Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование метода пультивирования и самодостаточности ооцитов коров in vitro в различных культуральных системах

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование метода пультивирования и самодостаточности ооцитов коров in vitro в различных культуральных системах"

• ¿йз\ххчмский да^ ¿xjoфателыжпе ут

ЖИЮТНЭВОЖГГЕА

Нз лравах рукописи

Еашеков Фарад Рзфаэлбглч

У008£РШ!СГВ08АНКВ !5ГГОЯ\ ЮНЪТИБЙРОаАКШ П СПГО-:.ОТЕС?1лГ:Л

оощтш короз ni vitra в рдз£НЧ1шх кул>турлаак свгеш: Специальность 03.00.13 - Физиоло г »-я человека" # лиьотвих

АЕГОЯШРАТ диссертации на соясканк- ученой 'степеня кандидата биологических наук

п. Дубровицы, псковская область 1902

Работа выполнена в Центре трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Нзучшз | ущ

академик РАСХН Л К. ЗРЕСТ

доктор биологических наук, профессор Ей. СЕРГЕЕВ

О^дадьша оллонентъс

доктор биологических наук, профессор К. Я. ЕШХ08

кандидат биологических наук, Н.Г. клвдю

Ведуеэе учеррззденке: ТСХА, г. Мэсква

Защита.диссертации состоится в часов на . заседании Специализированного совета

Д. 020.16.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская область. Подольский район, пос. Дубровицы, ВИЖ.

С диссертацией ыожно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

"У" 199ЙГ.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биоя. наук

И.Н. ©един

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тсии. Развитие трансплантации как биотехнологи-эского метола позволило более эффективно использовать репродук-квный потенциал высокопродуктивных тавотных, резко увеличить ко-£фициент размножения высококлассных особей. •

Однако разработанные методы гормональной стимуляции женских :обей в настоящее время не позволяют в полной мере' использовать этенциальный воспроизводительна йонд, заложенный в яичниках. В ичниках коровы атрезии подвергается около 707. премордиальных элликулов и от 10 до 41X преполостных (Эрнст Л К , 1983). При гом индуцирование высокой степени множественной рвуляшш отрица-эльно сказывается на выходе нормальных эмбрионов. „;-;Вцсокая вариа-гльность и непредсказуемость реакции яичников на гонадотропин. эявление отрицательных факторов после применения гормональных эегаратоз на воспроизводительную способность делает известные этоды весьма ненадежными (Сергеев НИ. , 1986).

Непосредственную роль в ■решении данного вопроса отводят сле-лализации по in vitro созреванию и in vjtro'оплодотворению ооци-эв, которая в большей степени могла бы удовлетворить потребности ж в производстве эмбрионов на определенных стадиях развития, жив развитии приоритетных направлений в биотехнологии. Однако {фэктивность змбриопроиэводства in vitro в настоящее время эставляет около 10% живого потомства, что явно ниже, чем в усло-гах in vivo (First и Parrish, 1987).

Цель я задачи исследований. Дель наших исследований заклю-алась в усовершенствовании и разработке метода культивирования-л тлодотворения оошггов коров in vitro в различных культуральных гетемах.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние температурь транспортной среды ка созревание ооцитов к их дальнейшее развитие после оплодотворения.

2. Изучить эффективность использования различит культураль-

о

аых сред при созревания ооцитов и культивирован™ ранних эк!брио-нов.

3. Определить оптимальные условия полготовки ооцитов к оплодотворению.

4. Изучить влияние спермы различных быков на оплодотворение ооцитов in vitro.

5. Выявить влияние различных культуральных систем на дальнейшее развитие ранних эмбрионов.

Научная новизна иссхгдоштий. Определены оптимальные критерии культивирования и оплодотворения ооцитов коров in vitro. Изучено влияние спермы различных быков на оплодотворение ооцитов in vitro. Шяснено влияние различных монослоев соматических клеток репродуктивного тракта на дальнейшее развитие полученных эмбрионов. Усовершенствован метод культивирования и оплодотворения ооцитов коров вне организма. Жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов, полученных методом in vitro, подтверждена продолжением их развития после пересадки реципиентам.

Практическое звачеииэ работы заключается в усовершенствовании метода созревания изолированных ооцитов in vitro, экстракорпорального оплодотворения и дальнейиего культивирования ранних эмбрионов в различных культуральных системах. Использование разработанных условий транспортировки яичников, созревания ооцитов коров, капацитации сперматозоидов и тестирование сперш быков на on-здотворящую способность in" vitro позволит значительно по-выход нормальных эмбрионов, необходимых как для трансплантации, так и для других направлений в биотехнологии.

Апробация работы. Результаты, представленные в работе были элокены ка научно-методической конференции "Профессиональная здготовка национальных кадров в МВД для аарубетых стран" (Моск-1. 1990), на III Республиканской научно-практической конференции злодых ученых и специалистов (Алма-Ата, 1991). на II! иежоегио-щьной научно-практической конференции молодых ученых и специа-:стов (Бишкек, 1992). на научно-методических конференциях Центра ;анспланташи эмбрионов с.-х. у.-.-с-ткьк (1989-1991).

Структура Д1ксертации. Диссертационная работа состоят из ¡едения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 'Зудьтатов собственных исследований, обсуждения, выводов и пред->жений. Диссертация изложена на 124 страницах а машинописного кета, включает 14 рисунков и 9 таблиц. Список использованной ггературы состоит из 276 источников, в тем числе 250 иностоан-х.

а. ¡1АГЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВА1ШЯ. Яичники, для получения ооцитов, доставлялись с Подольского спериментального мясокомбината. Транспортировали яичники в ла-раторию в термосе, при температуре физиологического раствора 37° или 4°С, в зависимости от условий эксперимента. Брега от момен-вэягия яичников на мясокомбинате до постановки ооцитов на соз-вание составляло 2-2,5 часа

Яичники неоднократно промывали в физиологическом растворе и «шали в ламинарный бокс (Babcoc). Затем с помогаю 5 мл шприца äimann) и иглы 18G (Erosa) с поверхности яичника аспирировали шжулы с диаметром 2-8 мм. Поиск ооиитов осуществляли при мал увеличении (х15) под стереомикроскопом (Nikon).

Для созревания ооцитов использовали среду МРМ с 20% эстраль-i сыворотки (инактивированной 30 мин, при 56°С) и добавление!'

10 ыкг/мл ФСГ i USD A, Beltsvi lie Acrrikultural Research Center, USA), иди шдакицмроьак*;ую среду Kfeaezo-B (ШШ с аналогичными добавками. pH средь; находилась в пределах 7,3-7.4.

о

Согревание ^социтоа происходило в СО-,-инкубаторе (Heraeus) с 5% С0£е воздухе и максимальной влажности. Температура созревания ооцжгое бала 39VC. время созревания - 24 часа Приготовление сред, а также все манипуляции, связанные с получением ооцитов и их постановкой на созреванье, происходили в максимально стерильных условиях.

Репродуктивные органы (яичники, яйцеводы, рога матки) для получения клеток доставлялись в лаборатории при температуре 4°С в среде DMEM с добавлением антибиотиков м аятимикотиков.

В эксперименте использовали органы от животных с ясным ова-риадьным циклом, без патологических изменений, на стадии фолликулярного роста. Для получения клеток гранулезы, фолликулы с диаметром 3-8 ш препарировались" под 'стереомикроскопом (Mil&n) в ла-лашарном боксе. Полученные клетки гранулезы.трипсиниэировадись раствором Трипсин/EDTA и затем центрифугировали при 485 G, 10 минут.

Посев клеточного седимента осуществлялся в 500 мкл среды DnEM + 20% фетальной сыворотки (Sigma), в'культуральных чашках (Nunc). Еассак помешали в С0г-инкубатор на три дня, при температуре 39°С, 5%. С(\и максимальной влажности. При получении монослоя клеток гранулезы, клетки обрабатывали Mitomycin С (Sigma) с концентрацией 10 мкг/мл.

Для получения монослоя кумулвсных клеток (по U. Berg и а Brem, 1989), использовали'кумулюсные клетки прикрепившиеся ко чашки, после сокультивироьания гамет.

Для получения монсслоя эпителиальных клеток яйцевода в лабо-

ратории яйцевод препарировали и промчали 20 ш FBS без Ca++/>,fe-t + раствором. Затем пропускали 2-2 мл раствора Трипсин/EDIA. Преды-инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Яйшеод промывали 10 мл среды DKEM+207. фетальной сыворотки ( Si гпн) в центрифужную пробирку (Nunc), центрифугировали 10 ыияут при 4B5G,' Осадок ресуспендировали и производили посев клеточкой культура. Культивировали при 39°С, 5% СОгв воздухе и-максимальной влажности. При достижении монослоя процедура :>:£отки 'клеток Mitomycin С и замена среды на эстральной сыворотки, была аналогична процедуре, как и в случае с клетками гранулезы.

При получении клеток маточного эндодермия, рог матки промывали PES без Ca++/Mg++, затем грипсинизировалц '4-5 мл раствора

^ * i) ; ЧОР»

TpimcKH/EDTA. Спустя 10 минут, рог матки обмывали 8-10 раз по 2 мл DMEM+207. фатальной сыворотки в центрифужную пробирку и центрифугировал:! 5 кинут при 485G. Осадок ресуспеядировали 5 мл DMEM+20Z фетальной сыворотки и производили, посев клеток. Режим и система инкубации были аналогичными, как и в случае с эпителиальными клетками яйцевода. Обработка Mitomycin-С. описывалась выше.

Для экспериментов по оплодотворению in vitro использовалась исключительно, гдубокозамороженная сперма, голяггйнофризской и немецкой черно-пестрой пород/, от быков класса элита рекорд. Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по"методикам, описанными Parrish и др. (1986). и Greve. и др. (1985).

. Оплодотворение ооцитов in vitro проводили в микрокапле среды Fert-TALP под минеральным маслом, в инкубаторе при 39°С, 57. СС^и максимальной влажности. Время со-культивирования гамет составляло 18-20 часов. *

Оплодотворенные оогдиты культивировали в 400 мкл среды МРМ + 207. эстральной сыворотки или МММ + 20Z эстральной сыворотки, в 00г

- «дакуозторе, при температуре 39°С, 57. СОги максимальной ьдаж-время культивирования составляло 7-8 суток. При со-культи-ьимвании с монослойными культурами соматических клеток репродуктивного тракта, оплодотворенные ооциты по 20-35 на ячейку переносили на подготовленный монослой клеток и культивировали при тех >.е условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ КССЛЕДОЗАИШ 3.1. ihtcnajicua кумулзешх iuiqto:; п зависимости от шрфоисогнческой оцэ;ки1 ооцзггов лра поетадагке i.a созрэваике.

Раэрыь коммуникационной системы внутри фолликула, освооозда--•: . :ш1Г-кумулюсный комплекс от влияния мейозшгибируших факто-. На этой основе наступает реинициация мейоза. При этом -кспаксия кумулюсных клеток является результатом прекращения действия факторов поддерживающих мейотический покой.

Таким образом, цитоморфэдогическая оценка окружающего куму-л»са и ооплаамы самого ооцита 'отвечают селекционным критериям /спешного мейстического созревания.ооцита in vitro (табл.1).

После 24 часового культивирования in vitro, в данной серии опытов наш проводилась оценка созревания in vitro ооцитов по лролиферативной активности кумулюсных клеток.- За основу бьша взята степень экспансии окружающего ооцит кумулюса Отличную экспансию кумулюсных клеток обозначали - "+++", среднюю - "++", удовлетворительную - 'Ч-". При этом отмечали, также ооциты с неп-ролиферируюпмми кумудюсныш клетками ("-") и "перезревшие " ооциты, у которых наблюдался лизис кумулюса в конденсированные участ-округлой формы.

I-лши наблюдения показать • что наивысшую степень реинициация -..■¡•■.за, по кумулюсной экспансии (84,7%), показали ооциты в группе

Таолина 1.

Результаты согревания в зависимости от качества ооштов

Качество Кол-во Экспансия кумулисних клеток

ооцитов оошт._;_'__

п . Всего -М-+ +-+• - Перезрело

п-л . п-7. n-Z . п--% . .• п-% п-Х

14-8,0 7-3,9 20-11,4 33-27,7 22-18,5 23-39,3 32-14.1 100-43, е 72-31,6

* J ,

р<0,001 р<0,001 р<0,05 р<0; 001 р<0,001 "хорошие". В группе "средние" 74 ооцита (62,17.) имели различную степень экспансии кумулюсньК клеток, а в группе "плохие" лишь 24,5%, что достоверно (р<0,001) ниже, чем в вышеназванных группах.

По различной степени экспансии кумулюсных клеток, как видно из таблицы 1, между всеми тремя опытными группами также наблюдались высоко достоверные различия. Так, кумулюсную-экспансию оие-. ненную как "отличная" (+++)' в группе "хорошие" имели 61,92 ооцитов, в группах-"средние" и "плохие" 25,21 и 2,6X, соответственно. По другим уровням ■пролиферативной активности кумулюсных клеток ("+-+"' и "+") между опытными группами были также установлены выео-кодостоверные различия в степени реинициации мейоза.

Таким.образом,. наблюдения, показали, что цитоморфологическая оценка ооцит-кумулюсного комплекса перед постановкой на созревание in vitro обуславливает степень реинициации мейоза у ооцитов.

Хорошие 176 149-84,7 109-61,9 26-14,8 Средние 119 74-62,1 30-25,2 " 11-9.2 Плохие 228 56-24,5 6-2.6 18-7,9

Установлено, что только .ссштк с незкспанцировакным. многослойный

»

кумулюсом и темной мелкозернистой ооплагмой способны обеспечить более 801 созревания in vitro.

3.2. Результат согревашш ооцагов в аавксюязсти от те»«юрзтуры транспортной среды Интервал времени между убоем животного я эффективной постановкой ооцитов на созревание in vitro не имеет большого влияния ' на степень созревания ядра, однако в дальнейшем более короткий интервал полокительно влияет на результаты оплодотворения и, соответственно,.на способность оплодотворенных ооцитов к дальней-

о

шему развитию in vitro.

В результате ряда экспериментов, нами было установлено влияние температуры транспортной среды на степень экспансии куму-люсных клеток В таблице 2,. представлены данные характеризующие степень реинициации мейоза в . зависимости от температуры транспортной среды. ' ■ а

' • /;.' ~ Таблица 2.

Результаты влияния тепературы транспортной среды на созревание in vitro

Темпер. Кол-во , ' .Экспансия кумулюсных клеток

среда ■ ооцитов _._^__-'

п "Всего '+++ . ++ + - ' Перезрело

(°С) -, ■ rt-Z ,n-Z , n-Z n-Z n-% n-%

4 137 101-73,'7 60-43,8 20-14,6 21-15,3 13-9,8 22-16,8

37 .176 149-84,7 109-61..9 26-14,7 14-7.9 7-3,9 20-11,4

p<0,05 p<0,05

Как видно из таблицы 2. наивысшая степень (84,7%) экспансии кумулюсных клеток наблюдалась в опытной группе яичники которой транспортировались при температуре 37*0. В группе-4еС, экспансия кумулюсных клеток составила 73,71, что на 111 меньше (р<0,05), чем в группе-37вС.

Аналогичные результаты были получены нами и при дифференцированном рассмотрении степени экспансии кумулюса между' двумя опытными группами. Так, колггь ^гво ооцитов имевших "отличную" (+++) экспансию кумулюса в группе-37вС было на 18,1% больше, чем в груоте-4°С. Таким образом, в результате транспортировки яичников при 4°С 43,81 ооцитов имели пролиферацию кумулюсных клеток, оцененную как "отличная",, что достоверно ниже Д Р<р,05), чем в

группе-37°С. , . j"

■1 ' . • э •

Исходя из этого, , нами сделан вывод, что температура

транспортировки оказывает достоверное влияние (р<0,05) на проли-феративную активность кумулюсных клеток, что. в свою очередь сказывается на степени ре инициации мейоза. '

S. 3. Влиянкэ различных культуралыгис сред на результаты созревания оадагоз в степень дробления м развития . ранних эмбрмошв коров. В настоящее время" известно, что. в ,значительной мере степень реинициации мейоза и степень развития ранних эмбрионов.зависит от правильности подбора • питательной среды.. Однако неадекватность условий инициации, мейоза in:vitro, ..в сравнении с in vivo в конеч-4 нем итоге приводит, к частичной дегенерации и (или) неполноценному завершению ядерного^ и цйтоплазматического созревания, ооцита. < ,

В наших экспериментах- при оптимизации системы' культивирова-. ния in vitro использовались шдифицированная среда Паркера (ЫРМ) и модифицированная среда Менезо (ШУ).

Кроме этого, следует отметить, что среда МММ использовалась не только в качестве среды созревания и среды для дальнейшего развития, но и в.качестве среды для капацитации сперматозоидов. Тем самым при использовании" среды ЫШ отпадала необходимость приготовление специальной- среды для капацитации - Sperm-TALP, что сокращало количество Необходимых сред для проведения экспериментов по in vitro культивированию .'и оплодотворению ооцитов-коров.

Данные, представленные в таблице 3, характеризуют в динамике созревание, оплодотворение и развитие ранних эмбрионов от числа ооцитов поставленных на созревание.

Таким образом,, анализ полученных результатов показал, что при использовании среды МРМ 149 ооцитов из 176 (84.7Z) имели «»экспансию, кумулюсных клеток, • а при созревании в среде МММ -132/158. (83,6Х) смогли реиницировать мейоа. При этом не было "'.;''..■'•■ "„ • ,.. .'Таблица а

-".'••• \ / „ Влияние различных, культуральвых сред о '. на созревание ооцитов .п..их дальнейшее развитие

Используемая .'Созрело Оплодотв..' Степень дробления и развития (2)

среда .' . ооцитов' ооцитов __■ ■■

- ' за 165-172 часа

. n-Z ■ п-% . Дегеяер. 2-16 кл. Морула

14.7

12.8

ЬРМ+201 зстр, 149-84.V .104-59,1 30.7 54,6

сыворотки . • ■

МММ+20Х зстр. 132-83,6 91-57,6 ' 30,3 , 56,9

сыворотки ' ' ■

хжаружено лостоверных различий в степени пролифератявной актив-юсти кумулюса и, следовательно, в степени созревания ооцитов ледду представленными опытными группами.

Число оплодотворенных ооцитов в опытной группе созревших в :реде МРМ составило 59,17. (104) от числа ооцитов поставленных на юзревание. Во второй опытной группе, созревших в среде МММ, уро-¡ень оплодотворения ооцитов составил 57,62.

При исследовании степени дробления и развития ранних змбрио-юв за 165-172 часа культивирования нами было получено 14,72 мо->ул при использовании среды МРУ и 12,82 морул при культивировании 1 среде МШ. По степени дегенерации оплодотворенных ооцитов за ¡ремя культивирования мы .не обнаружили раглтлй между опытными ■руппами.

« • -

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют сде-;ать вывод, что в качестве питательной среды для созревания ооци-ов коров юкт быть использована как среда. МРМ, так и МММ. : При апацитации сперматозоидов методе« "swim up", среда Sperm-TALP южет быть успешно, заменена та среду МММ, так.как по степени лол-оцеяного оплодотворения не было обнаружено достоверных различий ¡еаду опытными группами. ■

3. 4. Влияние старш различных быков на результаты дробления и развития ранних эмбрионов.

В наших экспериментах,мы исследовали влияние спермы отдель-ых. быков и смешанной спермы на результаты дробления. и степень азвития ранних' эмбрионов, оплодотворенных in vitro. При этом спользовалась глубокозаморожвнная сперма отЮ различных быков олштинской и немецкой черно-пестрой пород.

Анализ данных таблицы 4 показал, что при использовании спер-

ш быка Монитор оплодотворяемость ооцитов составила 55,71, что достоверно Ср<0,01) выше на 7,81 чем при оплодотворении спермой быка Рид (47,9%) и на 7,5% выше (р<0,01), чем Сэр (48,2%). При оплодотворении спермой бык^ Персуадер было получено 62,7% оплодотворенных оодагов, что достоверно выше (р<0,01), чем при использовании спермы быка Сэр. Аналогичные результаты получены при сравнении быков Каистар и Сэр - 53,82 и 48,2% соответственно-.

" Таблица 4.

Влияние спермы различных быкоз на степень дробления и развития ранних.эмбрионов

. Кличка Кол-во Степень дробления и развития (%)

быка ооцитов - •_____-___

' . за.44-48 часов за 160-172 часа

. п 2-клет. 4-кдет. 8-клет. Дегенер. 2-16 кх йэрула

Каистар ; 146 ' 16,9 21,-?: . V " ■ • • 46,2 53,8 -

Мзнитор Г 120 . 18,1 22,3. 3,8 ' 9,5

Таррагон 131 22,7" 22,9 . 2,3 49,5 43,3 7,2.

Шрсуадер 174 19,1 , 23,1' ,'.4,1 47,3 43,2 9,5

Родкер • 168 26,5 22,0 .4,7 . 48,7 41,2 10,1

Сэр '/ 170 21,1 1,2 51,8. 48,2

Рид 159/ >5,2, .22,1 1,3 52,1 . 47,9 :. -

Скиф 171 . 22,3 21,9 2,7 * 51,4 .41,2 7,4

Сантал 169 -.26,1. ' 21,2 , 50,6 ; 38,9 10,5

Лель' 159 ■ 18,9 . 15,1 2,3 ..51,0 ' 42,7 6,3

Монитор/

Таррагон 176 17,3 28,3 14,8 30,9 53,0 16,1

р<0,05 р<0,001 р<0,01

При использовании смешанной спермы (¡¿онитор'Таррагон) нами 1ЫЛ0 установлено достоверное (р<0,05) повыгнние степени оллолот-оряемости ооциюв, по сравнению с индивидуальна использованием перш быков. Олходотворяеиость ооцитов при использовании сметаной спермы составила 69,IX, что на 21.2/1 ешк, чем при использо-ании спермы быка Рид и на 20,9% выпю чем при использовании спер-ы быка Сэр (р<0,05).

В результате проведенных .'•.'^лс-доЕа.чий по определения всал-ссвязи между оплодотворяюаей способностью in vitro и sn vivo, ами не установлено коррелятивной связи между оцекиваемьп.ш приз-аками (г=+0,353). При сравнении результатов оллодотворяеиостп in ivo у. развитием ранних эмбрионов до стадии коруха jí¡ vitro таклг г было обнаружено тесной коррелятивной сеязк (г»+Э,246).

Jarana образом, на»,от установлено, что при сялодстворгкии сортов m vitro судэствуот различия, которы-э в значительной степе-i обусловлены индивидуальными особенностями спермы бьков, ^пользование смешанной сперш повшает степень сплодотгоргмкя по равнению с индивидуальным 'использованием сперта данных быков. >-видимому, это происходит за счет .конкурентного преобладания жруг ооцита. Отсутствует тесная коррелятивная связь меяду опло-¡творяемостью in vitro и in vivo, а тага® между оплодотворяе->стьв in vivo и выходом моруд после in vatro оплодотворения и мотивирования.

3.5. Низзшэ подготовки осцстоз ¡ra к; оплодотсоренш in vitro Нумулюсные клетки необходимы при процедуре оплодотворения, к как они не только оказывает гемотактическое притях-ение на ерши но и повышают их калацитанионную активность. Однако боль-

шая кумуjux:ная масса клеток препятствует контакту сперматозоидов

♦

с яйцеклеткой, что в свою очередь отрицательно сказывается на оплодотворении.

Б результате экспериментов (табл. б) нами установлено, что обработка созревших ооцитов раствором трипсин/ЕДТА достоверно Елияет на результаты оплодотворения. В группе ооцитов, у которых перед оплодотворением был полностью удален кумулюс (трипсин/ЕДТА) степень оплодотворения составила 82,8%, что достоверно выше (р<0.001) на 21,7%, чем в I группе и на 26,5%, чем во II группе.

Таблица 6.

о

Влияние подготовки ооцитов на оплодотворение in vitro

уСпособ обработки

Кол-во

ооцитов _

п • Всего п-%

Оплодотворено

Полиспермно п-2

•I группа . 67 . 41-61,1

не обработанные

II группа 66 • 37-56,3 частично денуди • '

рованные

(гилауронидаза) .

III группа - ■ 70 . 58-82,8 полностью

денудированные (трипсин/ЕДТА)

1-2,4

3-8,1

11-18,5

р<0,001

р<0,001

jjeayt т tut i,. чтс л pi; e:глеатк- „еппт:л-UJIA лосторорко : р*0.0Э1 < у^личишотол стс-пет ссиктоь, :"..■:■'■,:.!'"-üí-i-'a пслиспе;змно. Так. с гту/ппе Mi nnjacifc-v-ie:;« лотгсг-.-ниг щгтгушлс- IB.51. чт" и-i '.v. í» илк-. ч-м ье- ;! групп-: ч ;г-1 л;;1:-, чем 1 групп-.

ссг.алом, на>'>! устанем.-'.;;*;. ате- \:у: у.л--

еплел_теорен;;-м iü vitro сша полнеет! ю лгнулирсг-анаа гсулл.: :il; . !P.*r."í! ЛОСТСЬ-РКС. WJíOKyk. . »¡П. ОПЛОДОТВОРЕНИЙ RC сраык>-¡w ;-ош!Таш J и 3J групп. Однако. анализируя полученные- ля;;-;;не. vosho сослать еш-од, что при хй-нуяи&о-ании ooííütop ¡1; rpvn-.JH t-aiiotcu 7Г-ип01ш/КЛТЛ разругали«. не только кумулкенкс клет-¡-с, такее -.теть зоны пеллшияа. В связи с этик, отсутствовала :к- -гхил олзка с.онн пелхшкда и тем саным возрастала степень осии-

sy

->■;:, еплолот-'оренньпг пол'.:оп?р»аю. У ооцитов ¡1 группы сстьвтаяся •: . ^ кл"тск не ен'зУала достаточного ьл/.якил на ре-

зультаты оплодотворения, а поскольку зона пеллшида не была пов-рйдш-гка. тс степень оплодотворения оошггов И группы была также как и у I тугаш достоверна (р<0,001) ниже, чем в III группе. Различия ненцу 1 и ]1 группами в полислермном'оплодотворении можно объяснить тем, что сперматозоидам при пенетрации ооцитов I группы, в отличии от II группы, требовалось больше времени при прохожпешм через кумулюс для достижения оопита. В связи с этим ¡'.пелось достаточно времени для развития реакции гоны пеллюцида 3.6. Результат» дройлешгя н развития ранних

э^йрчокоз в зажскиоста от ь»р?олоп"!ес!г.с;з ог.онги ооцясов

Целью данных экспериментов было определение зависимости результатов дпооления и развития ранних эмбрионов от морфологической оценки ооцитов при постановке на созревание. В результат

проведенных экспериментов нами было установлено, что развитие»

ранних эмбрионов зависит от исходного качества ооцитов. Е группе "хорошие" стадии 8-ш клеток за 44-48 часов культивирования достигло 13% эмбрионов, в группе "средние" было обнаружено достоверно (р<0,05) менызе эмбрионов на этой стадии развития'и составило 5,0%. В группе "плохие", при культивировании in vitro 44-48 часов мы не наблюдали эмбрионов на 8-ми клеточной стадии развития (табл.7). Учитывая этот факт, мы пришли к выводу, что жизнеспособный потенциал оцениваемых оодатов оказывает определенное влияние на скорость дробления ранних эмбрионов коров.

Таблица 7.

Степень дробления и развития ранних эмбрионов в зависимости от качества ооцитов

Качество Кол-во Степень дробления и развития (%)

ооцитов' ооцитов ____0_

за 44-48 часов за 165-172 часа

п ■ '2-клет. 4-клет. 8-клет. Дегенер. 2-16 кл.' Шрула

хорошие 176 19,9 25,5 13,0 30,7 54,6. 14,7

средние 119 '16,8' 19,3 5,0** .41',7*** '45,1 7,8** плохие 228 28,0 12,3 - 48,2* 51,4 .0,4*

*р<0,001 **р<0,05 ***р<0,01 При культивировании in vitro мы обнаружили также достоверные различия в степени дегенерации. Так, з группе "хорошие" дегенерировало. 30,71 эмбрионов, что достоверно меньше, чем в группе "средние". - - ■ 41,7% (р<0,01) 'и чем в группе "плохие" - 48,2% i р<0,001).

Количество ранних эмбрионов, развившихся до стадии моруда, в группе "хорошие" составило 14,77., что на 77. больше (р<0.05), чем s группе "средние" и на 14,3% больше (р<0,001), чем в группе •плохие".

Таким образом, нами установлено, что цитоморфологическая щенка оошггов при постановке на согревание in vitro' определяет ie только степень рзинициации мейоза, . но и зффестивность культи-¡ироЕачия ранних эмбрионов, кот:-;'уд мояно .определить по 'интенсив-юсти дробления га 44-48 часов, при последу/лгем культивировании 165-172 часа) до стадии морула эта зависимость увеличивается.

3.7. Влияшгэ теклератури транспортной среды ка результаты дроблеюа и развития, ранних atJSpisoHon В предварительных экспериментах нами изучалось влияние тем-еритур1' транспортной среды на созревание ооцитов in vitro. Были становлены достоверные (р<0,05) различия в степени реинициации ейоза в зависимости от температуры транспортировки. После in itro оплодотворения созревших-ооцитов и in vitro культивирования анних эмбрионов нами бнди получены следуйте результаты табл. 8).

Стадии 8-ми клеток после' 44-48 часов культивирования в грул-е-37°С достигло 13% эмбрионов, что на 10,8% (р<0,01) больше, чем группе-4°С. Относительно степени оплодотворения,нами было определено, что в группе-4°С оплодотворено ооцитов на 11% меньше,' чем группе-37вС, • однако достоверных различий при этом не наблюда-ось. ,

При исследовании развития ранних эмбрионов до стадии нсрула, зеле 165-172 часов культивирования мы не обнаружили статисти-2ски достоверных различий медду опытными группами, хотя в груг,-

Таблица 8.

Влияние температуры транспортной среды на степень дробления и развития ранних эмбрионов

Темп-ра Кол-во * Степень дробления и развития (X)

среды ооцитов __

за 44-48 часов за 165-172 часа

( С) п 2-клет. 4-клет. 8-клет. Дегенер. 2-16 кл. Морула

4 С 137 27,0 21,1 2,2 41,6 53,9 12,3

37 С 176 19.9 25,Ъ 13,0 30,7 54,6 14,7

р<0,01

пс-37° С было на 2,4% больше эмбрионов на стадии морула, чем в группе-4°С С 12,3%).

Таким образом, нами установлено, что температура транспорт«-

с

ровки яичников оказывает определенное влияние на степень реиници-ации мейоза, но при дальнейшем культивировании после оплодотворения ооцитов in vitro температура транспортной среды играет второстепенную роль при развитии эмбрионов.

З.В. Результаты культквкроваииа м сокультишравания ралнш э&брагоков коров isa различных шнослойных культурах соматических клеток В настоящее время известно, что условия культивирования ранних эмбрионов in vitro при неустановленных потребностях приводят к остановке в развитии, которая называется эмбриональным блоком и является видоспецифическим фактором. У крупного рогатого скота -о отмечено на 8-ми клеточной стадии развития.

Следует отметить, что поскольку остановка в развитии на 8-ми

- ?л -

'легочной стадии при культивировании in vitro обусловлена также и ¡еадекватностью к условиям in vivo, исследования многих авторов )ыли направлены на установление потрёбностей развития ранних эмбрионов при сокультивировании их с различными соматическими клет-

klmh.

Таблица 9.

Результаты культивирования оплодотворенных ооцитов коров на различ;'^ монослоях соматических клеток

ультуральная Кол-во Степень дробления и развития (X)

истема оошггов__

за 1б5-172.-часа

п Дегенер, 2-16 клеточн. Мэрула

j>

Контроль 176

Монослой кумул. 168 клеток

(по U. Berg и G. Brem) Мэнослой клеток 163 гранулезы

Мэнослой эпите- 135 лиальных клеток яйцевода

Ыонослой клеток 127 маточного эндо . ■дермия

30,7 33,9

31,2

30,1

33,1

54,6 39,4

43,1 44,0

66,9

14,7 26,7

25,7 25,9

р<0,05.

Б наших экспериментах при культивировании ранних эмбрионов были использованы соматические клетки репродуктивного тракта. В результате экспериментов исследованы следующие культуральные системы: 1) контроль (без йоиослойной культуры клеток); 2) мо-носяой эпителиальных клеток яйцевода; 3) моносдой кумулюсных клеток; 4) монослой клеток маточного эндодермия; 5) монослой фолликулярных клеток яичника

Проведенные исследования показали (табл. 9), что совместное культивирование ранних эмбрионов с соматическими клетками репродуктивного тракта способствует преодолению эмбрионального блока в развитии и тем самым достоверно повышает выход интагегных эмбрионов пригодных для нехирургической переездки реципиентам. Жиз-енеспособность эмбрионов полученных методом in vitro подтверждена продолжением их развития после пересадки реципиентам. 4. вывода

1. Дитоморфологическая оценка ооцит-кумулюсного комплекса перед постановкой на ■ созревание -in .vitro обуславливает степень реинициации мейоза у ооцитов. Ооциты с неэкспандированным, многослойным кумулюсом (не менее четырех слоев) и темной мелкозернистой ооплазмой способны, обеспечить более 80% созревания in vitro.

2. Эффективность культивирования определяется интенсивностью дробления за первые 44-48 часов. При последующем культивировании (165-172 часа) до предымплантационньи стадий эта зависимость увеличивается.

3. iТемпература транспортной среды оказывает определенное влияние на пролиферативную акгизность кумулюсных клеток при созревании ооцитов in vitro. После оплодотворения ооцитов in vitro ге»щература транспортной среды играет второстепенную роль в раз-

витии эмбрионов.

4. В качестве питательной среда для культивирования ооцитов коров молет Сьггь использована модифицированная среда Паркера (МРЫ) и среда Мэнезо (ЫШ). При капацитации сперштозоидов методом "swim up" среда Sperm-TALP шязт быть успешо заменена среду МШ.

5. При оплодотворении ооцитов коров :n vitro существует ргч-лкчия, которые в значительной : обусловлены индивидуалы:!.-;-л особенностями спермы быков. Использование смешанной спермы от различных быков повышает степень оплодотворения.

6. Денудирование ооцитов перед оплодотворением in vitro увеличивает степень пенетрации ооцитов и повышает t процент оошгтов, оплодотворенных полиспермно. Наличие экспандированкьх куугулпот:: клеток при оплодотворении in vitro сказыгаег положительное влга-ние на результаты дробления и -развития при дальне Леем .культивировании.

7. Совместное культивирование ранних эмбрионов с соматическими клетками репродуктивного тракта коров способствует преодолению эмбрионального блока в развитии и тем самым повышает выход интакгных эмбрионов пригодных для пересадки реципиентам.

5. пргдаохщшя

1. Полученные данные рекомендуется использовать в научно-исследовательских работах при решении проблем, связанных с культивированием ооцитов коров in vitro. Для оптимизации условий культивирования ооцитов в замкнутой in vitro-системе использовать питательную среду ШМ С модифицированная среда Шнезо). отсох ОПУВЛШШННЫХ РАБОТ

1. Мальцева Я В., Еайбеков Ф. Р. Методические вопросы культивирования и оплодотворения ин витро ооцитов крупного рогатого

скота // Вшл. научных работ ШЖ..-1991.-Вып. 104.-С. 49-52.

2. Еайбеков Ф. Р. , Мальцева И. Е Результаты культивирован

«

ооцитов коров на монослое клеток яйцевода // Тезисы докл. н уч. -прак. конференции молодых ученых и специалистов. -Алма-Ат 1991.-С. 5-6.

3. Вайбеков Ф. Р., Мальцева И. В. Культивирование и оплодотв peime in vitro// Тезисы докл. науч.-лрак. конференции молодых уч ных и специалистов.-Бишкек, 1992.-С. 192-194.

4. Sergeev N.I. , Baibekov F. R. In vitro maturation and vitro fertilization oF 'bovine oocytes.// J. Reprod. Domes Anim. -1992(Feb. ).-27(1).-P. 44-45.

л

• Подписано к печати 3.03.1995 г. -Заказ '?'? >

¥нрвх 80. ' Объем 1,0 уч.-как. к.

ГЫП ВЙЖв