - способ создания геноисточни-ков и родоначальников новых сортов льна-долгунца с высокими показателями основных хозяйственно ценных признаков, включающих устойчивость к экстремальным факторам среды.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом исследований, проведенных автором лично в течение 17 лет. В проведении комплексных исследований под его руководством принимали участие специалисты разных профилей из ВНИИЛ: Т.А. Александрова, Л.Н. Павлова, Н.И. Лошакова, Т.В. Крылова, О.Ф. Чикризова, Л.П. Кудрявцева, О.Ю. Сорокина, А.И. Копасов, H.A. Кудрявцев,Е.Г. Егорова, Н.В. Пролетова, О.В. Баранова, Л.В. Никитина. Часть исследований проведена совместно с ГБС АНРФ - А.Г. Слюсаренко, В.Н. Суворовой; Институтом натуральных волокон (Польша) - И. Рутковской-Краусе, Г. Маньковской; • фирмой АГРИТЕК (Чехия)' - Е. Тейкловой; Научно-производственным кооперативом "Фонтен-Кани" (Франция) - Жан Поль Труве. Всем коллегам автор признателен за сотрудничество.

В ходе работы автор пользовался консультациями академика БАН Л.В. Хотылевой, академика РАСХН B.C. Шевелухи, директора ВНИИЛ, член-корр. РАЕН, заслуженного агронома РФ АН. Марченкова, доктора биологических наук A.A. Жученко, которым выражает глубокую благодарность.

Связь диссертационной работы с тематическим планом научно-исследовательских работ. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ВНИИ льна по решению научно-исследовательских проблем - 0. СХ. 21 [задание 01 (Р)], № государственной регистрации 01.9.30.001897, № 01.9.60.012464, № 02.890.003583, а также в рамках федеральной целевой программы "Развитие льняного комплекса России" и международной программы "Генетика льна".

Апробация работы. Основные положения работы были доложены или представлены на IV и V съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Кишинев, 1982; Москва, 1987), Третьей всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев, 1987), Научной конференции " Использование искусственного климата в селекции сельскохозяйственных культур (Ленинград, 1988), Second European Regional Workshop on Flax " Flax as a fibre and oil bearing crop" (Brno, 1991), Second meeting of the International Flax Breeding Research Group (Brno, 1994), Третьем Всероссийском симпозиуме " Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995), Всероссийском съезде по защите растений " Защита растений в условиях реформиро-

еания агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность"

(Санкт-Петербург, 1995), XIV EUCARPIA Congress (Jyvaskyla. Finland. July 31-August 4, 1995. University of Jyvaskyla. Jyvaskyla. 1995), Third meeting of the International Flax Breeding Research Group "Breeding for fibre and oil quality in flax" (St. Valéry en Caux, 1995), Fourth European Regional Workshop on Flax "Producing for the market" (Rouen, 1996), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (16-20 июня 1997 г. Пущино, 1997), IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г. Москва, МСХА); VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда (25-28 ноября 1997 г., Москва); FAO conference "Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow. Beyond 21st Centuty" (September 28-29, 1998, St. Petersburg).

Публикации результатов исследований. По результатам исследований по теме диссертации опубликована 51 работа и получено положительное решение ВНИИГПЭ (от 8.01. 1998 г.) о выдаче патента на изобретение "Питательная среда для культивирования пыльников льна".

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, основных выводов, предложений для селекционной практики, заключения, списка литературы и приложений. Она изложена на 300 страницах машинописного текста, содержит 108 таблиц, 22 рисунка. Список литературы состоит из 616 наименований, в том числе 302 на русском и 314 на иностранных языках. Приложения включают 16 документов, подтверждающих использование результатов диссертационной работы.

УСЛОВИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Условия проведения исследований. Экспериментальные исследования проведены в 1980-1998 гг.: во Всероссийском научно-исследовательском институте льна (1980-1998 гг.), в Главном ботаническом саду АНСССР (1986-1987 гг.), в Саскетчеванском университете (г. Саскатун, Канада, 1990 г.) и в Институте натуральных волокон (г. Познань, Польша, 1993-1998 гг.).

Растения выращивали в вегетационных домиках в сосудах Митчерлиха по общепринятой методике (Соколов, 1967; Доспехов, 1979). Полевые опыты закладывали в Опытно-производственном хозяйстве им. В.И. Ленина ВНИИ льна (Торжокский район, Тверской обл.) Оценку регенеран-

тоз и линий льна-долгунца по основным морфологическим и хозяйственно ценным признакам проводили по типу луночного питомника первого года по методике ВНИИЛ (1987). В качестве стандартов высевали сорта льна-долгунца Торжокский 4, А-29, Алексим, внесенные в Государственный реестр селекционных достижений России.

Устойчивость растений к болезням - ржавчине и фузариозу определяли на инфекционно-провокационных фонах в соответствии с методическими указаниями по селекции льна-долгунца (1987) и селекции льна-долгунца на устойчивость к ржавчине (1988). Оценка ряда линий была проведена в селекционном питомнике третьего года по методике селекции льна-долгунца (1987).

Материал исследований. В качестве объекта исследования автор использовал лен культурный (L'inum usitatissimum L.) и ряд дикорастущих видов. Семена генотипов культурного льна были получены из отделов семеноводства и селекции ВНИИЛ, семена дикорастущих видов - из Мировой коллекции рода Linum (ВИР, Санкт-Петербург) и Национальной коллекции русского льна (ВНИИЛ, Торжок), трансгенные гербицидо-устойчивые формы льна масличного - из Саскетчеванского университета (Саскатун, Канада). После проверки по потомствам, семена использовались в качестве исходного материала для исследований.

Методика исследований. Лабораторные исследования проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов растений (Бутенко, 1964; Урманцева, 1988), методикой трансформации растений (McHughen, Jordan,1989; Drapperet al.,1988) и методикой лабораторных опытов с гербицидами (Войтехова, 1967).

Использовались среды: Sh-2, Sh-0, MSFC, LMA-1, Ro, разработанные в процессе выполнения исследований, а также MS (Murashige T., Skoog F., 1962), B5 (Gamborg O.L., 1975), Ne(Chu C.C., 1978), LMK-3 (Ftriedt W., 1996), A22 (Nichterlein K, Umbach H., FriedtW., 1991).

Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на ПЭВМ с использованием пакета программ БИОСТАТ. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с применением критериев Стьюдента и Фишера (Доспехов, 1979; Зайцев, 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛЬНА

Наряду с гибридизацией, мутагенезом и рекомбиногенезом большое значение в увеличении генетического разнообразия льна имеют генетическая трансформация, эмбриокультура нежизнеспособных зародышей и гаметоклонапьная изменчивость.

Сомаклонапьная изменчивость льна в культуре ткани. Известно, что явление "сомаклональной вариабельности" может быть успешно применено для расширения, спектра генетического разнообразия. При изучении культуры ткани льна масличного in vitro показана возможность получения форм, измененных по ряду хозяйственно ценных признаков (Marshall G., Courduries P., 1991).

Нами установлено, что культивирование in vitro корневых, гипокотиль-ных и семядольных эксплантов близнецовых гаплоидных и диплоидных трехсуточных проростков льна линии Istru 53' на питательной среде Sh-2, содержащей сахарозу в концентрации 3%, а также регуляторы роста БА -1 мг/л и НУК - 0.05 мг/л привело к увеличению плоидности гаплоидных тканей. При этом наибольшая доля (66,6%) образовавшихся эксплантов была отнесена к диплоидам. Тетраплоидные и миксоплоидные эксплан-ты составили соответственно 30,5% и 2,7%. Оценка эксплантов, полученных на основе исходных диплоидных тканей, показала, что примерно третья их часть (27%) сохранила первоначальный диплоидный статус, а другие экспланты состояли из тетраплоидных (66,9% эксплантов) или мик коллоидных (3,0%) клеток. Выращивание'же в течение 5 недель растений льна в обычных условиях не сопровождалось изменением плоидности клеток.

С целью изучения роли сомаклональной изменчивости в увеличении генотилической изменчивости хозяйственно ценных признаков, нами проводилась оценка 22 регенерантов, полученных на основе сорта Торжокский 4, 17 регенерантов сорта Belinka, 12 регенерантов сорта Даш-ковский 2 и 10 регенерантов сорта Славный 82. Растения-регенеранты были получены на основе каллуса гипокотильных сегментов 3-7 субкультур. В течение 3-4 лет в селекционном питомнике 2-го года нами проводилась оценка потомств регенерантов по основным хозяйственно ценным признакам: высота растений, техническая длина, число семян и коробочек на растении, содержание волокна и др.. Эти исследования

позволили выделить 2 регенеранта сорта Торжокский 4, которые по числу коробочек на 20-180% и по числу семян с растения на 28,8-92,4% превосходили исходный сорт. Выделен 1 регенерант сорта Belinka, который на 11-19,5% по содержанию волокна превосходил исходный сорт. Кроме того, эти регенераты по основным хозяйственно ценным признакам не уступали сорту-стандарту Алексим, а в отдельные годы по числу семян и массе волокна превосходили его.

Гаметоклонапьная изменчивость льна в культуре ткани. Для рас-тений-регенерантов, полученных из гаплоидных генеративных клеток и органов, характерным является то, что доминантные и рецессивные мутации могут быть выявлены в поколении Ro (Атанасов А, 1993). Однако в целом, гаметоклонапьная изменчивость до сих пор остается малоизученной областью биотехнологии.

В наших опытах пыльники льна-долгунца, взятые на стадии поздней одноядерной микроспоры, культивировали в течение 3-6 месяцев на питательной среде Sh-2, включающей углеводы в концентрации 5%, а также регуляторы роста БА - 1 мг/л и НУК - 0.05 мг/л. В результате этого опыта выявлено, что после трех месяцев культивирования 23 экспланта (49%) имели диплоидную природу, 5 (9,8 %)-тетраплоидную, 18 (35,3%) -миксоплоидную (ди- и тетраплоидную), и 3 (5,9%) экспланта были отнесены к миксоплоидам, состоящие из тетра- и октаплоидных клеток. После 6 месяцев культивирования наблюдалось увеличение хромосомной вариабельности каллуса. Так,из 49 проанализированных эксплантов 11 состояли из диплоидных (22,4%), 12 -тетраплоидных (24,5%), 2 - октаплоидных (4,1%) и 21 - миксоплоидных (43%) клеток.

Изучение потомств 68 регенерантов, полученных в культуре пыльников на основе межсортовых гибридов, различающихся по окраске лепестков, показало, что только 17 (25%) регенерантов были однородны по маркерному признаку, а следовательно, брали начало от клеток микроспор. Потомства 18 (26,5%) регенерантов включали отдельные инако-цветущие растения (среди растений с голубой окраской лепестков встречались отдельные растения с белой и наоборот). Потомства остальных 33 регенерантов (43%) имели нормальное расщепление по изучаемому признаку и, по всей вероятности, происходили от диплоидных тканей пыльников. Потомства, имевшие явно нарушенное расщепление по окраске лепестков, скорее всего, также брали начало от микроспор. Однако культивирование пыльников и каллуса in vitro привело к возникновению мутаций по этому признаку (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика регенерантов льна-долгунца, полученных

в культу ре пыльников, по ок эаске лепестков. 1996 г.

Генотипы Проанализировано, шт Обнаружено генотипов

константных с нарушенным расщеплением

генотипов растений шт. % шт. %

Сорта 4 2700 4 100,0 0 0,0

Гибриды Р1 5 545 5 100,0 0 0,0

Гибриды Рг 5 4320 0 0,0 0 0,0

Регенеранты (б х г)* 68 9901 17 25,0 18 26,5

Регенеранты (бхб)" 21 11169 9 42,9 5 23,8

Примечание: б х г* - регенеранты гибридов р1, полученных при скрещивании белолепестковых с голуболепестковыми генотипами; б х б** - регенеранты гибридов р1, полученных при скрещивании белолепестковых генотипов.

В 1993 -1996 гг. нами изучено 357 регенерантов, полученных в культуре пыльников. Оценка растений второго-четвертого поколений показала, что ряд регенерантов по одному и нескольким признакам существенно превосходит исходные генотипы и сорт-стандарт Алексим. Обнаружено, что наиболее часто в культуре пыльников образуются регенеранты, превосходящие исходные сорта по семенной продуктивности, а также массе волокна и массе технической части. Гораздо реже удается получить регенеранты, превосходящие исходные генотипы по содержанию волокна и длине технической часта стебля. В зависимости от года исследований, регенеранты, которые существенно превосходили исходные генотипы, составляли: по высоте растений - 5,2-5,8%, по длине технической части стебля - 0,5-4,3%, по массе технической части стебля - 7,2-17,1%, по числу коробочек на растении - 7,3-28,3%, по числу семян на растении -21,8-29,0%, по массе волокна - 12,4-13,0%, по содержанию волокна - 0,71,0% (табл. 2).

Результаты получения регенерантов в культуре пыльников, превосходящих исходные генотипы. 1.996 г. _(селекционный питомник 2 г.)_

Проанализировано регенерантов Число регенерантов, превосходящих исходные генотипы по признаку

высота растений техн. часть масса техн. части число коробочек число семян масса волокна % волокла

1995 г.

193** ! 10* 1* 33* •к СМ * 24* 2*

100*** | 5,2 0,5 17,1 7,3 | 21,8 12,4 1,0

1996 г.

138*" 8* 6* | 10* 39* | 40* 18* 1*

юо*-** 5,8 4,3 | 7,2 28,3 | 29,0 13,0 0,7

Примечание: *- число регенерантов, которые при Р=0,95 существенно превосходили исходные генотипы; ** - регенерантов, шт; *** - регенерантов, %

Отмечено, что культура пыльников позволяет получить регенеранты, которые по двум и более признакам превосходят исходные генотипы. В частности выделены регенеранты, которые по высоте растений и массе технической части стебля существенно превосходили исходные сорта. Такие регенеранты составляли 4,7-6,5% от общего числа. Регенеранты, существенно превосходящие исходные генотипы по массе технической части и числу семян, составляли 6,5-11,9%, а по высоте растений, массе технической части и числу семян - 3,6-4,1%.

Увеличение генетического разнообразия льна-дслгун»а путем сохранения нежизнеспособных зародышей саморпыленных генотипов и внутривидовых гибридов. Изучение сортов льна показало, что в процессе вегетации в коробочках формируются, наряду с нормальными (НЗ), неполноценные, недоразвитые семена и'зародыши (НИЗ). К "недоразвитым" нами отнесены зародыши, уступавшие в 2-4 и более раза по размеру и существенно - по развитию в сравнении с нормально развивающимися зародышами. Как правило, на момент изоляции развитие нормальных зародышей соответствовало семядольной стадии, а недоразвитых- глобулярной или начальной сердечковидной стадиям. Количество недоразвитых зародышей зависело в большой мере от условий произрастания материнских растений.

На образование недоразвитых семян существенное влияние оказывал уровень минерального литания. Доза удобрений (азот 20 мг/кг, фосфор 10 мг/кг, калий 20 мг действующего вещества на 1 кг почвы) у большинства изученных генотипов несколько увеличивала число недоразвитых зародышей. Доза же удобрений в 20 раз, превышающая оптимальную, приводила к существенному (в 1,8-5 раз) увеличению числа недоразвитых зародышей.

Анализ семян гибридов первого и второго поколений показал некоторое увеличение количества недоразвитых семян и зародышей по сравнению с родительскими генотипами. В условиях 1992 г. недоразвитые зародыши у сортов составили 4,6%, а у гибридов первого поколения-5,7% Аналогичные результаты получены в 1993 г. Так, у сортов обнаружено 11,4% недоразвитых зародышей, у гибридов первого поколения-12,4%, а у гибридов второго поколения -13,2%.

Исследования, проведенные в 1991-1993 гг. на сортах Дашковский 2, Belinka, Р-736, а также их реципрокных гибридах первого и второго поколений показали, что культивирование незрелых зародышей in vitro на средах Sh-2 и MSFC позволяет получить от 15% до 43% (табл. 3), а в ряде случаев до 46% морфогенных зксплантов, на которых образуется от 3 до 6 почек. При этом обнаружено, что наиболее эффективно изв-

Таблица 3

Морфогенез у 10 дневных зародышей льна-долгунца

_на среде Sh-2. 1992-1993 гг. _

Г енотип Тип Изучено Образовалось Получено

зароды- зксплан- эксплантов с почек на 1

шей тов почками зксплант

шт. % + Sp шт.

. Р-736 НЗ 65 43,1 +6,1 4,4

ннз 68 32,4 + 5,7 3,7

Fi Р-736 х НЗ 61 42,6 + 6,3 4,6

Belinka ннз 53 37,7 + 6,7 4,1

Belinka НЗ 83 30,1+5,0 4,4

ННЗ 72 15,3 + 4,2 3,6

Fi Р-736 х НЗ 68 39,7 + 5,9 3,2

Дашковский 2 ННЗ 63 30,2 + 5,8 2,8

Дашковский 2 НЗ 98 18,4 + 3,9 2,9

ННЗ 97 19,6 + 4,0 3,2

лечение недоразвитых зародышей на начальной сердечковидной стадии из 10 суточных семян, так как в этом случае образуется большее число жизнеспособных эксплантов.

Изучение регенерантов и их потомств, полученных на основе незрелых, недоразвитых зародышей, показало возможность получения форм льна, которые, по изучаемым признакам, отличались от исходных генотипов. При этом выявлены регенеранты с необычно длинными листьями и укороченными междоузлиями. Однако такие регенераты имели пониженную жизнеспособность, плохо росли и на них не образовывались семена. Большая же часть регенерантов хорошо росла и производила семена.

В 1994-1996 гг. нами изучено 315 регенерантов второго-четвертого поколений, созданных на основе внутривидовых скрещиваний, 177 из которых образовалось из незрелых нормально развитых и 138 из недоразвитых зародышей. Оценка растений показала, что ряд регенерантов, полученных на основе незрелых зародышей по комплексу хозяйственно ценных признаков на 10-50% превосходили исходные генотипы и стандарт. Установлено, что культивирование недоразвитых зародышей in vitro позволяет выделить большее количество ценного материала по признакам: высота растений и масса технической части стебля, масса технической части стебля и волокна по сравнению с культивированием нормально-развитых зародышей (табл. 4).

Создание генетического разнообразия при межвидовой гибридизации льна. Разработке методик получения отдаленных гибридов льна многие исследователи уделяли особое внимание (Laibach F., 1925, 1929; Земит В.Э., 1934; Рогаш А.Р., 1964; Seetharam А., 1972; Green A G., 1983; Nickel М., Nictterlein К, Friedt W., 1989). Однако эти работы показали, что скрещивания культурного льна с дикими многолетними видами практически не удаются. В этих исследованиях зародыши начинали развиваться, ко затем дегенерировали В связи с вышеизложенным нами были предприняты попытки усовершенствовать методику получения межвидовых гибридов льна при использовании современных приемов эмбриокультуры, которые показали возможность получения нормально развитых семян и на их основе фертильных растений при скрещивании обычным путем L. usitatissimum с L. angustifolium, L. bienne. При нанесении пыльцы вида льна L. flavum на кастрированные цветки L. usitatissimum коробочки и семена не завязывались. Опыление кастрированных цветков льна L. usitatissimum пыльцой L. grandiflorum, L. austriacum, L. alpinum, L. perenne, L. Hirsutum

Результаты получения регенерантов в эмбриокультуре, превосходящих исходные генотипы. 1996 г. _(селекционный питомник 2 г.)_

Проанализировано регенерантов Число регенерантов, превосходящих исходные генотипы по признаку

высота растений техн. часть масса техн. части число коробочек число семян масса волокна % во-лок-на

1995 г.

Незрелые нормальноразвитые зародыши

99" 8* 9* 24* 30* 27* 14* 0

100*** 6,1 9,1 24,2 30,3 27,3 14,1 0

Незрелые недоразвитые зародыши

56** 16* 13* 22* | 16* 16* 18* 0

100*** 28,6 23,2 39,3 | 28,6 28,6 32,1 0

1996 г.

Незрелые нормальноразвитые зародыши

63** 11* 14* 5* 13* 8* 3* 1*

100*** 17,5 22,2 7,9 20,6 12,7 4,8 1,6

Незрелые недоразвитые зародыши

67** 17* 19* 12* 21* 13* 4* 0

100*** 25,4 28,4 17,9 31,3 19,4 6,0 0

Примечание: *- число регенерантоз, которые при Р=0,95 существенно превосходили исходные генотипы; ** - регенерантоз, шт; *** - регенерантоз, %

сопровождалось образованием коробочек в пределах 30-68% с недоразвитыми нежизнеспособными семенами. Культивирование семян позволяло получить от 0,5 до 4,5 зеленых зародышей на одно скрещивание, которые могли прорастать, находясь еще в семени или формировать морфогенный каллус. Дальнейшее культивирование жизнеспособных зародышей приводило к получению дигаплоидов. Формирование же побегов, имеющих морфологические признаки отцовских форм (диких видов), происходило с частотой 0,1-0,2%. Для получения межвидовых гибридов льна, видимо, необходимо дальнейшее усовершенствование методики эмбриокультуры или использование культуры протопластов. Усло-ви^получения протопластов, их слияния и регенерации растений на их основе уже определены для ряда видов рода Упит (Вагака!

Cocking E.C., 1983; 1985; Ling Q., Binding H., 1987).

Генетическая трансформация. Большие надежды в получении принципиально нового исходного материала и повышении эффективности селекционного процесса связаны с использованием достижений в области генной инженерии. Создание новых сортов культурных растений, так называемого интенсивного типа, хорошо отзывающихся на совершенствование агротехники и устойчивых к различным экстремальным условиям среды, является одной из задач, стоящих перед селекционерами (Шевелуха В, С., 1992).

Применение генной инженерии позволило получить трансгенные формы и сорт льна-масличного, устойчивые к гербицидам, активным компонентом которых являются хлорсульфурон и метсульфуронметил (McHughen А., Ho!m F., 1991; McHughen A, Rowland G.G., 1991). Однако на льне-долгунце подобные работы не были известны. Наши исследования показали, что отличительной особеностью льна-долгунца от льна масличного в условиях in vitro является его пониженная морфогенетиче-ская активность. В связи с этим, возникла необходимость адаптации метода трансформации применительно ко льну-долр/нцу.

Гипокотильные сегменты льна-долгунца сортов Дашковский 2 и Beiinka кокультивировали с A. tumefaciens штаммов LBA4404 (РВ1 121) и А 281 (pTiBo 342) pGA 482, векторные плазмиды которых имели маркерный ген NPT-II, придающий растениям устойчивость к канашцину. При этом использовали гипокотильные сегменты, длиной 1-3 мм (Basiran N., 1987; Drapper J., 1938; Mlynarova L., Pretova A.,1393), атзк^ке гипоштили длиной 8-10 мм с частично (до 50 %) удаленным эпидермисом (McHughen А., 1989; Dong J.-Z., McHughen А., 1991) и сегменты аналогичной длины, проколотые по поверхности иглой.

В зависимости от размера и возраста гипокотильных сегментов, число морфогенных эксплантов варьировало от 13% до 54 %. Наибольшей ре-генерационной способностью обладали 7-8 суточные экспланты льна-долгунца с частично удаленным эпидермисом. Было отмечено, что мор-фогенетическая актив,чссть у проколотых эксплантов льна-долгунца отсутствовала. Возникновение новообразований на неповрежденных гипокотильных сегментах составляло 13' %.

Состав среды оказывал существенное влияние на процесс регенерации трансформантов. Индукция почек, и побегов льна-долгунца на селективной среде MSB5 2", была в среднем в 1,7 раза выше, чем на среде MS с таким же содержанием канамицина (50 мг/л). Наиболее широко распространенными компонентами среды при получении трансгенных растений являются канамицин, клафоран и карбенициллин.

При изучении действия этих веществ на rvpc j :генез у льна-долгунца было уСТЭНОВЛбНО, ЧТО ОНИ в рЗЗНОИ СТвПбНИ v.rn "ибируют процесс побегообразования. Добавление в среду 25, 50, 100 и 200 мг/л канамицина снижало выход регенерантов в 1,3; 1,3; 5,5 и 50 раз соответственно. Как следует из множественного линейного уравнения плоскости регрессии: Y= 65,2 - 0,36 Xi - 0,001 Х2 + 0,003 Хз, действие канамицина (Xi) на образование побегов было значимым (R=0,90). Клафоран (Хг) и карбени-циллин (Хз) практически не оказывали отрицательного влияния на индукцию побегов.

В результате исследований было выявлено, что отбор предположительно трансформированных эксплантов льна-долгунца эффективнее проводить на селективных питательных средах, содержащих 50-100 мг/л канамицина, 200 мг/л карбенициллина и 200 мг/л клафорана, на которых получено 29 растений-регенерантов.

Поскольку селекция на устойчивость к канамицину не дает полной гарантии получения трансгенного каллуса и побегов их дополнительно проверяли на NPT-ll-активность. Из трех проанализированных образцов, инфицированных плазмидой А 281 (pTiBo 542) pGA 482, положительный сигнал давали два трансформанта.

Исследования, проведенные нами в Саскетчеванском университете показали, что у гипокотапьных сегментов льна, инокулированных А. .tumefaclens штамма А 281 с векторными плазмидами pGV 3850:pus 3, pGV 3850:200 и GUS INT и помещенных на селективную питательную среду, содержащую 600 мг/л канамицина, 250 мг/л' цефотаксима и 500 мг/л карбенициллина, наблюдалось образовывание почек и побегов. При этом отмечено увеличение регенерационной активности эксплантов, трансформированных плазмидой А 281 (pGV 3850:200). Эта особенность была характерна как для льна-масличного сорта McGregor, так и для льна-долгунца сорта Торжокский 4 (табл. 5). Трансгеннач природа эксплантов доказана наличием GUS-активности (В-глюкуронидазы) с помощью флуорометрического и гистохимического методов анализа. Следует отметить, что эффективность трансформации зависела от генотипа льна. Так, у льна-масличного сорта McGregor все инокулированные аг-робактериями экспланты оказались трансгенными, а доля трансгенных эксплантов у льна-долгунца сортов Торжокский 4 и Славный 82 составила 87,5 % и 50,0 % соответственно. При этом отмечено, что морфогене-тическая активность эксплантов была наиболее высокой у сорта McGregor и наиболее низкой у сорта Славный 82.

Таблица 5

Регенерация зеленых почек на трансформированных зксплантах льна

Вариант опы- McGregor Торжокский 4

та изучено получено изучено экс- получено

эксплантов почек, по- плантов почек, по-

бегов бегов

Контроль 1* 84 391 62 208

Контроль 2** 72 0 72 0

pGV 3850 : pus 3 232 11 272 0

pGV 3850: 200 164 16 192 7

GUS INT 176 5 24 0

Примечание: контроль 1* - культивирование гипокотильных сегментов на среде без канамицина, контроль 2** - культивирование гипокотильных сегментов на среде, содержащей 600 мг/л канамицина, 250 мг/л цефо-таксима и, 500 мг/л карбенициллина.

Коэффициент корреляции между числом почек, образовавшихся in vitro на гипокотильных сегментах и числом трансгенных эксплантов составлял 0,99 (tr=9,9; tos=4,3).

Оценка льна в культуре ткани на устойчивость к канамицину- Ги-покотильные сегменты длиной 8-10 мм, полученные от побегов, в стерильных условиях культивировали в течение 30-ти суток.на агаризован-ных питательных средах, содержащих канамицин в концентрации 50-300 мг/л. В результате экспериментов отмечена повышенная морфогенети-ческая активность эксплантов трансгенных форм льна (Б-1, 12, W), несущих ген устойчивости к канамицину (NPT-H) и гибридов, полученных с использованием этих форм по сравнению с обычными сортами Belinka, Дашковский 2, Р-736 на селективной среде, содержащей канамицин в концентрации 100-200 мг/л. Повышенная морфогенетическая активность эксплантов гибридов Fi и F 2 на селективном фоне свидетельствует об экспрессии у них гена NPT-II и позволяет отобрать трансгенные генотипы.

Оценка льна на устойчивость к канамицину при проращивании семян. При проращивании семян на растворе канамицина в кон цен-трации 500 мг/л у сортов льна Belinka, Дашковский 2, Р-736, McGregor, Norlin было отмечено снижение их всхожести по отношению к контролю в среднем на 50 %. Увеличение селективной нагрузки в два раза привело к полной потере всхожести у перечисленных сортов. У трансгенных форм

-2012, W и L всхожесть семян была на уровне 83-92 % при проращивании на растворе канамицина в концентрации 500 мг/л, а на фоне 1000 мг/л ка-намицина - 59-88 %. Аналогичная тенденция просматривалась и по длине корешков.

Оценка гибридов первого, второго поколений и их родительских форм показала, что у устойчивых родителей и у гибридов наблюдался один тип реакции на действие канамицина. Потеря всхожести их семян на фоне антибиотика по отношению к контролю была на уровне 25 % (500 мг/л Km) и 45 % (1000 мг/л Km).

Таким образом, использование раствора канамицина в концентрации 500 мг/л и 1000 мг/л при проращивании семян, позволяет идентифицировать и отобрать трансгенные генотипы, несущие ген NPT-II.

Оценка льна на устойчивость к гербицидам группы хлорсупьфу-рона при проращивании семян. Семена трансгенных форм: 12, W, L и нетрансгенных сортов льна: Beiinka, , Р-736, McGregor, Noriin, а также гибриды, полученные на их основе, проращивали на растворе гербицида Препарат 1 в концентрации 50 мг/л, 100 мг/л и 200 мг/л. Отмечено, что всхожесть семян нетрансгенных сортов была практически полностью ин-гибирована в присутствии гербицида. Проращивание семян трансгенных форм на растворе гербицида в концентрации 100мг/л и 200 мг/л привело к снижению всхожести соответственно на 20% и 40%. При наличии в растворе 200 мг/л Препарата-1, всхожесть семян у гибридов Fi и F2 комбинации скрещивания 12 х Beiinka была на уровне устойчивого родителя (12) и равнялась 69 %, а в обратной комбинации Beiinka х 12 соответствовала 50 %. Такая реакция гибридов на действие гербицида указывает на наличие у них гена устойчивости к хлорсульфурону, переданную им от устойчивых трансгенных родителей, и возможность идентификации и отбора гербицидоустойчивых форм при проращивании семян на растворе соответствующего гербицида.

Анализ эффективности способов создания генетического разнообразия у льна, с учетом литературных данных и результатов, полученных в ходе этой работы, показывают высокую значимость для селекционного процесса биотехнологических приемов (табл. 6). По времени, необходимому для получения новообразований и родоначальников новых сортов они имеют преимущество перед гибридизацией, а по частоте новообразований они значительно превосходят традиционные способы индуцирования мутаций. Особое место среди биотехнологических методов занимает генетическая трансформация. Практически по всем анализируемым показателям она превосходит остальные. Следует также обратить внимание на гаметсклонапьную изменчивость и культуру незрелых,

недоразвитых зародышей, которые позволяют получить на 100 анализируемых до 29, 39 регенерантов с ценными новообразованиями.

Таблица 6

Эффективность способов создания генетического разнообразия у льна L usitatissimum L.

Способ Частота ценных новооб- Время получения ново- Время получения родона-

ра-зований, образо- чальни- ков сор-

% ваний, год. тов, год.

Внутривидовая гибридизация* 0-30 3-5 5 и более

Межвидовая гибриди- 0 1-3 7 и более

зация

Мутагенез* 0,3-3,3 1-3 3-5

Полиплоидия 0 1 2

Культура протопластов нет данных 1-3 2-4

Генетическая транс- 1-20 1 2

формация*

Сомаклонапьная из- 0-9,0 1-3 2-4

менчивость*

Гаметоклональная из- 0,5-29,0 1-3 2-4

менчивость

Эмбриокультура 0-39,3 1-3 2-4

Примечание: '-способы, с помощью которых созданы сорта, используемые в поизводстве

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛИЗАЦИЯ.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГАПЛОИДОВ ЛЬНА Отбор. Основными методами генетической стабилизации селекционного материала являются отбор и использование гаплоидов.

Как отмечает A.C. Образцов (1981) сами по себе скрещивания, мутагенез и другие методы только создают исходный материал. Получение из него форм, обладающих сочетанием нужных признаков, достигается отбором. Учитывая, что основные хозяйственно ценные признаки имеют полигенный тип наследования, то выщепление генетически однородных растений происходит в поздних поколениях. При этом, чем более генетически отдаленные генотипы взяты в скрещивания, тем длительнее процесс расщепления. Однако даже высокий уровень инбридинга у само-

опылителей и шести-восьмикратный индивидуальный отбор не ликвидируют гетерогенность растений сортовой популяции по признакам, на которые обычно отбор не ведется (Лудилов В.А., 1995; Молчан И.М., Ильина Л.Г., КубаревП.И., 1997). Эти трудности относятся и к селекционному процессу льна- долгунца. По существующей методике на выведение новых сортов льна-долгунца требуется 15 и более лет, на создание родоначальников сортов уходит не менее 5 лет (Рогаш А.Р.,1982). В связи с этим, поиск методов создания генетически выровненного материала за более короткий промежуток времени является весьма актуальным.

Гаплоидия. Известно, что метод гаплоид и и позволяет преодолеть ряд вышоютмеченных трудностей. Гаплоиды и дигаплоиды у льна в настоящее время получают близнецовым методом (Rosenberg L., 1974; Rajhathy T., 1976) и методом культуры пыльников (Nichterlein К, Umbach H., Friedt W.,1989; Sun H., Fu W., Dong L., Liu X.,1991; Sun H., He Z., Wang X.,1993). Исследования по получению гаплоидов у льна активно развиваются. Однако многие вопросы остаются нерешенными. Спонтанное образование гаплоидов у льна. Анализ нескольких десятков сортов и гибридных популяций показал, что спонтанное образование гаплоидов у льна на-велико и в зависимости от года и сорта колеблется в пределах от 0 до 0,04%, в то время как у гибридных растений Fi, полученных при межсортовой гибридизации, матроклинные гаплоиды составляют 0,06-0,24%.

Образование гаплоидов у льна при опылении "чужеродной" пыльцой и обработке кастрированных цветков химическими веществами. Опыление кастрированных цветков культурного льна пыльцой диких видов L. grandiflorum и L. perenne и последующим (через 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 и 24 часа) опылением пыльцой льна L. usitatissimum привело к образованию 12495 семян, из которых 8291 были нормально сформированными. Из нормальноразвитых семян получено 7578 растений, среди которых обнаружено 18 гаплоидов (0,24%). Наибольшее число гаплоидов образовалось в вариантах, где кастрированные цветки сортов культурного льна были опылены смесью пыльцы видов льна L. grandiflorum и L. usitatissimum, атаже в варианте, где после нанесения пыльцы дикого вида льна через 3-4 часа на рыльца пестиков наносили пыльцу культурного льна. В вариантах межсортового скрещивания получены единичные гаплоидные растения, составляющие 0,120,24% от общего числа. Однако низкий выход гаплоидов, трудность их своевременной идентификации не позволяют рекомендовать этот метод к использованию в селекционной практике

В вариантах обработки кастрированных цветков раствором молочной кислоты в концентрации 0,5%, 1,0% и ДМСО -0,1%, 10% и последующего опылен^ пыльцой того же вида обнаружены гаплоидные растения, которые составляли от 0,4% до 1,5%! Достигнутый уровень частоты появления гаплоидов нельзя считать достаточным для использования в селекционной практике. В связи с этим, нами апробированы другие способы получения гаплоидов льна на основе полиэмбрионии. Использование полиэмбрионии для получения гаплоидов льна. Капперт (Kappert Н., 1933) на основании изучения полиэмбрионии у льна показал возможность использования близнецовых растений в качестве источника гаплоидов.

Нами проанализировано 625000 проростков, относящихся к 130 сортооб-разцам льна. Обнаружено 210 (0,034%) семян, каждое из которых произвело по два растения и четыре (0,0006%) семени, из которых получено по три растения. Средняя частота полиэмбрионии составила 0,034%.

Исследования по выявлению связи между полиэмбрионией и отдельными факторами, влияющими на рост и развитие растений, позволили обнаружить увеличение выхода полиэмбрионов у сортов Belinka, Торжокский 4, Верхневолжский и ряде других, обработанных в фазы начало быстрого роста-цветение растворами двухромовокислого калия в концентрации 0,1-5,0%, никотинамида - 0,001-1,0%, метабисульфита натрия -1,0-10,0%, диметилсульфоксида - 1,0-10,0%. Обработка этими веществами позволила получить полиэмбриональные семена у сортов, которые при других условиях не производили близнецовые растения и усилить полиэмбрионию у сортов, склонных к образованию близнецовых растений. При этом, наряду с диплоидно-диплоидными парами, обнаружены диплоидно-гаплоидные пары. Изучение

сортообразцов, выращенных в одинаковых условиях, показало, что образование полиэмбриональных семян в значительной степени обусловлено их генотипом. Так, близнецовые проростки у сортов: Садко, С-108, Надежный, 1288« (СССР), Lintex (ГДР), Natasia, Ninke (Нидерланды), Minerva , Cristal (США) и др. составляли 0,05-0,2%, а у сортов: Светоч, Лазурный,Торжокский 4 (СССР), к-7222, Тайга (Франция) они не были обнаружены даже при анализе выборки 10-16 тыс.лроростков.

Цитологический анализ 143 пар и троен близнецов, среди которых не было гибели растений, позволил установить, что гаплоидные растения в них составляют около 30%, в то время как спонтанная частота появления

неблизнецовых гаплоидов у льна не превышала 0,04%. Анализ ре-ципрокных гибридов выявил, что вовлечение в скрещивания сортов Ottava 770В, Deep-pink увеличивает вероятность появления близнецовых пар, использование сортов 128812,Тверца понижает уровень полиэм-брионии, а сорта Crista!, Тайга не оказывают существенного изменения на изучаемый признак при использовании их как в качестве материнской, так и в качестве отцовской формы. Эти данные позво-

лили нам сделать предположение о наличии трех типов взаимодействия цитоплазмы и ядра у льна: первый тип -цитоплазма, стимулирующая появление полиэмбриональных семян, второй тип-цитоплазма нейтральная, не оказывающая существенного влияния на проявление полиэм-брионии, третий тип -цитоплазма, ингибирующая полиэмбрионию.

Причины, приводящие к усилению полиэмбрионии в первых поколениях, слабо изучены. В связи с этим необходимо отметить факт резкого увеличения полиэмбрионии при скрещиваний отдельных генотипов, сопровождающийся образованием гапло- диплоидных пар близнецов. Так, в комбинации скрещивания Ottava 770В х 128812 среди гибридных растений Fi обнаружено 11 пар близнецов, 9 из которых состояли из диплоидно-гаплоидных сочетаний растений. Этот факт заметного увеличения частоты появления близнецовых растений у гибридов Fi внутривидовых скрещиваний может иметь практическое значение. Например, при определенном подборе материнского и отцовского компонентов скрещивания уже в Fi гибридов появляется возможность получить большое число гаплоидных растений. Последующие

исследования показали, что использование в качестве отцовских компонентов скрещивания сортов Призыв 81, Rocket 4 и ряда других повышает частоту появления полиэмбриональных семян у сортов, не склонных к полиэмбрионии с 0,06% до 2,06 % и с 7,6% до 36,8% у генотипов, склонных к полиэмбрионии. Отмечено, что почти половина близнецов состоит из гаплоидных растений. Диплоидизация гаплоидов льна. Изучение нескольких сотен гаплоидов льна, относящихся к виду L. usitatissimum L. показало,что спонтанное удвоение наборов хромосом происходит крайне редко. Только в отдельные годы на некоторых генотипах можно получить единичные нормально развитые семена. В связи с этим, поиск способов . удвоения хромосом у гаплоидов льна является насущной задачей.

В наших опытах гаплоидные растения, полученные на основе поли-эмбрионии, диплоидизировали колхицином в концентрации 0,05% и 1,0% в течение 24 и 48 часов в фазы быстрого роста, бутонизации и цветения. У колхицинируемых в фазу цветения растений предварительно удаляли соцветия. Отмечено преимущество обработки растений в фазу цветения по сравнению с другими. Так, при колхицинировании гаплоидов в фазу цветения, в среднем, на каждом из обработанных растений завязалось 6,5 семян, в то время как в аналогичных вариантах обработки растений в фазы быстрого роста-бутонизации - 0,2. Методика удвоения числа хомосом у льна относительно проста и достаточно эффективна. Она позволяет получать 70-90-дигаплоидных растений на 100 колхицинированных. С ее использованием удвоены хромосомы у более 200 гаплоидов.

Генетическая стабилизация признаков при использовании близнецовых гаплоидов. Нами изучено несколько десятков дигаплоид-ных линий, полученных от разных генотипов льна-долгунца. Анализ ди-гаплоидов первого поколения выявил, что по высоте растений, числу семян, массе волокна они уступают контрольным растениям - близнецовым диплоидам. Это, видимо, объясняется последействием колхицина, для которого характерны токсические свойства, явно выраженные в год обработки растений.

Изучение показало,что дигаплоиды различаются между собой и могут отличаться от исходных генотипов по ряду признаков. Эта закономерность была характерна для дигаплоидов сортов Верхневолжский, Лазурный, Прогресс и подтверждена исследованием 5 поколений. Кроме того, некоторые дигаплоиды, выделенные из сорта Верхневолжский, были более устойчивы к фузариозу, чем исходные сорта.

Феномен получения дигаплоидов, отличающихся от родительских сортов,- возможно объясняется гетерозиготностью исходных генотипов. В случае проявления рецессивных генов у гаплоидов и их сохранения в гомозиготном состоянии, при переводе на диплоидный уровень, могут образовываться формы с измененными признаками по сравнению с исходными сортами.

Отмечено, что по большинству изученных признаков коэффициенты вариации несколько ниже у линий, созданных на основе близнецовых диплоидных растений, и более низкие у дигаплоидов (табл. 7). Эти данные могут свидетельствовать о более быстрой стабилизации признаков при использовании метода гаплоидии.

Значения коэффициентов вариации признаков у дигаплоидов

Генотип Высота Техн. Масса техн. Масса во- % во-

растении часть части локна локна

Верхн.* 14,3 18,2 45,4 47,2 10,1

Верхн. 1 11,8 11,7 29,0 29,3 6,4

Верхн. 1** 2,6 2,0 15,3 14,3 3,4

Верхн. 2 12,8 11,8 35,6 38,2 6,0

Верхн. 2** 9,4 9,3 29,5 26,5 5,5

Верхн. 3 10,4 9,6 ■ 36,6 38,1 6,1

Верхн. 3" 3,1. 3,1 12,9 13,6 5,2

Примечание: Верхн.* - Верхневолжский; ** - дигаплоид; 1, 2, 3 - близнецовые диплоидные растения

Изучение устойчивости дигаплоидов к фузариозному увяданию на ин-фекционно-провокационном фоне показало возможность создания высокоустойчивых линий льна-долгунца на базе слабоустойчивых в течение одного поколения (табл. 8).

Таблица 8

Степень поражения льна-долгунца Fusarium oxysporum на

инфекционно-провокационном фоне. 1991-1995 гг.

Генотип Изученр растений Поражено растений Степень поражения

шт. %+2Sp р.в., %*** %+2Sp р.в., %***

Верхн.* 29 58,6+18,3 14,3-87,5 40,6+18,2 9,5-58,3

Верхн. 1 28 71,4+17,1 16,7-100 47,2+18,9 5,5-100

Верхн. 1** 24 4,2+8,2 0-12,5 2,1+5,9 0-8,3

Верхн. 2 28 32,1+17,6 14,3-75,0 23,2+16,0 0-50,0

Верхн. 2** 32 12,5+11,7 0-50 8,3+9,8 0-33,3

Верхн. 3 27 51,9+19,2 25,0-80,0 35,1 + 18,4 2,5-66,7

Верхн. 3** 28 3,6+7,0 0-12,5 3,1+6,6 0-12,5

Примечание: Верхн.* - Верхневолжский; ** - дигаплоид; р.в.*** - размах варьирования; 1, 2, 3 - близнецовые диплоидные растения Последующие исследования показали возможность отбора потомств из дигаплоидов, которые по ряду признаков отличаются от исходных дигаплоидов. Так, дигаплоид 2" имел меньшую высоту растений, длину и массу технической части стебля, массу волокна, производил меньше семян по сравнению с линией 2"-1-6 (табл. 9). Кроме того, линии, отобранные из этого дигаплоида, различались по морфологическим признакам и устой-

чивости к ржавчине (Ме1атр5ога |]п|),

Таблица 9

Характеристика линий льна-долгунца, полученных на основе _дигаплоидов. 1993 г._

Сорт, линия Высо- Техн. Масса тех Число Масса во- '% во-

та длина части семян локна локна

см см мг шт мг

Алексим 100,7 93,0 395,6 9,0 147,5 37,3

Верхн.** 101,5 90,3 620,5 16,8 221,2 35,6

Верхн. 2' 94,8 86,7 428,3 17,8 157,7 36,8

Верхн. 2" 103,3 92,2 429,2 19,0 142,0 33,1

Верхн. 2"-1 116,8* 105,7* 415,7 12,8 150,2 36,1*

Верхн.2"-1-3 114,3* 104,3* 499,1 15,4 179,7 36,0*

Верхн. 2"-1-6 121,3*- 111,0* 617,2* 17,0 214,7* 34,8*

HCPos 4,4 5,0 114,3 6,8 54,5 1,4

Примечание: '-различия существенны при сравнении линий с исходным дигаплоидом (Р= 0,95); Верхн.** - Верхневолжский; 2', 2" - близнецовая пара; 2'- диплоид; 2"- дигаплоид; 2"-1-..линии, полученные на основе ди-гаплоида

Факт расщепления дигаплоидов по количественным признакам и устойчивости к ржавчине может свидетельствовать о полиплоидном происхождении льна культурного и позволяет предположить, что в ряде случаев генетическая неоднородность может быть результатом гетерогенности пыльцевых зерен, и в случае возникновения необычных условий среды в период их формирования и опыления растений нетипичные, генетически отличающиеся от основной массы пыльцевые зерна могут иметь преимущество в оплодотворяющей способности. В типичных же условиях оплодотворение происходит "типичной" пыльцой. Это предположение позволяет объяснить такие "необычные" явления, как быстрое вырождение сорта, генотрофия и ряд других. Культура пыльников. Наиболее перспективный подход к разработке технологии получения гаплоидов, отвечающий современным требованиям-это культивирование пыльников или пыльцы in vitro (Хотылева JIB. и др., 1991).

Проведенные исследования показали, что эффективность культуры пыльников у'льна генетически детерминирована. Реализация потенциальных возможностей генотипов при каллусогенезе и морфогенезе зависит от условий выращивания донорных растений, стадии микроспор, ус-

ловий предобработки исходных эксплантов, состава питательных сред и условий культивирования пыльников.

Влияние условий выращивания донорных растений на каллусо-генез пыльников льна. Выращивание растений льна-долгунца в естественных условиях не обеспечивало получение растительного материала, способного формировать гаплоидный каллус или эмбриоиды в культуре пыльников. В связи с этим было исследовано влияние ряда биологически активных веществ, пониженной температуры, обильного удобрения донорных растений с целью повышения андрогенетической способности генотипов.

Отмечено, что выдерживание пыльников в течение 1 суток при температуре + 4° С и воздействие НУК в концентрации 10 мг/л и пакпобутра-зола в концентрации 10 мг/л и 50 мг/л индуцирует образование морфо-генетических Р-зерен.

Установлено, что воздействие на соцветия льна низкой температурой (4°С) в течение 12-72 часов не способствует образованию пыльников с новообразованиями. Предобработка пыльников низкими температурами (4°С) по разному влияет на разные генотипы льна и не является стабильной по годам.

В совместном эксперименте с Институтом натуральных волокон (Польша) и фирмой Агритек (Чехия) изучалось влияние дополнительного удобрения (обильного питания) донорных растений в период роста на каллусогенез льна в культуре пыльников. В этом опыте растения выращивали с площадью питания 6,25 см2 и 25 см" и периодически, начиная с фазы быстрого роста, каждые две недели подкармливали питательным раствором, состоящим из минеральных веществ среды ЭИ. Результаты, полученные во всех организациях, были близкими и показывали, что дополнительные подкормки растений увеличивают частоту пыльников с новообразованиями с 8,4 + 1,7% до 16,0 + 2,5 %.

Изучение влияния стадии пыльцы на интенсивность каллусогенеза в культуре пыльников льна в наших опытах показало, что д- получения новообразований предпочтительно использовать пыльцевые зерна, находящиеся на стадии одноядерной вакуолизиррванной микроспоры. Так, культивирование пыльников, содержащих пыльцу на стадии вакуолизи-рованной одноядерной микроспоры, позволяет получить, в зависимости от генотипа, от 7,0% до 15,0% (в среднем 10,8%) новообразований. В то время как пыльники, содержащие пыльцу на стадиях одноядерной нева-куолизированной или двуядерной микроспоры, производили соответственно от 2,0% до 9,0% (в среднем 4,7%) и от 0% до 1,5% (в среднем 0,8%) новообразований.

<

Индуцирование каллусо- и органогенеза у исходных эксплантов.

Исследования показали, что после недели культивирования наибольшая часть микроспор погибает. После трех недель культивирования в ряде пыльников на основе микроспор образуются многоклеточные структуры. В 1992 г. мы исследовали 207 пыльников и обнаружили 28 таких структур (9,2%), относящихся к 19 пыльникам. Одновременно наблюдалось образование каллуса на основе диплоидных тканей связника и остаточных частей тычиночных нитей. Так, 58 пыльников (28%) имели каллусирующий связник и 40 пыльников (19,3%) каллусирующие тычиночные нити. В этих экспериментах отмечалось одновременное образование многоклеточных структур на основе как микроспор, так и связников, и остатков тычиночных нитей. Это приводило к образованию в пределах одного экспланта гаплоидной и диплоидной типов ткани и осложняло получение гаплоидов. Использование разработанной нами технологии культивирования пыльников, как правило, сопровождалось образованием каллуса. Формирование эмбриоидов непосредственно на основе пыльника носило нерегулярный характер.

Проведена серия экспериментов по выявлению эффективности культивирования пыльников при доступе света и в темноте. Установлено, что отсутствие света существенно (с 2,9-5,5% до 6,9-15,1%) увеличивает долю пыльников с новообразованиями.

Питательные среды Sh-2 и LMK-3 усиливали каллусогенез пыльников льна и позволяли получить при отсутствии света 19-22% пыльников с новообразованиями у различных генотипов. Каллусогенез у пыльников льна-долгунца продолжался в течение двух месяцев. Наиболее активно он проходил в первой половине культивирования. Интенсивность каллу-согенеза зависела от генотипа. Перенос каплусирующих пыльников на питательные среды: Sh-2, A-22m, содержащие БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК- 0,05 мг/л или зеатин -1,0 мг/л,сопровождался образованием почек и побегов. Проведенные исследования позволили уточнить ряд других условий культивирования пыльников льна-долгунца in vitro и получить в зависимости от генотипа от 0 до 10% дигаплоидов. Однако достигнутый уровень регенерации растений (в среднем 1,2%) и высокая частота наследственных изменений признаков не позволяют рекомендовать андрогенез in vitro для генетической стабилизации селекционного материала.

Получение гаплоидов льна методом "qrandiflorum". Опыление кастрированных цветков L. usitatissimum пыльцой L. grandiflorum сопровождалось образованием 28 - 55 коробочек на 100 опыленных цветков. Извлеченные семена на 6-25 сутки после опыления были белого цвета и

не содержали видимых зародышей. В то же самое время семена, полученные при самоопылении, на 5 - 7 день были зеленого цвета, а зародыши - почти такого же размера, как и зрелые. В среднем, в зависимости от года исследований и генотипа,завязывалось 28-55 коробочек на 100 опыленных цветков, 5-7 нежизнеспособных семян на коробочку и 1,5 -4,3 семян на одно скрещивание.

Установлено, что для получения жизнеспособных зародышей необходимо культивирование in vitro незрелых семян. Использование питательных сред: LMA - 1, LMK - 3, MS, Sh-2, позволяло получить от 0,50 % до 26% зеленых зародышей от числа культивируемых семян: При этом наилучшие результаты получены на среде Sh - 2, на которой образовывалось 11-26 зеленых зародышей на 100 семян (табл. 10).

Таблица 10

Образование зеленых зародышей на питательных средах при

гибридизации L. usitatissimum х L. grandiflorum

Годы Питательная среда Культивировалось семян Получено зеленых зародышей

всего, un- шт % + Sp

1993 Sh-2 1131 290 25,6+1,3

MS 1007 186 18,5+1,2

1995 Sh-2 945 141 14,9+ 1,2

LMK - 3 935 123 13,1 + 1,1

LMA - 1 880 97 11,0 + 1,1

1996 Sh-2 168 19 11,3+2,4*

Bl 258 10 3,9+1,2

Регрессионный анализ экспериментальных данных, полученных в 1996 г., показал высокую зависимость выхода зеленых зародышей от возраста семян (r=0,87; tr=10,88; tos=3,18). Использование 20 суточных семян в качестве исходных эксплантов в 1995 г. и последующие годы приводило к образованию наибольшего количества зеленых зародышей (20-21 шт. на 100 семян) по сравнению с другими вариантами опытов.

Важным фактором регулирования морфогенеза в условиях in vitro являются регуляторы роста и их концентрация. Выявлено, что наибольший выход зеленых зародышей (14,8%) отмечался на среде Sh-2, содержащей БА в концентрации 1 мг/л в сочетании с НУК - 0,05 мг/л. Использование этого варианта среды приводило к образованию жизнеспособных

побегов, которые по морфологическим признакам соответствовали материнскому типу растений (L. usitatissimum). На их основе были получен! ы фертильные регенеранты, которые были однородны и по изученным признакам соответствовали L^usitatissimum. Образование гаплоидов отмечено лишь в единичных случах.

Изучение потомств 29 регенерантов, полученных из семян межвидовых гибридов Fi в течение 1996-1997 гт,. не выявило ни одного случая расщепления растений по окраске лепестков. Эти результаты свидетельствуют о том, что культивирование семян и зародышей, полученных при межвидовой гибридизации in vitro, не влечет за собой изменение моногенных признаков.

Использование электрофореза для изучения регенерантов, полученных in vitro при культивировании семян гибридов Fi L. usitatissimum х L. grandiflorum в отделе белков и нуклеиновых кислот ВИР, не выявило у регенерантов наличия фракций, присущих виду L. grandiflorum.

Анализ состава жирных кислот семян этих же регенерантов, проведенный в Институте натуральных волокон методом HPLC, не показал различий между регенерантами, а также между регенерантом и исходным материнским сортом Славный 82 ни по одной из 9 изученных жирных кислот.

Эти данные показывают,что регенеранты, получаемые из семян гибридов Fi L. usitatissimum х L. grandiflorum, являются дигаплоидами со спонтанно удвоенным набором хромосом.

Сравнительный анализ эффективности способов получения гаплоидов и дигаплоидов у льна L. usitatissimum L. также показывает , что метод "grandiflorum" является наиболее перспективным. В зависимости от года, генотипа и условий культивмровния этот метод позволяет получать дигаплоиды с частотой 9-26 на 100 ¿льтивируемых семян (табл. 11). Высокая выровненность регенерантов, полученных таким способом, относительно несложная и достаточно эффективная технология получения растений от любых генотипов, позволяет рекомендовать этот способ для использования в селекционном процессе для стабилизации генотипов. Удовлетворительные результаты, полученные при использовании методов индуцирования полиэмбрионии, могут быть использованы при производстве гаплоидов в случае отсутствия биотехнологического оборудования. Высокая выровненность регенерантов, полученных таким способом, относительно несложная и достаточно эффективная технология получения растений от любых генотипов, позволяет рекомендовать этот способ для использования в селекционном процессе для стабилизации

генотипов. Удовлетворительные результаты, полученные при использовании методов индуцирования полиэмбрионии, могут быть использованы при производстве гаплоидов в случае отсутствия биотехнологического оборудования.

Таблица 11

Эффективность способов получения гаплоидов и дигаплоидов

у льна I-. и5йаУ15атит 1_.

Способ получения Частота образования, % Возможность получения от любых генотипов Риск мутирования

Гаплоидов дигаплоидов

Спонтанное образование 0-0,04 0 неудовлетворительная 0

Опыление пыльцой диких видов 0-0,24 0 неудовлетворительная 0

Обработка бутонов раствором ДМСО 0-0,24 0 неудовлетворительная ~0

Обработка бутонов молочной кислотой 0-1,5 0 удовлетворительная -0

Спонтанное образование близнецов 0-0,1 0 неудовлетворительная 0

Обработка растений раствором ДМСО -0,02 0 неудовлетворительная - 0

Использование индукторов полиэмбрионии 0,031,03 0 удовлетворительная 0

Культура пыльников -0 0-10 средняя высокая

"СгапсШ1огит" ~0 9,0-25,6 хорошая ~0

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОТИПОВ

В настоящее время в селекции существует традиционный принцип идентификации генотипа по его фенотипу-испытание его потомства. Однако частота встречаемости уникальных генотипов в реальных популяциях столь низка, а популяции столь объемны, что селекционер вынужден на первых этапах селекции браковать по фенотипам до 80-90% особей расщепляющейся популяции. При отсутствии надежных методов идентификации генотипов по их фенотипам безвозвратно теряется большая часть ценных форм (Драгавцев В.А., 1993). Поэтому многие исследователи уделяют пристальное внимание этой проблеме и ведут по-

иски путей идентификации генотипов различными методами (Созинов A.A., Попереля Ф.А, 1972; Конарев В.Г., 1980; Гаврилкж И.П., Дягилева Г.Е., 1975; Василевская Г.А., 1979; Friedt W., 1996; Cullis С., 1991; 1995).

Для установления генотипических особенностей растений используются различные способы: составление генетических карт (молекулярный анализ), анализ ферментов, посев на специальных фонах и др. Однако до настоящего времени основным критерием при идентификации сортов и гибридов служат морфологические признаки.

Лен (L. usitatissimum L.) имеет малое число контрастных морфологических признаков и является трудной культурой с точки зрения идентификации его генотипов.

Использование маркерных признаков. У льна маркерными признаками служат окраска пыльников, лепестков и семян (Pero Г.Р., 1928, Дунаева Г.В., 1970). Известно также, что крапчатость чашелистиков и опу-шенность перегородок коробочек, растрескиваемость коробочек являются четкими, генетически детерминированными признаками у льна. Однако известно мало маркерных признаков для идентификации генотипов льна на ранних этапах развития.

При обследовании более 200 генотипов льна обнаружено, что растения в период "всходы-" елочка" различаются по окраске гипокотиля. Установлено, что у сортов Crystal (к-6295), Ottava 770В (к-4035) гипокотиль не имеет антоцианового окрашивания, а у сортов 1288^ (к-4457), Тверца (к-6765), Тайга (к-7222), Deep-pink (к-4043) и многих других, гипокотиль имеет антоциановое окрашивание. Выявлено наличие антоциановой окраски у гибридов Fi, у которых хотя бы один из родителей имел пигментированный гипокотиль. Соотношение растений с пигментированными и непигментированными гипокотилями в F2 соответствовало расщеплению 3:1. Эти результаты доказывают, что окраска гипокотиля контролируется ядерными генами и является доминантным признаком. Данный признак легко поддается анализу, проявляется на первых этапах развития растений и его можно успешно использовать в качестве маркерного признака. При изучении коллекции обнаружены сортообразцы льна, различающиеся по степени проявления воскового налета на семядольных и настоящих листьях проростков. Установлено, что сорта: Томский 10, Союз, Надежный, Istru, Minerva, Bertelsdorfer, Bison, Blay d' Oplang имеют хорошо выраженный восковой напет, сорта: ВНИИЛ-11, Томский 12, 128812, Светоч, Тверца, ВНИИЛ-17, Лазурный, Тайга, Полесский 4, Смоленский, Оршанский 2, Могилевский, Торжокский 4 и др., имеют слабо выраженный восковой налет, а у сортов' Садко, Ottava 770В, Crystal, Deep-pink

восковой налет отсутствует. Анализ гибридов Fi, полученных от скрещивания сортов, контрастных по изучаемому признаку, показал промежуточный тип наследования этого признака.

В 1983 г. нами из сорта Надежный выделена линия (потомство близнецового растения), имеющая темно-фиолетовую окраску кончиков листьев. Данный признак проявлялся у всех растений, выращенных в разные сроки посева и на разных агрофонах. Подкормка растений сернокислым цинком не изменила пигментацию листьев. Скрещивание этой линии с исходным и другими генотипами и последующий анализ гибридов Fi и F2 показал полигенный тип наследования этого признака.

Наряду с этими способами идентификации оценка генотипов in vitro, в ряде случаев, может дополнить их.

Оценка льна на устойчивость к гербицидам группы хлорсульфу-рона в вегетационных опытах. Материалом для изучения служили формы льна, полученные на основе реципрокных скрещиваний сортов льна-долгунца: Beiinka, Дашковский 2, Р-736 с трансгенными гербицидо-устойчивыми формами льна: 12, W, несущими ген (ALS) устойчивости к гербицидам группы хлорсульфурона. В качестве стандартов использовались сорта льна-долгунца Алексим и А-29. Гербицид Препарат 1 в дозах из расчета 10 г/га, 20 г/га, 50 г/га, 75 г/га по действующему веществу вносили в почву перед посевом, а также обрабатывали им растения в фазы "всходы" и "елочка".

Установлено, что лучшим способом для оценки форм льна с повышенной устойчивостью к хлорсульфурону является внесение Препарата 1 в почву перед посевом. У генотипов льна, у которых отсутствовал ген гербицидоустойчивости, высеян&е семена не всходили. В то же время гербицид не оказывал столь угнетающего действия на растения льна, несущих этот ген (ALS). Было отмечено, что общая высота растений, полученных на основе гибридов и их устойчивых родителе^ снижается по отношению к контролю в среднем на 10-15 %, а количество семян с растения не уменьшается.

Учитывая достоверность коэффициентов корреляции между регене-рационной способностью и продуктивностью растений на гербицидном фоне (r=0,88, tr=2,95, tos=2,37), оценку образцов по устойчивости к гербициду можно осуществлять как вегетационным, так и лабораторными методами (табл. 12).

Коэффициенты корреляции признаков при сравнении разных _методов гербицидоустойчивости_

Сравниваемые методы г tr

Регенерационная способность гипокотильных сегментов (кт,100 мг/л) - всхожесть семян (Препарат 1, 200 мг/л) 0,77* 2,96

Регенерационная способность гипокотильных сегментов (кт,100 мг/л)- продуктивность растений (Препарат 1, 50 г/га до посева) 0,68* 2,95

Всхожесть семян (Препарат 1, 200 мг/л) - продуктивность растений (Препарат 1, 50 г/га до посева) 0,65* 2,70

Примечание: *- достоверно при Р=0,95 (tos = 2,37)

Оценка на устойчивость к фузариозу (Fusarium oxysporum f. sp. lini). Из многочисленных болезней льна-долгунца наиболее вредоносным является фузариоз, вызываемый грибом из рода Fusarium. При сильной степени заражения посевов льна фузариозом урожай соломы . может снижаться до 60%, семян - до 80% (Лошакова Н.И., 1994).

В настоящее время оценка льна на устойчивость к фузариозу осуществляется в провокационных питомниках. Однако такая оценка трудоемка и не всегда дает надежные результаты. Известно, что применение токсинов может быть эффективнее по сравнению с использованием живых культур, так как реакция растений на токсины в меньшей степени зависит от погодных условий (Никуленко Г.Ф., Чкаников Д.И., 1987).

В наших опытах использовались 3 штамма F. oxysporum, различающиеся по вирулентности: 162 - слабовирулентный, 102 и 159 - сильновирулентные, которые были любезно предоставлены нам для исследований канд. с.-х. наук Н.И. Лошаковой.

Существенной разницы по интенсивности роста первичных корешков между сортами Славный 82 и Areko в контрольных вариантах (проращивание семян на фильтровальной бумаге, смоченной водой и питательной средой) не наблюдалось. Отмечено, что добавление культуральной жидкости грибов F. oxisporum подавляет рост корешков во всех вариантах. В варианте же ¡1роращивания семян в течение двух суток на фильтровальной бумаге, смоченной водой, а затем на культуральной жидкости и варианте проращивания семян на культуральной жидкости в течение суток с последующим культивированием их на воде, обнаружено снижение интенсивности роста первичных корешков у неустойчивого сорта Славный 82 по сравнению с устойчивым сортом Areko (табл. 13).

Таблица13

Влияние 30 суточной культуральной жидкости грибов F. oxysporum

Вриант опыта Прирост корешков на 3-й сутки, %

Славный 82 (S)* Areco (R)**

Проращивание на воде 125 122

Проращивание на среде 311 363 363

Проращивание на к.ж. 0 0

Проращивание 1 сут. на воде + 2 сут. на к.ж.*** 141 141

Проращивание 2 сут. на воде + 1 сут. на к.ж. 16 .45

Проращивание 1 сут. на к.ж. + 2 сут. на воде 1237 1750

Примечание: S* - неустойчивый; R** - устойчивый; к.ж.*** - культуральная жидкость F. oxysporum

Оценка на устойчивость к знтракнозу (Colletotrichum lini Mannas et Bollev). Антракноз является распространенным и вредоносным заболеванием льна в России. В настоящее время отсутствуют сорта льна-долгунца, устойчивые к Colietotrihum lini (Кудрявцева Л.П., 1994).

Для разработки методики экспресс-оценки льна на устойчивость к С. lini использовались 3 штамма Colietotrihum lini, различающиеся по вирулентности: 86 - слабовирулентный, 178 и 226 - сильновирулентные, которые были любезно предостазлень: для исследований канд. с.-х. наук Л.П. Кудрявцевой.

Культивирование гриба на среде Sh в течение 15-70 суток в наших исследованиях, приводило к образованию токсичной культуральной жидкости. Проращивание семян льна на культуральной жидкости позволило обнаружить различия между устойчивыми (Leona и 130.3) и неустойчивыми генотипами (Г-1478 и БТЛ-13) по длине первичных корешков. Различия проявлялись преимущественно у 3-х суточных проростков и при использовании 25 и 70 суточной культуральной жидкости сильнсзиру-лентного штамма 178 и популяции штаммов. При этом, у' устойчивых к антракнозу генотипов льна наблюдалось меньшее снижение роста первичного корешка, чем у неустойчивых (табл. 14). Использование слабовирулентного штамма не было эффективно.

Влияние культурапьной жидкости грибов С. Пгн на прирост первичных корешков льна. Популяция штаммов

Вариант опыта Прирост корешков на 3-й сутки, %

БТЛ-13 (S)* Г-1478 (S) Leona (R)** 130.3 (R)

Проращивание на воде 100 100 100 100s

Проращивание на 20 сут. к.ж.*** 40,7 38,3 34,3 37,3

Проращивание на 25 сут. к.ж. 16,7 23,3 29,8 32,8

Проращивание на 70 сут. к. ж. 0 1,7 2,9 2,9

Примечание: S* - неустойчивый; R** - устойчивый; к.ж.*** - культуральная жидкость С. lin:

Оценка на устойчивость к алюминию. Токсичное действие почвенной кислотности связано с высоким содержанием ионов водорода и ряда микроэлементов, подвижность которых резко возрастает на фоне низких значений рН почвенного ратвора. Наиболее негативно сказывается на жизнедеятельности растений избыток алюминия в почве. Кроме того, этот токсикант чаще других распространен з кислых почвах Нечерноземной зоны Российской Федерации (Косарева И.А., Давыдова Г.В., Семенова ЕВ., 1995).

Растения наиболее уязвимы к избытку подвижного алюминия в почве на ранних фазах онтогенеза. Показана достаточно высокая корреляция результатов ранней диагностики с данными полевых испытаний (Кпима-шевский Э.Л., 1991; Aniol А., 1991; Косарева И.А., Давыдова Г.В., Семенова Е. В., 1995).

В исследованиях семена проращивали на растворе хлорида алюминия по модифицированной нами методике Косаревой И.А., Давыдовой Г.В., Семеновой Е.В. (1995). В результате лабораторной оценки более 30 сортов установлено, что лен обладает высокой устойчивостью к этому веществу. Отмечен хо: оший рост первичных корешков у абсолютного большинства сортов льна при проращивании семян на растворе хлорида алюминия в концентрации 44 мг/л, 87 мг/л, 174 мг/л, 251 мг/л, 426 мг/л, 600 мг/л и 1000 мг/л. Существенные различия по алюмоустойчивости проявились на фоне 600 мг/л,- 1400 мг/л и 2200 мг/л хлорида алюминия. По этому признаку сорта льна-долгунца были разделены на три группы. В группу высокоустойчи dix к хлориду алюминия генотипов вошли: сорт

Агесо, дигаплоид 3, выделенный из сорта Верхневолжский,и некоторые другие. В группу со средней устойчивостью - сорта Алексим, ТЕ 93/13, Могилевский и другие. В группу с низкой устойчивостью - Г-1351, Славный 82, Laura и другие.

Необходимость использования трех концентраций хлорида алюминия обусловлена разной устойчивостью сортов. У ряда генотипов (Г-1351, Laura) наблюдалось резкое снижение роста первичного корня на фоне 600 мг/л хлорида алюминия. У большинства же сортов льна резкое снижение роста корней отмечено при проращивании семян на растворе хлорида алюминия в концентрации до 1400 мг/л (ТЕ 93/13, Славный 82). У ряда сортов льна устойчивость проявлялась на таких концентрациях и не проявлялась при более высоких. К таким сортам относятся Алексим, Верхневолжский, Marina и ряд других. Некоторые генотипы: сорт Агесо, дигаплоид 3, выделенный из сорта Верхневолжский и линия, полученная на основе регенеранта Славный 82, проявляли устойчивость и при более высокой концентрации хлорида алюминия - 2200 мг/л. При этом реакция изученных генотипов на действие хлорида алюминия была близкой. Значения коэффициентов корреляции были достоверны и находились в интервале от - 0,95 до - 0,98.

Идентификация гаплоидов. Для идентификации гаплоидов можно успешно использовать метод маркерных признаков. Наши исследования показали, что для предварительной идентификации гаплоидов такие признаки, как окраска гипокотилей, наличие воскового налета на семядолях и настоящих листьях могут быть успешно использованы. Кроме того, гаплоиды льна по комплексу признаков значительно отличаются от дип-лоидов. С уменьшением плоидности растений льна связано уменьшение репродуктивных и вегетативных органов. Эти различия проявляются на всех этапах роста. Так, первичные корешки гаплоидов характеризуются более тонким диаметром и меньшей длиной по сравнению с диплоида-ми. Диаметр бутонов у гаплоидов в 1,4 раза меньше, чем у диплоидов; длина пыльника гаплоида в 1,9 раза меньше, чем у диплоида; ширина пыльника гаплоида в 1,3 раза меньше, чем у диплоида.

Эти органы у гаплоидов имеют меньшие размеры из-за того, что составляющие их клетки также уменьшены по сравнению с диплоидами Так, диаметр пыльцевых зерен гаплоидов в 1,8 раза меньше, чем у диплоидов; диаметр ядра клеток в меристеме корешка у гаплоидов в 1,7 раза меньше, чем у диплоидов. Гаплоиды льна с высокой точностью могут быть определены по размерам замыкающих клеток устьиц и по их числу на единицу площади листа. Длина замыкающих клеток устьиц у гаплоидов в 1,4 раза меньше, чем у диплоидов, зато число устьиц на 1 мм2

нижней стороны листа у гаплоидов было в 1,6 раза больше, чем у дип-лоидов. Характерной особенностью изученных гаплоидов льна является полная стерильность их пыльцы.

РАЗМНОЖЕНИЕ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА IN VITRO.

ПОЛУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАНТОВ Традиционное размножение льна-долгунца. Лен Linum usitatissimum является самоопыляющейся культурой, имеющей низкий коэффициент размножения, который в семеноводческом процессе в зависимости от репродукции и урожайности составляет 1,2-4,5 для семян 1-4 репродукций (Семеноводство льна-долгунца, 1989). В селекционном процессе, с момента создания элитного растения, параллельно испытаниям его по-томств, проводят размножение в открытом грунте, на высоком агротехническом фоне, с большой площадью питания (Методические указания по селекции льна-долгунца, 1987). Это позволяет увеличить коэффициент размножения семян до 10-60.

Размножение льна in vitro. Ценность технологий размножения in vitro заключается в высоком коэффициенте размножения, превышающем обычные в десятки тысяч раз, и получении при этом здорового посадочного материала (Бутенко Р.Г., Хромова Л.М., Седнина Г.А., 1983; Катаева Н.В., Бутенко Р.Г., 1983). Кроме того, биотехнологические методы создания нового исходного материала для селекции могут иметь широкий выход в практику лишь в тех случаях, когда обеспечивается стабильное получение регенерантов в массовых количествах.

Установлено, что на процесс образования почек, побегов и регенерантов у льна-долгунца в культуре ткани, пыльников и эмбриокультуре существенное влияние оказывают состав питательной среды и ее концентрация, а также содержание фитогормонов, углеводов и агара.

Проведенные нами исследования позволяют рекомендовать питательную среду Sh, содержащую БА в концентрации 1,0 мг/л и НУК - 0,05 мг/л, а также сахарозу в концентрации 30 г/л для культивирования верхушечных почек, гипокотильных сегментов и незрелых зародышей льна. Установлено, что ее использование приводит к стимулированию роста стеблей и формированию розетки, состоящей из 5-10 и более жизнеспособных почек. Разделение и перенос почек на свежие безгормональные питательные среды аналогичного состава приводит к их интенсивному размножению и сопровождается формированием побегов. Этот процесс можно поддерживать в течение длительного времени (по крайней мере в течение 7-10 субкультивМрований) без существенного снижения морфо-генетической активности и появления аномальных побегов.

Полученные нами данные показывают, что эффективность укоренения побегов льна-долгунца зависит от концентрации веществ в питательной среде. Безгормональные питательные среды А-22 и Sh-О, содержащие сахарозу в концентрации 10 г/л, агар-7 г/л, борную кислоту-18 мг/л, мо-либденовокислый натрий 0,75 мг/л, тиамин-15 мг/л и остальные вещества, взятые в половинной концентрации, являются эффективными для укоренения побегов льна-долгунца и позволяют получить 73-99 регене-рантоз из 100 культивируемых побегов.

Высаживание регенерантов, корневая система которых полностью отмыта от среды, в простерилизованный и увлажненный грунт, состоящий из песка, торфа и плодородной почвы в соотношении 1:1:2, приводит к хорошей адаптации почти всех регенерантов.

Процесс размножения льна на основе зксплантов, полученных из верхушечных и других почек, может быть описан зависимостью (Т / to) -1

_ „ . „ (Ш). |/Э , „ .1,3 v J ■„ (T-it3)/t4. , _ (ТЛч).

К к - С}п Яэ К о + qn К о Л Яэ Чч + Чч Ко

i=1

где: i,n, - циклы размножения; qn, q3- коэффициенты размножения побегов и зксплантов, q4 - коэффициент черенкования; Кэ0, Кп0 - исходное количество эксплантсв и побегов, Т - время размножения (сут.). Данная зависимость является расчетной и позволяет при известных параметрах q„, q4, Т, t4, U, Ко", Коэ определить Кк" и при требуемом К«" вычислить Т. При введении коэффициентов укореняемости побегоз и их способности адаптироваться к обычным условиям может быть определено количество адаптированных регенерантов.

Учитывая то, что на регенеранте в среднем образуется 110-130 семян при массе 1000 шт. около 5 г, то для производства 14 г семян необходимо получить 24 регенеранта. При выполнении указаных требований будет получено достаточное количество семян для проведения испытаний по типу селекционного питомника третьего года с площадью делянки 1 м2. Время, необходимое для производства 24 регенерантов и их созревания составляет не более 6 месяцев за один сезон, а стоимость 14, г семян - 42 руб. 24 коп.

Расчеты показывают, что стоимость семян, полученных in vitro на основе верхушечных почек, гипокотильных сегментов и незрелых зародышей, на сегодняшний день остается высокой. При производстве 14 г семян она в 13,5 - 22,8 раза выше, чем при обычном способе размножения (табл. 15). Однако размножение in vitro позволяет сэкономить год и про-

вести полноценную ускоренную оценку материала в селекционном питомнике 3-го года минуя питомник 2-го года. В случае, если селекционеры располагают установками искусственного климата, то для экономии затрат целесообразно использовать их.

Таблица 15

Эффективность способов размножения льна

Способ размножения Число семян на растении, шт. Число растений, шт. Затраты на производство семян, руб. Продолжительность размножения, мес.

Традиционный 50-60 500 3,12 6-7 (два сезона)

Искусственный климат 110-130 100 22,17 6 (один сезон)

Гипокотильные сегменты - 24 35,04 6 (один сезон)

Верхушечные почки - 24 42,24 6 (один сезон)

Зародыши - 24 72,28 8 (один сезон)

Биотехнологические методы (апикальные части побегов) являются незаменимыми при размножении генотипов, у которых затруднен процесс воспроизводства (генотипы с различными формами стерильности, межвидовые гибриды, анеуплоиды, коллекционные образцы после длительного хранения).

ВЫЯВЛЕНИЕ КОНКУРЕНТОСПОСОБНЫХ ГЕНОТИПОВ. ХАРАКТЕРИСТИКА СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЬНА-ДОЛГУНЦА, СОЗДАННОГО МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Задачей селекции льна-долгунца в настоящее время является выведение новых сортов, отличающихся по сравнению с существующими комплексом главных хозяйственно ценных признаков: высокой урожайностью, высоким качеством волокна, повышенной урожайностью семян, устойчивостью к полеганию и основным грибным заболеваниям.

Выявление конкурентоспособных генотипов льна-долгунца, сочетающих необходимый комплекс хозяйственно ценных признаков, осуществляется в селекционных питомниках второго-пятого годов селекции (Ме-

г

тодические указания по селекции льна-долгунца, 1987), а затем в Государственном сортоиспытании и завершается в хозяйствах, возделывающих лен.

Характеристика дигаплоидов. полученных близнецовым методом. Нами изучено несколько десятков дигаплоидов льна-долгунца разных поколений в селекционных питомниках второго и третьего годов в течение 1990-1997 гг. Эти испытания показали, что ряд дигаплоидов не уступает по комплексу основных хозяйственно ценных признаков сортам стандартам: Торжокский 4 и Алексии, и в тоже время по ряду признаков превосходят их. Так, морфологический анализ растений ряда линий, полученных на основе близнецового дигаплоида, выделенного из сорта Верхневолжский показал, что они ни по одному из изученных признаков не уступали сорту Алексим, а по высоте растений и длине технической части стебля превосходили его.

Исследования, проведенные в лаборатории селекции ВНИИЛ, показали, что созданный нами дигаплоид 2"-1 превосходил стандарт по урожаю семян на 45%, по урожаю волокна - на 47%, по массе соломы - на 30%. Этот дигаплоид характеризовался более высокой,чем стандарт, устойчивостью к полеганию и позволил получить больше волокна (на 47%) с лучшим качеством (табл. 16).

Таблица 16

Характеристика дигаплоида 2"-1, выделенного из сорта

Верхневолжский. 1990 г. (селекционный питомник 3 г.)

Признаки Торжокский 4, стандарт Верхневолжский 2"-1, дигаплоид

Высота, см общая 87 80

техническая 64 66

Урожай, г/м^ соломы 300 390

семян 28,1 40,7

волокна 59 87

Устойчивость к полеганию, балл 2,5 4,5

Вегетационный период 86 85

Масса, г/м^ чес. волкна 21 30

очеса 38 57

Средний номер чес. волкна 17 22

треп, волокна 9,8 11,5

Из материала, переданного нами для изучения в селекционном питомнике 3-го года, по мнению специалистов, особенный интерес для селекции представляет линия С-96-6, которая наряду с высокими морфологическими показателями обладает и высокой устойчивостью к ржавчине и фузариозу. При этом качество длинного волокна у этой линии на 1,5 номера выше, чем у сорта Алексим, характеризующегося высокой продуктивностью и высоким качеством волокна.

Характеристика линий, полученных методами биотехнологии, по результатам испытаний в селекционном питомнике 3-го года. В лаборатории селекции ВНИИЛ в 1995 г. испытывались 2 линии льна-долгунца, полученные на основе культуры пыльников. Выделена линия БТЛ-10, которая на 10% по урожаю соломы и 43% по урожаю семян превосходила стандартный сорт Алексим и не уступала ему по устойчивости к фузариозному увяданию.

Линия льна-долгунца БТЛ-15, полученная на основе эмбриокультуры при межвидовой гибридизации льна,на 14% по урожаю соломы, 40% по урожаю семян и 18% по урожаю волокна превышала сорт-стандарт Алексим.

Выявлены 2 линии, полученные ип основе незрелых зародышей межсортовых гибридов, которые 12-14% по урожаю соломы и до 34% по урожаю волокна превосходили сорт-стандарт Алексим и в течение двух лет проявили высокую устойчивость к полеганию и фузариозному увяданию.

Наиболее устойчивые к хлорсульфурону трансгенные формы льна были оценены по хозяйственно ценным признакам в условиях луночного посева При сравнении с исходными сортами льна-долгунца было отмечено, что гербицидоустойчивые формы уступают им по общей высоте на 8-17% (БТЛ-ГУ-1-1), а по массе технической части растений находятся на уровне или несколько превосходят долгунцовых родителей (БТЛ-ГУ-3-1). У всех гербицидоустойчивых форм наблюдалось превышение урожайности семян с одного растения по отношению к исходным родителям льна-долгунца и стандарту в среднем на 50%. Содержание волокна в стебле у гербицидоустойчивых форм в среднем составляло 26,0%, а у формы БТЛ-ГУ-10-1 - 28,9%. Эти показатели трансгенных форм позволяют отнести их к долгунцовому типу.

Полученные высокопродуктивные по семенам и волокну трансгенные гербицидоустойчивые формы могут быть использованы в селекционном процессе в качестве исходного материала для создания сортов льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона.

В целом можно отметить, что использование биотехнологических методов позволяет получить ценный исходный материал для селекции.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны и усовершенствованы способы биотехнологии, позволяющие повысить эффективность селекционного процесса льна-долгунца на этапах увеличения генетического разнообразия, генетической стабилизации селектируемого материала, идентификации, размножения и создания конкурентоспособных генотипов.

2. Установлено, что эмбриокультура незрелых зародышей, генетическая трансформация и гаметоклональная изменчивость позволяют получить от 0,5% до 39% растений-регенерантов, являющихся источником ценных новообразований. Использование этих методов позволило получить трансгенные гербицидоустойчивые формы, формы с измененными морфологическими признаками, а также линии, существенно превышающие исходные сорта и стандарты по ряду основных признаков.

3. Показаны возможности использования дигаплоидов, полученных методом "grandiflorum" и полиэмбрионии, как перспективных способов генетической стабилизации селектируемого материала, позволяющих в 2-3 раза сократить период создания родоначальников новых сортов и новых геноисточников.

4. Высокая частота наследственных вариаций, а также сравнительно низкая частота получения регенерантов (1,2%) не позволяют рекомендовать андрогенез in vitro как путь ускоренного создания константного материала.

5. Экспериментально обоснована возможность экспресс-оценки ; льна на устойчивость к гербицидам группы хлорсульфурона, хлорида алюминия, и грибам видов Fusarium oxysporum f. sp. lini и Colletotrichum lini Mannas et Bolley на стадии проростков.

6. Предложены технологии размножения льна in vitro при помощи апикальных частей побегов, гипокотильных сегментов и незрелых зародышей. Показана перспективность использования апикальных частей побегов для размножения особо ценного селекционного материала и сохранения генотипов, у которых затруднен процесс воспроизводства.

7. Разработанные методы биотехнологии позволили создать линии льна-долгунца, превосходящие исходные сорта и стандарты на 15% и более по одному или ряду основных хозяйственно ценных признаков, и которые используются в селекционном процессе.

Предпожения для селекционной практики

1. Для создания генетического разнообразия льна-долгунца рекомендуется использовать разработанные методы сома- и гаметоклональной изменчивости, эмбриокультуры незрелых зародышей и генетической трансформации.

2. Для ускоренного создания родоначальников новых сортов и повышения эффективности селекционного процесса предлагается использовать методы получения дигаплоидов, основанные на испльзовании в качестве гаплопродюсера вида льна L. grandiflorum и полиэмбрионии.

3. При идентификации генотипов льна целесообразно использование оценки in vitro, предусматривающей проращивание семян на растворах, содержащих гербициды группы хпорсульфурона в концентрации 100-200 мг/л, хлорид алюминия-600, 1400, 2200 мг/л, а также культуральную жидкость грибов Fusarium oxysporum f. sp. lini и Colletotrichum lini Mannas et Bolley.

4. Предложены и нашли использование в качестве исходного селек -ционного материала линии льна БТЛ-10, БТЛ-13, С-96-6, сочетающие высокую продуктивность по волокну и семенам с высокой устойчивостью к полеганию и наиболее вредоносным болезням - фузариозу и ржавчине, а также трансгенные формы льна-долгунца, устойчивые к гербицидам группы хпорсульфурона: БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БТЛ-ГУ-5, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7, БТЛ-ГУ-10.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поляков A.B. Распространение и некоторые, особенности полиэмбрионии у льна// С.-х биология - 1983 - № 11,- С. 51-53.

2. Поляков A.B. Получение гаплоидов льна из полиэмбриональных семян// Сельскохозяйственная биология,- 1984,- № 6 - С. 62-65.

3. Поляков A.B. Идентификация гаплоидов льнаЯСборник научных трудов ВНИИЛ. - Торжок: ВНИИЛ, 1984,- Вып 21,- С. 59-66.

4. Поляков A.B. Проявление полиэмбрионии у межсортовых гибридов культурного льна,- Генетика,- 1985,- Т. ХХ1,- № 2,- С. 283-287.

5. Поляков A.B., Ремизова Т.В., толмачева С.А, Николаева Л.М. Инструментальная- оценка качества волокна у льна-долгунца / Тез. докладов 4 научно-практической конференции (4-5 декабря 1985г.).- Калинин: Калининский обком ВЛКСМ, 1935,- С.10-11.

6. Поляков A.B. Получение и использование гаплоидов у льна/ Гамет-ная и зиготная селекция растений. Материалы республиканской конференции 23 июня 1986 г.- Кишинев: Штиинца, 1987,- С. 96-98.

-467. Поляков А.В. Гаплоидия у льна// Тез. докл. V съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова.- М.: ВОГИС, 1987,-Том 4,-Ч. 2,-С. 95.

8. Поляков А.В. Получение гаплоидов льна при опылении "чужеродной" и поврежденной пыльцой // Тез. докл.конф. молодых ученых,- Торжок, ВНИИЛ, ВАСХНИЛ, 1987,-С. 3.

9. Поляков А.В. К получению гомодиплоидов льна// Тез. докл. Третьей всесоюзной конференции (12-14 октября 1987) "Экологическая генетика растений и животных",- Кишинев: Штиинца, 1987,-С. 216.

10. Поляков А.8., Александрова Т.А., Марченков А.Н., Ремизова Т.В. Перспективы селекции льна на качество волокна / Сб. науч. трудов, вып. ХХ111. Торжок: ВНИИЛ, 1986,-С. 8-11.

11. Поляков А.В.-Спонтанное изменение полиэмбрионии у льна- долгунца. / Сб. науч. трудов, вып. ХХ111. Торжок: ВНИИЛ, 1986,- С. 35-40.

12. Поляков А.В. Получение апомиктических гаплоидов у культурного льна/Сб. науч. трудов.-Л.: ВАСХНИЛ, 1988,- С. 80-86.

13. Поляков А.В., Кельнер Е.В., Лемешко И.И., Слюсаренко А.Г., Суворова В.В. Органогенез и регенерация у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) в культуре in vitro,'Сб. науч. трудов ВАСХНИЛ,- М.: ВО Агропромиздат, 1991,-С.192-199.

14. Поляков А.В., Егорова Е.Г. Использование гаплоидии для получения исходного селекционного материала льна-долгунца// Селекция, семеноводство и агротехника возделывания льна-долгунца- Сб. на-уч.трудов, вып. XXVII. Торжок: ВНИИЛ, 1991,- С. 31-38.

15. Поляков А.В., Перепеч Е.В. Морфогенез у льна-долгунца в культуре in vitro// Селекция, семеноводство и агротехника возделывания -льна-долгунца'/.Сб. науч. трудов, вып. XXVI!. Торжок: ВНИИЛ, 1991.- С. 57-617.

16. Поляков А.В., Чикризова О.Ф: Влияние ауксинов на ризогенез у побегов льна// Селекция, семеноводство и агротехника возделывания льна-долгунца,- Сб. науч. трудов, вып. XXVII. Торжок: ВНИИЛ, 1991.- С. 20-23.

17. Poliakov A.V. Utilization of haploidy and tissue culture technique for obtaining new breeding material of fibre flax// Second European Regional Workshop on Flax. Book' of abstra£ts. June 18-'20, 1991, Brno, Czechoslovakia- P. 54.

18. Poliakov A.V. Utilization of haploidy and tissue culture technique for obtaining new breeding material of fibre flax// Flax as a fibre and oil bearing

сгор,- Proceedings of the FAO European Regional Workshop on Flax. June 18-20, 1991, Brno, Czechoslovakia-P 361-362.

19. Marchenkov A.N., Poliakov A.V., Alexandrova T.A., Loshakova N.I., Kudriavtsev N.A., Tihomirova V.J., Matuhin A P. Technology of obtaining good quality flax fibre.- Natural Fibres, XXXVIII, 1994,-P. 129.

20. Poliakov A.V., Loshakova N.I., Rutkowska-Krause I., Trouve J.P. Perspectives of haploids use for flax improvement (Linum usitatissimum L.).-1 Report of flax genetic resources workshop. Second meeting. Brno, 8-10 November, 1994,-P. 38^14.

21. Поляков А. В. Перспективы использования биотехнологии для селекции льна (Linum usitatissimum L.)// Селекция, семеноводство, возде-лызание и первичная обработка льна-долгунца. Сб. науч. трудов ВНИИЛ. Вып. 28-29. Торжок, 1994,- С.120-124.

22. Поляков А.В., Чикризсва О.Ф. Влияние способа стерилизации питательной среды и регуляторов роста на морфогенез льна- долгунца в культуре ткани.// Селекция, семеноводство, возделывание и первичная обработка льна-долгунца. Сб. науч. трудов ВНИИЛ. Вып. 28-29. Торжок, 1994. С. 131-134.

23. Poliakov A.V., Proliotova N.V., Rutkowska-Krause I. Some aspects of flax anther culture (Linum usitatissimum L.) Cytology and pretreatment.-Natural Fibres, R. XXXIX, 1995,- P. 21-28.

24. Poliakov A.V., Zhutchenko A.A., Egorova E.G., Proliotova N:V., Chikrizova O.F., Rutkowska-Krause !., Trouve J.P. Embryo culture as a tool for production of new flax genotypes (Linum usitatissimum L.)// Breeding for fibre and oil quality in flax. Proceedings of the Third meeting of the International Flax Breeding Research Group.St. Valery en caux, France, 7-8 November 1995,- P. 51-56.

25. Rutkowska- Krause I., Mankowska G., Poliakov A.V., Proliotova N.V. Plant regeneration through anther culture of flax (Linum usitatissimum L.)// Breeding for fibre and oil quality in flax. Proceedings of the Third meeting of the International Flax Breeding Research Group.St. Valery en caux, France, 7-8 November 1995.- P. 83-90.

26. Poliakov A.V., Proliotova N.V., Rutkowska-Krause I. Some aspects of flax anther culture (Linum usitatissimum L.).Cytology and pretreatment./ Adaptation in Plant Breeding. XIV EUCARPIA Congress. Abstracts. Jyvaskyla. Finland. July 31- August 4 1995,- P.123.

27. Poliakov A.V., Rutkowska-Krause I. Biotechnology in flax breeding improvement // Producing for the market. Proceedings of the 4-th European

regional workshop on flax. Rouen, France, September 25-28 1 996.- P. 197202.

28. Rutkowska-Krause I., Poliakov A.V., Malepszy S. Flow cytometric analysis of ploidy level in callus culture of flax (Linum usitatissimum L) // Producing for the market. Proceedings of the 4-th European regional workshop on flax. Rouen, France, September 25-28 1996,- P. 221-226. * 29. Чикризова О.Ф., Поляков A.B. Оптимизация условий получения трансгенных растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона// Сельскохозяйственная биология, 1996.- №3. - С. 117120.

30. Поляков А.В., Егорова Е.Г. Использование эмбриокультуры в межвидовых скрещиваниях рода Linum// Национальная коллекция русского льна. Торжок: ВНИИЛ. 1996,- С.39-43.

31. Поляков А.В., Павлов Е.И., Кудрявцев Н.А. Льноводство в Китае// Льняное дело,- 1996,- № 2,- С. 19-22.

32. Чикризова О.Ф., Поляков А.В., Кудрявцев Н А. Оценка устойчивости льна к хлорсульфурону на селективных фонах, получение геноисточ-ников по этому признаку// Агрохимия - 1997.- № 1.- С. 66-69.

33. Poliakov А.V., Proliotova N.V., Egorova E.G., Rutkowska-Krause I. The influence of some factors on rooting of flax shoots obtained in vitro culture// Natural Fibres, R.XL, 1996 - P. 75-80.

' 34. Поляков А В. Использование биотехнологических методов в селекции льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) / Второй международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (16-20 июня 1997 г., Пущино).- Пущино, 1997-Том 4,- С.352-353.

35 Поляков А.В., Чикризоза О.Ф., Егорова Е.Г., Пролетова Н.В., Рут-ковска-Краусе И. Влияние регуляторов роста на морфогенез и генетические изменения льна при культивировании изолированных тканей и органов in vitro // Тез. докл. IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г.). М.: МСХА. 1997,- С. 310311.

36 Поляков А.В., Чикризова ОФ., Егорова Е.Г. Перспективы использования биотехнологии в решении проблем льноводства // Тез. докл. 1 Областной научно-практической конференции (20-21 ноября 1997г.). Тверь, 1997,- С. 134-135.

37. Поляков А.В., Рутковска-Краусе И. Сомаклональная изменчивость у льна (Linum usitatissimum) // Тез. докл. VII Международной конференции "Биология клоток растений in vitro, биотехнология и сохранение гено-

фонда (25-28 ноября 1997 г., Москва).- М.: Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева, центр 'Биоинженерия", 1997,- С. 225-226.

38. Poliakov A.V., Proliotova N.V., Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Tejklova E. Screening of genotypic peculiarties and the effect of donor plants growth conditions on callus production in anther culture of flax (Linum usitatissimum L.)// Natural Fibres, R.XLI, 1997.- P. 5-10. . 39. Поляков A.B., Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г. Использование биотехнологических методов для расширения генофонда льна // Тез. докл. VII съезда БОГИС (16-19 июля 1997 г.).- г. Горки, 1997,- С. 103. 40, Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Poliakov A.W. Changes of ploidy level in ontogenesis and tissue culture in vitro of flax (Linum usitatissimum L.) // International Symposium on Breeding of Protein and Oil Crops. EUCARPIA. 1-4 April, 1998.-Pontevedra, Spain.-1998.-P. 77-78.

41. Poliakov A.V. Perspectives of biotechnological methods use in breeding of flax (Linum usitatissimum L.) // Материалы международной конференции " Молекулярная генетика и биотехнология". 6-8 апреля 1998,- Минск: Институт генетики и цитологии.- С. 248-249.

42. Егорова Е.Г., Поляков АВ. Использование эмбриокультуры при опылении Linum usitatissimum L. пыльцой Linum grandiflorum // Научная сессия "Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы" (1...3 июля 1998 г.).-Киров: РАСХН,- С. 24-25.

43. Поляков А.В., Чикризова О.Ф., Никитина Л.В. Изучение алюмо-устойчивости льна-долгунца // Научная сессия "Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы" (1...3 июля 1998 г.).- Киров: РАСХН,- 1998,- С. 162-163.

44. Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Poliakov A.V. Somaclonal and gametoclonal variation of flax (Linum usitatissimum L.) in relation to breeding purposes // Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow. FAO conference.- St. Petersburg, Russia, September 28-30, 1998,- P. 214-220.

45. Chikrisova O.F., Poliakov AV. Transformation of flax by Agrobacterium tumefaciens on the basis of gene NPT-II introduction / Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow. FAO conference.- St. Petersburg, Russia, September 28-30, 1998,- P. 237.

46. Poliakov A.V., Pavlova L.N., Alexandrova T.A, Loshakowa N.I., Krylova T.V., Marchenkov A.N..Rutkowska-Krause I. Anther culture as a tool for production of new flax genotypes (Linum usitatissimum L.) / Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow. FAO conference.- St. Petersburg, Russia, September 28-30, 1998,- P. 210-213.

47. Поляков A.B., Чикризова О.Ф., Каляева М.А, Захарченко Н.С., Блохи-на Н.В., Бурьянов Я.И. Трансформация растений льна-долгунца // Физиология растений, 1998.- Т. 45,- №6 - С. 882-887.

48. Поляков AB., Пролетова Н.В. Питательная среда для культивирования пыльников льнаИ Заявка № 96112871 / 13 (019116) от 27.06.1996 (Положительное решение ВНИИГПЭ от 08.01.98. о выдаче патента на изобретение).

49. ' Чикризова О.Ф., Поляков A.B. Создание геноисточников льна-долгунца, устойчивых к гербицидам// Тез. докл. Всероссийского съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: Экономика, эффективность, экологич-ность",- Санкт-Петербург, 1995,- С. 268,

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Поляков, Алексей Васильевич, Торжок

Российская Академия Сельскохозяйственных Наук ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЛЬНА

На правах рукописи

ПОЛЯКОВ Алексей Васильевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (Ыпит ивНаводтит 1_.) НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

03.00.23 - Биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Торжок -1998

СОДЕ РЖАН И Е

Стр.

Перечень сокращений 6

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. УСЛОВИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 17

Глава 2. СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛЬНА 26

2.1. Создание генетического разнообразия льна тради-

ционными методами 28

2.2. Клональная изменчивость льна в культуре ткани 32

2.2.1. Сомакпональная изменчивость 3§

2.2.2. Гаметоклональная изменчивость 37

2.3. Увеличение генетического разнообразия льна-долгунца путем использования нежизнеспособных зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовых гибридов 48

2.3.1. Образование недоразвитых зародышей при внутривидовой гибридизации льна-долгунца 48

2.3.2. Культура недоразвитых зародышей льна-долгунца 50

2.3.3. Характеристика регенерантов, полученных на основе недоразвитых зародышей льна-долгунца 54

2.4. Создание генетического разнообразия при межвидовой гибридизации льна 58

2.5. Генетическая трансформация 65

2.5.1. Генетическая трансформация растений с использованием АдгоЬа^епит илг^ааепв 65

2.5.2. Генетическая трансформация льна 67

2.5.3. Трансформация льна-долгунца с помощью АдгоЬас1егшт ^гг^ааепэ на примере введения гена МРТ-Н 69

2.5.4. Оценка трансгенных форм льна в культуре ткани

на устойчивость к канамицину 76

-32.5.5. Оценка трансгенных форм льна на устойчивость к

канамицину при проращивании семян 80

Выводы 83 Глава 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛИЗАЦИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ

ГАПЛОИДОВ ЛЬНА 85

3.1. Отбор 85

3.2. Гаплоидия 87

3.2.1. Получение апомиктичных гаплоидов льна 89

3.2.2. Использование полиэмбрионии для получения

У

гаплоидов льна 94

3.2.3. Диплоидизация гаплоидов льна 109

3.2.4. Генетическая стабилизация признаков при использовании близнецовых гаплоидов 110

3.3. Культура пыльников 117

3.3.1. Влияние условий выращивания донорных растений

на каллусогенез пыльников льна 118

3.3.2. Влияние стадии развития пыльцы 123

3.3.3. Индуцирование каллусо- и органогенеза у исходных эксплантов 125

3.3.4. Каллусогенез у льна-долгунца разных генотипов 133

3.3.5. Регенерация почек и побегов из пыльцевого каллуса 136

3.3.6. Получение регенерантов льна в культуре пыльников 140 3.4. Получение гаплоидов методом "дгапсНАогит" 143

Выводы 155

Глава 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОТИПОВ 158

4.1. Идентификация генотипов по белкам семян 159 4.1.1 Идентификация генотипов льна по белкам семян 160

4.2. Использование маркерных признаков 162

4.3. Отбор клеток растений по требуемым признакам 164 4.3.1. Отбор клеток льна по требуемым признакам

-44.4. Оценка льна на устойчивость к гербицидам 168 4.5. Оценка на устойчивость к фузариозу (Fusarium

oxysporum f. sp. lini) 1ff

4.6. Оценка на устойчивость к антракнозу (Colletotrichum

lini Mannas et Bolley) 181

4.7. Оценка на устойчивость к алюминию 183 4.5. Идентификация гаплоидов 186

Выводы 1|§

Глава 5. РАЗМНОЖЕНИЕ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА IN VITRO.

ПОЛУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАНТОВ 190

5.1. Традиционные способы размножения m

5.2. Размножение растений методами in vitro 190 5.2.1. Размножение льна in vitro при использовании

верхушечных почек 19|

5.2.2. Размножение льна in vitro при использовании гипокотильных сегментов 200

5.2.3. Размножение льна при использовании культуры зародышей 200 Выводы 21 g

Глава 6. ВЫЯВЛЕНИЕ КОНКУРЕНТОСПОСОБНЫХ ГЕНОТИПОВ. ХАРАКТЕРИСТИКА СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЬНА-ДОЛГУНЦА, СОЗДАННОГО МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ 214 6.1 Характеристика дигаплоидов, полученных близнецовым методом 214

6.2. Эффективность получения ценного селекционного материала в культуре пыльников 21§

6.3. Характеристика линии, полученной при опылении

льна L. usitatissimum пыльцой L. grandiflorum 2Ш

6.4. Получение ценного селекционного материала на основе незрелых зародышей при внутривидовой

гибридизации 220 6.5. Характеристика гербицидоустойчивых форм льна

по основным хозяйственно ценным признакам 221

Выводы 221

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 224

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ 22|

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 226

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 22?

ПРИЛОЖЕНИЯ 20|

-6-

Перечень сокращений

Sh-2, Sh-0, MSFC, LMA-1, Ro - питательные седы, разработанные в про -цессе выполнения исследований;

MS - среда Мурасиге-Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962); Bs - среда Гамборга (Gamborg O.L., 1975); N6- среда (Chu С.С., 1978);

LMK-3 - среда Фридта (Ftriedt W., 1996, не опубликованные данные); А22- среда (Nichterlein К., Limbach H., Friedt W., 1991); БА - 6-бензиладенин; Кин - кинетин;

ИМК - индолилмасляная кислота;

ИУК - индолил - 3 - уксусная кислота;

НУК -1 -нафтилуксусная кислота;

NPT-II - маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II;

ALS - ген ацетолактазсинтетазы;

Km - канамицин;

KI - клафоран;

КЬ - карбенициллин;

N - азот; К - калий; Р - фосфор;

НЗ - незрелый нормальноразвивающийся зародыш;

ННЗ - незрелый недоразвитый зародыш;

ДМСО - диметилсульфоксид

Кау- коэффициент алюмоустойчивости;

тм - микрометр;

пг - пикограмм

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лен культурный (Linum usitatissimum L., 2n=2x=30) -одна из древнейших и важнейших технических культур комплексного использования, значение которой в мире неизменно высоко. Лен возделывается человеком в течение нескольких тысячелетий (Trump D.H., 1980). Растения льна были и остаются великолепным источником волокна, которое нашло широкое применение в текстильной, автомобильной, авиационной и других отраслях промышленности. Льняное масло является незаменимым компонентом лакокрасочной, парфюмерной, фармацевтической и многих других отраслей. Жмых - ценный корм для животных, а костра, являющаяся отходом льнотресты, используется для изготовления облицовочных плит и утеплительных материалов.

В настоящее время лен адаптирован во многих странах мира и возделывается на всех континентах. По данным ФАО (1982, 1990) в мире ежегодно засевают льном около 7 млн. га. При этом площади, занятые под лен-долгунец, составляют 1,2-1,3 млн. га. Рынок льна в настоящее время зависит в основном от промышленного использования волокна и масла для технических целей. Хотя производство таких товаров, как линолеум и обычные краски уменьшается, производство стойких, связующих, антикоррозийных веществ увеличивается (Van Dam J.E.G. et al„ 1994).

Известно, что внедрение в производство высокоурожайных, устойчивых к неблагоприятным факторам окружающей среды сортов имеет большое экономическое значение, так как является доступным и дешевым способом увеличения производства сельскохозяйственной продукции (Александрова Т.А., Марченков А.Н., 1994).

Сельское хозяйство и перерабатывающая промышленность предъявляют жесткие требования к сортам. Они должны быть восокопродуктивными по волокну и семенам, иметь высокое качество волокна, дружное созревание, обладать высокой устойчивостью к полеганию и комплексу болезней, а также должны удовлетворять производителя по длине вегетационного периода и целому ряду других признаков.

По нашим данным, селекция льна-долгунца за последние 25-30 лет обеспечила прирост урожая всего волокна на 32-36%, а длинного волокна на 21-41%

(Поляков A.B. и др., 1986). Вклад селекции в производство льнопродукции может быть более значимым при условии повышения эффективности селекционного процесса.

Больших успехов добились селекционеры России, Белоруссии, Франции, Голландии и ряда других стран в создании сортов льна с высокой продуктивностью волокна и семян. В производстве используются сорта с высоким качеством волокна, высокой устойчивостью к полеганию и ряду болезней. Хотя традиционная селекция имеет ряд успехов в улучшении растений льна-долгунца, необходимо отметить, что мало сортов, характеризующихся необходимым комплексом признаков. Большая часть сортов имеет низкое качество волокна, не обладает достаточной устойчивостью к полеганию и болезням, а по длине вегетации относятся к позднеспелым (Кутузова, 1993); подавляющее большинство высокопродуктивных сортов льна-долгунца характеризуется низкой приспособленностью к экстремальным факторам внешней среды (засуха, резкое колебание температуры и др.) (Жученко А. А. мл., 1994). Сортовой материал страдает генетическим однообразием. Это постепенно снижает эффективность селекционного процесса и может привести к тупику (Кутузова С. Н., 1993; Жученко A.A. и др., 1994). Кроме того, низкий коэффициент размножения, необходимость селекции на трудносовместимые признаки-высокий урожай волокна и семян, высокий урожай и качество волокна и др., полигенный контроль большинства хозяйственно ценных признаков, низкий коэффициент наследуемости и трудоемкость технологий их оценки на фоне недостаточного внимания к вопросу интенсификации селекционного процесса, привели к тому, что традиционная селекция льна на сегодняшний день остается трудоемким процессом, требующим больших навыков, времени и средств для создания новых конкурентоспособных сортов.

В связи с упомянутыми выше проблемами возникает необходимость оценить перспективы биотехнологии как дополнительного инструмента к классической (традиционной) селекции для повышения эффективности селекционного процесса и генетического улучшения культуры льна.

Из литературных источников известно, что культивирование на питательных средах изолированных семяпочек и зародышей, создание гомозиготных линий сельскохозяйственных растений с применением гаплоидов, преодоление ле-

талей в раннем развитии гибридных растений путем индукции стеблевого органогенеза в культуре изолированной гибридной ткани, ускоряет и облегчает селекционный процесс. Мутагенез и селекция на клеточном уровне, гибридизация соматических клеток, перенос в растительную клетку индивидуальных генов открывают новые пути для получения измененных исходных форм и создания отвечающих запросам практики сортов растений (Бутенко Р.Г., 1985).

Благодаря развитию современной молекулярной биологии, биотехнологии, генетической инженерии и молекулярной генетики перед генетиками, селекционерами и семеноводами появляются новые возможности в конструировании и поддержании особо ценных генотипов (Шевелуха B.C., 1992).

Роль научно-технического прогресса в селекции новых высокопродуктивных сортов, прежде всего, состоит в ускорении темпов селекционной работы. Одним из наиболее перспективных путей ускорения селекционного процесса на сегодняшний день является создание нетрадиционной технологии селекции посредством быстрого и массового получения гомозиготных линий из гаплоидов гибридных растений (Харченко П.Н., 1997).

Освоение методов биотехнологии в нашей стране уже принесло значительные результаты. Новая технология получения безвирусного картофеля позволяет повысить урожай на 25-30%, а на юге страны - на 40-50%. Широко развернуты работы по получению растений на основе культуры меристем в цветоводстве (Шаповал А., Иптышева К., 1989).

На основе методов генной инженерии разработана и осуществляется крупная селекционная программа по картофелю. Ведется целенаправленный перенос в его клетки четырех генов устойчивости - к колорадскому жуку, вирусам, бактериозам и грибной инфекции (Шевелуха B.C., 1992). Успешно ведется конструирование трансгенных растений подсолнечника, сахарной свеклы, табака с экспрес-сируемыми генами чужеродного происхождения, имеющими отношение к стрессовым ответам растений (Пирузян Э.С., 1988).

За рубежом методами клеточной селекции созданы болезнеустойчивые сорта сахарного тростника, табака, картофеля, рапса, овса и других культур (Ми-роненко Н.В., Гусева H.H., 1987).

Лен, как объект биотехнологических исследований для решения селекционно-генетических задач, используется в различных странах. Рядом исследователей достигнуты определенные успехи в культуре тканей и органов льна. Так, канадскими исследователями на основе льна масличного получены формы, устойчивые к засолению почвы (McHughen A., Swartz M., 1984). На основе солеустойчивой формы получены линии резистентные к хлорсульфурону, причем, это свойство передается в поколениях через семена (Jordan M., McHughen А., 1987). Получены трансгенные формы льна-масличного, которые в полевых испытаниях проявили высокую устойчивость к гербицидам, а на безгербицидном фоне не уступали по урожаю семян исходным сортам (McHughen А., 1991).

Опубликованы результаты исследований по получению протопластов культивируемого и диких видов льна и регенерации из них растений (Baracat M.N., Cocking Е.С., 1983; 1985; David H. et al.,1991), использованию незрелых зародышей для селекционно-генетических целей (Nichterlein К. et al., 1991), по регенерации гаплоидных растений на основе пыльников и микроспор (Sun H., 1984; Sun H., FuW., 1991; Nichterlein K. et al., 1991; Poliakov A.V., 1991). Однако большая часть иследований находится на стадии методической проработки и не вышли за пределы лабораторных испытаний.

Исходя из вышеописанных проблем, целью многолетних исследований являлась разработка нетрадиционных, биотехнологических методов селекции льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) для повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и создания форм льна, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методы создания генетического разнообразия на основе эм-бриокультуры при культивировании незрелых зародышей, получаемых при внутривидовой и межвидовой гибридизации, культуре пыльников, а также генетической трансформации, гамето- и сомакпональной изменчивости, включающие оптимизацию питательных сред и условий культивирования исходных эксплантов, каллусов и регенерантов, полученных на их основе.

2. Выявить эффективные способы генетической стабилизации популяций льна путем использования дигаплоидов, получаемых в культуре пыльников и при разных формах апомиксиса; разработать технологии массового получения гаплоидов и дигаплоидов в культуре пыльников, межвидовой гибридизации, полиэм-брионии.

3. Исследовать возможности идентификации генотипов in vitro.

4. Оптимизировать процесс размножения льна in vitro с целью ускоренной передачи особо ценных геноисточников в селекционную практику.

5. Создать линии льна-долгунца на основе нетрадиционных методов, с высокими показателями основных хозяйственно ценных признаков, представляющие интерес для селекционной практики и производства.

Методы исследования основаны: на анализе существующих способов селекции льна, на теоретическом выявлении влияния различных факторов на протекание технологических процессов, с широкой экспериментальной проверкой теоретических предпосылок и установления оптимальных технологических режимов.

Научная новизна работы. Исследования по разработке и применению методов in vitro для решения селекционно-генетических вопросов льна являются современным, приоритетным направлением как в нашей стране, так и за рубежом.

В представленной работе впервые показана роль биотехнологических методов в усовершенствовании селекционного процесса льна-долгунца на этапах создания генетического разнообразия, получения константного, в генетическом отношении, селекционного материала, оценки его in vitro и размножения.

Разработаны и усовершенствованы технологии получения регенерантов в культуре ткани, пыльников и эмбриокультуре. Уточнены условия для проведения генетической трансформации льна-долгунца A. tumefaciens на примере введения маркерного гена NPT-II. Впервые получены трансгенные формы льна дол-гунцового типа с повышенной устойчивостью к гербицидам группы хлорсульфуро-на, обусловленной наличием гена ALS. Разработана питательная среда для культивирования пыльников льна, по которой принято положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ.

Показано, что культивирование тканей и органов льна в условиях in vitro сопровождается образованием широкого спектра генетической изменчивости в последующих поколениях. При этом, впервые на культуре льна показана высокая значимость сомаклонов, близнецовых дигаплоидов и регенерантов, полученных от незрелых недоразвитых зародышей самоопыленных генотипов, а также межсортовых и межвидовых скрещиваний для ускоренного создания линий, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков.

Впервые широко изучено распространение гаплоидии у льна и оценены различные способы получения гаплоидов, основанные на использовании индуцированного апомиксиса, эмбриокультуры, культуры пыльников. Показаны морфоге-нетические особенности различных типов эксплантов в зависимости от условий культивирования донорных растений, предобработки и условий культивирования эксплантов, а также способы их использования для решения селекционно-генетических вопросов.

Выявлены эффективные методы оценки селекционного материала на устойчивость к гербицидам в условиях in vitro и в вегетационных опытах, определены условия для оценки генотипов льна по проросткам на устойч�