Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ IN VITRO В РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ IN VITRO В РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СИСТЕМАХ"

з

' <:. , ,_.../ v t i. » ' , ,, .

j^i'O'X^icíüy; НАУЧНА кос JFJRVÍUT ЕЛЫ И^КГГУТ

1ИЕ0ГГОТШГГВА

На правах рукошюи

Баибеков 4врвд Рафаэле ëîî-

УООСЕРШШТВОВАНКК МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ U СШ35СТШ?Ша ООЦИТОв КОРОВ IN VITRO В РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУРД^ЫЗЯ CKCTKÍAX

Специальность СЗ. 00.13 - Физиология человека* jí.jraBOTKbK

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стеленк кандидата биологических наук

п. Дубровида, Московская область 1932

Работа выполнена в Центре трансплантации эмбрионов сельскохозяйственны* животных Всероссийского научно-исследовательского института тевотноводства.

академик рдсхн ХК. ЭРНСТ

доктор биологических наук, профессор Н. 1.

доктор биологических наук, профессор И. Я.

кандидат биологических ваук, К. Г.

учедодете: ТСХА, г. Ыэсква

Защита, диссертации состоится " /¿Г" ¿l^Wt&Aj 199$ г. в часов на . заседании Специализированного совета

Д. 020.15. ог ш защите диссертаций яа соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства- ;

Адрес института; 142012, Московская область, Подольский район, пос. дубровипы, виж.

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослав

Г.

Лов* секрета!» П>)|phi иинртпгяннптчт совета мштэт бш. наук

Н.Н. feurnt

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PABOTU

Актуальность теиы. Развитие трансплантации как. бисггхнодоги-ческого метода позволило более эффективно использовать репродуктивный потенциал высокопродуктивных животных, резко увеличить коэффициент размножения высококлассных особей. ■

Однако разработанные методы гормональной стимуляции женских ocoGeft в настоящее время не позволяют в полной мере' использовать потенциальный воспроизводительна 4онд, заложенный в яичниках. В яичниках коровы атрезии подвергается около 707. премордиальных фолликулов и от 10 до 41Х преполостнш (Эрнст Л.К., 1983). При этом индуцирование высокой степени множественной рвуляции отрицательно сказывается на выходе нормальных эмбрионов.^-¡Йасокая вариабельность и непредсказуемость реакции яичников на гонадотропин. появление отрицательных факторов после применения гормональных препаратов на воспроизводительную способность делает известные методы весьма ненадежными (Сергеев ЕИ., 1566).

Непосредственную роль в решении данного вопроса отводят специализации по in vitro созреванию и in vitro оплодотворению ооци-тов, которая в большей степени могла бы удовлетворить потребности как в производстве эмбрионов на определенных стадиях развития, так и в развитии приоритетных направлений в биотехнологии. Однако эффективность змбриопроиэводстьа in vitro в настоящее время составляет около 101 живого потомства, что явно ниже, чем в условиях in vivo (First и Parrish, 19В7).

Цель и задачи исследований. Дель наша исследований заключалась в усовершенствовании и разработке метода культивирования -и оплодотворения сопитов коров in vitro в различных культуральных

системах.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

Исходя из зтого, был i _ИА5аив$»ьВВйЯЬ<ШкК'4ш эчи: Моск. сел,- . >■ ■ . ..«двмии

гдвмин

1. Изучить влияние температуру транспортной среды созревание ооцитов и их дальнейшее развитие после оплодотворения.

2. Изучить эффективность использования различных культураль-

.о

пых сред при созревании ооцитов и культивировании ранних эмбрионов.

3. Определить оптимальные условия подготовки ооцитов к оплодотворению.

4. Изучить влияние сперма различных быков на оплодотворение ооцитоа in vitro.

5. Шявить влияние раз .личных культуральных систем на дальнейшее развитие ранних эмбрионов.

Научная новизна яссждовзяий. Определены оптимальные критерии культивирования и оплодотворения ооцитов коров in vitro. Изучено влияние спермы различных баков на оплодотворение ооинтов )п vitro. Выяснено влияние различных мовослоев соматических клеток репродуктивного тракта на дальнейшее развитие полученных эмбрионов. Усовершенствован метод культивирования и оплодотворения ооцитов коров вне организма. Жизнеспособность заморомэнно-оттаянных эмбрионов, полученных методом in vitro, подтверждена продолжением их развития после пересадки реципиентам.

Практическое звачение работы заключается в усовершенствовав нии метода созревания изолированных ооцитов in vitro, экстракорпорального оплодотворения и дальнейшего культивирования ранних эмбрионов в различных культуральных системах. Использование разработанных условий транспортировки яичников, созревания ооцитов копов, капацитации сперматозоидов и тестирование спермы быков на оглэпотворяадую способность in vitro позволит значительно по-выход нормальных эмбрионов, необходимых как для трансплая-таши, так и для других направлений в биотехнологии.

Апробации работы. Результаты. представленные в шооте Сьли доложены на научно-методической конференции "Профессиональная подготовка национальных кадров в МЕА дли зарубежных стран" (Москва. 1990). на 111 Республиканской научно-практически ко mit-рении к молодых ученых и специалистов (Алма-Ата, 1991i. на ]]i межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых к спеш;а-якстов {Бишкек, 199"), на научно-методических конференциях Центра трансплантации эмбрионов с.-х. г.:-тных (19S9-1991).

Структура диссе рта^ии. Диссертационная т>а6ота состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований. обсуждения. вweghob и предложений. Диссертация изложена на 124 страницах^ машинописного текста, включает 14 рисунков и 9 таблиц. Список использованной литературы состоит из 276 источников, в тем числе £Ш иностранных.

2. МАТЕРИАЛ Н МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИИ.

Яичники, для получения ооиитов. доставлялись с Подольского экспериментального мясокомбината. Транспортировали яични."л в лабораторию в термосе, при температуре физиологического раствора 37° С или 4°С. в зависимости от условий эксперимента. Время от момента взятия яичников на мясокомбинате до постановки ооцитов на созревание составляло 2-2,5 часа.

Яичкики неоднократно промывали в Физиологическом растворе и помещали в ламинарный бокс (БаЬсос). Затем с помогаю 5 мл шрица (Heimnn) и иглы 18G (Erosa) с поверхности яичника аспирировали фолликулы с диаметром 2-8 км. Поиск ооштов оеушетвдяди при малом увеличении (х15) под стереомикроскопом (Niken).

Для созревания ооцктое использовали среду МРМ с Z0Z естраль-шй сыворотки Синактивированной 30 мин. при 56°С) и добавлен«?»-'

10 мкг/мд ФСГ {U3DA. Beltsvj 1 le Atfnkultural Research Center. USA), или шдифииирОБакиу ю сроду Menezo-B (ЬШ) с аналогичными

добавками. рР ср^ды находилась в пределах 7,3-7.4.

«

Созреваке зенитов происходило и СОг-инкубаторе (Негаеиз) с 5% СОг в воздухе в мажкмальноД влажности. Температура созревания ооштог была 39*С, время созревания - £4 часа. Приготовление срел, а такие Бое манипуляции. " связанные с получением социтов и их постановкой на созревзние, происходили в максимально стерильных условиях.

Ре продукт иг. ние органы (яичники, яйцеводы, рога матки) для получения клеток поставлялись в лаборатории при температуре 4вС в среде ШЕМ с добавлением антибиотиков и антидакотиков-

В эксперименте использовали органы ст животных с ясным ова-риажьяым никлом, без патолоптческих изменений, га стадии фолликулярного роста Для получения клеток гранулезы, фолликулы с диаметром 3-8 мм препарировались под стереомикросколом (Nik'on) в ламинарном боксе. Полученнае клетки гранулезытрипсикизировались раствором Тр.ипсин/ЕОТА и затем центрифугировали при 485 G, 10 минут.

Посев клеточного седимента осуществлялся в 500 мкл среда Di.EM + 20% фатальной сыворотки (Sigma), в' культуральньк чашках (Nunc). Пассаж помешали в СОг-ннкуСатор на три дня, при темперз-туре 39*С, 5Z СС^и максимальной влажности. При получении монослоя клеток гранулезы, клетки обрабатывали Mitomycin С (SJgm) с концентрацией 10 мкг/ше.

Для получения монослоя кумулюсных клеток ( по U. Berg и S. Вгеш, 1989), использовали кумулюсные клетки прикрепившиеся ко ¿ну чашки, после сокультивироьания гамет.

Для получения моксслоя эпителиальных клеток яйцевода в лабо-

ратории яйце вол препарировали и промывали 20 ил PBS без Са++/№;4 + раствором. Затем пропускали 2-3. мл раствора Трипсии/ЕЮТА. преды-инкубировали 10 минут при комнатной температуре, Яйцегод промывали 10 ил среды Dfc£fcf+20X фетальной сыворотки (Sijma) в центрифужную пробирку (Nunc), иентрийугировали 10 минут при 485G,, Осадок ресуспеняировали и производили посев клеточной культура Культивировали при 39eC, 5Z COjB воздухе и-максимальной влажности. При достижении монослоя процедура "^'^.ботки клеток Mitomycin С и замена среды на МРМ20Х астральной сыворотки, была аналогична процедуре, как и в случае с клетками гранулезы,

Ори получении клеток маточного эндодермия, рог матки промывали РБ5 без Ca++/Mg++, затем трипсинизировалч ил. раствора

Трипсин/ЕША. Спустя 10 минут, рог матки' обшваЛи'в-Ю раз по 2

. ■» -

«л DKEf.t+20l фэталыюя сыворотки в центрифужную пробирку и центри-5 минут при 4856. Осадок ре с успеядировали 5 мл DKEU+2031 феталькой сыворотки и производили посев щеток. Релим и система инкубации были аналогичными* как и в случае с эпителиальными клетками яйцевода. Обработка Mitomycin-С. описывалась выше.

Для экспериментов по оплодотворение in vitro' использовалась исключительно, глубокозаморожеяная сперма, голштинофриэской и немецкой черно-пестрой пород, от быков: класса элита рекорд. Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по'методикам, описанными Parrish и др. (1986), и Greve и др. (1986).

Оплодотворение оодаггов in vitro проводили в микрогапле .среды Fert-TALP под минеральным маслом, в инкубаторе при 39°С, 51 COjH максимальной влажности. Время со-культивирования гамет составляло 13-20 часов.

Оплодотворенные ооциты культивировали в 400 мкл среды ЫРМ + 20?. астральной сыворотки или ШМ + 20Х эетральвой сыворотки, в OCv

- инкубаторе, при температуре 33"Сt 52 СС^и максимальной влах-чости, время культивирования составляло 7-8 суток. При со-культивировании с монослойиыми культурами соматических клеток репродуктивного тракта, оплодотворенные ооциты по 20-35 на ячейку пере-

v

косили на подготовленный моносдой клеток и культивировали при тех же условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ 3.1. Лтспансяя куиулкэмс клеток в эавмюмостк от морфашпмесю* оценки ооцкгов прм постановке ка созреванье. Разрыв коммуникационной системы внутри фолликула, освобождает сош-кумулюсныЯ комплекс от влияния мейогкнгибирутосш фаигго-ров. На этой основе наступает ре инициация >*ейоза. - При этом экспансия кумулюсных клеток является результатом прекращения действия факторов поддерживающих «ейотический покой.

Таким образом, цитоморфологическая оценка окружают© го куму-люса и ооплазмы самого ооцита 'отвечают селекционным критериям успешного мейотического созревания ооцита ш vitro.(табл. 1).

После 24. часового культивирования in vitro, в данной серии опытов нами проводилась оценка созревания in vitro ооцитов по лролнферативной активности куыулюсных клеток. За основу была взята степень экспансии окружающего ооцит кумулюса. Отличную экспансию кумулюсных клеток обозначали - "+++", среднюо - "++", удовлетворительную' - "+".'■ При этом отмечали, также ооциты с веп-ролиферирушими кумулюсными клетками ("-") и "перезревшие " ооциты, у которых наблмдался лизис кумулюса s конденсированные участка округлой формы. ' i ■

Кэши наблюдения показали,- что наивысшую степень реинициааии по кумулюсной экспансии (84,71), показали ооциты в группе

Таблица i.

Результаты согревания в зависимости от качества осштое

Качество Кол-во

Зкгпансия кумулюсных клеток

ООШГГОВ ООШ1Т-

п Всего +++

п-Х п-Х

п-Х

п-Х . ■ п-Х

+

Перезрело п-Х

Хороше 176 149-84,7 103-61,9 26-14,8 14-8.0 7-3,9 £0-11.4 Средние 119 74-62,1 30-25.2 11-9.2 33-27,7 22-18,5 23-19,3 ПЛОХИ*? 223 56-24,5 6-2.Б -18-7.9 32-14.1 100-43.8 72-31.6

"хорошие". В группе "средние" 74 ооцита f£2,17,) имели различную степень экспансии кумулюсных клеток, а в группе "плохие" лишь 24,5Х. что достоверно (р<0,001) ниже, чем s вышеназванных группах. ■

По различной степени экспансии кумулюсных клеток, как видно из таблицы 1, между всеш тремя опытными группами также наблюдались высокодостоверные'различия. Так,' кумулксную-зкспансию оцененную как "отличная" (+++V в группе "хорошие" имели 61,9Z ооци-тов, в группах "средние" и "плохие" 25,2Х и 2.6Х, соответственно. По другим уровням пролиферативной активности кумулюсных клеток ("++" и "+"} между опытными группами были также установлены высокодостоверные различия в степени ре инициация мейоза.

Таким .образом,. наблюдения показали, что штоморфологиччская оценка ооцит-кумулюсного комплекса перед постановкой на созревание in vitro обуславливает степень реинициации мейоза у ооцитов.

p<0,001 piO.OOl р<0,05 р<0;001 р< 0,001

Установлено, что только сойоты с незксяактгооЕакнш. многослойным кумуякеои и темной мелкозернистой ооплагмой способны обеспечить более 80Z согреваний in vitro.

3.2. Результат сюре&ашт ооцкгов я зависимости «"температуры транспорт»«« среда Интервал времени между убоем животного и эффективной постановкой ооцитов на созревание in vitro не имеет большого влияния на степень созревания ядра, однако в дальнейшем более короткий интервал положительно влияет на результаты оплодотворения и. соответственно,.на способность оплодотворенных ооцитов к дальнейшему развитию in vitro. • ■ ■

В результате ряда экспериментов, нами было установлено влияние температуры транспортной среды на степень экспансии куму-дюсных клеток.' В таблице 2,. представлены данные характеризующие степень реиниииации мейоза в . зависимости от температуры транспортной среды. •• ; - . 4

Г; Таблица 2.

Результата влияния тепературы транспортной среды ' ■ . на согревание in vitro

Темпер. Кол-во ;.,'■"'■' Экспансия куыулвсных клеток

среды ооиитов ■.,,'. ' ■ • ' ■

п "•Всего ' : +++ ..V ++ + ; ^ , - перезрело

(*С) • ri-r п-1 п-Х n-X п-Х п-2

137 101-73.7 60-43,8 20-14,6 £1-15,3 13-9,8 23-16,8 176 149-84,7 109-61,9 ■26-14,7 14-7.9 7-3,9 20-11,4

4

27

р<0,05 р<0,05

Как видно из таблицы 2, наивысшая степень (84,7%) экспансии кумулюсных клеток наблюдалась в опытной группе яичники которой транспортировались при температуре 37*С. В группе-4еС, экспансия кумулюсных , клеток составила 73,71, что на ИХ меньше {р<0,05), чем в группе-37*С.

Аналогичные результаты были получена наш н ори дифференцированной рассмотрении степени экспансии куыуяоса между двуия опытными группами. Так. колгпГ ^гво - ооцитов имевших "отличвус" С+++) экспансию кумулгса в группе-37*С было ва 18,12 больше» чем в группе-4°С. Таким образом, в результате транспортировки яичников при 4°с 43,82 ооцитов имели пролиферации кумулюсных клеток, оцененную как "отличная", что достоверно ниже,Сд<0,05), чем в группе-37вс. /

Исходя из этого, нами сделан вывод, что температура транспортировки оказывает достоверное влияние (р<0,05) на проли-феративную активность кумулюсных клеток, что. в свою очередь сказывается на степени реинициации мёйоза.

3.3. Влияние разлмнья културальиш сред на реауштахи созревания ооцитов ■ степень дробления к разнята ., ранюи эмбриона» кирш. в настоящее время известно, что: в .значительной мере степень реингошации мейоза и степень развития ранних эмбрионов.зависит от правильности подбора питательной среды. Однако^ неадекватность условий инициации itóñoaa in'vitro, .в сравнении с in vivo в конечной итоге приводит/к частичной дегенерации,« (или) неполноценному завершению ядерного' и шттоплазматйческого созревания ооцита.*

В наших экспериментах- при оптимизации системы' культивирования in vitro использовались модифицированная среда Паркера США и модифицированная среда Шнезо С МВД.

Кроме этого, следует отметить, что среда МММ использовалась

»

не только в качестве среды созревания и среды для дальнейшего

развития, но и в качестве среды для капацитации сперматозоидов.

Тем самым при использовании* среда ыш отпадала необходимость при* - .

готовление специальной- среды для капацитации - Sperm-TALP, что сокращало количество необходимых сред для проведения экспериментов по in vitro культивированию и оплодотворению ооцитов-коров.

Данные, представленные в таблице 3, характеризуют в динамике созревание, оплодотворение и развитие раиних эмбрионов от числа оошггов поставленных'на созревание.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что при использовании среды МРЫ 149 ооцитов из 176 (84,71} имели «экспансию кумулюсньд .клеток,-;а при созревании вереде ЫШ-132/158 (83.6Х) смогли рекницировать ыейоэ. При этом не было _ ' - Таблица З. .

■ V. , Влияние различных, культуральных сред о ', на созревание оошггов и их дальнейшее развитие

Используемая .'Созрело Оплодотв.,' Степень дробления и развития (X)

среда ■.':". . .ооцитов' ооцитов ' - ■ ■■■■■■ - - • ■•

■;■-■■.' ■■ • ■■■.'-'.*'' за 165-172 часа

.п-Х п-Х . Дегенер. 2-16 кл. Шрула

14.7

12.8

NPM+20Z эстр. 149-84,7 104-59,1 30,7 . 54,6

сыворотки ■ ' '■'■■" ■' "

КШ*20Х встр. 132-83,6 91-57.6 ' 30.3 56,9

сьпоротки N'4'-'-

с-окаруж&ис достоверных различий в степени пролиЧеративной активности кумулсса и, следовательно, в. степени созревания ооцитов ьйжеу представлеккши опытными группами.

Число оплодотворенных ооиитов в опытной группе созревших в среде МРЫ составило 59,12 (104) ст числа ооиитов поставленных нь. созревание. Во второй опытной груше, созревших в среде ШМ, уровень оплодотворения ооцитов составил 57.6%.

Щи исследовании степени дрсбления и развития ранних эмбрионов га 165-172 часа культивирования нами было получено 14,71 иэ-рул при испольго&ании среды ЫРЫ и 12,87. морул при культивировании в среде МШ. По.степени дегенерации оплодотворенных ооцитов за время культивирования мы не обнаружили рагл:гщй'между опытными группами.

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют сделать вывод, что в качестве питательной среды для согревания ооцитов коров мэжет быть использована как среда. МРЫ, так и ЩЦ. :цри капаштации сперматозоидов методом "swim up", среда Sperm-TALP может быгь'успешно. заменена на среду МММ. так.как по степени, полноценного оплодотворения не было обнаружено достоверных различий между опытшйи группами.

3.4 &лнше спор»! ршлнна бькав на результат дробления к развит» рангах эмбрмонсе.

В наших экспериментах' мы исследовали влияние спермы отдельных быков и смешанной спермы' на результаты дробления и степень развития ранних',эмбрионов,, оплодотворенных in Vitro, При этом использовалась глубокозаыороженная сперма от 10 различных быков голшгинской и немецкой черно-пестрой пород.

Анализ данных таблицы 4 показал, что при использовании спер-

мы быка Монитор опдодотворяеыость ооцитов составила 55,7Z, что достоверно (р<0,01) выше на 7,81 чем при оплодотворении спермой быка Рид (47.91) и. на 7,51 выше (р<0,01). чем Сэр (48,2Х). При оплодотворении спермой бык% Персуадер было получено 52,71 оплодотворенных ооцитов, что достоверно выше (.р<0,Ш), чем при использовании спермы быка Сэр. Аналогичные результаты получены при сравнении быков Каистар и Сэр - 53,83: и 4S.2Z соответстгенвд-.

Таблица 4.

Влияние спермы различных быкоз на степень дробления и развития ранних эибрйоноз

. Кличка Кол-во Степень дробления и развития (X)

быка ооцитов ■ '_____;___

за-44-48 часов за 160-172 часа

■-.'■ п 2-клет. 4-tuieT.-8-клет. Дегенер. 2-16 кх ibpyís

Каистар , 146 ' 16,9 21,7 ' ¿-6,2 53.Й

ЬЬшпор ; 120' . 16,1 ; 22,3 ' 3,8.. 44.3 " . '''í5„2 - ' 9,5

Таррагон 131/' 22.7" 22,9 . 2,3 49,5 43,3 7,2

Персуадер 174 13 Д 28,1 • 4.1 47.3 '■ 43,2 9.5

РЬдлвр ■ 168 26,5 22.0 4.7 48,7 41.2 10,1

Сэр •• " 170 17.2 21,1 -1,2 51,8 48,2

РИД ' 159. ,"15,2 22,1 1.3 52,1 47,9

Скиф _ .171 . 22.13 21,9 2.7 " 51,4 41,2 7,4

Сантал 169 • 26.1 ' 21,2 . 5,1 50,6 38,9 10,5

Лель 159 18,9 15,1 2,3 51,0 ■ 42,7 6,3 Моннтор/

Гзррагон 176 17,3 28,3 ■ 14,8 30,9 53,0 16.1

р<0,05 р<0,001 р<0,01

При использовании смешанной спермы ( ib¡i итор / ï ар paro к ) ksüm бшо установлено достоверное íp<0t05) повышение степени сллодот-воряемости оонигов, по сравнению с индивидуальным использованием спермы быков. Озлодотворяемость ооцитов яри использовании сиелан-ной спермы составила 69,11, что на £1,21 выше, чем при использовании спермы быка Рид и на 20,El выше чем при использовании спермы быка Сэр (piO.CS) .

В результате проведенных гл-лздований по определенно взаимосвязи между оядодотворяйаеп способностью in vitro и in vive, нами не установлено коррелятивной связи между оцениваемыми признаками íг-+0,353). При сравнении результатов оплодотворяемости i» vivo к развитие»! ранних эмбрионов до стадии керула^п vitro такл-не было обнаружено тесной коррелятивной сеязи ( г-+0,*24б) „

Таким образом, нами установлено, что ^рк оплодотворении ооцитов in vitro существуют раз-гачия, которые в значительной степени обусловлены индивидуальными особенностями спермы быкс-Е. Использование смэшаяной спермы повышает степень оплодотворения п-еравнения с . индивидуальным ; использованием спермы данных бьков.

видимому, это происходит аа счет .конкурентного преобладания вокруг ооцита. Отсутствует тесная коррелятивная связь мевду опдо-дотворяемоетыо in vitro и in vivo, а также не.жду 'оплодотворяе-мостью in vivo' и выходом ыорул после in vitro оплодотворения и культивирования.

, 3.5. Вликюю подготовки оецмгаз на m

отдодотвореянэ in vitro

Кумулюсные клетки необходимы'при процедуре оплодотворения, так как они не только оказывают гемотактическое притяжение на спермин но и повышают их капацитационную активность. Однако боль-

Uiarf кумудюспая Mat с а кусток пг-епятсть/чт г^.^т^кту рматозсидоь с яйцеклеткой, что ь свою сче^Д! отрицательно сказывается на оплодотворении.

В результате экспериментов (табл. 6) нам/ установлено, что обработка соэревЪта ооиитов раствором трипсин/ЕЖА достоверно влияет на результаты оплодотворения. В группе соштоь, у которых перед оплодотворением был полностью удален куыулгс iтрипсия/ЕДТА) степень оплодотворения составила 82.3%, что достоверно выше (р<.0.001) на 21,7%, чем в I группе и на 26,чем во П группе.

Таблица 6.

Влияние подготовки ооцитов на оплодотворение in vitro

^Способ Кол-во Оплодотворено

обработки ооцитов _;_

п • Всего л-% Шлисяермно n-Z

I группа 67 .41-61,1 не обработанные

II группа 66 37-56,3 частично денуди

рованные (гилауронидаза)

III группа 70 58-82,8 полностью

деяудированные 1Трипсин/ЕЛТА)

1-2,4 3-8,1

11-18,5

р<0,001

р< 0,001

. ;:•• 2;Г:'а ^г-': гл Г-(- ■ С'. у;- .'л ь,

огиг^тьор^;^:-: "р.: ¿с:: ¡-р.«-:. 'Ш: £ г::/;:::- :!; -/¡¡се

1: г-.;; " ^ч;-.:. V.:' гру;;:;-

на Е^;.-.-, "¿к: г- ;

¿¿о.. уfL-.iiо-,. ,Г",- 1";. : :;■.■,>.-■:.

;. :С^;,*. г::.^ г> ; г ру ,-.:'.-..■.

_ :.■:■.': то с..'.:...

кит.-: оон/: : г.. . пс^уч-т:;^- 1=01-

, л чт: у.^,' ;; М1 гр.т.-

¿ГЬ> -П'Л уа::;"и? ""¿ьяо куму"*..::илст ■

ки. гакл-е чко^с ьо:-^ Ггелл^иадь. £ с йт>;,!.; отсутет* и^:^

иак^кл олгжа ^о;;.-: 1! т^ с 0

ю*, г-^рекь'р:' У сп^п'сь I! гру-Л^

к;: г:.-; л: л; :;.у:?:.точкйгс ьррчч,- ;>:■■

Эу-Еьтзть: а р:.-;!;- и-н-: Оь'ла

режлека. то степени эрлодотборекил ссиитсв ! I групгш как и у I групл^ юстоверно (р<-0,001) нкаэ, ч-м в Ш группе. Различия иеглу I и !] группами 5 го-яиспермном'оплодстьорении ма>.-но о отменить -тем, вдо спермагсзокраи при пенстрдрии оошп'це I группи, в отлили от И группы. трезоьа^ось болъЕс времени при

прохоиьнк;! Ч5ре£ НУМу.Р'Х ДЛЯ 001Г>:Т£1. Б сьязи с 3тш

;гшдось достаточно йреь«кн длл развития реакции ьоны 3.6. РсЗ^лта-ш ЗфОйлг^а ^ г^шггиз [иаьз:

Зайр^ко^ з от шрфХ'^огнческйЛ

Цел„к ра.-;;:^: зкелеришнтов бшю определение завис ;о/ости ро-¿ултатсв ^роолан;:;; я развития ра.ч,чнх эмормонсв о? морфологической оиен:-;;: оот^ггоъ т.рн пзсгакоЕко 'н:л ссзреван^в. В резу-зьтс:

ib -

.'¡роЕедзнкшс зкспе^чмснтог мзш Ssisc- vcTiiii^i'.'ieHC, что развитие ранних зморионов зависит от исходного качества ооцитов. В группе "хорошие" стадии S-ки клеток га 44-43 часов культивирования достигло 132 эмбрионов, в группе "средние" было обнаружено sojto-верке (р< 0,05) меньке эиОрионов на этой стадии развития 'и составило 5.OS. В группе "плохие", при культивировании in vitro 44-48 часов ш не наблюдали эмбрионов на 8-ми клеточной стадии развития (табл.?). Учитывая этот факт, мы пришли к выведу, что лиз-неспособньй потенциал оцениваемых сопитов оказывает определенное влияние на скорость дробления ранних эмбрионов коров.

Таблица 7.

Степень дробленая и развита ранних эмбрионов в зависимости от качества ооцитов

Качество Кол-во Степень дробления и развития (%)

оооитов' ооцитов _______;_а„_

за 44-48 часов за 165-172 часа

п 2-клет. 4-клет. буклет. Легенер. 2-16 кл. Мэрула

хорошие 176 19,9 25,5 13,0 30,7 54,6. 14,7

Средние 119 16,8 19,3 5,0** 41,7*** 45,1 7,8** плохие 228 28,0 12,3 - 48,2* 51,4 0,4*

*р<0,001 **р<0,05 ***р<0,01

При культивировании ir, vitro мы обнаружили также достоверные различия в степени дегенерации. Так, з группе "хорошие" дегенерировало 30,7% эмбрионов, что достоверно меньше, чем в группе

"средние" -- 41,77. (р<0,01) ."и чем в группе "плохие" - 48,2% (р<0,001).

Количество ранних эмбрионов, развившихся до стадии морула, в группе "хорошие" составило 14,72, что на 7Z больше {р<0.05)чем в группе "средние" и на 14,32 больше (р<0,001), чем в группе "плохие".

Таким образом, нами установлено, что Ш'томорфологическая сценка ооцитов при постановке на созревание in vitro определяет не только степень ргиншшации мейоза, .во и эффегаивность культивирования ранних экйрионов. можно.определить по интенсивности дробления за 44-4В часов, при .последующем культивировании (1G5-17D часа) до стадии морула эта зависимость увеличивается.

3.7. влияние температуры транспортной среды на результаты дробления н развития ранних эМЗрманав

Б предварительных экспериментах нами изучалось влияние температуры транспортной среды на созре ванна оодитов in vitro. Ьыли установлены достоверные (р<0.05) рзэличия в степени реинициации мейоза в зависимости от температуры транспортировки. После in vjtro оплодотворения созревших-ооцитов и in vitro культивирования ранних эмбрионов - нами были получены следующее результаты Г табл. 8).

Стадии 8-ми клеток после 44-48 часов культивирования в груп-пе-37"С достигло 132 эмбрионов, что нэ 10,82 (р<0,01) больше, чем в гру]ше-4вС. Относительно степени оплодотворения, нами было определено, что в группе-4еС оплодотворено ооцитов на 112 меньше, чем в группе-37°С, однако достоверных различий при этом не наблюдалось.

При исследований развития ранних эмбрионов до стадии маруда, после 165-172 часов культивирования мы не обнаружили статистически достоверных различий между опытными группами, хотя в грул-

Т35Л1И13 i1.

Влияние температуры транспортной среды * на степень дроблеякя и разгктиз ранних змОрионэЕ

Те.мл- ра .Кол-во Степень дробления я развития (X)

среды ооцитов

за 44-45 часов за 165-172 часа

; С) п S-клет. 4-клет. 8-клет. Дегенер. 2-16 кл. Морула

4 С 137 27,0 21,1 2.2 41,6 53,9 12,3

37 С 176 19.9 25,5'' 13,0 30,7 54,6 14,7

0,01

яс-37ьС было на 2.4% больше эмбрионов на стадии морула, чем в группе-4(1£,ЗХ>.

Таким образом, нами установлено, что температура транспортировки яичников оказывает определенное влияние на степень реиници-ации мейоза, но при дальнейшем культивировали« после оплодотворения ооцитов in vitro температура транспортной среды играет второстепенную роль при развитии эмбрионов.

3.8. Результаты культивирования к сокудьтквмровакия ранних эмбрионов коров на различных шносдойных культурах соматических клеток 3 настоящее время известно, что условия культивирования ранних эмбрионов in vitro при неустановленных потребностях приводят к остановке в развитии, которая называется эмбриональным блоком к является видоспецифическим фактором, У крупного рогатого скота "з отмечено на 8-ми клеточной стадии развития.

Следует отметить, что поскольку остановка в развитии на 8-ми

клеточной стадии при культивировании ín vi tro обусловлена также и неадекватность*) к условиям in vivo, исследования многих авторов были направлены на установление лотрёбностей развития ранних эмбрионов при сокультивировании их с различными соматическими клетками.

Таблица 9.

Результаты культивирования оплодотворенных ооыитов коров на различиях монослоях соматических' клеток

Культуральная система Кол-во социтов п Степень дробления и развития (X)

Дегенер. за 165-172¿часа 2-16 клеточн. Морула »

1. Контроль 176 30,7 ' 54,6 14,7

2. Ыонослой кумул. 168 : ■ : 33,9 39,4 26.7

клеток

(по U.Веге и ¿Brem) а иэноолой.клеток 163 31,2 . 43,1- 25,7

гранулезы

4. Мэнослой зпите- 135 30,1 44,0 25,9

лиальных клеток яйцевода

5.. Монослой клеток 127 - 33,1 65,9

маточного эндо . ■дермия

р<0,05.

В наших экспериментах при культивировании ранних^эмЗрионов Зьш использованы соматические клетки репродуктивного тракта. В результате эксперимента!; исследованы следующие культуральиые системы: 1) контроль (без монослойноа культуры клеток); 2) мо-

V

кослоЯ эпителиальных клеток яйцевода; 3) монослой кумулюсных клеток; 4} монослой клеток маточного эндодермия; 5) монослой фолликулярных клеток яичника.

Проведенные исследования показали (табл. 9), что совместное культивирование ранних эмбрионов с соматическими клетками репродуктивного тракта способствует преодолению эмбрионального блока в развитии и тем самым достоверно повышает выход интактных эмбрионов пригодных для нехкрургической переездки реципиентам. Жиз-еяеспособность эмбрионов полученных методом in vitro подтверждена продолжением их развития после пересадки реципиентам, 4, BUBO№

1. Питоморфологичеекая оценка оошт- кумулюсного комплекса перед постановкой на созревание in vitro обуславливает степень реинициации шйоза у ооцитов. Ооциты с неэкспандированным, многослойным кумулюсом (не менее четырех слоев) и темной мелкозернистой ооплазмой способны обеспечить более 80% созревания in vitro.

2. Эффективность культивирования определяется интенсивностью дробления за первые 44-48 часов. При последующем культивировании (165-172 часа) до предымплантационных стадий эта зависимость увеличивается.

3. Температура транспортной среды оказывает определенное влияние на пролиферативнув акгизность кумулксных клеток при созревании ооцитов in vitro. Шсле оплодотворения ооцитов in vitro гзмпература транспортной среды играет второстепенную роль в раз-

витии эмбрионов.

4. В качестве питательной среды для культивирования ооцитов коров может Сыть использована модифицированная среда Паркера CMPU) и среда Менезо (ИМШ. При калацитации сперматозоидов методом "swim up" среда Sperm-TALP модат Сыть успешно заменена к а среду МММ.

5. При оплодотворении ооцитов коров in vitro существует различия, которые в значительной у -.они обусловлены индивидуальное особенностями спермы быков. Использование смешанной спермы от различных быков повышает степень оплодотворения.

6. Денудирование ооцитов перед оплодотворением in vitro увеличивает степень пенетраади 'ооцитов и повышает,процент ооцитов, оплодотворенных по лиспе рмно. Наличие экспандированиш кумулхсншг

■ клеток при оплодотворении in vitro оказывает положительное влияние на результаты дробления и-развития при дальнейдоы культивировании.

7. Совместное культивирование ранних эмбрионов с соматическими клетками репродуктивного тракта коров способствует лрео-_ доленив эмбрионального блока в развитии и тем самым повышает выход ивтактвых эмбрионов пригодных для пересадки реципиентам. •

Б. ПРПИМООЮ

1. Полученные данные рекомендуется использовать в науч-во-исследовательских работах при решении проблем, связанных с культивированием ооцитов коров in vitro. Для оптимизации условий

культивирования ооцитов в замкнутой in vitro-системе использовать

_ * ...

питательную среду ИМИ (модифицированная среда Ыенезо).

ШЮСК ОПУБНПОВШНиХ РАБОТ

I. 1ЬльцеваИ.Ь , Еаябеков Ф.Р. Методические вопросы культивирования и оплодотворения ин витро ооцитов крупного рогатого

скота /Л&злл. научных работ ЕИЖ. -1991; -Еып. 104. -С. 49-52.,

2. Еайбеков Ф. Р. . Мальцева IL R. Результаты культивирования

« . ,

ооцитов коров монослое клеток яйцевода // Тезисы докл. науч. -прак. конференции молодых ученых и специалистов.-Алма-Ата, 1991.-С. 5-6. ' ■ -

3. Еайбеков Ф. Р.. Мальцева И. Е Культивирование и оплодотворение in vitro// Тезису докл. науч.-прак. конференции молодых ученых и специалистов. -Бишкек, 1992.-С-192-194.

4. Se г gee V К. I, . Baibekov F. R. In vitro maturation and in vitro fertilisation of bovine oocytes. // j. Re prod. Dornest. Anim. -1992( Feb. -27(1). -P. 44-45.

4

■ Пмшван» к печет« 3.03.1995 г.

Тирах 90. Овгем 1,0-уч.

ПХП BKX«

-Зака» -изд. я.