Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (L. USITATISSIMUM L.) НА ОСНОВЕ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (L. USITATISSIMUM L.) НА ОСНОВЕ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ"

/\-з%аъб

На правах

ЕГОРОВА Елена Григорьевна

СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА ([.. иэКайэз^ит L.) НА ОСНОВЕ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ

06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1999

ь& а. ¡уО ' С

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте льна

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник А В Поляков

Официальные оппоненты: Федоров А.К., доктор биологических наук, профессор, Кобозева Т.П , кандидат с -х наук, доцент

Ведущая организация:

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится ЦьОНЗ_ 1999 г

в Л? часов

на заседании диссертационного совета Д 120 35 04 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул , 49 Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА Автореферат разослан " && " Л( в Э!_1999 г

Ученый секретарь диссертационного совета -кандидат сельскохозяйственных наук

Р Р Усманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лен-долгунец (Linum. usitatissimum L-.) -ценная техническая культура, комплексного использования, значение которой в мире неизменно высоко. В России в последние годы идет сокращение посевных площадей в связи с этим перед льноводством стоит задача по стабилизации отрасли, увеличению урожайности и улучшению качества льнопродукции. ;

Большие надежды в решении этих задач связаны с созданием новых сортов льна-долгунца. Наиболее перспективным способом повышения эффективности селекционного процесса является использование биотехнологическйх приемов (Поляков, 1999).

Использование метода культуры изолированных зародышей нашло применение для изучения механизма покоя семян и путей его регулирования. Метод эмбриокультуры позволяет изучать морфогенети-ческие и морфофизические аспекты эмбриогенеза (Pretova, 1978, 1991, Williams, .1987). Он дает возможность получать новые хозяйственно ценные формы растений, которые в естественных условиях не удаются, повышать эффективность отдаленных скрещиваний (Здруй-ковская-Рихтер, .1979, Курсаков, 1979, Nichterlein, 1991, Williams, Lautour, 1981, Cohen et al., 1984, Мс Coy et al., 1985).

Эмбриокультура считается одним из перспективных способов получения гаплоидных растений. Основной интерес к гаплоидам связан с возможностью их использования в качестве посредников для получения гомозиготных растений (Данвел, 1989).

Все изложенное свидетельствует о большом значении, метода культуры изолированных зародышей при проведении теоретических и прикладных исследований. Культура изолированных зародышей для решения селекционно-генетических задач льна изучалась в Германии (Laibach, 1925,1926,Fridt, 1989), Австралии (Green, 1983, 1986), Словакии (Pretova, 1986, 1991), США (Willams, De Lautour, 1980, 1981). Однако результаты этих исследований не нашли применения в селекционной практике. ч -

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось создание форм льна-долгунца методом эмбриокультуры и оптимизация условий получения дигаплоидов при опылении L. usitatissimum пыльцой L grandiflorum, а также получение регенерантов на основе нежизнеспособных зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовой гибридизации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи :

- исследовать генотипические особенности льна при культивировании in vitro незрелых семян и зеленых зародышей;

- уточнить условия вырацдедоодя&одфрных растении;

НАУЧМ'.Ч Г' о л1,1ЭТЕКА

fvtOCK. . .двмии

Hivl. Ii. ,-iA I ЬкОа

Инв. №.-

- уточнить условия культивирования исходных эксплантов,

- подобрать условия для повышения морфогенетической активности зеленых зародышей,

- подобрать условия для укоренения побегов,

- установить природу происхождения регенерантов, полученных на основе межвидовых скрещиваний,

-создать линии льна-долгунца на основе метода эмбриокультуры с высокими показателями основных хозяйственно ценных признаков, представляющих интерес для селекционной практики

Научная новизна и практическая ценность исследований

Впервые, с помощью метода эмбриокультуры на основе межвидовых скрещиваний получены жизнеспособные регенераты, являющиеся дигаплоидами Уточнены условия культивирования незрелых семян для увеличения выхода зеленых зародышей и регенерантов

Впервые на льне-долгунце показана высокая значимость культивирования незрелых недоразвитых зародышей для создания линий, характеризующихся комплексом хозяйственно ценных признаков

На основе эмбриокультуры при межвидовой и внутривидовой гибридизации созданы формы льна-долгунца, которые используются в селекционном процессе лаборатории селекции ВНИИЛ

Апробация результатов диссертации Основные результаты докладывались на Third meeting of the International Flax Breeding Research Group "Breeding for fibre and oil quality in flax" (St Valéry en Caux, 1995), Fourth European Regional Workshop on Flax " Producing for the market" (Rouen, 1996), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования"^ Пущино, 16-20 июня 1997), IV Между народной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (г Москва, 24-26 июня 1997)

Публикации Основные материалы и результаты диссертации изложены в 9 печатных работах

Структура и объем работы Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (2 главы), общих выводов, предложений селекционной практике, списка использованной литературы, включающего 228 наименований, в том числе 148 иностранных авторов

Работа содержит 45 таблиц, 8 рисунков и 3 приложения

УСЛОВИЯ И МЕТОПИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Работу проводили на льне культурном (□пит изКайватит Ь.) и ряде дикорастущих видов. Лен-долгунец представлен сортами и линиями отечественной и зарубежной селекции. Семена генотипов культурного льна были получены из отделов селекции, семеноводства ВНИИЛ и Национальной коллекции русского льна (ВНИИЛ, Торжок), семена дикорастущих видов льна: Ыпит дгапсПАогит, Ааит, 1_.регеппе, 1_. МгеиЬдт - из Мировой коллекции рода Упит (ВИР, Санкт-Петербург). После проверки по потомствам, семена использовались в качестве исходного материала.

Донорные растения выращивали в вегетационных домиках в сосудах Митчерлиха по общепринятой методике (Соколов, 1967; Доспехов,1979). В почву перед посевом вносили минеральные удобрения из расчета: N 25о Р вдо К г50 мг/сосуд. Норма высева составляла 50 семян на 1 сосуд. Скрещивания проводили по общепринятой для льна-долгунца методике (Рогаш, Дунаева, 1970). Сортовую однородность селекционного * материала проверяли согласно методике ВНИИЛ (1968). Устойчивость растений к болезням - ржавчине и фузариозу определяли на специализированных инфекционно-провокационных фонах в соответствии с методическими указаниями по селекции льна-долгунца (1987) и селекции льна-долгунца на устойчивость к ржавчине (1988). В качестве стандартов использовали сорта льна-долгунца Алексии и А-29, включенные в Государственный реестр.

Методика проведения исследований. Лабораторные исследования проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов растений (Бутенко, 1964; Урманцева, 1988).

Простёрилизованные исходные экспланты культивировали на питательных средах при температуре 24° + 1° С,'освещенности около 4000 Люкс и фотопериоде: 16 часов день и 8 часов ночь. Питательные среды готовили на основе концентратов. Регуляторы роста добавляли в нужных количествах перед автоклавированием среды. Реакцию рН среды (5,6 - 5,8) устанавливали перед автоклавированием.

Метеорологические условия. Метеорологические условия в годы проведения исследований были различными. 1991 год характеризовался избытком влаги в мае-июле, а 1992 г. отличался малой обеспеченностью влагой. Вегетационный период 1995 года был контрастным по температурному режиму и количеству осадков (холодный май с осадками, на 80% превышающими норму, и теплый сухой июль).

1996 год характеризовался отсутствием достаточного количества влаги и чередованием жарких и холодных дней с сильными ветрами. В

1997 году была теплая с неравномерным выпадением осадков погода. В целом годы исследований были удовлетворительными для выращивания льна-долгунца.

Математическая обработка данных. Экспериментальные данные обрабатывали методом дисперсионного и регрессионного анализа на ПЭВМ с использованием пакета программ " БИОСТАТ " и " Excel 05", а так же по методикам, опубликованным рядом авторов (Доспехов, 1979, Зудин, 1987, Плохинсшй, 1970, Седловский и др , 1982)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Создание форм льна-долгунца при опылении цветков L. usitatissimum L. пыльцой L. grandiflorum.

Для полумения дигаплоидов льна-долгунца нами использовались межвидовые скрещивания льна Установлено, что при опылении каст-рированых цветков L usitatissimum пыльцой L grandiflorum формируется 28 - 54 коробочек на 100 опыленных цветков Анализ завязавшихся коробочек при созревании показал, что они содержат нежизнеспособные семена На 6 - 24 сутки после гибридизации, как правило, семена были белого цвета и не содержали видимых зародышей Тогда как, семена льна культурного, полученные от самоопыления, уже на 5 день после цветения имели видимые зародыши, а на 7 день были зеленого цвета и зародыши занимали весь объем семени

Извлечение и культивирование незрелых семян на питательной среде приводило к образованию в них видимых зеленых зародышей На количество полученных зеленых зародышей влияли ряд факторов генотип, возраст первичных эксплантов, состав питательной среды и ДР

Генотип. Результаты эксперимента показали, что используемый генотип L usitatissimum оказывал существенное влияние на количество завязавшихся коробочек Так, от опыления линий Г 1478 и Г 1472 пыльцой L grandiflorum, было получено соответственно 51 и 56 коробочек на 100 скрещиваний, что существенно больше, чем при опылении линии Rod 646/4 и сорта Верхневолжский (35 и 37 коробочек)

Возраст исходных эксплантов. Выявлено, что извлечение семян на 6. 8, 10, 12, 16 20, 24 сутки после опыления и культивирование их на питательных средах в течение 20-60 суток позволяет получить 0,1-1,9 зеленых зародышей на 1 скрещивание Данные регрессионного анализа свидетельствуют о том, что использование 20-ти суточных семян, является близким к оптимальному и способствует образованию существенно большего количества зеленых зародышей (20,7-20,9 %) по сравнению с другими вариантами опыта (табл 1)

■ ' " • ' Таблица 1

Влияние возраста семян, полученных от опыления изПаивштит пыльцой I.. дгап(1Шогит, на образование зеленых зародышей

Годы Возраст Образова- Получено зеленых , Г .

исследова- семян лось семян •• зародышей

. ний сутки шт. шт.- % ± 2Sp

1995 . 6 1041 93 8,9 ±3,8

10. 823 89 10,8 ±2,2

■ - . i - ■■• ■ 20 . ... 883 183 20,7 ± 2,8* 0,94

1996 6 99 2 2,0 ±2,8

12 195 18 9,2 ± 4,2

. . л' 16 196 ■ - 24 12,2 ±4,6*

20 206" : 43 : 20,9 ± 5,6* 0,98А

24 " 278 > 30 10,8 ±3,8 0,87АА

Примечание: А - при сравнении 6-20 суточных семян, м - при сравнении 6-24 суточных семян. ' . ' ' ' ; . ....:.

Питательная среда. Использованные в наших исследованиях 8 вариантов питательной среды позволило' получить жизнеспособные зародыши. Показано, что лучший результат достигнут при культивировании эксплантов на среде ЗЬ-2, на которой получено; 11-15 зеленых зародышей на 100 культивируемых семян.

Установлено, что использование 6-бензиладенина (БА) в концентрации 1 мг/л в сочетании с а-нафтилуксусной кислотой (НУК -0,05) мг/л было наиболее эффективно. Уменьшение содержания ауксинов и цитокининов в 10 и 50 раз, сопровождалось существенным снижением выхода зеленых зародышей до 6,5 - 4,6 % по сравнению с контролем, где количество зеленых зародышей составило 14,8 % (табл.2). • . . .... V : ; . " • -

- -=■,■*:..'. ■ .... Таблица 2

Влияние регуляторов роста на образование зеленых зародышей, " полученных при гибридизации £.. изПаИзэ^ит х дгапбШогит

на среде ЭЛ-г. 1996 е.

, Вариант - опыта * . Культивировалось семян, шт. Получено зеленых зародышей

шт. % ± 2Sp

1 (контроль) 1893 280 14,8 ± 1,3a

1/10 1947 127 - : 6,5 ±0,6

; 1/50 1828 85 4,6 ±0,5

Уменьшение содержания макро - и микроэлементов, составляющих среду 5(1-2, не оказывало значительного влияния на образование зеленых зародышей (г=-0,11), но существенно сказывалось на пути развития зеленых зародышей и регенерацию на их основе (г=-0,94)

Природа происхождения регенерантов. Образование побегов, которые по фенотипу имели признаки отцовских форм (диких видов) было редким (0,1-0,2%), а их жизнеспособность низкой. Такие побеги плохо росли и не укоренялись Большинство же побегов по фенотипи-ческим признакам соответствовали материнскому типу растений (1_ ивЛа^зитшт). Жизнеспособность таких побегов была достаточно высокой они хорошо укоренялись на безгормональной среде, что приводило к получению регенерантов Изучение регенерантов и их по-томств по морфологическим признакам в течение нескольких лет выявило их однородность Электрофоретический анализ семян регенерантов и исходных форм, проведенный в отделе белков и нуклеиновых кислот ВИР И П Гаврилюк, не выявил у регенерантов каких либо фракций дикорастущего вида Анализ жирных кислот, проведенный в ИНВ также не позволил обнаружить различий между регенерантами и исходными генотипами I. иэЛайзвипит Результаты этих анализов показывают, что регенеранты, полученные при опылении 1_ ивйа^Бвтпит пыльцой I. дгапсПАогит, являются дигаплоидами со спонтанно удвоенным числом хромосом

Характеристика линий, полученных на основе дигаплоидов. В 1995 - 1997 гг нами изучались потомства второго-четвертого поколений 87 регенерантов, полученных в эмбриокультуре на основе опыления I. иэЛа^эвтилт пыльцой I. дгапсМогит, по хозяйственно ценным признакам. Ряд регенерантов по одному или нескольким признакам значительно превосходил исходные сорта и сорт-стандарт Алек-сим

С 1997 года в лаборатории селекции ВНИИЛ в селекционном питомнике 3-го года испытывалась линия льна-долгунца, полученная в эмбриокультуре при опылении селекционной линии П-148 пыльцой I. дгапсМогит. Отмечено, что она превосходила сорт-стандарт Алексии и исходный генотип по массе семян с 1м2 на 69 % и 30 % соответственно (табл 3)

На ряду с этой линией в селекционном питомнике 2 года изучались ряд регенерантов, характеризующихся высокими показателями по изучаемым хозяйственно ценным признакам (табл 4)

Лучшие линии были переданы нами для испытания в селекционный питомник 3-го года лаборатории селекции ВНИИЛ Изучение по-

казапо, что линия БТЛ-15 на 14% по урожаю соломы и 18% по урожаю волокна была лучше, чем сорт-стандарт Алексим (табл. 5).

Таким образом, культивирование незрелых зародышей льна, полученных при межвидовой гибридизации льна культурного с видом и. дгапсПАогитГ позволяет получить регенеранты, существенно превосходящие исходные материнские сорта по продуктивности волокна и семян. ............................

. Таблица 3

Характеристика линии, полученной в эмбриокультуре при межвидо-,. вых скрещиваниях. Данные лаборатории селекции ВНИИЛ. 1997 г. (Селекционный питомник 3-го года) .

Название линии Высота растений, см Масса с 1 м*, г Длина вегетационного периода, суток

соломы семян

П - 148 х 1_. ' дгапсИАогит "•" " 62 - 202 57,3 67

в % к стандарту 108,8 76,5 169,0 ± о .

в % к контролю 101,6 103,6 129,9 + 0

П-148, контроль 61 195 44,1 67

в % к стандарту 107,0 73,9 130,1 -■■ ±0 • •

Алексим, стандарт 57 264 33,9 - 67

- . • . ..... . _ Таблица4

Характеристика регенерантов третьего поколения, - полученных при межвидовых скрещиваниях. 1995 г. , ; ., (Селекционныйпитомник2-гогода) " ; ;

Сорт, реге- Высота. Масса Число ко- Число Масса Содер-

нерант расте- техн.' роб. на 1 семян с 1 волок- жание

ний,см: масти, мг раст., шт раст., шт на,мг волокна, %

Г1351х 89,7 448,7 2,3 16,3 185,6 41,2

Lgrand. R1

в % к ст. 100,1 110,7 115,0 116,4 126,4 113,8

Алексим, ст. .89,6 405,2 ■ 2.0 14,0 146,8 36.2

П-148хЬ .87,0 409,5 4,0 25,5 100,0 24,4

Grand. R1

в % к ст. 106,7 .132,6 307,7 236,1 90,7 68,3

Славный 82 х Larand. R5 70,0 396,0 3.0 24,0 145,0 36,6

в % к ст. 85,9 128,2 230,8 222,2 131,6 102,6

Алексим, ст. 81,5 308,8 1,3 10,8 110,2 - 35,7

Таблица 5

Характеристика линии, полученной в эмбриокультуре при скрещивании £. и^айвв/тит х I. дгапФЛогит. Данные лаборатории селекции ВНИИЛ 1995 г (Селекционный питомник 3-го года)

Название линии Масса с 1 м^, г Выход волокна всего, % Высота растений, см Длина вег периода, сут Устойчивость к фуза-риозу,%

соломы семян волокна

БТЛ-15 700 51,0 106,0 15,1 86,0 71,0 4,2

в % к ст. 114,4 103,0 117,8 102,7 104,9 100,0

Алексии ст 688 36,3 95,0 13,8 84,0 71,0 77,8

Создание форм льна путем сохранения нежизнеспособных зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовой гибридизации

При изучении образовавшихся после опыления коробочек различных генотипов льна выяснилось, что большая их часть, наряду с нормальноразвитыми семенами, имеющими крупные зеленые зародыши, содержала и недоразвитые, в которых зародыши отставали в развитии и были меньшего размера

Условия культивирования. На количество недоразвитых зародышей в значительной степени влияли условия произрастания материнских растений Внесение перед посевом минеральных удобрений, в дозе азот 20 мг, фосфор 10 мг, калий 20 мг из расчета на 1 кг почвы, несколько увеличило число недоразвитых зародышей, по сравнению с контролем (без удобрений) Использование в 20 раз более высокой дозы удобрений, приводило к существенному увеличению числа недоразвитых семян (табл 6) Кроме того, установлено, что коробочки гибридов первого поколения содержали несколько большее количество семян с недоразвитыми зародышами по сравнению с исходными родительскими генотипами

Возраст семян. Проведенные исследования показали, что образование недоразвитых зародышей зависело от возраста семян (г =0,99, ^ =7,07, ¿5 =4,30) В семенах формирование недоразвитых зародышей практически прекращалось на 10-12 сутки с момента опыления.

Морфогенез различных типов эксплантов. Культивирование незрелых недоразвитых (ННЗ) и нормальноразвивающихся (НЗ) заро-

дышей позволило получить от 24 % до 47 % морфогенных эксплантов, на которых образовывалось 2-4 почки При этом установлено, что использование среды БЬ-2 обеспечивало существенно лучший результат для культивирования ННЗ и не уступало по эффективности среде Монниера (1978) в случае использования ее для культивирования НЗ (табл 7)

Таблица 6

Влияние повышенных доз минеральных удобрений на образование недоразвитых семян у льна

Вариант опыта Доза удобрений Проанализировано семян

всего втч не доразвитых

мг/кг шт. шт. %±2Sp

Контроль 0 1010 16 1,6 ±0,3

азот + фосфор + калий 20+10+20 1872 44 2,3 ± 0.2

азот + фосфор + калий 400+200+40 0 3606 290 8,0 ± 0,4*

Таблица 7

Образование почек на эксплантах, полученных на основе 10 суточных зародышей льна-долгунца 1992 г.

Среда Тип зародыша Изучено эксплантов Образовалось эксплантов с почками Получено почек

всего на 1 эксплант

шт шт % ± 2Sp шт шт.

Sh-2 НЗ 191 90 47,1 ±7,2 387 4,3

ННЗ 170 70 41,2 ±7,6 273 3,9

Моп НЗ 167 70 41,9 ±7,6 224 3,2

ННЗ 160 39 24,4 ± 6,8 109 2,8

Наши исследования показали разную реакцию НЗ и ННЗ на изолирование и культивирование их in vitro Отмечено, что чем старше НЗ, в интервале 8-12 суток после опыления, тем выше морфогенети-ческая активность Установлено, что наибольшей морфогенетической активностью обладают ННЗ в возрасте 9-10 суток При этом образуется существенно большее число эксплантов с почками и колличество почек на один эксплант Снижение морфогенетической активности у ННЗ старше 10 суточного возраста может указывать на начало про-

цесса их элиминации и этот возраст может рассматриваться как критический (табл. 8). . : .

; .. .. Таблица 8

Влияние возраста незрелых зародышей на морфогенез эксплантов льна-долгунца на среде 8Ь-2. 1992-1993 гг. "

Возраст, зародышей Тип зародышей , Изучено эксплантов Образовалось эксплантов с почками Получено почек

всего на 1 экс-плант

сутки шт. шт. % ± 2Эр шт. шт.

8 - нз .112 19 17,0 ±7,0 38 2,0

ННЗ 110 11 10,0 ±5,8 18 1.6 ^

9 НЗ 147 52 35,4 ±7,8* 125 2,4

ННЗ 126 49 38,9 ± 8,6* 122 2,5

10 НЗ 206 103 50,0 ± 7,0* 257 2,5

ННЗ 173 50 28,9 ± 6,8* 120 2,4

12 НЗ . 106 71 67,0 ± 9,2* 191 2,7

ННЗ. .... 107..... 15 . .14,0 ±6,8 32 2,1

Укоренение побегов. Изучение влияния ряда факторов на укоренение побегов льна-долгунца показало, что снижение концентрации углеводов в диапазоне 30-10 г/л в питательной среде сопровождалось усилением процесса корнеобразования у побегов. - Существенно большее количество регенерантов (73,3 %) получено при наименьшем содержании сахарозы, при содержании углеводов в среде 30 г/л -. 40%. Для оценки влияния концентрации питательных веществ на образование корней у побегов использовалась среда А22т. В опыте изучались 4 варианта концентраций среды: полная и сниженная на 0,25 %, 0,50 % и 0,75 %. Исследования показали, что количество макро- и микроэлементов, составляющих среду существенно влияет на укоренение побегов^ -Уменьшение концентрации питательной среды на 50% существенно увеличивало число побегов с корнями. Однако, дальнейшее снижение концентрации не сопровождалось улучшением корнеобразования (табл. 9). . . .

Таблица 9

Влияние концентрации среды на укоренение побегов льна, полученных на основе незрелых зародышей. 1995 г. п=60

Концентрация среды, % Получено регенерантов

шт. % ± 2 Эр

100 28 46,7±12,9

75 31 51,7±11,8

50 44 73,3±11,4*

25 32 53,3±12,9

Использование питательной среды А22т, содержащей 50 % концентрата и 10 г/л сахарозы, позволило получить достаточное количество корней на одном побеге (от 3 до 15 шт.), что способствовало успешной акклиматизации регенерантов к обычным условиям и получению наибольшего количества укорененных побегов (73-87%) Установлено, что увеличение концентрации агара в диапазоне 0-7 % в среде сопровождалось усилением корнеобразования (г = 0,95)

Характеристика линий, полученных на основе незрелых недоразвитых зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовой гибридизации. Изучение регенерантов и их потомств, полученных на основе ННЗ, показало возможность получения форм льна, которые по изучаемым признакам отличались от исходных генотипов Испытание потомства первого - третьего поколений позволило получить линии, не уступающие, а в ряде случаев превосходящих по ряду признаков исходные генотипы и сорт-стандарт Алексим При сравнении потомств различных типов зародышей (НЗ и ННЗ), изолированных из одной коробочки выяснилось, что потомства регенерантов, полученные на основе ННЗ не уступали или превосходили потомства, полученные на основе НЗ (табл 10)

Из 5 линий, проходивших испытание в селекционном питомнике 3-го года, выделились 3 линии, которые по урожаю соломы, семян и длинного волокна превосходили стандартный сорт Алексим Причем, в условиях 1995 г , они имели высокую устойчивость к полеганию Выявлено, что линия БТ.П-13 может представлять особый интерес для использования в селекционном процессе, так как она превосходит стандарт по ряду хозяйственно ценных признаков и при этом является высокоустойчивой к фузариозному увяданию (табл. 11)

:•- : ; Таблица 10

. Характеристика регенерантов третьего поколения, полученных на основе недоразвитых зародышей.

1996г. Селекционный питомник 2-го года. ; :

Генотип Высота растений, см. - Техническая : длина, см. Масса технической части, мг. - Число коробочек на раст., шт. Число семян на раст., шт. Масса волокна с раст., мг. Содержание волокна, %о

Алексим, ст. 81,2 75,0 381,2 2,4 8,4 144,8 38,0

Дашковский 2 ■ 80,0 73,2 340,5 2,7* 11,7* 109,5 32,2

Дашковский 2,14нз 86,6** 80,6** 355,6 2,8* 14,8* 115,0 : 32,3

Дашковский 2,14ннз 88,4** 83,4** 394,0* ■ 2,8* 12,8* 127,4* 32,4

НСР05 1,5 1,7 15,9 0,3 2,3 6,7 1,2

Алексим, ст. 81,2 74,0 ■ 381,2 2,4 ' 8,4 144,8 38,0

Р-736 ' . 86,2* 83,7* 427,2 1,4 4,8: 153,8 36,0

Дашковский 2 ' 80,0 -73,2 340,5 2,7* 11,7* 109,5 : 32,2

Р-736 х Дашковский 2 83,8 79,1* . 367,6 1,8 10,8 127,8* 34,8

Р-736хДашк.2,155H3-R-2 93,2** 86,0** 510,8** 2,2 11,2* 180,2** »■ 35,3

Р-736 х Дашк.2,1HH3-R-44 96,8** '89,2** 555,6** 2,8* .6,8 194,6** » 35,1

НСР 05 3,9 3,6 50,4 0,4 2,6 18,0 1,1

Алексим, ст. 81,6 74,6 393,6 2,2 15,4 149,4 37,9

Р-736 86,2* 83,7* 427,2* 1,4 4,8 153,8 36,0

Белинка 83,8* 76,8 - 403,2 .. 2,8* 15,2 115,6 28,7

Р-736 х Белинка 84,0* 79,6* = 387,2 2,0 9,0 122,0 ; 31,5

Р-736хБелинка,23нз^-99 85,2* 80,4* 403,0 2,8** 14,0* • 130,2 ' 32,3

Р-736хБелинка, 12HH3-R-78 86,2** 81,0* ' 431,4**- 2,6* у 17,4* 135,6* ; 31,4

НСР 05 1,8 2,2 . 24,3 0,5 : 3,9 10,9 1,8

Таблица 11

Характеристика линий, полученных в эмбриокультуре при внутривидовой гибридизации Данные лаборатории селекции ВНИИЛ _Селекционный питомник 3-го года 1995 -1996 гг_

Название линии Масса с 1 м2, г Выход волокна всего, % Высота раст., см Длина вегетационного периода, сут Устойчивость к фуза- риозу, %

соломы семян волокна

1995 г

БТЛ-12 690 45 6 103,0 14,9 86,0 71,0 42

В % к ст 114,0 84,0 133,8 117,3 121,0 95,9

Алексим.ст 605 54,3 77,0 12,7 71,0 74,0 80,0

БТЛ-13 690 43,3 93,0 13 5 90,0 71,0 87,5

В % к ст 114 0 79 7 120 8 106,3 126.8 95,9

Алексим.ст 605 54,3 77 0 12,7 71,0 74,0 80,0

1996 г

БТЛ-13 415 57,3 95,9 23,1 59,0 86,0 83,3

В % к ст 111,9 134,7 99,4 88,8 103,5 0

Алексим.ст 371 42 7 96,5 26,0 57,0 86,0 100 0

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1 Усовершенствован метод получения регенерантов льна, основанный на культивировании in vitro незрелых семян, формирующихся при опылении кастрированных цветков льна L usitatissimum пыльцой L grandiflorum, который позволяет получить 9,0-25,6% регенерантов

2 Культивирование незрелых семян, полученных при опылении L usitatissimum пыльцой L grandiflorum, в возрасте 20 суток на питательной среде Sh-2, включающей БА в концентрации 1,0 мг/л, НУК- 0,05 мг/л, сахарозу - 25 г/л, глюкозу - 25 г/л, позволяет получить 20 - 21 зеленых зародышей на 100 культивируемых семян

3 Регенераты льна, полученные на основе межвидовых скрещиваний фертильны и соответствуют L usitatissimum Природа происхождения дигаплоидов подтверждена данными морфологического, электрофоретического и биохимического методов анализа Побеги, имеющие фенотипические признаки L grandiflorum появляются с частотой 0,1- 0,2 %

4. Усовершенствовано получение растений-регенерантов путем сохранения нежизнеспособных зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовых гибридов.

5. Наиболее активно морфогенез протекает при культивировании in vitro 9 - 10 суточных незрелых недоразвитых зародышей льна. Чем старше (8-12 суток) нормальноразвивающийся зародыш, тем

. выше его морфогенетическая активность. Применение ■ питательных сред Sh-2, Монниера для культивирования незрелых зародышей позволяет получить 24 - 76 % эксплантов с почками и побегам. :

6. Культивирование побегов льна на среде А-22т, содержащей 50% макро- и микросолей и'Ю г/л сахарозы, позволяет получить 73- " 87% укорененных побегов. " , ;

. 7. Культивирование in vitro незрелых недоразвитых зародышей льна, -позволяет выделить большее количество ценного материала по признакам: высота растений, длина и масса технической части

. стебля, а также масса волокна по сравнению с культивированием незрелых нормальноразвитых зародышей.;

8. Использование эмбриокультуры самоопыленных генотипов и внутривидовых гибридов L usitatissimum приводит к получению , регенерантов, отличающихся по морфологическим признакам от исходных генотипов, а также регенерантов, превосходящих родительские генотипы и сорта-стандарты по основным селектируемым признакам.

9. Использование усовершенствованного метода' эмбриокультуры позволило создать на основе межвидовых и внутривидовых скрещиваний формы льна-долгунца БТЛ-13; БТЛ-15; П-148-R; R-44 и др., превосходящие по продуктивности исходные генотипы и сорта-стандарты. Данные формы нашли применение в селекции льна-долгунца. . „

. Предложения для селекционной практики

1. Для создания генетического разнообразия льна-долгунца наряду с традиционными методами селекции рекомендуется использовать разработанные методы эмбриокультуры незрелых зародышей, получаемых при межвидовой и внутривидовой гибридизации;

2 Для ускоренного получения гомозиготных линий и повышения эффективности селекционного процесса предлагается использовать метод получения дигаплоидов, основанный на культивировании незрелых семян межвидовых гибридов льна-культурного с видом I. дгапсЬАогит;

3 В качестве исходного материала при создании новых сортов рекомендуется использовать формы льна-долгунца (БТЛ-13, БТЛ-15, П-148 И, Я-44 и др ), созданные на основе эмбриокультуры при межвидовых и межсортовых скрещиваниях

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Поляков А В , Егорова Е Г. Использование гаплоидии для получения исходного селекционного материала льна-долгунца // Селекция, семеноводство и агротехника возделывания льна-долгунца - Сб науч трудов, вып XXVII Торжок ВНИИЛ - 1991.-С 31-38

2 Poliakov А V, Zhutchenko А А , Egorova Е G , Proliotova N V, Chikrizova О F , Rutkowska-Krause I, Trouve J P Embryo culture as a tool

for production of new flax genotypes (Linum usitatissimum L) II Breeding for fibre and oil quality in flax Proceedings of the Third meeting of the International Flax Breeding Research Group St Valery en caux, France, 7-8 November 1995 - P 51-56

3 Поляков А В , Егорова E Г Использование эмбриокультуры в межвидовых скрещиваниях рода Linum II Национальная коллекция русского льна Торжок ВНИИЛ -1996-С 39-43

4 Poliakov А V, Proliotova N V, Egorova Е G , Rutkowska-Krause I The influence of some factors on rooting of flax shoots obtained in vitro culture II Natural Fibres, R XL -1996 - P 75-80

5 Поляков А В , Чикризова О Ф , Егорова Е Г., Пролетова Н В , Рутковска-Краусе И Влияние регуляторов роста на морфогенез и генетические изменения льна при культивировании изолированных тканей и органов in vitro // Тез докл IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г) М МСХА -1997 - С 310-311

б.Егорова Е.Г. Получение регенерантов при скрещиваниях льна культурного с диким видом L grandiflorum // Тез. докл. II меж- '--дународного симпозиума" Новые и нетрадиционные растения и перспективы • •'.<• - . их практического использования" (16-20 июня 1997 г., г. Пущино).- г. Пущино.-1997,-С. 303-304.

, 7.Поляков A.B., Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г. Перспективы использования биотехнологии в решении проблем льноводства // Тез. докл. 1-ой Обласной научно-практической конференции "Научные проблемы устойчивого развития Тверской области" (20-21 ноября 1997 г., г. Тверь).- г. Тверь.- 1997.- С. 134-135.

в.Поляков A.B., Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г. Использование биотехнологических методов для расширения генофонда льна // Тез. докп. VII съезда БОГИС. (16-19 июля 1997 г. г.Горки Могилев-ской обл.)-1997.-С.103.

Э.Егорова Е.Г., Поляков A.B. Использование эмбриокультуры при опылении Linum usitatissimum L. пыльцой Linum grandiflorum // Научная сессия "Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы" (1...3 июля. 1998 г.).- Киров: РАСХН, Северо-Восточный научно-методический центр.-1998.-С. 24-25.