Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие активированного кислорода в различных формах сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие активированного кислорода в различных формах сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу"

г Г 5 ОД г П МАЙ 1Я97

На правах рукописи

ПАСЕЧНИК Татьяна Дмитриевна

УЧАСТИЕ АКТИВИРОВАННОГО КИСЛОРОДА В РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ СОРТОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РИСА К ПИРИКУЛЯРИОЗУ

Специальность 03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, A.A. Аверьянов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.Л. Озерецковская кандидат биологических наук Н.В. Гужова

Ведущая организация: Главный ботанический сад РАН

Защита состоится I/1997 г. в _часов

на заседании Специализированного Ученого Совета по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке

Биологического факультета МГУ.

Автореферат .разослан ' 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Полесская О.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Физиолого-биохимические механизмы болезнеустойчивости растений представляют общенаучный фундамен- ' таяьный интерес и служат основой совершенствования методов растениеводства. Пирикуляриоз риса является характерным и удобным для изучения примером грибной болезни, актуальной и для сельского хозяйства. Она уносит до 10-15%, а в отдельные годы до 90% урожая. Возбудитель заболевания - гриб Pyricularia oryzae Cav. (телеоморфа - Magnaporthe grisea (Hebert) Barr), поражающий наземные части растения (Ои, 1985).

Возделывание устойчивых сортов является одним из важнейших способов борьбы с пирикуляриозом и другими болезнями. Селекцию по этому признаку приходится вести непрерывно из-за изменчивос-.ти патогенов, приводящей к появлению новых вирулентных рас.

Сортовую устойчивость к инфекционным заболеваниям обычно подразделяют на вертикальную и горизонтальную (синоним последней - частичная) (Вандерпланк, 1981; Parlevliet, 1988). Вертикально устойчивые сорта одними расами совершенно не поражаются, а к другим - сильно восприимчивы. Частично устойчивые сорта, напротив, поражаются большинством рас, но симптомы при этом развиваются слабее, чем на восприимчивых сортах. Потери урожая при выращивании частично устойчивых сортов относительно невелики. На них не столь интенсивен, как на вертикально устойчивых, отбор высоковирулентных рас паразита. Поэтому частичная устойчивость стабильна, что позволяет снизить расходы на селекцию и сортоиспытания (Simmonds, 1985).

Селекция на болезнеустойчивость требует адекватных методов оценки последней. Обычно используются визуальные симптомы, развитие которых, однако, занимает относительно много времени. Сократить его позволяет досимптомная диагностика, основанная, в

- г -

частности, на различных защитных реакциях растений.

Известно, что болезнеустойчивость, как вертикальная сортовая, так и индуцированная, складывается из ряда защитных реакций: сверхчувствительного некрозообразования, лигнификации, образования каллозных папилл, синтеза белков, связанных с патогенезом, синтеза фитоалексинов и т.п. (Agrios, 1988). Некоторые из этих процессов и, как следствие, устойчивость так или иначе связаны с активными формами кислорода (АФК): перекисью водорода, супероксидным (0г~) и гидроксильным ООН) свободными радикалами. Образуемые хозяином АФК способны непосредственно подавлять развитие патогенов, а также запускать другие реакции фито-иммунитета (Аверьянов, 1991; Levine et al., 1994).

Ранее показано, что сильное антигрибное действие экзомета-болитов листьев обусловлено АФК и служит досимптомным признаком как индуцированной, так и вертикальной сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу; оно пригодно для экспресс-оценки последней (Николаев, Аверьянов, 1991; Николаев и др., 1991). Физиоло-го-биохимические механизмы частичной устойчивости изучены мало и нет данных о возможных фунгитоксических эффектах и участии в них АФК.

Значительный прогресс в современной селекции связан с клеточными культурами. Они позволяют быстро получать большое разнообразие свойств за счет сомаклональной изменчивости, индуцированного мутагенеза и переноса генов. Узким местом, по-прежнему, остается оценка устойчивости, проводить которую на клеточных культурах еще сложнее, так как в этом случае нет характерных визуальных симптомов болезни (Максимова и др., 1996). Регенерация клеточных культур в целые растения только для испытаний

резко удлиняет сроки работы и просто нереальна для каждого из

\

многочисленных клонов. Поэтому необходим поиск признаков болезнеустойчивости, проявляющихся в клеточной культуре и отражающих свойства интактных растений. Для этого представляют интерес новые методические подходы, в частности, связанные с АФК.

Целью настоящей работы было выяснение роли активированного кислорода во взаимоотношениях растений риса и возбудителя пири-куляриоза в связи с вертикальной и частичной устойчивостью к этой болезни.

Задачи работы включали сравнение восприимчивого, вертикально устойчивых и частично устойчивых к пирикуляриозу сортов риса по следующим показателям:

1) Токсичность диффузатов листьев для возбудителя болезни.

2) Ранние стадии развития возбудителя на листьях.

3) Возможное участие АФК в фунгитоксичности диффузатов листьев.

4) Фунгитоксичность диффузатов каллусов и роль АФК в ней.

Научная новизна работ. Впервые выявлено антигрибное действие диффузатов листьев частично устойчивых сортов риса.

Проанализированы ранние стадии развития пирикуляриоза на листьях частично устойчивого к нему сорта риса и обнаружено, тао развитие паразита подавлено, начиная со стадии образования злрессориев.

Показано, что АФК участвуют в механизме фунгитоксичности экзометаболитов листьев частично устойчивых сортов риса, но 1наче, чем в случае вертикально устойчивых.

Установлено, что способность выделять токсичные экзомета-5олиты сохраняется в культурах клеток устойчивых сортов риса. Практическая ценность работ. Найдены тесты, применимые

как к интактным растениям, так и к каллусам, позволяющие определить сортовую устойчивость и её тип. На основании этих тестов разработаны методические указания по досимптомному выявлению частичной устойчивости.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых-рисоводов (ВНИИ риса, Краснодар, 1991), представлены на семинаре по болезням риса в Средиземноморье (Монпелье, Франция, 1995), на 13-м Международном конгрессе по защите растений (Гаага, Нидерланды 1995) и на 26-й конференции Рисовой рабочей группы (Сан-Антонио, США, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 печатных работ, 3 сданы в печать.

Объем и структура дисссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 10 рисунков. Библиография на 40 страницах включает 319 наименований, из них 277 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Инокуляция растений и учет визуальных симптомов болезни. Работа выполнена на пяти природных изолятах гриба Pyricularia огугае Cav.

Исследованы семь сортов риса (Oryza sativa I.), различающихся по устойчивости: восприимчивый (Sha-tiao-tsao), вертикально устойчивые (Zenith и Tadukan) и частично устойчивые (Shimokita, Norin 18, China 1039, CNAB kwelchow). Большинство сортов и штаммов были любезно предоставлены сотрудниками лаб.

Генетики факультативных паразитов ВНИИФ Е.Д. Коваленко и Т.М. Коломиец.

Интактные растения или отрезки листьев заражали опрыскиванием или фиксированными каплями. Для фиксации капель на интакт-ных растениях нами были разработаны инокуляционные камеры.

При заражении опрыскиванием определяли относительную площадь поверхности, занятой инфекционными пятнами совместимого типа (Гешеле, 1978). При заражении фиксированными каплями подсчитывали долю капель, оставивших после себя симптомы этого или иных типов (Ьа11еге1 е1 а1., 1965).

Получение диффузатов листьев. Интактные или фрагментиро-ванные листья инокулировали фиксированными каплями суспензии спор (Аверьянов, Лапикова, 1989). В контроле на листьях инкубировали капли воды. Затем суспензию спор или воду собирали с листьев, одновременно удаляя споры с помощью разработанных нами фильтрующих патронов.

Определение фунгитоксичности диффузатов листьев. Мерой фунгитоксичности диффузатов было ингибирование прорастания в яих свежеполученных спор по сравнению с прорастанием в воде.

Изучение ранних стадий болезни. С помощью световой микроскопии исследовали прорастание спор и образование апрессориев Р. огугае непосредственно на листьях интактных растений.

Исследование роли АФК в механизме токсичности диффузатов шстьев. Для этой цели определяли токсичность диффузатов после юбавления антиокислительных реагентов: каталазы, разлагающей [2О2, супероксиддисмутазы (СОД) или тайрона, разрушающих супе-юксидный радикал, а также перехватчиков гидроксильного радика-:а. Поскольку взаимопревращения АФК катализируются ионами желе-

- б -

за, аналогичным образом испытывали влияние хелатора десферриок-самина, связывающего эти ионы в неактивный комплекс (Halliwell et al., 1980). Изучали также действие гистидина, модифицирующего цитотоксические свойства АФК (Schubert et al., 1969).

Для выявления роли пептидов или белков в механизме фунги-токсичности диффузаты обрабатывали протеиназой. Низкомолекулярные компоненты удаляли диализом, а термолабильные - разрушали кипячением.

О роли фотосенсибилизаторов судили по действию света (10 клк, 1 ч)_ на токсичность диффузатов. Такая доза не влияла на прорастание спор в воде.

По реакции с тиобарбитуровой кислотой (Aust, 1987) определяли перекисное окисление липидов в гомогенатах листьев.

Исследование фунгитксических свойств диффузатов каллусов. Каллусы риса, выращенные из семян на агаризованной среде Мура-сиге-Скуга, были получены из Российского Университета Дружбы Народов. Кусочки 7-дневных каллусов инкубировали в воде или в суспензии спор, в ячеистых пластинах. Диффузаты собирали через 16-17 ч. Их токсичность, а также влияние на неё различных факторов оценивали описанными выше способами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Визуальные симптомы болезни.

Для проверки соответствия типа устойчивости, проявлявшегося в наших экспериментальных условиях, и литературных данных (Kiyosawa, 1972), мы провели фитопатологическую оценку интакт-ных растений.

Таблица 1.

Визуальные симптомы1' пирикуляриоза на интактных листьях риса различных сортов при разных способах заражения.

Способ заражения и метод подсчета результатов

Штамм Опрыскивание2^ Фиксированные капли3)

гриба ----------------- --------------------------------

Степень поражения Доля (%) инфекционных капель, поверхности, % давших симптомы указанного типа^

тип 0 типы 1-3 типы 4-5

Sha-t1ао-tsao Свосприимчивый)

Н5-3 58 + 15 15 ± 1 9 ± 8 76 + 6

КР-69 67 + 1 17 t 5 15 +- 6 77 + 6

F 67-57 77 + 10 22 ± 7 2 ± 6 77 ± 6

КК-37 67 + 1 27 t 13 3 ± 3 70 + 10

КР-57 70 + 13 3 ± 6 11 ± 16 Zenith (вертикально устойчивый) 86 + 20

Н5-3 0 100 ± 0 0 0

КК-37 0 100 ± 0 0 Tadukan (вертикально устойчивый) 0

Н5-3 0 100 ± 0 0 0

КР-69 0 100 ± 0 0 0

F 67-57 26 ± 2 74 ± 10 14 ± 5 14 + 6

КК-37 0 77 ± 5 25 ± 17 0

КР-57 0 58 ±13 41 ± 18 SMmokl ta (частично устойчивый) 3 + 4

Н5-3 25 + 5 69 t 6 14 i 4 17 + 7

КК-37 8 + 4 76 ± 8 11 ± 6 12 + 5

КР-57 6 ± 7 89 ± 4 6 ± 6 7 ± 8

CNAB kwelchow (частично устойчивый)

Н5-3 10 + 5 62 ± 10 29 ± 12 9 + 8

КР-69 8 ± 6 78 ± 16 18 ± 3 13 ± 9

F 67-57 0 98 i 3 2 ± 3 0

КК-37 8 + 6 63 ± 11 20 i 4 17 + 4

КР-57 9 ± 6 25 ± 3 57 ± 7 Norin 18 (частично устойчивый) 18 ± 8

Н5-3 10 + 9 73 ± 5 13 ± 13 China 1039 (частично устойчивый) 14 + 5

Н5-3 0 100 ± 0 0 0

КК-37 28 + 3 51 ± 4 19 ± 5 28 ± 9

КР-57 10 + 5 57 ± 17 32 ± 14 11 ± 2

^Подсчет проводили на 4-м листе через 6-8 дней.

Опрыскивали суспензией спор (10& спор мл 1), 5 мл на 8 растений.

3) На каждый лист наносили по 3 капли (20 мкл каждая) такой же суспензии.

4) Симптомы учитывали по шкале Латерелл.

Сорт Sha-tlao-tsao поражался всеми испытанными штаммами. После заражения опрыскиванием большую часть поверхности листьев занимали инфекционные пятна совместимого типа (табл. 1). Фиксированные капли оставляли после себя преимущественно такие же пятна. Сорта Zenith и Tadukan вели себя, в целом, как вертикально устойчивые. На их листьях симптомы обычно отсутствовали, изредка встречались мелкие некрозы. На интактных листьях сортов Shimokita, Norln 18, China 1039 и CNAB kvelchow при обоих способах заражения, как правило, появлялись характерные для частичной устойчивости редкие и мелкие пятна совместимого типа, некрозы были редкими.

У восприимчивого или у вертикально устойчивых сортов симптомы не зависели от целостности объекта. Напротив, у частично устойчивых сортов на отрезках листьев развивались многочисленные некрозы, нехарактерные для этого типа устойчивости.

Таким образом, на интактных растениях были подтверждены фитопатологические характеристики использованных сортов и рас. Результат не зависел от способа инокуляции. Следовательно, метод фиксированных капель, необходимый для получения диффузатов, тоже давал естественную картину болезни. В то же время, выявлена непригодность отрезков листьев для работы с частично устойчивыми сортами. Поэтому сравнительные исследования всех сортов выполнены, в основном, на интактных растениях.

Фунгитоксичность диффузатов листьев.

Мы исследовали, проявляют ли диффузаты листьев антигрибную активность, и как она связана с сортовой устойчивостью.

У восприимчивого сорта токсичность диффузатов, полученных

на первые (рис. 1) или вторые сутки (рис. 3) после инокуляции, обычно была невелика или отсутствовала, причем как в здоровых, так и в зараженных вариантах.

У здоровых листьев вертикально устойчивых сортов этот показатель варьировал в широких пределах в зависимости от сорта растения и штамма гриба (рис. 1 и 3). После заражения во всех комбинациях наблюдалась сильная токсичность на первый или на второй день после инокуляции.

0

X га а

8.

5

5

1

100 у Восприимчивый ЭЬа-Аао-йао

80 -

60

20 -■

□Здоровые а Зараженные

тй тТ

Вертикально устойчивые 2епЙ1 ; Тайикап

НМ кпт Р 87,57 КК37 КПЗ7

ям КК-37

Н5-Э КП69 Рв7-В7 КХ-Э7 КГЦ?

Рис. 1. Фунгитоксичность диффузатов листьев восприимчивого и вертикально устойчивых сортов риса через 24 ч после инокуляции. Для определения токсичности использовали свежеполученные споры того же штамма, которым инокулировали. В незараженных вариантах капли воды инкубировали на листьях в тех же условиях. На рисунках 1-3 и в таблицах 2-4 полная остановка прорастания спор в диффузате соответствует ингибированию 100%, а прорастание в контроле (в воде) - ингибированию 0%. Штаммы обозначены снизу.

У частично устойчивых сортов обнаружены закономерности, аналогичные описанным выше для вертикально устойчивых. Сущест-

венных различий по величине токсичности диффузатов между обеими группами сортов не было (рис. 1 и 2).

о.

В

g

га а о а. с а>

5

(0 о о а

S

100 т

80 -

60 -•

40 -•

20

Shlmoklta

Norin 18

i 1

ъ %

% Ъ

1

i?

gs

С NAB kweichow

£

it

ш

China 1039

H5-3 KK-37 КП-57

НЬ-3

«5-3 КГШЗ F «7-57 КК-37 КП-57

Н5-3 К К-37 КП-57

Рис. 2. Фунгитоксичность диффузатов листьев частично устойчивых сортов через 24 часа после инокуляции.

Восприимчивый

Sha-tiao-tsao

1

Вертикально устойчивый Tadukan

хгш

F 67-57 кгт

Ч астично устойчивый CNAB kweichow

ХЛ69

Рис. 3. Фунгитоксичность диффузатов листьев разных по устойчивости сортов через 48 ч после инокуляции.

Таким образом, листья устойчивых, но не восприимчивых сортов Б 0ТБ8Т KS SSpSStSKKS ВЫДсДЯЮ™ БсщсСТБй, ПОдаБЛЯЮшИс р£ЗБИ-тие возбудителя пирикуляриоза In vitro. Мы проверили, подавлено ли развитие гриба непосредственно на листьях, и как это связано с сортовой устойчивостью.

Раннее развитие гриба на листьях в связи с фунгитоксичность м их диффузатов.

Через сутки после заражения на листьях восприимчивого сорта споры прорастали и апрессории образовывалис беспрепятственно (табл. 2). У вертикально устойчивого сорта оба эти по-

Таблица 2.

Прорастание спор и образование алрессориев Р. огугае (штамм Н5-3) на листьях интактных растений различных сортов риса через сутки после инокуляции.

Субстрат для инкубации спор Прорастание спор1' Образование алрессориев1'

Полистирол 78 ± 4 43 ± 11

Листья риса сорта

Sha-tlao-tsao (воспримчивый) 87 ± 5 36+4

-"- Tadukan (вертикально устойчивый) 41 ± 9. 8 ± 5

(53)Z) (78)

-'*- Shimoklta (частично устоичивыи) 78 ± 4 И ± 8

(12) (70)

г) Исследовали по 5 растений, на каждое из которых наносили по 1 капле суспензии спор. Подсчитывали долю (%) проросших спор £или образование алрессориев) от общего числа спор.

В скобках дано относительное ингибирование (%) указанных параметров на листьях устойчивых сортов по отношению к тем же показателям на листьях восприимчивого сорта.

казателя, напротив, были достоверно подавлены. У частично устойчивого сорта прорастание спор, по сравнению с восприимчивым, подавлялось слабо, а образование алрессориев - сильно.

Инфекционные гифы, внедрившиеся в клетки эпидермиса листьев восприимчивого сорта, были хорошо развиты, вертикально устойчивого - слабо; а частично устойчивый сорт занимал промежуточное положение.

Таким образом, у восприимчивого и у вертикально устойчивого сортов споры на листьях развивались примерно так же, как и в диффузатах. Напротив, у частично устойчивого сорта слабое инги-бирование прорастания спор на листьях не соответствовало его сильному ингибированию в диффузатах. Мы предположили, что iл vivo антигрибные эффекты определяются не только концентрацией, но и скоростью выделения токсикантов. Чтобы это проверить, сравнили динамику фунгитоксичности диффузатов листьев в те же сроки, что и развитие гриба. У восприимчивого сорта ни через пять, ни через 24 часа токсичность не обнаруживалась ни в здоровом, ни в зараженном варианте (рис. 4). Диффузаты здоровых

^ 90

Рис. 4. Зависимость фунгитоксичности диффузатов от времени инкубации капли иноку-люма на листе. Споры тест-объекта инкубировали в диффузате 5 ч. Пунктиром и пустыми символами обозначены незараженные варианты, сплошной линией и заполненными символами - зараженные. Д, А - Shatiaotasao (восприимчивый);П,И- Tadukan (вертикально устойчивый);О,® - Shimokita (частично устойчиВЫЙ). 0 12 3

Время, ч

листьев вертикально устойчивого сорта были слабо токсичны через 5 и умеренно токсичны через 24 часа, а зараженных - высокотоксичны уже через 5 ч. Для частично устойчивого сорта получасовой инкубации капель воды на листьях было достаточно для слабого ингибирования прорастания спор, но далее (включительно до 5 ч)

токсичность не увеличивалась. В зараженном варианте она была немного больше. Тем не менее, через 24 часа токсичность диффу-затов листьев этого сорта повышалась до уровня вертикально устойчивого. В воде на нейтральной поверхности большинство спор успевало прорасти уже за 5 ч. Поскольку токсичность диффузатов листьев частично устойчивого сорта в этот период была низкой, гриб, по-видимому, успевал пройти на листьях свою первую фазу развития. Ко времени образования апрессориев концентрация токсикантов достигала достаточно высокого уровня.

Следовательно, выделения листьев устойчивых сортов, действительно, ингибируют развитие патогена 1л vivo. У частично устойчивого сорта такие вещества выделяются медленнее и существенно подавляют развитие гриба, начиная только со стадии образования апрессориев.

Возможное участие АФК в антигрибном действии

диффузатов листьев.

Ранее было показано, что фунгитоксичность выделений отрезков листьев вертикально устойчивых сортов риса опосредована АФК, поскольку устраняется антиокислительными реагентами (Аверьянов, Лапикова, 1988; Лапикова и др., 1994). Используя те ке подходы, мы попытались выявить аналогичные особенности у частично устойчивых сортов.

На интактных листьях вертикально устойчивых сортов мы подтвердили, что каталаза, разлагающая Н2О2, а также формиат «ли маннит, перехватывающие гидроксильный радикал, значительно эслабляют токсичность диффузатов (табл. 3). У частично устойчивых сортов антигрибное действие диффузатов тоже устранялось

Таблица 3.

Фунгитоксичность1' диффузатов листьев вертикально устойчивых сортов риса и действие на нее ряда факторов.

{акторы, действовавшие на диффуэат

Штамм Вариант и время ----------------------------------------------

гриба посла инокуляции без ката- СОД фор- тионо- кипя-

добавок лаза миат чввина чениа

Zenith

И5-3 Здоровые, 1 день 1В + В 5 + 5 2 + 5 16 + В -2 + 6 2 + 5

Зараженные, 1 день 63 ♦ 7 0 + 8 -5 + 3 21 + 3 -3 + 4 -7 + 3

КК-37 Здоровые, 1 день В + 5 11 + 3 1 + 4 20 + 5 - -

Зараженные, 1 день 52 + 8 5 + 3 4 + 3 19 + 5 - -

TaduKan

Н5-Э Здоровые, 1 день 46 + В 1 + 4 -5 + 7 7 + б 10 + 5 3 + 3

Зараженные, 1 день 5? + 5 3 + 5 -1 + 5 6 + 4 1 8 3 + 5

КР-69 Здоровые, 1 день 30 + 5 -7 + 4 -5 + Ё -1 + в 5 + 6 0 + 6

Зараженные, 1 день 38 + 4 □ + 5 5 + 6 4 6 -3 + 6 11 + 9

Здоровые, 2 дня 40 + 4 В + g -13 + 4 10 + 4 8 + 7 9 + 9

Зараженные, 2 ДНЯ 76 + 4 14 + 5 25 + 8 28 + 9 2 + 5 -3 + 9

F 87-57 Здоровые, 1 день зв + 9 12 + ¡3 + 7 -11 + Ô IS + S -5 + ?

Зараженные, 1 день 32 + 3 7 + 9 14 + 7 -9 + 7 15 + 7 -2 + 9

Здоровые, 2 ДНЯ 10 + 8 -1 + 8 8 + 5 -7 + 5 -Б + 7 -1 + 8

Зараженные, 2 дня 54 + 3 -9 + 5 2 + 8 -5 6 -4 + 9 4 + 8

КК-3 7 Здоровые, 1 день 49 + 6 4 + 9 10 + 7 S + S 12 + 6 1 + б

Зараженные, 1 день 78 + 7 В + Б 9 + 4 14 + 8 6 + 6 9 + 6

КР-57 Здоровые, 1 день 35 + 8 -3 + 7 3 + В 19 + в -9 + 1 32 + Ù

Зараженные, 1 день 79 + 7 3 + В 23 t в 12 + 10 8 + 4 23 + в

15 Фунгитоксичность определяли по ингибированию прорастания спор указанных штаммов, согласно подписи к рис. 1. Отрицательные величины ингибировэния означают стимуляцию прорастания относительно контроля.

указанными реагентами (табл. 4). Это говорит о возможной связи токсичности с Н2О2 и 'ОН. По-видимому, как и во многих других случаях (На1Пете11, Би^е^с^е, 1984), гвдроксильный радикал является непосредственным токсикантом, а перекись - его предшественникам:

Н20г + Ре2+ -* ОН" + Ге3+ + 'ОН

Таблица 4.

Фунгитоксичность диффузатов листьев частично устойчивых сортов риса и действие на нее ряда факторов.

Факторы, действовавшие на диффуэат

Штамм Вариант и вреия -----------------------------------------------

грива после инокуляции ваз ката- СОД $ор- тиомо- кипя-

довавок лаза миат чевина чениэ

STiimoicita

Н5-Э Здоровые, 1 день 83 + В -2 + 4 8В + 3 13 + 7 84 + В 78 + 7

Зараженные, 1 день 75 + 5 -8 + 7 80 + 6 13 + 6 80 + 3 86 5

КК-Э7 Здоровые, 1 день Э 4 3 2 i + b -3 + 5 - -

Зараженные, 1 день 73 + 1 9 + в 52 + 3 14 + 3 - -

КР-57 Здоровые, 1 день 13 * 3 -6 а 1 + 3 5 8 14 + 8 22 V 7

Зараженные, 1 день 77 9 18 + 7 77 + 6 14 + 9 78 + 5 79 + 9

Norin 18

Н5-3 Здоровые, 1 день 56 + 4 -2 + 4 53 + 5 2 + 4 52 + 2 58 + 5

Зараженные, 1 день 59 + 4 0 + 5 56 + 6 -4 + 3 49 + 5 59 + В

CN4B hwe-lchow

Н5-Э Здоровые, 1 день 50 + 5 4 + 3 50 + 3 7 + 3 43 + 7 49 + 7

Зараженные, 1 день 76 + 5 4 + 5 51 + 4 0 + 5 40 + 5 67 + 5

КР-69 Здоровые, 1 день 36 + 4 22 О 2fl + ä £1 + 5 23 + 7 22 + ь

Зараженные, 1 день 34 + 5 18 + 8 35 + 7 17 + 7 22 + 5 19 + 3

Здоровые, г дня 55 + 9 в + 3 55 + 9 33 + 5 35 + 2 32 + 7

Зараженные, 2 дня 82 5 27 + 8 71 + 6 41 + 10 44 + 9 ВО 8

F 67-57 Здоровые, 1 день 19 + 3 15 + 7 28 + 9 -4 + 9 8 + 7 -3 + 10

Зараженные, 1 день 77 + 5 10 + 7 56 + 1 -8 + 9 53 12 73 + И

КК-3 7 Здоровые, 1 день 57 + а -1 1 53 ♦ 7 -У + 8 4t) + Ы + 4

Зараженные, 1 день 52 + 5 -6 + в 66 + 7 7 + 7 61 + 8 59 + 7

КР-57 Здоровые, 1 день 43 + 9 17 9 7 + 6 19 +■ 8 45 + 7 22 7

Зараженные, i день 72 + 7 14 + 7 25 + 6 28 + 9 33 + 8 14 + 7

China 1039

И5-3 Здоровые, 1 день 45 + 5 -4 + 3 27 + 3 5 + 5 31 + 8 24 + 4

Зараженные, 1 день вз + 6 -4 + 5 50 + 6 10 + 5 41 + 5 52 + 9

КК-3 7 Здоровые, 1 день -3 + 5 -12 + 3 -7 + 5 -14 lo 4 + 6 1 + 4

Зараженные, 1 день 77 + 5 -12 + 3 71 + 3 3 + 9 7B В 65 + Б

КР-57 Здоровые, 1 день 28 + 8 11 + 8 25 + 5 0 + 9 42 + 12 31 + 2

Зараженные, 1 день 71 + 7 4 + 8 56 + 6 10 + 7 64 + 2 61 + 4

В этой реакции участвуют ионы металлов переменной валент-гости, например, железа (НаХНтсеП, БиНег1<3{гэ, 1984). Роль же-[еэа в токсичности диффугатов как вертикально, так и частично стойчиеыл сортов следует из обнаруженного нами сильного зашитого действия десферриоксэмина, специфически связывающего Ре^"1" неактивные комплексы (На111»е11 е1 а1., 1380).

Для образования 'ОН может быть достаточно следовых количеств ионов железа, которые, естественно, требуют ревосстанов-ления. Донором электронов может быть супероксидный радикал (НаШиеП, бииепаее, 1984):

02~ + Ре3+ -► 02 + Ре2+

У вертикально устойчивых сортов антигрибное действие диффузатов устранялось СОД или тайроном, указывая на участие супероксида, возможно как восстановителя железа. В диффузатах частично устойчивых сортов СОД и тайрон были неэффективны, что свидетельствует о непричастности Ог", роль которого, вероятно, выполняют иные восстановители.

Тиомочевина, еще один перехватчик 'ОН, устраняла токсичность диффузатов вертикально устойчивых, но не частично устойчивых сортов. Поскольку 'ОН образуется сайт-специфично, места его генерации могут быть недоступны для некоторых перехватчиков (Сгарэк! ей а1., 1984), что вероятно, определяется сортом растения .

Мы попытались в общих чертах выяснить, от чего зависит образование АФК в диффузатах.

У вертикально устойчивых сортов кипячение полностью или почти полностью устраняло токсичность диффузатов (табл. 3). Возможно, активация кислорода в них связана с термолабильными соединениями, например, ферментами (Аверьянов, Лапикова, 1994; Аверьянов, Лапикова, 1995). Напротив, на диффузаты частично устойчивых сортов кипячение действовало слабо или совсем не действовало (табл. 4), не меняя их чувствительности к антиокислительным реагентам. Вероятно, в диффузатах листьев частично устойчивых сортов химическая система, активирующая кислород, тер-

мостабильна. Она, очевидно, не содержит ферментов и, вообще, пептидов, но зависит от низкомолекулярных соединений, поскольку фунгитоксичность не менялась после обработки диффузатов протеа-зой, но полностью исчезала после диализа.

Цитотоксические свойства АФК могут модифицироваться эндогенными соединениями, в частности, гистидином (Schubert, Wil-mer, 1991). Он обнаружен в выделениях листьев устойчивых, но не восприимчивых к пирикуляриозу сортов риса (Mohanty, Gangopadhy-ау, 1986).

Таблица 5.

Влияние гистидина на фунгитоксичность1J диффузатов листьев л раствора перекиси водорода.

Добавки в среду инкубации

:реда инкубации спор ----------------------------------

вез добавок гистидин гистидин. Вариант каталаза

1и$$уэат2) листьев риса:

сорт Stia-tiao-tsao Здоровые 5 + 7 25 + 6 -1 6

(восприимчивый) Зараженные 7 + 7 64 + 7 7 + в

То же. Zenith (вертикаль- Здоровые го + 8 5 + 7 -5 + 4

но устойчивый) Зараженные 53 + 9 -4 + 3 -5 + 9

-"-, SJHmolcita Здоровые 41 + 5 67 + 7 -5 + 8

(частично устойчивый) Зараженные 49 + 7 73 + 7 -13 + в

ерекись водорода, 5 мИ 3 + 3 49 + 10 19 + 7

' Инокулюм и тест-объект - шгзш Н5-3. ' Все диффузаты разводили еодой в 5 раз.

На диффузаты разных по устойчивости сортов экзогенный гис-идин влиял противоположно. В нетоксичной концентрации (5 мМ) н делал токсичными диффузаты листьев восприимчивого сорта, странял токсичность у вертикально устойчивого, но резко усили-ал ее - у частично устойчивого (табл. 5). Эта аминокислота, с цной стороны, перехватывает 'ОН (Нз1Пгсе11 еЬ а1., 1980), что,

вероятно, происходило в диффузатах вертикально устойчивого сорта. С другой стороны, гистидин способствует проникновению Н2О2 в клетки бактерий (Schubert et al., 1969; Schubert, Wilmer, 1991). Аналогичным образом он мог действовать на споры в диффузатах восприимчивого или частично устойчивого сортов. Действительно, перекись водорода в концентрации, индифферентной для спор пирикулярии, подавляла их прорастание в присутствии гисти-дина. Каталаза предотвращала вызванное гистидином усиление токсичности как перекиси, так и диффузатов, что указывает на ключевую роль Н2О2 в механизме этой токсичности.

Активация кислорода может происходить не только в темно-зых, но и в светозависимых реакциях. У восприимчивого и вертикально устойчивого сортов СЕет усиливал фунгитоксичность диффузатов, а СОД полностью устраняла её (табл. 6). Это говорит о возможном вкладе фотосенсибилизаторов, образующих супероксидный радикал. На токсичность диффузатов листьев частично устойчивых сортов свет, однако, не влиял, что свидетельствует об отсутствии фотосенсибилизаторов и, по-видимому, является еще одним отличием таких сортов.

Таким образом, у исследованных нами устойчивых сортов токсичность листовых диффузатов зависит от активации кислорода. Сильная чувствительность диффузатов к перехватчикам О2-, тиомо-чевине, кипячению или свету свойственна вертикально устойчивым, а слабая - частично устойчивым, что, вероятно, свидетельствует о различном вкладе отдельных АФК и разных механизмах их генерации.

Известно, что многие сорта одновременно содержат гены обоих типов устойчивости, экспрессирующиеся в разной степени и не-

зависимо друг от друга (Kiyosawa, Lee, 1975). Видимо, поэтому в некоторых комбинациях хозяин-паразит отмечены визуальные симптомы смешанного типа. Возможно, по той же причине, фунгитоксич-íocTb в промежуточной степени ингибировалась супероксиддисмута-зой, тиомочевиной или кипячением.

Таблица 6.

Влияние света на фунгитоксичность1) диффузатов2) листьев.

«акторы, действовавшие на ди$фузат 'орт риса ----------------------------------

Вариант Темнота СветЗ) Свет + сс

üa-tiao-t-sao (восприимчивый) Здоровые 3 + 5 22 + 4 4 + 4

Зараженные И + в 18 + 1 -4 + 7

enitíi Íвертикально устойчивый) Здоровые 2 + 9 35 + 10 6 + 7

Зараженные 23 + 4 56 ± 5 -5 + 7

adukan -"- Здоровые 27 + 5 28 + 7 -0 + 6

Зараженные 30 + 5 51 ± 3 -2 + 9

íiimokita (частично устойчивый) Здоровые 21 + 8 32 + 7 23 + 5

Зараженные 38 + 11 42 1 в 29 + 9

ПАВ kneiciio» Здоровые 27 £ 9 36 ± 6 35 + 6

Зараженные 45 + 6 37 ± 5 36 + 6

jrin 18 Здоровые 31 + 5 31 ± 2 28 + 4

Зараженные 59 + 6 64 + 6 70 + 3

lina 1039 Здоровые 30 + б 31 ± б 40 + 5

Зараженные 51 + в 50 i в 40 + 9

\ Инокулюм и тест-объект - штамм Н5-3. J Все диффуэаты разводили водой в 5 раз. ' Смесь диффузага со спорами освещали 1 ч с интенсивностью 10 клк, затем инкубировали в темноте 4 ч.

Одним из следствий активации кислорода в организме являет-

i перекисное окисление липкдов (ПОЛ) (Larson, 1978), происхо-

щее, например, при реакции сверхчувствительности (Koga et .., 1986). Мы исследовали, насколько ПОЛ свойственно листьям 13личных jio устойчивости сортов. Определяли один из продуктов крушения липидных перекисей, малоновый диальдегид (МДА). В ороЕЫХ листьях всех сортов соответствующий максимум (532 нм), к и ожидалось, отсутствовал. В зараженных листьях восприимчи-

зого сорта он обнаруживался на 7-й день, при появлении совместимых пятен. Очевидно, ПОЛ сопутствовало разрушению ткаквк в результате болезни и не было защитной реакцией. У вертикально устойчивого сорта во Есе сроки измерения ПОЛ выявлено не было. Поскольку течение болезни было бессимптомным и реакция сверхчувствительности происходила лишь в немногих клетках, можно полагать, что количество ЭДЦА было ниже порога чувствительности метода. У частично устойчивого сорта так:«« не обнаружено ПОЛ, возможно из-за отсутствия реакции сверхчувствительности и слишком малого числа совместимых пятен. Интересно, что в гомогена-тах листьев присутствовали ТБК-активные продукты с максимумом поглощения при 450-455 нм, более выраженным у зараженных листьев вертикально устойчивого сорта. Бероятно, высокое содержание соответствующих продуктов связано с таким типом устойчивости.

Хотя в большинстве опытов мы изучали интактные растения, анализ токсичности диффузатов был проведен и на отрезках листьев. У всех сортов её величина была такой же, как и у интактных растений. Сортогые различия отмечены в действии некоторых факторов на фунгитоксичность. Так, у вертикально устойчивого сорта интактные и фрагментированные листья не различались между собой по влиянию СОД, тайрона, каталазы, маннита, формиата, тиомоче-вины или кипячения на токсичность диффузатов. Тем не менее, у частично устойчивого сорта токсичность диффузатов отрезков листьев, в отличие от интактных растений, устранялась СОД тай-роном или кипячением.

По-видимому, механизм экстрацеллюлярного антигрибного действия листьев риса меняется при нарушении целостности растения. Мы исследовали, сохраняются ли зависящие от сорта фунги-

токсичные ответные реакции клеток на инфекцию в столь дезинтегрированной системе, как каллусная культура.

Фунгитоксичность диффузатов каллусов.

У восприимчивого сорта диффузаты были нетоксичны или малотоксичны, как з здоровом, так и в зараженном варианте (табл. 7). У вертикально устойчивого сорта токсичность диффузатсв не-

Тгблица 7.

Фунгитоксичность диффузатов каллусов различных сортов риса и действие на нее ряда факторов.

Шгам Вервнг гриба

Фскторы, двйствсвввиив т диффуэогг

бвэ ката- тайрсн СОД

дэвзвск лзэа

фор- мгнниг тисмо- десферр»- кипя-мгаг чввина сксамин ченив

ЯпЧ-1ао-<:.ето (воспр^гииви*) 6 + 8 6 + 3 4 + 4 12 + 6 10 + 6 6 + 4 8+7 7 + 9 10 + в 23 + 7 4 + 7 6 + 5 7 + 7 6 + 5 25 + 5 7 + 4 9 + 6 15 + 10

Н5-3 Здарсвыэ

КК-37

-5 + 4 Зараженные 10 + Э

0 + 7 -1+6

-1 + 4 1 + 6

-2 + 4 -Э + Э

-6 + 5 9 + 4

1 + 7 -3 ; 7 + 5 1

4 + 3 -3 + 3

-10 + 6 -3 + 8 11+9 3 + 7

5 + 7 -3 + 4 3 + 6 4 + 8

2втАХЪ (еерп«шьно устсгкивш)

40 + 7 57 + 8 52 + 8 46 + 6

67 + 5 68 + 9 72 + 7 74 + 4

4 + 6 4+3 3 + 3 -3 + 7

25 + 5 48 + 5

КР-57

}Б-3

Здорсвье -7 + 4 Эгрпюенные 19+2

43 + 7 79 + 5

-6 + 9 13 + 7

43 + 8 67 + 3

-9 + 6 5 + 7

45 + 5 78 + 7

-4 + 2 2+7

40 + 7 67 + 5

КК-37

Зяэрсвыв -8 + 4 Ззреяенныв 79 + 6

-2 + 3 66 + 6

-2 + 3 66 + 6

-1+3 -4 + 4 -1 + 8 -6 + 6 75 + 5 67 + 8 84 + 6 84 + 6

12 + 6 55 + 5

27 + 7 37 + 8 25 + 5 ЭО + 5 4Э + 7 32 + 9

81 + 7 91 +7 81 + 2 90 + 4 84 + 6 85 + 6

51НлиКОа (частично усгойдамй)

6 + 7 36+9 29 + 5 26 + 9 14 + 5 18 + 7

45 + 9 54 + 7 4 + 6 54 + 6 4 + 0 6 + 5

10 + 5 8 + 7 -5 + 3 -5 + 6

18 + 7 6 + 5

КР-57 Здоровые

И5-Э Здорсвда

43+7 86 + 8

55 + 5 78 + 4

31 + 6 89 + 6

20 + 8 3 + 6

КК-37

Здоровье 30 + 6 Ээрзженше 64 + 6

13 + 3 25 + 7

-3 + 3 13 + 5

-1+7 14 + 6

29 + 5 4 + 6

22 + 6 -3 + 3 54 + 7 13 + 5

-2 + 5 16 ♦ 6

11+5 55 + 4

КР-57

98 + 3 Заражение 99 + 3

17 + 5 23+7

36 + 7 6В + 7

: 9 68 + 6 38 + 9 92 + 4 8 66 + 6 74 + 8 83 + 8

73 + 7 78 + 9

24 ; 21 •

зараженных каллусов для одних штаммов была низкой, для других -высокой, а диффузаты зараженных каллусов всегда были высокотоксичны. Частично устойчивый сорт в этом отношении походил на

вертикально устойчивый. По величине токсичнсти у сортов из различных групп выявлены, в основном, те же закономерности, что и на целых растениях.

Тем не менее, некоторые использованные нами факторы действовали на токсичность диффузатов каллусов иначе, чем в случае интактных растений. У вертикально устойчивого сорта ингибирова-ние прорастания спор в диффузатах почти не менялось под действием любых антиокислительных реагентов(табл. 7). У частично устойчивого сорта, оно, наоборот, снижалось многими антиокислительными реагентами, в особенности каталазой.

У вертикально устойчивого сорта токсичность диффузатов каллусов (как и листьев) после кипячения сильно снижалась (табл. 7). На диффузаты каллусов частично устойчивого сорта кипячение действовало аналогично, хотя было малоэффективно в случае интактных листьев.

Экзогенный гистидин придавал токсичность диффузатам каллусов восприимчивого сорта, не влиял на нее у вертикально устойчивого, и усиливал - у частично устойчивого.

Свет увеличивал антигрибную активность диффузатов каллусов всех исследованных сортов. У восприимчивого и вертикально устойчивого сортов СОД не влияла на светозависимую часть токсичности, а у частично устойчивого - полностью или почти полностью устраняла.

Таким образом, клетки риса в каллусной культуре сохраняли способность выделять фунгитоксичные вещества в ответ на заражение. В случае вертикально устойчивого сорта механизм их действия, по-видимому, не зависел от АФК, а в случае частично устойчивого сорта, зависел, но иначе, чем на интактных растениях.

Заключение.

На примере пирикуляриоза риса показано, что частичная болезнеустойчивость растений может быть связана с подавлением развития возбудителя на ранних фазах болезни. Этот эффект вызван экзометаболитами листа, фунгитоксичность которых опосредована АФК. Ранее другими авторами обнаружено, что рост мицелия Р. oryzae в тканях частично устойчивых сортов замедлен, по сравнению с восприимчивыми. По нашим данным, развитие гриба за-горможенно еще до его внедрения в ткани. Способность выделять токсиканты в ответ на контакт с паразитом свойственна не только целому растению, но и его отдельным клеткам, как следует из эпытов с каллусными культурами. Вклад отдельных АФК в антигриб-íoe действие диффузатов и механизм активации кислорода, по-видимому, зависит от целостности растения и различен у сортов с эазным типом устойчивости.

Обнаруженные в работе эффекты могут быть основой для экс-фесс-методов оценки устойчивости на досимптомной стадии бо-гезни, а также в клеточных культурах.

ВЫВОДЫ

1. Листья интактных растений риса как вертикально, так и [астично устойчивых, но не восприимчивых к пирикуляриозу сортов [ерез 1-2 дня после заражения выделяют в инфекционную каплю ве-[ества, подавляющие развитие возбудителя.

2. Непосредственно на листьях вертикально устойчивого сора развитие гриба подавлено уже при прорастании спор. У частич-о устойчивого - ингибирование проявлется позже, когда образу-тся апрессории, что обусловлено более медленным выделением унгитоксичных веществ в инфекционную каплю.

3. Фунгитоксичность диффуаатав листьев исследованных устойчивых сортов связана с АФК, а именно, с перекисью водорода и гидроксильным радикалом. При вертикальной, но не частичной устойчивости токсичность опосредована также и супероксидным радикалом. Активация кислорода у вертикально устойчивых сортов зависит от термолабильных веществ, а у частотно устойчивых - от термостабильных Ееществ непептидной природы. Диффузаты листьев вертикально устойчивых сортов содержат фотосенсибилизаторы, в отличие от частотно устойчивых.

4. Клетки устойчивых, но не восприимчивого сортов риса и в каллусной культуре могут выделять фунгитоксичные вещества, что стимулируется заражением спорами Р. oryzse. Антигрибное действие диффуэатов каллусов вертикально устойчивого сорта не связано с АФК, а частично устойчивого - связано, но иначе, чем у интактных растений.

5. Фунгитоксичнасть диффуэатов может быть показателем сор-тоеой устойчивости риса к пирикуляриозу. Этот показатель применим как к интактным растениям, так и к клеточным культурам, причем в сочетании с некоторыми факторами он позволяет выявить тип устойчивости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Пасечник Т.Д. Возможное участие активных форм кислорода в механизме частичной устойчивости риса к пирикуляриозу // Рис России, 1993, N1. С. 25

2. Лапикова В.П., Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д. Устройства для получения капельных диффуэатов листьев злаков // Микология и фитопатология. 1995. 29. N2. С. 44-4?.

3. Пасечник Г.Д., Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Коваленко Е.Д., Чернова Н.А. Фунгитоксичкость выделений листьев риса, вызванная активированным кислородом и связанная с частичной устойчивостью к лирикуляриозу // Физиология растений, 1995. Т.42. N3. С. 377-384.

4. Aver'yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D. Active oxygen: a possible role for rice resistance to blast // Abstracts of the Seminar on Rice Diseases in the Mediterrsnien Region and Breeding for Resistance (May 15-17, 1995 at CI-RAD, Montpellier, France). 1995, P.25.

5. Pasechnik T.D., Aver'yanov A.A., Lapikova V.P., Kovalenko E.D. Possible relation of active oxygen to partial resistance of rice to blast // Abstracts of the 13th International Plant Protection Congress (July 2-7, 1995, the Hague, the Netherlands), 1996, Abst. N 997.

6. Пасечник T. Д., Аверьянов A. A., Лапикова В.П., Коваленко Е.Д., Коломиец Т.М. Методические указания по досимптомной диагностике частичной устойчивости. ЕНИИФ. Московская обл., Большие Вязёмы, в печати.

7. Пасечник Т.Д., Аверьянов А. А., Лапикова В. П., Коваленко Е.Д., Коломиец Т.М. Подавление развития возбудителя пирику-ляриоза зкзометаболитами листьев риса, вызванное активным кислородом. Возможная связь с вертикальной и частичной устойчивостью. Физиология растений, в печати.

9. T.D. Pasechnik, V.P. Lapikova and A.A. Aver'yanov. Inhibition of ectophytic development of blast fungus in relation to partial resistance to this disease // European Journal of Plant Pathology, в печати.