Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Создание форм льна-долгунца Linum usitatissimum L. на основе эмбриокультуры

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Егорова, Елена Григорьевна, Торжок

6У; О^'З АА-

V V

ВСЕРОССИйс:А/;й А АУ Ч НО -АССА ЕДС £АТЕЛ ЬСКИЙ Акститут ЯЬНА

ме прй~ях рукописи

.аидвдсп сельскохозяйственных наук. А,А, ПОЛЯКОВ

; ир>:СОК - 133?

SO ЦСбро^СМЙСЮМ

а 1990 - 1997 гг.

С ОД Е РЖАН И Е

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ 9 ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЦЕННЫХ ФОРМ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

1.1. Значение льна-долгунца, достижения и перспективы в 9 селекции этой культуры

1.2. Направления исследований в культуре тканей льна 14

1.3. Практическое применение метода эмбриокультуры 19

1.4. Межвидовая гибридизация 22

1.5. Снижение эллиминации рекомбинантов на стадии 27 незрелых зародышей

1.6. Влияние ряда факторов на выход регенерантов в 30 эмбриокультуре

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 37

2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИСХОДНЫЙ 37 МАТЕРИАЛ, СХЕМЫ И МЕТОДИКА ОПЫТА

2.1. Почвенные, агротехнические и метеорологические 37 условия проведения исследований

2.2. Исходный материал исследований 41

2.3. Методы исследований 42

2.3.1. Методы вегетационного и полевого опытов 43

2.3.2. Методика лабораторного опыта 45

2.3.3. Математическая обработка экспериментальных 48 данных

3. СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА ПРИ ОПЫЛЕНИИ 49 ЦВЕТКОВ 1_. ивКайввшит 1_. ПЫЛЬЦОЙ 1_. дгапсПЛогит

3.1. Влияние генотипа льна на получение зеленых 49 зародышей при межвидовых скрещиваниях

3.2. Изучение влияния возраста исходных эксплантов на 54 получение зеленых зародышей при межвидовой гибридизации

3.3. Влияние питательных сред на получение зеленых 59 зародышей при межвидовой гибридизации

3.4. Укоренение побегов, полученных на основе зеленых 65 зародышей при межвидовой гибридизации и изучение регенерантов

3.5. Характеристика линий, полученных на основе 71 межвидовой гибридизации льна по основным хозяйственно-ценным признакам

4. СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА ПУТЕМ СОХРАНЕНИЯ 82 НЕЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ЗАРОДЫШЕЙ САМООПЫЛЕННЫХ ГЕНОТИПОВ И ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДОВ

4.1. Образование недоразвитых зародышей при 82 внутривидовой гибридизации льна-долгунца

4.2. Морфогенез у льна-долгунца на основе недоразвитых 85 зародышей

4.3.Оптимизация условий укоренения побегов, полученных 91 на основе незрелых зародышей при межсортовой гибридизации

4.4. Характеристика регенерантов, полученных на основе 95 незрелых недоразвитых зародышей по основным хозяйственно-ценным признакам

ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ 108

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 111

ПРИЛОЖЕНИЯ 131

- питательные срьды;

й^рьлый ноошльчстжйивающийся заоодыш:

1й

<• Г

M - ••>•• CS

'A. nai-

ИМВД Ii

if i с > Чг V'^iS. . 1 í t,V ,i "-o

ui r M .-?r(í -к 4.

>Ан:й,ллгтай nr.uTéi

Vïl-Г l

' l 1 . ->,< '' ■"a 1 г ч J

¡ _ f ^ , ^ ii, • „ í, , ' i r 'ri .

• ! liíi

4 Ï J f ¡ л

гербицидам, а на безгербицидном фоне не уступали по урожаю семян исходным сортам (McHughenA., 1989, 1991).

Опубликованы результаты исследований по получению протопластов культивируемого и диких видов льна и регенерации из них растений (Baracat M.N., Cocking Е.С., 1983,1985; David H., Sourmail N., Bade P., David A.,1991), использованию незрелых зародышей для селекционно-генетических целей (Nichterlein К., Nickel M., Limbach H., Friedt W., 1991), по регенерации гаплоидных растений на основе пыльников и микроспор (Sun H., 1984, Sun H., Fu W., 1991; Nichterlein К., Nickel M., Umbach H., Fried W., 1991; Poliakov A.V., 1991). Однако, большая часть иследований находится на стадии методической проработки и не вышли за пределы лабораторных испытаний.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание форм льна-долгунца методом эмбриокультуры и оптимизация условий получения дигаплоидов при опылении L. usitatissimum пыльцой L. grandiflorum, а также получение регенерантов на основе нежизнеспособных зародышей самоопыленных генотипов и внутривидовой гибридизации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи :

- исследовать генотипические особенности льна при культивировании in vitro незрелых семян и зеленых зародышей;

- уточнить условия выращивания донорных растений;

- уточнить условия культивирования исходных эксплантов;

- подобрать условия для повышения морфогенетической активности зеленых зародышей;

- подобрать условия для укоренения побегов;

- установить природу происхождения регенерантов, полученных на основе межвидовых скрещиваний;

- создать линии льна-долгунца на основе метода эмбриокультуры с высокими „ показателями основных хозяйственно ценных признаков, представляющих интерес для селекционной практики.

Научная новизна и практическая ценность исследований.

Впервые, с помощью метода эмбриокультуры на основе межвидовых скрещиваний получены жизнеспособные регенераты, являющиеся дигаплоидами. Уточнены условия культивирования незрелых семян для увеличения выхода зеленых зародышей и регенерантов.

Впервые на льне-долгунце показана высокая значимость культивирования незрелых недоразвитых зародышей для создания линий, характеризующихся комплексом хозяйственно ценных признаков.

На основе эмбриокультуры при межвидовой и внутривидовой гибридизации созданы формы льна-долгунца, которые используются в селекционном процессе лаборатории селекции ВНИИЛ.

Данные исследования открывают новые возможности создания нетрадиционных генотипов льна-долгунца.

я •• Г-' Г; Л т V О

- - г-~ V - .У И- ^ ' ' «. Ц - f---- ФОРМ

* > '.

V-.».уиунца. достижения и перспвюгивы в селекции

V

ЯЛН культурный (Ипит ииРаУзз;ГпУГЛ I... оооо,ойил;>; технических культур комплексного и >г, \л,\ . - *

и--» » и 1 чч 10 "V • ^ й области

гения льна

1 ■ ! у ценность

которого не может зэм&нмть волокно других технических растений, льняное ло-окно нашло широкое применение в текстильной, автомобильной ооо\олаоол лктл1ох. Лнняныо ткони отличаются гигиеничностью, долговлчиостдо, нлчоной. Льняное масло является незаменимым в лакошасочноРн

х,

нооолллооиой. фармацевтической и другой отраслях промышленности;, Лы-шлой

ОКООВ?яНН& _ , ... (. :

,-ОК1

: (содержит до ¡ЛНЗуЛТСя для ТЛИ и МНОГИХ

. Г удезич П.П..

л--; одаптнроран но вдног т-0'0 ;:ннголн. По Дйиното ФАО (1 лчо.д.гТ;;.. / л.нн. со. При зтоад площа^

с оста в J ¡,»

3 ^оосон о 1994 г, об-дие посевные площади ллооично*"о льна

л

>

оннок льна настояш-ос оостоо здо^оот в основное от промышленного

ОТТОООТ. KZ'/ ОООО.ТОуМ v- О0! О ООС у0т0-;0пс070:0 тродаподстЗО СТОЙКОХ

ссооук;-щкх. ан7сощоотк уввл^чизйемсн (Van Dam J.E.G. et aL - " -у что рцадп^ние p производство высокоурожайных, устойчивых к

. ■ ■ 1 ..... . ■ ! ■ ..... . : ...... ; ,..■ .. . ... ■■■. ^ ; г...;..' -.,„■

•> t "> > ••/! и> , li. tu j ir w не'. ¡jt.1 ItWf , (ЛИ ' 1 ^KvS • '

^^¡'WRjji'OB A H 1-9Я4),

Я COpTOO:. Окк ДССШНЫ быть вОСОКОПрОДуСТИВНЫШ по

I i j < _ i » .о м 1 L 1 < (ч _« I iv 1 с « 1 [ , I I '

v-осокой устойчивостью к гюлегочмю и комплексу болезней, а также

V „^.„нн^..« . .'-.у'. ,41-. tj 1 1 wt t^ri ' ^ I ! /> * С 1 i

- 1 , - .. ~ f r ' <• , ■ 1 . 1,

lilt t*. ^ J t (Ji !

■ к - » ц r , ,_> _ 'f , , " » " ' . , И Г - ,r J - f, Ь

оч^ толокно с гектара, обладают комплексной устойчивостью

содво К.И.: 1994; Жучеико o:v'c.y Хотрадиционная селекция имеет ряд успехов в улучшении

что мало сортов, сом почснякоо Большая часть сортов

•"••••< • - . - с, 1 л jo >

" " " v

Г.-. íi;nKO

Г.., . - г /i■ ику

- ; С;а;: ,

i ■- •<••-..":• - - - ~ "''*'! n

,.--vV> ». ' MfivH>V(wefl>" n r • >*.«< «-»►• -»•>_♦.>•«« .». , . y.. ^ -г"» - • •• f't-'И 'Ai (И

...------! I >■-■ Ml H rS ..ítí'.l|arf;v> in yi ¿j.' Г • ; r'Jff"» У H У U i U í^H

, ¡.i ../■b'vjib^i СУЗДЭНИв

, rOh -.. rwl • - • •• • ,<

.4.,,> , ; , i ,< íу p '^O.'.'T^ Г^'П Ь КПвТКУ

...... ,. .■■■■• ' ..■-.- -VODTCÏÏ растений

: '" ■ ¡II i i:1' s ,,

J" J^

-..-г.., >-...„,,

,„,..,;..: i...-;.;,,.. ,, , « . j i ч., i-, .. r i.:, л

уступающие по

.................................... * - Л ' ... . Г / > > : ... ». Í it j t Ii

■ >■-> -.r,..,, ,,,-.:,.,,,>- i, , (fiai Í7 4 f'îri ¡1.' > i ' .» í

МЫ nif>¡-ЙП

Vf ''t"

— U I < 1

(íí!,, íiiO

Л-гЛен и

г: и-;

16

Таблица 1

Использование льна Linum usitatissimum в культуре ткани

Эксплант Цель Результат Источник

1 2 3 4

Пыльники Гаплоидные растения Гаплоидные растения SunH., FuW. (1981)

Меристема Регенерация побегов Побеги, корни LaneD.W. (1979)

Побег (протопласты) Регенерация Побеги*, корни Barakat M.N., Cocking EC. (1985)

Сегменты стебля Регенерация Побеги, корни Chlyah H.M. etal (1980)

Сегменты стебля Регенерация Побеги, корни Murray B.E. et ai (1977)

Сегменты стебля Анализ нуклеиновых кислот Каллус CullisCA (1991)

Семядоли Регенерация Побеги,корни Rybczynski Y.J. (1975)

Семядоли Регенерация Корни Ibrahim R.N. (1971)

Семядоли Регенерация Корни Mathews V.N., Narayanaswamy S. (1976)

Семядоли (суспензия) Анализ на фенолы Каллус, суспензия Ibrahim R.N., Phan M. (1978)

Семядоли (протопласты) Регенерация Побеги, корни Barakat M.H., Cocking E.C. (1983)

Проростки Регенерация Побеги, корни McHughen A., Swartz M. (1984)

Гипокотели Гипокотели Побеги, корни Lane D.W.(1979)

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4

Гипокотели Регенерация Побеги, корни Mathews V.H., Narayanaswamy S. (1976)

Гипокотели Регенерация Побеги, корни Gamborg O.L., Shyluk J.P. (1976)

Гипокотели (протопласты) Регенерация Копни ---Г- BarakatM.H., Cocking E.C.(1983)

Корни (протопласты) Регенерация Побеги, корни Barakat M.H., Cocking Е.СД1983)

Незрелые зародыши Регенерация Соматические зародыши Pretova A., Wiilams E.G. (1986)

Проростки, апексы побегов (протопласты) Регенерация Побеги, корни Ling H.Q., Binding H. (1987)

Примечание:* характерно только для вида льна L. lewisii

сегменты, меристемы и сегменты стеблей использовались в качестве исходных эксплантов для индуцирования культур in vitro льна (Ibrahim R.H.,1971; Gamborg O.L., Shyluk J.P., 1976; Mathews V.H., Narayanaswamy S., 1976; Murray В., Handyside R.J., Keller W.A., 1977; Lane W.D., 1979: Kaul V., Williams E.G., 1987; Поляков A.B. и др., 1991). Показано, что регенерация растений происходит высоко эффективно на основе гипокотильных сегментов (Gamborg O.L., Shyluk J.P., 1976; Mathews V.H., Narayanaswamy S., 1976; Kaul V., Williams E.G., 1987; Поляков A.B. и др., 1991).

К изменению наследственности приводит культивирование in vitro тканей и клеток in vitro в течение длительного времени. Это явление нашло применение в селекции табака (Flashman J.M., 1982), пшеницы (Larkin P.J. et al.,

1984), ячменя (Powell W. etal., 1984), лядвенеца рогатого (Damiani F., Pezzotti M., Arcioni S., 1990), огурца (Toldi O. et al., 1995), картофеля (Thieme R., Grieb H., Tiemann H., 1995), моркови (Toldi O. et al., 1995) и ряда других культурных растений, как способ увеличения генетического разнообразия и получило название "сомакпональной вариабельности" (Larkin P.J., Scowcroft W.R., 1981)/.

Большое колличество исследователей на многих субкультурах наблюдали возрастающие отклонения в числе хромосом. Воспроизведение генетически идентичных генотипов через дифференциацию в культуре каллуса можно осуществить только у некоторых видов и при определенных условиях, например, при использовании первичного каллуса, при малых субкультурах и по возможности при соматическом эмбриогенезе. Однако, для селекции регенеранты, в которых возникновение стеблевых меристем индуцируется заново, могут представлять большую ценность, в связи с изменениями прошедшими на генетическом уровне (Лейке Г., Лабес Р., Зртель К., 1980; Бутенко Р.Г., Хромова Л.М., Среднина Г.А. и др., 1983).

Наблюдаемое генетическое несходство регенерированных растений, полученных на основе культуры каллуса, может быть результатом таких факторов, как: прижизненные изменения в эксплантах, стрессовые условия in vitro культуры, отбор специфичных генотипов в течение регенерации растений (McCoy T.J. et at., 1982). Мутации отдельных генов, активация элементов мутаторов, изменение количественных признаков и хромосомные нарушения (Phillips R.L., Kaeppler S.M., Peschke W.M., 1990) и ряд других причин, подробно описанных в статье Przybecki и Malepszy (Przybecki Z., Malepszy S., 1992) могут лежать в основе сомакпональной изменчивости. На частоту возникновения сомаклональных вариантов влияет генотип культивируемого растения (Armstrong К.С. etal., 1983; Flashman J.M., 1982; Thieme R., Grieb H., Tiemann H., 1995), однородность донорных растений (Hanna W.W., Lu С., Vasil I.K., 1984), тип культуры ткани (McCoy Т.J. etal., 1982). В исследованиях Damiani и его коллег, на лядвенеце рогатом, было показаночто она может достигать 20% (Damiani F., Pezzotti М., Arcioni S., 1990).

При культивировании тканей льна-масличного в условиях in vitro, были получены формы, устойчивые к экстремальным факторам среды, и формы, измененные по ряду хозяйственно-ценных признаков (Marshall G., Courduries P., 1991).

Важным аспектом культуры in vitro является метод изолированной культуры зародышей - это один из нетрадиционных методов селекции, позволяющий значительно повысить эффективность селекционного процесса. Он позволяет получать новые хозяйственно-ценные формы растений, которые в естественных условиях не удаются, повышает эффективность отдаленных скрещиваний.

1.3. Практическое применение метода эм6риокультуры

Эмбрионы - это первый растительный орган, который был успешно культивирован in vitro на искусственной среде. Изучение культуральных условий и физиологии in vitro в первой четверти нашего века сделало возможным два важных практических применения: спасение эмбрионов, полученных путем межвидовой гибридизации, которые в противном случае были бы потеряны в гибнущих семенах, и размножение садовых культур путем проращивания in vitro их маленьких и физиологически незрелых _ семян. Одновременно с использованием культур in vitro связано изучение различных аспектов эмбриологии. Спасение гибридных эмбрионов оставалось в течение последних 50-ти лет важным для различных видов, родов и семейств растений.

Первое сообщения об успешном культивировании эмбрионов in vitro сделал Hannig (1904), который отдельно выращивал эмбрионы Raphanus и Cochlearia на среде из минеральных солей с добавлением Сахаров, аминокислот и растительных экстрактов. Он описал проблему прорастания

зародышей - маленьких незрелых эмбрионов, необходимых для того, чтобы прорастить слабые и недостаточно жизнеспособные растения.

С этой проблемой впоследствии сталкивалось множество других ученых, использовавших незрелые эмбрионы (Norstog К., 1975). Brown (1906), работая с эмбрионами Hordeum, изучил влияние различных органических источников азота и установил, что глутамин наиболее эффективен для инициации роста культуры. Используя Zea mays, Andronescu (1919) установил, что эмбрионы, культивируемые без эндосперма, прорастают в более мелкие растения, чем эмбрионы, культивируемые с эндоспермом - таким образом появилось несколько важных гипотез, касающихся функций эндосперма. Вероятно, что первое применение культуры эмбрионов должно найти коммерческое использование для размножения растений. Это основано на открытии Knudson (Knudson L., 1922) того, что семена рода орхидейных Caffleya и Laeiia могут быть пророщены In vitro в отсутствии нормального симбиоза с грибами. Еще одно применение, основанное на использовании эмбриональной культуры установили Essenbeck и Suessenguth (1925), изучавшие биохимию прорастания в Zea mays. Несколько важных наблюдений сделал Dietrich (1924 ), работавший с эмбрионами видов, родов и семейств, включавших Althera и Ipomoa. Используя агар-гелевые минеральные питательные растворы, он установил, что прорастание наиболее быстро идет на поверхности агара по сравнению с полным погружением. Dietrich также подтвердил наблюдение Hannig в преждевременном прорастании и, что наиболее важно, установил, что эмбрионы, эксплантированные на менее чем 1/3 размера зрелого зародыша, могут производить растения, способные к полному созреванию.

La Rue (1936) подтвердил это наблюдение и сделал заключение, что эмбрионы, размером меньше критического ( 0.5 мм ) не могут быть культивированы in vitro.

Успешное спасение гибридных эмбрионов Linum осуществил Laibach (1925, 1929), внедрив возрастание интереса к эмбриональной культуре как к методу улучшения растений.

Эмбриокультура считается одним из самых прогрессивных способов получения гаплоидов растений. Основной интерес к гаплоидам связан с возможностью их использования в качестве посредников для получения гомозиготных растений. Это открывает новые пути для получения измененных исходных форм и создания отвечающих запросам практики сортов растений (Данвел Дж.М.,1989).

На ряде злаковых культур широко применяется метод гаплопродюссера. Так в ВСГИ сотрудниками отдела ячменя проводится работа по получению гаплоидов из F1 гибридов от скрещивания перспективных форм отдела с тем, чтобы непосредственно из популяции F2 получать гомозиготные линии (Методы культуры тканей и органов в селекции растений, 1980). На возможность использования Hordeum bulbosum в качестве гаплопродюссера при скрещивании с Н.vulgare указал впервые Devies (Devies D.R., 1960). После скрещивания происходит элиминация хромосом H.bulbosum из гибридного зародышевого мешка, и в дальнейшем вследствии деструкции эндосперма такие зародыши погибают. Однако, вычленив и поместив на питательную среду эмбрион, мотто получить гаплоидное растение.

На основе гаплоидной селекции созданы два сорта яменя: Исток и Одеский 115 во ВСГИ, отличающиеся повышенной устойчивостью к полеганию, засухе, пыльной и твердой головне, высокой продуктивностью. Этим же методом созданы многочисленные линии яровой пшеницы, ячменя (НИИСХ Юго-Востока) и картофеля (НИИКХ), используемые в селекционном процессе.

В работах чехословацких ученых показана возможность получения соматических эмбриоидов на основе незрелых эмбрионов (Erdelska О., Kobetikoba D., Pretova А., 1973; Pretova А., 1978). В качестве исходных эксплантов, были использованы незрелые зародыши, полученные от самоопыления. В ходе экспериментов проводились наблюдения за развитием зародышей в искусственных условиях. Характер и степень различий в развитии в естественных и условиях in vitro зависили от возраста извлеченных зародышей, степени их дифференциации во время извлечения, а также от физических параметров окр