Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Маркеры сортовой устойчивости к пирикуляриозу в каллусной культуре риса

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Маркеры сортовой устойчивости к пирикуляриозу в каллусной культуре риса"

и

- На правах рукописи

I

Да мл эдн Да да Кута

МАРКЕРЫ СОРТОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ РИСА

Специальность; 03.00.12 - Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений аграрного факультета российского университета дружбы народов и в группе биофизики ВНИИ фитопатологии. Большие Вяземы, Московской области.

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Л. М. Гайворонская, доктор биологических наук, А. А. Аверьянов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. К. Федоров, кандидат биологических наук, Т. А. Власова.

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева.

Защита диссертации состоится ^УУ"./2000г. в 73_ часов на

заседании диссертационного совета К053.22.31 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8 корпус 2 (аграрный факультет).

С диссертации можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

Автореферат разослан 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук, ^п

доцент в г Заец

П ¿Ю) /1 л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Большая часть мирового урожая риса выращивается и употребляется в развивающихся странах, включая Нигерию. По статистике средний нигериец употребляет 21 кг риса в год или 9 % полного калорийного потребления и 23 % потребления всех хлебных злаков в стране [FAOSTAT, 1999]. Однако серьезным препятствием местного производства риса является его высокая восприимчивость к пирнкулярнозу (возбудитель - гриб Magnaporthe grísea (Hebert) Barr). Во всех рисосек>шмх регионах Нигерии эта болезнь уносит до 35-50%, а в отдельные годы даже 100% урожая [West African Rice Development Association,. WARD A, 1989]. В борьбе с пирикуляриозом, особенно в развитых странах, широко применяют фунгициды. Однако, разрозненность и небольшие размеры рисовых полей в Нигерии не позволяют проводить химическую обработку быстро и одновременно. Кроме того, высокие цены на ядохимикаты ограничивают их применение. Решение этой проблемы путем выведения и внедрения устойчивых сортов к пирнкуляриозу более перспективно и безвредно для окружающей среды.

Традиционная селекция, бесспорно, надежна, но требует много времени. Значительный прогресс в современной селекции связан с клеточными культурами. Они позволяют быстро получать большое разнообразие свойств за счет сомаклональной изменчивости, индуцированного мутагенеза и трансгеноза. Применительно к болезнеустойчивости, узким местом, по-прежнему, остается её оценка, проводить которую на клеточных культурал сложно, так как в этом случае нет характерных визуальных симптомов болезни. Поэтому необходим поиск маркеров болезнеустойчивости, проявляющихся в клеточной культуре и отражающих свойства интактных растений.

Ранее во ВНИИФ [Аверьянов и др., 1994] показали, что листья устойчивых, но не восприимчивых сортов риса, особенно после заражение спорами M.grísea, выделяют вещества, ингибирующие прорастание спор возбудителя. Аналогичные свойства были также показаны для каллусов риса [Аверъянов и др., 1999]. При этом, однако, не исключено, что и другие проявления взаимодействия клеток хозяина и патогена in vitro могут зависеть от совместимости

или несовместимости партнеров. Кроме того, представляется актуальным и целесообразным выясннть механизм цитогоксических реакций каллусов.

Цель и задачи исследования Целью данной работы было выявление признаков сортовой устойчивости к пирнкуляриозу в клеточных культурах риса. Решались следующие задачи:

1. Выяснить выделяют ли клетки каллусной культуры риса, зараженной возбудителем пирикуляриоза, вещества, токсичные для спор и мицелия возбудителя, и как это связано с сортовой устойчивостью донорских растений.

2. Изучить реакции каглусов на обработку элиситором гриба в Той же связи.

3. Исследовать возможные признаки устойчивости или восприимчивости при двойном культивировании клеток растения и гриба.

4. Выяснить некоторые детали механизма указанных эффектов.

Научная новизна работы. Показано, что при двойном культивировании, M.grisea колонизирует каллусы восприимчивых, но не устойчивых сортов риса, и что образование воздушных гиф гриба стимулируется в совместимых комбинациях хозяин-патогена. Получены указания на участие NADP(H)-OKCiwa3bi и пероксидазы в элиситор-зависимой некротической реакции каллусов риса. Показана зависимость этих эффектов от ионов кальция и активных форм кислорода.

Практическая значимость работы. На основе представленных экспериментальных данных, можно рекомендовать использование некоторых выявленных защитных эффектов в качестве маркеров устойчивости риса к пирикуляриозу при селекции in vitro.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на семинарах кафедры ботаники и физиологии растений РУДН и группы биофизики ВНИИ фотопатологии и на четвертом съезде Общества физиологии растений России (Москва, 1999г.).

Публикация. Результаты диссертации опубликованы в S печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на /¿¿Зпр и состоит из введения, трех глав и выводов. Список использованной литературы включает 178 источников, в том числе 148 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследований. Для опытов использованы каллусные культуры, полученные по методике Белянской и Шаминой [1993] из стерилизованных зрелых семян разных сортов риса н различные штаммы гриба Magnaniporthe grísea (Hebert) Barr (табл. 1). Культуру гриба выращивали на ага-ризованной морковной среде при 28°С.

Таблица 1

Использованные сорта риса, штаммы гриба и типы их взаимодействия при заражении патогеном интактных растений (S — восприимчивость; R - устойчивость)

Штамм

Сорт H5-3 Ken54-20 Kyu82-395A Inal68 PH31

Zenith R R R R S

Shin2 S S R S S

Aichi-Asahi S S S R S

Maratelli s S S S S

Shat-tiao-tsao s S S R S

Ishikare- s R R R S

Shiroke

Элиситор получали из автоклавированного гомогенизированного мицелия гриба. Получение суспензии спор гриба, инокуляцию каллусов, сбор диф-фузатов инокулированных каллусов и определение токсичности диффузатов для прорастания спор возбудителя, проводились по методике, схематически представленной на рис. 1. Кроме того, фунгитоксичность диффузатов каллусов определяли визуально по степени ингибирования роста мицелия на среде каллусов. При этом, рост мицелия оценивали в балах по следующей шкале:

0 - Колонии гриба отсутствуют

1 • Колонии покрывают меньше 25% поверхности среды,

2 - Колонии покрывают до 50% поверхности среды,

3 - Колонии покрывают до 75% поверхности среды,

4 - Колонии покрывают всю поверхности среды.

РисЛ: Схема опыта по определению фунгитокснчности выделений каллусов

При двойном культивировании в чашку Петри с питательной средой Му-расиге и Скуга сажали 2 кусочка каллусов (0 5 мм) на расстоянии 2 см друг от друга, а между ними, в центре чашки, - мицелий гриба (0 1мм). Степень колонизации каллусов грибом оценивали по шкале Миллера [1985]:

0 - Воздушные гифы отсутствуют (устойчивость),

1 - Воздушные гифы покрывают меньше 25% поверхности каллусов (устойчивость),

2 - Воздушные гифы покрывают до 50% поверхности камусов (устойчивость),

3 • Воздушные гифы покрывают до 75% поверхности хачяусов (восприимчивость),

4 - Воздушные гифы покрывают всю поверхности калпусов (восприимчивость).

При этом учитывали размеры и форму колония гриба, и образование его воздушных гиф.

Некротизацию каллусов оценивали по степени их побурения через 48 часов после обработки элиситором гриба или заражения спорами. Участие активных форм кислорода ("ОН, HjOi, 'О^ и Ог") в этой реакции учитывали по ннги-бирующему действию маннита, формиата натрия или тиомочевины (перехватчики 'ОН), диметилтиомочевины (перехватчик HjOj), тайрона (перехватчик Ог' ) и гистидина (тущитель'Ог).

О генерации Oj' в диффузатах каллусов судили по СОД-чувствительному восстановлению нитросинеготетразолия, которое измеряли на спектрофотометре "Shimadzu" UV-260 (Япония) по поглощению при 560 нм [Dolce, 1983].

Активность пероксидазы в каллусах и их диффузатах опредиляли спетро-фотометрически по окислению гваякола [Трубецкова и Баславская, 1964]. Дтя выявления возможного участия ферментов (ЫАО(Р)Н-оскидаза, пероксидаза и липоксигеназа), продуцирующих активные формы кислорода (АФК) в некротической реакции каллусов, добавляли дифенилениодониум (DPI - ингибитор КА1)(Р)Н-оскидазы) и салицилгидроксамовую кислоту (SHAM - ингибитор пероксидазы и липоксигеназы).

О роли ионов кальция судили по влиянию этиленгликолтетрауксусной кислоты (ЭГТА - хелатор Са2+) и хлорида лантана (блокатор кальциевых каналов, в частности плазмалеммы).

Для каждого варианта вычисляли средние арифметические и их среднеквадратичные отклонения.

Список сокращения: АФК - активные формы кислорода; Of - суперок-сидныи радикал; Н2О2 • перекись водорода; 'ОН- гидроксильныйрадикал; 'О2 — синглетный кислород

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Защитные реакции культивируемых клеток.

1.1. Фунгитоксические выделения культивируемых клеток риса

Известно, что листья ннтактных растений вертикально устойчивых, но не восприимчивых к пирикуляриозу сортов риса через 1-2 дня после заражения выделяют в инфекционную каплю вещества, подавляющие развитие возбудителя [Аверъянов и др. 1994].

Мы исследовали, проявляется ли аналогичная антигрибная активность в диффузатах каллусов. Диффузаты незараженных каллусов устойчивого сорта

Zenith не были токсичными для прорастания спор M.grisea. Однако после заражения наблюдалось резкое усиление этого показателя (табл. 2).

Таблица 2

Фунгитоксичность днффузатов каллусов устойчивого сорта JZenith в зависимости от заражения грибом M.grisea штамма Ina 168 (18 часов инкубации каллусов с ииокулюмом и 5 часов инкубации тест-объекта в диффузатеj

Среда прорастания спор

Ингибирование прорастания спор, %

Вода

Диффузат незараженных каллусов Диффузат зараженных каллусов

О ± 3 -2 ±8 70 ± 9

(Абсолютное прорастание спор е воде 672%)

Возможно, защитные вещества выделяются и неинфициро ванными каллусами, но медленнее, и при длительном культивировании каллусов могут накапливаться до токсичного уровня в среде. Действительно, развитие мицелия несовместимого штамма ингибируется средой, на которой длительно росли каллусы. На рис. 2 показано, что штамм гриба К.еп54-20 вирулентный для сорта Shat-tiao-tsao, но не сорта Zenith, плохо растет на среде после каллусов Zenith, а на среде после каллусов Shat-tiao-tsao Кеп54-20 растет беспрепятственно, также как и на свежеприготовленной среде.

5 4,5

5 4

ю 3,5 -

га : ю _ .

12,В-\ ^ 2

о

О- 1 0,5-1 о

Свежая среда Среда после Среда после Shat-tiao-tsao (S) Zenith (R)

Рис.2. Ингибирование роста мицелия гриба штамма Кеп54-20 на среде, где длительно (1 месяц) культивировались каллусы устойчивого (R) Zenith и восприимчивого (S) Shat-tiao-tsao сортов риса.

Полученный результат показывает, что выделение фунгитоксических веществ может быть свойством каллусов устойчивого сорта, причем не только зараженных. Тем не менее, устойчивость обычно наиболее четко проявляется на зараженном хозяине, что было, в основном, исследовано нами в дальнейшем.

Кроме того, защитные выделения клеток растений могут быть токсичными не только для внедряющегося патогена, но и для самого хозяина, что, возможно, приводит к сверхчувствительной гибели клеток, препятствующей колонизации ткани. Аналогичные реакции обнаружены также при обработке каллусов препаратом элиситора, выделенным из гриба. При этом сохранялись различия между совместимой и несовместимой комбинациями.

1.2. Некротическая реакция каллусов риса в ответ на обработку j.iii-ситором возбудителя пирикуляриот При обработке каллусов разных по устойчивости сортов риса элисито-ром патогена, некротическая реакция наблюдалась только если штамм, из которого выделяли элиентор и сорт, из которого получили каллусы, представляли несовместимую комбинацию (табл.3).

Таблица 3

Некротическая реакция каллусов в ответ на обработку элиситором штамма Kyu 82-395А в зависимости от болезнеустойчивости сортов-доноров

Сорт _Доля некротизированных каллусов, %_

(S -восприимчивый, Необработанные Каллусы, обработанные

R- устойчивый)_каллусы_элиситором_

Aichi-Asahi (S) 0.0 ± 0.0 0.0 + 0.0

Ishikare-Shiroke (S) 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Maratelli (S) 0.0 ±0.0 0.0 ± 0.0

Shat-tiao-tsao (S) 0.0 ±0.0 0.0 + 0.0

Zenith (R) 0.0 ±0.0 89.7 ±3.5

Сорта Aichi-Asahi, Maratelli, Shat-tiao-tsao и Ishikare-shiroke, восприимчивые в виде интактных растений к штамму Куи82-395А, в клеточной культуре не реагировали некротизацией, тогда как каллусы устойчивого сорта Zenith - реагировали.

По-видимому, клетки устойчивого хозяина^ не только в составе листьев, но и будучи изолированными, распознают элиситор патогена и запускают каскад

К)

защитных реакций, приводящих в частности, к некротизацни. При этом паразит, изолированный зоной мертвых клеток, не успевает колонизировать соседние живые клетки. У восприимчивых сортов, у которых нами не наблюдалась некротическая реакция, паразит, по-видимому, может это успеть. Для проверки мы проанализировали колонизацию каллусов разных по устойчивости сортов риса различными штаммами гриба Л/, grísea

1.3. Ко.юпиишия KiLLiycoe риса грибом M.grisea

Каллусы одного из двух сортов культивировали совместно с одним из следующих штаммов гриба' Ina 168, Kyu82-395A или Н5-3. Через 7 дней, гриб полностью колонизировал каллусы восприимчивого сорта Maratelli. Однако, те же штаммы гриба почти не колонизировали каллусы устойчивого сорта Zenith (рис. 3).

5 i

Ina 168 Н5-3 Kyu 82-395А

Рис. 3. Колонизация каллусов устойчивого (Zenith) и восприимчивого (Maratelli) сортов риса разными штаммами (Ina 168.Н5-3, Kyu82-395A) гриба

Для более строго доказательства специфичности отношений хозяин-патоген, мы исследовали перекрестные комбинации, где один и тот же сорт мог быть как устойчив, так и восприимчив, в зависимости от штамма возбудителя. Известно, что целые растения сорта Shin2 устойчивы к штамму Куи82-395А, но восприимчивы к штамму Ina 168, а сорт Aichi-Asahi, наоборот, восприимчив к штамму Куи82-395А и устойчив к штамму Ina 168. В условиях in vitro, штамм Ina 168 колонизировал клетки сорта Shin2, но не сорта Aichi-Asahi, а штамм

Kyu82-395A колонизировал каллусы сорта Aichi-Asahi, но не сорта Shin2. llpiV этом ни один нз штаммов гриба не колонизировал каллусы устойчивого сорта Zenith, в то время как оба штамма полностью колонизировали каллусы восприимчивого сорта Maratelli (табл. 4). Таким образом, сортовая специфичность этой реакции риса сохраняется в клеточной культуре.

Таблица 4

Колонизация клеток разных по устойчивости сортов риса указанными штаммами гриба в зависимости от специфичности взаимодействий хозяин-патоген (S - восприимчивость; R -устойчивость)

Степень колонизации данным штаммом. Сорт в балах шкалы Миллера

Inal68 Kyu82-395A

Zenith 0.0 ± 0.0 (R) 1.3 ±0.6 (R)

Shin2 4.0 ± 0.0 (S) 2.0 + 0.0 (R)

Aichi-Asahi 1.3 ±1.2 (R) 3.3 +0.6 (S)

Maratelli 4.0+ 0.0 (S) 4.0 +0.0 (S)

Вещества, выделяемые каллусом и способствующие или препятствующие росту гриба, вероятно, могут, попадая в питательную среду, влиять на рост мицелия непосредственно с каллусами не контактирующего. Мы попытались выявить этот эффект в двойной культуре, где клетки гриба и растения были первоначально разделены.

Обнаружено, что каллусы риса влияют на рост иг •. .гие гриба и, что это влияние зависит от сортовой устойчивости. Хотя размеры колонии гриба в двойной культуре не всегда зависели от устойчивости каллусов (табл.5), их форма зависела от совместимости или несовместимости комбинации. Вопреки ожиданиям, мы не обнаружили угнетения роста мицелия в несовместимых комбинациях. В то же время, противоположное влияние было в совместимых комбинациях. При несовместимой комбинации, колония гриба обычно имела круглую (А) форму, а при совместимой - вытянутую (В) форму (рис. 4).

Кроме того, каллусы восприимчивых и устойчивых сортов различались по влиянию на образование воздушных гиф гриба. Каллусы именно восприимчивых сортов стимулировали образование таких гиф, причем не только над каллусами, но и по всей колонии. На грибных колониях, выросших в отсутствии каллуса, воздушных гиф не было.

Таблица 5

Размеры (мм) колоний двух штаммов гриба в двойной культуре с каллусами разных сортов риса

Диаметр колонии штамма Ina 168

Диаметр колонии штамма KyuS2-395A

Сорт вдоль каллусов (А) поперек каллусов (В) В/А вдоль каллусов (А) поперек каллусов (В) В А

Гриб без каллуса 39.7 + 0.6 39.3 + 0.6 1.0 26.7 + 1.2 27.3 ± 0.6 1.0

Maratelli 39.3 + 0.6 46.7 ± 0.6 1.2 (S) 28.0 ±1.0 35.0 ±1.0 1.3 (S)

Zenith 29.0 + 1.0 30.0 ±1.0 1.0 (R) 29.3 + 0.6 29.0 ± 0.0 1.0 (R)

Shin2 40.3 + 0.6 45.3 ± 0.6 1.1 (S) 33.0 + 0.0 33.5 ± 0.7 1.0 (R)

Aichi-asahi 29.0 + 1.0 28.3 + 1.5 1.0 (R) 30.0+ 1.0 36.3 ±0.6 1.2 (S)

Таким образом, выделения каллусов риса в несовместимой комбинации, ингибируют прорастание спор M.grisea, и препятствуют колонизации каллусов грибом, но в совместимой комбинации - стимулируют рост мицелия гриба. Кроме того, при несовместимых взаимодействиях, наблюдалась гибель самих клеток риса, возможно под влиянием тех же веществ. Мы попытались выяснить некоторые детали механизма этих цитотоксических эффектов.

2. Механизмы устойчивости к пирикуляриозу в клеточных культурах риса

2.1. Участие Са2^ в защитных реакциях культивируемых клеток устойчивого сорта риса Известно, что ионы кальция участвуют в запуске защитных реакций у многих растений [Levine et al., 1996; Zimmermann et al., 1997]. В нашем опыте,

мы изучали участие Са2' в некротических реакциях каллусов на обработку эли-ситором гриба. При удалении Са2' из среды инкубации с помощью I мМ ЭГТА (хелатор Са2") ослаблялась некротическая реакция на обработку элиситором (табл. 6). Добавление 1 мМ СаСЬ после обработки ЭГТА восстанавливало реакцию каллуса на элиситор. Таким образом, в элиситор-зависимой некротизации каллусов риса, очевидно, участвуют ионы кальция

Таблица 6

Влияние ЭГТА и ионов кальция на некрозообразованне каллусов риса (сорта Zenith), вызванное элиситором из мицелия М. grísea (штамм Куи 82-395А)

Вариант

Контроль

Элиситор

ЭГТА, затем элиситор

ЭГТА, затем СаСЬ, затем элиситор

Доля некротизированных каллусов, % 0 ±0.0 66 ± 3.6 13 + 1.0 51.3 ± 1.5

Ранее мы показали, что авирулентные штаммы индуцируют у устойчивого каллуса защитные реакции, приводящие к усиленному выделению веществ, ингибирующих прорастание спор гриба (рис. 2). Так как Са2* играет важную роль в активации многих защитных механизмов, было целесообразно исследовать его роль в индукции и этой реакции. Оказалось, что добавление 1 мМ ЭГТА и 0.1 мМ ЬаСЬ к зараженным каллусам значительно снижает фунгито-кичность их диффузата (табл. 7).

Таблица 7

Влияние ЭГТА и ЬаСЬ "а фунгитоксичность диффузатов зараженных спорами штамма 1па 168 каллусов устойчивого сорта ХепНЬ.

Вариант Ингибирование прорастания спор гри-

_ба того же штамма, %_

Диффузат без добавок 70 ±0.9

Диффузат + ЭГТА 8±в.6

Диффузат + ЬаС13 8 ±8-8

Следовательно, распознавание патогена, вероятно, приводит к притоку Са"* в клетку из апопласта через кальциевые каналы плазмалеммы, что индуцирует выброс фунгитоксичмых вешесгв. .

Известно, что приток Са2' необходим в качестве вторичного мессенджера для элиситирования окислительного взрыва в растительных клетках [Qiu et al., 1994; Mehdy, 1994]. В свою очередь, окислительный взрыв запускает многие последующие защитные реакции растений [Doke et al., 1996; Low and Merida, 1996].

2.2. Генерация активных форм кислорода каллусами

05 участии супероксидного радикала (0_> ) в механизме фунгитоксично-сти свидетельствует ее ослабление добавленной в диффузат супероксиддисму-тазой (СОД) - ферментом, специфически разрушающим Ог". В нашем опыте по СОД-чувствительному восстановлению нитросинего тетразолия обнаружено, что незараженные каллусы, независимо от устойчивости, генерируют супероксидный радикал, правда каллусы устойчивого сорта несколько сильнее, чем восприимчивого. Однако после заражения генерация супероксида значительно усиливалась у устойчивого, но почти не изменялась у восприимчивого сорта (табл. 8).

Таблица 8

Генерация супероксидного радикала каллусами в зависимости от болезнеустойчивости сортов-доноров и заражения штаммом Н5-3

(AS60xio3;

Сорта Минус СОД Плюс СОД ±СОД

ЗДОРОВЫЕ КАЛЛУСЫ

Zenith (R) 96+ 19 46+6 50

Sha-tiao-tsao (S) 74 ± 10 30 + 8 44

ЗАРАЖЕННЫЕ КАЛЛУСЫ

Zenith (R) 112 + 16 30 ±8 75

Sha-tiao-tsao (S) 71 ± 19 30 + 8 41

Известно, что супероксид не обладает непосредственной микробицидной активностью, а является предшественником более реакционной формы кисло-

рода - гидроксильиого радикала ("ОН). Другим участником этой реакции является перекись водорода (H202).

Чтобы показывать участие активных форм кислорода в некротической реакции, вместе с элиситором добавляли к каллусам антиокислительные реагенты, разрушающие те или иные АФК: маннит, формиат натрия или тиомочевину (перехватчики 'ОН), диметилтиомочевину (перехватчик Н^О:), тайрон (перехватчик О,'), или гистидин (тущитель !Oi). Все эти вещества в той или иной степени ослабляли некротизацию, что и указывает на участие в ней соответствующих АФК (табл. 9).

Возможным источником АФК могли быть ферменты, ранее известные в этом качестве, в частности, пероксидаза. ГГо окислению гваякола, нами обнаружена пероксндазная активность в каллусах, чувствительная к салицилгидрокса-мовой кислоте (SHAM), известному ингибитору пероксидазы.

Таблица 9

Влияние различных перехватчиков АФК на элиснтор-завнснмую некротизацию каллусов устойчивого сорта Zenith

_Доля некротизированных каллусов, %_

Вариант Без элиситора С элиситором _ % %

Без добавок 0.0 + 0.0 97.7 + 2.5

30 мМ диметилтиомочевина 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0

10 мММаннит 0.0±0.0 19.0±3.6

1мМ Тайрон .0.0 ±0.0 38.7 ±3.2

1 мМ Формиат 0.0 ±0.0 40 ± 1.0

2.3 мМ Гистидин 0.0 ± 0.0 56.0 ± 5.3

0.5 мМ Тиомочевина 0.0 ±0.0 39 ±1.0

Чтобы показать участие АФК в некротической реакции каллусов, тот же ингибитор добавляли к ним вместе с элиситором. Обнаружено, что тогда некро-тизация проявлялась слабее, чем с одним лишь элиситором (табл. 10). Правда, данный ингибитор действует и на липоксигеназу, то есть в защитной реакции каллусов может участвовать и этот фермент.

Другим ферментативным источником 0{ является NADPH-оскидаза, а ее ингибитором - дифенилениодониум (DPI). В нашем случае, этот ингибитор тоже ослаблял элиситор-зависимую некротизацию, правда, слабее, чем преды-

душий (табл. 10) То есть, фермент КАЛРН-оскидаза также мог участвовать в этой защитной реакции.

Таблица 10

Влияние ингибиторов НАДФ-оксндазы и пероксидазы (учитываемое по ингибирукицему действию DPI и SHAM) на элиситор-зависнмую некроти-зацню каллусов устойчивого сорта Zenith

Доля некротизированных каллусов, %

Вариант Без обработки С обработкой элиситором

Без добавления 0.0 + 0 99.0 + 1.0

Добавление 2 цМ DPI 16.3 + 0.6 54.0 ±3.6

-"- 100 цМ SHAM 17.0 ±1.0 33.0 ±1.0

Таким образом, важную роль в механизме защитных реакций культивируемых клеток риса играют Са2+ и активные формы кислорода. Мы предполага-

21*

ем, что повышение концентрации Са в цитозоле активирует генерацию активных форм кислорода латентной НАДФН-оксидазой и другими окислительными ферментами (пероксидаза, липоксигеназа). Образованные АФК, в свою очередь, могут токсически влиять на патоген, а также вызывать сверхчувствительную цитотоксическую реакцию клеток хозяина.

Установлено, что культивируемые клетки сохраняют свойственную ин-тактным растениям способность к некротической реакции и выделению фунги-токсических веществ в несовместимых комбинациях или стимуляции развития гриба в совместимых.

ВЫВОДЫ

1. Клетки риса в каллусной культуре выделяют вещества, токсичные для гриба М.grísea именно несовместимых штаммов, и этот эффект усиливается после заражения каллусов.

2. Обработка каллусов элиситором, выделенным из гриба, вызывает их некро-тизацию, что также свойственно несовместимым комбинациям.

3. В двойной культуре, именно в совместимых комбинациях, наблюдается стимуляция роста мицелия гриба.

4. В механизме цитотоксических реакций каллусов на инфекцию или элиситор участвуют активные формы кислорода и ионы кальция.

5. По-видимому, выявленные нами эффекты могут служить маркерами при селекции риса in vitro на устойчивость к пирикуляриозу.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Кута Д.Д. Участие ионов кальция в сверхчувствительной реакции каллусов на обработку элиситором гриба Magnaniporthe grísea. // Проблемы землепользования, земельного и городского кадастра и градостроистельства -Москва: Совет молодых ученых и специалистов ГУЗ, 1998г. - С.225-227

2. Кута Д Д., Гайворонская Л.М., Пасечник Т.Д., Лапикова В П., Аверьянов A.A. Сверхчувствительная реакция каллусов риса на элиситор возбудителя пирикуляриоза. // Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений. Москва, 4-9-октября 1999 г.Том 1. - С: 226-227

3. Кута Д.Д., Гайворонская Л.М., Пасечник Т.Д., Лапикова В П, Аверьянов A.A. Развитие возбудителя пирикуляриоза в двойной культуре с каллусом риса в зависимости от сортовой устойчивости к этой болезни. // Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений. Москва, 4-9-октября 1999 г. Том 1-С: 227

4. Кута Д.Д., Гайворонская Л.М., Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д. Оценка клеточной культуры риса на устойчивость к пирикуляриозу // В сб. «Достиж. и перепек, в области троп. земл. и живота.» М., 2000. С: 68-69

5. Кута Д.Д., Гайворонская Л.М., Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д. Участие супероксид-аниона кислорода в биохимической защитной реакции клеток Oryza sativa на заражение Magnaniporthe grísea // В сб. «Достиж. и перепек, в области троп. земл. и животн.» М., 2000. С: 69-70

Данладн Дада Кута (Нигерия)

"МАРКЕРЫ СОРТОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ в КАЛЛУ СНОП КУЛЬТУРЕ РИСА"

Исследованы некоторые реакции каллусов на заражение спорами или обработку элиситором возбудителя пирикуляриоза для выявления их биохимических механизмов и возможного использования в качестве маркеров сортовой устойчивости. Установлено, что культивируемые клетки сохраняют свойственному интактным растениям способность к некротической реакции и выделению фунгитоксических веществ в несовместимых комбинациях или стимуляции развитии гриба в совместимых. В механизме цитотоксических реакций каллусов на инфекцию или элиситор участвуют активные формы кислорода и ионы кальция.

Danladi Dada Kuta (Nigeria)

"MARKERS OF INHERITABLE RESISTANCE TO BLAST DISEASE IN RICE CALLUS CULTURE"

Some responses of rice calli to spore inoculation or treatment with elicitor from blast pathogen were investigated to reveal their biochemical mechanisms and possible application as markers of inheritable resistance to blast. It was established that cultured cells retain intact plants' ability to necrotic reaction and exudation of fungitoxic substances in incompatible combinations or stimulation of fungal development in. compatible ones. Active oxygen species and calcium ions participate in the mechanism of the cytotoxic reactions of calli to infection or elicitor treatment.

7 C-TitfiC, ifS »c^Aces/sus^S-r^ ¿. Ты». А'/ЛС /^WGH