Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

(ВИЖ)

На правах рукописи

КУТРА Ионас Повилович

УДК 612.646.02

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.13 — физиология человека п животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

и. Дубровицы, Московской обл., 1991

Работа выполнена в Литовском институте животноводства.

Научный руководитель:

— заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор Ю. Д. КЛИНСКИЙ.

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук В. П. КОНОНОВ,

— кандидат биологических наук В. Я. ЧЕРНЫХ.

Ведущее учреждение —

Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных жи-вотых, Боровск.

Защита диссертации состоится <Ог...:.<..»..л....г /

1991 года в.........¿..У.......часов на заседании Специализированного совета Д 020.16.02 при Всесоюзном ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательском институте животноводства. Адрес: 142012, Московская область, Подольский р-н, пос. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инс-

Автореферат разослан ......../.... .1'.. .(19 91 года.

I

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

И. И. ЩМЫГИН

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последнее время, наряду с традиционными биотехнологическими методами (искусственное осеменение, глубокое замораживание и длительное хранение семени быков, вызывание половой охоты и др.), практическое значение приобрела трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный метод ускоренного размножения высокоценных племенных животных.

В Литве первые успешные пересадки эмбрионов крупного рогатого скота сделаны в 1985 г. специалистами сектора трансплантации эмбрионов Литовского НИЖ. За 1989 год от высокопродуктивных коров-доноров было получено 113 телят-трансплантантов. Приживляемость пересаженных эмбрионов в среднем составила 55—60%. В настоящее время освоены методики и успешно проводятся работы по микрохирургическому делению, культивированию in vitro и замораживанию эмбрионов.

Воспроизводительная функция животных контролируется сложным комплексом механизмов нейроэндокринной системы, ключевую роль в которой играет гипоталамус. Поэтому открытие гипоталамического гонадотропин-рилизинг гормона (Гн-РГ) и успешный синтез его аналога сурфагона вызывали особый интерес среди многих исследователей. После того как было установлено, что коровы на введение Гн-РГ реагируют выделением лютеинизирующего гормона (ЛГ), его начали применять с целью стимуляции воспроизводительной функции у коров в послеотельный период.

В научной литературе имеется мало экспериментальных данных об использовании сурфагона при вызывании суперовуляции у коров-доноров и о его влиянии на овуляцию, развитие эмбрионов и гормональный статус в организме животных. Недостаточно данных и об исследовании отечественных гипофизарных препаратов и простагландинов, применяемых при вызывании суперовуляции.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в усовершенствовании и разработке более эффективных методов гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров, синхронизации овуляций и улучшении качества эмбрионов путем применения гонадотропного рили-зинг-гормона — сурфагона.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

— изучить эффективность применения различных гона-дотропных препаратов (ФСГ-П. фоллитропин, фоллигон) отдельно и в комплексе с Гн-РГ на проявление полиовуляции, выход, качество и возраст эмбрионов;

— установить коррелятивную связь уровня прогестерона, эстрадиола, лютеинизирующего гормона в крови доноров перед началом гормональной обработки, во время охоты и во время вымывания эмбрионов с последующим выходом эмбрионов и их качеством;

— определить оптимальное место введения семени и кратность осеменения коров-доноров при суперовуляции;

— установить связь гормонального статуса реципиентов с приживляемостью эмбрионов.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые изучено влияние сурфагона на созревание и синхронность овуляций фолликулов в связи с динамикой ЛГ в крови после обработки коров-доноров ФСГ-П, фоллитропином и фол-лигоном.

Впервые для синхронизации охоты у телок-реципиентов использован синтетический аналог простагландина Рга — анкпрост и установлено, что препарат пригоден для этой цели (приживляемость эмбрионов у обработанных анипрос-том телок-реципиентов существенно не различалась от при-живляемости у обработанных эстрофаном и у телок со спонтанной охотой).

Установлено негативное действие высоких доз сурфагона на гипофиз, вследствие чего уменьшается выделение лютеинизирующего гормона при повторных обработках меньшими дозами этого препарата.

Практическая значимость работы. Полученные нами данные позволяют эффективно использовать Гн-РГ (сурфа-гон) при вызывании суперовуляции разными фолликулости-мулирующими препаратами и увеличить выход пригодных для трансплантации эмбрионов, эффективно провести осе-, менение коров-доноров и пересадку эмбрионов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

— всесоюзной научно-технической конференции по применению биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине (Москва, 1988);

— республиканской конференции «Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литве», Вильнюс, 1989;

— республиканской конференции «Вклад молодых ученых и специалистов при интенсификации животноводства в республике», Байсогала, 1988, 1989 гг.

Объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 4 графика, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и предложений производству, списка литературы, включающего 138 источников, из них 82 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Научно-исследовательские опыты проводили в 1987— 1989 гг. в Байсогальском экспериментальном хозяйстве Литовского научно-исследовательского института животноводства и ветеринарии и в экспериментальном хозяйстве Литовского научно-исследовательского института земледелия. Для опытов использовали коров-доноров литовской черно-пестрой породы, 4—7-летнего возраста живой массой 500— 650 кг со средней продуктивностью 4500—6000 кг молока за лактацию и телок-реципиентов 16—18-месячного возраста живой массой 340—360 кг.

Рационы кормов для коров-доноров и телок-реципиентов в зимний и летний периоды были сбалансированы по основным питательным веществам согласно нормам ВИЖ.

Перед обработкой животных гормональными препаратами проверяли общее состояние их здоровья (с учетом физиологических показателей крови).

Состояние половых органов исследуемых животных проверяли путем ректального обследования яичников (с учетом их размеров и наличия в них хорошо развитого желтого тела).

Опыты проводили в осенний и зимний периоды.

&

Схема опытов

I ОПЫТ

Применение сурфагона в сочетании с гппофпзарвыми и планцентарными гокадотропинамн для сипхровизацпи овуляций

Группа 1 | Препарат ( Доза Число животных

Контрольная ФСГ 40 мг 20

I опытная ФСГ-сурфагон 40 мг+25 мкг 20

II опытная Фоллитропин 1100 ЕД 20

III опытная Фо.'литропин+сурфагон 1100 ЕД+25 мкг 20

IV ояытная Фоллигон 2500 ИЕ 20

V опытная Фоллигон-)-сурфагон 2500 ИЕ+25 мкг 20

Применение разпых доз сурфагона для вызывания суперовуляции

у телок

Группа Препарат Доза Число животных

I опытная Сурфагон 2400 мкг 6

II опытная Сурфагон 800 мкг 6

III опытная Сурфагон 500 мкг 6

IV опытная Сурфагон 400 мкг 6

п ОПЫТ

Определение оптимального места введения семени и оптимальной кратности осеменения коров-доноров при суперовуляции

Число

Группа Кратность и место введения семени живот-

ных

1.

Контрольная Двухкратное осеменение в шейку матки с интервалом 12 ч 10 I опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интервалом 12 ч 10 II опытная Трехкратное осеменение в шейку матки с интервалами 12 V Ю III опытная Трехкратное осеменение в тело матки с интервалами 12 ч 10 2.

Контрольная Трехкратное осеменение в тело матки с интервалами ,12 ч 10 I опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интервалом 112 ч Ю II опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интервалом 12 ч с применением сурфагона 10 III опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интервалом 24 ч 10

ш опыт

Применение простагландинов для синхронизации охоты у те\ок-реципиентов Влияние различных факторов на прнжнвляемэсть эмбрионов

Группа

Приживляемость эмбрионов

Число -юаиж

Контрольная Прижнв ,'яемость эмбрионов у телок со спонтанной охотой 50 I опытная Приживлгемость эмбрионов у телок со синхронизированной эстрофаном охотой 100 II опытная Приживляемость эмбрноноз со синхронизированной анипростом охотой 20

В лабораторных и научно-производственных опытах использовано 152 коровы и 250 телок.

Содержание прогестерона и эстрадиола в крови определяли радиоиммунологическим методом в лаборатории эндокринологии ВИЖ, уровень ЛГ — в лаборатории Всесоюзного кардиологического научного центра Академии Медицинских наук СССР.

На каждого животного вели индивидуальный учет.

Для гормонального вызывания суперовуляции использовали стандартный СЖК (РоШаоп), ФСГ-П и фоллитропин по 4-дневной схеме. Для синхронизации овуляций применяли синтетический аналог гонадотропного рилизинг-гормона —■ сурфагон.

Корсв-доноров осеменяли ректоцервикальным методом замороженным-оттаянным семенем одного быка с количеством подвижных сперматозоидоз в дозе не менее 15 млн.

Для синхронизации охоты у телок-реципиентов использовали простагландип Г2« эстрофан (ЧССР) в дозе 500 мкг и анипрост (СССР) в дозе 500 мкг.

Кровь для определения концентрации гормонов брали из яремной вены у коров-доноров 1 раз перед началом гормональной обработки (9—И день полового цикла), 5 раз с 1-часовыми интервалами во время охоты и 1 раз после вымывания эмбрионов (7 день полового цикла). У телок, у которых вызвали суперовуляцин с помощью сурфагона, кровь брали перед началом обработки, 3 раза с 2-часовыми интервалами после введения сурфагона, 1 раз во время охоты и 1 раз на 7 день полового цикла. У телок-реципиентов кровь брали на 7 день полового цикла (после пересадки эмбрионов). Гормоны определяли в сыворотке крови, до анализа хранившейся при —20 °С.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование влияния сурфагоиа на созревание фолликулов, овуляцию и качество эмбрионов

Во время опыта установлено, что при обработке коров-донсров различными гормональными препаратами овуляция начинается и происходит неодновременно и зависит от вида применяемого гонадотропина.

Так, у 23,8% коров, обработаных ФСГ-П, 14,4%—фол-литропином и 6,7% фоллигоном, овуляция завершилась до 48 ч после введения эстрофана.

Более растянутая овуляция отмечена у животных, обработанных фоллигоном. Это отражает анализ стадий развития вымытых эмбрионов, а также исследования уровня ЛГ во время охоты.

Для синхронизации овуляций у коров-доноров был использован синтетический Гн-РГ — сурфагон. Время его введения (через 48 часов после обработки простагландинами, т. е. предполагаемое начало охоты) выбрано с целью через выброс ЛГ воздействовать на неовулировавшие фолликулы. Для определения влияния сурфагона на овуляцию нами было подсчитано процентное соотношение одновозрастных эмбрионов.

Наибольший эффект синхронизации овуляций сурфагон дает при использовании его с фоллигоном (процент однозначных по возрасту эмбрионов достигал 74,9%) (Р<0,001), а у обработанных только фоллигоном число таких эмбрионов составило 46,4%. Менее значительный эффект синхронности получен при применении сурфагона с ФСГ-П и фол-литропином. При этом синхронность возраста эмбрионов повышалась на 4,1 и 6,6% (Р<0,05) (табл. 1).

Во всех группах животных, обработанных сурфагоном, увеличилось число эмбрионов, стадия развития которых во время вымывания была (на 7 день полового цикла) поздней морулы и ранней бластоцисты. При этом соответственно уменьшалось число эмбрионов других стадий (табл. 2).

Было установлено, что эффект сурфагона проявляется не только синхронизацией овуляции, но и влиянием на качество эмбрионов.

У коров-доноров, обработанных ФСГ-П, в среднем с одного донора вымыто 3,4, фоллитропином — 3,6 и фоллигоном— 3,4 пригодных для трансплантации эмбрионов (Р< 0,05). В то время с коров, обработанных фолликулостиму-

Таблица 1. Синхронность развития эмбрионов в момент их вымывания при использовании разных гормональных препаратов

Показатель ФСГ (I контрольная) ФСГ+сур- фагон (I опытная) Фоллитро-пин (I контрольная) Фоллитро-пин+РГ (II опытная) Фоллигон (III контрольная) |Фо ЛИГОН+ | сурфагон ((III опытная)

Число животных 19 16 21 17 15 16

Вымыто эмбрионов 1,15 1119 150 99 81 88

Вымыто однозначных эмбрионов на 1 донора 55,6±4,69 59,7±6,4 61,5±5,3 68,1|±7,0С 40,5 ±4,56 74,9±4,5

Таблица 2. Синхронность возраста эмбрионов при использовании различных фоллнкулостиму ирующих препаратов отдельно и с сурфагоном

и о о. «

н о и. , и,

Показатель ФСГ + и и е Фолл! ропин Я ® © с < < о е Фолли ГОН+Р

Число животных 19 16 21 17 15 16

Всего вымыто эмбрионов 115 119 150 €9 81 88

Вымыто эмбрионов по их

возрасту:

М/, ч/% 1,4 1 12 1 8 8

12,1 0,8 8 1,0 9,9 9,1

М;/, ч/% 7 16 38 8 21 10

0,6 13,4 25,3 8,18 2,6 11,4

Мш, ч/% 16 38 15 13 16 18

13,9 31,9 10,0 13,1 19,8 20,5

Б,, ч/% 11 26 17 32 11 20

9,5 21,8 11,3 32,3 13,5 22,7

Б/л ч/% 27 8 21 13 7 16

19,1 6,7 14,0 13,1 8,6 18,2

Бш, ч/% -29 6 23 16 9 9

25,2 5,0 15,3 16,2 11,1 10,2

Б/у, ч/% ¡1 5 0 1 5 0

0,8 4,2 0 1,0 6,1 0

лирующими препаратами и дополнительно сурфагоном, получено: ФСГ-П — 3,9, фоллитропином— 4,0 и фоллигоном — 3,7 пригодных для трансплантации эмбрионов с одного положительного по суперовуляции донора (табл. 3).

3.2. Уровень суперовуляции в зависимости от концентрации гормонов в крови коров-доноров в отдельные моменты полового цикла при обработке различными гормональными препаратами

Гормональный фон крови коров-доноров перед обработкой фолликулостимулирующими препаратами (9—11 дни полового цикла) соответствовал физиологическим нормам. Уровень прогрестерона в среднем составил 4,9 ±0,20 нг/мл (Р<0,05), эстрадиола 17(5 — 18,5± 1,3 пг/мл, ЛГ— 3,2 = 0,61 нг/мл. Нами учитывались уровень гормонов перед началом гормональной обработки и реакция яичников суперовуляцией на 7 день полового цикла (во время вымывания эмбрионов) (табл. 4).

Таблица 3. Число и качество эмбрионов у коров-доноров при введении фолликулостимулирующих препаратов отде ьно и с сурфагоном

Показатель ФС.Г ФСГ+сур-фагон Фоллитро-пин Фоллитро-пин+сур-фагон Фоллигон фоллигон-}-сурфагон

Число животных 21 22 21 20 18 20

Число осу рций 193 245 221 248 187 204

Число овуляций на .1 донора 9,2 ±0,90 ■■1.1,1=Ь0,9.2 <10,5±0,86 12,4+1,21 10,3±!1,01 10,2+0,93

Есего вымыто эмбрионов 119 120 150 102 82 92

Число эмбрионов на 1 донора 5,6±0,Й8 5,4±!1,06 7Д±0,97 5,1±0,80 4,5 + 0,86 4,6+0,81

Число эмбрионов, пригодных для 74 87 74 81 62 72

трансплантации, ч/% 62,2 72,5 49,3 79,4 75,6 78,3

Число пригодных для трансплантации эмбрионов на 1 донора 3,4±0,76 3,9±0,79 3,6±0,68 4,0+0,79 3,4+0,60 3,7 ±0,82

Извлечено эмбрионов от числа овуляций, % 61,7 49,0 67,8 41,1 43,9 45,1

Оплодотворяемость яйцеклеток, % 80,6 84,(2 84,7 83,4 94,0 91,3

Таблица 4. Реакция яичников суперовуляцей в зависимости от уровня гормонов в крови перед гормональной обработкой

Реакция Груп- Число животных Прогесте- Эстрадиол, ЛГ,

яичников па рон, нг/мл 17ß, пг/мл нг/мл

10 и больше же >

тых тел I 23 4,9 ±0,32 1,6,1 ±1,77 4,5±1,02

4—9 желтых тел II 17 5,0±0,37 18,0±2Д8 1,7±0,64 3 и менее желтых

тел III 6 5,4 ±0,43 25,0+0,46 5,4+3,78

Концентрация прогестерона в крови перед гормональной обработкой у коров с хорошей и средней суперовуляторной реакцией была приблизительно одинаковая (4,9 и 5,0 нг/мл), у нереагировавших — более высокой и достигла в среднем 5,4 нг/мл.

У коров со слабой реакцией яичников в то время концентрация эстрадиола 17 ß была 25,0 пг/мл и с увеличением реакции яичников имела тенденцию уменьшаться.

Нами было установлено, что реакция яичников на гормональную обработку более связана с концентрацией гормонов в крови во время охоты. Из данных таблицы 5 видно, что наилучшая реакция суперовуляцией была у коров с низким уровнем прогестерона и наиболее высокими концентрациями эстрадиола и ЛГ. Замечено, что у коров, плохо реагировавших или совсем нереагировавших на гормональную обработку (группа III), был относительно высокий уровень ЛГ в крови.

Таблица 5. Реакция яичников суперовуляциен и уровень гормонов в крови во время охоты

Реакция яичников Группа Число животных Прогестерон, нг/мл Эстрадиол 17ß .(мах.), пг/мг ЛГ (мах), нг/мл

10 и больше жел-

тых тел I 15 0,9±0,24 50,4+7/27 47,7±7,04

4—9 желтых тел II 12 '1,1±0,47 40,1+5,85* 23,9±7,32*

3 и меньше желтых

тел III 7 1,7 + 0,84 27,6+8,48* 31,2+8,24**

* — Р<0,05, ** — Р<0,1.

При анализе данных о связи между величиной пика ЛГ и выходом пригодных для трансплантации эмбрионов установлено, что больше пригодных для трансплантации эмбрио-

нов вымыто у доноров II группы (повышение концентрации ЛГ в крови достигало 20—49 иг/мл) (табл. 6).

Таблица 0. Быход и качество эмбркопоп при различном урсзие ЛГ

во время охоты

Уровень ЛГ, нг/мл -(мах) Группа Число животных Число эмбрионов на .1 донора Число пригодных эмбрнонов на 1 донора

50 и больше I 5 6,4±2,42 4,2±2,24

49—20 II 14 7>0±<1,47 4,5±0,89

10 и меньше III 11 5,6±1,44* 2,9±0,48

* — Р<0,05.

У животных с более высоким пиком ЛГ в крови (50 и больше нг/мл) число пригодных для трансплантации эмбрионов уменьшалось. Оно уменьшалось и при более низком его пике (19 и меньше нг/мл).

Уровень гормонов в день вымывания эмбрионов (на 7—8 день полового цикла) был близким базальному и не зависел от использованного для обработки гормонального препарата. Отмечено повышение лишь уровня прогестерона в зависимости от числа желтых тел.

В опыте исследовалась динамика ЛГ во время охоты после обработки коров-доноров фолликулостимулируюгцими препаратами отдельно и в сочетании с сурфагоном.

У коров-доноров, обработанных ФСГ-П через 48 ч после введения эстрофана концентрация ЛГ была низкой по сравнению с таковой у коров, обработанных другими гонадот-ропинами, и в среднем достигала 6,7 нг/мл (Р<0,1). У животных, обработанных фоллитропином и фоллигоном, уровень ЛГ был значительно выше и в среднем составлял 15,4 ,(Р<0,1) и 24,6 нг/мл (Р<0,02) соответственно.

Результаты исследования образцов крови, взятой через более длинные интервалы (49, 50, 51, 52 ч), показывают, что у обработанных ФСГ-П животных значительного повышения концентрации ЛГ в крсзи не было. У коров-доноров, которым через 48 ч после введения эстрофана вводили сур-фагон, максимальное повышение концентрации ЛГ (до 23,6—24,3 нг/мл) фиксировано через 2—3 часа с момента его введения (график 1).

В крови коров-доноров, обработанных фоллитропином, замечена более пульсирующая выброска ЛГ (график 2). Максимальная волна ЛГ (32,3 нг/мл) была через 50 часов

нг/мл

Время после инъекции эстрофана (часы) График 1. - ФСГ-П

.---ФСГ-П в сочетании с сурфагоном

1.4

Ч

Время noce инъекции эстрофана (часы) График 2. -- фоллитропин

____ фоллитропин в сочетании с сурфагоном

после введения эстрофана. При введении сурфагона пик АГ отмечен также через 2 часа после его введения и достигал 32,3 нг/мл.

В группе доноров, которым суперовуляцию вызывали фоллигоном, самый высокий уровень ЛГ отмечен через 48 часов после введения эстрофана (24,6 нг/мл) и снижался неравномерно (график 3). Второе значительное повышение концентрации этого гормона в крови наблюдалось через '3 часа после введения сурфагона.

Бремя пос е инъекции эстрофана (часы)

Гргафик 3. - фоллигон

---фоллигон в сочетании с сурфагоном

Из полученных данных видно, что выброс АГ начинается в течение 1—2 часов после введения сурфагона и потом начинает постепенно уменьшаться. Повышенное количество ЛГ наблюдается около 2—3 часов.

3.3. Применение сурфагона для стимуляции роста фолликулов с целью вызывания суперовуляции

Исходя из того, что большие дозы сурфагона стимулируют выделение из гипофиза ФСГ, а небольшие — ЛГ, нами был проведен опыт на половозрелых телках с целью вызывания суперовуляции сурфагоном. Полученные результаты

показывают, что ни в одной группе суперовуляции не было, только в группе телок, которым вводили общей дозой 2400 мкг сурфагона, яичники были увеличены почти вдвое, твердоватой консистенции, их поверхность ровная. У телок других групп, которым вводили сурфагон общей дозой 400 ч 800 мкг, яичники не увеличились, только незначительно изменилась их форма.

Было установлено воздействие высокой дозы сурфагона ча выброс ЛГ (график 4). Через 2 часа после введения сур-

нг/мл

о 2 ч 6

Впемя после инъекции эстрофана (часы)

График 4.

—____100 мкг

__ . — . _— 75 мкг

--50 мкг

---25 мкг

фагона дозой 100 мкг уровень АГ в крови достигал в среднем 200,7 нг/мл (базальный уровень ЛГ перед введением сурфагона был 14,15 нг/мл). В дальнейшем уровень ЛГ в крови, взятой через 4 и 6 часов после введения сурфагона, уменьшился и составил 79,96 и 38,6 нг/мл соответственно. Через 12 часов тем же самим животным было введено 75 мкг сурфагона, но повышение уровня ЛГ в крови, взятой через 2 часа после введения сурфагона было незначительное и составляло 14,67 нг (базальный уровень— 13,6 нг). Также незначительной была разница между уровнем ЛГ в крови, взятой через 4 и 6 часов после введения сурфагона.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО МЕСТА И КРАТНОСТИ ВВЕДЕНИЯ СЕМЕНИ У КОРОВ-ДОНОРОВ ПРИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

Нашими опытами установлено, что оптимальным мес-•том введения семени можно считать тело матки. При введении семени в тело матки на глубину 1—1,5 см оплодот-воряемость яйцеклеток была на 7,3% выше, чем при введении в кранильную часть шейки матки. Также с коров, •осемененных в тело матки, получено на 15,4% больше качественных эмбрионов (табл. 7).

Таблица 7. Общий результат оплодотворяемости яйцеклеток в зависимости от места введения семени

Место введения семени

Показатель

тело матки

шейка матки

Число животных

Всего извлечено эмбрионов

В том числе:

19 112

23 1)74

нормальных, ч/% дегенерированных, ч/% пеоплодотворенных яйцеклеток, ч/%

70 62,5 36 32,1

6

5,4

82 47,1

70 40,2

22 12,6

Среднее число зародышей на донора Среднее число пригодных для трансплантации зародышей на донора

Вымыто эмбрионов от числа овуляций, % -Оплодотворяемость яйцеклеток, %

3,6 ±0,78

52,7 94,7

5,8±1,00

3,5±0,82

61.3

47.4

7,5±1,05

Неодновременная овуляция фолликулов при гормональной обработке коров-доноров требует многократного их осеменения. Проведенные нами опыты по осеменению коров-доноров показали, что оптимальным можно считать трехкратное осеменение в тело матки с 12-часовыми интервалами, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты. При этом оплодотворяемость яйцеклеток достигала 94,4%, и вымыто достаточно высокое число нормальных эмбрионов (67,3%) (табл. 8).

Таблица 8. Сравнительные результаты оплодотворяемости яйцеклеток при двухкратном и трехкратном осеменении

Показатель

Кратность введения семени

3-кратное с интервалами 12 ч (контрольная группа)

2-крат- 2-крат-

ное с ин- нос а ин-

терва- терва-

лом 12 ч лом 24 ч

(I опыт- ¡11 опыт-

ная ная

группа) группа)

2-кратное (сур-фагон! с интервалом 12 ч (III опытная группа)

Число животных Есего извлечено эмбрионов 3 том числе:

дегенерированиых, ч/р/о

неоплод отворенных яйцек леток, ч/%

10 9 10 И

52 60 57 70

35 35 28 57

07,3 50,3 49,1 81,4

14 22 20 Ю

26,9 36,7 35,1 14,3

3 3 8 3

5,8 5,0 14,0 4,3

нормальных, ч/°/о

Среднее чис.о зародышей на донора

Среднее число пригодных для трансплантации зародышей на донора

Вымыто эмбрионов от числа овуляций, %

Оплодотворяемость яйцеклеток, %

3,5+0,82 6,6+1,93 5,1+0,68' 6,3=1,27

3,5+0,83 3.8+1,43 2,53:0,62 5,1 + 1,02

46,4 94,3

60,0 95,0

47,3 06,0

50,0 95,7

Высокая оплодотворяемость (95,0%) получена и при двухкратном осеменении, но число пригодных для трансплантации эмбрионов было на 10% меньше, чем при трехкратном осеменении.

о. ПРИМЕНЕНИЕ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ДЛЯ СИНХРОНИЗАЦИИ ОХОТЫ У ТЕЛОК-РЕЦИПИЕНТОВ. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЭМБРИОНОВ

В опыте исследовали влияние синхронизации охоты простагландинами на результаты приживляемости пересаженных эмбрионов. Для синхронизации охоты телок-реципиентов использованы простагландины эстрофан (СПОФА, ЧССР) и анипрост («Витамины», СССР).

Установлено, что нет существенной разницы между уровнем стельности у телок-реципиентов со спонтанной и синхронизированной простагландинами охотой. Стельность реципиентов со спонтанной охотой составила 51,9%, синхронизированных эстрофаном — 53,3 и анипростом — 53,3%.

Не выявлено существенной разницы и между прижив-ляемостью эмбрионов у телок-реципиентов с хорошим и среднеразвитым желтым телом (58,6 и 56,9%). Значительно ниже (31,57о) стельность была у телок с плохо развитым желтым телом.

При исследовании крови у телок-реципиентов (на 7 день полового цикла) достоверной связи между уровнем прогрес-терона и приживляемостью эмбрионов не обнаружено (табл. 9). В крови стельных телок в это время количество прогестерона составило 4,2 нг/мл, а у нестельных — 3,9 нг/мл.

Таблица 9. Уровень гормонов в крови у телок-реципиентов на 7 день полового цикла

Показатель

Число животных

Прогестерон, нг/мл

Эстрадно1 пг/мл

Стельные 23 • 4,2+0,30 14,1,±2,74

Нестельные 15 3.9±0,34 1'1,3±2,23

Также не обнаружено значительной разницы в уровне прогестерона в крови телок с хорошо и средневыраженным желтым телом (4,0 и 3,9 нг/мл) (Р<0,1).

Установлена зависимость приживляемости эмбрионов от стадии их развития. При пересадке реципиентам поздних морул и ранних бластоцист приживляемость составила 66,7 и 64,7%. Пересаженные эмбрионы более ранней или более поздней стадии приживлялись хуже, особенно ранние мо-рулы (45,5%) и поздние бластоцисты (43,5%) (табл. 10).

Таблица 10 Приживляемость эмбрнонов в зависимости от стадии их развития

Стадия развития эмбрионов

Показатель

М/ Ып Мш Бл/ Б л// Б Л/;/

Число животных 11 35 15 17 51 23

Из них стельных 5 19 10 11 30 10

Стельность, % 45,5 54,3 66,7 64,7 58,8 43,5

Получены данные о прнживляемости пересаженных эмбрионов в зависимости от их качества (табл. 11). Для опыта

Таблица И1. Приживляемость эмбрионов в зависимости от их качества

Качество эмбрионов

Показатель отличное хорошее среднее

1 4+ 3 + 2 +

Чис (о животных 25 40 28

Из них стельные 16 25 15

Стельность, % 64,0 62,5 63,6

использованы эмбрионы отличного, хорошего и среднего качества. Наилучший результат получен при пересадке эмбрионов отличного качества и составил 64,0% прнживляемости. Почти такой же процент приживляемости получен и при пересадке эмбрионов хорошего качества (62,5%).

Была изучена приживляемость двух эмбрионов одинакового и различного качества, пересаженных в один рог матки. Наилучшая приживляемость эмбрионов — 63,2% была у телок, которым пересажены эмбрионы хорошего качества (табл. 12). У животных II и III группы приживляемость эмб-

Та блица 12. Приживляемость эмбрионов различного качества, пересаженных по два в один рог матки

Показатель 2 эмбриона хорошего качества (I группа) Эмбрион хорошего качества и условно пригодный (II группа) Эмбрион хорошего качества и дегенериро-ванный (III группа)

Число животных 19 23 20

Число стельных 12 12 10

Стельность, % 63,2 52,2 50,0

Из них родилось двоен 2 3 1

% двойневости 23,0 25,0 10.0

Абортировало 1 — —

% абортов от стельных 8,3 — —

рионов была меньше и достигала 52,2 и 50,0% соответственно.

6. ВЫВОДЫ

1. Фоллитропин по фолликулостимулирующему действию и выходу пригодных для трансплантации эмбрионов не уступает зарубежным препаратам ФСГ-П (США) и фоллигону (Голландия).

2. Включение в общую схему гормональной обработки сурфагона в дозе 25 мкг через 48 ч после введения проста-гландина дает возможность увеличить число эмбрионов с одинаковой стадией развития: в сочетании с ФСГ-П — на 4,1%, с фоллитропином — на 6,6% и с фоллигоном — на 28,4%. Препарат сурфагон увеличивает выход нормальных эмбрионов при его применении с ФСГ-П на 10,3%, с фоллитропином— на 30,1% и с фоллигоном — на 2,7%.

3. Введение сурфагона в дозах 2400, 800, 500, 400 мкг половозрелым телкам по 4-дневной схеме (аналогично ФСГ) не вызывает роста фолликулов в яичниках.

4. Введение сурфагона в дозе 25 мкг через 48 ч после введения эстрофана продлевает натуральную предовуля-торную волну ЛГ на 1—2 часа.

5. Выход нормальных эмбрионов выше у коров-доноров, предовуляторный пик ЛГ в крови которых во время охоты был в пределах от 20 до 50 нг/мл. При наличии слишком высокого или низкого уровня ЛГ выход качественных эмбрионов уменьшается.

6. Уровень прогестерона на 9—11 день полового цикла в крови коров-доноров с хорошей, средней и плохой супе-ровуляторной реакцией яичников существенно не различался. Уровень прогестерона в крови животного перед гормональной обработкой может служить только дополнительным критерием для отбора коров-доноров.

7. Осеменение коров-доноров трехкратно в тело матки с интервалами 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты, обеспечивает высокий процент (94,3%) опло-

• дотворяемости и выхода качественных эмбрионов (70,2%).

При использовании сурфагона в начале охоты достаточно осеменять двухкратно с интервалом 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты.

8. Нет существенной разницы между уровнем стельности у телок-реципиентов со спонтанной и синхронизированной простагландинами охотой.

9. Проетагландин анипрост не уступает зарубежному аналогу ПГФга — эстрофану (ЧССР) по лютеолитическому действию и по эффективности синхронизации охот у телок-реципиентов и не оказывает отрицательного влияния на приживляемость эмбрионов.

7. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для повышения выхода нормальных зародышей и синхронизации овуляции у коров-доноров следует в начале охоты (через 48 ч после введения простагландина) применять сурфагон в дозе 25 мкг.

2. Коров-доноров следует осеменять трижды в тело матки с интервалами 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты. При использовании сурфагона коров-доноров осеменить двухкратно в тело матки через те же интервалы.

3. Для синхронизации охоты у коров-доноров и телок-реципиентов следует применять анипрост в дозе 500 мкг.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ:

1. Эффективное использование эмбрионов среднего качества и усовершенствование морфологического метода их оценют//Тезисы докладов симпозиума «Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота».— Тарту, 1986 —С. 22 (в соавт.).

2. Экспериментальное обоснование применения в животноводстве упрощенного способа разделения эмбрионов//Тезисы док. Ьдов Всесоюзной научно-технической конференции по применению биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине.— М., 1988.— С. 6 (в соавт.).

3. Применение метода клеточной хирургии в практике//Тезисы докладов Республиканской конференции «Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литве».— Вильнюс, 1989.— С. 41 (в соавт.).

4. Осеменение коров-доноров при трансплантации эмбрионов//Тезисы докладов Республиканской конференции «Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литье». —Вильнюс, 1989. — С. 51—52 (в соавт.).

5. Применение Гн-РГ для синхронизации овуляции у коров-доноров// Тезисы докладов конференции «Вкад молодых ученых и специалистов при интенсификации животноводства в республике».— Еайсогала,— 1988.— С. 23.

6. Разработка программы для ЭВМ по селекции коров-доноров и тран» сплантации эмбрионов//Тезисы докладов конференции «Научно-исследовательская работа молодых ученых в животноводстве».— Еайсогала,— 1989.— 12—14 с.