Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие цитокининов пуринового ряда и производных фенилмочевины в задержке старения листьев ячменя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие цитокининов пуринового ряда и производных фенилмочевины в задержке старения листьев ячменя"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ.К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ОРУДИЯ Эмин ЫуниО огми

УЧАСТИЕ ЩПШШИНОВ ПУРИНОВОГО РЯДА И ПРОИЗВОДНЫХ «шлыочшны В ЗАДЕРЖКЕ СТАРЕНИЯ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ

03.00.12 - Сизиология растений

Автореферат дяссэртация на ооискатао ученой стопонз кандидата биологических наук

Цэсква, 1992

' ' ( л

ч:. г".

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязеве РАН

доктор биологических паук, профессор Кулаева О.Н. кандидат биологических наук Романов Г.А.

доктор биологических наук, Клячхо Н.Л.

кандидат биологических наук, Косулина Л.Г.

Ведущее учреждение: Главный Ботанический Сад РАН

Завита состоится " * «»та Т-^^-^т-«—-ЧЕСЗВ ~ : ~~

на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растения им.К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., д.35. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН

Автореферат разослан ^^ ^^ 1992 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Учений секретарь Специализированного совета ханд. оаол. неук

Л.И.Сергеева

C'rt

' •"i'Ji 1 .

• ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Одна из центральных задач в

изучении механизмов действия цитокигошов состоит в поиска и изучении рвгуляторных систем, воспринимавдих гормональный сигнал и передвпплх ого на компетентные структуры клетки, такие как гена плоский аппарат, белок-синтезирупций комплекс и т.д..

Изучение 2тих проблем уделялось большое внимание в отношении цитокшшнов пуринового ряда (Кулаева, 1973;1982; Романхо и др., 1980,* Клячко и др., 1975; Саливанккна и др., I979;I982;I987;I988; Venia, 1985). В то же время вта проблема остаэтся малоизученоа для синтетических цотокжптов производных фешшючавяпн (Кулаэва, 1973; batham et al., 1973; Ieogai, 1981).

Известно, что антпцятокиштн пуринового ряда подавляют {пзиологическвй эффект не только цитокшшнов пуринового типа, но и производных феншшочевнны и, наоборот, антнцитохинзпш - производные феншаючешшн годавлявт физиологический сОфэкт цитокининов -производшос пурина (КоГГоМ et al., 1963; Ieogai, 19S1). Била показана воамоавость совместной невддитавноа регуляции цитокшвшеии пуриновой природа а производима фошимочевшш активности питратродуктазы из вародшша куколя. Показшш сходные механизма регуляции роста клеток в височках из листьев ,фасоли цитокининада обоих типов (Кулаэва а др., 1982). Эти результата позволяли предположить наличие обвдгб механизма действия цитокшшнов -производных пуриаа и фегошючввшш.

В то жа время, сяльша различия в алактро- в стереохюаческих свойствьх ползал в тих двух груш цатакнышт ародалагагт наличие для шх в клетках растение различных сайтов связывания (inogai, 1981; Kok: et al., 1982$ liataubara, 1930}t990t Shudo, 199t). Одновременно, в литература имеются далныо, говорявдв о способности цятокинипоа - производных февилночевпш индуцировать синтез пли вздергивать ресгад опдогонлых щпокшшга в шкоторнх культурах растителышх клэтск (Vankova et al., 1991). Показана такхэ возможность ингпбзропания цитокяшшаии* произведшая феншаючевзны, BitTHBHocTE цотокитш-сксддага, фермента ответственною га рассад и Еяактаведш) цптскшшюэ в растениях (коо&г et al., 19Ю; Borgan, 1990t Ohatiild ot л1., 19в6;1987).

fSRSit образом, сюденая о ыахангаш дойстезя двух химических классов цитокишюп достаточно протаварэЧаш. Сто ставал задачу

_ ч-

сравнительного исследования механизмов действия цитокининов этих двух типов. В качестве системы для изучения этого вопроса были выбраны изолированные старещие листья ячменя, наиболее хорошо изученный объект в отношении действия цитокининов пуринового типа (Кулаева, 1973; 1983). В частности, из этого объекта, были выделении два цитокинлн-связывавдих Солка (ЦСБ), с молекулярной массой ЗО кДа И 42-46 кЛа соответственно (КиХаета е4 а1., 1990; Ношапот е» а1., 1988), с предполагаемой рецепторной ролью для цитокининов. Прячем, если первый из них (80 кДа), являвдийся цитокишш-зависимым Фактором активации транскрипции, был неактивен в присутствии производных $вгоимочевины, то взаимодействие второго белка (42-46 кДа) с цитокининами производными фенилмочевиш оставалось неизученным.

_Цель И 3?,1»ТУ рдЛлто; Цдлии-ИАИД»—ТМАЧЧ'Ц Аила

изучение действия цитокининов пуринового ряда и производных {вгашючевины на старение листьев ячменя.

Перед вами стояли следующие задачи:

1. Изучить действие цитокининов производных фенилмочевины, а именно, тидаазурона и 4РЧ-Э0 (Н-фешл-ы-(2-хлор - 4-пиридал] мочевина) на задержку старения изолированных листьев ячменя в сравнепии с цитокининами пуринового ряда (дигкдрозеатином в 6-бензиламинопурином).

2. Провести сравнительное изучение связывания тидаазурона и 4Ри-эо с цитокинян-связывавдими белками (43-46 кДа) из цитозолл стареющих листьев злаков.

3. Изучить влияние тодиазурона и 4Р1/-Э0 на содерваше вндогенных цатокнтшов в изолированных листьях ячменя в связи о задорзхой их старения.

Научная новизна и практическая ценность; Показано, что сшшшке те «па роста листьев первого яруса растений ячменя связана с падением содержания в них еццогешшх цитокининов (зеатина и его рпОозвда). Прэтсм падание уровня (»дергания эндогенных цитокининов ускорялось при срезании листьев. Было показано, что старение срезанных листьев ячменя ыохет быть аадержало не только цитокшпгаами пуринового ряда (дагидроза атином и е-оепзвламинопуршюм), но в производными фешиыочевины гядааз уроном и 4кь30. В то &э время этот аффект достигался при водов высоких концентрациях последних. Наш гаккэ было показано.

что в цгггозоле листьев всех анализировавшихся ет!дов злаков (рохь, кукуруза, ячмень п шошща) присутствуют цитокиния-связцващио Селкп СЦ.СБ) о молекулярной массой 42-46 кДа. Эти белки обладала шсокоЯ оСфшшостьо к цптокиттам пуриювого типа (Кд=Ю-7-Ю"вМ) и отпоситольпо 1шзкой а№пностыо к тидиазурону, цитокинину пропзводпому фошш.тотештны (Кд=1-2хЮУстановлено, что связывание • тадиазурона и 4РЧ-30 цитогашин-связивающимн белками 5га цитозоля старощих лкстьов злаков на конкурентно по отношении к .цитокпшшам пуринового ряда, что указывает на та разные сайта связнвания. Связывание с ЦСБ тадиазурона или 4Ш-30 сникает айипность соответствующих сайтов связывания к цитоккнинам пурт-шовсго типа, в частности, к дигпдрозоатину. Это снижение Сило обратим?«. Иммунофэрмоитгаш анализом показано, что цптокнтты производим фенплмопевташ задаривает падение содержания бндогоншо. цятокштпов (зеатипа и ого рибозида) в срезанных листьях ячменя ц ото сопровождается задержкой старения этих лястьов.

Совокупность получениях данных позволила нам заключить, что для цитогстпшов пуринового ряда к производпш: фошхлмочевзшц вароятпо существуй1 различные механизмы действия в задержо старения ср08аппих листьев ячм-зня. Получению донтше позволяет также предполокить, что производные фэгшмочввшш проявляют свою ■ гаставпостъ в задержка старения срезанных листьев за счат влияния на мэтпболизм вндогенпых цагокптшоэ.

Аттробптртя работа: Осеовшэ результата работы Сила представлении на Всесоюзном Сишоззумэ по Хтяш Белков (Цуаяшо, 1990), 2-е« съезда БОТ? (Шсква, 1590), на 19-ой конференция та (Рим, 1969), на 14-ой коррекции 1Р08А (Амстердам, 1990).

Публикация; По гемэ диссертации спублнкозанно 10 печатных работ.

Стгягктура п овит работа: Диссертационная работа состоит вз введения, обзора литоретуры, описания объекта и методов исследования, изложения получениях результатов п их обсуждения, оаклшешя, визодоа и сшска использованной литература. Дкссортподанная работа пзжиина па страницах ыапиношеного

текста, содержит 3 таблгц, расушив. Отсох цнтвруоюоа

литература вхлшавт нйзюаощдай ез которых па

шгсстраншх кгшхах.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИСОЩОВАНИ-

Вся основная экспериментальная работа Сила выполнена на зрелых зеленых листьях первого яруса 10-дневных растений ячменя (Hordaun vulgare L.) сорта Винер. Как показали исследования, проведенные ранее в лаборатории профессора Кулвевой O.K., для этого объекта было показано быстрое старение отрезков листьев на воде и высокая чувствительность к экзогенным цитокининам, которые задерживали старение изолированных листьев (Кулаева, 1973). Более того, в настоящее время система изолированных стареющих листьев первого яруса растоняй ячменя является одной из наиболее полно изученных в отношении действия экзогенных цитокининов пуринового типа на фенологическом, биохимическом и молекулярном уровнях.

Растения ячменя выращивали в ящиках с почвой в факторостатшх условиях: температура воздуха днем cocTft'"""1* " нг»чмп-тп°п.

тунна светового дня - 16 часов, освещенность - 6000 лк. Перед посадкой, семена ячменя предварительно проращивались в течение 36 часов в кюветах с дистиллированной водой в темноте при температуре 26°С. Для посадки отбирали равномерно проросшие семена.

Биотести по влиянию вкзоганных цитокининов на старение листьев ячменя проводили по описанной ранее методике (Кулаева, 1973).Отрезки инкубировались в течение 6 суток на водных растворах испытуемых соединений при температуре 26°С и круглосуточном освещении 2500 лкс. Для нестабильных на свету соединений использовался темновой вариант биотеста (Мввеп et al., 1968). В каадой биологической пробе использовали 6-10 отрезков. Для получения каздой экспериментальной точки использовали не менее 3-х биологических и химических повтордастей. После инкубации, из отрезков 80Х этанолом экстрагировался хлорофилл и определялся спактрофотомегрически при длине волны 665 да.

Препараты цитогашип-связывавдих белков из цитозоля листьев злаков выделяли с использованием методики, описанной ранее (Романов в др., 1988). Для выделения цигокинин-связыващих белков использовала зрелые листья растений ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Винер, ржи (Seoale oerealae L.) Сорта ВЯТКЭ, ПШвНИЦЫ (Trltloua durun I.) сорта Московская-35 и кукурузы (Zea maye L.) оорта Астра-U. Растения злаков выращивались, как в факторостатных условиях, описанных ранее, так и в полевых условиях Московской области.

Методика постановки опытов по связыванию описана ранее (Романов и др., 1988). В этих опытах использовались меченые по тритию аналоги дигедрозеятина (857 ГБк/ммолъ), зеатииа (96 ГБк/ммоль) и тидаазуронп (99 ГБк/ммоль), синтезированные в Институте нуклеарной биологии и радиохимии ЧСАН (Прага, ЧСФР).

Определение содержания а опытном материале ондогешюго зеатина И его производных проводилось с использованием твердофазного конкурентного иммунофермоптного анализа на основе метода еыза о Использованием лерохсидазноЗ системы и поликлональных антител к золтину (Кудоярова и др., 1300).

Результаты и обсуждение

Кривая роста листьев первого яруса растений ячманя и содержание в них эндогенных цатоказшпов (зеатиаа и его риСозэда) продставлош! иа рис.1. Из рисунка видно, что рост листьев первого фуса растения ячменя закапчивается к 9-10 дна от проростания. Злродолепиа, с «спользсва;г/ом юялупкшмяпаских методов, содержания а листьях ячменя первого яруса цятсюсгжов (зеатина и ого рибозвдв) токозало, что их урошпь значительно спишется (примерно на тарядок) о хода стороння люта (см.рис Л). В период иезду 3 и 6 !Ц1ем падение содержания цитоккпинов а листьях наиболее существенно. Зйо продолхается, но менее резко, в период между 6 и 9 днем а ■Уходит па плато после 9 дня, когда прекращается рост листьев 1э'рвого яруса растений ячменя. Гшся образом икеотсд хорошая юррелядия кэаду содержанием эвдогепншс цотокгашюв в листьях н коросгью роста последних.

Возможно, низкая чувствительность иолодах (3-6 дней) листьев ймвпя к вкзогепннм цитекптшам объясняется относительно высоким ¡бдержшпвк в них епдогешшх гормонов: И наоборот, высокая увстштельность Э-12 давших листьев ячменя к якзогеншш Зтокияинам связано о падением содержания в них апдогенных зтогаиинов. В связи с отам, для оштоз использовались старо ссие истья ячнепя (10-12 деоП) о относительно низким содержанием пдогеппых гормонов.

Активность татототогоов пешзво динх пурина я зтузючашшц в бнотестат. схжовзнвых на задержка старения грезхов листьев ятаеаят- '¿и провала сравнигвлыюа язученав аа

25Г

ТНО

3 6 9 12 15 1В

Возраст растений, сут

Риал Рост листьев первого яруса на растениях ячменя и содержание в них видогеннмх цитокининов (зеатина и _его_ рибозида) , "" АН» яЛг>ддп_у«>я»я»- циацщмр паптптпгя п -ииманта появления всходов. На оси ординат даны длина листьев ( -о- ) в миллиметрах и содержание зеатина я его рибозида в молях на грат сирого веса ( -•— ).

2,5

2.0

£ 1.5

чо

1.0}-0,5

X В

10'

,-9

10"

10

10"

10'

,-5

Концентрация соединений, Ы

Р»о.2 Влияние цитокининов (I- 6-бензиламинопурина, 2- 4Ри-зо, 3-тидиаэурон, 4- аденин) на старение отрезков изолированных листьев ячменя. На оси ординат содержание хлорофилла в относительных единицах (А ббЬнм.). На оси абсцисс концентрация соединений в Молях. К- содержание хлорофилла в исходных листьях до инкубации В- содержание хлорофыиа в отрезках после инкубации на ьедо (6 суток).

цитокингоговую активность ряд производных как пурина, так и фешшлочввиш. Как показали результата (рис.2), всо испытуемые соединения (ВАЛ, 4pu-30 и тидиазурон), за исключением аденина, обладали высокой цитокининовоЯ активностью. Дозы максимального Эффекта составили, соответственно, для БАП 1хЮ-6М, а для 4PU-30 и тидивзуропа IxICT^H. Дози полумаксимального эффекта для этих соединений такте сильно отличались. Для БАП она составляла Ixicr'si, а для производных фэгоимочевины примерно 5хЮ-6М. Аденин был мало активен далее при концентрациях порядка 10"3М.

Поскольку зеатин и дигидрозеатин нестабильны в условиях освещения, отрезки листьев инкубировали с растворами этих соединений в темноте. При такой постановке биотэсга БАП, зеатин и дигидрозеатин обладали сходной и высокой цитокинлиовой активностью.

Таким образом било показано, что цктокиншш, как пуринового ряда, так и производные фепялмочевины обладают высокой активностью по заде рис о старения изолированных листьев ячмэля. Это ставило задачу изучить, как представители двух различил в химическом отношении классов соядинений оказывают сходное воздействие на процесс старения листьев ячменя. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать наличие конкурентного связывания производных этих двух типов цитогатинов с обнаруженными ранее в папой лаборатории сайтами связывания цитокзшинов пуринового типа на белках с молекулярной массой 42-46 кДа.

Выделение препаратов ЦСВ из листьев разных злаков. Для

выделения препаратов ЦСБ использовалась единая стандартная процедура. Исходные белковые препараты, полученные из листьев злаков, пэдзсргалась разделении пря шмозд ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharotjo Past Flow. Способностью спецпфгчоска связывать 'н-дигидрозеотин и *.Н-зеатин обладала только фракция белка, алшруемая студакчатшд градиентом 0.4 U Haci.

Полученная таким образом бэлковзя фракция подвергалась разделению мэтодон голь-хроматографт на Saphaoryi 8-гоо (рис.3). При разделении белковых фракций, полученных из листьев ячменя, шзеницы к рая, получала два пика связывания "н-дигядрозватина. Один из паков связывания совпадал о пакоы шхода высокомолекулярных белкоц и бал обусловлен неспацифкчесюш связыванием "Н-дигидрозеатииа. Второй пик связывания *й-дигидрозеаткиа совпадал 0 зоной выхода маркерного белка овальбудава с молекулярной кассой в

- /о -

Номер фракции

Рпс.З Разделение фракции ЦСБ из листьев ячменя, полученных после фракционирования на EBAE-Sepharoae Fast Flow, гель-фильтрацией на колонке с Sephaoryl S-200. На оси абсцисс указаны номера фракций. На оси ординат указаны поглощение ( -*- )(280нм.) и специфическое связывание Н-дигидрозеа тина ( -о- ). .

Концентрация немеченых лигандов, Ц

Peo.* Вытеснение меченных *Н- дигидрозеатина (I) и тидиазурона (2) немаче иыми из комплекса с ЦСБ из листьев злаков (ячмень). На оси абсцисс даны концентрации немаче ных аналогов в иолях. На оси ординат указан процент связывания от исходного.

- ff'

l3 кДа. Этот пик связывания был обусловлен специфическим Связыванием 3Н-дигидрозеатинв.

При разделении иа Sephaoryl S-200 пост-ДЕАЕ Фракции ЦСБ из Лйстьев кукурузы профиль злвции белков сильно отличался от oöötbqтствунцэго профиля для других использовавшихся злаков. Тем не МЙее, единственный, четко выраженный пик специфического связывания 'Н-дигидрозеатина, также выходил в непосредственной близости от зозш выхода маркерного белка овальбушна (мол. масса 43 кДа).

Полученные препараты ЦСБ из листьев злаков использовались в дйяьпейпем для изучения характеристик взаимодействия ЦСБ с цн^окигошами производными пурина и фешшючевиш.

Срашительпое.из^ченив__связывания__'Н-дипцрозеатина_и

ÜrfeSneSffioHa__Штогашиьспязывагс^ш__белками___цитозоля

листьев__злаков. Сайты специфического связывания меченых лигандов в

препаратах ЦСБ злаков определял! по способности избытка немеченых аналогов вытеснять связанную о ЦСБ радиоактивность. Использовали иэтод осагаденлл болсов сульфатом еиноняя, который, как было показппо рапе о (nomanov «t./kii i99o), давал качественно сходные результаты при сравнении с методами равновесного диализа п улмрафильтрацкн.

Как и следовало озидать, "Н-дпгидрозеатин, один из наиболее актшшх цитокишшов пуринового типа, активно специфически связывался ЦСБ из цитозоля листьев злаков (рис.4). "Н-тидиазурон, прскЬсодаоз фопщкочопяпа, обладает^ цягокининовой ектавяостьв в биотасте по задвржке старения отрезков листьев ячменя, был такхв способен специфячаскп связываться о соответствующими сайтами в npsnfapava ЦСЗ, соотно1Г.е:не caaunlixgciMro п яэсттфгасхого изязаванля для. *К-тндаозурона Сило зшзтш пгош, чем в случае вН-дйгндрозватина.

Копстатга диссоциации сайтов связывания *Н-тидиазурова, измаранная катодом Скатчарда, лекала в пределах 1-2x10"^, что на шзсй&вько порядков шзе соотватствупцэй константы диссоциации для сайтов связывания "н-дагидрозватшз (Ю^-Ю-8!/). Эти данные ршзавалд на то, что афЩносгь сайтов связывания на ЦСБ дая производных Феншзючовяич на 2 порядка еиеэ, чем для щтокишгаов пурапового ряда.

Лйгавднув. шзцвфпчпость связнващп *Н-дагвдрозеатнн и

-

вН-тидиазурон сайтов определяли по способности ряда немеченых цитокининов - производных пурина или фенилмочевины вытеснять меченые гормоны из их комплексе с ЦСБ из цитозоля листьев злаков.

Выте снэгае_ *Н=дягидрозе атина_из__сайтов__его__связывания

цитокининами - производными пурина и фенилмочевины. Как показали полученные результаты (рис.6а), немеченые дигидрозеатин и БАП были способны вытеснять в атом опыте "Н-дигидрозеапш из его комплекса о белком примерно на 55Х, т.е. специфическое связывание составляло около половины от общего. При увеличении степени очистки цитокишш-связывапщх белков уровень неспецкфического связывания снижался в ряде опытов до 20% от общего связывания. Половинный аффект от максимального вытеснения для зеатива, дигидрозеатина и БАП достигался при концентрациях последних порядка ШО~®М. Добавление одновременно С И" Щ'ЧЦЛШ Ил 1Г

достижению етого аффекта дата при концентрации 1х10-5М. Для тидиазурона и 4ри-зо етот аффект достигался при концентрациях, соответственно, 4х1(Г6М и 2хЮ"7М. Между теи, 4РЧ-30 и тидивзурсЯ обладали практически одинаковой способность!) задерживать старение изолированных листьев ячменя. Несомненный вывод на в тих опытов состоял в том, что цитокинивы - производные фенилмочевины обладают способность!) связываться ЦСБ из вдтозоля листьев злаков, выделенных но способности связывать шгтокинины пуринового ряда, хотя и с аффинностью существенно меньшей, чем у высокоактивных цитокининов пуринового ряда. Кроме того, производные фенилмочевины способны снижать аффинность ЦСБ к цитокюшнам пуринового типа.

1&те сне 'Н^тидааэ

~ производными пурина .и фенилмочэюшы. Как видно из рисунка (рас.66), мечекай тидаазурон вытеснялся немечеными тидиазуроноы и 4РСТ-30, в атом опыте, на 30-35Х при концентрациях последних 1x10"%, т.е. не специфическое связывание составляло 65-70% от общего связывания. В ряде опытов, при увеличении степени очистка ЦСБ, уровень неспецифаческого связывания снижался до 46-601. Половинный аффект от максимального вытеснения достигался для чри-эо и тидиазурона при концентрациях, соответственно, 5x10"% в 8х10~®Ы. Цитокинины пуринового ряда (дигидрозеатин, аеатин и ВАЛ) бала практически неактивны в вытеснении *Н-тидиаэурона из его комплекса с ШВ.

Эта данные позволили предположить наличие разных сайтов

100 90

м. ® 80

I 70

т

I 60

50 40

Концентрация немеченых лигандов

2

10-5 М

§ р>

лонцентрашя немеченых лигандов, М

рис.6 Вытеснение "Н-днгидрозэатина (А) и Н-тидиазурона (Б) из их комплекса с ЦСБ из цитозоля листьев ячменя различными немече *яыми лигацдами: I- дигидрозеатин, 2-6-бензиламинопурин, 3- ШЬЗО, 4- тидиазурон, 5-аденин. На оси ординат указано связывание мечен ого горюна в процентах к исходному связыванию. На оси абсцисс указаны концентрации добавленных намечен ых гордонов в Молях.

связывания для вН-дигидрозеатина и *Н-твдиазурова и наличие неконкурентного механизма взаимодействия а тих двух типов цитокшшпов.

Для проварки этого предположения вытеснение связаного эН-днгидрозеатина сзрией концентраций немеченого аналога проводили в присутствии постоянной концентрации лрч-зо.

^теспение_*Н;йИ1т^^зеатгаа_н

Присутствие 4ги-зо уменьшало связывание эН-дигидрозеатипа с цсб. Это уменьшение .проявлялось как в отсутствии, так и в присутствии всего диапазона ( Б порядков ) концентраций не\ » ного дигвдрозеатина, и, хотя различалось по абсолютным значениям, но в относительном выражении било примерно одинаково (тао.1), пдрдрщ^.'п— -от—конца а грацид немече пого дагидрозеатнна.Удаление 4РП-30 из реакционной смеси путем гельЗильтрацик не сефодексо 6-25 приводах» к полному количественному восстановлению способности ЦСБ связывать "Н-дигидрозеатин.

Эти данные ■подтвердили ноле предположение о неконкурентна.» и обратимом характере снижения производными фепилшчешпы свявшшдя цитокининов пуршювого типа соотвотствулшши сайтами сьяодшняя. па . ЦСБ из цитозоля листьев злаков.

Вытеснение *Н-дагидрозеатина из соответствующих сайтов связывания при добавлении тт-зо имело близкие значения при ипкубациа как в стандартных условиях, гак и при условиях предварительного осаздония белков 804 от насыщенна сульфатоы аммония, т.е. в условиях, неблагоприятных для мекбвлкошх взаимодействий. Это говорит в пользу присутствия обоих катав сайтов на одном белке или общем белковом коышюксе. Дэйстхатедьво, способность связывания *Н-тадаазурона сохранялась у ЦСБ посла нескольких стадий очисти,. вклвдахщих осаждение сульфатом шашая, ионообменную и гидрофобную хроыатогрьЗиз, а тага» голъ&шЬтращй). При разделении ва колонке Мово-О свотеад №10 пшш связивашя тадааауропа и дигидрозэахкаа ело довали сяшхронпо с' выходах! одновраыенво (рио.6).

Таким образш, совокупность получанных ддшш позволила ваклхшть, что действие цитокининов - пропвводдох февшаютвЕсш ва старание изолированных лкстьав ячмеая, о одной стороны, сходно о аналогичным действием цитокининов пуринового типа, а о другой

Комер фракции

Рис. 6 Разделение цитокинин-связываища белков из цигозоля листьев злаков (рожь) на колонке «ono-q система fplc. На оси ординат указаны поглощение при длине волны 280нм. | -»- ) и связывание Н-дигидрозеатина ( -о- ) и Н-тидиазурона < -о- ). На оси абсцисс указаны номера фракций. Пунктирная линия указывает линейный градиент (0-1,0 м kci) элюции.

Таблица I. Влияние 4PU-30 в постоянной концентрации (10"7М) па вытеснение Н-дигидрозеатина его немечен зм аналогом в различных концентрациях.

Концентр. Соотноше- 'связывание аН- -дигидроэеатина Подавление

немэчен. ние 4PU- 1...... связывания

дигидро- -30 и не- в присутствии в отсутствии Н-диги-

зеатина мечен ого 4PU-30 4РО-ЭО дрозеатина

дигидро- dpm 1 в присут-

зеатина dрт i i ствии 4PU-

i -30 в % i

1 0 — 1 9900 ' II483 ' 14% '

' Ю-9М 100:1 9385 ' 1СГ760 ' 13% '

' IO_öM 10:1 6690 ' 7760 14«

1 Ю~7М 1:1 • 3836 ' 4496 ' 15% '

' 10-6М 1:10 3260 ' 3596 10% '

' ю_ьм 1:100 2900 ' 3330 ' 13% '

оюрош, «итоюапшы этих двух тшов не имеют общих сайтов связывания на ЦСБ из цитозоля старещих листьев злаков. Это позволяло предположить, что цнтокшшш - производные фенилмочевины проявляют свою ¿шттность в биотесте по задержке старения изолированных листьев ячменя опосредованно, через катаболизм эндогенных цитокининов пуринового типа.

Изучение__влияния__экзогенно. _ добавленных__Ш19Ш2Э25

производных дифенилмочевиш на содержание в листьях__ячменя

эндогенных цитокининов. пуринового типа.. Для изучения влияния на содержание эндогенных, иятокшшнов пуринового ряда экзогенных цптокошнов производных дифешшючевины, последние использс ались в концентрации 10_6М, поскольку именно при етой концентрации паблвдались пая боло о сильные различия в действии цитокятвпюп ■Пурттнового гааа^1-цршашдщ1Г1Щдцыочбвшш. '

Било показано, что в хода старения срезанных ластьав ячменя (при инкубации в течотш Б суток на водо) происходит резкое падение (примерно на два порядаа) содоркашя заатипа и его рмбозида па сравнению с исходным уровнем (т.е. до поыащопия отрезков ка воду) (рис.7А). Содержание в отрззках хлорофилла также падь^о весьма зпачптельно по сравнению с исходим (рис;7Б).

При инкубации отрезков листьев на растворах, содержащих цитокяшшы - производные фонилыочешшы, уровень содержания андогенного веатина ц его рибозида снижался горазда меньше, чей в контрольных отрезках, янкуОировавшхся на воде (ряо.71). Содержание в этих отрезках хлорофилла также незначительно падало, но в то и время было выше чем у отрезков, инкубировавшихся на воде (рлс.7Б). Таким образом, полученные результаты позволяют заключать, что тидиазуроп н 4РН-Э0 влияют на метаболизм вндогевиых цатокшашов в срозанних'листьях, торлозн их убыль и задерживая стармта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что в период роста первого листа на растоцпях ¡гшт происходит неуклонное снижение содзргапил в них щдогеннцзс цитокининов, которое достигает тшиуиа и выходит ва плата к 9 дню, когда прекращается рост листьев и начиназтся вх старание. Низков содоркаше ондогешшх цитокининов дэлаот 10-12 дне вниз листья пербого яруса, растений ячыаня внсокочуЕСТвагольннма к екзогешш цитокинкнал. Срезание листьев сопрововдаатся лвлмтявяягц падением содержания в ■ них вндогевных цитокининов н старешш

10

п

Контроль Вода Твдиазурон 4Ри-Э0

0,8 г

0,6

ш 0,4

1П '

VI)

0,2

п

Контроль Вода Тидиазурон 4РИ-Э0

Рис.7 Содержание вндогешшх цитокшшнов (А) (зеатипа и его риоозада) и хлорофилла (В) в Зх сантиметровых отрезках листьев первого яруса 10-дневных растении ячменя, инкубированиях в течегега 6-ти суток на водах растворах производных фешимочевгош в концентрациях 10 41.

— /&-

листьев, о чей мы судили по убили в них хлорофилла. Как показали наши результата, шйвктивно задеркать старение срезанных листьев ячменя можно не только с поыоац>1> цитошшинов пуринового ряда, но и производными фвнилмочевшш - тацназуроноы и 4Ри-30, взятыми в концентрациях, в 15 раз более высоких, чем для БАП.

Чтобы понять загадку одинаковой физиологической активности у столь различных в химическом отношении соединений, как цитокинины пуринового тепа и производные фетгалмочевшш, мы проанализировали связывание производных фенилмочевшш с выделенной из цптозоля листьев злаков белковой фракцией ЦСБ, обогавешюй сайтами связывания цитокшюнов пуринового типа (зеатина, дигидр^еатияа, изопентениладетгав, кинетипа и БАП). Проделанная работа показала,

что 4РЧ-30 и тидиазурон обладали в 50 раз мэнып°й -

_£шм——чии цитишиш пур;шового типа. Их связываний о указанными белками бнло нектошурэятиш по отнопони» к цитошлпшм пуршювого ряда, что уквьиваот на различие сайтов свяаавания для этих двух груш цитокшптов. Связывание ЦСБ с тадиазуроном и 4РЧ-30 снижало аффинность этих болков к цкток^лшам пуринового типа, ио это снижение било обратило.

Совокупность полученных данных позволяет говорить о различиях в механизме действия цитоюшшов стих двух классов, несмотря на одинаковое проявление их биологической активности - аадергащ старения лиотьев.

Используя метод конкурентного твердо-фазного иммуноформэнтного анализа, мы показали, что тидиазурон и 4Ри-зо способны задерживать падение содйржания вндогэпних цитоккштов в срезанных гастьяж ячменя. Это- действие цитсшпшюа - производных фэнялмочовиш сопровоадалось задер»?ой их старания.

Таким образом, полученные в ходе работы данные позволили предположить, что активность вдтокшшиов пуринового рада в производных фэшимочевиш в вадэрхка старения изолированных лиотьев ячменя, несмотря на какуиуюся сходвосчь, обусловлена, вероятно, различными иахашимши дейотвия: вовмогно, провзводаэ фэнилиочашши проявляют цетскшшювяй еффект, вадоргивая убшп.

8ПДОГЭЕНЫХ ЦИТОКЕШШОВ ПурШОВОГО ТШШ.

швода

I. С помощью Ешунофаршктного анализа показано, что сшташш тайна роста листьев первого яруса растений ячневя коррелирует с педзтаы

содержания в нт эндогенных цитокининов, которое ускоряется при срезании листьев.

2. Установлено, что старение срезанных листьев порвого яруса растения ячменя может быть задержано не только цитокининами пуринового ряда, но и производными фэнилмочевюш - тидиаэуроном и 4PU-30, взятыми в 16 раз больших концентрациях по сравнению с цитокининами пуринового типа.

3. Обнаружено, что в цитозоле листьев злаков (ячменя, ржи, кукурузы и пшеницы) присутствуют цитокгашл-связыввпцие белки с молекулярной массой 42-46 кДа, обладающие высокой аффинностью к цитокишнам пуринового ряда (Кд=IО-7-1) и относительно низкой аффинностью к тидиазурояу (Кд=1-2хЮ-6М).

4. Выявлено, что связывание тидаазурона и 4PU-30 цитокинин-связываюцими белками из цйтозоля листьев злаков не конкурентно по отношению к цитокишнам пуринового ряда, что указывает на различные сайта их связывания.

5. Связывание цитоютин-связнваших белков с тидиазуроном и 4PU-30 сникало оффштость этих белков к цитокинялам пуринового типа. Это cmotenno было обратимым.

G. Глмуноформзн-пшм анализом показано, что тидиазурон и 4PU-30 задэрхивают падание содержания эндогешшх цитокининов (зеатина и его производных) в срезанных листьях ячменя, что сопровождается задержкой старо ¡гая этих листьев.

7. Совокупность полученных нами дашшх позволяет предположить, что механизм действия производных фонилмочэвины и цитокининов пуринового ряда в вадеркке старения срезанных листьев ячменя различен. Возиокио, производные фешлмочевипи проявляют цитокмшновую активность в задержке старения срезанных листьев ячменя за счет влияния на метаболизм эндогенных цитокишшов в а тих листьях.

CraiQOK ^аСот^^огцОжковаит

1. Романов Г.А., Бровко Ф.А., Таран В.Я., Оруджев Э.М., Венис П., Кулаева О.Н. Получение и свойства высокоочищепных цитокгаын-связываиодх белков из некоторых злаков. // Тез. Всес. Симпозиума по Химии Белков. -Пущино,1990. -стр.70.

2. Романов Г.А., Таран В.Я., Венис М.А., Орудквв З.М., Кулаева О.Н. Новое семейство цитокинин-связивавдих белков злаков. // 2-ой съезд ВОФР. -Москва,1990. -стр.77.

-JO-

3, Pouohob Г.ü.., Tapan В.Я., Ору да в 3.!;«, Кулсова 0.11. 8оатш1-связшшщаэ белел злаков: возрастные, органные, тканэшэ я оубклэточше аспекта. // Физиология раотешй,1991. т.38, шп.6, отр.ТМЗЗ.

4. Taran V.Ya., Orudgev К.И., Romanov G.¿. Oytoidnin-binding protolwi and thoir looalleation in oeroala. // 19 th Heating oí. PEBSs Abetraoto. -Home, 1989. -141325.

Б. Orudgov E.K., Taran V.Ya., ilomanov O.A. Иш оооигепоэ oí oytokinin-binding protoina in oerealo: physiological relévanos. // Phyaiology and bioolieinieiry of oytolcinina in plante; Abatraoto. -Hblioa,1990. -р.4Э .

6. Bomanov O.A., Breeinova A., Orudgav Е.Ц., Hauusli J. Strong interaction of dtkyüroaoatin with oytokinin blr.diq~ protein froa_ barley loavo» - // PhpnJ^lagy—wri—nf r.ytnk{n-(n* ir, planta: Abatraotu. -Liblio«,19SO. -p.49»

7. Ногаотот O.A., Toru-.i 7.Ya., Orud£av Е.1Г., Voniu U., Kulaava O.K. A novel oyioltinin-binding pi*otein /¡unil}' in oei^sai planta. // Phyeiology end biooheoiintry of oytoldnina iri plantas Atatraots. -Liblioo,1990. -p.50.

0. Orudis? E.M. Ze>atin-bindin£ pjfoteino of caroalo! с см ontogenetic aopoots. // 5-th International? Youtti Ey&posiuo on Plant líetabolion Regulation. Abntraate. -Yarn«, 1990. -p.75.

9. Romanov Q.A., Orudgev Е.Ы., Brovko Г.А., KuXeava О.И. Ceroal' oy toUlnin-binlint; proteins belonging to putativa roooptoi-fenlly reoognics purine as wall aa j&enylureo oytokinlca. //14th International Oonfareno^ oí Slant Growth Substance»« Abolraota. -Asiatewlm, 1991. -p.44. .

10. Orudgev Е.И., Torsn V.Ya.» Огомко P.A., ftoasanov Q.A. Temporal bnl вpaticd distribution of soluble cytokinin binding proteina in oeroaln: ita relation to oyto&inia ooatont end Borwotivity. // 14th.'International Ooaferenoe . of Pleat' Growth BubBtanoess Afcctraoto. -¿E-3tordfja,1991. -p,51.

Орудоз s.Ы.