Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитоплазматические регуляторы транспорта катионов и метаболитов через мембрану митохондрий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гайнутдинов, Марат Хамитович

ВВЕДЕНИЕ . 6

ГЛШ I. ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ И МЕЖБОЛИТОВ ЧЕРЕЗ

МЕМЕ>АНУ МИТОХОНДРИЙ . 17

1.1. 1)эанспорт метаболитов в митохондриях. 17

1.2. Транспорт катионов в митохондриях. 34

ГЛАВА 2. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

ГОРМОНАМИ НА КЛЕТОЧНОМ, УРОВНЕ И НА.

УРОВНЕ МИТОКОНЛРШ. 40

2.1. Взаимоотношения ц з/з' АШ и ионов кальция в регуляции гормонами глюконеогенеза и гликогенолиза в печени и почках. Щ

2.2. Взаимоотношения гормональной регуляции на уровне клетки и "на уровне митохондрий.53 - 61 2.3. Регуляция ц 3'5*АМФ метаболических процессов в митохондриях гепатоцитов в связи с регуляцией глюконеогенеза. 61-7%

2.4. Ион кальция как посредник действия ка-техоламинов в их действии на метаболизм митохондрий печени. 74

ГлаВА 33. ЦИТОПЛАЗМА ШЕСКИЕ РЕГУЛЯТОРЫ ФУНКЦИИ

МИТОХОНДРИЙ . 78 - да

3.1. Регуляторные эффекты С1К. 80

33.2. Цитоплазматический метаболический фактор; 82 - 84 3.3. Регуляция функционального состояния митохондрий бурого жира пуриновыми нуклеотидами. 85

ЗА. Регуляция функции митохондрий печени адениновыми нуклеотидами. 87

- 3

3i.5. Инсулинзависимый цитоплазматический регулятор транспорта кальция и субстратов в митохондриях. 90

3.6. Выделение и идентификация инсулинзависимого цитоплазматического регулятора. 98

3.7. Действие ИЗР на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для одновалентных катионов. ПЗ

33.8'. Регуляция окисления субстратов ИЗР. 119

3.9. Действие ИЗР на транспорт и метаболизм пирувата в митохондриях печени крысы. 126 - D

3.10. Действие И2Р на транспорт сукцината, <ï» -кетоглютарата, глютамата »аспартата, цитрата и фосфата в митохондриях. 133

3.11. О механизме действия ИЗР на митохондрии. 138 -

ГЛАВА 4. I3P КМ ВОЗМОЖНЫЙ ПОСРЕДНИК ДЕЙСТВИЯ

ИНСУЛИНА. НА МЕТАБОЛИЗМ. 144

4.1. Основные метаболические эффекты инсулина и механизм действия инсулина. ИЗР как возможный посредник действия инсулина. 144

4.2. Действие ИЗР на глюконеогенез в кусочках печени крысы. 155

4.3. Действие ИЗР на глюконеогенез в корковом слое почки. 157

4.4. Регуляция глюконеогенеза в печени гормонами. Взаимоотношения ц 3'5*АМФ, ионов кальция и ИЗР в регуляции метаболизма пирувата в митохондриях. 160

- 4

4.5. Действие ИЗР на гликогенолиз в печени крысы. 170

6. Действие ИЗР на синтез гликогена в диафрагме крысы. 172

7 Действие ИЗР на синтез белка в изолированной диафрагме крысы. 176

4.8. Гипогликемическое действие ИЗР. 180

4.9. ИЗР как посредник действия инсулина на метаболизм. 181

ТЛШ:, 5. О РОЛИ ИЗР ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ ИНСУЛИНА И ГСРМОНОВ-АШАГОНИСТОВ ИНСУЛИНА ПРИ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ КРЫСАМ СТРЕСССРШХ ГОРМОНОВ . 192

5.1. Взаимоотношения инсулина и гормонов-антагонистов инсулина в регуляции углеводного обмена при стрессе. 193

5.2. О влиянии стресса и глгококортикоидов на активность ИЗР. 198

5.3. Снижение чувствительности митохондрий к действию ИЗР как один из механизмов возникновения инсулинрезистентности. 204

5.4i. Функциональное состояние митохондрий печени крыс при стрессе и их чувствительность к действию ИЗР. 210

5.5. Физиологическая инсулинрезистентность как механизм усиленного синтеза гликогена в печени при стрессе и введении крысам гидрокортизона. 219

- 5

5.6. Увеличение активности Са2+/2Г переносчика в митохондриях печени при введении крысам гидрокортизона. 229

ГЛАВА 6. ТРАНСПОРТ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МИТОХОЦЯРИЯХ СЕРДЦА. РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ

ГЛИКОПРОТЕИДАМИ. 239

ГШ 7. КЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ,ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ И ИХ СТк-ШЛИЗАЦИЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К П0ЕРЕ1ДАЮЦИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ. 253

7.1. Повреждение митохондрий печени ионами кальция. Стабилизация митохондрий фактором из поврежденных митохондрий. 255

7.2. Влияние ишемии на активность ИЗР в печени крыс. 266

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитоплазматические регуляторы транспорта катионов и метаболитов через мембрану митохондрий"

Прошло уже более 30 лет с тех пор', как были разработаны методы выделения интактных митохондрий. Все эти годы митохон-рии были и остаются одним, из самых популярных объектов исследования. Едва ли ситуация изменится в ближайшие годы. Актуальность исследований на уровне митохондрий определяется целым рядом причин. Трудно переоценить важность такой функции митохондрий как окислительное фосфорилирование. Поэтому вполне естественно,что исследование молекулярного механизма окислительного фосфорилирования оказалось одной из самых важных проблем современной биологии. Впоследствии оказалось, что окислительное фосфорилирование не является единственной функцией митохондрий в клетке. Митохондрии участвуют в регуляции концентрации кальция в цитоплазме, осуществляя активный транспорт кальция с использованием энергии Alf или окисления субстратов / I - 7 /.

В клетках с интенсивным глюконеогенезом С Гепатоциты и клетки коркового слоя почки ) в митохондриях осуществляются начальные этапы глюконеогенеза, а в клетках, осуществляющих синтез жирных кислот,функцией митохондрий является синтез цитрата, необходимого для синтеза GSK в цитоплазме. В буром жире, основной функцией которого является генерация тепла, такой же важной функцией митохондрий как окислительное фосфорилирование является прямая трансформация энергии окисления в тепло / 8 -13 /. Этот далеко не полный перечень функции митохондрий в клетке указывает на то, что митохондрии являются полифункциональными органеллами, причем четко проявляются тканеспецифи-ческие различия в свойствах митохондрий, выделенных из различных органов, например, из печени, бурого жира, сердца, надпочечников и т.д.

Чрезвычайно сложной оказалась организация транспорта катионов и метаболитов из цитозоля в митохондрии, который определяется функционированием нескольких десятков переносчиков в мембране митохондрий / 13-30 /, перечень которых увеличивается в последние годы и, по-видимому, далеко не полон. Очень важно, что отмеченная выше тканеспецифичность митохондрий определяется в основном тканеспецифичностью набора переносчиков в мембране. Так, например, в митохондриях печени, где происходит синтез СЖК, имеется переносчик цитрата, а в митохондриях сердца, в котором синтез цитрата не происходит, этого переносчика нет / 13 /. В буром жире в мембране митохондрий имеется канал проницаемости для анионов, регулируемый пурино-выми нуклеотидами, которого нет в митохондриях печени и сердца / 10 /. В митохондриях почки имеется переносчик глютамина, которого нет в митохондриях печени и сердца / 31 /. В последние годы получены прямые указания на то, что одним из способов регуляции метаболизма гормонами является изменение проницаемости митохондриальной мембраны для метаболитов, которое цриводит к изменению интенсивности транспорта метаболитов из цитозоля в митоховдрии / 13-15, 32-34 /.

Все это позволяет, во-первых, сделать вывод о том, что для понимания физиологической регуляции функции митохондрий особенно важным является исследование регуляции транспорта метаболитов через мембрану митохондрий, а, во-вторых, поставить вопрос об идентификации эффекторов, регулирующих активность переносчиков метаболитов в мембране митохондрий. В достаточной степени этот вопрос разрешен только в отношении переносчиков адениннуклеотидов, активность которого регулируется длинноцепочечными ацил КоА, и в отношении канала проводимости для анионов в митохондриях бурого жира, эффекторами активности которого являются адениннуклеотиды, (Ж и длинноцепо-чечные ацил коА / 11,14,34,35-37 /.

В настоящее время очевидно, что действие гормонов на транспорт метаболитов через мембрану митохондрий не определяется прямым взаимодействием гормонов с митохондриями и, следовательно, в данном случае проблема идентификации эффекторов активности переносчиков метаболитов сводится к проблеме идентификации посредников действия гормонов, непосредственно действующих на транспорт субстратов в митохондриях.

Каковы же пути решения этой проблемы? Если учесть, что этими эффекторами могут быть метаболиты цитозоля, такие как (Ж, длинноцепочечные ацил КоА, нуклеотиды и т.д., то самым простым подходом к решению проблемы является исследование действия этих метаболитов на транспорт субстратов в митохондриях. Этот подход в настоящее время является основным и привел к определенным достижениям при исследовании регуляции транспорта анионов в митохондриях бурого жира и регуляции транспорта адениннуклеотидов в митохондриях из большинства тканей / 10,13,15 /, но очевидна ограниченность этого подхода. Дело в том, что при использовании только этого подхода, заведомо исключается возможность выявления в цитозоле неидентифициро-ванных специализированных регуляторов функционального состояния митохондрий. Напротив, что же позволяет постулировать возможность существование таких регуляторов? В конце пятидесятых годов стало очевидным, что митохондрии являются чрезвычайно перспективным объектом исследования для специалистов в области биохимии, физиологии и биофизики клетки. Относительная простота экспериментов с изолированными митохондриями, казалось, открывает возможность быстрого выяснения регулятор-ных механизмов, контролирующих энергетические процессы в клетке. Более того, долгое время сохранялась иллюзия, что именно этот подход даст ключ к решению проблемы механизма действия таких гормонов как тироксин, ПТГ и т.д. /116, 192 /. К сожалению оказалось, что эксперименты с изолированными митохондриями дают обширную информацию о мембранной организации самих митохондрий, о транспортных механизмах в мембране митохондрий, но эта информация становится ограниченной и противоречивой, когда результаты экспериментов с митохондриями in vitro интерпретируются на\ уровне целой клетки. При выяснении вопросов о том, каким образом изменяется функция митохондрий при изменении физиологического оостояния клетки,какие эффекторы изменяют активность митохондрий, за редким исключением четкого ответа на них эксперименты с изолированными митохондриями не дают. И если до сих пор; часто приходится ставить вопрос примерно таким образом: "Соотношение физиологической и мито-хондриальной регуляции" / 38 /, то это свидетельствует о том, что существует некоторый разрыв между современной физиологией клетки и митохондриологией. В чем же причина этого разрыва ? Прежде всего в том, что исследователи, работающие на клеточном уровне, и митохондриологи имеют дело с объектами, которые по сложности мембранной организации качественно находятся на одном уровне. Имеется в виду то, что, работая о целой клеткой, исследователь фактически имеет дело с мембранными процессами в плазматической мембране, а внутренняя митохондриальная мембрана по своей организации, набору переносчиков и т.д. совсем ив проще мембраны бактерии. Сложность транспортных процессов в митохондриях и является одной из причин, которая заставляет часть митохондриологов абстрагироваться от физиологии клетки. В самом деле, по-видимому, еще достаточно долгое время можно будет заниматься идентификацией транспортных механизмов в митохондриях, выделенных из различных объектов. Вместе с тем эксперименты с изолированными митохондриями по сравнению с экспериментами на клеточном уровне в физиологическом отношении выхолощены. В какой-то степени это обусловлено переходом с клеточного на субклеточный уровень. Известно, что сами среды выращивания клеточных культур в большинстве своем содержат плазму, и поэтому исследование действия гормонов и других физиологически-активных компонентов плазмы с самого начала составляют основу работ на клеточном уровне. По аналогии среды инкубации митоховдрий должны включать в себя компоненты ци-тозоля и именно в цитозоле могут находится регуляторы функционального состояния митохондрий. Тем не менее, как известно, эксперименты с добавлением к митохондриям цитоплазмы не являются достаточно разработанным экспериментальным подходом. Общепринятые методы выделения, хранения и инкубации митохондрий имеют целью получение как можно более чистого препарата митохондрий, хотя очевидно, что при этом происходит отмывание от цитоплазматических регуляторов функции митохондрий. Этим, по-видимому, и объясняется то, что в целом ряде случаев различия в функциональных характеристиках препаратов митохондрий, выделенных из животных с различным физиологическим статусом, не коррелируют с результатами, полученными обычными методами на клеточном уровне. Но даже в тех случаях, когда изменения в функциональном состоянии митохондрий достаточно стабильны и

- II сохраняются в процессе выделения и очистки, эксперименты с чистой суспензией митохондрий не могут дать ответа на вопрос о клеточных механизмах, ответственных за эти изменения.

Основной целью представленной работы явилась попытка разработки модельной системы, позволяющей изучение in vitro гормональной регуляции энергетических реакций митохондрий, опосредованной цитоплазматическими регуляторами митохондриаль-ных процессов. Так как гипотетические неидентифицированные регуляторы митохондриальных процессов должны находиться в цитоплазме, то была использована модельная система, включающая в себя помимо митохондрий цитоплазму, и наши исследования в основном свелись к выяснению влияния гормонального статуса организма на регуляцию функционального состояния митохондрий компонентами цитозоля.

Как уже говорилось выше, митохондрии являются чрезвычайно сложными полифункциональными органеллами. В связи с этим нам предстояло решить вопрос о том, какие параметры функционального состояния митохондрий представляют наибольший интерес с точки зрения гормональной регуляции метаболизма клетки? Так как в основном наши исследования проводились с митохондриями печени, то регуляция функции митохондрий интересовала нас в связи с гормональной регуляцией глюконеогенеза в гепатоцитах.

Современные представления о регуляции глюконеогенеза в гепатоцитах гормонами сводятся к тому, что регуляция осуществляется с одной стороны глюкагоном, катехоламинами и глюкокортикои-дами, которые стимулируют глюконеогенез, и с другой стороны, инсулином, который ингибирует глюконеогенез / 39-41 /. Считается, что лимитирующей стадией глюконеогенеза, регулируемой всеми перечисленными гормонами, является превращение пирувата в фосфоэнолпируват, которое осуществляется двумя ферментами, пируваткарбоксилазой и ФЭП-карбоксикиназой / 39-41 /. Пируват-карбоксилаза локализована в митохондриях, а внутриклеточная локализация ФЭП-карбоксикиназы в гепатоцитах видоспецифична / 40 /. Как правило, гормоны, стимулирующие глюконеогенез, параллельно увеличивают интенсивность карбоксилирования пирувата в митохондриях и активность ФЭП-карбоксикиназы / 32,33,41-44 /. Показано, что увеличение интенсивности карбоксилирования пирувата в митохондриях печени в условиях стимуляции глюконеогене-за является следствием не увеличения активности пируваткарбок-силазы, а стимуляции транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии печени, так как карбоксилирование пирувата лимитируется транспортом пирувата из цитозоля в митохондрии гепатоцитов / 14,32 /. В связи с этим возникло представление о том, что одним из механизмов стимуляции глюконеогенеза в гепатоцитах гормонами является стимуляция транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии / 14,32 /.

Основываясь на вышеизложенном, основное внимание в наших исследованиях было уделено гормональной регуляции транспорта и метаболизма пирувата в митохондриях печени цитоплазматически-ми регуляторами. Помимо исследования участия цитоплазматичес-ких регуляторов в гормональной регуляции транспорта метаболитов из цитозоля в митохондрии нами было проведено и аналогичное исследование регуляции транспорта ионов кальция в митохондриях печени. Поводом к этому исследованию послужило представление о том, что действие ряда гормонов на глюконеогенез опосредовано изменением концентрации ионизированного кальция в цитоплазме, причем цри действии гормонов изменяется распределение ионов кальция между митохондриями и цитоплазмой / 1,45-48 /•

- 13

По целому ряду причин в первую очередь нас интересовал вопрос о влиянии инсулина на регуляторные взаимоотношения цитоплазмы и митохондрий. Во-первых, потому, что вопрос о действии инсулина на метаболизм митохондрий в литературе почти не освещен, хотя в последние годы появился целый ряд работ о регуляции функционального состояния в митохондриях печени глюка-го ном и катехоламинами / 32,33,49-60 /. Объясняется это тем, что для глюкагона и катехоламинов (J> -адренергическая регуляция) известен второй посредник - ц-3 £ АМЗ>, и проблема во многом сводится к вопросу о том, каким образом ц- ä Ö Ш изменяет функциональное состояние митохондрий in vir» . Для инсулина посредники его действия на метаболические процессы в гепатоцитах не известны / 39 / и это, конечно же, затрудняет выяснение вопроса о клеточном механизме, опосредующем действие инсулина на митохондрии печени.

Во-вторых, как раз в отношении действия инсулина на транспорт пирувата и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени общецринятые подходы изучения гормональной регуляции функции митохондрий оказались неэффективными. Оказалось, что при выделении митохондрий из печени крыс, которым вводили инсулин, не удается обнаружить функциональные изменения, противоположные тем, которые в аналогичных условиях имеют место при введении глюкагона и катехоламинов / 33,56 /. Те же функциональные изменения, которые сохраняются в процессе выделения митохондрий, обусловлены не действием инсулина на гепатоциты, а эффектами контргормонов инсулина (глюкагона и катехоламинов), секретируемых в плазму в условиях инсулиновой гипогликемии. На наш взгляд эти негативные результаты объясняются отмыванием митохондрий от инсуяинзависимых цитоплазматических регуляторов в процессе их выделения.

Поэтому следующей задачей нашего исследования явилась проверка предположения о наличии в цитоплазме инсулинзависимого регулятора функции митохондрий с использованием модельной системы, содержащей помимо митохондрий цитоплазму. В дальнейшем, когда инсулинзависимый цитоплазматический регулятор (ИЗР) был нами обнаружен, выделен и идентифицирован как гликолипо-пептид, встал вопрос о том, не является ля ИЗР посредником действия инсулина на метаболические процессы в таких органах-мишенях инсулина как печень, сердце, диафрагма. Для выяснения этого вопроса была исследована возможность проявления инсулин-подобного действия ИЗР на клеточном уровне и in vivo Обнаружение целого ряда инсулинподобных эффектов ИЗР и наличие корреляции между концентрацией инсулина в плазме и активностью ИЗР в печени, сердце и диафрагме крыс позволило нам сделать вывод о том, что, по крайней мере частично, действие инсулина на метаболические процессы в этих органах опосредовано увеличением активности ИЗР.

Исходя из представления о том, что ИЗР является посредником действия инсулина на метаболизм, нами была сделана попытка выяснить роль ИЗР во взаимоотношениях инсулина и гормонов-антагонистов инсулина, таких как глюкокортикоиды и адреналин. При этом нами рассматривались взаимоотношения ИЗР и таких посредников действия гормонов на метаболизм как ц-ё £> АМФ и ионы кальция.

Участие ИЗР в регуляции метаболических процессов рассматривалось не только при введении крысам инсулина, глюкокорти-коидов и адреналина, но и при голодании, тиреоидэктомии, мышечной нагрузке и действии стресса.

Хорошо известно,что необратимость повреждения клетки при патологии в ряде случаев обусловлена повреждением митохондрий / 36 /.

В связи с этим большое значение имеет выяснение клеточных механизмов, обуславливающих повреждение митохондрий, стабилизацию митохондрий к повреждающим воздействиям и обратимость повреждения митохондрий. Одним из экспериментальных подходов к решению этой проблемы является проведение модельных экспериментов с суспензией митохондрий in vitro в которых исследуется влияние на митохондрии клеточных факторов, которые повреждают митохондрии при патоо логии (ионы Ca , СЖК, длинноцепочечные ацил КоА, перекиси липи-дов, лизофосфолипиды, литические ферменты и т.д.) и цитоплазмати-ческих регуляторов, стабилизирующих митохондрии к повреждающим воздействиям.

По современным представлениям особенно важную роль в повреждении митохондрий печени in vivo играют ионы кальция / 57 /. Поэтому, в представленной работе были рассмотрены взаимоотношения иоо нов Ca и ИТ при повреждении митохондрий печени in vivo и in vitro обратимость повреждения митохондрий ионами Са^+ и взаимодействие интактных и поврежденных митохондрий при усилении гетерогенности популяции митохондрий при патологии.

Основные положения, которые выносятся на защиту: I. Гормональная регуляция транспорта ионов кальция и метаболитов через мембрану митохондрий печени и сердца крыс опосредовано изменением активности термостабильных гликопептидов цитозоля (Инсулинзависимый цитоплазматический регулятор, который увеличивает кальциевую емкость и ингибирует транспорт метаболитов в митохондриях печени и сердца крыс, и гликопептид-ингибитор электрогенного транспорта ионов кальция в митохондриях сердца крысы.

2. ИЗР является одним из посредников действия инсулина на метаболизм, гак как активность ИЗР в органах-мишенях инсулина коррелирует с концентрацией инсулина в плазме, а очищенные препараты ИЗР обладают инсулинподобным действием в экспериментах с митоховдриями на клеточном уровне и in vivo.

3. Ингибирование глюконеогенеза при добавлении ИЗР происходит вследствие ингибирования транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии.

При стрессе и введении глюкокортикоидов транспорт пирувата и ионов кальция в митохондриях печени крыс регулируется изменением чувствительности митохондрий к действию ИЗР.

- 17

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гайнутдинов, Марат Хамитович

выво ш

1. Показано,что в цитоплазме печени,сердца,диафрагмы и скелетных мышц функциональное состояние митохондрий регулируется ин-сулинзависимым термостабильным гликолипопептидом с молекулярным весом около 6000 дальтон.

2. Показано корреляция между активностью ИЗР в печени и концентрацией инсулина в плазме в широком диапазоне изменений физиологического состояния крыс (при голодании,введении глюкозы,инсулина,адреналина,гидрокортизона,прогестерона,при беременности, мышечной деятельности,тиреоидэктомии и т.д.,).

3. Показано,что пептидная компонента ИЗР состоит из Ю аминокислот в состав углеводной компоненты ИЗР входят глюкоза,рамноза,ман-ноза и галактоза. В процессе очистки ИЗР происходит сильной уве личение общей активности,обусловленное переходом неактивной фо{ мы ИЗР в активную.

4. ИЗР снижает проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени для одновалентных катионов и увеличивает кальциевую емкость митохондрий печени крыс.

5. При добавлении ИЗР снижается проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени для пирувата,сукцината, оС- кетоглютарата, цитрата,глютамата,аспартата,хотя ИЗР не оказывает влияния на транспорт N0^ , С1~ и стимулирует транспорт фосфата. Снижение активности переносчиков монокарбоновых кислот,дикарбоновых кислот, оС-кетоглютарата,глютамата и глютамат/аспартат антипор тз кг при добавлении ИЗР нельзя объяснить прямым взаимодействие?/ ИЗР с переносчиками метаболитов, так как эти эффекты проявляются при концентрации ИЗР порядка 10"^

6. Очищенные препараты ИЗР ингибируют глюконеогенез в кусочках печени и коркового слоя почки крысы in vitro . Этот эффект может быть объяснен ингибированием транспорта субстратов глюконеогенеза из цитозоля в митохондрии. ИЗР стимулирует синтез белка и синтез гликогена в изолированной диафрагме крысы, ингибирует гликогенолиз в кусочках печени крысы и оказывает сильное гипогликемическое действие при введении крысам с аллоксановым диабетом. Наличие корреляции между концентрацией инсулина в плазме и активностью ИЗР в цитоплазме органов-мишеней инсулина и инсулинподобное действие.ИЗР in vivo , на клеточном уровне и на уровне митохондрий позволяют сделать вывод о том, что ИЗР является одним из внутриклеточных пос-. редников действия инсулина на метаболизм.

7. Показано, что в печени ц з'5*АМФ и ц з'5*ГМФ.не оказывают прямого влияния на активность ИЗР в то время, как увеличение концентрации ионизированного кальция в цитоплазме приводит к снижению активности ИЗР.-Предполагается, что инсулин может увеличивать активность ИЗР, снижая концентрацию ионизированного кальция в цитоплазме печени. Снижение активности ИЗР в печени при введении адреналина обусловлено увеличением концентрации ионизированного кальция в цитоплазме гепатоцитов, которое имеет место при взаимодействии катехоламинов с Х-ад-ренорецепторами.

8. Гормональная регуляция метаболизма пирувата в митохондриях печени может осуществляться как в результате изменения активности ИЗ? в цитоплазме,так и в результате изменения чувствительности митохондрий печени к действию ИЗР. Показано,что при введении гидрокортизона и при стрессе имеет место снижение чувствительности митохондрий к действию ИЗ1 на транспорт пирувата и ионов кальция через внутреннюю мембрану. Получение результаты указывают на то, что одним из механизмов ин-сулинрезистентности является снижение чувствительности метаболических процессов к действию ИЗР.

Снижение чувствительности транспорта пирувата к ингибиру-ющзму действию ИЗР при введении глюкокортикоидов,которая при водит к стимуляции транспорта пирувата из цитозоля в митохон дрии,является одним из механизмов активации глюконеогенеза глгококортикоцдами. Введение крысам гидрокортизона приводит к увеличению активности Са2+/2Н+ антипортера в митохондриях печени , следствием которого может быть увеличение концентрации ионизированного кальция в цитоплазме.

9. При стрессе в фазе тревоги действие ИЗР на митохондрии печен! ослабляется не только в результате снижения чувствительности митохондрий печени к ИЗР, но и в результате снижения активности ИЗР, причиной которого является ингибирование секреции инсулина адреналином.

10. В сердце функциональное состояние митохондрий помимо ИЗ* регулируется термостабильным щелочным гликопептидом, который является ингибитором электрогенного транспорта ионов кальция из цитозоля в митохондрии. Активность этого ингибитора может регулировать поступление ионов кальция из миоплазмы в митохондрии при сокращении миокарда, когда концентрация ионизированного кальция в миоплазме увеличена.

11. Активность ИЗР сильно снижена при ишемии печени, по-видимому, в результате.увеличения концентрации ионизированного кальция в цитоплазме. Ослабление стабилизирующего действия ИЗР на митохондрии может быть одним из факторов, определяющих повреждение митохондрий при патологии печени.

12. Повреждение митохондрий печени ионами Са^+ in vitro приводи1; к выходу из них в среду инкубации низкомолекулярного фактора пептидной природы, который при.кислых рН оказывает стабилизирующее действие на митохондрии. Предполагается, что одним из механизмов стабилизации популяции митохондрий к повреждающим воздействиям является действие этого фактора на относительно интактные митохондрии.

8. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на самцах белых крыс весом 150-200 Условия содержания и кормления животных соответствовали нормативным (358). В помещении вивария поддерживалась температура 18-22°С влажность воздуха не более 65$, естественный световой режим солнечного освещения.

Выделение митохондрий. Митохондрии выделяли по методу Шнейдера (357). Животное декапитировали, вырезали печень и помещали ее в стакан со льдом. Печень продавливали через пресс с отверстиями ди аметром 2мм и гомогенизировали в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Соотношение веса печени в граммах к количеству добавленной среды выделения в мл равнялось одной шестой. Среда выделения содержала следующие компоненты: сахарозу 0,ЗМ, трис-HCI ТОмМ, рН - 7,5. Гомогенат центрифугировали в рефрижираторной центрифуге при 800g в течении 7 минут. Надосадочную жидкость вторично центрифугировали в рефрижираторной центрифуге при 6000g в течении 15 минут при температуре 0° - +2°С. Осадок суспендировали в среде выделения в соотношении 10 : I (вес печени в граммах к количеству среды в мл). Всю процедуру выделения, хранения митохондрий проводили в холодной комнате при температуре 0° - +2°С.

При измерении окислительного фосфорилирования в суспензии митохондрий печени и при вцделении митохондрии сердца крысы в срезу выделения штохощфий добавляли I мМ ЭДТА. Выделение цитоплазмы и определение активности ИЗР. Использовали два варианта методики получения цитоплазмы из печени крысы. Крыс обезглавливали с минимальным стрессорным воздействием на них (без 1рименения корсанга). Извлеченную печень помещали, в стаканчик со тьдом, взвешивали, продавливали через пресс из нержавеющей стали з отверстиями диаметром 2 мм и гомогенизировали в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Гомогенат готовили в соотношении один к одному (вес печени и объем среды выделения) в 0,3 М Сахарозе, 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4. Б первом варианте методики гомогенат цент рифугировали при 100000 & в течение 30 минут и в надосадочной жидкости определяли активность цитоплазмы по ее действию на транспорт кальция в митохондриях. Так как цитоплазматический фактор, активирующий транспорт кальция в митохондриях,оказался термостабильным, то во втором варианте методики выделения цитоплазмы нашей целью являлось получение термостабильной фракции цитоплазмы, обладающей активностью ИЗР. Б этом варианте гомогенат центрифугировали при 30000 ё в течение 20 минут. Супернатант нагревали при 97°С в течение 7 минут. Денатурированные белки и мембранные фрагменты осаждали центрифугированием при 30000 & . Прозрачный супернатант, содержащий активность ИЗР, хранили в замороженном состоянии.

Бее операции производились в холодной комнате и в рефрижира-торных центрифугах при температуре +2°- +4°С. Тот же метод исполь зовался и при получении термо стабильной фракции цитоплазмы сердца диафрагмы и других органов. Определение активности ИЗР в термостабильной фракции цитоплазмы производили по ее действию на активный транспорт ионов кальция в митохондриях печени крысы. Транспорт кальция измеряли рН-метрическим методом, как описано вше. Термостабильную фракцию цитоплазмы перед определением активности размораживали и преинкубировали с митохондриями 60 секунд при 24°С перед добавлением ионов кальция. Если термостабильная фракция цитоплазмы использовалась в дальнейшем для получения высоко-очищенных препаратов ИЗР, то крысам за 20 минут до обезглавливания вводили инсулин (0,1 Щ / 100г веса) для того, чтобы увеличить активность ИЗР в цитоплазме. При определении действия гормонов на активность ИЗР выделение цитоплазмы из контрольных и опытных животных проводилось одновременно. Измерялась концентрационная зависимость действия термостабильной фракции цитоплазмы контрольных и опытных крыс на транспорт ионов кальция в митохондриях печени, выделенных в среде без ЭДТА.

В экспериментах, в которых исследовалось влияние относительно высоких концентраций термостабильной фракции цитоплазмы на тра спортные процессы в митохондриях и окислительное фосфорилирование в среде выделения цитоплазмы сахарозу заменяли на 0,12 М KCl. В этих экспериментах контролем к действию цитоплазмы на митохондрии служили эксперименты с добавлением 0,I2M KCl к суспензии митохондрии.

Измерение кинетики активного транспорта ионов кальция в митохондриях печени крыс.

Одним из наиболее простых и надежных методов измерения кинетики транспорта ионов кальция в митохондриях является рН-метричес-кий метод (359)»основанный на измерении кинетики Са^/И^обмена в суспензии митохондрий. Известно,что в зависимости от условий митохондрий может изменяться стехиометрия обмена ионов Ca на ионы Н4". Поэтому при использовании рН-метрического метода необходимо строгое соблюдение стандартной среды инкубации митохондрий. Так как в присутствии фосфата в качестве проникающего аниона стехиометрия Са^+/Н+ обмена постоянна и отношение Са^+/Н+ приблизительно 1,0, то во всех наших экспериментах использовалась среда инку бации содержащая помимо О,IM KCI,2wM Трис, 5мМ сукцината как суб страт окисления,ротенон для предотвращения накопления ЩУК, и 0,7 - 1,0мМ фосфата как проникающий анион. рН-среды инкубации варьировала между 7,1 - 7,5 в зависимости от целей эксперимента. На. рис-91 показано,что в отсутствии сукцината,когда окисление эндо

РИС-91. рН МЕТРИЧЕСКИЙ ГЛЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ КИНЕТИКИ ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ.

Среда-инкубации: 0,1 М КС1, Л, М~Фосфата, 2*Ю~3М Трис, рН 7,3, ротенон -0,7 мкг/мп, митохондрии - 1,5 мг белка/мл.

I, 1а, 2 - в среду инкубации добавляли 5 мМ сукцината,

3 - среда без сукцината.

Добавки: СаС19 - 4.104М, 2,4-ДНФ - 10"%, КСН - I мМ. енных НАД субстратов заблокировано ротеноном, добавление СаС10

- л- к с суспензия митохондрий вызывает незначительное закисление среды ткубации. В присутствии сукцината добавление СаС12 приводит к 5ыстрому выходу ионов Н+, обусловленному Са^/Н* обменом, который ¡аканчявается, когда большая часть добавленного кальция аккумуля-ювана митохондриями ^рис.91). Деэнергизация митохондрий добавле-шем КСы или 2,4 ДНФ вызывает выход кальция из митохондрий и, юответственно, защелачивание среды инкубации. рН метрический метод позволяет оценить устойчивость митохон-1рий печени к повреждающему действию ионов кальция. При последовательном добавлении нескольких добавок СаС]^ поглощение ионов }а2+ в обмен на ионы Н* сменяется самопроизвольным выходом всего ранее накопленного кальция из митохондрий (рис.91). Самопроизволь зый выход кальция обусловлен повреждением митохондриальных мембран в связи с активацией эндогенной фосфолипазы А2> разобщением экислительного фосфорилирования и набуханием митохондрий. Следовательно, способность митохондрий к аккумуляции больших количеств ионов кальция без самопроизвольного выброса кальция из митохондрий может быть критерием устойчивости мембранных структур мито- ховдрий к повреждающему действию ионов кальция. Эксперименты проводились в открытой ячейке, и поэтому одним из основных требований к экспериментам по определению "кальциевой ёмкости" митохондрий являлось интенсивное перемешивание суспензии митохондрии электромагнитной мешалкой, так как усиленное потребление кислорода при аккумуляции кальция может приводить к гипоксии и, как следствие, к активации самопроизвольного выброса кальция из митохондрий. Измерение концентрации ионов водорода в суспензии митохондрий производили с помощ>ю рН-метра рН-340. В качестве регистрирующего потенциометра использовали блок полярографа 0Н-102.

Помимо рН метрического метода для измерения кинетики трансюрта ионов кальция» использовались ионселективнне кальцийчувзтвительные электроды.

Измерение проницаемости мембраны митохондрий для анионов по кинетике набухания деэнергизованных митохондрий в изоосмоти-ческих растворах аммонийных солей.

Одним из методов оценки проницаемости митохондриальной мембраны *ля анионов является измерение кинетики набухания митохондрий в !зоосмотических растворах солей этих анионов в условиях деэнерги-»ации митохондрий (17). Мембрана митохондрий хорошо проницаема 1ля 1Ш3. Часто накопление ионаян^+в матриксе митохондрий лимити »уется низкой проницаемостью мембраны митохондрий для ионов Н4* и 1Н7 так как в результате реакции кН3кн^"*"происходит защела-[ивание матрикса митохондрии (214-215). Поэтому в экспериментах по измерению проницаемости для анионов мы добавляли Ю2|М 2,4 ДНФ для того,чтобы индуцировать высокую проницаемость для ионов + и этим самым предотвратить защелачивание матрикса во время ин-убации митохондрий в изоосмотических растворах аммонийных солей, присутствии 2,4 ДНФ скорость накопления ионов в матриксе итоховдрий очень высока и скорость набухания митоховдрий опреде-яется проницаемостью мембраны для аниона,так как в этих условиях корость накопления в матриксе митохондрий анионов лимитирует про-эсс набухания митохондрий (17). При измерении проницаемости мембраны для дикарбоновых кислот в среду инкубации вводили фосфат, ак как в обычных условиях накопление дикарбоновых кислот в мито-ондриях определяется синхронным функционированием двух переносчи ов: переносчика дикарбоновых кислот и переносчика фосфата (17). ак показано на рис-1 фосфат транспортируется в митохондрии в об-эн на ионы 0Н~ переносчиком фосфата и из митохондрий в обмен на якарбоновую кислоту переносчиком дикарбоксилатов. Так как ско-эсть транспорта фосфата в митохондрии вызока, то скорость набухания лимитируется обменом дикарбоксилат / фосфат.

Набухание суспензии митохондрий измеряли по изменению оптической плотности при 540 нм на фотометре ЛМФ - 69. Рис. 92 показывает, что в условиях нашего эксперимента четко проявляется корреляция между проницаемостью для аниона и скоростью набухания. Самая низкая скорость набухания в растворе N так как для С1~ мембрана митохондрий печени очень плохо проницаема. Самая высокая скорость набухания митохондрий наблюдается в растворе фосфата аммония. При измерении скорости транспорта пируъата помимо описанного выше метода использовался рН-метрический метод, описанный Хале страпом (14).

Измерение проницаемости внутренней-мембраны митохондрий для ионов кальция и одновалентных катионов.

В работе использовались методы,разработанные Брайерли и др.(214) в: которых для оценки проницаемости внутренней мембраны митохондрий для катионов использовалось измерение кинетики набухания деэнергизованных митохондрий в изоосмотических растворах исследу емых катионов и проникающих анионов. Как показано на схеме, представленной на рис 4 , транспорт катионов в митохондрии осуществляется либо как электрогенный процесс, либо как электронейтральный обмен на ионы Н+. Набухание митохондрий в изоосмотических растворах нитратных солей Са2+, иег+ , К+ и ка+в слабо щелочных растворах лимитируется проницаемостью для катионов. Поэтому кинетика набухания деэнергизованных митохондрий в этих растворах определяется проницаемостью мембраны для катиона (214). Если в среде инкубации нет разобщителя, то практически измеряется элек трогенный транспорт катиона (214), так как мембрана митохондрий плохо проницаема для ионов К4",а при функционировании электроней дСП-540нм

0,6 0.5

0.4

0.3 0.2 М I

30 60 90 120 150сек

Рис-92. НАБУХАНИЕ ДЕЭНЕРГИЗОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ

В И300СМ0ТИЧЕСКЙХ РАСТВОРАХ АММОНИЙНЫХ СОЛЕЙ СУКЦИНАТА, ФОСФАТА И ХЛОРА.

Среда инкубации митохондрий печени крысы-(0,6мг белка/ мл) I - 120в/М Н4С1, 5мМ Трис - буфера, рН-7,4.Роте-нон-0,7 мкг/мл, 2,4 ДНФ - 10"%.

2 - 80мМ сукцината аммония, Антимицин А - 0,6 мкг/мл, Фосфат - 2Ш, Трис - буфер-ТГМ, рН-7,4, 2,4 ДНФ -10"%. -.

3 - 80мМ фосфата, аммония, Трис-буфер ЮмМ, рН-7,4. Ро-тенон - 0,7мкг/мл 2,4 ДНФ - 10"%. трального обмена катиона на ионы Н+ возникает необходимость в рециклизации ионов Н* (рис 24) В присутствии 2,4 ДНФ измеряется суммарная активность электрогенного транспорта и обмена катионов на ионы Н4". В тех случаях, когда активность электрогенного транспорта катиона низка (Например,для ионов калия), набухание в изо-осмотическом растворе нитрата в присутствии 2,4 ДНФ практически полностью связано с функционированием катион/Н4" антипортера в мембране митохондрий.

Для определения активности электрогенного транспорта одновалентных катионов в митохондрии печени и сердца наш использовался метод описанный Брайерли и др.(360), в котором активность электрогенного переносчика калия или натрия оценивается по кинетике набухания энергизованных митохондрий в среде,содержащей ацетат в качестве проникающего аниона. Как показано на рис 24 в присутствии ацетата набухание митохондрий лимитируется низкой скоростью электрогенного транспорта катиона в митохондрии.

Измерение потенциала на мембране митохондрий.

Потенциал на мембране митохондрий измеряли по методу предложенному Митчеллом и Мойл (361). В присутствии антибиотика вали-номицина мембрана митохондрий становится хорошо проницаемой для ионов. В этих условиях ионы калия распределяются между внутренним пространством митохондрий и инкубационной средой согласно потенциалу на мембране митохондрий (361). Зная концентрацию ионов калия по обе стороны митохондриальной мембраны можно рассчитать величину потенциала на мембране. Определение концентрации ионов калия в среде инкубации производилось с помощью селективного калий-чувствительного электрода. При разрушении митохондри альной мембраны детергентом Х-ЮО происходит выравнивание концентрации ионов калия по обе стороны мембраны. Зная объем внутримитохондриалъного пространства и концентрацию ионов калия в среде инкубации по количеству ионов калия, вышедших в среду инкубации из митохондрий в ответ на добавление детергента, легко рассчитать концентрацию ионов калия во внутримитохондриальном пространстве до добавления детергента. Расчет потенциала проводили по формуле Нернста где и - газовая постоянная

Т - абсолютная температура Я - число Фарадея.

При расчете Д ^ Митчелл принимал содержание свободной воды во внутреннем сахаронедоступном пространстве митохондрий, равным 0,4г/г митохондриального бежа.

Полярографический метод-измерения скорости дыхания

Скорость окисления субстратов митохондриями измеряли полярографическим методом с вращаюцимся платиновым электродом. На полярографе ОН - 102 рН-метрический метод измерения кинетики АТФ-азы митохондрий печени.

Впервые рН-метрический метод для исследования реакций синтеза и гиролиза АТФ в суспензии митохондрий in vitro был описан Нишимура и соавт.(362). В настоящее время этот метод применяется для исследования окислительного фосфорилирования кинетики активного транспорта ионов Са^+, Н4" для изучения АТФ-азной реакции в митохондриях многими отечественными и зарубежными исследователями. Для измерения концентрации ионов водорода в суспензии мимитохондрий. тоховдрий, мы использовали рН-метр 340, соединений с записывающим потенциометром 0Н-102. Для быстрого размешивания веществ, добавляемых в ячейку, использовали магнитную мешалку. Все добавляемые в процессе опыта вещества очень строго доводились до рН инкубационной среды. Среда инкубации митохондрий: 0,1М сахароза, 061 М КС1, 0,002 М Трис-буфер (рН-7,4), АТФ-1мМ, М6сь2-1тМ 2,4 ЛИФ-Ю"^.

Гельфильтрация ИЗР Гельфильтрацию предварительно концентрированной термостабиль ной фракции цитоплазмы проводили на хроматографической колонке (25Х400мм), в которой в качестве разделяющего геля нами был использован сефадекс в - 2 5(1Ып) . Подготовку геля и наполнение колонки проводили по Детерману (363). Колонку уравновешивали и элюировали 0,1М КС1, избыток которого удаляли перед нанесением цитоплазмы на старт геля. После нанесения цитоплазмы на впитанную стартовую поверхность геля доливали уравновешивающий буфер и плотно закрыв адаптором колонку,гидростатическим давлением устанавливали скорость элюирования материала (40мл/час). Выходящий элюат собирали фракциями по 4мл,каадую пробу спектрофотометриро-вали при длине волны 280нм и определяли активность,как описано выше.

Методика подготовки и нанесения образца на колонку с ионообменником ДЭАЭ-целлюлозой.

Следующей стадией очистки ИЗР после гель-фильтрации на сефа-дексе в -25 явилась хроматография на ДЭАЭ целлюлозе. Фракции, содержащие активность ИЗР (40-50мл) добавляли в 5 кратном объеме бидистиллята для снижения концентрации КС1 в наносимом объеме. Подготовку и обработку ДЭАЭ целлюлозы проводили по общепринятой методике (364). Насыпной порошок ДЭАЭ-целлюлозы (Реанал)

- 297 - . . . в течении суток замачивали в бидистилляте, многократной декантацией; отделялись от мелких неосевших частиц ионообменника. Далее в течении 40 минут смолу суспендировали 0»5 Н НС1, промывали до нейтрального значения рН, смолу вновь суспендировали 0,5 Н етаОН в течении 40 минут. Отмытую до нейтрального значения рН смолу использовали для хроматографии. Для ионообменной хроматографии применяли колонку размерами (15 х 250 мм). Колонку в течении нескольких часов уравновешивали буфером (2мМ Трис, рН 9,2). Устанавливали гидростатическим давлением нужную скорость на выходе и в течении 10 часов наносили разбавленный материал на колонку. Сорбированный активный материал смывали градиентно-ступенчатым способом (в качестве элюента использовали раствор Трис-НИ, рН 6,5). Плохо сорбируемые компоненты смывали, увеличивал концентрацию КС1 в буфере от 0 до 0,15 М. Последующий этап смывания проводили при градиентном увеличении концентрации КС1 с 0,15 до 0,4 М. Каждую фракцию спектрофотометрировали в диапазонах длин волн 260 нм и 230 нм, и определяли в ней активность ИЗР.

Рехроматография активного материала на колонкешс

ДЭАЭ - целлюлозой.

Рехроматографшо активного материала (100-120мл) на ДЭАЭ-цел-лкшозе проводили в идентичных условиях, за исключением того, что наносимый объем разбавляли бидистиллятом в 10 раз. Скорость нанесения составляла 150 мл/час. Вместо маточного раствора в качестве элюирукзцего раствора использовали бидистиллированную воду, для исключения возможности попадания молекул Триса в очищенный объем активного материала. Смытые активные фракции (100 мл) после рехроматографии концентрировали на роторном испарителе до минимального объема, этим же способом мы также частично избавлялись от избытка КС1.

Обессоливание ИЗР Обессоливание очищенного ИЗР проводили после рехроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе диализным методом или гельфильтращей . На колонке (15x300мм) с сефадексом G-I0 обессоливали 1мл концентрированного препарата ИЗР, содержащего 2-4мг бежа. Колонку элюировали бидистиллированной водой со скоростью 5мл/час. Каждую фракцию спектрофотометрировали на спектрофотометре при ллине вол ны 230нм и определяли в ней активность ИЗР. Обессоленные активные фракции,концентрировали на роторном испарителе до минимального объема и леофильно сушили. Обессоленный препарат хранили в плотно закрытой бюксе при температуре +2 +5С. В ряде случаев ИЗР диализовали в целлофановом мешочке против большого объема бидистиллированной воды при температуре +5°С. Трехкратную смену бидис тиллята проводили в течении 96 часов. При этом диализуемая мономерная форма ИЗР отделялась от аггрегированной формы ИЗР,которая оставалась в диализном мешке.

Определение аминокислотного состава.

Кислотный гидролиз ИЗР проводили по методике (365). 2 мг обес соленного материала растворяли в 2 мл трижды перегнанном 6N HCl. Содержимое ампулы замораживали в жидком азоте, создавая вакуум ОД см ртутного столба, и запаивали. Ампулу термостатировали при температуре ЮБ^С в течении 24часов. После окончания гидролиза содержимое ампулы переносили в бшс и сушили в эксикаторе над КОН в вакууме. Аминокислотный анализ гидролизата ИЗР проводили на аминокислотном анализаторе Фирмы ькв . Для каждого ана лиза использовали 200мкг исследуюмого вещества.

Определение содержания утлеводов в ИЗР Содержание утлеводов в ИЗР измеряли по Дюбуа (235).Углеводы определяли в препарате ИЗР, предварительно гидролизованном в ЧN HCl при температуре IIO^C в течение Ч часов

Диск-электрофорез Электрофоретическую подвижность ИЗР исследовали вертикальным диск-электрофорезом в 7% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия СДДС) и 8 М мочевины. Раствор готовили по методике предложенной Маурером (367) и Филштовичем (365). Образцы готовили непосредственно перед электрофорезом. В обессоленный препарат ИЗР (0,5мг) добавляли 0,5 мл диссоциирующего раствора (0,1$ раствор ДДС в трисглициновом буфере, рН-8,б). Содержимое пробирки тщательно перемешивали,термостатировали при 5(Рс в течение I часа и, добавив 0,02 мл меркаптоэтанола, тер-мостатировали еще I час. После 2хминутного нагревания при температуре 90^С образцы по 0,2 мл вносили в гель.

В экспериментах с ДДС или мочевиной смесь (0,5мг ИЗР в 0,5мл диссоциирующего раствора) перемешивали и термостатировали в течение Ч часов при бО^С, в присутствии мочевины или ДДС. После преинкубации смесь в течение 2хминут выдерживали в кипящей водяной бане и по 0,2 мл вносили в гель. Маркером служил бромфе-нол-синий. Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 3 часов. Первые тридцать минут на каждую трубку подавали ток 2мА, а в последующем по 5мА. Электрофорез прекращали,когда контрольная краска мигрировала на расстояние 0,5см от конца геля. Гели окрашивали реактивом Шиффа (367) и толуидиновым синим (364). Колибровочную кривую на сахар строили с использованием стандартного раствора глюкозы,содержащего 100мкг/мл.

Определение неорганического фосфора в ИЗР.

Содержание неорганического фосфата в препаратах ИЗР опреде-по методу (368).

- 300

Определение фосфолипидов и СЖК" в ИЗР.

Фосфолипиды и СЖ экстрагировали из леофильно высушенных препаратов ИЗР по Фолчу (369). Тонкослойную хроматографию проводили по методу (370) на пластинках с силикагелем.

Определение молекулярного веса ИЗР гелъожлътращей.

Молекулярный вес ИЗР определяли гельфильтрацией на колонке ;( 25 х 400мм) с сефадексом а -50 (Fain). Колонку уравновешивали и элюировали раствором, содержащим 0,1 М KCI и 0,05 М Трис-НС1, рН 7,5. Скорость элюции - 30 мл в час. Свободный^объем колонки определяли с помощью голубого декстрана. В качестве маркеров использовали НАДФН и цитохром С, вещества с молекулярными весами 743 и 13000. При определении молекулярного веса на колонку наносили 200 мкг ИЗР, растворенного в I мл 0,4 М KCI. Молекулярный вес ИЗР определяли с помощью графика, на оси абсцисс которого откладывали отношение для ИЗР, НАДН и Цитохрома С, а на оси ординат откладывали значения Log молекулярного веса НАДН и Цитохрома С.

Определение углеводных компонентов ИЗР.

Гидролиз образца: к 10 мг вещества добавляли 2,5 мл H^SO^, ампулу с содержимым термостатировали при температуре 98°С в течение 38 часов. После завершения гидролиза ампулу вскрывали и гид-ролизат обрабатывали карбонатом бария до нейтральности.

Для качественного определения углеводных компонентов в молекуле ИЗР нами был использован гнзожидкостной хроматограф "Цвет" (371). Гидролизат предварительно сушили в вакууме в эксикаторе, далее в колбу с гидролизатом добавляли 0,1 г солянокислого гид-роксилаланина и I мл свежеперегнанного пиридина. В течении одного часа реакционную смесь кипятили в бане с обратным холодильником. По истечении часа в смесь добавляли 2 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида и еще в течении часа кипятили в бане. После завершения вышеописанной процедуры к реакционной смеск приливали 25 мл дистиллята и продукты трижды экстрагировали хлороформом. Хлороформные вытяжки промывали водой по 25 мл три раза для удаления избыточных количеств реагентов. Хлороформный раствор сушили с безводным Bas 0^, после чего хлороформ перегоняли на роторном испарителе. Остаток использовали для газожидкостного анализа.

Определение бежа.

Содержание белка в митохондриях и в препаратах ИЗР определяли биуретовым методом С372).

Тиреоидэктомия.

В экспериментах по тиреоидэктомии операцию проводили у самцов крыс весом 100 г по методике, описанной у Кабака (373). Через 4 месяца после тиреоидэктомии контрольные крысы весили 250-280Г, а тиреоидэктомированные - 130-160г.

Определение концентрации инсулина.

Концентрацию инсулина в сыворотке крови крыс измеряли радио-имунным методом (374).

Измерение синтеза гликогена в изолированной диафрагме крысы.

Полудиафрагмы крыс инкубировали 60 минут в Кребс-Рингер фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 20 мМ глюкозы при 37°С. Перед началом инкубации среду инкубации продували кислородом. Содержание гликогена в полудиафрагмах измеряли по методу (375).

Измерение содержания гликогена в печени при стрессе и восстановлении после стресса.

Крыс декапитировали с минимальным стрессом при забое ( без применения корсанга). Печень извлекали, взвешивали, помещали на лед и определяли содержание гликогена по методу (375)

Иммобилизация

Иммобилизацию вызывали фиксацией крыс за 4 конечности на промежутки времени от I до 24 часов. Контрольных крыс в те же промежутки времени содержали с доступом к воде без пищи.

Определение сахара крови.

Содержание глюкозы в плазме измеряли ортотолуидиновым методом (376).

Измерение скорости синтеза.белка в изолированной диафрагме.крыс.

Полудиафрагмы крыс инкубировали 2 часа в Кребс-Рингер би-карбонатном буфере в присутствии 10 мМ глюкозы и С^тирозина (I мкКюри/Юмл). Перед инкубацией доводили рН до 7,4 и продували среду кислородом. Инкубация проводилась при 37°С с интенсивным встряхиванием в герметически закрытых сосудах. После инкубации полудиафрагмы промывали ледяным физиологическим раствором и гомогенизировали на льду в физиологическом растворе (100мг/мл). 0,1мл гомогената добавляли к 0,4 мл 10% трихлоруксусной кислоты. В осад-кеизмеряли радиоактивность на сцинтилляторном счетчике машс^ Ш.

Измерение глюконеогенеза в кусочках коркового слоя почки.

Кусочки коркового слоя почки получали продавливалием ткани через пресс с отверстиями диаметром 0,5 мм и инкубировали при 30°С в герметически закрытых сосудах с интенсивным встряхиванием. Перед внесением кусочков коркового слоя почки среду инкубации продували газовой смесью, содержащей 95% О2 + 5% СО2. Среда инкубации - Кребс-Рингер бикарбонатный буфер, рН 7,4, концентрация СаС12 в котором составляла 0,2 мГЛ* Концентрацию глюкозы измеряли до внесения субстратов глюконеогенеза и после инкубации с субстратами глюконеогенеза. Глюкозу измеряли модифицированным ортотолуидиновым методом. К 0,9 мл среды инкубации, отделенной от кусочков почки, добавляли 0,1 мл трихлоруксусной кислоты, все остальные процедуры проводили по методике (377). В этих условиях чувствительность метода увеличивалась на порядок. Кроме того, в ряде экспериментов был использован энзиматический метод с использованием методики, описанной В.С.Асатиани (378).

Измерение глюконеогенеза в кусочках печени крысы.

Условия эксперимента в основном те же, что и в экспериментах по измерению глюконеогенеза в кусочках коркового слоя почки, но концентрация ионов кальция составляла I мМ. В экспериментах использовались крысы, голодавшие 24 часа, для того; чтобы понизить исходное содержание гликогена в печени. С той же целью до инкубации с субстратами глюконеогенеза кусочки печени I час преинкуби-ровались в среде без субстратов в присутствии 10"% адреналина, а затем переносились в среду с субстратами глюконеогенеза.

ИК спектроскопия.

ИК спектры ИЗР снимали в таблетках с КВг на спектрофотометре ur -20 (ГДР).

УФ спектроскопия.

УФ спектры ИЗР снимали на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе а впервые для исследования гормональной регуляции транспортных процессов в митохондриях использована модельная система, содержащая помимо митохондрий цитоплазму. Необходимость такой модельной системы обусловлена тем, что действие гормонов на митохондрии опосредовано цитоплазматичес-кими регуляторами функции митохондрий.

Основным объектом наших исследований явились митохондрии печени. Одной из основных функций печени является глюконеогенез / 61 /. Первый этап глюконеогенеза, карбоксилирование пирувата, локализован в митохондриях. Низкая активность переносчика моно-карбоксилатов в мембране митохондрий печени определяет возможность гормональной регуляции глюконеогенеза на уровне транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии печени / 20,32,33 /. Единственным гормоном, ингибирующим глюконеогенез, является инсулин, хотя гормонами-активаторами глюконеогенеза являются глюкагон, адреналин, глюкокортикоиды, СТГ, Т / 110 /. Это и и определило наш интерес к действию инсулина на митохондрии. Нам удалось показать, что при введении инсулина крысам в термостабильной фракции цитоплазмы увеличивается активность фактора, регулирующего транспорт кальция и транспорт субстратов через мембрану митохондрий. Этот фактор был назван ИЗР (инсулинзависи-мый цитоплазматический регулятор). Было показано, что активность ИЗР проявляется в цитоплазме органов крысы, регулируемых инсулином (печень, сердце, диафрагма, скелетные мышцы), и не проявляется в цитоплазме органов, которые инсулином прямо не регулируются (корковый слой почки, мозговой слой почки, мозг, надпочечники, гипофиз). Показана корреляция между активностью ИЗР и концентрацией инсулина в плазме в широком диапазоне

- 272 состояний с гиперинсулинемией (введение крысам глюкозы, пищи, глюкокортикоидов, прогестерона самкам, беременность) и гипо-инсулинемией (голодание, мышечная деятельность, фаза тревоги стресса, тиреоидэктомия).

Нами была разработана методика выделения и очистки ИЗР.Показано, что ИЗР является гликолипопептидом с молекулярным весом мономерной формы около 6000 дальтон. В состав пептидной компоненты ИЗР входят 43 аминокислоты. Идентифицированы углеводы, входящие в состав ИЗР. Для очищенных препаратов ИЗР характерна аггрегация, которая усиливается при снижении ионной силы раствора. Аггрегацией обусловлена ограниченная растворимость ИЗР в солевых растворах и практически отсутствие растворимости в водных растворах с низкой ионной силой.

Нами подробно исследовано участие ИЗР в регуляции глюконео-генеза в печени. Показано, что ИЗР может оказывать ингибирующее действие на глюконеогенез как в результате ингибирования транспорта пирувата из цитозоля в митохондрии, так и в результате стимуляции транспорта ионов кальция из цитозоля в митохондрии гепатоцитов. Ингибирование транспорта пирувата ИЗР наблюдается и при высоких концентрациях пирувата, значительно превышающих Кщ переносчика монокарбоксилатов, и это свидетельствует о том, что причиной ингибирования транспорта пирувата при добавлении ИЗР является не увеличение Кш , а снижение умах переносчика монокарбоксилатов. При добавлении ИЗР снижается активность не только переносчика монокарбоксилатов, но и переносчиков дикарбоновых кислот, & кетоглютарата, глютамата, глютамат/ аспартат антипортера. Это свидетельствует о том, что ингибирование транспорта субстратов при добавлении ИЗР происходит не в результате взаимодействия ИЗР с переносчиками метаболитов, а в результате изменения конформации внутренней мембраны митохонд

- 273 рий, следствием которого является снижение подвижности переносчиков субстратов в мембране митохондрий, in vivo наибольшее значение для метаболизма гепатоцитов имеет ингибирование транспорта пирувата. Как уже говорилось выше, низкая активность переносчика монокарбоксилатов лимитирует глюконеогенез в гепа-тоцитах / 33 /. Поэтому ингибирование транспорта пирувата при увеличении активности ИЗР в гепатоцитах должно приводить к ин-гибированию глюконеогенеза из пирувата и лактата. В соответствии с этим тезисом очищенные препараты ИЗР ингибируют глюконеогенез из лактата и пирувата в экспериментах с кусочками печени и коркового слоя почки in vitro . Следовательно, ИЗР является эндогенным ингибитором глюконеогенеза в гепатоцитах. Был рассмотрен вопрос о взаимоотношениях ИЗР с такими хорошо извест i ными посредниками действия гормонов, как ц 3 5 АМФ и ионы кальция. Оказалось, что в печени активность ИЗР не регулируется t • прямо изменением концентрации ц 3 5 АМФ, но регулируется изменением концентрации ионизированного кальция в цитоплазме. Увеличение концентрации кальция приводит к снижению активности ИЗР в результате активации ферментативной системы, инактивирующей ИЗР. Снижение активности ИЗР, обусловленное увеличением концентрации ионизированного кальция в цитоплазме, по-видимому, является одним из механизмов стимуляции глюконеогенеза в гепатоцитах при взаимодействии катехоламинов с i адренорецепторами, когда вторым посредником является кальция, а не ц з'+5 АМФ / I /. Напротив, снижение концентрации ионов кальция в цитоплазме гепатоцитов, которое наблюдается при введении инсулина / 39 /, должно приводить к увеличению активности ИЗР и ингибированию глюконеогенеза. Подтверждением этих представлений может служить снижение активности ИЗР в печени, которое имеет место при введении адреналина, и увеличение активности ИЗР при введении инсулина.

• »

Хотя ц 3 5 АМФ не оказывает прямого действия на активность ИЗР в гомогенатах печени, в интактных гепатоцитах увеличение

I » концентрации ц 3 5 АМФ приводит к увеличению концентрации ионизированного кальция в цитоплазме / I /, и, как следствие, по-видимому, снижает активность ИЗР.

Участие ИЗР в регуляции глюконеогенеза косвенно подтверждается наличием достаточно хорошей корреляции между активностью ИЗР в печени и активностью глюконеогенеза. Активность ИЗР снижена при голодании,введении адреналина, мышечной деятельности , стрессе, когда стимулирован глюконеогенез, и увеличена при кормлении крыс и введении инсулина, когда ингибируется глюконеогенез.

При введении гидрокортизона крысам снижается чувствительность митохондрий печени по отношению к ингибирующему действию ИЗР на транспорт пирувата в митохондриях, и этот эффект, по-видимому, является одним из механизмов инсулинрезис-тентности при избытке глюкокортикоидов в организме. Следовательно, причиной инсулинрезистентности может быть не только нарушение связывания инсулина рецепторами, но и нарушение передачи сигнала инсулина на уровне взаимодействия ИЗР с митохондриями. Сходным образом снижается чувствительность митохондрий к действию ИЗР на транспорт пирувата при иммобилизации. При голодании снижается и чувствительность к стимулирующему действию ИЗР на синтез белка в диафрагме крысы.

Катехоламины снижают чувствительность глюконеогенеза к действию ИЗР, увеличивая д рН на мембране митохондрий /350/. Увеличение лрН, обусловленное стимуляцией дыхательной цепи митохондрий, приводит к стимуляции пируват/ОН~ обмена, обусловленного увеличением концентрации 0Н~ в митохондриях /350/.

- 275

Так как ИЗР снижает активность переносчика монокарбоксилатов, но не оказывает влияние на дрН, то в условиях увеличения АрН адреналином ослабляется контроль ИЗР и инсулина над транспортом пирувата из цитозоля в митохондрии печени. При иммобилизации имеет место и этот механизм снижения чувствительности митохондрий к действию ИЗР, так как наблюдается стимуляция окисления субстратов, обусловленная увеличением концентрации катехоламинов в плазме.

Так как активность ИЗР в цитоплазме печени в значительной степени определяется концентрацией ионизированного кальция в цитоплазме, то при рассмотрении действия глюкокортикоидов была рассмотрена возможность регуляции активности ИЗР глюкокорти-коидами за счет изменения распределения ионов кальция между митохондриями и цитоплазмой, В связи с этим было исследовано действие гидрокортизона на активность Са^+/2 Н+ антипортера в печени крыс, так как именно этот переносчик осуществляет транспорт ионов кальция из митохондрий в цитоплазму. Оказалось, что при введении гидрокортизона в печени нескольких дней активность Са^+/2 Н+ антипортера в митохондриях печени крысы увеличивается. Следствием этого эффекта является снижение эффективности активного транспорта кальция в митохондрии и изменение распределения кальция между митохондриями и цитоплазмой в сторону увеличения концентрации ионизированного кальция в цитозоле. Увеличение активности Са2+/2Н+ антипортера имеет место только при многократном введении гидрокортизона или хроническом стрессе и, по-видимому, является одним из механизмов стимуляции глюконеогенеза в печени при этих воздействиях.

В работе рассмотрена роль ИЗР и чувствительности метаболических процессов к ИЗР и инсулину в адаптационном синдроме. Предполагается, что частичная резистентность к инсулину при

- 276 стрессе и при восстановлении после стресса является причиной повышенного синтеза гликогена в печени при адаптационном синдроме. Известно, что основная направленность метаболических процессов при стрессе это обеспечение высокой концентрации глюкозы в крови, которое достигается стимуляцией глюконеогене-за и ингибированием потребления глюкозы. В норме концентрация глюкозы в плазме контролируется соотношением двух гормонов антагонистов - инсулина и глюкагона / 110 /. При стрессе основную роль играют глюкокортикоиды, глюкагон и катехоламины. В обычных условиях, когда метаболизм контролируется глюкагоном и инсулином, существуют реципрокные взаимоотношения между активностью глюконеогенеза и активностью гликогенсинтетазы, так как инсулин ингибирует глюконеогенез и стимулирует гликогенсинте-тазу, а глюкагон стимулирует глюконеогенез и ингибирует глико-генсинтетазу / 39 /. Эти реципрокные взаимоотношения определяют невозможность запасания больших количеств углеводного материала из глюкозы, синтезированной in vivo . При стрессе реципрокность нарушается, так как при избытке глюкокортикоидов стимулирован глюконеогенез и высока активность гликогенсинтетазы / 245 /. Известно, что стимуляция глюконеогенеза это следствие действия самих глюкокортикоидов, а стимуляция глико-гепсинтазы - следствие гиперинсулинемии, обусловленной снижением чувствительности метаболизма к инсулину / 40 /. Таким образом, при избытке глюкокортикоидов не проявляется ингиби-рующее действие инсулина на глюконеогенез, но сохраняется стимулирующее действие инсулина на гликогенсинтазу. Следовательно, частичная инсулинрезистентность при действии глюкокортикоидов является причиной нарушения реципрокных взаимоотношений между глюконеогенезом и синтезом гликогена. Этот механизм создает возможность для синтеза больших количеств гли

- 277 когена из глюкозы, синтезированной in vivo , и это имеет большое значение в состоянии неспецифической резистентности.

Одной из целей работы явилось выяснение роли ИЗР в рассмотренном механизме синтеза гликогена в печени при введении глюкокортикоидов и при стрессе. Показано, что при введении глюкокортикоидов увеличивается активность ИЗР в печени, сердце и диафрагме вследствие гиперинсулинемии, но ослабляется действие ИЗР на транспорт пирувата из цитозоля в митохондрии печени, что может послужить причиной потери чувствительности глюконеогенеза в гепатоцитах к ингибирующему действию инсулина. Сходная ситуация наблюдается и при иммобилизации. Так как при введении глюкокортикоидов активность гликогенсинтетазы увеличена и показано, что это следствие гиперинсулинемии, то, очевидно, что действие инсулина на гликогенсинтетазу сохраняется. Возможно, что стимуляция гликогенсинтетазы связана с высоким уровнем активности ИЗР, так как ИЗР стимулирует синтез гликогена в изолированной диафрагме и ингибирует гликогенолиз в кусочках печени.

В целом, полученные нами данные позволяют рассматривать ИЗР как один из посредников действия инсулина на метаболизм. Получены три типа доказательств в пользу этого вывода. Во-первых, существует хорошая корреляция между концентрацией инсулина в плазме и активностью ИЗР в органах-мишенях инсулина. Во-вторых, активность ИЗР обнаружена в органах, регулируемых инсулином (печень, сердце, скелетные мышцы, диафрагма, бурый жир) и чрезвычайно низка в органах крысы, метаболизм которых прямо инсулином не регулируется (мозг, надпочечники, щитовидная железа, корковый слой почки крысы, мозговой слой почки крысы). В-третьих, ИЗР обладает инсулинподобным действием на

- 278 клеточном уровне и ln vivo . Нами показано, что ИЗР обладает гипогликемическим действием, стимулирует синтез белка и синтез гликогена в изолированной диафрагме крысы, ингибирует глюконеогенез и гликогенолиз в кусочках печени крысы. Все это позволяет сделать вывод о том, что, по крайней мере частично, действие инсулина на метаболизм опосредуется увеличением активности ИЗР в цитоплазме.

Этот вывод особенно показателен в том отношении, что впервые доя идентификации внутриклеточного посредника гормонов использована тест-система, включающая в себя митохондрии. Более подробный анализ механизма инсулинподобных эффектов ИЗР нами не проводился в связи с тем, что основной задачей работы явилось исследование гормональной регуляции на уровне митохондрий, а не на уровне клетки. Правомерность использованного в работе экспериментального подхода в какой-то степени подтверждг ется и появлением в I979-I98I г.г. работ по регуляции активности пируватдегидрогеназы в белом жире инсулином / 259-262 /. В этих работах сделан вывод о том, что при действии инсулина на адиноциты увеличивается активность внутриклеточного фактора, который вызывает стимуляцию пируватдегидрогеназы митохондрий адиноцитов. В настоящее время невозможно рассмотрение вопроса в возможной идентичности ИЗР и инсулинзависимого фактора из адиноцитов, так как этот фактор не очищен до конца / 259 /, но несомненно, что и представленная работа и цитированные работы позволяют сделать вывод о том, что сложные модельные системы, содержащие помимо митохондрий другие клеточные органеллы, необходимы как при исследовании гормональной регуляции транспортных процессов в митохондриях, так и для идентификации внутриклеточных посредников действия гормонов на метаболизм.

Предложенные в работе тесты на определение активности ИЗР

- 279 в органах-мишенях инсулина могут быть использованы при исследовании механизма инсулинрезистентности при различных формах сахарного диабета и ожирения. Эти тесты позволяют идентифицировать пострецепторные формы инсулинрезистентности, в которых инсулинрезистентность обусловлена не нарушением связывания инсулина рецепторами, а нарушением передачи сигнала инсулина на уровне внутриклеточных посредников действия инсулина.

Возможно, что измерение активности ИЗР в клетках-мишенях инсулина может послужить основой для разработки диагностических тестов при эндокринных заболеваниях.

Инсулинподобное действие очищенных препаратов ИЗР in vivo и in vitro позволяет рекомендовать их для широких фармакологических исследований как препарата с гипогликемическим действием. Этот препарат может оказаться эффективным при инсу-линрезистентных формах сахарного диаебата в тех случаях, когда инсулинрезистентность является следствием нарушения связывания инсулина рецепторами плазматической мембраны.

Известно, что выделение иниактных препаратов митохондрий из многих тканей сопряжено с серьезными методическими трудностями. Предложенный в работе методический подход, основанный на измерении активности цитоплазматических регуляторов транспортных процессов в митохондриях, позволяет исследование гормональной регуляции энергетического метаболизма в органах, из которых трудно выделить интактные митохондрии. Так, например, динамика изменения активности ИЗР в диафрагме позволяет косвенно судить о функциональных изменениях в митохондриях диафрагмы. Основной вывод представленной работы заключается в том, что при исследовании гормональной регуляции транспортных процессов в митохондриях необходимы модельные системы, содержащие помимо митохондрий компоненты цитозоля. Эти модельные системы позволяют

- 280 исследование действия гормонов как на активность цитоплазмати-ческих регуляторов транспортных процессов в мембране митохондрий, так и на чувствительность митохондрий к действию цитоплаз-матических регуляторов.

Этот вывод подтверждается не только исследованием регуляции митохондриальных процессов ИЗР, но и экспериментами с добавлением термостабильной фракции цитоплазмы к суспензии митохондрий Эти эксперименты показали, что в термостабильной фракции цитоплазмы, помимо ИЗР,имеются и другие регуляторы транспортных процессов в митохондриях. Нами выделен и очищен термостабильный гликопептид из цитоплазмы сердца, который ингибирует электрогенный транспорт кальция в митохондрии сердца. В отличие от ИЗР, который является кислым гликолипопептидом, ингибитор транс порта кальция в митохондрии сердца является щелочным гликопеп-тидом с молекулярным весом около 2000 дальтон. Показано, что в цитозоле ингибитор находится как в свободном состоянии, так и в связанном виде с кислым термостабильным белком. Предполагается, что при сокращении миокарда увеличивается концентрация свободной формы ингибитора и ингибирование электрогенного транспорта кальция из цитозоля в митохондрии усиливает выход кальция из митохондрий, осуществляемый Са^+/2иа+ антипортером. Это предположение косвенно подтверждается экспериментами, в которых добавление рутениевого красного-синтетического ингибитора электрогенного транспорта кальция усиливает выход кальция из митохондрий сердца, индуцируемый добавлением ионов Nа+ / 28 /.

Следует отметить,что и ИЗР и цитоплазматический ингибитор транспорта ионов кальция в митохондрии сердца являются относительно низкомолекулярными гликопротеидами. Если ИЗР является эндогенным ингибитором транспорта субстратов и одновалентных

- 281 катионов в митохондриях печени и сердца, то щелочной глико-пептид из цитоплазмы сердца является ингибитором электрогенного транспорта кальция в митохондрии сердца. Можно предположить, что одной из основных функций низкомолекулярных глико-пептидов цитоплазмы является регуляция транспортных процессов в мембране митохондрий.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гайнутдинов, Марат Хамитович, Ташкент

1. Hasmussen Н.,Goodman D.B. Relationships between calcium andcyclic nucleotides in cell activation. Physiol. Rev., 1977| 57, N3, 422-495*

2. Lenhinger A.L. Physiologcal siqnificance of mitochondrialcalcium uptake. Biochem J.1970»119»N1,129-138*2+

3. Vasinqton F. D.,Murphy J.V. Ca uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. J.Biol.Chem.,1962,337«N8,2670-2675.

4. Rossi C.S.»Lehninger A.L. Stoichometric relationships between2+.accumulatiin of Ca ions by mitochondria and theenergy-couplinq sites in the respiratory chain.

5. Biochem,Zeitschrift,1963,¿£8,N2,698-673.

6. Brierley G.P.,Murer E.,Bachmann E., The accumulation of calcium and inorqanic phosphate by heart mitochondria, Archiv Biochem»Biophys.1964,105,N1,89-93

7. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах.М.,1972.

8. Himms-Haqen J.Role of adrenal medulla in adaptation to cold.

9. Handbook of Physiology,Endocrinology.Washinqton D.C.Am.Physiol.Soc.-5975, sect7iV,chapt38,637-665.

10. Nicholls D.G.»Lindberq 0. Brown-adipose tissue mitochondria

11. Biochemistry, 1970, 12, N8, 1508-1521.+

12. Brosnan J.T.,Hall B. The transport and metabolism of glutamine by kidney-cortex mitochondria from normal and acidotic rats.Biochem J.1977,164,N3,331-337

13. Haynes R.C. Hormonal regulation of pyruvate metabolism inrat liver mitochondria, In energy metabolism and regulation of metabolic processes in mitochondria, ed M.A.Mehliman.»R.W.Hanson, Acad.Press,New.York, London, 1972,239-252.

14. Titheradge M.A.,Coore H.G, Hormonal regulation of liver mitochondrial pyruvate carrier in relation to gluco-neogenesis and lipogenesis. EBBS Letters, 1976, 71, N1, 72-75.

15. Mc.Lean P.,Gumaa K.A.,GreenBaum A.L. Long chain acyl CoA,adenine nucleotide translocase and the coordination of the redox states of the cytosolic and mitochondrial compartments. PEBS Lett era. 1971 >17, N2,34-5-348.

16. Exton J.H.»Harper S.C.,Tuchker A.Lee,Plagy J.L.,Park Ch.R.

17. Effects of adrenalectomy and glucocorticoid replacement on gluconeogenesis in perfused liver from diabetic rats. Biochim.Biophys.Acta. 1973, 329, 41-57.

18. Adam P.A.,Haynes R.C. Control of hepatic mitochondrial C02fixation by glucagon,epinephrine and Cortisol J.Biol.Chem. 1969, 244, N23, 6444-6450.

19. Parrilla R.,Jimenes M.I.,Ayiso-Parrilla M.S. Cellular redistribution of metabolites during glucagon and insulin control of gluconeogenesis in the isolated perfused rat liver. Arch.Biochem.Biopbys. 1976, 174, N1, 1-12.

20. Rasmussen H. Cell communication,calcium ion and cyclic adenosine monophosphate. Science. 1970,170,N3936, 404-415.

21. Friedmann N.»Rasmussen H. Calcium,magnesium and hepatic gluconeogenesis. Biochim.Biophys.Acta. 1970, 222,1. N1, 41-50.

22. Friedmann IT. Effects of glucagon and cyclic AMP on ion fluxes in the perfused liver. Biochim.Biophys.Acta 1974, 274, N1, 214-225.

23. Chen J.J.,Babcoock D.F.,Lardy H.A. norepinephrine,vasopressin, glucagon and A23187 induce efflux of calcium from an exchangeable pool in isolated rat hepatocytes. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1978, 75, N5, 2234-2239.

24. Garrison J.C.,Haynes R.C. The hormonal control of gluconeogenesis by regulation of mitochondrial pyruvate carboxylation in isolated rat liver cells. J.Biol.Chem.1975, 250,N8, 2769-2776.

25. Halestrap A.P. Stimulation of pyruvate transport in thetransmembrane pH gradient induced by glucagon treatment of rats. Biochem J. 1978,172,N3, 389-396.

26. Hughes B.P., Barritt G.J. Effects of glucagon N 0 dibutyryladenosine 3' 5' cyclic monophosphate on calciumtransport in isolated rat liver mitochondria.

27. Biochem.J. 1978, 176, 295-304.

28. Prpic V.,Spencer T.L.,Bygrave F.L. Stable enhancement of2+

29. Ca retension in mitochondria isolated from ratliver after the administration of glucagon to the intact animal. Biochem.J. 1978, 176, N3, 705-714-.55* BArritt.,TH0rne B.F., Hughes B.P. Effect of hormones and6 2 .' »

30. NO- dibutyryl-adenosine 3 5 cyclic monophosphate, administrated in vivo on phosphate transport and metabolism in rat liver mitochondria. Biochem. J. 1978, 172, NS2, 577-585.

31. Siess E.A., Wieland O.H. Early kinetics of glucagon action in isolated hepatocytes at the mitochondria level. Eur.J.Biochem., 1980, 110, NT1, 203-210.

32. Ньюсхолм Э.,Старт К. Регуляция метаболизма, Мир. Москва,1977.

33. Halestrap А.P. Stimulation of the respiratory chain of ratliver mitochondria between cytochrome C^ and cytochrome С by glucagon treatment of rats, Bio-chem J. 1978, 17£, №3» 399-406.

34. Mitchell P.Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Bodmin.Glynn.Research. 1966.

35. Hoek J.B. Njogu R.M. Glutamate transport and the trans-membrane pH gradient in isolated rat liver mitochon dria. FEBS Letters.1976, 71, №2, 341-346.

36. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Biol.Rev.^I, 445-467.

37. Meijer A.L. Groot G.S.,Tager J.M. Metabolite transport inrat liver mitochondria. FEBS Letters. 1970, 8, N1, 41-47»

38. Tischler M.E.,Pachence J.,Williamson J.E.,La Noue K.P.

39. Mechanism of glutamate-aspartate translocation across mitochondrial membrane. Archiev.Biochem. Biophys. 1976, 171, N2» 44-8-462.

40. Wit-Peeters E.M.,Schölte H.H.Elenbaas H.L. Patty acid synthesis in heart. Biochim. Biophys.Acta. 1970, 210, N1, 360-372.

41. Dhadli S.C.,Halperin M.L. The role of mitochondrial citratetransporter in the regulation of fatty acid synthesis: effect of fasting and diabetes. Can.J.Biochem. 1973, 51,N11, 1542-1544.

42. Shung A.L.,Shrago E. The inhibition of adenine nucleotidetranslocase activity "by oleoil CoA in rat liver mitochondria. Biochem.Biophys. Res-Commun.,1973» 52, N2, 659-666.

43. Exton I.H. Park C.R. Control of gluconeogenesis in liver

44. J.Biol.Chem. 1969, 244, N6, 1424-1436.

45. Snell K. Mitochondrial-cytosolic interrelationships involvedin gluconeogenesis from serine in rat liver. PEBS Lett. 1975, 55, N1, 202-206.

46. Paradies G.,Papu S. Substrate regulation of the pyruvatetransporting system in rat liver mitochondria PEBS Lett. 1976, 62, N2, 318-322.

47. Meijer A.L.,Vignais R.M. Adenine nucleotide transport inrat liver mitochondria. Biochem Biophys.Acta,1973, 325, N2, 375-386.

48. La Noue K.F.,Bryla J.,Bassett J.R. Glutamate-aspartate translocation across mitochondrial membrane.J.Biol. Chem. 1974, 249, N23, 7514-7521.

49. La Noue K.F.,Walajtys E.I.,Williamson J.R. J.Biol.Chem.1973, 248, N21, 7171-7181.

50. Pfaff E.,Klingenberg M. Adenine nucleotide translocation oft ' ' " ". ' ■ ' ■ ■ 'mitocliondria. European J.Biochem., 1968.6.N1.66-71 •

51. Souverijn J.H. »Huisman L.A.»Rosing J.,Kemp A. Comparison of

52. Shug A.,Lerner E.,Elson C.,Shrago E. The inhibition of adenine nucleotide translocase activity by oleoil Co A and its reversal in rat liver mitochondria. Bio-chem.Biophys.Res.Commun. 1971N2. 557-562.

53. VALTER P. Stucki J.W.,Regulation of pyruvate carboxylase inrat liver mitochondria by adenine nucleotides and short chain fatty acid. Europ.J.Biochem. 1970. 12. N3, 508-519.

54. Babior B.M.,Creagan S.,Ingbar S.H. Stimulation of mitochondrial adenosine diphosphate uptake by thyroid hor mones. Proc.Natt.Acad.Sci.USA.1973.70.N1.98-102.

55. Portnay G.I.,Mc.Clendon F.D. Bush J.E. The effect of physiological doses of thyroxine on carrier-mediated ADP uptake by liver mitochondria from thyroidecto-mized rats. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1973« 55» N1. 17-21.

56. Carafoli E. The calcium cycle of mitochondria. FEBS Lett1979. 104. N1. 1-5.

57. Caroni P.,Schwerzmann K«,Carafoli E. Separate pathmays for2+

58. Ca uptake and release in liver mitochondria. FEBS Lett. 1978. 96.N2. 339-342.

59. Moore C.L.Specific inhibition of mitochondrial Ca2+ transport by ruthenium red, Biochem.Biophys.Res.Commun. 1971. 42. N2. 298-303.

60. Bygrave F.L. Reed K.C. Spenar T. The concentration dependence of calcium ions accumulation by rat liver mitochondria. Nature.1971. 230.89-92.

61. Vinogradov A. Scarpa A. The initial velocities of calciumuptake by rat.liver mitochondria. J.Biol.Chem. 1973. 248. N15. 5527-5536.107« Bragadin M.»Bernard P.,Pozzan T. Molecular properties of2+

62. Ca carrier in rat liver mitochondria. ABstracts

63. XI-th Intern Congress of Biochem, july 8-13.1979.Toronto, Canada. 06-6-R97. 4-52.

64. Carafoli E.,Crompton M.,Roos I.,Schwerzmann K.,Lotcher H.R.2+1.dependent Ca uptake and release pathways in liver mitochondria. Abstracts Xl-th Intern Congress of Biochem. July 8-13. 1979. Toronto, Canada 06-6-R98 p492.

65. Robinson G.A.,Butcher R.H.,Suthorland E.W. Cyclic AMP.

66. New York-London,Academic Press.1971*

67. Woods C.S.,Porte D. Neural Control of the endocrine pancreas. Physiol.Rev. 1974.54. N3. 596-619.

68. Ажипа Я.И. Нервы желез внутренней секреции и медиаторы врегуляции.эндокринных функций.М.Наука.1976. ИЗ. Афиногенова и др. Биохимия гормонов и гормональной регуляции, под ред.Н.А.Юдаева. М.Наука 1976.

69. Взаимодействие гормонов с рецепторами. Молекулярные аспекты. Ред.Дж.Леви. М.Мир. 1979.

70. Oppenheimer J.H.,Surks M.J. Biochemical basis of thyroidhormone action. In "Biochemical actions of hormone nes" ed G.Litwack.Acad.Press.New York,London 1975. vol-III. 119-155.

71. Litwack G.»Singer S. Subcellular actions of glucocorticoids

72. Biochemical actions of hormones,ed G.Litwack

73. Acad.Press.New York.London. 1972.vol-H.114-158

74. Sutherland E.W.,Rall T.W. Formation of cyclic adenine ribonucleotide by tissue particles. J. Biol. Chem. 1958. 232. N8. 1065-1076.

75. Tolbert M.E.,Butcher F.H.,Fain J.N. Lack of correlation between catecholamines effect on cyclic adenosine t •3 5 monophosphate and gluconeogenesis in isolated rat liver cells. J.Biol.Chem.1973.226. N24. 5686-5692.

76. Keppens S.,VANDENHEEDE J.R.,De Wulf H. On the role of Ca2+as second messenger of glycogen phosphorylase. Biochem.Biophys.Acta. 1977.429. N2. 448-457»

77. Hardman J.G.,Beavo J.A.,Gray J.P.,Chrisman T.D.»Patterson

78. W.D.»Sutherland E.W. The bormation and metabolism of cyclic GMP. Ann N.t.Acad.Sci. 1971. 185. N1. 27-35.

79. Kimura H.»Murad F. Evidence for two different forms of guanilate cycles« in rat heart. J.Biol.Chem. 1974. 249. N21. 6910-6916.

80. Goldberg N.D.,Hardox N.K.,Nicol S.E.,Glass D.M.»Sanford

81. C.H.,Kuehl F.A.»Estensen R. Biological regulation through opposing influences of cyclic GMP and cyclic AMP: the Yin-Tang hypothesis. Advan Cyclic Nucleotide Res.1975. 5. N2. 307-330.

82. Anderson R. Role of cyclic AMP and Gar in metabolic andrelaxing effects of catecholamines in intestinal smooth muscle. Acta phisiol, Scand. 1972. 85. N2. 312-322.

83. Anderson R.,Nilsson K.,Wikberg J.,Jonansson S.,Lundholm L.

84. Jen-Ling J.Chen.,Babeock D.F.,Lardy H.A. Norepinephrine,vasopressin,glucagoa and A-23187 induced efflux p+of Ca from an exchangeable pool in isolated rat hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1978. 75. N5. 2234-2238.

85. Blackmore P,F.,Dehuye J.P.,Strickland W.G.,Exton J.H.di adrenergic mobilization of hepatic mitochondrial calcium. FEBS Lett. 1979« 100. N1. 117-120.

86. Pilkis S.J.»Claus T.H.»Johnson R.A.»Park Ch.R. Hormonal1 tcontrol of cyclic 3 5 AMP levels and gluconeoge-nesis in isolated hepatocytes from fed rats.J. Biol. Chem. 1975. 250. N16. 6328-6336.

87. Biochem J. 1963- 82. N1. 22-29.132» Cloucomb W.C. Kilpheimer G.S. Effect of glucagon adenosineb 5'-monophosphate and theophylline on free fatty acid release by liver slices.Tissue le vels of coenzyme A. Endocrinology. 1969. 84. N5. 1179-1183.

88. Eoobol A., Alleyne G. Regulation of renal gluconeogenesis1 tby calcium ions, hormones and 3 5 cyclic amp AMP. Biochem J.1973. 134. N1. 157-165. ¿134. Hoch P.L. Biochemical actions of thyroid hormones. Physiol

89. Rev. 1962. 42.N2. 605-648.

90. Bronk J.R. Some actions of thyroxine on oxidative phosphorylation. Biochim Biophys.Acta. 1960. 37. N2. 327-336.

91. Rassmussen H.F.,De Luca H.F. Parathyroid hormone and mitochondrial metabolism. J.Biol.Chem. 1967.242. N21. 4669-4676.

92. Туракулов Я.Х. Новые данные о взаимодействии с внутриклеточными компонентами и молекулярном механизме действия гормонов щитовидной железы. В кн. "Новое о гормонах и механизме их действия" .Киев.Наукова Думка.1977.65^80.

93. Туракулов Я.Х.»Хамвдов Д.X.Винокурова Т.Н.,АбдуКаримов А.

94. А.Гагельганс А.И. 0 тироксинсвязывающем факторе митохондрий печени крыс. ДАН СССР.1974. 218. Н. 238 241.

95. Barker S.В. Mechanism of action of the thyroid hormone.

96. Physiol.Rev. 1951-31- N3. 205-248.

97. Herd P.A. Thyroid hormone-divalent cation interactions.

98. Sterling K. Thyroid hormone action at the cell level.

99. New England J.Med.1979.300.N4. 173-177.

100. Mendoza D.D.»Moreno H.,Massa E.M.»Morero R.D.»Farias R.N.

101. Thyroid hormone actions and membrane fluidity. FEBS Letters. 1977. 84. N1. 199-203.

102. Sterling K., Brenner M.A.,Sakurada T. Rapid effect of triiodothyronine on the mitochondrial pathway in rat liver in vivo* Science, 1980. 210»N24467. 340-342.

103. Herd P., Kaplay S.S., Sanadi D.R. On the origin and mechanism of action of a thyroxine-responsive protein. Endocrinology. 1974. £4. N2 £. 464-474.

104. Гагельганс А.И., Гайдина.Г.А., Гольбер Л.М., Кандрор В.И.,

105. Мирахмедов А.К., Салахова Н.С., Оракулов Я.Х. Тиреоидине гормоны. Ташкент. "ФАН". 1972.

106. Levey G.S., Epstein S.E. Myocardial adenyl cyclase activation Ъу thyroid hormones and evidence for two adenyl cyclase systems» J.Clin»Invest., 1969* 48. № 6. 1663-1669»

107. Siess E.A., Wieland O.H. Glucagon-induced stimulation of2.oxoglutarate metabolism in mitochondria from rat liver. FEBS Letters, 1978, 92, NS 2, 301306.

108. Titheradge M.A., Binden S.B., Tamazaki R.K., Haynes H.C.

109. Glucagon treatment stimulates the metabolism of hepatic submitichondrial particles* J.Biol. Chem., 1976, 2^, NS 10, 3357-3362. 162» Zahlten E.N*, Hochberg A.A., Stratman F.W., Lardy H.A.

110. Glucagon-stimulated phosphorylation of mitochondrial and lysosomal membranes of rat liver in vivo. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1972, № 4, 800-809.

111. Vardanis A. Protein-kinase activity at the inner membraneof mammalian mitochondria. J.Biol.Chem., 1977, 252. № 3, 807-813.

112. Matlib A.,0 Brien J.P. Adenosine 3 5 -cyclic mnopphosphatestimulation of calcium efflux from mitochondria Biochem.Soc.Trans. 1974. 2. N3- 997-999.

113. Le Blank P.,Bourdahl M.,Clauser H. A specific ADP requir2+ement in the course of Ca and phosphate accumulation in mitochondria. Biochem.Biophys Res. . Commun. 1970. 40. N3«. 754-759.

114. Оракулов Я.Х. ,Гайнутдинов TM.X. .Салихов Р .С. ,Гизатуллина33.»Лавина И.И.Действие АМФ л "Фактора.взаимодействия- митохондрий" на транспорт.ионов в митохондриях печени. ДАН СССР.1976.226.№2.478.

115. Borst P.,Loos J.A. The identification of active componentof mitochrome and the influence long-chain fatty acids on the adenosine traphosphatase activity of rat liver mitochondria. Recuil trav.chem. 1959, 78, N3, 874-879.

116. Borst P.,Loos J.A.,Christ E.J. Uncoupling activity of longchain fatty acids. Biochim.Biophys.Acta. 1962.

117. N2. 509-515. •172.Скулачев В.П. Аккумуляция энергии в клетке. М. 1969.173*Fain J.N.,Loken S.C., Czech М.Р. Oligomycin effects on ly-polysis and. the oxidative metabolism of brown fat cells. Biochim.Biophys.Acta. 1970.197. N1 40-45.

118. Левачев IJ.M. ,Мишукова Е.А.,Сивкова В.Г. »СкулачевВ.П.

119. Энергетический обмен-голубя при самосогревании . после гипотермии. Биохимия. 1965. 30.№4.864-872.

120. Ellis S. Pharmacol. Rev. 1956. 8. N2. 485-519.

121. Loh Н.,Volfin P.,Кип E. Regulation of mitochondrial metabolism by specific cellular substances.Isolation of a cytoplasmic fraction and its effect on oxidative phosphorylation. Biochemistry. 1978. 7. N3. 726-732.

122. Кип E.,Kearney E.B.,Lee N.M.»Wiedemann I. Interaction ofa cytoplasmic factor with electron and ion transfer coupled functions of mitochondria. Biochem. Biopbys.Res.Commun. 1970. 38. 1002-1005.

123. Lee N.M.»Wiedemann I.,Кип E. Control of cation movementsin liver mitochondria by a cytoplasmic factor. Biochem.Biophy s.Res.Commun. 1971. 42. N6. 10301041.

124. Кип E.,Lee N.M.,Lin D.C.»Wiedemann I. In "Molecular basisof electron transport" ed J.Sshults, B.F.Cameron Acad.Press. New.York. 1972. 119-131.

125. Кип E.,Dummel R.J.»Battaglia W.L. Mechanism of Mg^ uptakeinto mitochondria and its cellular regulation. Fed.Proc.1974.32. N5. 1257-1261.

126. Kun E.Kinetics of ATP-dependent Mg flux in mitochondria

127. Biochemistry. 1976. 15. N11. 2328-2336«

128. Binet A.,Gross C.,Volfin P. A cytoplasmic molecule active2.ton membranal Mg movement. Isolation and properties.FEBS Lett. 1971.17.N1.193-196.

129. Binet A.,Volfin P. II its role as a factor of the membraneintegrity in mitochondria chloroplasts and bac-teria.FEBS Letters. 1971.17.N1.197-201.

130. Binet A.,Volfin P. ADP reguirement for prevention by a cy2+ 2+tosolic factor of Mg& and Ca release from rat liver mitochondria. Archiv.Biochem.Biophys 1974.164.N2.755-762.

131. Binet A.,Volfin P. Regulation by Mg2+ and Ca2+ of mitochondrial membrane integrity. Archiv.Biochem.Biophys 1971.170.N2.576-582.

132. Smith R.E.,Horwitz B.A. Brown fat and thermogenesis.

133. Physiol.Rev. 1969. 49. N1. 330-359. 187* Lindberg 0. de Pierre J.,Rylander E.,Afzelium B.A. Studiesof the mitochondrial energy-transfer system of brown adipose tissue. J.Cell.Biol.1967.34-.N2. 293-298.

134. Nicholls D.L. Hamster brown-adipose tissue mitochondria.

135. The chloride permeability of the inner membrane under respiring conditions,the influence of purine nucleotides. Europ J. Biochem. 197449. N3. 585-593.

136. FEBS Letters .1976.74-.N1.43-46.- .- . . .

137. Connelly J.L.»Halmstrom C.H. A nonphosphorylative functionof adenosine 5 - diphosphate in the maintenance of mitochondrial integrity. Biochemistry 1967. 6. 1567-1573.

138. Lehninger A.L.,Water, uptake and extrusion by mitochondriain relation to oxidative phosphorylation. Physiol. Re v. 1962.42.N3.467-499.

139. Le Blank P.,Clauser H. Regulation of Ca ions transport ih rat hepart mitochondria by adenine nucleotides.Biochim.Biophy s.Acta. 1974.347*N1.87-95»

140. Туракулов Я.Х., Гай нутди нов М.Х., Физиологическая регуляцияэнергетических реакций митохондрий. Ташкент "Фан" 1980.

141. Panov A.»Fillippova S.»Lyakhovich V. Adenine-nucleotidetranslocase as a site of regulation by ADP of the liver mitochondria permeability to H+and K+ions. Archiv.Biochem.Biophys. 1980.199.N2. 420-426.

142. Out T.A.,Kemp A.»Souverijn J.H. The effect of bongkrekicp+acid on the Ca stimulated oxidation in the rat liver mitochondria. Biochim.Biopbys.Acta.1971• 245. N2. 299-304.

143. Jefferson L.S.,Exton J.H.,Butcher R.W.»Sutherland E.W.,

144. Park C.R. Role of 3*5* cyclic AMP in the effects of insulin and anti-insulin serum on liver metabolism. J.Biol.Chem. 1968.243.N5.1031-1038.

145. Dorman D,M.»Barritte G.J.,Bygrave F.L. Stimulation of Ca2+ions transport in the rat liver mitochondria by elevated plasma insulin. Biochem.J. 1975.150. N3. 389-395.

146. Cash W.D.,Aanning H.L.,Carlson H.E.,Cox S.W.,Skong E.A.

147. Role of Zn in the Mitochondrial swelling action of insulin. Archiv.Biochem.Biopbys. 1968.128. N2. 456-459205. Беллами Л. "Инфракрасные спектры сложных молекул'.1 М.ИЛ.1963.205а Чиргадзе Ю.Ю. "ИК спектры и структура полипептидов ибелков. М. Наука 1963.

148. Dubois М.А.,Gilles J.К.»Hamilton P.A. Anal.Chem. 1956.28. 350-354.

149. Polch J.,Lees M.,Sloane G.H.,Stanley M. A simple methodfor the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J.Biol.Chem. . 1957. 226. N5. 497-502

150. Ленинджер АЛ. Митохондрия. M. Мир. 1964.226.№5.497-502.

151. Hehrle J.P., Jurkowitz M.,Scott K.M. Brierley G.P.2+

152. Mgfc and the permeability of heart mitochondria to monovalent cations.Archiv.Bioch-em.Biophys. 1976. 174. N2. 312-323.

153. Mitchell P. Moyle J. Translocation of some anions,cationsУand acids in rat liver mitochondria.Europ J.Biochem. 1969. 9« N1. 149т155.

154. Garlid V.D. Unmasking of mitochondrial exchanger.

155. Bi oc hem. Bi ophy с. Re s. С ommun. 1978.83.N4-.1450 -1456.

156. Brierley G.P.»Jurkowitz M.,Jung D.W. Osmotic Swelling ofheart mitochondria in acetate and chloride salts.Evidence for two pathways for cation uptake. Archiv.Biochem.Biophys. 1978.190.N1. 181-192.

157. Ляхович В. Мембранная организация и биохимическая функциямитохондрий и микросом. Автореферат докт. дисс. М. 1973.

158. Gomez-Puyou А.Т.,Gomez-Puyou М. Monovalent cations in mitochondrial oxidative phosphorylation. J. Bioenerg.Biomembranes.1977. 9. N1. 91-102.

159. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Biol.Rev. 1966. 41. 445-481.

160. Wieland 0.,Siess E.,Schulze-We thmar F.H.,Funcke H.G.,

161. Winton B. Active and inactive forms of pyruvate dehydrogenase in rat heart and kidney Effect of diabetes fasting and refeeding Archiv.Biochem.Biophys. 1971. 143. N2. 593601.

162. Harris R.A.,Mapes J.P.,Ochs R.S.,Grabb D.W.,Stopes L.

163. Hormonal control of hepatic lipogenesis ad vances experimental Med.Biol. V 111.Hormones and Energy Metabolism,ed D.M.Klachko,Plenum Press. N.Y.London. 17-42.

164. Killian H. Localanesthesic und lokala naesthetika. 1959*.1. Stuttgart.

165. Fritz I.B. Insulin actions on carbohydrate and lipid metabolism In Biochemical actions of hormones. G. Litwack ed vol.11. Acad.Press.New.York.London 1972.166-210.

166. Krahl M.E. The action of insulin on cells. Acad.Press.1. New.York. 1961.

167. Levine R.,Goldstein M.S. Recent Progr.Horm.Res. 1955.11343.362.

168. Ginsberg B.H. The insulin receptor: properties and regulation. In Biochemical actions of hormones, vol.17 Acad.Press. New York. San Francisco»London. 1977» 159-193.

169. Wicklmayr M.»Dietze G.»Mayer L. Evidence for an involvement of kinin liberation in the primary action of insulin on glucose uptake into skeletal muscle

170. Claus T.H., Pilkis S.J. Regulation by insulin of gluconeogenesis in isolated rat hepatocytes. Biochem. Biophys.Acta, 1976. 421. N2 2. 246-262.

171. Siddle K., Hales C.N. Biochem. J., 1974. 142. N2 1. 97-103.

172. Kisselbah A.H., Hope-Gill H., Vyde-Lingum N.91 Tulloch B.R.,

173. Clarke P.V., Eraser T.R. The role of calcium in insulin action. II. Effects of insulin andprocaine-hydrochloride on lypolysis. Hormone, Me tab.Res., 1974. 6. 357-364.

174. Severson D.L., Denton R.M., Bridges B.J., Handle P.J.

175. Calcium and magnesium ions as effectors of adipose-tissue pyruvate dehydrogenase phosphate phosphatase. BiochemVJ., 1976. 154. № 2. 209-223.

176. Martinetti G.V., Shlatz Iu, Reilly K. Insulin Action.

177. New York, Acad.Press, Fritz I.B. ed. 1972.207.

178. Kisselbah A.H., Clarke P.V., Vydelingum N., Hope-Gill H.,

179. Tulloch B.R., Fraser T.R. The role of calcium in insulin action. Eur.J.Clin.Invest., 1975. 5. N2 2. 339-349.

180. Hers H.G. The control of glycogen metabolism in the liver.

181. Ann.Rev.Biochem., 1976. 45. 167-181rf 243#) Williams T.F., Exton J.H., Friedmann N., Park C.R. Effectsof insulin and adenosine 3'5' monophosphate on К flux and glucose output in perfused liver. Amer.J.Physiol., 1971. 221. 1645.

182. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М., Медицина. . . -I960.

183. Ярошевский Ю.А. Тканевая чувствительность к инсулину и еёроль в патогенезе.сахарного диабета. Проблемы эндокринологии, 1980. ХХУТ, №5, 81*89.

184. Lipson L.G., Siegel Е., Wollheim С.В., Sharp W.G. Insulinrelease during fasting. Endocrinology, 1979« Ю5. № 3> 702-707.

185. Exton J.H., Harper S.C. Role of cyclic AMP in the actionsof catecholamines on hepatic carbohydratemetabolism. Advan.Cyclic Nucleotide Res., 1975» 248; - 5. 519-532.

186. Fain J.N. Biochemical aspects of drug and hormone action onadipose tissue. Pharmacol.Rev., 1973* 25« NS 1. 67-108.248 a. Kahn C.R., Goldfine I.D., Neville D.M., De Meyts P.

187. Alterations in insulin binding Induced by changes in vivo in the levels of of glucocorticoids and growth hormone. Endocrinology, 1977«103. NS 4. 1054-1066. --. 2+249« Carafoli E., Azzi A. Affinity of mitochondria for Ca .

188. Experientia. 1972, 28. NS 8. 906-908. 250. Rieser P. Insulin. Membranes and Metabolism* Williams and

189. Wilkins. Baltimore, 1967. 251* Cleave T.L. The Saccharine Disease. John Wright and Sons.1.d. Bristol, 1974. 252. Baumann G., Puavial G., Freinkel N., Domont L.AT,Metzger

190. Woods S.C., Porte D. Neural control of endocrine pancreas.

191. Physiol.Rev., 1974. 54. H2 3* 596-619.

192. Lamer J., Huany L.C., Brooker G., Murad F., , Inhibitor ofprotein kinase formed in insulin-treated muscle. Fed.Proc., 1974. IN 3. 330.

193. Larner J., Galasko G., Cheng K., De Paoli-Roach A.A.,

194. Huang L., Dagy P., Kellogy J. Generation by insulin of a chemical mediator that controls protein phosphorylation and dephosphor,ylation^ Science. 1979. 206. N2 4425. 1408-1410.

195. Popp D.A., Kiechle F.L., Kotagal N., Jarett L. Insulinstimulation of pyruvate dehydrogenase in an isolated plasma membrane mitochondrial mixture. J.Biol,Chem., 1980. 255. N2 16 . 7540-7543.

196. Селье Г. Концепция стресса, как мы ее представляем в 1976году. В кн. Новое о гормонах и механизме их . действия. Киев. "Наукова думка". 1977. 27-51.

197. Selye Н. Stress in health and. disease.Reading, Mass,1. Butterworths. 1976.

198. Litwack G., Singer S. Subcellular actions of glucocorticoids« In "Biochemical Actions of Hormones"* Ed. G.Litwack. vol. II. Acad.Press. New York, London. 1972. 114-158.

199. Kinney J«М., Feliy Ph. The Metabolic response to injuryand infection. In "Endocrinology" v.3. ed by L.J.De Groot. 1979. New York, San Francisko, London, 1963-1985*

200. ДардымовВ.А. Женьшень. Элеутерококк. Москва. Наука. 1976.

201. Porte D., Robertson R.R. Control of insulin secretion bycatecholamines, stress and the sympathetic nervous system. Fed.Proc., 1973. J32. № 7. 1792-1796.

202. Bauer W.E., Vigas S.N., Haist R.E., Drucker W.R. Insulinresponse during hypovolemic shock. Surgery.1969. 66. № 1. 80-88.

203. D.S. Serum insulin and growth hormone response to hemorrhagic shock. Endocrinology, 1971. 88.m 1. 138-143.

204. Ross H., Johnston I.D., Welborn T.A., Wright M.1.ncet. 1966. 2. № 2. 563-568.

205. Henderson M.J., Morgan H.E., Park C.R. Regulation of glucose uptake in muscle. IV. The effect of hypo-physectomy on glucose transport, phosphorylation and insulin sensitivity in the isolated perfused heart. J.Biol.Chrm., 1961. 236. № 2. 273-277.

206. Krahl M.E., Cori G, Adrenalectomy effects on insulin sensitivity. J.Biol.Chem., 1947. 170. N2 2. 607615.

207. Malchoff D.M., Livingston J.N., Lockwood D.H. Dexametasone effects on the insulin action on rat adipose tissue. Endocrinology. 1978. 102. 511-513« Abstracts.277« Уильяме P. ред. "Диабет" M., "Медицина". 1964.

208. Kimberg D.V., Goldstein S.A. Binding of calcium by livermitochondria, regulation by steroid hormones» J.Biol.Chem., 1966. 241. № 1» 95 99.

209. Smolenice. September, 17-20. 1972. Bratislava. 1973. 229-241.

210. Deavers D.R., Musacchia The function of glucocorticoidsin thermogenesis. Fed.Proc., 1979. ¿8. Ш 8. .2177-2188-». .

211. Saris N.E. Soc.Sci.Fennica Commentations.Biol., 1963. 1.28.

212. Haugaard N., Haugaard E., Nam Nea Lei. Accumulation of Gaions by rat liver mitochondria. Influence of ATP 2+

213. Mg and phosphate. Proc.Koninke Nider.Acad., 1969. 72. NS 1. 3-8.

214. Гайнутдинов M.X. Исследование регуляции транспорта.ионовкальция в митохондриях. Канд.диссертация. Ташкент, 1973.

215. Гайнутдинов М.Х., Салихов Р.С. , Туракулов Я.Х. Взаимодей-*ствие между интактными и поврежденными тироксином р.и Ca -Т митохондриями. В сб. "Митоховдрии", М., Наука, .1977, 67-70.

216. Katz A.M., Tada М., Kirchberger М. Control of calciumtransport in the myocardium by the cyclic AMP-protein kinase system. Advan.Cyclic.Nucleotide. Res., 1975. 5. № 3. 453-472.

217. Lee C.O., Fozzard H.A. J.Gen.Physiol., 1975.65. 695-706.

218. Friedmann N., Dambach G. Antagonistic effect of insulinon the glucagon elicited hyperpolarization of the liver. Abstracts Xl-th Intern.Сongres of Biochem., July 8-13, 1979. Toronto, 11-6-S154, 624.

219. Horwitz B.A. Cellular events underlying catecholamine-induced thermogenesis. Cation transport in brown adipocytes. Fed.Proc?, 1979. 38. 2170-2176.

220. Carafoli E., Tiozzo R., Luigli C., Grovetti F., Kratzing C.

221. Release of calcium from heart mitochondria. J.Moll.Cell.Cardiol., 1974. 6. N14. 361-371.

222. Brierley G.P., Passive permeability and energy-linked ionmovements in isolated heart mitochondria. Ann. N-Y. Acad.Sci., 1974. 22?. 398-411.

223. Entman M.L., Levey G.S., Epstein S.E. Mechanism of actionof epinephrine and glucagon on the canine heart: evidence for increase in sarcotubular calcium stores mediated by cyclic 3'5'-AMP. Circulation Res., 1969. 25. № 2. 429-438.

224. Fehmers M,C. Possible role of mitochondria in the relaxation of heart muscle. Fed.Europ.Biochem.Soc. Oslo, 1967. Abstracts, P 76.

225. Bloom S., Cancilla P.A. Myocytolysis and mitochondrialcalcification in rat Myocardium after low doses of isoproterenol. Amer.J.Pathol,, 1969. 54. ffi 3. 373-382.

226. Katz A.M. Physiol.Rev., 1970. 50. N1 1. 63-95.

227. Chance B. The energy-linked reaction of calcium withmitochondria. J.Biol.Chem., 1965. 243. 27292738.

228. Scarpa A*, Graziotts P. Mechanisms for intracellularcalcium regulation in heart. J.Gen.Physiol,, 1973. 62. 756-769.

229. Sordahl L.A. Effects of magnesium, ruthenium red and theantibiotic ionophore A-23187 on initial rates of calcium uptake and release by heart mitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 1974. 167. N2 1.

230. Solaro P.J,, Brigss F.M. In "Calcium binding proteins".

231. Drabikowska W., Strzelecka H., Carafoli E. eds. Elsevier Amsterdam. 1974. 587-594.

232. Schaffer S., Safer B., Williamson J.R. Investigation ofmitochondria function in the contraction-relaxation cycle of heart. FEBS Lett., 1972. 23. № 1. 125-129.

233. Muallem S., Karlish S.J. A simple rapid and efficientprocedure for purification of calmodulin from human red cells. FEBS Letters, 1979. 1p7. №1. 209-212.

234. Larsen F.L., Katz S., Roufogals B.D. Calmodulin regula- 342 2+ . tion of Ca transport in human erythrocytes,

235. Brooker G. Implications of cyclic nucleotide oscillationsduring the myocardial contraction cycle. Advan.Cyclic.Nucleotide.Res., 1975. 5. 435-452.

236. Mittnacht S., Sherman S.C., Farber J.L. Reversal of Ischemic mitochondrial dysfunction. J.Biol.Chem., 1979. 254. № 19. 9871-9878.

237. Jurkowitz M., Scott K.M., Altschuld R.A., Merola A.J.,

238. Rasmussen H., Tenenhouse A. Parathyroid hormone and calcitonin. In Biochemical Actions of Hormones. Ed. G.Litwack. Acad.Press. NvY. London. 1970.

239. Wasserman R.H., Kallfela F.A. Transport of calcium acrossbiological membranes, in Biological Calcification.Cellular and Molecular aspects. Ed. H. Schraer. New York. 1970. 106-201.- 343

240. Leninger A.L. Reversal of various types of mitochondrialswelling by ATP. J.Biol.Chem., 1959» 234-. Ni 9. 2^65-2471.

241. Pathol., 1969. 57. 539. 344« Wojtczak L., Lenimger A.L. Formation and disappearanceof an endogenous uncoupling factor during swelling and contraction of mitochondria. Biochem.Biophys.Acta., 1961. ¿1. N2 Ъ* 442-446.

242. Гайнутдинов M.X., ХалматоваЛ.Р., Анашкина О.В. Взаимо- .действие между интактными и поврежденными митохондриями при действии тироксина. ДАН УзССР, 1975. № 9. 57-59.

243. Davis В.J. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1964. 121. Ki 2. 404-408.

244. Гайнутдинов M.X. О межмитохондриальных взаимодействияхпри выходе ионов кальция из митохондрий. . В сб.: Биология и научно-технический прогресс. Пущино. 1974.

245. Гайнутдинов М.Х., Халматова Л.Р. Взаимодействие между интактными и поврежденными митохондриями в уело2+виях самопроизвольного выхода Са из митохондрий. Узб.биол.журнал, 1975. № I. 3-5.

246. Boime I., Smith Е.Е., Hunter F.E. The role of fattyacids in mitochondrial changes during liver ischemia, Arch.Biochem.Biophys. 1970. 139. Ж 2. 425-443.

247. Denton R.M., Halestrap A.P. Regulation of pyruvate metabolism in mammalian tissues. Essays Biochem., 1979. 15. 37-77.- 345

248. Brabec M.J., Gray R.H., Bernstein I.A. Restoration ofhepatic mitochondria during recovery from carbon tetrachloride intoxication. Biochem. Pharmacol., 1974. 23. № 23. 3227-3238.

249. Farber E. ATP and cell integrity. Fed.Proc., 1973. 32.1534-1541.

250. Гайнутдинов M.X., Гизатуллина 3.3., Лавина И.И., Гулямов

251. Туракулов Я.Х., Гизатуллина 3.3., Гайнутдинов М.Х., Гулямов Т.Д. Торможение глюконеогенеза в почках цитоплазматическим регулятором проницаемости -мембраны митохондрий. Бюлл.эксперим.биол.мед., 1981. № 3. 322-324.

252. Лоскутова З.Ф. Виварий. М., "Медицина", 1980. 92.

253. Shneider W. Isolation of mitochondria from rat liver.

254. J.Biol.Chem., 1948. 176. № 1. 250-253.

255. Кудзина Л.Ю. Действие катионов на окислительное фосфо^рилирование митохондрий печени крысы. Дисс. на соискание ученой степени канд.биол.наук. Пущино. 1970.

256. Brierley G.P., Jurkowitz М., Jung D.W. Osmotic swellingof heart mitochondria in acetate and chloride salts. Evidence for two pathways for cation uptake. Archiv.Biochem.Biophys., 1978. 190. № 1. 181—192.

257. Mitchell P., Moyle J. Estimation of membrane potentialin the rat liver mitochondria. Europ.J.Bio-chem., 1969. 9Y N? 1. 149-157.

258. Nishimura M., Ito Т., Chance B. Biochim.Biophys.Acta.,1962". 52. N2 1. 177-182.

259. Детерман.Г. "Гель^хроматография", M., Мир. 1970.

260. Дэвени Т., Гергей Я. "Аминокислоты, пептиды и белки",

261. М., Мир. 1976. 204^205. . .

262. Филлипошч Ю.Б. и др., "Практикум по общей биохимии". М.,1. Просвещение. 1975. 109.

263. Dubois М.А., Gilles J.K., Hamilton P.A. Annal.Chem.,1956. 28. 350. Описание метода по кн.: "Экспет* риментальная микробиология". София. 1965. 314.

264. Маурер Г. "Диск-Электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле". М., Мир. 1971.

265. Gerlach Е. Eine Einbache methode sur microbestimmung yonphosphat in der papierchromatographie. Bio-chem.J., 1963. 377» Ш 5. 477- 482.

266. Folch J., Lees M., Sloane G.HV, Stanley M. A simple me- 347 thod for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J.Biol.Chem. 1957. 226. Ж 5. 497-502.

267. Новицкая Г.В. " Методическое-руководство по тонкослойнойхроматографии фосфолипидов". М., 1962.

268. Lance D.L., Jones L.K.N. Gas chromatography of derivatives of the methyl ethers of D-xylose. Canad. J.Chem., 1967. 45. № 17. 1995-2000.

269. Ditterbrandt M. Amer.J.Clin.Path., 1948. 18. № 2. 439444.

270. Кабак Я.М. "Практикум.по эндокринологии", Издательство1. МГУ, 1968.

271. INSIK-1-M, Insulin Radioimmunoassay KIT. СЕА Sorin.

272. Carol N.V., Longley R.W., Roe J.H. Determination ofglycogen in liver and muscle by use of ant-rone reagent. J.Biol.Chem., 1956. 220. N2 2. 583-587.

273. Методические указания по применению унифицированных кли~нических лабораторных методов исследования. Под редакцией профф. В.В.Меньшикова. М., 1973. 59.