Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие внутриклеточных посредников в электрических ответах нервной клетки на физиологические воздействия

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Участие внутриклеточных посредников в электрических ответах нервной клетки на физиологические воздействия"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЖШНОСОЗА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СОЛНЦЕВА Елена Ивановна

УЧАСТИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ОТВЕТАХ НЕРЗНОй КЛЕТКИ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ

03.00.13 -физиоло1'ия человека и животных

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Научно исследовательском институте

мозга АМН СССР

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Тушмалоза H.A. Доктор биологических наук, профессор Воронин Л.Л. Доктор биологических наук, профессор Сахаров Д.А.

Ведущая организация:

Институт нормальной физиологии им.П.К.Анохина АМН СССР

специализированного совета Д.053.05.35 при Московском Государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, М1У, биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

Защита состоится

| ( WjCUÜO'fJl I9SI года на заседании

УчёныГ, секретарь

специализированного сое< канд.б'юл.науь

J

1 - .

-I -

ОБОЙЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

!2Р.£.ь_32255л£мй« Электрический ответ нервной клетки ка фи-

зиологические воздействия обусловлен изменением работа ионных каналов плазматической мембрана. Во многих случаях рецепторы к физиологически активным веществам имеют с ионными каналами не прямую, 1 опосредованную связь. Проме«уточными звеньями в таких случаях выступают мембранные Г"Ш-связывающие белки и ферменты, а также большая группа цитоплазматических низкомоленулярнкх соединений, получивших название вторичных, посредников. На сегодняшний день к группе вторичных посредников, способных регулировать ионные накалы, относят: циклический аденозинмонофосфат (цАМ$), циклический гуанозинмонофосфат (цПА5), ионы продукты гидролиза инозито-

ловнх фосфолипидов, метаболиты арахидоновой кислоты ( 11еес11еиап ет а1 1986, НеЬег 1988, ШоохЬгоек & Иааз 1988).

Изучение особенностей внутриклеточного Опосредования ответа нейрона на то или иное физиологическое воздействие является актуальной проблемой нейрофизиологии, поскольку знание этих особенностей не только расширяет наши представления о фундаментальных основах деятельности нейрона, но и позволяет направленно регулировать физиологический ответ клетки.

В работе изучались особенности внутриклеточного опосредования электрических ответов нейрона на ряд физиологически активных соединений. В эту группу вошли: нейромедиаторы-серотонин и дофамин, нейромодуляторы -морфин и энкефалины, а также некоторые вида про -тивоысзгоеых антител, предположительно участвующих в патогенезе шизофрении ( Jaлkovic е-ь а! 1980-1965). На первый взгляд, эта группа соединений выглядит весьма разнородной. Однако, как показали наши исследования, все эти соединения обладают общим свойством, которое

заключается в том, что вызванные ими электрофизиологические ответа нейрона развивается с учаатиеы одного и того же вторичного посредника -цАШ. При этом важно откатить, что способы регуляции уровня цАМФ, типы ионных каналов» задействованных в ответе, и ке ханизмы управления конными каналами цА10-ом отличаются в ответах нейрона на разные физиологические воздействия.

Большинство наших экспериментов проведено на нейронах виногра ной улитки. Ута модель приобрела широкую популярность при исследовании взаимодействия вторичных посредников с ионными каналами (Костюк 1986, Gerscheafeld et al 1986), благодаря крупным разме рам клеток, позволяющим осуществлять длительную внутриклеточную регистрации потенциалов и ионных токов, а также инъецировать внутрь клетки вторичные посредники.

Цель и задачи исследования,

Целью диссертационной работы являлось изучение роли вторичных посредников в электрических ответах нервной клетки на некоторые физиологические воздействия.

В ходе исследования решались следующие задачи:

-Изучение электрофизиологических эффектов иммуноглобулинов, в деленных из сыворотки крови больных шизофренией, а также антител к белкам S-I00 ( AS -ICO) и выявление роли внутриклеточных посредников в эффектах AS-ЮО.

-Изучение механизмов ингибирующего влияния цАЬ® на потенциалз висимыв Са^-каналы.

-Изучение опосредования циклическими нуклеотидами возбуждавших ответов нейронов моллюска на серотонин и дофамин.

-Исследование роли цАШ>-системы в модуляции иейроыедиаторных ответов морфином и знкефалинами.

Новщна_получ^ных_результатов.

В работе впервые получены следующие результаты.

Изучены электрофизкологкческие эффекты нейрона на аппликации ютител к белкам мозга человека, иммуноглобулинов сыворотки крози юльньк шизофренией, а также АБ -100. Показано участие вторичных юсредников -ионов Са*"+ и цА1й в электрических ответах нейрона ;а АЯ-ЮО. Установлено, что антитела к другим мозговым белкам зазывают эффекты, отличные от эффектов АЗ -100.

Исследованы механизмы снижения цАМФ-ом пиковой амплитуды 1 ускорения его спада. Получены результаты, позволяющие предполагать, что указанные эффекта цА№ связаны с дефо сформированием ак-гивационного и инактивационного субстратов Са*"+-канала.

Обнаружено, что возбуждающие ответы на серотонин (5-НТ) и дофа-«ш (ДА) в разных нейронах сеязэны с активацией или инактивацией трёх различных типов ионных каналов. Показано, что возбуждающие ответы на 5-НТ и ДА связаны с: повышением уровня цА!Й в клетке.

Установлено, что морфин ШО) и энкефалины ингибируют возбукда-гацие ответы нейрона ка 5-НТ и ДА. Получены результаты, позволяющие предполагать, что указанные эффекты МО и энкефаликов связаны с понижением уровня цАМФ в клетке.

бучены механизмы влияния МО и энкефалинов на деполяризацию, вызванную аппликацией ацетилхолина.

Выявление роли внутриклеточных ионов и цА5@ в электрсфизи-ологическюс эффектах противсмоэгоЕнх антител необходимо для понимания механизмов действия противомозговых антител, углубляет представления аутоиммунной концепции шизофрении, стимулирует поиск новых путей для коррекции мозговых функций при шизофрении.

Полученные данные о регуляции Са^+-какалов кейрональной мембрана ьторичныии посредниками, а также об участии цАМЕ-систеш в ответах нейрона на -5-НГ и ДА. явяялтся вакнкми для понимания фундаментальных основ деятельности нервной клетки и расширяют наши представления о связи между работой ионных каналов нейро-нальной мембраны и внутриклеточным метаболизмом.

Данные об участии цАШ-систаш в нейромодулятооных эффектах МО и энкефаликов расширяют наши представления о ызхашэмах действия этих физиологически активных веществ и могу? способствовать более целенаправленному их применению в клинике.

Результаты и выроди работы могут бить использованы при чтении курсов по нейрофизиологии, нейроиммунологии и нейрофармако-логии.

Результаты работы были представлены на:

11-ом и 12-ом Международных Конгрессах по нейролсихофармако-логик, Вена 1978 г., Гете борг 1980г; 5-ом Всесоюзно»! семинаре "Гкгеграгивная деятельность кеГфона", Москва 1979г; 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде, Москва 1982г.; Всесоюзном симпозиуме "Механизмы пластичности мозга", Махачкала 1982р.; 3-ей Зсесо. юзкой конференция по биологической психиатрии, Москва 1984г.; Всесоюзном сгагпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти", Пущико 1984г.; Всесоюзной конференции "Современные аспекты нейропсихоиыыунологии", Воронеж 1985г.; 4-ой Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов", Москва 1985г.; 1-ой и 2-ой Всесоюзных конференциях по иейронаукам, Киев 1986 и 1988г.; 3-е* СССР-ФРГ симпозиуме "Возбудимые мембраны" » Киев 1987г.; 1-ом съезде психим/роз социалистических стран, Москва 1987г.; 10-ом объединенном симпозиуме биохимичес-

ких обществ СССР-ГДР, Ташкент 1989г.; Международном стапозиуиб "Транспорт ионов и механизма его регуляции", Тбилиси 1989г.; Всесоюзной симпозиуме "Конше каналы з биологических иеибранах? Кара-даг 1990г.; Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия кедиаторньк процессов", Москва 1990г.; III Всесоюзной конференции по нейронауяам, Киев 1990г.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания катодов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований я четырех глазах, заклвчания, выводов, списка, литературы. Общий объем диссертации - 247 страниц. Библиография - 363 источника.

По теме диссертации опубликовано 26 статей и 20 тезисов.

МЕТОДУ КС-СЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проводили на Ч.н.с. активных взрослых особей днух близких видов виноградной улитки: Helix pomatia и Helix агрегзаВ большинства экспериментов нейроны идентифицировали в соответствии с классификацией Д.. А. Сахарова (1974).

Изоляция нейронов производилась как с предварнтольной обработкой ганглиев трипсином (0,5% рествор), так и без нее с по-ксщью заточенных нгл под контролем стереоыикроскопа. Гигантские идентифицированные нейроны большой частью плохо переносили процедуру изоляции. В связи с этим большинство экспериментов проведено на кеидентифицировакных нейронах средних размеров (50-70 мкм). 2-1-113

- Е -

Срезы гиппокаыпа мозга крысы

Эксперименты на срезах гиппокаыш мозга крыс проведены с участием канд. биол. наук Воробьева B.C. на собранной им установке. Подробно эта методика описана в диссертации B.C. Воробьева (1982).

В опытах использовали крыс линии »'¿star . Срезы находились ■на капроновой сетке и омывались снизу солевым раствором Хенкса. В поле CAj- регистрировали внутриклеточную активность пирамидных нейронов и популяционный слайк, который вызывали стимуляцией коллатаралей Шаффера. Для внутриклеточной записи использовали стеклянные микропипетки, заполненные 2 моль/л раствором цитрата К4" и имеющие сопротивление 40-50 мОм. Микроотгедеиие и стимуляция производились пипетками, заполненными перфузирующим раствором. Электрическую активность среза регистрировали с помощью усилителя К S-7041 С , США) и обрабатывали на микроэвм babtam -3015.

Внеклеточная микроаппликация и макроаппликация

На поверхность регистрируемого нейрона через внеклеточную микропипетку апплицировали следующие вещества (в скобках указана концентрация вещества в микротшетке в моль/л): АХ (0,1), 5-НТ (0,5), ДА (0,5), МО (0,05), мет-энкефалин (0,1), лей-энке-фалин (0,1), растворы белков (4 мг/мл). Дня выведения вещества из микропипетки использовали метод микроионофореза (Крастс I97J Александров 1983) или повышение давления в микропипетке.

М&кроаппдотацию препаратов производили в окружающий клетку раствор с помощью шприца при перекрытом протоке.

Внутриклеточная инъекция

Через внутриклеточные микроэлектроды в нейроны виноградной улитки инъецировали следующие препараты (в скобках указана кон-

центрация вещества в микроэлектроде в моль/л): ц/Ш® (0,1), Ь'Ш (0,1), цПЙ (ОД), ЭГТА (0,2), теофиллин (0,1), К*1 (I), Г13? (0,1). Выведение веществ из микроэлектрода осуществляли с помощью микроионофореза или под давлением. Для внутриклеточного микроионофореза использоеоли самодельный 4-канальный микроиньек-тор. Токи инъекции пропускали между стволами многоствольного микрсэлектрода, используя в качестве индифферентного электрода ствол, заполненный раствором 2 моль/л цитрата К1". Сила токов инъекции составляла 10-30 иА, длительность I с-5 минут. Между инъекциями включали "аапиращий" ток силой 2-4 нА.

При инъекции под давлением сила давления в микропипетке составляла 15-30 psi , длительность - 0,5-1 с.

Микрсэлектродная установка для работы с нервными ганглиями виноградной улитки.

Эксперименты проводили в режиме фиксации тока. Для измерения потенциалов и пропускания тока с целью смещения МП применяли два раздельных минроэлектро.да или один двухствольный микроэлектрод, заполненный раствором 2 моль/л цитрата калия. Установка собрана из приборов японской фирмы Hihoa Kohden . Сигнал от клетки через микроэлектрод поступал на микроэлактродный усилитель MEZ -7101 и затеи на осциллограф VC-9. Параллельно с осциллографом соединяли 4-канальный чернильный самописец hjg 4024.

Микроэлектродная установка для работа с_изолироаа;тыш1[_ней- _ ронаии виноградной улитки.

На изолированных нейронах виноградной улитки эксперименты проводили в рекике фиксации потенциала.Для регистрации потенциала и пропускания тока обратной связи в клетку вводили два шкроэлектрода, заполненных 2 иоль/л раствором цитрата К4". В тех случаях, когда одновременно с фиксацией потенциала применя-

-Ö -

ли внутриклеточную кньекцкю фармакологических препаратов , один из кикроэлектродов был многоствольным, В указанных условиях изолированные нервные клетки сохраняли яизнедеятельность и генерировали стабильные трансыоыбранные токи (включая Iq3) в течание нескольких часов.

Установка включала г себя приборы японской фирмы iiihon Kohden : микроэлёктроцныЯ усилитель иг -7101, осциллограф ус » стимулятор SEN -7103, шаговый генератор s-8300, усилятсяь фиксации напряжения СЕ z -1100, чернильный самописец rjg-4024, фотсрегистрируюцую приставку РС-2А. Потеициалзависимые токи регистрировали при деполяризующих смещениях потенциала от удер-кяваемого потенциала -бО-т-ЬО иВ. Время переходных процессов при ступенчатом смещении потенциала составляло 0,1-1 не.

РЕЗУЛЬТАТЫ МХЛЕДОВМШЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

-• Родь вторичных посредников в электрофизиологических

I.I. Влияние рнтисыяороткк к 5&лхем иоагя чалоьека на алект-

Данное исследование было предпринято с целью доказательства воеможности использования нейронов виноградной улитки в кячест-I© модели при изучении элехтрофкзиологических эффектов противо-мозговых антител человека.

Иммунная сыворотка производилась к.б.н. Кушнзр С.Г. в лаборатории клинической иммунологии ВКЦПЗ АМН СССР (Москве). Подробное описание получения иммунной сыворотки г. белкам мозга человека представлено s работе (Солнцева

и Кушкер, 1978). В контрольных экспериментах использоелли еыьсротку крови неиммушзи-рованных кроликов.

Изучали изменение мембранного потенциала (МП) и амплитуды

потенциалов действия (ДД) нейронов группы у висцерального ганглия. Реакция нейронов на противомозговую сыворотку характеризовалась деполяризацией мембраны на 3-30 мВ и уменьшением *мп~ литуды ПД часто вплоть до 0. Латентный период реакции составлял 2-10 минут. При отмывании препарата от гаедуниой сыворотки контрольным раствором в большинстве экспериментов удавалось наблюдать частичное или полное восстановление ЫП и ДЦ через 10-20 минут. Указанная реакция на иммунную сыворотку наблюдалась в большей или меньшей степени у всех 18 исследованных нейронов. В контрольных экспериментах с неиммунной сывороткой лишь у 4 нейронов из 15 наблюдалась незначительная (1-3 иВ) деполяризация мембраны и частичное уменьшение амплитуды ПД. Для количественной оценки результатов использовался показатель скорости уменьшения амплитуды ПД —-- , где ь А - изменение амплитуды ПД ( %), . время, за которое произошло наблюдаемое изменение ПД. Средние показатели нейротропкой активности иммунной и контрольной сыворотки кроликов соответственно составляют 4,0 ¿1,1 и 1,0 ± 0,3 и имеют достоверное различие (р < 0,01),

Результаты позволяют предполагать, что в поверхностной мембране не?фоноз виноградной улитки белки, участвующие в генезе биопотенциалов, имеют общие свойстве с белками мозга человека. Эти результаты соответствуют данным" литературы об эволюционной стабильности многих.мозговых белков (Штарк 1978, 1985) и позволяют считать нейроны виноградной улитки выгодной моделью при проведении икмукнонейрофиэиологических исследований.

1.2. Действие иммуноглобулинов сыворотки крови больных

шизофренией на потенциалы нервной клетки.

Предпосылкой для этих исследований послу пили, с одной сторо-

3-1413

ны, результаты иммунологических работ, в которых было показано повышение уровня противомозговых антител в сыворотке крови больных шизофренией (Колясккна и Кутнер 1969« Rabia al 1986) и, с другой стороны, данные некоторых алектрофизиологи-ческих работ, свидетельствующие об изменении суммарной электрической активности мозга экспериментальных нивотгаи под влиянием иммуноглобулинов сыворотки кроЕи больных шизофренией С яеа'сЪ and Krupp 1967, Bergea et al I960).

В работе использовали сыворотку крови 10 больных: шизофренией и 10 здоровых людей. Фракционирование белков сыворотки крови производила к.б.н. М.И. Фактор в лаборатории клинической биохимии ВНЦПЗ АЫН СССР (Москва). Всего эдюировали 9 фракций. Наличие иммуноглобулинов классов , IsМ и l&k з каждой фракции определяли на шмунодиффузионшх пластинках. Подробное описание фракционирования сыворотки крови и определения содержания белков во фракциях содержится в работе (Солнцева и Фактор 1979). В эдектрсфигиологичес.ких зкспериивнт&х изучалась способность каждой из балконах фракций сиворстхк больного шизофренией кли здорового человека влиять ка МП и ПД нзйроно» группы F виноградной улитки. Обнаружено, что сыворотка. кро»и больных шизофренией, а также некоторые из ее белковых фракций, содержащих иммуноглобулины, оказывают выраженный эффект на электрическую активность нейронов. Эффект заключается в снижении амплитуда ПД вплоть до полного угнетения их генерации ка фоне более или менее выраженной деполяризации мембраны (от 2 до 30 мВ) (рис.1)/ В ряде экспериментов уменьшение амплитуды ПД происходило без заметной деполяризации мембраны. Указанные эффекты были частично или полностью обратимы пси отмывании препарата контрольны}.! раствором в течение 10-30 минут.

- и -

о

-50мВ

чЬОмЗ О

-ЬОмВ

XXX ...4—и.....

КСН1Р.

1

-и

КОНТР,

4РАЩИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА

15' 30-

ФРАКЦИЯ СЫВОРОТКИ ЙРОВИ БОЛЬНОГО ¡ЖЗОФРЕНШ

и-

ошв.

01ШВ.

1с

Рис Л.

Количественную оченку наблюдаемого электрсфиэяологичзского эффекта производили так же, как и в разделе 1.1., т.е. по скорости снижения амплитуда ПД. Средние значения этих показателей цля сг орогки крови больных шизофренией и здоровых людей составляли соответственно 2,0^0,4 и 0,8^0,4 и достоверно отличались (р-с 0,05). Достоверно более высокой нэйротропной активностью обладала такяе одна из белковых фракций сыворотки крови больных шизофренией, содержащая 1бМ. Средние показатели нзйротропной активности данной фракции сыворотки крови больных шизофренией и здоровых людей соответственно составляли: 2,2^0,4 и 0,6^0,2, р-< 0,01. Бзлковыэ фракции сыворотки крови больных шизофренией, не содержащие иммуноглобулинов, повышенной кейротропной активностью кз обладали.

Полученные результаты указывают на содержание в сыворотке крови больных шизофренией повышенного количества противомозговых антител, способных характерным образом изменять олектрлчесхул активность нейронов.

AS-100

А

Б

В

1_Г

10' 20 50 40 мин

Рис.2.

1.3. Влияние антител к группе белков s -100 ( -100) на электрическую активность нейронов виноградной улитки. Согласно литературным данным в сыворотке крови больных пизо-френией содержится повышенное количество антител к белкам S _хоо ( JaxOsoriS efe al 1980, 1982, 1985). В связи с этим представляло интерес сравнить эффекты антител к белкам s-100 (-100) с эффектами иммуноглобулинов сыворотки крови больных шизофренией.

AS _Ю0 производили в Центре иммунологических исследований в г. Белграде (Югославия) и в Институте нормальной физиологии им. Анохина в Москве. Подробное изложение приготовления -100 имеется в работе (Беляев и др. 1981). В контрольных эксперимен-

тах использовали Х-глобулиноьуа фракцию крови неиммунизированнцх кроликов.

Эксперимента проводили на нейронах В4, Вл, Ша?, г . Количественна оценивали изменение величины №, амплитуды ПД и относительной величины р. 0Х. Под влиянием неиммунных гакиа-глобуди-нов достоверного изменения указанных параметров электрической активности нейронов не обнаружено (п=20). На этих же нейронах через 30 минут после отмывания их контрольный раствором исследовали влияние аб -100. Антитела вызывали выраженные изменения в электрической активности нейронов (п=£7), которые развивались с небольшим латентным периодом (менее 3 минут) и проявлялись в резком учащении ПД в первые 1-2 минуты и последующем снижении их амплитуды вплоть до полного прекращения генерации спайксв через 30 ищут или менее. При этом препотенциалы синаптэтесксй или аутогенной природа продолжали регистрироваться. Уменьшение Ш1 и квх составляло в среднем 8-3 иВ я 19-6$ соответственно. Длительная искусственная гиперполяризация мембраны до уровня МП, близкого к исходному, приводила к восстановлению амплитуды ПД до 20-50% с? начальной величины. Отмывание препарата контрольным раствором вызывало достаточно полное (90-100$) восстановление измененных характеристик электрической активности нейрона через 10-20 минут.

При проведении экспериментов в безнатриевом растворе, где ПД имели чисто Са^+-природу, аппликация АЗ-100 также вызывала деполяризацию мембраны и угнетение генерации ПД. Эти результаты указывают на то, что под влиянием дз-ЮО увеличивается проводимость неселективных омических каналов и снижается потенциалзави-симая Са^+-прозодимость.

1.4. Эффект А8-100 на электрическую активность срезов

-£2222£§!522д.

&--4Т3

Учитывая возможные отличия участия группы белков д -ЮО в электрогенезе нейронов ыоллэска и нейронов млекопитающих представлялось целесообразным изучить эффекты да-ЮО также к на нейронах млекопитающих.

Настоящая работа проведена на пирамидных нейронах срезов гиппокампа мозга крысы и представляет собой первую попытку изучения эффектов -АЗ -ЮО при внутриклеточном отведении потенциалов от нейронов млекопитающих.

Перфузия срезов гиппокампа (и=5) в течение 10 минут раствором, содержащим 50 мкг/мл контрольного гам,и-глобулина, не вызывала заметных изменений амплитуды поп-спайка, а также электрических параметров внутриклеточной активности пирамидных нейронов; Ш, возбуждающих постсинаптических потенциалов (ШСП) и . После отшва контрольного гамма-глобулина на этих же срезах изучали эффекты аз -100. Обнаружено, что перфузия срезов гиппокампа в течение 5-7 минут раствором 50 мкг/мл А£ -100 вызывает быстрые и существенны;: изменения всех регистрируемых параметров электрической активности среза (рис.2). Амплитуда поп-спайка (рис. 2А) и ВПСП (рис.2В) после кратковременного увеличения в 2-3 раза снижалась во всех случаях практически до 0 и лишь частично восстанавливалась при отмывании контрольным раствором в течение 40-60 минут. Ш пирамидных нейронов (рис.2Б) снижался на ЗО-бОмВ (при потенциале покоя от -55 до -70мВ), что сопровождалось уменьшением*^ на 20-605? (рис.2Г). Отмывание среза контрольным раствором приводило к восстановлению МП (после кратковременной следовой гиперчоляризгции) и н^ через 10-15 минут.

Полученные результаты указывают на. принципиальное сходство эф фектов АЗ-100 на электрическую активность нейронов моллюска и нейронов крысы.

1.5. Влитие as-iqq на омическую проводимость и потенциал-зависимый Са^+-ток (1дд).

Наши дальнейшие исследования были посвящены изучению механизмов эффекта JSS-ЮО на омические каналы и потекциалзависише Са*"+-кан8лы в экспериментах на изолированных нейронах виноградной улитки методом фиксации потенциала.

Гамиа-глобулиновая фракция сыворотки крови неккмунизированно-го кролика в концентрации 2-10 мкг белка на мл раствора ке оказывала выраженного влияния на омическую проводимость и Iq3 (п=6).

Влияние as-100 в концентрации 2-6 мкг белка на мл на эти же параметры электрической активности изучалось на 20 нейронах. На всех клетках as -100 вызывали дозозависимое и обратимое при отмывании ингибирование В 15 случаях из 20 при этом наблюдалось увеличение входят,его удерживаемого тока. Эффекты AS-ЮО на трансмеэбранные токи были практически полностью обратимы при отмывании нейрона контрольным раствором в течение 10-30 минут. Судя по вольт-амперной характеристике (ВАХ) мембраны, стационарный входяший ток на аппликацию низких концентраций as-100 (2мкг/мл) связан со снижением проводимости мембраны, а на аппликацию более высоких концентраций as -100 (3~б мкг/мл) - с увеличением проводимости мембраны. as -100 в концентрации вше б мкг/мл вызывали обычно необратимое повреждение нейрона.

В 4 экспериментах изучали влияние as-100 на потенциалзависи-шй Ва**+-ток (Iga). Обнаружено, что ингибирующий эффект AS-100 в равной мерз проявляется на 1Са и Iga.

-I.» б^_.Устранениа.1ингкбируюиег91 эффекта^ as -100 на г при

Угнетение под влиянием as-100 могло быть, по-видимому, вызвано как непосредственным воздействием антител на потзнциалза-

- О -

контроль

эта

íüOhc

АЗ-IOO

as-xoc

контроль AS—100+ ЭГТА

на эгта 50-- —

30'

10

L

ЭГТА

ЭГТА

В»»'

-t—I—I—

30

-I-—I-1-!-1—t-

60

I¿0

H-(-

по мкн

и

Рис.3.

зависишь Са2+-каналы, так и влиянием и на 1Са через системы вторичных посредников. Извест-но, что универсальным свойством по-тенциалзависимкх Са2+-каналоИ является их инактивация при повышеНИИ уровня свободного Са2* в цитоплазме (Костюк 1986). В связи , этим можно было предполагать, что икгибирование AS-IOO в на. ших экспериментах вызвано увеличение* внутриклеточной концентрации свободного Са2+ и Саг+-зависимой инактивацией Са +-квнало5. Это пре.дполокение получило подтверждение в экспериментах ( п=5), где изучали влияние на 1Са внутриклеточной инъекции Са +-связыва щего агента ЭГТА. Было обнаружено, что ЭГТА вызывает частичное или полное восстановление 1Са, ингибироваяного as -100 (рис.3). I -?:_алю«ие nttA и » , JS^IOO^

Согласно литературным донным Са2+-зависишя инактивация Са каналов связана с прекращением их фосфорилированид цШ-активиру

(

- ~t

БОнА

КОНТР. 5'ЛМФ ujKm 150 м

О . 20. Н.0_ мй

Б

'ьп

AS-IOO ЛВ-100+ 1__Í ! /

-5'амф as-ioo+L___1 60

+иамф отмыв, на нА 5'АМФиДМФ-ASdM.

ВО но 20

5'АМФ иАМФ

ш*

..... 6

20 40 БО SO

120 140 160 150 МИМ

Рис.4.

емой протеинкиназой (Косгвк 1986, Chad & Eckert 1986). В связи с этим можно было предполагать, что эффекта A3 -100 в наших экспериментах -также опосредованы цАй5-системоЯ. С целью проверки этого предположения было проведено исследование влияния внутриклеточного цАМЗ на эффекты AS -100.

Эксперименты проведены на 8 нейронах, где внутриклеточный уровень цЛМ® повысили с помощью внутриклеточной инъекции цА!£5 либо внеклеточной аппликации дибутирил-цШ! (дцАМ$). В качестве контроля использовали инъекцию 5'ШЗ из другого ствола многоствольного иикрозлектрода.

Обнарукено, что в контрольном растворе внутриклеточная инъекция цАМ'5 анодным током ЮнА длительностью 5 минут или внеклеточная аппли кеция дпАМ£ й концентрации I ммоль/л не вызывает заметных изменений Iqq, либо снижает амплитуду 1Са на 20-40$. После аппликации AS -100 средняя максимальная амплитуда составляла 15+12$ от

w<д -

5-I4I3

исходной амплитуды. Б этих условиях цА® и дцАМЕ восстанавливали 1Са до Ь0±11% от исходной величины (рис.4). Секция 5" Ai® такого эффекта не вызывала.

Полученные данные об устранении цАШ-ом ингибирующего эффекта AS -100 ка ICg свидетельствуют о том, что механизмы ингибирова-

ния опосредованы цАШ-системой и связаны, по -видимому, с дефос-р,

фсрнлированиеи Са^ -каналов вследствие повышения уровня свободно-„ 2-1-

го внутриклеточного Са .

1.8. Влияние внутриклеточной инъекции ЗГГА на стационарный входящий ток, вызванный as -100.

Стационарный входящий ток, вызванный AS -100, частично связан

л

с накоплением внутриклеточного Са Об этом свидетельствуют результаты экспериментов, в которых обнаружено, что инъекция ЭГТА на 2Q-505S сникает амплитуду стационарного входящего тока, вызванного AS -100 (и=5).

1.9. Механизмы стимулирующего влияния на Iga антител против микросомальной фракции мозга крысы.

Для выяснения специфичности AS -100-эффектов представляло интерес сравнить их с эффектами других видов антител. С этой целью мы изучили влияние на стационарный ток и Iça нейронов виноградной улитки антител к шпфосомальной фракции мозга крысы. Эти антитела производились в Центре иммунологических исследований в Белграде (CSPD) по методике, описанной в работах (Lapetina et al 1967, StanislawsfcL 1975).

Обнаружено, что антитела к микросомальной фракции мозга крысы вызывают увеличение амплитуды Iça без заметного изменения стационарного тока. Увеличение максимального Iça достигало 7-38S, тан чт в среднем эта величина составила 16+3$ ( а =Б). Эффект был быстро

обратим при отмывании антител. Механизмом наблюдаемого эффекта является, по-видимому, ослабление связывания ионов Са^+ с внутренним селективным фильтром канала. Об этом свидетельствуют резуль таты экспериментов с ионами са2+, которые, как известно, являются конкурентным блокаторои Са^+_кацалов, прочно связываясь с их внутренним селективным фильтром (Крышталь 1976, Акгаке et а1 1978). Противомикросомальные антитела снижали эффективность бло-

2+ с

кады ионами с<* . Если максимальный в присутствии 2.10~° моль/л составлял 50+11$ о? исходной величины, то антитела

восстанавливали до 92+9% ( а=6).

Результаты свидетельствуют о том, что эффекты противомикросо-мальных антител отличаются от эффектов АЗ -100, т.е. эффекты антител к разным мозгозым белкам на электрическую активность нервной клетки различны. Этот вывод подтверждается и данными литературы (Штарк 1985, БауХс вt еО. 1983, аоГЪез еЪ а! 1983).

1.10. Обсуждение результатов.

Суммируя сказанное, можно предложить следующую схему влияния АЗ -100 на ионную проводимость нейрональной мембраны, включающую несколько типов ионных каналов (рис.5).

Взаимодействие АЗ -100 с белком-антигеном Б -100 приводит к повышению уровня ионов Са^+ в цитоплазме. На рис. приведён самый простой иэ нескольких возможных путей повыиения уровня Са^+ под влиянием АЗ -100-прекращекие связывания ионов Са^+ белками Э -100 ( СаИзэало еь а11969, 1зоЪе ет а1 1981). Далее ионы Са2+ воздействуют на три различных мишени: Са^+-зависимые каналы входящего тока ( Patrid.se & ЗчгалйиНа 1987), фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов (ФДЗ) (Северин и Кочеткова 1985) и мембранную фосфата-зу (ФТ) ( 1пееЪг^зеп еЪ а1 1983). Активация ккналов входящего тока приводит к деполяризации мембраны. Активация ЗДЭ вызывает сни

VJ

\ .... „

Ь'АМф , \

ЧФДЭ \ пк у пк

цитоплазма

Рис.5.

кение уровня цАМФ в цитоплазме и, как следствие, прекращение активации специфической протеинкиназы (ПК) и инактивации цАШ-зэвиеи-мых ионных каналов. Одним из этих каналов является потенциалзависи-мый Са2+-канал, инактивация которого приводит к икгибированию Са~+-компонента ЯД (Костюк 1986). Другой путь инактивации Са2+-канэлов связан с активацией ионами Са2+ ФТ, дефосфорилирующей ханал (chad & Eckert 1986). Прекращение активации ПК ведёт также к инактивации другого цАШ-зависимого канала -Ку-канала аномального Еыпрямления ( Kramer et ai 1988), Снижение ^-проводимости вносит дополнительный вклад в деполяризацию мембраны. Наконец, третий компонент наблюдаемой под влияинием AS -100 деполяризации мембраны связан, по-видимому с увеличением проводимости через касяецяфические каналы утечки, воздействие A3-Ю0 на которые может осуществляться через липидиый матрикс мембраны. Деполяризация мембраны приводит к инактивации по -

тэнциалзависимых Ка+ -каналов и т.о. к полному прекращении генерации ИД.

Обнаруженное в нашей работе сходство эффектов иммуноглобулинов сыворотки крови больных шизофренией и Ай -100 позволяет предполагать также и сходство механизмов их действия. Можно думать, что подобные эффекты АЗ -ЮО могут иметь место и в нейронах мозга человека. В пользу этого предположения свидетельствуют наши результаты о сходстве эффектов АБ -Ю0 в нейронах моллюска и в нейронах млекопитающих. Появление таких изменений в функциональной активности нейронов человеческого мозга может, очевидно, привести к существенным сдвигам в психическом статусе человека и явиться т.о. одним из компонентов биологических основ шизофрении.

2, Изучение механизмов ингибирующего эффекта цАМ$ на 1да.

2Л.Различные эффекты цАМ на I£а разных нейронов виноградной

улитки.

Работа проведена на 54 изолированных нейронах. Уровень цАМФ в нейронах повышали с поиощью внутриклеточной инъекции цАМФ, а также внеклеточной аппликации 0,1-1 ммоль/л дцАМВ и 0,1-1 тюль/л ингибитора фоефодиэстыразы изсбутилметилксантина (Ш5К). Из указанной группы клеток 18 нейронов оказались нечувствительными к повышению внутриклеточного уровня цШ8. На б других: нейронах повышение уровня цАЫ$ вызвало незначительное (10-20%) повышение амплитуды 1£а. В большинстве же экспериментов (30 из 54) повышение уровня цАШ> приводило к уменьшению пиковой амплитуда 1ра и ускорению его спада.

2.2. Снижение цШ>~ом, связанное с возрастанием

потенциалэависимых выходящих токов.

На б нейронах повышение уровня цАШ в цитоплазме вызывало снижение 1£а, которое было связано с активацией каналов выходящего тока.

6-1415

Об этом свидетельствуют следующие результаты. Эффект цШ6 на 1ра не проявлялся при отрицательных потенциалах, увеличивался по мере возрастания положительного потенциала. Выходящие токи, регистрируемые при высоких положительных потенциалах, возрастали.

_2.3. Уменьшение пиковой амплитуды и ускорение его спада,

связанные с влиянием цАМВ ка Са^-проводимость. На 24 нейронах удалось показать, что повышение уровня цАМЗ в цитоплазме нейрона вызывает уменьшение пиковой амнлиоуды и уско-

л ,

рение спада связанное с изменением Са^-проводиыости. Об этом свидетельствуют следующие результаты. Эффект цШБ проявлялся на всех уровнях потенциала, включая и отрицательный уровень,, не увеличивался по мере увеличения потенциала, не отражался ка выходящих токах, регистрируемых при высоких положительных потенциалах, в равной мере проявлялся и на Эффекты снижения Рис. 6.

А

I:

Сс

Б -30 . ■. Р

-кг—<-1-

ЗОмВ

"Н-1---н

V

1Ва

/1 .,10$ Чх/

I Ь150мс нА

-Зи □ 30 мВ

КОНТР.дцАМЧ? ОТМЫЙ. 20

/ ¡20нА

ПП11

пиковой амплитуда и ускорение спада могли проявляться как раздельно, так и совместно, В последнем случае прекращение действия цАМ$ приводило к быстром;/ восстановлению пиковой амплитуды (через 5-10 минут) и более медленному восстановлению спада (через 15-30 минут) (рис,б). Независимость проявления этих двух эффектов свидетельствует о различных механизмах их реализации.

Изучение влияния активатора фосфодизстеразы циклических нуклео-тидов имидазола ка было предпринято с целью ответа на вопрос, каково влияние физиологических концентраций цАМФ на

Эксперименты проЕе.цекы на 13 нейронах. Имидазол добавляли во внешний раствор в концентрации 0,01-1ммоль/л, В экспериментах обнаружено, что я большинстве клеток (8 из 13) имидазол вызывает увеличение амплитуды 1£а, которое достигает максимума через 1-5 минут после его аппликации и сохраняется 60-80 минут после отмывания клетки контрольным раствором.

Эффекты увеличения амплитуды под влиянием имидазола были дозозависимыми и возрастали при увеличении концентрации препарата. Максимальное уьелиаение под влиянием имидазола составляло в среднем 52+10$.

Активация имадазолом связана, очевидно, с известным свойством этого препарата активировать фосфодиэстеразу и понижать уровень цАМФ в клетке. В таком случае необходимо признать, что в физиологических условиях Са^+-каналы находятся под тормозным влиянием цАМФ.

2.5. Отсутствие влияния внутриклеточной ингекц^и ЭГ'ТА_на

ингибируицкй эффект цАМФ на 1п3

Внутриклеточная инъекция ЭГТА током 10-20 кА длительностью 5 минут увеличивала пиковую амплитуду контрольного на 18^10%

- -

(n=ô) и замедляла его спад. Длительность действия ЭГТА составляла 15-60 минут. На этих клетках инъекция цШ> понижала Iq2 до инъекции ЭГТА на 30*11$, а на фоне действия ЭГТА на 29± 12$. Результаты свидетельствуют о том, что внутриклеточный ЭРГА ке изменяет ингибирущего эффекта цАШ на Iça и позволяют заключить, что указанный эффект ц/Ш$ не связан с повышением уровня свободного Са2+ в цитоплазме.

2.6. Сравнительное изучение влияния на 1дд цДМВ и

На тех клетках, где цАМФ и ддАМЕ вызывали снижение пиковой амплитуды IQa » исследовали влияния внутриклеточной инъекции цП® и внеклеточной аппликации активатора гуанилатциклазы нитропрусси-да натрия (0,05-0,1 ммоль/л) (п=10). Обнаружено, что в большинстве клеток (п=9) повышение уровня qllffl в цитоплазме не снижает Iça, т.е. эффект цАШ не имитируется. Результаты свидетельствуют о том, что эффект цАШ на Iça не реализуется через цПЙ-систему.

2.7. Сравнительное изучение эффектов форболового эфира и

Са*"+-каналы нейрональной мембраны являются субстратом фосфори-лирования протеинкиназой С ( Нааоойй et аД. 1987). Однако, наблюдаемый эффект цАМ$ не связан с воздействием киназы С на Са2+-ка-налы. 'Об этом свидетельствуют результаты экспериментов, показывающие отсутствие влияния активатора протеинкиназы С форболового эф!фа ТРА на тех клеток, в которых дцАМВ вызывал вырааенное снижение (п=3).

2.8. Влияние толбутамида и Н-8 на пиковую амплитуду

Эксперименты с изучением влияния на lça ингибиторов цАМ$-акти-

вируемой протеинкиназы (киназы А) толбутамида и Н-8 были предприняты с целью ответа на вопрос, может ли ингибирующкй эффект цА1Э на 1Са быть объяснен активацией киназы А и фосфорилированием

- ¿ь -

белков ( йгееокагб. 1978).

Эксперименты проведены на 14 нейронах, где цАМБ или дцАМ5 вызывали снижение амплитуды 1ра. Толбутамид в концентрации 1-Б кмоль/л во всех клетках вызывал выраженное (30-80%) снижение пиковой амплитуды Эффект был обратим при отмывании толбутами-да через 6-15 минут. 1да снижался под влиянием толбутамида так же, как и (рис.7). Н-8 в концентрации 1-50 мкмоль/л токе вызывал снижение пиковой амплитуды хотя и более слабое, чем толбутамид. Эффект Н-в проявлялся на 5 нейронах из 14. Снижение амплитуды составило 10-20%.

Наиболее вероятным объяснением эффектов толбутамида и Н-8 является ингибирование ими киназы А и дефосфорилирование Са^+-кана-лов. Однако, если дефосфорилирование Са^-каналов приводит к подавлению следовательно, для нормального функционирования последних требуется их фосфорилирование киназсй А. Т.о. наши резуль-

Б

КОНТР.

И

Т/\ ТА + диМФ

п ' орОТМЫВ. 0 , ,

Рис.7.

таты с толбутамидом и Н-6 подтверждают развиваемую в литературе концепцию о необходимости фосфоридирозания потенциалзевисимых Са^+-каналов нейрснальной мембраны киназой А для их нормального функционирования (Костюк 1986, Cfc.ad & Eckerl; 1986). В то же время полученные результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемое в наших экспериментах ингибирование Iqs цАШ-ом невозможно сбь-яснить активацией киназы А и фосфорилированкем Ca - каналов.

амида и ццАМ$ при их совместном предъявлении.

Сходство эффектов толбутамида и цАШ на Iga позволяло предполагать и сходство механизмов их действия. Для проверки этого пред положения было проведено 12 экспериментов, где эффекты на толбутамида и дцАМФ изучались при раздельном и совместном предъявлении. В 6 из 12 экспериментов было обнаружено, что ингибирование lQa дцАМФ не проявляется на фоне действия толбутамида (рис.7). Неаддитивность эффектов дцАМФ и толбутамида свидетельствует о сходстве механизмов их действия. Т.о. «окно думать, что в больших концентрациях. цАМФ может тормозить процесс, который сам же и запускает, и вызывать прекращение фосфорилирования ка-налообразувщего белка киназой А.

2.10. Изучение механизмов ускорения спада 1од под £5£3ё^ёМЛШк

Эксперименты проведеш на 20 нейронах, где внутриклеточная инъекция цАМ$ или внеклеточная аппликация 0,1-1 ммоль/л дцАШ вызывали ускорение спада Iqs во время деполяризующего стимула. Вычисление времени полуспада быстрого и медленного компонента спада Iq0 j j- и ^ ^ б контРоле и 5 присутствии цАШ показывает, что под влиянием цАШ ускоряются оба компонента спада. 3 среднем ¡/j и спада Iqа под влиянием цАШ и дцАМФ уменьшались в 2,2 раза. Изменение времени полуспада под влиянием

ДАШ з 17 из 20 экспериментов на зависело от потенциала. Выходящие токи, регистрируемые при высоких положительных потенциалах, не изменялись. Показатели времени полуспада 1да этих же клеток такта уменьшались под влиянием цАШ в 2-2,5 раза. Совокупность результатов позволяет предполагать, что наблюдаемое ускорение спада под влиянием цАШ связано не с активацией выходящих токов, а с усилением инактивационшх процессов в Са^+-каналах ( а^ш.ск еъ а! 1989).

Изучение кривой инактивации, построенной в двухстимульном эксперименте, показало, что под влиянием дцАМ® усиливается как Са^+-зави-сишя, так и потенциалзависимая инактивация Са2+-каналов (рис.8).

По мере увеличения интервалов между стимулами в двухстимульном эксперименте мокко наблюдать постепенное ослабление влияния прести-мула на В тех случаях, когда престимул вызывает максимальный

Са'

такую процедуру используют для измерения времени вссстаноэле-

кия Са*"+- каналов от Са^+-зависимой инактивации. В наших эксперимен-

та |гонд

1«

100$

ьозг

контр.

дцАМФ

контр.

дцА&Ф

о-о-л^

-30 О 30

70 мВ

X ^ дцШЬ / I - контр.

10055

150 мс

1111

-30 о

30

-4—1—I—I Уо

70 мВ

Рис.8.

I ) I

/

- 2t -

тах обнаружено,что при длительности стимулов 150мс полное восстановление Са^+-каналов от инактивации, вызванной входом в клетку во время престиыула, происходит через I-Зс. На 7 клетках проверяли влияние 0,1ммоль/л дцА1® на процесс восстановления Са^+-наналов от Сал -зависимой инактивации. Во всех экспериментах получены сходные результаты, свидетельствующие о замедлении восстановления Са^+-ка~ налов от Са^-завксимой инактивации под влиянием дцАМ8.

2.II. Изучение алияния ингибиторов кикааы А на спад 1од.

Цель этой серии экспериментов состояла в выяснении вопроса о том,

Г) ,

в какой мере усиление инактивации Ca -каналов под влиянием цАМ$ связано с активацией яиназы А. Если это предположение верно, то эффекты ингибиторов ниназы А на процессы инактивации должны быть противоположны эффектам цАМ$. Это предположение, однако, не подтвердилось в наших экспериментах. Изучение спада и кривых инактивации в присутствии толбугамида и Н-8 показало, что процессы инактивации Са^+-каналов под воздействием этих препаратов усиливаются. Время полуспада быстрого и медленного компонентов спада if и

снижалось под влиянием 1-5 ммоль/л толбутамида на 13+6% и 40+16% соответственно ( д =15), а под влиянием 1-30 мкмоль/л Н-8 -на 20+8% и I8+6i6 соответственно ( п =10).

Изучение в двухетицульном эксперименте кривой инактивации в присутствии толбутамида показало, что инактивация тестируемого существенно усиливается при достижении престимулом потенциалов +30W70mB. Эффект толбутамида возрастает по мере увеличения потенциала престимула. В средней толбутамид в 2 раза усиливал инактивацию 1Сл при потенциале престимула Vc -ч-60мВ ( а ^7).

Т.о. изучение влияния на инактивационные процессы Са^+~каналов ингибиторов ккназы А показало, что аффекты этих препаратов заключаются в усилении инактивации и в целом, сходны с эффектами цАШ. На основании этих результатов можно сделать еывод, что эффект цАМ5 на

спад но связен с активацией ниназы А и фоофорилированием ка-' налов. Напротив, объяснением наблюдаемого эффекта цАШ является скорее всего дефосфорилирование канала вблизи инактивациокнсго субстрата.

2.12. Обсуждение результатов.

Сукмкруя сказанное, можно представить следующую схему взаимодействия цАМЭ с потекциалзависимыии Са2+-каналаыи нейрональной мембраны (рис.9)*

3 низких концентрациях цАМЗ стта^улирует Iq3 через активацию протвинкиназа А (ПК) и фосфорилирование (Р) канала. Это подтверждают литературная данные (Костюк 1986, Chad & Eckert; I96&.I986), а также результаты собственных экспериментов с ингибиторами кяк^эх А Н-8 и толбутакидом (ТА). На интактных нейронах виноградной улитки, однако, стяыулирущий эффект цАМЙ на проявляется в нормальных физиологических условиях лишь на кебсльа&м числа клеток, по-видимому, вследствие насыщения фосфорилкрования каналов. Вместе с тем, яри иотешенич уровня свободного Са~+ з цитоплазме, ко-

Ca

f

ФДЭ

\

\

\ Рис.9.

ИбМК

^ t X

- 1

Ca

- за -

торий, активируя фосфатазу (ФТ) и фосфодиэстеразу (ФДЭ), вызывает дефосфорияироаание каналов и ингибирование (Костик 1966, Cb&d 8а ackert 1985, 1986), стимулирующий эффект цАШ на 1Са проявляется значительно чаще (см. раздел I).

Высокие концентрации цА10 уменьшают пиковую амплитуду Iqö и усиливают его спад. Снижение пиковой амплитуды Iq3 цАШ-ом проявляется уже при физиологических концентрациях ц/Ш$, о чем свидетельствуют результаты экспериментов с активатором ФДЭ имидаэолом (ИМ). Механизмы этого эффекта связаны, на наш взгляд, либо с непосредственным взаимодействием цАМ5 с каналооб-разукцим белком вблизи центра фосфорилирования, находящегося на активационном субстрате, либо с активацией одной из форм ФТ, независимых от (например Ф12А). Ускорение спада связано, по-видимому, с дефосфорилированием инактивационного субстрата. Мишенями для цАМ$ в этом случае могут быть либо сам инактивацконный субстрат канала, либо ФТ2В. Данные литературы подтверждают способность фосфатаз типа I и 2А сникать пиковую амплитуду ICa ( Hescheler et al 1987), а фосфатазы типа 2В -ускорять спад 1Са ( Ша(1 & 1986).

3. Опосредование цАМЗ-ом возбуждающих ответов нейронов виноградной улитки на серогонин и дофамин.

3.1, Электрические ответы нейронов на цАШ. При проведении экспериментов на изолщюванныг неидентифици-рованных нейронах виноградной улитки в режиме фиксации потенциала обнаружено, что инъекция цАМФ с помощью микроионофореза (30-70 нА, С,5-5с) или внеклеточная аппликация 0,1 ммоль/л дцАМ£ вызывает на уровне удерживаемого потенциала, близкого к ПП (~50м8), стационарный входящий ток (19 нейронов из 33 исследованных). Зависимость амплитуда цАМФ-ответа от потенциала была

различной на разных нейронах. По характеру этой зависимости можно шцелить три типа цАМФ-ответов.

На 7 нейронах цАМЗ-ответ линейно увеличивался с гиперполяризацией мембраны. Потенциал реверсии этого ответа был близок к 0 мВ, т.е. совпадал с равновесным потенциалом для ионов Ответы не регистрировались в безнатриевом растворе. Результаты свидетельствуют о том, что этот тип ответа связан с активацией линейной На1"проводимости{рис.10). Сходные ответы ка цАМ2 были зарегистрированы на идентифицированных нейронах (ППа1, ППа2, ЛПа2, 5, 6 ) в целом ганглии улитки, где эксперименты проводились в режиме фискации тока и цШВ-ответы представляли собой быструю деполяризацию мембраны. В этих экспериментах внутриклеточная инъекция цП® вызывала ответы, сходные с цАМФ-ответами, хотя и более слабые. Такие же ответы нейронов на цА1Й описаны Либерманом с соавт. (1975,1977), Кононенко (1980), АЫепЛоГС вЪ аЛ. (1983), ИоОгоЬап & вШейв (1988) к др.

На другой группе нейронов (п«6) входящий ток, вызванный

Рис. 10.

Ъ

_А

А

УмВ -80 -40, 1-ОД_УмВ.-ЧО. ,0

лиАМФ ЛА

Л

ч.

ДА ^

1нА

3

I нА

ц --ЧОиВ л а

ли.

а т

12 н А т

1 МИН

даАМФ

Рис. II.

инъекцией цАШ или внеклеточной аппликацией дцАШ не имел линейной зависимости от потенциала. Характер зависимости амплитуда ответа от потенциала, а также исчезновение ответа в Сео-натриевом растворе позволяют прийти к заключению, что ионная природа этого типа цАМЙ-ствета связана с активацией медленной потенциалэависиыой -проводимости (рис. ПА). На нейронах виноградной улитки такой тип отгета ранее описан не был. На других видах моллюсков такой ответ описан ОаогШса эъ аЛ. (1988) и М&1шио.о1;о ей а! (19885.

Третий тип возбуждающих ответов на цАМ2 к дцАЬ® связан, на наш взгляд, с закрыванием линвйккх К+-каналов (п=б). Доказательством этого .утверждения яздяется, во-первых, линейное возрастание амплитуды входящего тока при деполяризации мембраны

и, во-вторых, реверсия ответа в области равновесного ^-потенциала (рис. ИБ).

_Зл2^_^авнительное_кзучение_элек J!§_2§£2I23I3J_íL3iJM5L_

В режиме фиксации тока на 20 нейронах области ? и G проводили сравнительное изучение электрических ответов на внеклеточную аппликации 1-50 мкмоль/л серотонинв 5-НТ внутриклеточную инъекцию цАМ5. Исследовали зависимость обоих ответов от потенциала и их потенциалы реверсии и ).

В 17 экспериментах б-НТ вызвал быструв и обратимую деполяризации мембраны, амплитуда которой линейно возрастала при увеличении МП (ряс. ЮА). был близок к равновесному по-

тенциалу для ионов i;a+ (рис. ЮВ). Внутриклеточная инъекция цАЬЭ в эти же нейроны вызывала кратковременную деполяризацию цэмбраны, которая по характеру зависимости от потенциала и потенциалу реверсии совпадала с 5-НТ-ответами (рис. ЮВ). Результаты указывают на идентичность ионной природа 5-НТ- и цА1®-ответов этих клеток.

В 3-х экспериментах на нейронах области а серотонин вызвал гиперполярнзацгаэ мембраны с Е§_^гр=-?04-80мВ. Внутриклеточная инъекция цАКФ в зти нейроны вызвала деполяризации с Ецд^= =04—10мВ. Эти результаты свидетельствуют о том, что тормозные 5~НТ~ответы зтих клеток не опосрв.дуются цАШ5-систе«ой.

На 14 нейронах области ? и & , э которых внеклеточная аппликация Б-НТ и внутриклеточная инъекция цАМ5 вызывали сходные деполяризационные ответы, изучали влияние на эти ответы

тесфиялина - ингибитора фосфодиэстеразы циклических нуклести-дов. Теофиллин инъецировали внутриклеточно под давлением или аплицирсвали вюклеточно в концентрации 1-5*10"^ моль/л. В 12 из 14 экспериментов теофиллт вызывал увеличение в 1,5-2 раза амплитуды и длительности как серотониновой, так и цАМЗ-зависимой деполяризации. Эффекты были обратимы при отмывании теофиллкна через 20-40 кинут. При увеличении концентрации теофиллина до I кмоль/л в 5 из 12 экспериментов последний сам проявлял способность вызывать деполяризацию мембраны, сравнимую по амплитуде с 5-НТ-деполяризацией.

3.4« Инициация сбротонином иг.дА^_пачвчной активности.

Как известно, пачечная активность б нейронах виноградной улитки требует высокой концентрации внутриклеточного цШ> СКоионенко 1981, Ьеуз^ал & ЬеухЪвп 1988). В наших экспериментах на клетках ППа2 и ® показано, что внеклеточная аппликация ееротошша, так ке как и внутриклеточная инъекция цАШ способна посла короткой деполяризации вызывать более длительней период пачечной активности.

3.5. Сравнительное изучение электрических ответов нейронов

на дофамин и цШ>.

На 12 изолированных нейронах виноградной улитки, которые генерировали стационарный входящий ток на внехлэточлую аппликацию 0,1 толь/л дофамина (ДА), проводили исследования, целью которых было изучение опосредования ДА-ответов цШ-оы. На первой этапе исследований ш проводили сравнительное изучение электрических ответов нейронов т внеклеточную аппликацию ДА. и ОД шоль/д дцАШ.

При изучении зависимости входящего Д-тока от потенциала

обнаружено 2 типа ответов. Амплитуда первого типа ответов (п= =5) нелинейно зависела от потенциала к ишла вид, представленный на рис. НА. Наиболее вероятный механизмом такого типа ответов является, очевидно, активация медленных потенциалэа-висяшх -каналов. Аппликация дцА1Э также вызывала на этих клетках стационарный входящий ток, зависимость которого от потенциала была сходной с зависимость®! от потенциала ДА-ответов. Эти результаты указывают на то, что дцАМЙ в этих клетках открывает те ае каналы, что и ДА.

На другой группе клеток (п= ?) ДА вызывал стационарный входящий ток, амплитуда которого линейно возрастала при деполяризации геибракы и потенциал реверсии был близок к К^-рав-ковесному потенциалу (рнс. ПБ). Этот тип ответов связан, очевидно, с закрыванием ^-каналов. Аппликация дцА1$ вызывала в этих клетках ответ, сходный по всем характеристикам с ДА-отве-тои.

_3.б.Влияние_иэобутшшетилксангина_на ДА-ответы.

На тех клетках, где аппликация ДА и дцАО вызывала сходные электрофнзиологнческие ответы, исследовали влияние на ДА-отве-ты ингибитора фосфодиэстеразы циклических нуклзотидов изобутил-кетилксантина (ЙБМК) (п=12). ИЕМК добавляли в окружающий клетку раствор в концентрации 0,1-1 кмоль за I минуту до аппликации ДА.

В экспериментах обнаружено, что независимо от типа ДА -ответа 0,1 кмоль/л КШК увеличивает амплитуду и длительность ДА-ответа в 1,5-2 раза (II из 12 экспериментов). Во всех экспериментах потенциирующий эффект И2Ж на ДА-ответы был обратим при отмывании клетки контрольным раствором в течение 15-40

минут» При увеличении концентрации И5МК до I ммоль/л на Б нейронах обнаружено, что ИЕМК сам по себе вызывает стащюнар-адй входящий ток, сходный с ДА-ответом. В этих случаях аппликация Jlfr на фоне действия ИБМК не приводила к генерации исходного ДА-ответа, т.е. ИЕМК- и ДА-ответы не были аддитивны.

_ЗЛ\ Обсуждение результатов.

Согласно концепции &xeengaxd (1978), принятой сегодня большинством авторов, основными критериями опосредования ней-ромедиаторного ответа клетхи цАШ-ом являются следующие: активация нейромедиатором аденилатциклазы и повышение им уровня цАМ$ в клетке, имитация внутриклеточным цАШ медиаторного ответа, соответствующее изменение медиаторного ответа под влиянием препаратов, изменяющих уровень цАМ® в клетке.

Совокупность литературных данных, указывающих на способное« 5-НТ и ДА активировать аденияатциклаэу и повышать уровень цАШ> в нейронах моллюсков ( Deterre et al 1982 и др.), и результатов собственных эдектрофизиологических исследований удовлетворяет перечисленным критериям и позволяет считать, что возбуждающие 5-НТ и ДА-ответы нейронов виноградной улитки опосредуются цАМ$-ом.

4. Механизмы нейроиодуляторных эффектов морфина и энкефз-линов.

4.1. Влияние морфина и экксфалтоз _мцспонта{р^ ческую активность нейронов, виноградндйпулитки^ У 39 из 200 нейронов (области f и g ) при ионофоретичес-кой аппликации или при добавлении в окружающий раствор в концентрации 1-10 мкиоль/л морфина (МО), мет-энкефалина или бета-эндорфина регистрировали гиперполяризацию мембраны и снк-

МЕТ-ЭНК.

РИЗ. 12.

кеняе Нщ- . Классический антагонист опиатов калоксон в концентрации I мкмоль/л, нэ вызывая сам по себе изменения МП, предупреждал эффекты МО.

В тех случаях, когда фоновая активность нейрона содержала спонтанные ВПСП, МО к мет-»нкефалин вызывали, как правило, их редукцию, Эффект редукции ВПСП не зависел от влияния МО и энкефалина на МП нейронов. Одним из возможных объяснений наблюдаемой редукции ВПСП является, очевидно, снижение чувствительности постсинаптической мембраны к медиаторам. Изучению этих эффектов посвящены следующие разделы нашей работы.

4.2. Ослабление морфином и знкефаяинаш деполяризации, вызван-кой аппликацией дофамина.

На нейронах В^, ППа2, а также некоторых клетках группы I и Д изучали влияние МО, лей-эняефалина и мет-энкефалина на деполгфиза-щ®, вызванную аппликацией 1-10мкмоль/л ДА. На 16 нзйронах из 27 было обнаружено, что в присутствии 10 ммояъ/л МО, лей-зккефалина н мет-энкефалина амплитуда ДА-деполярязации снижается (рис. 12). В среднем ее величина соответственно составляет в процентах от

•• за -

исходной ашыптущ : 63 + 7,. 74 + В, 64 + 8, Эффект скиз&ния (¿0 и энкефалинами амплитуды ДА-деполяризации является статистически значимым (р с 0,05). После отшвания МО и эикефаликов в течагшв 10-15 мшгут ДА-отвеяы полностью восстановились на всех; исслвдован-кых клетках.

Специфический антагонист опиатов иалоксок и концентрации 10 шазоль/л сам по себе не влиял на ДА.-отботы, но предупреждал эффекты МО и знкофалинов (рис. 12). Указанная налоксон-зевисйаюстъ эф-фактов ЫО и эккефалинов сзидетзльстаует о том, что эффекты МО и эккефалинов реализуются через опиатные рецепторы. Эти данные позволяют так®з цре.дполагать неконкурентный характер ингибировакия ДД-ответов МО и энкефаликамя.

Гиперполдризукцие ДА-ответы (клетки ЛИа2, клетки групп Д и А) не изменялись под влиянием ЫО, энкефалкнов и налоксона.

4.3. Неконкурентное ингкбирование морфином возбуждающих ответов

нейронов на серотонин.

Эксперименты проведены на нойрснах области вентральной стороны висцерального ганглия. Влияние МО на 5-НГ-деполяризацию изучали е 20 экспериментах. ЫО добавляли в окружающий раствор в концентрации ГЮ"7- I но ль/л. В 15 из 20 случаев МО вызвал до-зозагасииое уменьшение амплитуды 5-НТ-деполяризации, которое проявлялось как при ыикроионофоретичаскоЯ аппликации 5-Н'Г, так и при добавлении его в раствор (рис. 13). При концентрации ¡50 1-10"° ноль/л амплитуда 5-НГ-ответа составляла з среднем 50^7? от исходной, это отличие является статистически значт-ым (р^- 0,01). 0т-шванив МО в течение 10-15 минут приводило обычно к полному восстановлению 5-КТ-ответов.

Антагонист опиатов нзлоксон, который добавляли в окружающий рас

с

тзор в концентраций 1*10 * моль/л, не изменяя ¡¡И и 5-НТ-ответов,

— о?

Рис. 13.

во всех исследовании случаях (п-7) снимал эффект МО, так что при одновременном присутствия МО и налоксона в окружающем растворе амплитуда 5-НТ-цепояяризации составляла 90-100% от исходной.

Устранение эффекта МО налоксоном указывает на реализацию эффекта через опиатнке рецепторы, что, в сзов очередь, свидетельствует о неконкурентном характере икгибировэния 5-НТ-деполяризапич МО.

Другим доказательством неконкурентного механизма ингибирования 5~КТ~ответов МО является характер зависимости доза-эффект для 5-НТ в присутствии МО. На рис. 13 прсгст^ртенк усредненные кривые (п=7) доза - эффект для 5-НТ, пс-г^сснщз 5 ^гьггрзльном растворе и в присутствии МО. Мокко видеть, что ин№бируыц>\л эффект МО на Ь-НТ--ответ не уменьаается при увеличении концентрации 5-НТ в окружающем растаоре, что свидетельствует об отсутствии конкуренции менду МО и 5-НТ.

- <*и -

4.4. Отсутствие влияния морфина и анкефалинов на деполяризацию, вызванную инъекцией цАМ$.

В разделе 3 было показано, что возбуждающие 5-НТ и ДА-ствегы опосредованы цАМВ-ом. Представляло интерес выяснить, оказывают ли ЫО и энкефалины влияние на цА1Й-деполяризацию.

Работа проведена на 17 нейронах вентральной стороны облаете о, отвечающих деполяризацией на 5-НТ. ЫО, лей-энкефалин и ыет-эккефа-лин в концентрации 10 мкмоль/л добавляли в окружающий раствор. Обнаружено, что ни в одном из цроведенных экспериментов указанные препараты не вызывают изменения цАМФ-деполяркэации.

Результата позволяют прийти к заключению, что агонисты опиатов не действуют на те звенья 5-НТ и ДА-ответов, которые входят в состав цАМФ-отвегов: ионные каналы, фосфодиэстеразу, цротеинкиназу,

4.5. Действие морфинаг энкефалинов и налоксона на возбуждающие

ответы, вызванные аппликацией ацетилхолина.

На 20 нейронах областей р и а , а также клетках ППаЗ и ППа5 антагонист опиатов налоксон (10 мкмоль/л) вызывал снижение АХ-деполя-ризации в среднем до 35^7% от исходной величины. В II из 20 экспериментов сходным эффектом обладали агонисты опиатов: МО, лей-энкефалин и мет-энкефалин (10 мкмоль/л), которые в среднем снижали АХ-деполяризацию до 45^8% от исходной величины.

Ни агонисты, ни антагонисты опиатов не влияли на АХ-гиперполя-ризацию.

Известно, что АХ-огветы нейронов реализуются через два типа рецепторов: никотиновые к мускариновые. Изучение влияния агонистов и антагонисгов опиатов на никотиновый (10 мкмоль/л) и цуснариновый (10 мкмоль/л) ответы нейронов областей ?и <3(п=Н) позволило выявить, что только никотиновый, но не ыуснариновый компонент АХ-депо-ляризации ослабляется налоксоном, Ы0 и энкефалинами.

4

ТЕО

Рис. 14.

Наиболее вероятным механизмом снижения МО и энксфалинаии 5-НТ-и ДА-деполяризации является, на наш взгляд, ингибирования адени-латциклазы. Связь опиатншс рецепторов с аденилатциклазой через di -белок хорошо документирована на различных объектах ( UeherI988' в том числе и на моллюсках ( xeung а Stefano 1987). По нашему мнению, конкретные механизмы ингибирования МО и энкефалинами 5-НТ- и ДА-отеетов состоят в следующем (рис, 14): активированный опиатныи рецептором Oi-белок взаимодействует с аденилатциклазой (АД) и препятствует ее активации 5-КТ и ДА через Ga -белок. Благодаря этому аппликация 5-Н'Т и ДА вызывает меньший синтез цАШ, более слабую активацию ионных каналов и, следовательно, иеньщую по амплитуде деполяризацию мембраны.

Что касается угнетения МО и энкефалинами АХ-деполяризации, го в данном случае мы не можем говорить о реализации этих эффектов через опиатные рецептора, поскольку налоксон е этих экспериментах не проявлял себя как антагонист ЫО и энкефалинов. Вероятнее всего, на нап взгляд, что налоксон, МО и энкефадины связываются с никотиновыми рецепторами и препятствуют взаимодействию с ними АХ.

вывода.

1. Антитела против белков мозга человека, имцуноглобулины сыворотки зфови больных шизофренией и антитела к белкам S -100 ( AS -10$ вызывают быстрые и обратимые при отмывании электрофизиологические эффекты на нейронах моллюска, которые выражаются в деполяризации мембраны и угнетении генерации ЦЦ. Эффекты проявляются как в нормальном, так и в безнатриевом растворе и не полностью устраняются при гиперполяризации мембраны.

Сходные эффекты -^-100 оказывают и на пирамидные нейроны срезов гиппокампа мозга крысы, где они вызывают деполяризацию мембраны, угнетение генерации ПД, а также уменьшение амплитуды ВПСП и поп-спайка. Два последних параметра восстанавливаются при отмывания AS -100 гораздо медленнее, чем Ш и ПД.

2. На нейронах моллюска методом фиксации потенциала показано, что ¿S -100 вызывают стационарный входящий ток и угнетение генерации

1Са. Внутриклеточная инъекция Са^+-хелатора ЭГТА устраняет кнгиби-рование Iq3 антителами и снижает вызванный антителами стационарный входящий ток. Внутриклеточная инъекция цАМФ или внеклеточная аппликация дибутирил-цАШ приводит к частичному устранению ингибируххцего эффекта AS-100 на т.е. стимулирует Iqs в зтих условиях. Результаты свидетельствуют о том, что электрофизиологические

эффекты ДБ-ЮО развиваются с участием вторичных посредников: ионов Са2+ и цАМ.

Антитела к мккросомальной фракции мозга крысы оказывали на электрическую активность нейронов моллюска эффектов, сходных с эффектами ДЭ-ЮО.

3. Внутриклеточная инъекция цАШ, а также внеклеточная аппликация дибутирил-цАШ или изобутилметилксантина вызывает уменьшение амплитуды и ускорение спада интакткых нейронов моллюска. Эффект в равной мере проявляется на и на Активатор ф^сфодиэстеразы имидазол вызывает в большинстве нейронов противоположный эффект -стимуляцию 1£а. Результаты указывают на ингибирование Са^+~каналов нейрональной мембраны цААЙ-ом в концентрации, равной или превышающей физиологическую.

4. Ингибирующий эффект цАЫФ на пиковую амплитуду не имитировался цПгЙ-ом или форболовым эфиром и сохранялся на фоне внутриклеточ-но введенного ЭГГА. Ингибиторы протеинкиназы А толбутамид и Н-8 такке поникали Толбутамид обладал более выраженным действием на 1£а, чем Н-8. В половине исследованных случаев ингибируюций эффект дибутирил-цАЫ5 на 1£а не проявлялся на фоне действия толбут-амида. Предполагается, что механизмом ингибирующего действия цАШ на пиковую амплитуду 1£а является тормокение фосфорилирования ак-тивационного субстрата Са2+-каналов. В целом результаты свидетельствуют о двойственном (фосфорилирующем-дефосфорилирующем) влиянии цАШ на Са^+-каналы.

5. Ускорение спада под влиянием цАГЙ в большинстве нейронов обусловлено усилением инактивационных процессов в Са**+-каналах. Влияние цАШ на кривую инактивации, зарегистрированную в двухсти-мульном эксперименте, свидетельствует об усилении как Са^+-зависи-мой, так и потенциалзависимой инактивации. Толбутамид и Н-8 также

ускоряют спад Iça. Изменение кривой инактивации под влиянием тол-бутамида указывает на преимущественное усиление потекциалэависи-мой инактивации Са^+-канадса. Предполагается, что механизмы ускорения спада 1С под влиянием цАЫ2> связаны с торможением фосфорили-рования инактивационного субстрата Са^-канадаз.

6. В нормальном физиологическом растворе цАМ£ обычно деполяризует мембрану нейронов виноградной улитки, цАМФ-деполяриэация обусловлена в разных нейронах различными механизмами: активацией линейной

. + lïa -проводимости, активацией медленной потенциалзависимой Na-проводимости, инактивацией Непроводимости.

fia идентифицированных нейронах в препарате показано, что возбуждающие ответы на Ъ—HT, связанные с активацией линейной Na-проиоди-мости, опосредованы цАМФ-ом. Об этом свидетельствуют следующие результаты: сходство ионной природа ответов на внеклеточную аппликацию 5-HÎ и внутриклеточную инъекцию цАШ5, потенциация 5-НТ-отзе-тов теофилличом, имитация 5-НТ-ответов высокими дозами теофидлина, инициация Б-НТ пачечной активности. Гипарполцриэукцие 5-ИТ-ответы не имитировались цШб-ом.

На изолированных неидентифицированных нейронах показано, что возбуждающие ответы на дофамин, связанные с активацией медленной потенциалзависииой Яа+-проводимости или инактивацией ^-проводимости, опосредованы цАМФ-ом. Об этом свидетельствуют следующие результаты: сходство ионной природы ответов на внеклетощую аппликацию дофамина и дибутнркл-цАМФ, потенциация дофаминовых ответов изобутшшетилксантином, кмитацкз дофаминовых ответов высокими доза» ю изобутилмэтилксантина, отсутствие проявления дофаминовых ответ« на фоне ответов, вызванных высокими дозами изобутилмвтилксантина.

7. Морфин, лей-энккфалин и ыет-зккефалин вызывают в ряде нейронов виноградной улитки изменение Ш и уменьшение возбуждающих ответов

на аппликацию Ь-НТ и дофамина. Эффзкты морфина и энкефзлинов устранялись при предварительном введении налоксона, Сравнение кривых доза-эффект для 5-НГ в контроле и з присутствии морфина указывает на неконкурентный характер ингибирования. На этих же нейронах морфин и знкефалины не изменяли амплитуду цАМЭ-деполяризацни. Предполагается, что механизмом снижения морфином и энкефалинаии 5-НТ- и дофаминовых возбуждающих ответов является ингибированке аденилатци-клазы и понижение уровня цААЙ в клетке.

8. Налоксон обычно понижал амплитуву АХ-деполяризоции. На отдельных идентифицированных нейронах МО и энкефаляны вызывали эффекты,сходные с эффектами налоксона. Ыускарин и никотин имитировали АХ-депо-ляризацию, МО, знкефа.т/ш и налоксон угнетали никотиновые, но не мускариновые ответы. Предполагается конкурентное ингибироеачие АХ--ответов налсксоном, Ж) и энкефалинами.

9. В работе показано, что Енутриклеточкне посредники цАЬЯ>, цШЗ и и ионы Са<;+ способны регулировать различные типы ионных каналов нейрональной мембраны. Между системами внутриклеточных посредников имеются слолвде взаимодействия. Изменение регуляции ионных каналов внутриклеточными посредниками (ионами Са^+ и цАШ5~ом) является механизмом электрофизиологических эффектов таких физиологических воздействий, как повышение во внешней среде серотонина, дофамина, опиоидных пептидов, некоторых видов противомозговых антител.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Солнцева Е.И., Свешникова Е,В. Идентификация серотониновых рецепторов на некоторых нейронах виноградной улитки //Нейрофизиология. -1978.-т.10,№3.-С. 300-305.

2.Солнцева Е.И., Кушнер С.Г. Влияние противоыозговой сыворотки на электрическую активность нейронов виноградной улитки//ДАН СССР,-

- 4.6 -

-1976.-т.238,№4.-СЛ003-1007.

З.Солнцева Е.И., Фактор М.И. Влияние иммуноглобулинов сыворотки крови больных шизофренией на потенциалы нервной клэтки//Ж.невро-патол. психиатр.-1979.~№2.-С.206-.212.

A.Savic V., Solnceva E.f Horvat J., Jankovic B.i). Effects of aati-braia S-IOO protein antibodies on the bioelectric activity of snail neuions //Period. Biol.-1979.-v.81,N2.-P.215-216.

5.Солнцева Е.И., Булаев E.I,1. Влияние морфина и брадикинина на электрическую активность нейронов Helix //Нейрофизиология.-1979.-

T.II.-С.89-91.

6.Солнцева Е.И., Булаев В.М. Влияние морфина, -эндорфина и ыет-энкефалина на электрическую активность нейроноЕ Helix ponstia //Ж.эволюц.биохш.физиол.-1980.-т.16,№5.-С.42Ь-429.

6.Безрукова Л.В., Солнцева Е.И. Налоксон-зависимое ослабление морфином возбуждающих отбытое нейронов моллюсков на дофамин //Бюлл.эк-спер. биоя. кед. -1981. . -С. 51 -53.

9.Солнцева Е.И., Ведерникова Л.В., Позднякова А.Я., Полетаев А.Б. Влияние антител к белку s -100 и тубулину на электрогенные функции нейронов виноградной улитки //Д(Ш СССР.-I981.-т.260,№1.-С.252--256.

10.Безрукова Л.В., Солнцева Е.И. Налоксон-зависимое снижение ответов нейронов улитки на серотошн, вызванное морфином //Нейрофизиология.-! 981. -т.13,№5.-С.589-593.

П.Солицэъа Е.И., Безрукова Л.В., Амосова A.B. Сезонные особенности воздействия морфина и налоксока на дофаминовый ответ нейронов Kelix //Билл, зкспер. биол.тд. -1982. -М. -С .19-21.

12.Солнцева Е.И., Борисова О.В. Атипичные ответы на дофамин нейронов виноградной улитки //Бвлл.экспер.биол.мед.-1983.-№4.-0.3-5.

13.Солнцева Е.И., Безрукова Л.В., Амосова А.В. Избирательное ослабление морфином я эннофалинаки деполяризации, вызванной аппликацией дофамина на нейроны виноградной улитки //Нейрофизиология,--1983.-т.15,№1 .-С.10-15.

14.Борисова О.В., Солнцева Е.И., Скребицкий В.Г. Динамические изменения ответов нейронов моллюсков на цАШ при его многократных инъекциях //Ешл.экспер.биол.мед,- 1985.-№3.-С.291-293. I5.Solnt;seva 3.1., Bearukova L.V. Intracellular injection of CAMP and oGL'iP into ¿nail neurons induces an increase in Na+-conciuctance //Experisntia.-I9S5.-v. 41, Ы2. -P. 252-254-.

IG.S.-Hozoa K., Solntseva E.I. Modulation of cholinergic transaia- . si on by opiate peptide and Fffili'-amide 0:1 identified neurons of Helix pemotia //Acta Physiol.' Hung.-1986.-v.6? ,N'4.-P.429-453.

17.Солнцева Е.И., Позднякова А.Л., Савич В., Хорват И., Янкович Б. Изучение механизмов стимулирующего влияния противомозговых антител на Са^'+-токи нейрональной мембраны //Бюлл.экспер.биол.мед.-1987.-~!РП .-С. 537-539.

18.Воробьёв B.C., Солниева Е.И., Позднякова АД. Антитела к s-100 белку деполяризуют мембрану пирамидных нейронов я блокируют синап-ткческую передачу в срезах гиппокампа //ДАН СССР,-1987.-т.294,№5.-~С Л258-1261.

19.Борисова О.В,, Солнцева Е.И. Изучение роли цАМ® в генерации возбуждающих ответов на серотонин нейронов виноградной улитки // Бюлл.экспер.биол»мед.-1987.~№6.-С.657-659.

20.Позднякова A.J1., Воробьёв З.С., Солнцева Е.И. Олектрофизиологи-ческое изучение кейротропных эффектов антител к s -ТОО белку с использованием различных модельных систем /У В сб.:"Новое в иммунологии и терапии психических заболеваний", Труды ВНЦПЗ АЙН СССР, том ТУ, 0.36-39.-^.5 1988.

21.Солнцева Е.И. Устранение ингибирующего эффекта антител к белкам 2 -100 на кльциевый ток нейронов моллюска при внутриклеточной

инъекции ЭГТА //Бюлл.экспер. биол.мед. -1966. -С. 646-649.

22.Солнцева Е.И., Борисова О.Б. Имидазол вызывает длительное возрастание ШСП и потенциалзависимого кальциевого тот в нейронах моллюсков //ДАЛ СССР.-1986.-т.300,№3.-С.760-763.

23.Солнцева Е.И. Восстановление циклическим аденозикмонофосфатом потенциалозавискмого кальциевого тока, ингибированного противомоз-говыыи антителами //Нейрофизиология.-1989.-т.21 ,№2.-0.247-252.

24.Солнцева Е.И. Механизмы ингибирующего д&йствия циклического аденозинмонсфосфата .ка кальциевый ток интактных нейронов моллюска //Нейрофизиология,- 1990.-т.22,И.-С.54-51.

25.Солнцева Е.И. Роль цАШ> в генерации ответов нейронов моллюска, связанных с отрицательным сопротивлением, на аппликацию дофамина //Нейрофизиология.- I990.-t.22,»6.-0.846-649.

26.Солнцева Е.И. Внутриклеточная регуляция ионных каналов нейро-нальной мембрапы//Биол.мембр.-1991.-т.6,№6.