Диссертации » Биологические науки » Биохимия

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений"

На правах рукописи

Мубаракшина Мария Мансуровна

УЧАСТИЕ ПУЛА ПЛАСТОХИНОНА В ВОССТАНОВЛЕНИИ

КИСЛОРОДА В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2006

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Иванов Борис Николаевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Семенов Алексей Юрьевич,

доктор биологических наук Боиченко Владимир Алексеевич.

Ведущая организация:

Институт биохимии

ям. А.Н. Баха РАН, г. Москва,

Защита состоится 20 цеуабря 2006 г. в 1] часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фувдамедтальвых проблем биологии РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 2, ИФПБ РАН,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Автореферат разослан

ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема восстановления кислорода в фотосннтетической электрон-транспортной цепи (ФЭТЦ) хлоропласте® высших растений и водорослей возникла после открытия этого явления Мепером (Mehler, 1951). По мере выяснения состава переносчиков ФЭТЦ и ее структуры становилось все более очевидным, что перенос электронов, поступивших в ФЭТЦ от воды, на кислород — явление неизбежное в кислородной атмосфере Земли: часть переносчиков ФЭТЦ обладают достаточно низкими окислительно-восстановительными потенциалами, чтобы восстановить молекулу Oj. За зга годы не раз менялись представления об основной роли, которую этот процесс мог бы играть в хлоропластах. В результате восстановления 02 продуцируются активные формы кислорода (АФК), такие как супероксндный анион-радикал, Oj*-, и перокекд водорода, Н202, которые могут играть деструктивную роль. Считается, что в результате переноса электронов на кислород поддерживается электронный транспорт, ведущий к аккумуляции протонов в люмене тилакондов, обеспечивающей как синтез АТФ, не сопряженный с восстановлением НАДФ\ так и стимуляцию процессов, ведущих к диссипации энергии в антенне (виолаксантиновый цикл); а также происходит окисление переносчиков ФЭТЦ, предотвращающее фотоингибирование и обеспечивающее протскавие циклического электронного транспорта вокруг Фотосистемы 1 (ФС1). В последние годы основное внимание уделяется возможной сигнальной функции этого процесса, когда АФК, образующиеся в ФЭТЦ, передают информацию о состоянии ФЭТЦ системам регуляции.

Возможно, что каждая нз выше перечисленных функций важна в тех иди иных условиях жизни растений. Однако если до сих пор нет общепринятого мнения о реальной важности этих функций, то, прежде всего, потому, что остается неизвестным механизм самого процесса. Довольно рано сложилось представление, что основными восстановителями кислорода в ФЭТЦ выступают компоненты акцепторной части ФС1, которые имеют самые низкие окислительно-восстановительные потенциалы среди переносчиков ФЭТЦ. Существенную роль в восстановлении кислорода приписывали растворимому железо-серному акцептору - ферредоксину, пока не было выяснено, .что константа скорости его окисления кислородом невелика. Предполагалось, что восстановление кислорода с образованием АФК происходит и на акцепторной стороне Фотосистемы 2 (ФС2). Одним из вероятных кандидатов является восстановленная молекула феофитина, первичного акцептора электрона в ФС2 (Клевапик с соавт., 1977). Время жизни этого состояния мало при ненасыщенном фотосинтезе, около 200 пс (Shuvalov et al,, 1930;

Nuijs et al., 1986). Однако, при восстановлении пластохинона (ПХ) происходит накопление анион-радикала феофптиы", который может окисляться кислородом (KJimov et al., I9S5). Тем не менее, было выяснено, что восстановление кислорода в ФС2 невелико (окислительно-восстановителыше потенциалы однократно-восстановленных терминальных акцепторов /л situ выше (Petrouleas & Diner, 1987), чем окислительно-восстановительный потенциал пары Oj/Ог*-) и возрастает только при нарушении целостности тилакоидной мембраны (Хоробрых с соавт,, 2002). Возможность восстановления кислорода в пуле пластохинона не отрицалась, но отсутствие экспериментальных данных долгое время не позволяло оценить вклад этого переносчика в восстановление кислорода в ФЭТЦ. С другой стороны, весьма близкий к ПХ компонент электрон-транспортной цепи митоховдрий, убихвнон, уже давно рассматривали как главный продуцент АФК в этих органеллах. Первые убедительные данные о восстановлении кислорода в пуле пластохинона тилакоидов были получены в нашей лаборатории (Khorobrykh & Ivanov, 2000). Были исследованы pH-зависимости этого процесса. Показано, что происходит одноэлектронное восстановление молекул Ог и что непосредственным восстановителем служит пластосемнхинон, ПХ*~. Однако, многие вопросы остались невыясненными. В какие реакция может вступать суперокснд, возникший в ауле пластохинона? Какой вклад в обтее восстановление кислорода в ФЭТЦ может вносить пул пластохинона в разных условиях функционирования ФЭТЦ? Как влияет участие пула пластохинона в восстановлении кислорода на функционирование других компонентов ФЭТЦ? Знание механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода имеет наибольшее значение для понимания хронологически последней из приписываемых этому процессу функций, а именно, продукции АФК как сигнальных молекул. Предположено, что пул пластохинона является частью механизма поддержания баланса между накоплением и детоксикацией АФК (Maciejewskan et at., 2002). В настоящее время известно (Allen, 2002), что окислительно-восстановительное состояние этого пула инициирует целый ряд регуляторных процессов в клетках растений, в частности, активирует работу как хлоропластвых, так и ядерных генов. Было высказано предположение, что АФК, образующиеся в пуле пластохинона, могут служить сигналом о состоянии ФЭТЦ системам экспрессии генов (Ivanov & Khorobrykh, 2003).

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в установлении механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода в ФЭТЦ. Для достижения этой цели в ходе выполнения диссертационной работы решались следующие задачи:

1. Исследовать характеристики восстановления кислорода в пупс плаетохинона при ингнбировании переноса электронов от пуда плаетохинона к ФС1;

2. Установить вкязд пула плаетохинона в восстановление кислорода в ФЭТЦ;

3. Выяснить участие дула плаетохинона в образования конечного продукта восстановления кислорода в тилакопдах, Н^Оз;

4. Исследовать характеристики окисления пула плаетохинона в условиях восстановления кислорода в ФЭТЦ.

Научная новизна работы. Впервые был оценен вклад пула плаетохинона в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ. Было показано, что участие пула плаетохинона в восстановлении кислорода зависит от интенсивности света я при высокой интенсивности света составляет 50 - 70 % от общего восстановления кислорода в ФЭТЦ. Новым результатом, полученным в ходе выполнения работы, является доказательство того, что образование перокенда водорода в ходе восстановления кислорода частично происходит внутри тилакоидной мембраны. При этом с увеличением интенсивности света относительный вклад внутратилакоидного образования пероксида водорода в суммарное образование НгОг увеличивается. Как результат обобщения полученных экспериментальных данных предложена модифицированная схема функционирования ФЭТЦ, которая включает реакции переноса электрона с участием молекул кислорода и супероксида.

Практическая значимость работы. Полученные в диссертационной работе данные позволяют по-новому представить функционирование ФЭТЦ высших растений в кислородной атмосфере, что весьма важно для понимания механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу. Исследование участия пула плаетохинона в восстановлении кислорода позволяет лучше понять ангиоксидантные функции хинонов в растительных тканях. Учитывая, что АФК выступают как универсальные сигнальные молекулы в клетках в условиях стресса, от которых напрямую зависит функционирование ФЭТЦ, детальное знание механизмов образования АФК в ФЭТЦ важно для направленного конструирования генома растений, более устойчивых к изменениям окружающей среды.

Дпробапия работы. Основные положения работы изложены яа V съезде Общества Физиологов растений России (Пенза, 2003); XVI зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004); Ш съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); Юбилейной конференции,

посвященной 70-летию В Л. Скулачева (Москва, МГУ, 2005); XVJH Путинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотоснатезе» (Пущино, 2005); б"1 International conference on tetrapyrrole photoreceptors in photosynthetic organisms (Lucerne, 2005); 14th European bioenergetics conference (Moscow, 200$), международной конференции «Photosynthesis in the post-genomic era; structure and function ofphotosystems» (Pushchino, 2006),

Публикации. По теме диссертационной работ опубликовано 12 печатных работ, из них три статья в реферируемых журналах, включая международные.

Структура диссертация. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов в объекта исследования, 4 разделов, где представлены основные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ

Q?K>P литературы составляет первую часть диссертации. В нем изложены современные представления о структуре в функционировании ФЭТЦ. Часть обзора посвящена проблеме образования активных форм кислорода в ФЭТЦ. Представлены сведения о структуре, формах пластохиноиа в функциях пула дластохитона.

Объекты и методы исследования. Эксперименты проводили на изолированных твлакоидах, когда кислород является единственным акцептором электронов. Тилакоиды выделяли нз листьев 10-14 дневных проростков гороха, выращенных в теплице при естественном освещении. Среда реакции содержала 0,1 М сахарозу (0,4 М сахарозу — для измерений цитохрома/к пластохннона), 20 мМ NaCl, 5 мМ MgCb, 50 мМ Hepes-KOH Соля рН 7,8), 50 мМ Mes-KOH (для рН 6,5), 50 мМ Mes-KOH/Glycine (для рН 5,0), 1 мхМ грамицидин D (10 мкМ грамицидин D - для измерений цитохрома / и пластохннона). Концентрация тилакоидов соответствовала 10-15 мкг Хл мл'1 (100 мкг Хл мл'1 - для измерений цитохрома/ н пластохннона). Скорость фотосинтетического выделения/поглощения кислорода измеряли а термостатируемой стеклянной ячейке объемом 3,2 мл при 21°С с помощью рОг-электрода клзрковского типа, соединенного с компьютером через аналого-цифровой интерфейс. Для измерения поглощения кислорода при функционировании только ФС1 перенос электронов от ФС2 блокировали 10 мкМ диуроном, а подачу электронов к Р700 осуществляли с

помощью донорной пары, -100 ыкМ ТМФД и 5 ыМ аскорбата натрия. В опытах с донораой парой в среду реакции добавляли супероксиддисмутазу (СОД), 100 ед мл"', для предотвращения реакции окисления аскорбата супероксидом. Во избежание влияния неспецифических аффектов СОД ее добавляли в среду и в опытах без донорной пары. Модулированную флуоресценцию хлорофилла измеряла с помощью флуорпмегра РАМ-101 (Walz, Germany). Для генерации вспышки насыщающего белого света использовали осветитель FL-103 (Wals, Germany), соединенный с РАМ-103. Восстановление цитохрома С, цитохрома / и окисление ипастохикоиа регистрировали с помощью спектрофотометра {Hitachi 553, Japan) по изменению оптической платности при J. т 550 нм в сравнении с плотностью при 540 нм; при X — 554 нм в сравнении с плотностью при 545 км и при JL = 263 нм в сравнении с плотностью при 243 нм и X » 283 ем; соответственно. Реакционную смесь освещали с помощью диапроектора «ЛЭТИ» или «Свитязь» через красный светофильтр КС-10 (X > 600 нм); интенсивность света изменяли посредством нейтральных светофильтров (HCl, НС7, НС9) и измеряли с помощью Li-Cor quantum meter (model LI-250). Анаэробные условия в суспензии тилакоидов создавали с помощью системы, состоящей из ферментов глюкозооксндазы (20 ед мл"1) и каталазы (£00 ед мл"1), а также 10 мМ глюкозы. Для «расстыковки» тилакоидов гран в среды выделения, суспендировали» и реакции не добавляли NaCl и MgCli. Концентрация К* в среде реакции, содержащей в этих экспериментах 25 мМ HEPES, составляла 10-12 мМ. Суперокснщ-зависимую скорость восстановления цитохрома С рассчитывали как разницу между скоростью восстановления цитохрома С в отсутствие СОД и скоростью восстановления цитохрома С в присутствии СОД.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристики восстановления кислорода в пуде дластохинона в присутствии ДНФ-ИНТ. Иргнбитрра окисления пластогидтк^цщона bg/fщгуохромным комплексом

В предыдущих работах было предположено, что восстановление кислорода в пуле пластохинона происходит в результате реакции взаимодействия кислорода с плаетосемихиноном с образованием супероксида внутри тилакоидной мембраны (Kborobrykh & Ivanov, 2002; Ivanov & Khorobrykh, 2004). Нами было показано, что не все супероксиды, образующиеся при восстановлении кислорода в пуле пластохижша, выходят из мембраны в среду. Для оценки количества суперокеццов, оказывающихся вне мембраны,

была использована реакция окисления аекорбата супероксидоы. Аскорбат в низких концентрациях не накапливается внутри мембраны тилакоидов, хотя и проникает через мембрану в люмен тилакоидов (Foyer, 1995), т.е. может взаимодействовать с 0¡*~ не только в среде, но к в люмене. При добавке аекорбата в суспензию тилакоидов его реакция с супероксидом заменяет реакцию дисмутшщи супероксидов, в стехиометрия между переносом электронов по ФЭТЦ н поглощением кислорода изменяется. В отсутствие аекорбата процесс'описывается уравнениями (1), (2) и (3) со стехиометрией е\ Q¡ = 4 : !; в присутствии аекорбата процесс описывается уравнениями (1), (2) и (4) со стехиометрией е : Oi-3:4.

2Н20-ОаТ + 4Н*+4<?' (1) - фотолиз воды в ФС2.

Ае + 40з4- - 40i*~ (2) - восстановление кислорода.

Увеличение скорости поглощения кислорода при неизменной скорости электронного транспорта в присутствии аекорбата показывает, что реакция дисмутацки супероксидов действительно заменяется реакцией взаимодействия супероксида с аскорбатом (Таблица 1).

восстановления кислорода, и присутствие аекорбата не влияет на нее. Из увеличения скорости поглощения кислорода было рассчитано, какое количество супероксидов вступило в реакцию с аскорбатом (Таблица 1) (вывод соответствующих формул приведен в диссертации).

Как показано в Таблице 1, при рН 6,5 из мембраны выходят и взаимодействуют с аскорбатом И % супероксидов, а при рН 7,8 - 38 %. Различие, может быть, обусловлено тем, что при величинах рН выше значения рК для супероксшха (4,8) при увеличении значения рН на единицу константа скорости реакции днемутацаи супероксидов уменьшается на порядок. Более низкий выход супероксидов в среду при рН 6,5 по сравнению с рН 7,8, возможно, объясняется более высокой скоростью их дисмутацин внутри мембраны, однако протекание этой реакции в апротонной среде с низкой диэлектрической проницаемостью затруднено (Asada & Takahashi, 1988).

При рН 7,8 дисмутация заряженных супероксидов происходит с низкой скоростью, но в среде обнаруживается менее 40 % от числа супероксидов, которые должны были возникнуть в мембране. Этот факт позволил предположить, что супероксиды, образовавшиеся в

40j*~+4Н* = 2НгОг + 20гТ 40j*" + 4АскН = 4НгОг + 4МДА

(3) - дисмутация Ог*~.

(4) - реакция Oj*- с аскорбатом.

Скорость переноса электронов в присутствии ДНФ-ИНТ ограничена на стадии

мембране, вступают там в реакцию с пластсгидрохиноном, ПХН2, ведущую к образованию Н2Оц

СЬ^+ПХНг-НзОз + ПХ*" (5).

Таблица 1. Количество супероксидных .анион-радикалов, вступающих в реакцию с аскорбатом вне тилакоидной мембраны, в процентах от общего количества этих радикалов, образующихся в тилакоидах при восстановлении кислорода.

рН Добавки в среду реакции Поглощение кислорода, мкмоль (мг ХлУ'ч"1 Супероксидные радикалы, вступающие в реакцию с аскорбатом, %

6,5 ДНФ-ИНТ •И,57±0,9 11

ДНФ-ИНТ, аскорбат •15Д7±0,7

7,8 ДНФ-ИНТ -11,07±1,0 33

ДНФ-ИНТ, аскорбат •21,15±1,2

Интенсивность света 480 мкмоль фотонов м"1 с"1. Концентрация тилакоидов 15 мкгХл мл"1. ДНФ-ИНТ 5мкМ. Аскорбат 2,5 мМ.

Эта реакция термодинамически благоприятна вследствие большой разницы величин Ей пар ПХ—/ПХН3 (370 мВ) н 0г*"/Н202 (940 мВ).

Образование пероксида волопола внутри ттт^РУУУШ^Я мумбраны и его количественная опенка

Исследование образования пероксида водорода внутри мембраны проводили с использованием добавленного в среду щггохрома С, который действует как ловушка супероксидных радикалов. Неспособный проникнуть в мембрану тилакоидов, шггохром С взаимодействует с супероксидами вне мембраны, предотвращая образование пероксида водорода за счет реакции дисмутации супероксидов вне тилакоидной мембраны. В предварительных экспериментах было найдено, что при рН 7,$ насыщение суперокенд-зависямой скорости восстановления цнтохрома С достигается при концентрации щггохрома С 30 мкМ. Показано, что после освещения тилакоидов в присутствии цнтохрома С добавка каталазы приводит к выделению кислорода (рис. 15.), что свидетельствует об образовании

пероксида водорода не только вне тилахоидов. На рис. 1а для сравнения показано выделение кислорода при добавке катаяазы после освещения в отсутствие цитохрома С. В присутствии щггохрома С скорость поглощения кислорода меньше, поскольку цитохром С, окисляя супероксиды, «возвращает» кислород в среду, а также, являясь акцептором электронов, приводит к дополнительному выделению кислорода га воды в ФС2, что изменяет баланс кислорода в суспензия.

Для количественной оценки электронного транспорта, участвующего в образовании пероксида водорода в присутствии цитохрома С, в одной пробе измеряли скорости изменения концентрации кислорода и восстановления цитохрома С. С помощью формул, учитывающих стехиометрию протекающих при этом процессов, находили долю электронного транспорта, участвующего в образовании пероксида водорода в присутствии цитохрома С в общем потоке электронов во ФЭТЦ. Данные, одного из экспериментов приведены в Таблице 2 (эксперимент I).

Í -+■ кяпчииоа

Рве. 1. Светоиндуцировакное изменение концентрации кислорода в суспензии тнлакондов. а. - в отсутствие, б. и е. - в присутствии 60 мкМ цатохрома С. а. и б.-обычные, е.—«расстыкованные» тилакоиды. Каталаза 500 ед мл'1. Концентрация тилакоидов 10 мкгХлмл'1. Интенсивность света 450 мкмоль фотонов

Было найдено, что в среднем (по данным более 30 экспериментов) в образовании перокенда водорода в присутствии цитохрома С при интенсивности света 450 мкмоль

фотонов м"1 с"' участвует 45 "А электронов от общего количества электронов, восстанавливающих, кислород в ФЭТЦ. В отсутствие цнтохрома С, когда все электроны участвуют в восстановлении кислорода, используя измерения в присутствии цнтохрома С, можно рассчитать, что во внутритилакоидном образовании Н2О1 участвует более 60 % электронов, восстанавливающих кислород (Таблица 2, эксперимент I).

Были экспериментально проверены другие причины, которые могли приводить к образованию пероксида водорода в присутствии цнтохрома С. Помимо образования внутри тилакоидов образование НгОг могло бы происходить либо за счет СОД, «неотмывшейся» с мембраны тилакоидов в процессе выделения, либо в зоне стэхинга тилакоидов, куда проникновение цнтохрома С затруднено. Рис. показывает, что значительное образование Н]Оа в присутствии цнтохрома С происходит и в расстыкованных» тилаколдах. Доля электронов, участвующих в этом образовании Н2О2, уменьшается в среднем на 10 % по сравнению с «обычными» тилакоидами. Нельзя исключить, что это изменение - результат того, что реакция 02*~ с ютгохромом С в гранах затруднена. Однако, скорее всего это результат изменения взаимодействия переносчиков ФЭТЦ в условиях «расстыковки» тилакоидов 0еюш>£5 е( а!., 1983). Присутствие в среде цианистого калия и азида натрия, которые ингиблруют все типы СОД, встречающиеся в растениях, практически не влияло ла количество электронов, участвующих в образовании пероксида водорода в присутствии цнтохрома С.

Внутри тилакоидов образование НгОз возможно как в мембране, так я в люмене тилакоидов, в последнем случае как результат реакции днсмутапии супероксидов, выходящих в люмен из мембраны. Было найдено, что изменение потока супероксидов в люмен при изменении его объема, и изменение скорости днсмутацни супероксидов в люмене, путем варьирования рН люмена, существенным образом не влияли на эту величину. Изменение объема люмена достигали изменением осмолярности среды, варьирование рН люмена - исключением из среды реакции грамицидина О (при рН среды 7,8 значение рН в люмене на свету в его отсутствие ниже, чем в его присутствии).

Количество электронов, участвующих в образованна пероксида водорода в люмене тилакоидов, было прямо оценено с помощью добавки в среду инкубации тшгакоидов аскорбата в присутствии насыщающей концентрации СОД. Как указывалось выше, аскорбат проникает в люмен, а наличие СОД предотвращает взаимодействие аскорбата с супероксидами вне тилакоидаой мембраны. Способ расчета был аналогичен тому, который использовали для получения результатов, представленных в Таблице 1, но данные в

Таблица 2. Поток электронов, участвующих в образовании перокснда водорода в тилакоидах (эксперимент I) и в люмене (эксперимент Ц), в процентах от общего потока электронов в ФЭТЦ.

Экспер имент Добавки вср^ду реакции Изменение содержания кислорода мкмоль, (мгХп)"'ч"' Восстановление цитохрома С, мкмоль, (мгХл)-'ч"1 Электроны, участвующие в образовании НгОз, % от общего потока электронов по ФЭТЦ

I - -б,79±0,32 62

цнтохром С, 40мкМ +1,34±0,25 22^0±5,1б 43

П СОД, 50 ед мл"' -7,25±0,12 5.8

аскорбат, 0,5 мМ СОД, 30 ед мл"' -8,10±0,17

Интенсивность света 450 мкмоль фотонов Концентрация тнлакоидов МмкгХлмл*1.

последнем столбце в Таблице 2 (эксперимент II) относятся (из-за присутствия СОД в среде) только к электронам, образующим супероксиды, проникающие в люмен. В среднем эти электроны составляют около 10 % от общего потока электронов к кислороду. Это максимальная опенка, т.к. нельзя исключить, что частично увеличение скорости поглощения кислорода в присутствии аскорбата может происходить вследствие дотирования аскорбатом электронов в ФЭТЦ на уровне пластоциании/Р700.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что значительная часть электронов, поступивших в ФЭТЦ при разложении воды, участвует в образовании перокснда водорода внутри тилакоидной мембраны в условиях, когда кислород - единственный акцептор электронов.

Влияние интенсивности света на количество электронов, участвующих в образовании петюксида водорода внутри тилакоидной мембраны

На рис. 2 представлены световые зависимости скорости поглощения кислорода (А) и супероксид-эависимой скорости восстановления цитохрома С (Б) при функционировании полной ФЭТЦ. Видно, что супероксид-эависимая скорость восстановления цитохрома С

насыщается при интенсивностях света около 300 мкмояь фотонов м"г с*1, в то время, как скорость поглощения кислорода увеличивается с увеличением интенсивности света до значительно более высоких значений. Скорость восстановления цитохрома С показывает скорость появления супероксидов вне тилакоидов, а скорость поглощения кислорода при умножении на 4 дает общее число супероксидов, генерируемых в ФЭТЦ при восстановлении кислорода (см. уравнения 1-3). Увеличение с увеличением интенсивности света разницы между скоростью поглощения кислорода и скоростью восстановления цитохрома С показывает, что при более высокой интенсивности света большее число супероксидов остается внутри тилакоидов.

Я I'

¡1 а 8

и

г г

5 9

з I > I

х ™

а 8.

I к

г

Л 10

с

Э Н

109

100

зоо 400 500 боо

700

Интенсивность света, мкмсль фотоне* м с"

Рис. 2. Световая зависимость скорости поглощения кислорода (А) и супероксид-завясимой скорости восстановления цитохрома С (Б). Концентрация тилакоидов 10 мкг Хл мл"1.

Описанным выше способом можно оценить, как с увеличением интенсивности света изменяется доля электронов, участвующих в образовании перокевда водорода внутри мембраны. Результаты экспериментов, представленные в Таблице 3, показывают, что в образовании кероксида водорода внутри мембраны в присутствии цитохрома С при 75 мхмоль фотонов и2 с"1 участвуют 22,5 % электронов, поступающих в цепь «от воды», а при 600 мхмоль фотонов м*1 с"1 - 57,0 % (при интенсивности света 450 мкмоль фотонов м"1 с"1 -43 % (Таблица 2 эксперимент 1)). Таким образом, при увеличении интенсивности света доля электронов, «связываемых» в пероксцд водорода внутри мембраны возрастает, т.е.

увеличение интенсивности света приводит к росту продукции тех супероксидов, которые участвуют в образовании H2Q1 внутри мембраны.

Как было рассмотрено выше, скорость реакции дисмутации супероксидных анион-радикалов внутри тнлакоидной мембраны при рН среды реакции 7,8 невелика (Taiahashi & Asada, 19SS). Полученные результаты, показывающие, что значительная часть образовавшихся супероксидов участвует в образовании пероксида водорода в мембране, позволяют предположить, что и в присутствии ДНФ-ИНТ, при ингибировании переноса электронов к ФС1, и ори функционировании полной ФЭТЦ, этя супероксиды вступают в реакцию с пластогидрохиноном (реакция (5)). Из этого предположения следует, что пул пластохинона должен принимать заметное участие в процессе восстановления кислорода в ФЭТЦ.

Таблица 3. Зависимость количества электронов, участвующих в образовании пероксида внутри тилакоядов, от интенсивности света.

Интенсивность света, мкмоль фотонов м"г с"1 Поглощение кислорода, мкмоль (мг Хл)" V Восстановление цитохромаС, мкмоль, (мг Хл)"'ч*! Электроны, участвующие в образовании Н2О2, % от общего патока электронов по ФЭТЦ

75 •2,62*0,07 14,77±0,44 . 22,5

630 -4,7б±0,1б 18,10*0,28 57,0

Концентрация тилакоидов ЮмкгХлмл'1.

Учасрте пула пластохинона в восстановлении кислорода в ФЭ7П

В качестве подхода к выяснению участия пула пластохинона в восстановлении кислорода в ФЭТЦ был использован анализ световых зависимостей скорости восстановления кислорода на разных участках цепи. На рис. 3 представлены зависимости скорости поглощения кислорода в тилакоидах в присутствии ДНФ-ИНТ при трех значениях рН. Как видно из рисунка, во всех случаях скорости поглощения кислорода насыщались при низких интенсивностях света. Наименьшие скорости наблюдались яри рН 5,0; они близки к скорости поглощения кислорода в присутствии диурона, что свидетельствует об очень низкой' скорости восстановления кислорода в пуле пластохинона. Эта скорость увеличивалась при увеличении рН только до 6,0-6,5.

Как указывалось выше, восстановление кислорода в пуле пластохинона является одноэлектроиным а происходит при взаимодействии молекул Ог с молекулами ПХ*~: ПХ*~+Ог = ПХ + 01*~ (6).

Термодинамические свойства пар ПХ/ПХ*** и О1/О2*" достаточно хорошо объясняют увеличение скорости восстановления Ог тилакоидами в присутствии ДНФ-ИНТ при увеличении рН до рН 6,0-6,5; редокс потенциал пары Ог/О/" -160 мВ в исследуемом диапазоне рН не изменяется, так как рК суперохсида равно 4,8, а редокс потенциал пары ПХ/ ПХ*~ уменьшается при увеличении рН, достигая постоянной величины -170 мВ при рН 6,0, равному значению рК для пластосемяхшона (Нащка е1 а!., 1983). Более высокая величина редокс потенциала пары ПХ/ПХ*- при рН 5,0 делает термодинамически мало вероятным восстановление кислорода в пуле пластохинона при этом значении рН.

3

15-1

10-

з

а

3-

¡Г

в

100

200

—I—

300

—I—

400

—I

500

Интенсивность света, мкмоль фотонов м^с'1

Рис. 3. Световые зависимости поглощения кислорода при ннгнбировании переноса электронов от пула пластохинона к ФС1 в присутствии 5 мкМ ДНФ-ИНТ при рН 5,0 (А), 6,5 (Б) а 7,8 (В). Концентрация тилакоидов 15 мкгХл мл'1.

Параллельные измерения скорости восстановления кислорода при функционировании полной ФЭТЦ показали, что эта скорость ие насыщалась до высоких интенсивностей света (см. рис. 4). Оценка вклада пула пластохинона в восстановление кислорода в полной ФЭТЦ на основании сравнения скоростей поглощения кислорода при ингнбнровании переноса электронов от пула пластохинона к ФС1 в присутствии ДНФ-ИНТ и при функционирований полной ФЭТЦ, однако, невозможна, поскольку в присутствии ДНФ-ИНТ не происходит

физиологического окисления ITXHj. В отсутствие ингибитора функционирование ФС1 может влиять на реакции в пуле. Оценку вклада пула пластохинона в восстановление кислорода в полной ФЭТЦ можно провести, сравнивая электронный транспорт к кислороду при функционировании полной цени и при функционировании ФС1 в присутствии донорной лары (аскорбат + ТМФД (липоф ильный донор электронов для ФС1)) и диурона, В обоях случаях реакцией, лимитирующей перенос электронов в ФС1, является восстановление кислорода на ее акцепторной стороне, что было проверено с использованием метилвнологена, искусственного акцептора электронов. В силу своего низкого редокс-потенциала, -440 мВ, метилвиологеа принимает электроны от ФЭТЦ только на акцепторной стороне ФС1. Константа скорости второго порядка для восстановления ыетилвиологена равна 1,7 х 10a М"1 с"1 (Asada & Takahashi, 1987), что на порядок выше константы скорости второго порядка для восстановления Оз в ФС1 (k°Wx 10тМ"' с'1) (Asada & Nakano, 1978). В восстановленном состоянии метилвиологен быстро окисляется кислородом. Как видно из данных, приведенных в Таблице 4, скорость поглощения кислорода как при функционировании полной цепи, так и «изолированной» ФС1 выше в присутствии метилвнологена при всех значениях рН.

На рис. 4 (а, б., е.) показаны световые зависимости скорости поглощения кислорода тилакоидами при функционировании полной ФЭТЦ и «изолированной» ФС1 при рН 3,0, рН 6,5 и рН 7,8, соответственно. Как видно из этих рисунков, скорости поглощения кислорода в полной цепи и в ФС1 достигают насыщения только при рН 5,0, - при 500-600 мкмоль фотонов м"1 с"1. При более высоких значениях рН насыщение не наблюдалось, даже при интенсивности света выше, чем 800 мкмоль фотонов м*: с*1.

Скорости поглощения кислорода в ФС1, измеряемые в экспериментах с донорной парой, показывают потенциально возможные скорости восстановления Oí на этом участке, которые могут наблюдаться при функционировании полной ФЭТЦ в случае, если донированиё электронов к ФС1 не является лимитирующим (Таблица 4).

Таким образом, скорость переноса электронов к кислороду на участках ФЭТЦ до ФС1, можно рассчитывать как разность между скоростями переноса электронов к кислороду в полной цепи и в «изолированной» ФС1. Полученные при этом скорости показывают минимально возможный вклад других, помимо ФС1, участков ФЭТЦ, т.е. акцепторной стороны ФС2, компонентов пула пластохннона и переносчиков ¿^комплекса, в восстановление кислорода. На вставках на рис. 4 вклад этих участков в восстановление 02

показан в процентах от общего числа электронов, восстанавливающих молекулы Oi в ФЭТЦ.

Таблица 4. Влияние рН и метилвиологена на скорость поглощения кислорода в суспензии изолированных шлакоидов на свету прн функционировании полной электрон-транспортной цепи и короткой цепи, включающей только ФС1.

Добавки в среду реакции Поглощение кислорода мкмоль (мг Хл)"1ч'1

рН 5,0 рНб,5 рН7,8

- -11 ¿±0,8 -9,б±0,7 -9,4±0,8

метилвиологен -41±4 -149±8 -170±7

ТМФД/ аскорбаг, диурон -9,5±0,7 -10,б±0,7 -7,7±0,б

ТМФД/ аскорбаг, диурон, метилвиологен -57±2 -1б0±9 -183±8

Интенсивность света 500 мкмоль фотонов м"3 с"'. Концентрация тпакоидов 15 мкгХлмл"1.

Диурои 10 ЫхМ. Аскорбаг 5 мМ. ТМФД 0,1 мМ. Метилвиологен ОД мМ.

При увеличении интенсивности света этот вклад увеличивается и при высоких ннтенснвностях достигает 50 % прн рН 5,0 н составляет около 70 % и 60 % при рН 6,5 н рН 7,8, соответственно.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что при рН 5,0, когда ни один компонент ФЭТЦ на участке от воды до ФС1, включая пластосемихинон-радикал ПХ*~, яе способен восстановить молекулы Oj (см. выше), этот участок вносит 50 %-ный вклад в восстановление кислорода до пероксида водорода. Теоретически, 50 %-ное участие переносчиков ФЭТЦ, расположенных до ФС1, может наблюдаться, если супероксидные радикалы, возникающие в ФС1, восстанавливаются этими переносчиками. Таким переносчиком может служить пластогидрохинон, ГОШг, термодинамически благоприятная реакция которого с Ог*~ внутри мембраны уже предполагалась выше. Как компонент пула цластохинона, ПХНц, распространен по всей мембране и обладает высокой подвижностью в ней (Rich, 1984, Haehnel, 1984).

Ивгевсивностъ с fiera, икмоль фотонов н с

А

Í-

10

15

№ 1си} jw 300 400 j00 «ю 700 800 900 Интенсивность света, мкмоль фотонов m'V

JO

в.

Рис, 4. Зависимость поглощения кислорода тилакоидами при функционировании полной электрон транспортной цедя (1) и функционировании только ФС1 (2) при рН 5,0 (а), рН 6,5 (Л) и рН 7,8 (е.). На вставках при соответствующих величинах рН показан вклад участка ФЭТЦ «до ФС1» в восстановление кислорода в процентах от общего числа электронов, участвующих в восстановлении Ог в ФЭТЦ. Концентрация тилакоидов 15 мкг Хл

Более высокий, более 50 %, вклад участка ФЭТЦ до ФС1 в восстановление кислорода пр« рН 6,5 и рН 7,8 обусловлен, очевидно, тем, что ПХ*~ при этих значениях рН способен восстанавливать молекулы 0¡,

Окисление пула шгастохннона после выключения света

Данные литературы (Шувалов & КрасновскиЙ, 1975; Takahashi & Asada, 1988) предполагают, что сусероксидный анион-радикал может сохраняться в тнлакоидной мембране в секущшом интервале времени. Бели его реакция с ПХНг протекает на свету, она должна проявиться при окислении пула плаетохинона в первые секунды после выключения света.

Было найдено, что после освещения тнлахоидов в анаэробных условиях пул плаетохинона остается в темноте в восстановленном состоянии; количество восстановленных молекул при этом близко к имеющимся в литературе данным о величине этого пула. Появление окисленных молекул плаетохинона после освещения тилакондов в аэробных условиях состояло из двух фаз, быстрой и медленной:

Рис, 5. Изменение количества окисленных молекул плаетохинона после прекращения освещения тилакондов слабым, 50 мкмоль фотонов м"1 с"1 (А) и сильным, 500 мкмоль фотонов м*1 с'1 (Б) светом. Концентрация

тилакондов 100 мкг Хл мл.

во время быстрой первой фазы появилось примерно 50 % я 30 % молекул плаетохинона от общего числа молекул плаетохинона в пуле после освещения светом высокой и низкой интенсивности, соответственно (рис. 5).

Измерения выхода флуоресценция хлорофилла а в аэробных условиях показали, что степень восстановления пула пластохинона была близка при обеих интенсивиостях света. Отсутствие свегонндунированных изменений редокс состояния цитохрома/ при обеих интенсивн остях свидетельствовало, что быстрая фаза не связана с переносом электронов от пула пластохинона иа высокопотенциальные компоненты ФЭТЦ. Тот факт, что окисление пула пластохинона наблюдается только в аэробных условиях, указывает на участие или Oj, или Ог*~ в этом процессе. Есшее значительный вклад быстрой фазы появления молекул ПХ после освещения сильным светом соответствует более высокой скорости восстановления кислорода при увеличении интенсивности света (рис. 4). Это свидетельствует о том, что именно реакция с участием продукта восстановления кислорода, Qi*~, количество которого (в отличие от количества О2) зависит от интенсивности света, определяет величину быстрой фазы появления ПХ. После выключения света накопившиеся в мембране супероксиды окисляют молекулы ПХН2 с образованием молекул ПХ*- (реакция (5)). Последние могут днсмутнровать:;

ПХ*- + ПХ~«=ПХ + ЛХН1 (7).

или окисляться в реакции (6), - в обоих случаях с появлением молекул ПХ. Хотя константа равновесия реакции (7) велика, порядка Ю10 (Rich, 1984), а реакции (б) всего около 1,5, реакция (б) в отличие от реакции (7) не имеет кинетических ограничений из-за электростатического отталкивания реагентов.

После исчерпания супероксидов, накопившихся ва свету, последующее окисление пула пластохинона происходит, очевидно, за счет окисления молекулами Оз молекул ПХ*-(реакция (б)), образующихся в реакции обратной реакции (7), с последующим окислением молекул ПХН] образующимися супероксидами (реакция (5)), что дает дополнительные молекулы ПХ*~. Последние, однако, возникают в малом количестве, и реакция (5) протекает медленно. Очевидно, именно это определяет медленную фазу появления ПХ (рис. 5).

Заключение. Схема восстановления кислорода в фотосшггетнческой электрон-транспортной пищ

На основе полученных данных нами предложена схема функционирования ФЭТЦ, в которой имеется два участка восстановления Q¡ до Oí*-, акцепторная сторона, ФС1 и пул пластохинона (рис, б).

Мы считаем, что основными восстановителями 0¡ до Ог~ являются акцепторы ФС1. В работах Asada с соавт. (1974, 1988, 2004) приводятся данные, свидетельствующие в пользу

того, что восстановление кислорода на этом участке и, соответственно, образование супероксида происходит внутри мембраны. Наше главное предположение состоит в том, что образующиеся внутри мембраны супероксиды восстанавливаются молекулами пластощдрохинона.

НА

К

Рис. 6. Схема восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной кепи при низкой (А) и высокой (Б) интеиснвностях света.

Схема на рис. б учитывает описанные выше наши экспериментальные результаты, а именно: при увеличении интенсивности действующего света 1) увеличивается восстановление кислорода в ФЭТЦ (рис. 2,4); 2) большее число образующихся супероксидов остается внутри гилакоидов (рис. 2); 3) увеличивается вклад пластохинона в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ (рис. 4); 4) возрастает восстановление кислорода в ФС 1 (рис. 4); 5) возрастает доля электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри мембраны (таблица 3); 6) возрастает вклад быстрой фазы в общее окисление пула пластохинона после освещения (рис. 5).

ВЫВОДЫ

1. При восстановлении кислорода в условиях ингвбирования переноса электронов от пула пластохинона к Фотосистеме 1 не все образующиеся супероксиды покидают мембрану: количество супероксидных радикалов, регистрируемых в среде, составляет 10 % при рН 6,5 и 40 % при рН 7,8 от количества супероксидов, возникающих в процессе восстановления молекул Ог.

2. При восстановлении кислорода в условиях функционирования полной электрон-транспортной цепи тилаковдов часть молекул пероксида водорода образуется внутри тилаковдов. Доля потока электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри тилакондов, в общем переносе электронов в фотосиитетической

;электрон-транспортной цепи к кислороду растет с увеличением интенсивности света, достигая 60 % при высокой интенсивности света.

3. Основная часть пероксида водорода, возникающего внутри тнлакоидов, образуется внутри тилакоидной мембраны; при высокой интенсивности света в образовании Н2О2

. \ внутри мембраны принимает участие не менее 40 % потока электронов к кислороду в

-, условиях, когда кислород единственный электронный акцептор. Образование пероксида водорода в люмене тнлакоидов незначительно по сравнению с образованием пероксида водорода в тилакоидах; доля электронов, участвующих в этом образовании, составляет не более 10 % от общего переноса электронов в фотосинтетической электрон-транспортной цепи к кислороду.

4. При низкой интенсивности света участие пула пластохннона в восстановлении кислорода в фотосивтетической электрон-транспортной цепи невелико, но возрастает с увеличением интенсивности света до 50 % при рН 5,0 н до 60-70 % ери рН 6,5 и 7,8.

5. После прекращения освещения тнлакоидов наблюдается двухфазная кинетика появления окисленных молекул пластохннона. При этом после освещения светом высокоб интенсивности во время первой быстрой фазы появляется 44 % молекул пластохннона от общего числа молекул пластохннона в пуде, а после освещения тнлакоидов светом низкой интенсивности - 26 %. Величина быстрой фазы коррелирует со скоростью восстановления кислорода на свету. Сделан вывод о том, что эта фаза наблюдается в результате окисления молекул пласто гидрохинона супероксидамн, накопившимися в мембране на свету.

6. Предложена модель восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Отличительной чертой этой модели является кооперативное участие в этом восстановлении Фотосистемы 1 и пула пластохннона, восстановленные молекулы которого восстанавливают супероксидные анион-радикалы, генерируемые как в Фотосистеме 1, так и в пуле пластохннона, с образованием пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны.

Публикации по теме диссертации

Тезисы:

1. Мубаракшина М.М., Хоробрых С А., Иванов Б.Н. Участие пластохннона в восстановлении кислорода в электрон-транспортной цепи хлоропластов высших растений; V Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция "Физиология растений - основа фотобиотехнологии" (Пенза, 15-21 сентября 2003 г.), стр. 58.

2. Мубаракшина М.М, Участив пластохинона в восстановлении кислорода в фотосннтетической электрон-траисиорпгой цепи: Учебпо-научный центр Института биоорганической химии им, М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, XVI Зимняя молодежная наупгая школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 9-12 февраля 2004 г.), стр. 74.

3. Хоробрых С.А., Мубаракшина М.М., Иванов Б.Н. Механизм участия пластохмшжа в восстановлении кислорода в тилахоидах: Ш Съезд биофизиков России (Воронеж, 2429 июня 2004 г.), стр. 477-478.

4. Mubarakshina, М.М., Khorobrykh, S.A., Ivanov B.N. Plastoquinone participation in oxygen reduction in thylakoids and intramembrane formation of hydrogen peroxide: Юбилейная конференция, посвященная 70-летию В.П. Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, МГУ, 21-23 февраля 2005 г.), стр. 51-52.

5. Хоробрых С.А., Игнатьев А.Р., Мубаракшина М.М., Иванов Б.Н. Пути восстановления кислорода в тилакоидах: XVm Путинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 19-23 июня 2005 г.), сгр. 20.

6. Мубаракшина М.М., Козулева М.А., Хоробрых С.А., Иванов Б.Н. Характеристики восстановления кислорода в пуле пластохинона: XVIII Путинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 19-23 шоня 2005 г.), стр. 38-39.

7. Mubarakshiaa М.М., Khorobrykh S.A., Ivanov B.N. Participation of plastoquinone in oxygen reduction and formation of hydrogen peroxide in thylakoids: 6th Internationa] conference on tetrapyrrole photoreceptors in photosynthetic organisms (Lucerne, 11-16 September 2005), p. 81.

8. Ivanov В., Mubarakshina M., Khorobrykh S. The role of plastoquinone pool in production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplast thylakoids. 14th European bioenergetics conference (Moscow, 22-27 July 2006), p. 419.

9. Ivanov В., Mubarakshina M,, Khorobrykh S., Kozuleva M. Reactive oxygen spccies generation nduced in thylakoids by photosynthetic election transport: Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosy stems (Pushchino, 20-26 August 2006), p. 130.

Статьи:

10. Khorobrykh, M. Mubarakshina, B. Ivanov B, Photosystem 1 is not solely responsible for oxygen reduction in isolated thylakoids, Biochim, Biophys. Acta 1657 (2004) 164-167.

11. Мубаракшина, M.M., Хоробрых, C.A., Козулева, M.A., Иванов, БЛ. Внутримембранпое образование лероксида водорода при восстановлении кислорода в тилакоидах высших растений. Доклады Академии Наук 408(1) (2006) 118-121,

12. Mubarakshina, М., Khorobrykh, S. Ivanov, В. Oxygen reduction in chloroplast thylakoids results in production of hydrogen peroxide inside the membrane, Biochim. Biophys. Acta 1757(2006)1496-1503.

Список сокращений;

АФК - активные формы кислорода;

ДИФ-ИНТ - 2*,4*-динитрофенилэфнр 2-йодо-4-ншротнмол;

ПХ, ПХНг, ПХ*~ - пластохинон, пластогндрохинон и пластосемихинон-радикад соответственно;

СОД - суперокснддисмутаза;

ТМФД - N, N, N', N' - тетраметил-р-фенилендиамин;

Принято к исполнению 14/11/2006 :-. Исполнено 14/11/2006

Заказ N2 921 Тираж: 100 экз.

Типография «11-Й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36. {495)975-78-56 www.autorefcrat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мубаракшина, Мария Мансуровна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие представления о процессе фотосинтеза растений

1.1.1. Организация фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений

1.1.2. Мембранный комплекс фотосистемы

1.1.3. Мембранный комплекс фотосистемы

1.1.4. Переносчики фотосинтетической электрон-транспортной цепи хлоропластов

1.1.5. Пластохиноны - подвижные переносчики электронов фотосинтетической электрон-транспортной цепи

1.2. Кислород и активные формы кислорода

1.2.1. Синглетный кислород

1.2.2. Супероксидный анион-радикал

1.2.3. Пероксид водорода

1.2.4. Гидроксильный радикал

1.2.5. Липидные пероксиды

1.3. Образование активных форм кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Выделение тилакоидов

2.2. Измерение скорости выделения или поглощения кислорода в суспензии тилакоидов

2.3. Измерение флуоресценции хлорофилла тилакоидов

2.4. Измерение восстановления цитохрома С в тилакоидах

2.5. Измерение изменений окислительно-восстановительного состояния цитохрома/в тилакоидах

2.6. Измерение окисления пула пластохинона после выключения света

2.7. Освещение

2.8. Измерение концентрации хлорофилла

2.9. Создание анаэробных условий

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика восстановления кислорода в пуле пластохинона в присутствии ДНФ-ИНТ, ингибитора окисления пластогидрохинона Ь<//цитохромным комплексом

3.2. Внутритилакоидное образование пероксида водорода при функционировании полной фотосинтетической электрон-транспортной цепи и его количественная оценка

3.2.1. Образование пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны

3.2.2. Возможные причины образования пероксида водорода в присутствии цитохрома С

3.2.3. Влияние интенсивности света на количество электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны

3.3. Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи

3.3.1. Влияние интенсивности света на скорости поглощения кислорода при функционировании полной фотосинтетической электрон-транспортной цепи и при ингибировании физиологического пути окисления пула пластохинона

3.3.2. Влияние интенсивности света на участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи

3.4. Окисление пула пластохинона после выключения света

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений"

Актуальность проблемы. Проблема восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ФЭТЦ) хлоропластов высших растений и водорослей возникла после открытия этого явления Мелером (МеЫег, 1951). По мере выяснения состава переносчиков ФЭТЦ и ее структуры становилось все более очевидным, что перенос электронов, поступивших в ФЭТЦ от воды, на кислород - явление неизбежное в кислородной атмосфере Земли: часть переносчиков ФЭТЦ обладают достаточно низкими окислительно-восстановительными потенциалами, чтобы восстановить молекулу 02. За эти годы не раз менялись представления об основной роли, которую этот процесс может играть в хлоропластах. В результате восстановления 02 продуцируются активные формы кислорода (АФК), такие как супероксидный анион-радикал, 02'~, и пероксид водорода, Н202, которые могут играть деструктивную роль. Считается, что в результате переноса электронов на кислород поддерживается электронный транспорт, ведущий к аккумуляции протонов в люмене тилакоидов, обеспечивающей как синтез АТФ, не сопряженный с восстановлением НАДФ+, так и стимуляцию процессов, ведущих к диссипации энергии в антенне (виолаксантиновый цикл); а также происходит окисление переносчиков ФЭТЦ, предотвращающее фотоингибирование и обеспечивающее протекание циклического электронного транспорта вокруг Фотосистемы 1 (ФС1). В последние годы основное внимание уделяется возможной сигнальной функции этого процесса, когда АФК, образующиеся в ФЭТЦ, передают информацию о состоянии ФЭТЦ системам регуляции.

Возможно, что каждая из выше перечисленных функций важна в тех или иных условиях жизни растений. Однако если до сих пор нет общепринятого мнения о реальной важности этих функций, то, прежде всего, потому, что остается неизвестным механизм самого процесса. Довольно рано сложилось представление, что основными восстановителями кислорода в ФЭТЦ выступают компоненты акцепторной части ФС1, которые имеют самые низкие окислительно-восстановительные потенциалы среди переносчиков ФЭТЦ. Существенную роль в восстановлении кислорода приписывали растворимому железо-серному акцептору — ферредоксину, пока не было выяснено, что константа скорости его окисления кислородом невелика. Предполагалось, что восстановление кислорода с образованием АФК происходит и на акцепторной стороне Фотосистемы 2 (ФС2). Одним из вероятных кандидатов является восстановленная молекула феофитина, первичного акцептора электрона в ФС2 (Клеваник с соавт., 1977). Время жизни этого состояния мало при ненасыщенном фотосинтезе, около 200 пс (Shuvalov et al., 1980; Nuijs et al., 1986). Однако, при восстановлении пластохинона (ПХ) происходит накопление анион-радикала феофитин", который может окисляться кислородом (Klimov et al., 1985). Тем не менее, было выяснено, что восстановление кислорода в ФС2 невелико (окислительно-восстановительные потенциалы однократно-восстановленных терминальных акцепторов in situ выше (Petrouleas, Diner, 1987), чем окислительно-восстановительный потенциал пары ОгЮг') и возрастает только при нарушении целостности тилакоидной мембраны (Хоробрых с соавт., 2002). Возможность восстановления кислорода в пуле пластохинона не отрицалась, но отсутствие экспериментальных данных долгое время не позволяло оценить вклад этого переносчика в восстановление кислорода в ФЭТЦ. С другой стороны, весьма близкий к ПХ компонент электрон-транспортной цепи митохондрий, убихинон, уже давно рассматривали как главный продуцент АФК в этих органеллах. Первые убедительные данные о восстановлении кислорода в пуле пластохинона тилакоидов были получены в нашей лаборатории

Khorobrykh, Ivanov, 2002). Были исследованы pH-зависимости этого процесса. Показано, что происходит одноэлектронное восстановление молекул 02 и что непосредственным восстановителем служит пластосемихинон, ПХ,. Однако, многие вопросы остались невыясненными. В какие реакции может вступать супероксид, возникший в пуле пластохинона? Какой вклад в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ может вносить пул пластохинона в разных условиях функционирования ФЭТЦ? Как влияет участие пула пластохинона в восстановлении кислорода на функционирование других компонентов ФЭТЦ? Знание механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода имеет наибольшее значение для понимания хронологически последней из приписываемых этому процессу функций, а именно, продукции АФК как сигнальных молекул. Предположено, что пул пластохинона является частью механизма поддержания баланса между накоплением и детоксикацией АФК (Maciejewskau et al., 2002). В настоящее время известно (Allen, 2002), что окислительно-восстановительное состояние этого пула инициирует целый ряд регуляторных процессов в клетках растений, в частности, активирует работу как хлоропластных, так и ядерных генов. Было высказано предположение, что АФК, образующиеся в пуле пластохинона, могут служить сигналом о состоянии ФЭТЦ системам экспрессии генов (Ivanov, Khorobrykh, 2003).

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в установлении механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода в ФЭТЦ. Для достижения этой цели в ходе выполнения диссертационной работы решались следующие задачи:

1. Исследовать характеристики восстановления кислорода в пуле пластохинона при ингибировании переноса электронов от пула пластохинона к ФС1;

2. Установить вклад пула пластохинона в восстановление кислорода в ФЭТЦ;

3. Выяснить участие пула пластохинона в образовании конечного продукта восстановления кислорода в тилакоидах, Н202;

4. Исследовать характеристики окисления пула пластохинона в условиях восстановления кислорода в ФЭТЦ.

Научная новизна работы. Впервые был оценен вклад пула пластохинона в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ. Было показано, что участие пула пластохинона в восстановлении кислорода зависит от интенсивности света и при высокой интенсивности света составляет 50-70 % от общего восстановления кислорода в ФЭТЦ. Новым результатом, полученным в ходе выполнения работы, является доказательство того, что образование пероксида водорода в ходе восстановления кислорода частично происходит внутри тилакоидной мембраны. При этом с увеличением интенсивности света относительный вклад внутритилакоидного образования пероксида водорода в суммарное образование Н202 увеличивается. Как результат обобщения полученных экспериментальных данных предложена модифицированная схема функционирования ФЭТЦ, которая включает реакции переноса электрона с участием молекул кислорода и супероксида.

Практическая значимость работы. Полученные в диссертационной работе данные позволяют по-новому представить функционирование ФЭТЦ высших растений в кислородной атмосфере, что весьма важно для понимания механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу.

Исследование участия пула пластохинона в восстановлении кислорода позволяет лучше понять антиоксидантные функции хинонов в растительных тканях. Учитывая, что АФК выступают как универсальные сигнальные молекулы в клетках в условиях стресса, от которых напрямую зависит функционирование ФЭТЦ, детальное знание механизмов образования АФК в ФЭТЦ важно для направленного конструирования генома растений, более устойчивых к изменениям окружающей среды.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мубаракшина, Мария Мансуровна

ВЫВОДЫ

1. При восстановлении кислорода в условиях ингибирования переноса электронов от пула пластохинона к Фотосистеме 1 не все образующиеся супероксиды выходят из мембраны: количество супероксидных радикалов, регистрируемых в среде, составляет 10% при рН 6,5 и 40% при рН 7,8 от количества супероксидов, возникающих в процессе восстановления молекул 02.

2. При восстановлении кислорода в условиях функционирования полной электрон-транспортной цепи тилакоидов часть молекул пероксида водорода образуется внутри тилакоидов. Доля потока электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри тилакоидов, в общем переносе электронов в фотосинтетической электрон-транспортной цепи к кислороду растет с увеличением интенсивности света, достигая 60 % при высокой интенсивности света.

3. Основная часть пероксида водорода, возникающего внутри тилакоидов, образуется внутри тилакоидной мембраны; при высокой интенсивности света в образовании Н202 внутри мембраны принимает участие не менее 40 % потока электронов к кислороду в условиях, когда кислород - единственный электронный акцептор. Образование пероксида водорода в люмене тилакоидов незначительно по сравнению с образованием пероксида водорода в тилакоидах; доля электронов, участвующих в этом образовании, составляет не более 10 % от общего переноса электронов в фотосинтетической электрон-транспортной цепи к кислороду.

4. При низкой интенсивности света участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи невелико, но возрастает с увеличением интенсивности света до 50% при рН 5,0 и до 60-70% при рН 6,5 и 7,8.

5. После прекращения освещения тилакоидов наблюдается двухфазная кинетика появления окисленных молекул ПХ. При этом после освещения светом высокой интенсивности во время первой быстрой фазы появляется 44 % молекул ПХ от общего числа молекул ПХ в пуле пластохинона, а после освещения тилакоидов светом низкой интенсивности - 26 %. Величина быстрой фазы коррелирует со скоростью восстановления кислорода на свету. Сделан вывод о том, что эта фаза наблюдается в результате окисления молекул ПХН2 супероксидами, накопившимися в мембране на свету.

6. Предложена модель восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи, отличительной чертой которой является кооперативное участие в этом восстановлении Фотосистемы 1 и пула пластохинона, восстановленные молекулы которого (ПХН2) восстанавливают супероксидные анион-радикалы, генерируемые как в Фотосистеме 1, так и в пуле пластохинона, с образованием пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Схема восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи

На основе полученных данных нами предложена схема функционирования ФЭТЦ, в которой имеется два участка восстановления 02 до , акцепторная сторона ФС1 и пул пластохинона (рис. 21). от на на $ ц* Л 4* » * Ж poh,+oi" vqhj^jp^

PQHj+C^f \

•i-1

2PQH [ t*

PQHj-PQ

Pc —Pc-HX),

Рис. 21. Схема восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи при низкой (А) и высокой (Б) интенсивностях света.

Мы считаем, что основными восстановителями 02 до 02*~ являются акцепторы ФС1. В работах Asada с соавт. (1974, 1988, 2004) приводятся данные, свидетельствующие в пользу того, что восстановление кислорода на этом участке и, соответственно, образование супероксида происходит внутри мембраны. Наше главное предположение состоит в том, что образующиеся внутри мембраны супероксиды восстанавливаются молекулами пластогидрохинона.

Схема на рис. 21 учитывает описанные выше наши экспериментальные результаты, а именно: при увеличении интенсивности действующего света 1) увеличивается восстановление кислорода в ФЭТЦ (рис. 12, 13, 14); 2) большее число образующихся супероксидов остается внутри тилакоидов (рис. 12); 3) увеличивается вклад пластохинона в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ (рис. 14); 4) возрастает восстановление кислорода в ФС 1 (рис. 14); 5) возрастает доля электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри мембраны (Таблица 5); 6) возрастает вклад быстрой фазы в общее окисление пула пластохинона после освещения (рис. 19).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мубаракшина, Мария Мансуровна, Пущино

1. Ананьев Г.М., Климов В.В. (1988) Фотообразование связанной перекиси водорода на донорной стороне фотосистемы 2. ДАН СССР, т. 298, с. 1007-1011.

2. Афанасьев И.Б. (1979) Анион-радикал кислорода 02* в химических и биохимических процессах. Успехи химии, т. 48, с. 977-1014.

3. Афанасьев И.Б. (1984) Свободные радикалы и процессы жизнедеятельности. В кн. Кислородные радикалы в химии и биологии. Наука и техника, Минск, с. 19-29.

4. Бекина P.M., Лебедева А.Ф., Шувалов В.А. (1976) Нечувствительное к диурону восстановление кислорода в фотосистеме 2 в присутствии кремниевомолибденовой кислоты. ДАН СССР, т. 231, С. 739-742.

5. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И., Козлов A.B., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. (1991) В кн: Свободные радикалы в живых системах, с. 251.

6. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, с. 1-252.

7. Денисов Е.Т. (1971) Константы скорости гемолитических жидкофазных реакций. Изд. Наука, с. 128-171.

8. Застрижная О.М., Хоробрых A.A., Христин М.С., Климов В.В. (1997) Фотообразование пероксида водорода на акцепторной стороне ФС II. Биохимия, т. 62, с. 419-425.

9. Иванов Б.Н., Поваляева Т.В. (1979) Псевдоциклический транспорт электронов при фотовосстановлении НАДФ1 изолированными хлоропластами гороха. Физиол. Растений, т. 26, с. 276-282.

10. Иванов Б.Н. (1998) Восстановление кислорода в хлоропластах и аскорбатный цикл. Биохимия, т. 63, с. 165-170.

11. Иванов Б.Н., Редько Т.П., Шмелева B.JL, Мухин E.H. (1980) Участие ферредоксина в псевдоциклическом электронном транспорте в изолированных хлоропластах гороха. Биохимия, т. 45, с. 1425-1432.

12. Иванов И.И. (1981) Миграция свободного радикала в реакциях окисления мембранных липидов и процессах трансмембранного переноса ионов и электрона. Науч. докл. высш.шк., Биол. н., т. 5, с. 16-24.

13. Клеваник A.B., Климов В.В., Шувалов В.А., Красновский A.A. (1977) Фотовосстановление феофитина в световой реакции ФС2 высших растений. Докл АН, т. 236, с. 241-244.

14. Красновский A.A., мл. (1986) Синглетный кислород в фотосинтезирующих организмах. Ж. Всес. Химич. О-ва, т. 31, с. 562-567.

15. Красновский A.A., мл. (1988) Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах. В кн. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М.: Наука, с. 23-41.

16. Мерзляк М.Н. (1989) Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. Итоги Науки и Техн., ВИНИТИ, сер. Физиология Растений, т. 6, с. 1-168.

17. Мерзляк М.Н., Соболев A.C. Роль супероксидных анион-радикалов и синглетного кислорода в патологии мембран. Итоги Науки и Техн., ВИНИТИ, сер. Биофизика, 5,118-165.

18. Мецлер Д. (1980) Биохимия. М.: Мир, т. 3, с. 460.

19. Михайлик О.М., Шевченко А.И., Островская JI.K. (1988) Образование супероксидных анион-радикалов хлоропластами: норма и патология. В сб. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Мед. Ин-т, Рига, с. 253-272.

20. Редько Т.П., Шмелева В.Л., Иванов Б.Н., Мухин E.H. (1982) Биохимия, т. 47, с. 1695-1699.

21. Ременников В.Г.и Самуилов В.Д. (1980) Взаимодействие компонентов фотосинтетической цепи переноса электронов Phodospirillum rubrum с кислородом. ДАН СССР, т. 52, с. 491-494.

22. Своллоу А. (1976) Радиационная химия. М.: Атомиздат, с. 278.

23. Хоробрых С.А., Хоробрых A.A., Климов В.В., Иванов Б.Н. (2002) Фотопоглощение кислорода в препаратах фотосистемы 2 при повреждении водоокисляющего комплекса. Биохимия, т. 67, с. 823-829.

24. Шалыго Н.В. (2001) Порфириногенез растений: механизмы индукции, регуляция и генерация фотодинамических процессов. Автореф. дисс. д-ра биол. наук: 03.00.02; 03.00.04, Институт фотобиологии HAH Беларуси, Минск, с. 42.

25. Шувалов В.А., Климов В.В., Красновский A.A. (1976) Исследование первичных фотопроцессов в легких фрагментах хлоропластов. Молекуляр. биология, т. 10, стр. 326-339.

26. Шувалов В.А., Красновский A.A. (1975) Изучение фотовосстановления кислорода хлоропластами методом хемилюминесценции люминола и хлорофилла. Биофизика, т. 40, с. 358366.

27. Шувалов В.А., Красновский A.A. (1981) Фотохимический перенос электрона в реакционных центрах фотосинтеза. Биофизика, т. 26, с. 544556.

28. Adam W., Baader W.J., Cilento G. (1986) Enols of aldehydes in peroxidase promoted generation of excited triplet species. Biochem. Biophys. Acta, vol. 881, p. 330-336.

29. Allen J.F. (1977) In: Superoxide and Superoxide Dismutase (Michelson A.M., McCord J.M., Fridovich I., eds), Academic Press, New-York, p. 417-436.

30. Allen J. (2002) Plastoquinone redox control of chloroplast thylakoids protein phosphorylation and distribution of excitation energy between photosystems. Photosyn. Res., vol. 73, p. 139-148.

31. Allen J.F., Hall D.O. (1973) Superoxide reduction as a mechanism of ascorbate stimulated oxygen uptake by isolated chloroplasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 52, p. 856-862.

32. Allen J.F, Pfannschmidt T. (2000) Phil. Trans. Roy. Soc. London. B., vol. 355,p. 1351-1359.

33. Amesz J. (1973) Biochim. Biophys.

34. Ananyev G., Renger G., Wacker U., Klimov V. (1994) The photoproduction of superoxide radicals and the superoxide dismutase activity of photosystem II. The possible involvement of cytochrome b559. Photosynth. Res., vol. 41, p. 327-338.

35. Anderson J.M. (1975) The molecular organization of chloroplast thylakoids. Biochim. Biophys. Acta, vol. 416, p. 191-235.

36. Anderson J.M., Boardman N.K. (1966) Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis. Ibid., vol. 112, p. 403-421.

37. Anderson I.M., Waldron J.C., Thorne S.W. (1978) Chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylakoids. FEBS lett., vol. 92(2), p. 227-233.

38. Andreasson L.-E., Vanngard T. (1988) Electron transport in photosystem I and II. Ann. Rev. Plant, Physiol. Plant. Mol. Biol., vol. 39, p. 379-411.

39. Aryan A.P. and Wallace W. (1985) Biochem. Biophys. Acta, vol. 827, p. 215-220.

40. Asada K. (1980) Formation and scavenging of superoxide in chloroplasts, with relation to injury by sulfur dioxide. In: Studies on the Effects of Air Pollutants and Mechanisms of Phototoxicity, Res. Rep. natl. Inst. Environ. Studies (Japan), p. 165-180.

41. Asada K (1988) Superoxide Dismutase. In: Metalloproteins (Otsuka S, Yamanaka T, eds), Elsevier, Amsterdam, c. 91.

42. Asada K. (1994) Production and action of active oxygen species in photosynthesis tissues. In: Causes of Photooxidative Stress and Amelioration of Defense systems in Plants (Edited by Christine H. Foyer and Philip M. Mullineaux), CRC Press, p. 78-104.

43. Asada K. (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 50, p. 601-639.

44. Asada K. (2000) The water-water cycle as alternative photon and electron sinks. Philosophical Transactions Biol. Sciences, London, vol. 355, p. 14191431.

45. Asada K., Kanematsu S. (1976) Agric. Biol. Chem., vol. 40, p. 1891-1892.

46. Asada K., Kiso K., Yoshikawa K. (1974) Univalent reduction of molecular oxygen by spinach chloroplasts on illumination. J. Biol.Chem., vol. 249, p. 2175-2181.

47. Asada K. and Nakano Y. (1978) Affinity for oxygen in photoreduction of molecular oxygen and scavenging of hydrogen peroxide in spinach chloroplasts. Photochem. Photobiol., 28, 917-920.

48. Asada K., Takahashi M. (1971) in Photosynthesis and Photorespiration (Hatch M.D., Osmond C.B., Slatyer R.O., eds.), Wiley, New York NY, p. 387393.

49. Asada K., Takahashi M. (1987) Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. In: Photoinhibition (Kyle, D.J., Osmond, C.B., and Arntzen, C.J., eds), Elsevier, Amsterdam, p. 227-287.

50. Asada K., Yoshikawa K., Takahashi M., Maeda Y., Enmanji K. (1975) Superoxide dismutase from a blue-green alga, Plectoneme boryanum. J.Biol.Chem., vol. 250, p. 2801-2807.

51. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas C.E. (1985) Role of metals in oxygen radical reactions. J. Free Rad. Biol. Med., vol. 1, p. 3-25.

52. Badger M.R. (1985) Photosynthetic oxygen exchange. Ann. Rev. Plant Physiol., vol. 36, p. 27-53.

53. Barber J. (1987) Photosynthetic reaction centers: a common link. Trends Biochem. Sci., vol. 12(3), p. 321-326.

54. Barber J., Andersson B. (1992) Too much of a good thing: light can be good and bad for photosynthesis. Trends Biochem. Sci., vol. 17, p. 61-66.

55. Barber J., Chapman D.J., Telfer A. (1987) Characterization of a PS II reaction centre isolated from the chloroplasts of Pisuin sativum. FEBS lett., vol. 220(1), p. 67-73.

56. Bassi R., Simpson D. (1987) The organization of photosystem II chlorophyll-protein. Ed. J. Biggins. Netherlands: Martinus Nljhoff. Publ., vol. 2, p. 81-88.

57. Bassi R., Simpson D. (1987) Chlorophyll-protein complexes of barley photosystem I. Eur. J. Biochem., vol. 163(1), p. 221-230.

58. Bast A., Haenen G.R.M. (1986) Cytocrome P-450 and glutathione: What is the significance of their interactionship in lipid peroxidation. Trends Biochem. Sci., vol. 9, p. 510-513.

59. Bennet J., Shaw E.K., Bakr S. (1987) Phosphorylation of thylakoid proteins and synthetic peptide analogs. FEBS lett., vol. 210(1), p. 22-26.

60. Borg D.C., Fajer J., Felton R.H., Dolphin D. (1970) The 7i-cation radical of chlorophyll a. Proc. Nat. Acad. Sci. US, vol. 67, p. 813-820.

61. Boveris A, Cadenas F. (1982) Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. In: Superoxide and Superoxide Dismutase (ed. Oberly L.), CRS Press, Boca Raton, p. 15-30.

62. Breton J. (1982) The 696 nm fluorescence (F 695) of chloroplasts at low temperature is emitted from the primary acceptor of photosystem II. FEBS lett., vol. 147(1), p. 16-20.

63. Bricher T.M., Pakrasi H.B., Sherman L.A. (1985) Characterization of a spinach photosystem II core preparation isolated by a simplified method. Arch. Biochem. Biophys., vol. 237(1), p. 170-176.

64. Bushnell G.W., Louie G.V., Brayer G.D. (1990) High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. J. Mol. Biol., vol. 214, p. 585-595.

65. Byczkowsky J.Z., Gessener T. (1988) Biological role of superoxide ion-radical. Int. J. Biochem., vol. 20, p. 569-580.

66. Camm E.L., Green B.R. (1983) Relationship between the two minor chlorophyll-« protein complexes and the photosystem II reaction center. Biochim. Biophys. Acta, vol. 724(1), p. 291-293.

67. Canvin D.T., Berry J.A., Badger M.R., Fock H., Osmond C.B. (1980) Oxygen exchange in leaves in the light. Plant Physiol., vol. 66, p. 302-307.

68. Chapman D.J., Barber J. (1989) Properties and stability of the isolated photosystem two reaction center. Physiol. Plant, vol. 76(3), p. 142-151.

69. Cheniae G.M., Martin I.F. (1970) Sites of function of manganese within photosystem II. Biochim. Biophys. Acta, vol. 197, p. 219-239.

70. Chevion M., Narok T., Glaser G., Mager J. (1982) Eur. J. Biochem., vol. 127, p. 405-409.

71. Chitnis P.R., Xu Q., 1995; Chitnis V.P., Nechushtai R. (1995) Function and organization of photosystem I polypeptides. Photosynth. Res., vol. 44(1), p. 2340.

72. Chow W.S. (1984) The extent to which the spatial separation between Photosystems I and II associated with granal formation limits noncyclic electron flow in isolated lettuce chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys., vol. 232, p. 162171.

73. Cleland R.E., Grace S.C. (1999) Voltammetric detection of superoxide production by photosystem II. FEBS Lett., vol. 457, p. 348-352.

74. Cohen G. (1987) The Fenton reaction. In: Hanbook of Methods for Oxygen Radical Research (Greenwald R.A. ed.), CRS Press Inc., Boca Raton, c. 55-64.

75. Coleman W.J., Govindjee, Gutowsky H.S. (1987) Involvement Ca2+ and CI" binding to the oxygen evolving complex of photosystem II. Progress in photosynthesis research, vol. 1, p. 629-632.

76. Crystall B., Booth P.J., Klug D.R. (1989) Resolution of a long lived fluorescence component D1/D2/ cytochrome b-559 reaction centers. FEBS lett., vol. 249(1), p. 75-78.

77. Czapski G. (1971) Radiation chemistry of oxygenated aqueous solution. Rev. Phys. Chem., vol. 22, p. 171-208.

78. Danielius R.V., Satoh K., Van Kan P.J.M. (1987) The primary reaction in the photosystem II Dl/D2-cytochrom ¿-559 complex. FEBS lett., vol. 213 (2), p. 241-244.

79. De Vitry C., Wollman F.-A., Delapilaire P. (1984) Function of the photosystem II reaction center in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta, vol. 767(3), p. 415-422.

80. Döring G.H., Stiehl H.H., Witt H.T. (1967) A second chlorophyll reaction in the electron chain of photosynthesis registration by the repetitive excitation technique. Ibid. Bd. 22b., p. 639-644.

81. Elstner E.F. (1982) Oxygen activation and oxygen toxicity. Ann. Rev. Plant Physiol., vol. 33, p. 73-96.

82. Elstner E.F., Frommeyer D. (1978) Production of hydrogen peroxide by photosystem II of spinach chloroplast lamellae. FEBS. Lett., vol. 86, p. 143-146.

83. Elstner E.F., Kramer R. (1973) Role of the superoxide free radical ion in photosynthetic ascorbate oxidation and ascorbate-mediated photophosphorylation. Biochim. Biophys. Acta, vol. 314, p. 340-350.

84. Elstner E.F., Wildner G.F., Heupel A. (1976) Arch. Biochem. Biophys., vol. 173, p. 623-630.

85. Emerson R., Arnold W. (1932) The photochemical reaction in photosynthesis. J. Gen. Phys., vol. 16, p. 191-205.

86. Emerson R., Chalmers R., Cederstrand C. (1957) Some factors influencing the long-wave limit of photosynthesis. Proc. Nat. Acad. Sci. US, vol. 234, p. 381-389.

87. Farrington J.A., Ebert M., Land E.J., Flatcher K. (1973) Biochem. Biophys. Acta, vol. 314, p. 372-381.

88. Fee J.A., Valentine J.S. (1977) Chemical and physical properties of superoxide. In Superoxide and superoxide dismutases. London, Academic press, p. 19-60.

89. Foote C.S. (1976) in Free Radicals in Biology, Academic Press, New York NY, vol. II (Pryor W.A., ed.) p. 85-133.

90. Foote C.S. (1979) in Singlet Oxygen (Wassermann H.H. and Murray R.W., eds.), Academic Press, New York NY, p. 139-171.

91. Foyer C., Lelandais M. (1996) A comparison of the relative rates of transport of ascorbate and glucose across the thylakoid, chloroplast and plasmolemma membranes of pea leaf mesophyll cells. J. Plant Physiol., vol. 148, p. 391-398.

92. Foyer C., Rowell J., Walker D. (1983) Measurement of ascorbate content of spinach leaf protoplasts during illumination. Planta, vol. 157, p. 239-244.

93. Fridovich I. (1983) Superoxide radical: an endogenous toxicant, rev. Pharmacol. Toxicol., vol. 23, p. 239-257.

94. Fucci L., Oliver C.N., Coon M.J., Stadtman (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 80, p. 1521-1525.

95. Furbank R.T., Badger M.R. (1983) Oxygen exchange associated with electron transport and photophosphorylation in spinach thylakoids. Biochim. Biophys. Acta, vol. 723, p. 400-409.

96. Gebicki J.M., Bielski B.H.J. (1981) Comparison of the capacities of the perhydroxyl and superoxide radicals to initiate chain oxidation of linoleic acid. J. Amer. Chem. Soc., vol. 103, p. 7020-7027.

97. Goetze D.C., Carpentier R. (1994) Ferredoxin-NADP+ reductase is the site of oxygen reduction in pseudocyclic electron transport. Can. J. Bot., vol. 72, p. 256-260.

98. Golbeck J.H. (1992) Structure and function of photosystem I. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 43, p. 293-324.

99. Golbeck J.H., Mehari T., Parrett K.G., Ikegami I. (1988) Reconstitution of the photosystem I complex from P700 and Fx-containing reaction center core protein and the Fa/Fb protein. FEBS lett., vol. 240(1), p. 9-14.

100. Golbeck J.H., Radmer R. (1984) Is the rate oxygen uptake by reduced ferredoxin sufficient to account for photosystem I-mediated O2 reduction? Adv. Photosynth. Res. The Hague.M.NiJhoff/Dr. W. JunkPubl., vol. 1, p. 561-564.

101. Gounaris K., Barber J. (1985) Isolation and characterization of photosystem II reaction center lipoprotein complex. FEBS lett., vol. 188(2), p. 68-72.

102. Green M.R., Hill H.A.O. (1984) Methods in Enzymology, vol. 105, p. 3-22. Gus'kova R.A., Ivanov I.I., Kol'tover V.K. (1984) Permeability of bilayer lipid membranes for superoxide radicals. Biochem. Biophys. Acta, vol. 778, p. 579-585.

103. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J., vol. 219, p. 1-14.

104. Halliwell B., Gutteridge J.M.C.(1985) Free Radicals in Biology and Medicine. Claredon Press, Oxford, p. 1-259.

105. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. (1986) Arch. Biochem. Biophys., vol. 246, p. 501-514.

106. Hauska G., Hurt E., Gabellini N., Lockau W. (1983) Comparative aspects of quinol-cytochrome c/plastocyanin oxidoreductases. Biochim. Biophys. Acta, vol. 726, p. 97-133.

107. Herrmann R.G., Alt j., Schiller B. (1984) Nucleotide sequence of the gene for apocytochrome b-559 on the spinach plastid chromosome. FEBS lett., vol. 176(2), p. 239-344.

108. Hiyama T., Ke B. (1971) A new photosynthetic pigment P430: Its possible role as the primary electron acceptor of photosystem I. Proc. Nat. Acad. Sci. US, vol. 68, p. 1010-1013.

109. Hormann H., Neubauer C., Asada K., Schreiber U. (1993) Intact chloroplasts display pH optimum of 02-reduction in the absence of methyl viologen: Indirect evidence for a regulatory role of superoxide protonation. Photosynth. Res., vol. 37, p. 69-80.

110. Hosein B., Palmer G. (1983) The kinetics and mechanism of reaction of reduced ferredoxin by molecular oxygen and its reduced products. Biochem. Biophys. Acta, vol. 723, p. 383-390.

111. Jennings R.C., Garlaschi F.M., GerolaP.D., Forti G. (1979) Partition zone penetration by chymotrypsin, and the localization of the chloroplast flavoprotein and Photosystem II. Biochim. Biophys. Acta, vol. 546, p. 207-219.

112. Jennings R.C., Garlaschi F.M., Gerola P.D. (1983) A study on the lateral distribution of the plastoquinone pool with respect to photosystem II in stackedand unstacked spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, vol. 722, p. 144149.

113. Jones D.P. (1985) The role of oxygen concentration in oxidative stress: hypoxic and hyperoxic models. In: Oxidative Stress (ed. Sies H.), Academic Press, New-York, p. 151-195.

114. Kaiser W. (1979) Reversible inhibition of the Calvin cycle and activation of oxidative pentose phosphate cycle in isolated intact chloroplasts by hydrogen peroxide. Planta, vol. 145, p. 377-382.

115. Kano Y., Fridovich I. (1982) Superoxide radical inhibits catalase. J. Biol. Chem., vol. 257, p. 5751-5754.

116. Kanofsky J.R. (1983) J. Am. Chem. Soc., vol. 108, p. 2977-2979.

117. Ke B., Hansen K.E., Beinert H. (1973) Oxidation-reduction potentials of bound iron-sulfur proteins of photosystem II. Proc. Nat. Acad. Sci. US., vol. 70, p. 2941-2945.

118. Ke B., SugaharaK., Shaw E.R. (1975) Further purification of "triton subchloroplast fraction 1". Ibid., vol. 408, p. 12-25.

119. Khan A.U., Gebauer P., Hager L.P. (1983) Chloroperoxidase generation of singlet 'Ag molecular oxygen observed by spectroscopy in the 1 to 1.6 |j.m region. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 80, p. 5195-5197.

120. Khorobrykh S.A., Ivanov B.N. (2002) Oxygen reduction in a plastoquinone pool of isolated pea thylakoids. Photosyn. Res., vol. 71, p. 209-219.

121. Khorobrykh S., Mubarakshina M., Ivanov B. (2004) Biochim. Biophys. Acta, vol. 1657, p. 164-167.

122. Klimov VV, Ananyev GM, Zastrizhnaya OM, Wydrzynski T, Renger G (1993) Photoproduction of hydrogen peroxide in photosystem II membrane fragments. A comparison of four signals. Photosynth. Res., vol. 38, p. 409-416.

123. Klimov V.V., Shuvalov V.A., Heber U. (1985) Photoreduction of pheophytin as a result of electron donation from the water-splitting system to photosystem II reaction centers. BBA, vol. 809, p. 345-350.

124. Knaff D.B., Malkin R. (1973) The oxidation-reduction potentials of electron carriers in chloroplast photosystem I fragments. Arch. Biochem. Biophys., vol. 159, p. 555-562.

125. Knaff D.B., Malkin R. (1978) The primary reaction of chloroplast photosystem II. Curr. Top. Bioenerg., vol. 7, p. 139-172.

126. Kobayashi K., Tagawa S., Sano S., Asada K. (1995) A direct demonstration of the catalytic action of monodehydroascorbate reductase by pulse radiolysis. J. Biol. Chem., vol. 270, p. 27551-27554.

127. Kochubey S.M, Sytnik S.k., Shadchina T.M. (1983) Two chloroplast pigment-protein which may belong to photosystem II reaction center. Photosynthetica, vol. 17(3), p. 450-453.

128. Kok B. (1956) On the reversible absorption change at 705 nm in photosynthetic organisms. Biochim. Biophys. Acta, vol. 22, p. 399-401.

129. Kramer, D.M., and Crofts, A.R. (1994) Biochim. Biophys. Acta, vol. 1184, p.193-201.

130. Maciejewska U., Polkowska-Kowalczyk L., Swiezewska E., Szkopinska A. (2002) Acta Biochim. Pol., vol. 49, p. 775-780.

131. Mano J., Hideg E, Asada K. (2004) Arch. Biochem. Biophys., vol. 429, p. 71 -80.

132. Matheson I.B.C., Etheridge R.D., Kratowich N.R. and Lee J. (1975) Photochem. Photobiol., vol. 21, p. 165-171.

133. McCauley S., Melis A. (1986) Quantitation of plastoquinone photoreduction in spinach chloroplasts, Photosyn. Res., vol. 8, p. 3-16.

134. Mehler A.C. (1951) Studies on reactions of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Arch. Biochem. Biophys., vol. 33, p. 65-77.

135. Mehler A.H., Brown A.H. (1952) Studies on reactivities of illuminated chloroplasts. III. Simultaneous photoproduction of and consumption of oxygen studied with oxygen isotopes. Arch. Biochem. Biophys., vol. 38, p. 365-370.

136. Melis A. and Brown J.S. (1980) Stoichiometry of system I and system II reaction centers and of plastoquinone in different photosynthetic membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, p. 4712-4716.

137. Mikami B., Ida S. (1986) Plant Cell Physiol., vol. 27, p. 1013-1021.

138. Mitchell P. (1968) Chemiosmotic coupling and energy transduction. Bodmia; Cornwall: Glynn, p. 111.

139. Miyake C., Schreiber U., Hormann H., Sano S., Asada K. (1998) The FADenzyme monodehydroascorbate radical reductase mediates photoproduction of superoxide radical in spinach thylakoids membranes. Plant Cell Physiol., vol. 39, p. 821-829.

140. Muhlethaler K. (1971) The ultrastructure of plastids. Structure and function of chloroplasts. Ed. M. Gibbs., N.Y.: Springer, p. 7-43.

141. Mullet J.E., Burke J.J., Arntzen C.J. (1980) Chlorophyll-proteins of photosystem I. Plant Physiol., vol. 65(5), p. 814-822.

142. Nakano M., Takayama K., Shimizu Y., Tsuji Y., Inaba H., Migita T. (1976) J. Am. Chem. Soc., vol. 98, p. 1974-1975.

143. Nakatani H.Y. (1983) Correlation of the low temperature 695 nm fluorescence emission with reaction center of PS II (CP 47). Ed. Y. Ionone. -Tokyo. Acad. Press., p. 49-54.

144. Nanba O., Satoh K. (1987) Isolation of a photosystem II reaction center consisting of D1 and D2 polypeptides and cytochrome ¿-559. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84(1), p. 209-212.

145. Nelson N., Nelson H., Racker E. (1972) Photochem. Photobiol., vol. 16, p. 481-489.

146. Noctor G., Foyer C.H. (1998) Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol., vol. 49, p. 249-279.

147. Nuijs A.M., Van Gorkom H.J., Plifter J.J., Duysens L.N. (1986) Primary charge separation and excitation of chlorophyll a in photosystem II particles from spinach as studied by picosecond absorbance differential spectroscopy. BBA, vol. 848, p. 167-175.

148. Pericval M.P., Dodge A.D. (1983) Plant Sci. Lett., vol. 29, p. 255-264. Petrouleas, Diner. (1987) BBA, p. 126-137.

149. Rabinovitch H.D., Fridovich I. (1983) Superoxide radical superoxide dismutases and oxygen toxicity in plants. Photochem. Photobiol., vol. 37, p. 679-690.

150. Rich P.R. (1985) Mechanisms of quinol oxidation in photosynthesis. Photosynth. Res., vol. 6, p. 335-348.

151. Robinson J.M. (1988) Does 02 photoreduction occur within chloroplasts in vivo? Physiol. Plant, vol. 88, p. 666-680.

152. Rodgers M.A.J, and Snowden P.T. (1982) J. Am. Chem. Soc, vol. 104, p. 5541-5543.

153. Rose P.A. (2001) Free radicals in biology and medicine. Student paper, vol. 77, p. 222-223.

154. Rutherford A.W., Krieger-Liszkay A. (2001) Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II. Trends in Biochem. Sciences, vol. 26 (11), p. 648-653.

155. Sano S., Miyake C., Mikami B., Asada K. (1995) Molecular characterization of monodehydroascorbate radical reductase from cucumber highly expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem., vol. 270, p. 21354-21361.

156. Satoh K. (1985) Protein-pigments and photosystem II reaction center. Photochem. Photobiol., vol. 42(6), p. 845-853.

157. Satoh K., Nakatani H.Y., Steinback K.E. (1983) Polypeptide composition of a photosystem II core complex. Biochim. Biophys. Acta, vol. 724(1), p. 142150.

158. Schreiber U., Reising H., Neubauer C. (1991) Contrasting pH optima of light-driven O2- and H202-reduction in spinach chloroplasts as measured via chlorophyll fluorescence. Z. Naturforsch., vol. 46, p. 173-181.

159. Schubert W.D., Klukas O., Saenger W., Witt H.T., Fromme P., Kraub N. (1998) A common ancestor for oxygenic and anoxygenic photosynthetic systems. J. Mol. Biol., vol. 280(2), p. 297-314.

160. Setif P., Mathis P. (1980) The oxidation-reduction potentials of P700 in chloroplast lamellae and subchloroplast particles. Arch. Biochem. Biophys., vol. 204, p. 477-485.

161. Shibata H., Ochiai H., Kawashima T., Okamoto T., Inamura I. (1986) Biochim Biophys. Acta, vol. 852, p. 175-182.

162. Shimizu N., Kobayashi K., Hayashi K. (1984) The reaction of superoxide radical with catalase. J. Biol. Chem., vol. 259, p. 4414-4418.

163. Shuvalov V.A., Klimov V.V., Dolan E., Parson W.W., Ke B. (1980) Nanosecond fluorescence and absorbance changes in photosystem II at low redox potential. FEBS Lett., vol. 118, p. 279-282.

164. Stadtman E.R. (1986) TIBS, vol. 11, p. 11-12.

165. Suzuki R., Fujita Y. (1977) Plant Cell Physiol., vol. 18, p. 625-631.

166. Takahama U. (1979) Plant Cell Physiol., vol. 20, p. 213-218.

167. Takahama U, Nishimura M. (1975) Plant Cell Physiol, vol. 16, p. 737748.

168. Takahama U, Nishimura M. (1976) Plant Cell Physiol, vol. 18, p. 111118.

169. Takahashi M, AsadaK. (1982) J. Biochem, vol. 91, p. 889-896.

170. Takahashi M, Asada K. (1983) Superoxide anion permeability of phospholipid membranes and chloroplast thylakoids. Arch. Biochem. Biophys, vol. 226, p. 558-566.

171. Takahashi M, Asada K. (1988) Superoxide production in aprotic interior of chloroplast thylakoids. Arch. Biochem. Biophys, vol. 267, p. 714-722.

172. Tang X.-S, Satoh K. (1984) Characterization of 47-kilodalton chlorophyll-binding polypeptide (CP-47) isolated from a photosystem II core complex. Plant and Cell Physiol, vol. 25(6), p. 935-945.

173. Tang X.-S, Satoh K. (1985) The oxygen-evolving photosystem II core complex. FEBS lett, vol. 179(1), p. 60-64.

174. Thornber J.P. (1975) Chlorophyll-proteins: Light-harvesting and reaction center components of plants. Ann. Rev. Plant. Physiol, vol. 28, p. 127-158.

175. Thornber J.P, Albert R.S, Hunter F.A. (1977) The organization of chlorophyll in the plant photosynthetic unit. Brookhaven Symp. Biol, vol. 28, p. 132-148.

176. Turconi S, Weber N, Schweitzer G, Stromann H, Holzwarth A.R. (1994) Energy transfer and charge separation kinetics in photosystem I. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1187(1), p. 124-134.

177. Vladimirov Yu. A. (1986) Free Radicals, aging and degenerative diseases. Allan R. Liss, Inc., p. 141-195.

178. Webber A.N., Packman L., Chapman D.J. (1989) A fifth chloroplast-encoded polypeptide is present in the photosystem II reaction centre complex. FEBS lett., vol. 242(2), p. 259-262.

179. Wefers H. (1987) Singlet oxygen in biological systems. Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 18, p. 91-104.

180. Wildner C.F. (1981) The effect of oxygen on ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase and oxygenase. Ber. Dtsch. Bot. Ges., vol. 94, p. 151-160.

181. Witt H.T., Rumberg B., Jung W. (1969) Evidence for the coupling of electron transfer, field changes proton translocation and phosphorylation in photosynthesis. Progress in photosynthesis researches. Ed. H. Metzner. Tubingen, p. 1361-1373.

182. Wollman F.A., Minai L., Nechushtai R. (1999) The biosynthesis and assembly of photosynthetic proteins in thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1411(1), p. 21-85.

183. Yamada Y., Itoh N., Satoh K. (1985) A versatile chromatographic procedure for purifying PS II reaction center complex from digitionin extracts of spinach thylakoids. Plant and Cell Physiol., vol. 26(7), p. 1263-1285.

184. Yamada Y., Tang X.-S., Itoh S., Satoh K. (1987) Purification and properties of an oxygen-evolving photosystem II reaction center complex from spinach. Biochim. Biophys. Acta, vol. 891(1), p. 129-137.

185. Yamamoto H.Y., Vernon L.P. (1969) Characterization of a partially purified photosynthetic reaction center from spinach chloroplasts. Biochemistry, vol. 8, p. 4131-4137.

186. Yamashita T., Butler W.L. (1969) Plant Physiol., vol. 44, p. 1342-1346.

187. Youngman R.J. (1984) TIBS, vol. 9, c. 280-283.

Информация о работе
  • Мубаракшина, Мария Мансуровна
  • кандидата биологических наук
  • Пущино, 2006
  • ВАК 03.00.04
Диссертация
Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы