Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование метода получения, криоконсервирования и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование метода получения, криоконсервирования и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота"



•ri«

ШРГАГ'-

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКI-! Й ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах pyi.cr.;";;-УДК 612.64 о. 02

Бушманов Василий Иннокентьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ, КРИОКОКСЕРВАЦИИ И ПЕРЕСАДКИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО. РОГАТОГО СКОТА

03.СО. 13. - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канаицага биологических HavK

п. Дубровины .Московской области 199 3

Диссертационная работа выполнена в отделе трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института ЕИБОТноводства

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Е.И.СЕЕГЕЕВ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Ю.Д.КДШСКИЙ,

кандидат биологических наук В.В.ЕИЬЧШНОВ

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский селекционно-генетический институт

Д.020.16.02. при Всероссийской научно-исследовательском институте животноводства

.Адрес института: 142012, Московская обл.. Подольский район, пос. Дубровицы.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке института.

" ' С

Автореферат разослан " " ír'/''^, ' '' '"93 г..

/{/ часов на заседании-специализированного'совета

.Защита диссертации состоится

в

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

и.и.иряшш

I. ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность те.-,и

В настоящее время в области трансплантация эмбрионов накоплен большой фактический объем кнхорглацш, которая мояет быть использована для улучшения технологии трансплантации и является полезной я вне контекста э.убриопересадок для улучшения воспроизводства скота.

Большое теоретическое и практическое значение имеет выяснение роли раглкчннх факторов при гормональном вызывании суперовуляции, оценке качества в пересадке эмбрионов. Главнш сдерзпзащЕМ фактором развитая технология трансплантации до сих пор остается непредсказуемость н нестабильность реакции яичников коров на гонадотропикн.

Для повышения эффективности пересадок эмбрионов перспективны поиски путей регулирования фолликулогенеза для получения максимального возможного числа полноценных эмбрионов.Мак-сж.:алью::: генетпческиЗ прогресс за счет применения трансплантации эмбрионов ожидается в случае, когда от донора получают 10 эмбрионов, а стельность реципиентов составляет 70^.

Вопросы торговли эмбрионами в ветеринарного контроля при их перевозке в настоящее врег/я узе достаточно глубоко обсуждены. Отмечено, что более целесообразно импортировать генетический материал в виде сватах или зашрояенянх эмбрионов, что значительно сникает затраты на транспортировку и карантинные мероприятия по сравнении с завозом скота. При этом риск передачи болезней с эмбрионами самый ыикякгльнкН.

В практическом отношении эффективность трансплантация определяют следующие критерии:

- 50$ пригодность коров для получения эмбрионов путем суперовуляционной обработки и 75-85$ позитивных реакций на гормональную обработку;

- при кавдом успешном промывания получение 5-7 эмбрионов;

- 60-705? зпзяеаюсобнкх эмбрионов от общего числа извле- ■ ченннх при стельности 55-50$. после пересадки;

к

- получение "2-3 телят на каждое успешное промывание.

1.2. Цель и задачи исследований заключались в усовершенствований в разработке наиболее элективных способов гормонального визгвшш; суперовуляцил у коров—доноров | определении влияния некоторых экзогенных и эндогенных факторов на уровень суперовуляцкн, качество и приживляемо с ть эмбрионов после пересадки, а также в изучении влияния гормональной обработки и яехирургического извлечения на послидущую воспроизводительна Функции коров,доноров эмбрионов.

Для реализации данной дели были поставлена следущче задачи:

- провести сравнительную опенку действия гонздо тройных гипафизарянх препаратов разного производства ча уровень супер-евуляцг\л, качестзо эмбрионов и ах пршшзляемость после пересадки:

- изучить влияние эндогенннх и экзогенных факторов па ол-фектиБНОсгх трансплантации эмбрионов з условиях производства;

- определить взаимосвязь концентрации прогестерона и эст-радаола в крови реципиента с прияивляемостью эмбряонра поело пересадки, а такав изучить влияние экзогенного введения прогестерона и сурфагояа на функцию келтого тола у реципиентов

а эмбриональную смертность;

- изучить -£$фехтивносг*ъ многократного использования высокопродуктивных выбракованных коров в качестве доноров эмбрионов;

- провести сравнительную'оценку приживляемоетя свекеяолу-ченных и заморогешю-оттаянных эмбрионов, транспортированных

и полученных в хозяйстве.

1.3. Научная новизна работа состоят в усовершенствовании существующих способов гормонального вызывания суперовуляции у высокопродуктивных коров, определении эффективности многократного использования Еыбракозанных коров в качестве доноров эмбрионов, изучении влияния экзогенного введения прогестерона и сурфагояа на функцию желтого тела у реципиентов и эмбриональную смертность.

- з -

1.4. Практпческая значимость работа заключается в разработке системы целенаправленнсих) отбора коров для гспользоЕаяия их з качестве доноров эмбрионов, сн£~ен£И эмбриональной смертности после нехирургической пересадки и позшкеняи зфректпвяое-тл трансплантация в скотоводстве.

1.5. Апсобагшя работы.

Основные пололендя диссертации долоненк и получили положительную оценку:

- на атегедннх научных конференциях отдела трансплантация эмбрионов о.-х. животных (1939,1990,1991 a I9D2 тт.);

- на Республиканской научной конференции "Достигеапя 6р.о-технологии к перспективы их развития", Львов (октябрь, I9S0 г.);

- ка международной научной конференции "Трансплантация эмбрионов", Краснодар (август, I9SG г.).

1.3. Внедрение

—--- 0

Основные яолоз.ен2я к практические предложения внедрапк з племхозя£ствах 1&зраЁонного плешредприятия "Краснодарское".

1,7. Объа.у.работн.

Лдосертаяил состоит пз ввэденЕЯ, оЗзора литература, ts-.-o-риэла и методов исследования, результатов и обсузд-знзд, выво-дсв а списка литературы¿ Объем работа - 1ТЭ страниц, включая 30 таблиц. Список литературы включает 2QS работ, в том числе 112 иностранных. . -

2. ЖЩШ И КЕГОДЖА. ИССКВДОВАШЙ

Исследования проведены з агрофирме ем. Калинина Каневского района Краснодарского края и в отделе трансплантации зибрх-оноз ШЕа в период с 1938 по IS92 ход на коровах красной степной и черно-пестрой породе в возрасте от трех до двенадцати лет как лактирукщях, так я выбракованных из основного стада. Реципиентами служили телки з возрасте 16—1С месяцев с зивой массой 350-390 кг с синхронизированным я спонтанным половил циклом.

При отборе хквотяЕх-дояоров учитывала общее состояние здоровья, состояние репродуктивной система, периодичность астральных циклов. Гормональную обработку коров-доноров проводили по 4-дневной схе.:е препаратами ОСГ-п (СИЛ) в дезе 32 и 40 кг и феллптрошы (Литва) в дозе 1200 ЗД при наличии в одном из яичников хорошо вкранеаного зелтого тела. Охоту у доноров и реципиентов выявляли двазды в день, утром и вечером, по наличаэ у них рефлекса неподвижности. Осеменяли доко ров дваэды с-штерзалом 12 часов заморохенно-оттаянной сперыо с содержанием не менее 50 «лн спермаев з одной дозе. Донорам в день охоты инъецировали препарат ЛГ "Озогон-ТПО" в дозе 1500 ЕД. Для извлечения зародькел использовали двузгиангльные катетеры модели "ЕоЕштадт-Аш" (ФРГ). Поиск эмбрионов в аром ной среде и оценку их качества осуществляли по метода е BiSIa (1987). В дальнейшем, в зависимости от их качества, перзса.\-са вала свежел олучеяшш или замораживали.

Пересадку эмбрионов осуществляли нехярургически с кспоя зованиеы катетеров £армы "Кассу" (Франция) и "Нойптадт-Айш" (ФРГ). Для снятия напряжения шейка и рогоз маткл применяли сакральную анестезию с дополнительным введением релаксантов.

Замораживанию подвергали эмбрионы отличного и хорошего качества с использованием заыоракпзателя "АС-25" (Франция). Б качестве криопротектора применяли I ,CL! в 1,4'.! раствор глицерина. Насщенле эмбриона криопритектором перед заморозкой, внЕздеяие его и от;«ывку проводили по метедяке ВЛЕа..

Перед гормонально! обработкой у коров брали проб:: крови а определяли концентрации прогестерона а эстрадзола радпэпм-ыунологическиы методом. Весь полученный материал обрабатывал биометрическим методом по Е.К.Меркурьевой (1932).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОйАШЙ

3.1. Влияние различных гормональных препаратов на уровень стпеоовтляцид. качество п аязнеспоссб.чость эыбрг-'онов.

В исследованиях на группе коров красной степной н черно' пестрой пород было определено влияние различных доз гипофиза;

rhx гсру.окоз ее уровень супэровуляции н качество эмбрионов.

Из 133 обработанных коров реагировало суперовуляцией I2G для 94,7£ от числа обработанных. Пслолштельнкх доноров по извлечению зародысей было 106 или 84,2? от числа оперированных. Было извлечено 5,9 зародыша, в т.ч. 5,2 нормальных змбрионоз на донора (табл. I).

Таблица I

Уровень супэровуляции а качество эмбрионов у коров-доноров

Препараты

Показатель фоляптропин *СГ-с, кг ФСГ-п + 1Г

доза

1200 ЕД 32 40 32+15001Щ

Обработано коров 22 82 16. 13 Реагировала суперову-

дяцвеё, а-% 20-90,9 77-33,9 16 13 Число овуляций на

донора 10,1+1,3 9,6+0,5 9,5+1,13 10,1+1,09

Поло&ителъянх доноров по извлечению зародышей, а-% 16-80,0 67-87,0 11-68,8 12-92,3

Число зародааей ва '. " '

донора 6,7+1,22 5,6+0,51 5,6x0,88 7,8+0,98

в т.ч. норлалышх 5,8+1,12 5,2±0;39. 5,0±0,77 .6,2+0,98

Коровы-дозоры,обработанные'5СГ-п в дозв 40 иг л в дозе 32 да в сочетании с "Озогон-ТЛО", 100$ реагировали суперовуляцией, и было получено 9,5 я 10,1 овуляций на донора. При обработке коров фоллигропином результаты были аналогична®. Применение препарата "Овогоя-ГЛО" в сочетании с ФСГ в дозе 32 от обеспечило получение 6,2 нормальных эмбрионов на донора.

Препарат фэллятропин по своему биологическому действии не уступал препарату ФСГ-п (СЦА). Доза фоллктропина 1200 ЕД и ОТ-п - 32 мг является оптимальной. Препарат ЛГ ("Овогон-ГЛО"), оптимизируя продолжительность охоты, .моделирует "биохимическую ситуацию" в катке донора я оказывает благоприятное действие на развитие эмбрионов.

3.2. Нтакядв досопк докога ¡' сезона уода на уровень стаеаовуя.'шие д жизнеспособность эмбрионов Вараебельность в реакции яичников на гонадэтрошшы нахо дггся в пределах от С< м°о 50 овуляцй на донора и связана с лшдкзддуалъ^.т особенностям янвотенх, условиями кормленая е содержания. Коровы молочных пород 2меш более ннзкув озу-ляторзув реанцдв на обработки, чем корови ыяснех пород. Беро ятнО| имеются резлкчия в показателях суперовуляции я среди пород ыолочвого скота (табл. 2).

Табяща 2

Влияние порода донора на уровень суперсвулнцки и качество аабраояов

Порода

Показатель Красная степная Черио-лестрая

ФСГ-а $-млптрап2н оСГ-п фоллагрошс

Обработано коров 21 13 28 9 Реагировало стаьр-

озулдцаей, а-% 20-95,2 11-64,6 25-82,1 ц9-100,0 Число овуляций на

донора 9,9+1,05 15,0±1,49 9,3+1,09 6,0+1,63

ПоЛОЗЕТеЛЬЯНХ доноров цо изЕлеченяв,

в-% 17-85,0 10-30,2 17-68,0 6-86,7 Число зародышей

на донора 5,5+0,81 8,4±1,53 5,7*0,82 3,8+1,16 Процент от числа

озулягвС 55,5 56,0 61.2 63,3 Получено нормальных

эгаЗраонов на донора 4,6±0,69 7,0+1,29 5,210,86 3,.5+1,06 Процент от числа

аародшей 87,2 83,3 91,2 92,1

Нг 71 обработанной коровы суперовулкцией реагировало 65 31,5%. Ео?ох}'.телъкух доноров по извлечению вибрионов было 50, гли 76,ЭЙ от числа оперированиях. Члсло овуляций на до нора красной степной порода при обработка фоллитроаином и ¿СГ-з составило 15,0 2 3,9, черно-пестрой - 6,0 л 9,0 на до-

нора. Доноров,положительных по извлечению эмбрионов,было а группе коров красной степной порода 90,9 я 85,0^, черно-пестрой - 66,7 и 68,0*. По числу извлеченных зародышей на донора коровы красной степной порода превосходили коров черно-пестрой(8,4 и 5,5; 3,8 и соответственней Нормальных эмбрионов на донора было больше у коров красной степной породы. Коровы красной степной породы лучпе реагировали на одинаьовь'е дозы ФСГ, чем черно-пестрые.

Число овуляций на донора в з.-. ; й и осенний периоды было ылзе на 2-4,4 я 19,до сравнении с летним периодом. В весенний и летний периода яеоолодотворенных яйцеклеток было больше на 14,3^, дегенерпрозаяякх алЗрионов - на 90,£$, чем в среднем за ЗШ.ЯИЙ и осенний периода. ЗтшГ; и осенний периода характеризовались более высоким уровней выхода нормальных эмбрионов на донора. Их было больше на "¿4,4 и 46, ЗЯ (табл. 3).

Таблица 3

Влияние сезона года на уровень суперовуляции и качество эмбрионов

Показатель

Обработано коров

Реагировало супер-оьуляцией

Положительных доноров по извлечению заро-

дкшей, п-% 13-75,4 18-78,2 10-76,9 &-75.0 Число овуляций на

донора Ю,7У,18 Ю,1±0,87 6,6+1,16 10,3+1,II

Порчено зародышей

на донора 6,3+0,87 6,5+0,78 6,1±1,01 7,6+1,14 Процент от числа

овуляций 58,0 64,3 70,9 73,7 Число нормальных

эмбрионов на донора 5,810,63 5,0+0,57 4,1+0,33 6,0+1,03

3.3. Злкяние концентрации прогестероне в крови коров_ на уровень _суперовуляпки и качостЕО эмбтаонов

Декабрь-февраль Март- май Ишь-август Сентябрь-ноябрь

~ ~ 18~ ~ ~ ~24 ~ ~ " ~16 ~ " ~ ~13

17 23 13 12

В исследованиях было проведено сопоставление качества келтого тела перед гср:лолально2 обработке;: с уровнем прогестерона и показателями суперовуляпии (табл. 4).

Таблица 4

Взаимосвязь иегду качеством желтых тел, концентрацией прогестерона в крови коров перед гормональной обработкой и реакцией яичников на гонадотропик

Качество желтого тела Показатель --

отличное хорошее удовлетворительное

Обработано коров 19 23 17

Концентрация прогестерона, ет/мл 1,2:0,22 1,5^0,14 1,3+0,14

Реагировало суперовуляцией, п-% 15-78,9 19-82,6 12-70,5

Число овуляций на донора 11,2+1,3 6,8+1,01 5,311,02

Подучено зародышей на донора 4,8+0,92 4,510,65 4,8+0,84

В той числе пор;лзлышх эмбрионов 3,51:0,68 3,010,44 3,1+0,53

Из таблицы 4 видно, что уровень прогестерона в крови коров по группам отличался незначительно. Однако число реа-гирувцих суперозуляцией заметно было меньше в группе коров с удовлетворительными велись телами (70,552). Нэ 12,1/2 их реагировало больше в первой и на 8,45» во второй груше коров. Качество келтого тела незначительно влияло на число овуляций и нормальных эмбрионов. Сопоставление средних-значений концентрации прогестерона в крова доноров с уревке;.' овулядай показало четкою зависимость этих показателей (табл. 5).

Приемлемая реакция яичников на гонадотропин была получена у &3% коров с высокий уровнем прогестерона (2,0 нг/мл). Коровы почти не реагировали на гонадотропин при концентрации прогестерона 0,7 кг/мл. Только 72,2% коров реагировало суперовуляцией с концентрацией прогестерона в крови от 0,7 до 1,1

- Э -

.чгД'л при среднем уровне овуляций 8,5; зародышеЯ-3,5 я нормальных эмбрионов-2,6 на донора (табл. 6).

Таблица 5

Уровень озуляциЯ в зависимости от концентрация прогестерона в крови короз на день гормональной обработки

Количество Число Концентрация Процент от числа

короз овуляций прг^. гтерона, обработшшсс

___ ^ _ _ J^g

27 5-8 1,6 ± 0,14 34,3

29 9 и более 2,0 £ 0,15 35,7

13 отсутствие 0,7 £ 0,18 16,4

пеа:;цкн ла гонадогролия

Таблица 6

Результаты суперозуллгнн а число нормальных эмбрионов у короз при разно:": концентрация прогестерона

Показатель Концентрация прогестерона, кгДш

до 0,7 0,7-1,0 1,1-1,25 1,9-2,0 2,5-5,3

Обработано

короз 13 10 27 16 13

Реагировало супоровудяцшй,

% 7,7 72,2 85,0 90,9 83,2

Число овуляыай

на донора 5,3+1,15 8,510,69 8,3±1,СГ7 11,111,613,2+1,32

Получено зародышей на донора 1,5+1,0 3,5+0,73 3/5+0,75 5,9+1,5 8,5+1,0

В том числе нормальных

эмбрионов 1,210,76 2,410,41 2 ,8±0,53 3,010,62 5,6+1,25

При концентрации нрогесторока от 1,1 до 1,25 нг/:-л суяер-СЕуляцпед реагировало Ьо% короз при среднем числе озуляци;! 8,3,

зародьзей - 3,6; нор:.:альк:к о;.:5рпс;:ов -2,6 на донора. С уве-¿ячешви ковценградш прогестерона с? 1,9 до 2,0 нг/гл асЕ'ка-лось '42ело коров,pedTLpj-Jcua суперозуля-дей,до 90,ЗД; овуляций - до 11,1, зарод-пией-до 5,9, нормальных э:.:бру.онов - до 3,0 на донора. В группе коров, у которьх уровень прогестерона бит. от 2,5 до 5,Li нг/ыл,уровень овуляции достигал 13,2 при час ле зародышей - 8,5 и нормальных эабраоноз - 5-6.

К.з приведенных данных следует, чго туш прогнозирования воз:.:озпой суперозуляцки ¿ишн-ическлх данных состояния яичников не достаточно и они не отраглпп. объективного их ¿ипподогичес-кого состояния.

3.4. Нехпрург.пчоское 'извлечение э:;брг:оноь

В налей работе по определенна эффективности получения зародышей учитывали число полученных зародышей от величины потерь промывной средь:. При получении «алого числа заредыпей относительно числа овуляций проводили повторное про:л!ваняе рогов :.'дткп через 2-2,5 часа после первого. При потерях промывной среды до Ь% от введенной извлекали 48,8% зародышей от числа овуляций, от 5 до 10% - 38,5% и при потерях среды свыше 10>i - 35 ,&%, Повторное промывание рогоз ыаткл позволяло увеличить выход зародыпей при уровне потерь среды до Ь% на 9,2Д, от 5 до 10'4 на 14,45? к свыше 10% на 6,6^. Это свидетельствует о необходимости дальнейшего усовершенствования техники и технологии извлечения.

В назем исследовании на группе коров голптинской порока (п=28) изучено ^-установление половой дпкличностя при однократном вызывании с;- ■■ лэвуляцки и нехирургическоц извлечении заро-дшпей в различные сроки после отела (табл. 7).

- Кз 28 коров в первую охоту было осоменено 7,или 2Ь%, ео вторуэ - 16 (57,Ш и в третьи - 5 коров (17,8;:-).

Сервис-период составил в 1-й группе 27 дней, во второй -117 и в третьей - 142 дня. Гормональное вызывание сулеровуля-цяи и извлечение эмбрионов удлиняло сервис-период у коров-доноров по группам на 31,33 и 37 дней,соответственно.

Таблица 7

Влилнко гормональной обработки к пехирургического извлечения э:.:бриоясв на восстановление воспроизводительно:: ¿.ункхдш

Груши

Показатель

Деиь/лиммт

г

3

Число яизотккх До качала обработка

II

66/62-75

8

£5/¡y.-:ü

э

IC6/CI-12C

От извлечения эмбрионов до 1-й охогк 13/ t>-I-1 12/ 3-1S 13/11-17

До плодотворного

осеменения 3í/I2-o5 ЗЗ/14-ЬЗ ., 37/11-«.-

Поодол-тлтелькость

сервис-периода S7/79-I30 il7/I03-I2I Í42/IC9-I6I

3.5. Зависимость, прлмизляемости эмбрионов от.£тадии пх .развлт:ткачества .и пооддк Д^ора

В процентном отнесении поздних !.:орул и ранних бластондст бгло - 78,4# (45,7 л 32,7,соответственно^ ранних морул -8,6;1 и поздних бластоц^ст - 12,9:5. Эмбрионов отличного л хорошего качества бнло 30,1 и 49,6^, удовлетворительного - 25Й и дегенерированных эмбрионов - 9,8,?.

Было пересажено 25S эмбрионов телка1,-реципиента", из ли;-: 150 эмбрионов от коров краской степной порода u ICO - черзо-пестрой породы. Змбрпоноз отличного и хорошего качества оказалось IS6 л удовлетворительного - 63, в том числе IC4 и 46 от коров красной степной породы н S2 и 17 - черно-пестрой города. Эмбрионы, полученные от доноров разню: пород и при яез-породной пересадке, ямелл одинаковую примикляемость. Несколько вкпе показатель стельности от пересадки эмбрионов бкл у коров чсрно-построй породы по сравнении с красно? степной (табл. Б).

Для вкясяеяля индивидуального влияния коровы на в>*.тявля-омоси s;-:í;-::r:!C2 14 коров-доноров <&дц подвергнутн ::лсгс:-:рг?~ roil гор'.'.с.чй.'хькс.Ч обработке (1-6) прозс-дсч апслиз »•».сстй aburres z с.чг-исимоотя ст -"ячг-пгья.

Таблица 8

Приживляемое ть эмбрионов в зависимости от их качества и порода донора

Показатель

Порода

Всего

красная степная

черно-пестрая

Пересакено эмбрионов

Процент стельности

Стельных реципиентов

150 53 35,3

109 259

43 95

39,5 37,1

В т.ч. эмбрионов отличного и хорошего качества

104 46

92 17

196 63

удовлетворительного

Стельных реципиентов, п-% от пересадка эмбрионов: отличного и хорошего качества

42-40,3 38-41,3 8СМ0,8 11-23,9 5-29,4 16-25,3

удовлетворительного

Из 14 коров 3 (21,4%) не дали из одной прияизлясиости эмбрионов. Призизляеиость эмбрионов отличного качества составила 45,9$, хорошего - 39,85», удовлетворительного - 29,3$. Эмбрионов отличного качества бкло получено 16,8/1, хороших -61,2%, удовлетворительных - 21,9^, дегенрироваянкх - с,7% от общего числа зародышей. Поэтому подбор в группы постоянных доноров целесообразно проводить с учетом прпадзляе.\юстй полученных ох них эмбрионов.

Прияивляемость поздних ыорул отличного и хорошего качества составила 47,1?, ранних бластоцпст - 50^, удовлетворительных - 29,45 в поздних бласгоцисг - 12,5%. Прилсквляемооть условно годных ранних я поздних бластоцкст составила всего 22,2^,

Анализ качества свезеполученякх и за'.:оро:кенно-оттаяннкх зародыпей показал, что большинство из них л:,гели от 1-го до 3-х морфологических отклонений в клеточной структуре. Из 295 исследованных свеких зародышей 44,4/2 не имели видимое морфологических отклонений, и был получен са'-кй высокий процент их прилив-ляеглости (51,9) после нехирургической пересадки телкам-реципиентам (табл. 9).

Габлица 5

Иргкивляемость свезелолучсяных зародаллей после пересадка без в с видолкми морфологическими отклонениями

;.1орЛологичес:сле пРп/>ю~ргп Процент от об- Стельных

отклонения ^ цгго числа реципиентов (а-%)

Морфологически

нормальные 131 44,4 68-51,9 От Ю до 20/2 бласто-

меров разрушены 12 4,1 4-33,3

Неравновесное развитие, выделены бластомеры

с частичным разрушением 34 31,9 28-29,8

Деректы зоны пеллвдида и частичное разрушение

клеточного комплекса 6 2,0 1-1£,7

V

Выделение бластоыеров сопровождалось снияешзеы пргкивля-емостп зародышей на '7,7% (44,2$) по сравнении с зародышами без морфологических отклонений. Призизляемость зародазей с частичным разрушением бластоыеров была еще нияеи составила только 33,3/5. Хотя число их было небольшим (4,1$). Относительно невысокий процент (31,9) составили зародыши с неравномерным развитием, выделенными и частично разрушенными бластомерами. При-зивляемость их была низкой л составила 29,8$ от числа пересаженных. Дефект зоны пеллюцида с частичный разрушением клеточного ко:,шлекса был у незначительного числа зародышей (2$)с лрпнивдяемостью 16,7$.

Замораживание и дательное хранение зародышей заметно снижает их жизнеспособность. Вероятно, это является следствием повреждения зародышей при замораживания и оттаивании.

Из 221 заморокенно-оттаянного зародыша 73, или 33$, не имели вздалогх иораологдчесхях отклонений в структуре клеток, у 14 (6,3$) были выделены бластомеры (10$) паблэдалось частичное разрушение блаогомероз ,уб2 (28,1а) - дефект зоны пеллмцлда или ез полное разрушение к 50 (22,6$) имели несколько отклонений от нормы. Пересадка заморокенко-оттаяшшх заро-

стельносге! (табл. 10)

Таблица 10

ПрпгпБляегость за^оро^нно-оттаянных зародышей в зависимости от ах морфологического качества

Морфологическое

состояние

зародышей

Пеэесазоно зародыией

Процент Стельных от общего реципиентов, числа п - д

числа

Нсхильные, без видима лоотологических отклонений

73 14

33,0 32-43,8 6,3 Б-35,7

10,0 7-31,8

Ьселаяк бластоаерн

Частичное разрушение блас-томероа (от 10 до 20%)

22

Раз пушение или деЗоршцкя

золя пеллщида 62 28,1 19-30,6

Оделены бласюшрн, частичное их разрушение, грануляция клеток в зона 50 22,с 14-28,0

. При наличии морфологических отклонений в зародкпак- при.-лнепосхь хх после пересадки снизалась. Так, при пересадке зг далей с выделенной бластомераыя стельность составив 35,7^, частичным разрртениек бластомеров - 31,85?, с разрушением илг деформацией зонк пеллгцвда - 30,6# и при наличии 2-х и более морфологических изменений стельность была зарегистрирована з 2©% реципиентов, что на 13,8? меньше, по сравнению» с результг ш пересадки нормальных зародыпей.

3.6. Злиянае концентрации прогестерона в крове

В исследованиях изучена приаивляемость эмбрионов в зав; мости от гормонального проаиля перед пересадкой (табл. II).

При низком уровне прогестерона (до I нг/ьи) возрастает : цент рация эстрадкола в среди р.:.-; на 43 пг/ыл прд; коэффициент« изменчивости 52,5%. При таком гормональном профиле дряливля« ¡¡.¡ость эмбрионов очень низкая (II ,1%). С увеличением копцент]

дедипяегчгз на пожкявляемость эмбрионов

цид прогестерона от I до 3 яг/мл сшзается уровень эстрадполя в среднем до 25,6 нг/мл, вариабельность-до 37,7£,и повышается лрияывля&мостъ эмбрионов до 32,4$. Пргведзняне данные показывают, что для получения приемлемой стельности (5С#) концентрация прогестерона в крови зшвоткых должна быть о? 2 до 5 нг/ш:.

Таблица II

Прияивляемость эмбрионов в зависимости от концентрация прогестерона и эстрздиода ь крова реципиентов

Концентрация Число Стелышх реципиентов Процент стельности

прогестерон, . нг/мл эстрг пг/ шол, 'ш 1 * реципиентов

Х),81 + 0,03 48,4 + £.8 ' 19 2 11,7

2,0 + 0,05 25,6 ± 0,9 . Ш 36 . 32,4

3,7 + 0,08 25,7 ± 1,8 44 21 47,7

11,1 1 0,9 26,9 ± 1,7 26 По 42, г

Синхронизация охоты кокет увеличивать изменчззость £ мор-фо-ф7нкциональном состоянии эндометрия у реципиентов и оказывать негативное влияние яа прялшвляеыость эмбрионов (табл.12).

• Тайшша 12

Приживляемо с гь эмбрионов у реципиентов о естественной и синхронизированной охотой в зависимости от гормонального профиля перед пересадкой..

Охота

Показатель -—--.—

спонтанная синхронизированная

Концентрация прогесте- 10,6

рона, нг/ил 1,97 3,5 2,3 3,8 11,9

Зстрадиола, пг/.'лл 26,7 27,3 26,5 21,2 27,3 26,5

Пересзяеяо эмбрионов 87 21 1Э 24 23 7

Стульных реципиентов 32 12 8 4 9 3

Процент стельности 36,8 57,1 42,1 1С ,7 3?, 42,5

При концентрации прогестерона от I до 3 нг/мл стельность при спонтанной охоте составила 36,8£ црстиз 16,?£-в 'сзихроивгк-

роЕаанузз охоту, от 3,5 до 3,8 нг/ил - 57,1 л 39,1%, соответст; но. Оздаагозая прняавлаеыость эмбрионов в грушах была при ко: центрацни прогестерона свкле 10 ег/ыл(42,1 а 42,6,«').

Ира уровне прогестерона до I нг/:лд прпгазляеаость эабряо-ноз.кезазисило' от ах качества.бкла очень низкой. С повышением его концентрации узелпчпвачась и приззвляеиоста эцбриэков отличного и хорошего качества. Так, при концентрации прогестерона от I до 2 ягДк стельность составила 40,5,«; от 3-5 нгДи -56,» л более 5 нг/ит - 50;». Аналогичные результаты били получены при пересадке эмбрионов удовлетворительного качества, но при это»: прссле-иизазтся Ep.-2.ss: зависимость результатов стельности от гормонального провидя и качества э:лсрпсноз. При уроз-за прогестерона от I до 3 нг/ил стельность составила 21,75?, о; 3-5 егаи - 38,9^, более 5 нг/ил - 31,2% (табл. 13).

Таблица 13

Результаты перс-садки глбрионов в зависимости от их качества а гормонального профиля в крови реципиентов

Концентрация _Качество эмбрионов

прогестерона, _отличные а хозо^е_<-.

нг/мд пересажено стельных процент _________;___гм3£2онов_ _ ое^ил^&нтоэ стельности

0,792 оТо! 13 ' I 7,7

2,1 г 0,07 64 26 40,6

3,7 I 0,09 25 14 56,0

12,3 + 1,3 12 6 50,0

удовлетворительные

0,89 + 0,05 6 I 16,7

1,9 10,09 ' - 46 - 10 21,7

3,7 + 6,10 18 7 38,9

3,9 t 1,7 16 5 31,2

Телкам-реципиентам за 45 часов до пересадки инъецировали до 30 иг 1,«-го масляного раствора прогестерона (табл. 14).

Ери введении экзогенного прогестерона заметно повышалась его козцэятрацпя в крови с колебания!® от 1,6 до 11,2 нгДи, при стабильном уровне гстрадпола (22,3-23,2 пг/цл). Отпечено

заветное увеличение процента етельнссгей после пересадки еаио-рог.енно-о паянных зубрпоноз. Так, з контроле при концентрагдг. прогестерона до I нг/мд стельность не зарегистрирована, от 1 до 3 нт/ил ока составила 37,55», от 3,6 до 10,4 нгД'л - 44,45». В опыте при концентрации от 1,6 до 3,0 ягД'л - 40,от 3,1. до 4,3 нг/.-.к - 42,1 и 6,9 - до 11,2 нг/мл - 505?.

Таблица 14

Влияние экзогенного прогестерона ва пригдвляемость зш.:ораяеяко-оттаянных экбрисаов

показатель

Группы

экзогенный прогестерон

32,1 25,8 20,7 22,3 23,2 ® 22,5

7 8 9 10 14 16

- 3 4 4 6 6

- 37,5 44,4 40,0 42,1 50,0

Прогестерон.

кг/1,их 0,66-1,0 1,0-3,0 3,6-10,4 1,5-3,0 3,1-4,5 6,9-11,1

Эстрадаол, 4

пгДи

Пересажено о.\йрлонов

Стельных реципиентов

Пооцент стельности

3.7. Влияние замораживания и оттаивания на а; зн есп особио сть , змбрионов

Исследования проБедены на 233 эмбриона:: на разных стадиях развития и качества.

После оттаивания пригодных к пересадке оказалось 190 эмбрионов или 81,5$. Общая стельность телок-рецкпкентов составила 36,8%. Жизнеспособность эмбрионоз при захоранивании и оттаква-нлп зависела от стадии их развития (табл. 15).

Прк.7л!вляе;.юсть заморозекно-оттаянннх эмбрионов была более высокой при пересадке поздних бластоцнст (44%). Ника этот показатель был у поздних ;.:орул (33,7%) и ранних бластоцнст (37,5£}.

Было определено влияние качества зкбрнонсз после заг.орзз1> ваяля, оттаивания л пересадки на их прияквляемость (табл. 16).

Таблица 15

Жизнеспособность я прикпвляемость эмбрионов в зависимости от стадии развитии

Показатель

Общее число

морулн поздние

Стадия развития

бластоиисты

ранние

поздние

Заморожено и оттаяно эмбрионов

233

98

104

Количество

пересадок 190 77 Стельных

реципиентов 70 26

Процент стельности 3£,8 33,7

33

37,5

31

Пригодных к пересадке (л -%) 150-81,5 77-78,5 88-84,6 25-80,6

25 II

44,0

Таблица 16

ПрляЕкляшость за.\юрохешо-оттаяшшх эмбрионов разного качества

Качество эмбрионов

Пересажено эмбрионов

■ Стельных ' реципиентов.

~34 " "

18 17

т

Процент стельности

Отличные 71

Хорошие 41

Удовлетворительные 54

Условно годные 24

47,9 43,9 31,5 4,?-

: При пересадке эмбрионов отличного и хорошего качества была получена высокая пргсшзляекоргь. за^оропдакно-рттачшшх эмбрионов (47,8 и 43,9$). Пересадка удовлетворительных и условно год ных эабрионоЕ сопровождалась низкой пралявляемостьз (31,6 и

Отмечено усиление криозацитного действия повышенной концентрации глицерина при насыценйи клбраонов в четыре этапа. Почта при одинаковой выживаемости эмбрионов процент их приккз-ляемости был несколько выше. Прзживляемость эмбрионов заморо-

йЯ'ш:-: в 1,4!.! гляцсрьне составила 41,2%, а в 1,Ш глицерине -3,1£. Применение раствора сахарозы ускоряло я упрощало сод-этоЕку эцбрдоков к пересадке при вполне приеглешсс результате стельности (тайл. 17).

Таллина 17

Лизнеслособность я при-лвл^емосгь эмбрионов в зависимости от способз удаления ¡сряоаротектора при оттаивании

Сггаьвачле

Указатель i»4-М без 17£Г с'са- 1,ил с са- J.„4jJ с са-

сахарозы харозой хаоозой харозой

4 этапа 3 этапа 3 Irans I этап

щоооаена и от-1ЧЯ0 ьмбрпенов 41 44 35 34

а-ц'одных к передке, п-% 34-22,9 37- -84,1 29-82,9 •28-32,3

;оло реципиентов 34 37 26 20

■•эльных реципи-ТОБ 14 13 о 6 6

одскт стельности 41,2 35,1 23,1 30,0

За'.-:ораглвеняе в медленном рв:?лшз и при 4-х этапном удале-

и крпопротектора без раствора сахароза, после оттаивания ока-лись пригодны:.® для пересадки 62,9$ эмбрионов..

Нами сделана попытка транспортировки глубокозаморозеянгас орионов на дальние расстояния с оттаиванием и пересадкой их условиях фермы. Эмбрионы, полученные от г.ороз-доноров черно-строй породи, была заморожены, хранились в зидком азоте более • аэсяцев я поездом из Дубровяц (ЕЙЯ) бшш перевезены в колхоз . Калинина Краснодарского края. На ферме они были оттаяны и зесазены 72 телкаи-реципиентам красно-степной породы. В ре-тьтате било получено 23 теленка; II телочек и 12 бычкев 1бл. 18).

Таблица 16

Результаты пересадки заморояенно-огтаянньи транспортированных эмбрионов

Показатель

Качество эмбрионов

отличные хорозше

удовлетво- условно-рптелыше годные

Пересалено эмбрионоз Стельных реципиентов Процент стельности Получено талят

15 7

46,7

16 32 5 9

31,3 26,1 5 9

9 2

22,2

т

Общая стельность от пересадки заморозенно-оттаянныхэмбрионов составила 32,

1. Препарат ФСГ (фрллитрошш) Литовского производства по своему биологическому действию не уступает ФЗГ-п производства СМ. Включение в схему гормональной обработки препарата ЛЕГ "Оаогоя-Тио" увеличивает число овуляций и выход нормальных эмб рионов до 6,2 на донора. Коровы красно-степной породы превосхо дали черно-пестрых по числу овуляций и нормальных эмбрионов. Оптимально!! дозо2 ФСГ-п (США) и фоллитроаина следует считать 32 ыг и 1200 ЕЛ,

2. Сезон года оказывает определенное влияние

на уровень суперовуляции в выход нормальных эмбрионов. В осеняй::, зимний и весенний периоды нормальных эмбрионов можно полу чить на 24-£6^ больше, чем в летний период. Коровы красно-степ ной породы лучше реагирует на одни и те зе дозы препаратов ОСТ чем черно-пестрые. Установлена прямая связь концентрации прогестерона в крови коров-донороз перед обработкой с качество;.: желтого тела, числом овуляций и нормальных эмбрионов.

3. Однократная гормональная обработка и нехдрур-гнчесхое извлечение не оказывает отрицательного влияния на последуацуи воспроизводительную способность коров. В первую охоту мохно плодотворно осеменить 25%, во вторую - 57,1$ и в третью - 17,8; ::оров. Серзис-период при гормональной обработке зависит от яа-

4. ВЫВОДЫ И ПЕАКП1ЧЕС1Ш ПЕЗДЯОлЕШЯ

чала использования коров поело отела 'в качестве доноров гмбрн-онов. ЗДфектиЕНОсть извлечения зародышей зависит от потер., среды при промывании рогов матки. При потерях среды от введенной до Ь% эффективность извлечения зародышей от числа овуляций со-, ставляат 48,В%, от 5 до 10% - 38,555 и более 1055 - 35,82. Повторное промывание рогов матки позволяет увеличить выход зародышей на 9,2, 14,4 и 6,6%, соответственно потерям промывной среда.

4. На 7-й день извлечения эмбрионов в средней получают до В,б£ ранних и 45-поздних мору-. 32,1% ранних а 12,9« поздних бластоцист. Эмбрионов отличного качества - 30,1%, хорошего -49,б/а, удовлетворительного - 25% и дегенерированнкх - 9,8%. Пригивляемость змбрионоз зависит от стадии их развития и качества. Чем больше повра-здений, тем нине прияивляемость свемеполу-ченкых и за:.;оромеш-:о-отЕаякных эмбрионов. Доноры разных пород при ыезпородной пересадке илевт одинаковую ириниьдиемость.

5. Установлена связь концентрации прогестерона в крови реципиентов с приживляемо стью эмбрионов по еле? пересадки. Для получения приемлемой стельности (50$) концентрация прогестерона

в крови реципиентов долина быть от 2 до 5 нгАш. Инъекция экзогенного прогестерона повышает концентрацию его в крови животного и сопровождается удушением прияивляемости эмбрионов.

6. Пересадка замороленно-оттаяниь!*эмбрионов отличного и хорошего качества обеспечивает более 50% их пряхивляеглости после нехирургической пересадил.Увеличение концентрации глицерина до 1,4М и применение раствора сахарозы при оттаивании повышает яизнеспособнссть и прпаивяяеыость эмбрионов.

Практические предложения. Дяя увеличения числа овуляций, выхода нормальных1 эмбрионов рекомендуется применять препарат ЛГ в дозе по 15С0 ¡2 под первое и второе осеменение. Для повы- . иония прцмлвляемости эмбрионов - инъецировать .экзогенный 1$-ый наслянк-Л раствор прогестерона в дозе 30 мг за 52 часа до пересадки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Сергеев Н.И., Лебедев В.И., Ефремова ¡Л.Н., Смыслова Н.И. Г.улшнов 3.1!. Трансплантация эмбрионов в практике скотоводства

•

•и

//Зоотехния. - 1991. - №10. - С. 54-58.

2. Смыслова Н.И., Бушмаиов В.И. Влияние некоторых факторов на жизнеспособность и приживляемссть заморо-женно-оттаянных эмбрионов. //Бюллетень ВАСХНИЛ. Вып. 104 - Дубровины . - 1991. - С. 72-7 5.

3. Бушмаиов В.И.х Смыслова Н.И. Уровень суперову-ляшпг, качество и пршкивляемость эмбрионов у коров различным пород //Бюллетень ВАСХНИЛ Вып. 104. - Дубровины. - 1991. - С. 18-21.

4. Бушманов В.К. Опыт применения метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота //Информационный листок - ЦН^И. - Краснодар - 1990. - №4-90. -С. 1-4,

Г! .'ЛИ зила