Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитомегаловирусная инфекция в аорте человека: распределение инфицированных клеток в сосудистой стенке в норме и при атеросклерозе

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Цитомегаловирусная инфекция в аорте человека: распределение инфицированных клеток в сосудистой стенке в норме и при атеросклерозе"

РГ6 од

На правах рукописи

00 $ еи^/г/^/тс

ПАМПУ Сергей Юрьевич

ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ В АОРТЕ ЧЕЛОВЕКА: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК В СОСУДИСТОЙ СТЕНКЕ В НОРМЕ И ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ

03.00.25 - Клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1999

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ

Научный руководитель

кандидат биологических наук В.Б. Быстревская

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Е.Р. Андреева

доктор биологических наук, профессор А.А. Кущ

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится < {jXjQfc-i/'^L 2000 года

на заседании диссертационнопУсовета Д 074.22.02 в Институте экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ

Автореферат разослан

Л

2000 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, цель и задачи работы. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции и в последнее время привлекает внимание исследователей не только как источник тяжелых осложнений у пациентов с ослабленным иммунитетом, но и как один из возможных факторов атерогенеза. Развитие атеросклероза, как показывают результаты эпидемиологических исследований, сопровождается повышением уровня нейтрализующих вирус антител. Поскольку у людей без клинических признаков инфекции геном ЦМВ присутствует в артериальной стенке, сложилось представление, что развитие атеросклероза может быть связано с частичной или полной реактивацией латентной инфекции в стенке сосуда. Эта гипотеза весьма привлекательна, так как позволяет объяснить природу локального повреждения сосудистой стенки при наличии системных нарушений обмена веществ, сопутствующих атерогенезу. Чрезвычайно важно в связи с этим получить ответ на вопрос - может ли вирус, персистирующий в стенке сосуда, играть роль фактора инициации или фактора прогрессии атеросклеротического поражения.

На сегодняшний день предположение о вовлечении цитомегаловирусной инфекции в атерогенез остается недоказанным. Установлено, что в стенке сосудов, содержащих атеросклеротические поражения, присутствуют клетки, экспрессирующие вирус-специфические белки. Однако отражает ли этот факт процесс реактивации латентной инфекции - неизвестно, так как сравнительное исследование сосудов человека до и после появления атеросклеротических поражений не проводилось. Таким образом, чтобы понять значение цитомегаловирусной инфекции в патогенезе атеросклероза необходимо выяснить, какие клетки составляют резервуар вирусной инфекции в макроскопически-нормальных сосудах, и изменяется ли уровень экспрессии вирусного генома в этих клетках с развитием атеросклеротического поражения.

Одним из важнейших аспектов проблемы атерогенеза является вопрос о механизме первичного повреждения сосудистой стенки при наличии системных нарушений обмена веществ в организме. Представители различных научных школ и направлений едины во мнении, что начальные этапы развития атеросклеротической бляшки скорее всего связаны с нарушением функций эндотелиального барьера. Природа предполагаемого повреждения эндотелия в ходе атерогенеза все еще неясна, и в этой связи чрезвычайно важно понять инфицирует ли ЦМВ клетки эндотелия артерий человека и каков уровень экспрессии вирусного генома в этих клетках в норме и при атеросклерозе.

Цель настоящей работы - проверить гипотезу о том, что развитие атеросклеротического поражения сосудов человека может быть связано с

реактивацией латентной инфекции в стенке сосуда. Чтобы определить, является ли цитомегаловирусная инфекция латентной или активной целесообразно оценивать содержание сверхранних вирусных белков, которые синтезируются первыми в ходе инфекционного цикла вируса и являются критически необходимыми для экспрессии ранних и поздних генов ЦМВ. Исходя из того, что отсутствие сверхранних белков есть признак латентной инфекции, мы попытались охарактеризовать процесс реактивации, оценивая, какая часть инфицированных клеток содержит продукты гена ie-1 ЦМВ на разных этапах атерогенеза. Мы предприняли сравнительное изучение частоты встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих сверхранний вирусный антиген (70-72кДа), в эндотелиальном слое и в толще стенки макроскопически-нормальных и пораженных аорт человека.

Итак, для проверки гипотезы о реактивации цитомегаповирусной инфекции в ходе атерогенеза необходимо решить следующие конкретные задачи:

1. Выяснить, присутствуют ли клетки, содержащие геном ЦМВ, в эндотелии макроскопически-нормальных аорт и аорт с признаками атеросклероза, и охарактеризовать распределение инфицированных эндотелиальных клеток в сосудах, различающихся по степени развития атеросклероза;

2. Выяснить, экспрессируют ли эндотелиальные клетки сверхранний вирусный антиген та аорте in situ, и сопоставить частоту встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих вирусный антиген, в макроскопически-нормальных'и пораженных аортах;

3. Провести сравнительный анализ частоты встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих сверхранний вирусный антиген, в субэндотелиальной интиме и медии макроскопически-нормальных и пораженных аорт.

Научная новизна работы. Впервые идентифицированы инфицированные ЦМВ эндотелиальные клетки в аорте человека, а также охарактеризовано распределение этих клеток в грудном отделе аорты. Показано, что инфицированные ЦМВ эндотелиальные клетки присутствуют в аорте человека до появления атеросклеротических поражений и сосредоточены в зонах высокого риска развития атеросклеротической бляшки, но подавляющее большинство бляшек лишено инфицированных эндотелиальных клеток. Впервые показано, что инфицированные эндотелиальные клетки макроскопически-нормальных и пораженных сосудов различаются по характеру экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ. Впервые показано, что в медии пораженных сосудов, в отличие от макроскопически-нормальных сосудов, присутствуют кластеры инфицированных клеток, содержащих сверхранний антиген ЦМВ.

Практическая ценность работы. Полученные данные позволяют рассматривать цитомегаловирусную инфекцию в качестве возможного фактора атерогенеза и таким образом расширяют существующие представления о патогенезе атеросклероза. Результаты исследования позволяют предполагать, что реактивация цитомегаловирусной инфекции в клетках эндотелия играет роль первичного повреждения сосудистой стенки при атеросклерозе, и могут в перспективе служить основой для разработки новых подходов в профилактике атеросклероза.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на XI Международной конференции по атеросклерозу (Paris, 1997), совместном Российско-Американском симпозиуме по сердечно-сосудистым заболеваниям (New Orleans, 1999), VI Международной конференции Скандинавского общества по изучению атеросклероза (Humlebaek, 1999), семинаре Московского общества по клеточной биологии (Москва, 1999), межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (1999).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 125 страницах и включает 9 рисунков, 14 таблиц и список литературы, содержащий 167 ссылок.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал исследования В качестве материала для исследований был использован грудной отдел аорты человека, полученный при срочном вскрытии людей, погибших в результате несчастного случая. Все изученные сосуды были охарактеризованы с точки зрения степени атеросклеротического поражения в соответствии с классификацией Совета по атеросклерозу Американского Общества по изучению сердца [Stary et al., 1994]. На основании указанной классификации исследованные сосуды были распределены на три группы, различающиеся по степени атеросклеротического поражения (сосуды, не содержащие выраженных атеросклеротических поражений; сосуды, содержащие жировые полосы, но не содержащие липофиброзных бляшек; сосуды, содержащие не только жировые полосы, но и липофиброзные бляшки). Исследованные сосуды были охарактеризованы также с точки зрения распределения жировых поражений и бляшек относительно ответвлений межреберных артерий. В большинстве пораженных сосудов, бляшки были локализованы исключительно вокруг ответвлений межреберных артерий, так что максимальное возвышение бляшки находилось в зоне радиусом 0,2-0,5 см вокруг ответвлений. Исходя из этого,

в дальнейшей работе особое внимание было уделено сравнительному изучению участков, находящимся в радиусе 0,5 см от ответвлений межреберных артерий (зоны высокого риска атеросклероза), и участков, удаленных от ответвлений межреберных артерий на большее расстояние (более чем 0,7-1 см).

Клеточные культуры и тканевые препараты стенки аорты В исследованиях была использована первичная культура эндотелиальных клеток аорты человека (ЭКА). Выделение клеток из сосуда проводили по стандартному методу [Antonov et al., 1986]. Культуры ЭКА использовали для экспериментов в течение первой недели после выделения из аорты. Перевиваемые культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ЭКПВ) и фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), инфицированных или неинфицированных ЦМВ AD 169, использовали в качестве контроля при проведении ПЦР, гибридизации in situ и иммуноцитохимического окрашивания вирусного белка.

Чтобы обнаружить инфицированные эндотелиальные клетки в аорте in situ, были приготовлены препараты интактного эндотелия аорты (ИЭА). Сосуд разрезали продольно и после короткой формальдегидной фиксации из макроскопически-нормальных участков, жировых полос и бляшек аорты вырезали фрагменты площадью 5 или 10 мм2. Тонкий слой интимы, обращенный в просвет сосуда, отделяли с помощью пинцета и использовали либо для проведения гибридизации in situ, либо для иммуноцитохимического окрашивания вирусного белка. Эндотелиальный слой на препаратах ИЭА визуализировали окрашиванием антителами к фактору фон Виллебранда или с помощью импрегнации серебром [Poole et al., 1958]. •

Из сосудов, использованных для приготовления препаратов ИЭА, были вырезаны также кусочки сосудистой стенки, которые были заключены в парафин рутинным способом.

Полимеразная цепная реакция Для определения нуклеотидных последовательностей ЦМВ использовали метод двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР, комплементарные к главному сверхраннему региону генома ЦМВ экзон 3 - экзон 4, были любезно предоставлены доктором Гнедым С.Н. (ИМГ РАН). 30 циклов полимеризации проводили на каждом из двух этапов ПЦР. В качестве положительного контроля ПЦР была проведена с использованием праймеров, амплифицирующих ген стероидной сульфатазы человека.

Гибридизация in situ

Гибридизацию in siiu проводили на культивируемых клетках, препаратах ИЭА и парафиновых срезах сосудистой стенки с использованием коммерческого биотинилированного зонда на ДНК ЦМВ (Enzo Diagnostics Inc).

Прегибридизационная обработка препаратов была проведена по метод)', описанному ранее |Schrier et а!.. 1985). Для идентификации инфицированных эндотелиальных клеток непосредственно перед процедурой гибридизации проводили иммуногистохимическое окрашивание антителами к фактору фон Виллсбранда. В качестве вторых использовали антитела, коньюгированными со щелочной фосфатазой. Связавшиеся антитела были визуализированы с помощью субстратного набора BCIP/NBT.

Процедуру гибридизащш in situ проводили по методу, описанному ранее [Brigati et я/., 1983]. Для визуализации связавшегося зонда использовали комплекс авидин - биотинилированная пероксидаза хрена. Связавшийся коньюгат в и зу ал и з иро ва л и с помощью субстратного набора АЕС. В некоторых случаях связавшийся зонд был визуализирован с помощью авидина, коньюгированного с ФИТЦ.

Специфичность сигнала гибридизации оценивали, сравнивая результаты гибридизации зонда на ДНК ЦМВ, полученные на неинфицированных и инфицированных ЦМВ клетках ФЛЭЧ. Клетки ФЛЭЧ были обработаны во всех деталях так же, как клетки культуры ЭКА. Для подтверждения специфичности гибридизационного сигнала на препаратах ИЭА, часть образцов в каждой из исследованных групп (макроскопически-нормальные участки, жировые полосы, бляшки) обрабатывали с исключением зонда на ДНК ЦМВ из гибридизационной смеси. В качестве позитивного контроля при проведении гибридизации на парафиновых срезах сосудистой стенки использовали парафиновые срезы сетчатой оболочки глаза, взятые при аутопсии от больных СПИДом, сопровождавшимся цитомегаловирусным ретинитом.

Иммуноцитохимическое окрашивание сверхраннего белка ЦМВ Наличие продуктов гена ie-1 ЦМВ в инфицированных клетках устанавливали с помощью иммуноцитохимического окрашивания коммерческими моноклональными антителами, распознающими сверхранние белки ЦМВ молекулярной массой 70-72кДа (Virostat). Антитела окрашивают ядра инфицированных ЦМВ клеток ФЛЭЧ на веем протяжении инфекционного цикла вируса.

Для обнаружения вирусного антигена в культуре ЭКА использовали метод непрямого двойного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител к вирусному белку и поликлональных антител к фактору фон Виллсбранда

Для обнаружения вирусного антигена на препаратах ИЭА был разработан метод комбинирования непрямого иммуноцитохимического окрашивания и импрегнации границ эндотелиальных клеток серебром. Сосуды были обработаны нитратом серебра перед приготовлением препаратов ИЭА. Затем препараты инкубировали с моноклональными антителами к вирусному полипептиду, козьими биотинилированными антителами к иммуноглобулинам мыши и комплексом авидин-биотинилированная пероксидаза хрена. После визуализации связавшегося коньюгата при помощи субстратного набора АЕС препараты обрабатывали стандартным метол-гидрохиноновым проявителем для выявления границ эндотелиальных клеток. Клетки ФЛЭЧ, неинфициро ванные и инфицированные ЦМВ. были использованы соответственно как негативный и позитивный контроль при разработке метода комбинирования непрямого иммуноферментного окрашивания и импрегнации клеток серебром. В качестве дополнительного позитивного контроля часть препаратов ИЭА была окрашена моноклональными антителами к а-тубулину и виментину.

Перед иммуноцитохимическим окрашиванием парафиновых срезов проводили обработку' пепсином и Triton Х-100. Связавшийся коньюгат визуализировали с помощью субстратного набора, содержащего АЕС. В качестве контроля неспецифического связывания антител клетки культуры ЭКА, препараты ИЭА и парафиновые срезы стенки аорты были обработаны иммуноглобулинами мыши, полученными от неиммунизированных животных.

Статистическая обработка данных В большинстве случаев достоверность различий между выборками была оценена при помощи непараметрического Т-критерия Манна-Уитни с поправкой Йейтса. В некоторых случаях достоверность различий устанавливали с помощью сравнения 95% доверительных интервалов для долей, вычисленных на основании биноминального распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация инфицированных ЦМВ эндотелиальных клеток в макроскопически-нормальной и пораженной аорте человека

Для того чтобы выяснить, присутствуют ли инфицированные ЦМВ эндотелиальные клетки в аортах человека, различающихся по степени атсросклеротического поражения, мы изучили первичные культуры эндотелиальных клеток аорты (ЭКА), полученные из макроскопически-нормальных сосудов и сосудов с признаками атеросклероза, при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации ДНК в условиях in situ.

При помощи ПЦР были тестированы культуры ЭКА. полученные из трех сосу дов Один из них (женщина. 35 лет) не содержал никаких видимых

поражений, а в двух других сосудах (мужчины 43 и 53 года) были обнаружены атеросклсротичсскис бляшки. Нуклеотидныс

последовательности ЦМВ были обнаружены как в культуре ЭКА. полученной из макроскопически-нормального сосуда, так и в культурах ЭКА. выделенных из пораженных сосудов.

Для того чтобы убедиться в эндотелиальной принадлежности клеток, содержащих геном ЦМВ, был использован метод комбинирования иммуноцитохимического окрашивания маркерного белка эндотелиальных клеток, фактора фон Виллебранда, и гибридизации ДНК в условиях in situ. С помощью этого метода были изучены культуры ЭКА, выделенные из сосудов 10 человек в возрасте от 16 до 73 лет (Таблица 1).

Таблица 1. Количество инфицированных ЦМВ эндотелиальных

клеток в первичных культурах ЭКА

Макроскопически-нормальные Пораженные сосуды

сосуды

Номер Возраст Пол Кол-во инф. Номер Возраст Пол Кол-во инф.

сосуда глеток (%) сосуда клеток (%)

1 16 Ж 5 6 33 Ж 2

2 42 М 10 7 35 Ж 30

3 44 Ж 0 8 41 м 10

4 50 м 0 9 45 Ж 5

5 62 м 8 10 73 м 5

Как показано в Таблице 1, инфицированные эндотелиалъные клетки были обнаружены в большинстве культур ЭКА, полученных из макроскопически-нормальных или пораженных сосудов, хотя общее число клеток, которое удавалось выделить из разных сосудов, варьировало в широких пределах. В эндотелиальных клетках, выделенных из макроскопически-нормальных сосудов, связавшийся зонд был сосредоточен в клеточном ядре, контуры которого видны благодаря интенсивному окрашиванию фактора фон Виллебранда в цитоплазме. Интересно, что в культурах, выделенных из сосудов с атеросклеротическими поражениями, как правило, присутствовали эндотелиалъные клетки, в которых связавшийся зонд был расположен не только в клеточном ядре, но и в цитоплазме.

С возрастом в артериях человека накапливаются многоядерные эндотелиальные клетки [Cotton and Wartnian, 1961]. Известно, что цитомегаловирусная инфекция способна индуцировать образование многоядерных клеток в культуре [Gamett, 1979]. Для того чтобы проверить, связано ли формирование многоядерных эндотелиальных клеток с цитомсгаловирусной инфекцией мы проанализировали культуры ЭКА. содержащие большое количество многоядерных клеток при помощи гибридизации in situ. Инфицированные эндотелиальные клетки были

обнаружены как в популяции одноядерных ЭКА, так и в популяции многоядерных ЭКА с примерно равной частотой. Доля инфицированных многоядерных клеток от общего числа многоядерных клеток составляла примерно 4% в одном из исследованных сосудов (женщина 46 лет) и около 8% в другом (мужчина 61 год). Вирусный геном был обнаружен как в части двуядерных клеток, так и в части клеток, содержащих от 6 до 15 ядер. Интересно, что как среди двуядерных клеток, так и среди клеток, содержащих пять и более ядер, были найдены клетки, в которых только часть клеточных ядер несла вирусный геном. По-видимому, многоядерные эндотелиальные клетки образуются в результате клеточного слияния, в котором инфицированные клетки участвуют наравне с неинфицированными клетками. В целом наши данные говорят о том, что процесс формирования многоядерных клеток как таковой, скорее всего не является следствием вирусной инфекции.

Тот факт, что связавшийся зонд на ДНК ЦМВ был обнаружен не только в ядре, но и в цитоплазме эндотелиальных клеток, заставляет предположить наличие транскриптов вирусной ДНК в этих клетках. Для того чтобы выяснить, способны ли эндотелиальные клетки, инфицированные ЦМВ в организме человека, синтезировать вирусные белки, мы проанализировали первичные культуры ЭКА с помощью двойного иммунофлуорссцентного окрашивания сверхраннего антигена ЦМВ и фактора фон Виллебранда. Были изучены культуры ЭКА, полученные из макроскопически-нормального сосуда (женщина 22 года) и двух сосудов с атеросклеротическими поражениями (мужчина 25 лет и женщина 45 лет). Мы обнаружили эндотелиальные клетки, содержащие вирусный антиген, только в культурах, полученных из пораженных сосудов. Интересно, что антитела, распознающие ядерный антиген ЦМВ, окрашивали кластер гранул или везикул в цитоплазме эндотелиальных клеток, тогда как клеточные ядра оставались неокрашенными. Характер иммуноцитохимического окрашивания эндотелиальных клеток говорит о том, что сверхранний белок ЦМВ (1Е-1) не транспортируется в клеточное ядро. Продукты гена ¿е-1 являются ДНК-связывающими белками и функционируют как факторы транскрипции, регулируя экспрессию более поздних вирусных генов. Учитывая характер окрашивания клеток эндотелия аорты человека можно предположить, что экспрессия вирусного генома в этих клетках ограничивается сверхранними генами ЦМВ.

Таким образом, исследуя первичные культуры ЭКА, мы обнаружили инфицированные ЦМВ эндотелиальные клетки как в макроскопически-нормальных, так и в пораженных аортах. Причем, по крайней мере, после выделения из сосуда эти клетки способны экспрессировать сверхранний вирусный антиген, который накапливается в цитоплазме, а не в ядре эндотелиальных клеток. Далее мы изучили закономерности распределения инфицированных эндотелиальных клеток в аорте т хИи.

Распределение инфицированных эндотелиальных клеток в аорте человека

Анализ распределения инфицированных эндотелиальных клеток был проведен с помощью гибридизации in situ на препаратах ИЭА площадью 10 мм2. В макроскопически-нормальных сосудах мы обнаружили инфицированные эндотелиальные клетки как в районах, прилегающих к ответвлениям межреберных артерий (зоны высокого риска атеросклероза), так и в других участках сосуда. Однако частота встречаемости инфицированных эндотелиальных клеток в зонах высокого риска атеросклероза была достоверно выше, чем в других участках сосудов (Таблица 2).

Таблица 2. Инфицированные эндотелиальные клетки в макроскопически-нормальных аортах (изучено 3 сосуда).

Зоны высокого риска Другие участки

атеросклероза

Возраст Пол Кол-во инф.ЭК Возраст Пол Кол-во инф.ЭК

21 Ж 20 21 Ж 3*

21 Ж 4 21 Ж 0*

21 Ж 9 21 Ж 6*

21 Ж 0 35 Ж 0*

35 Ж 25 35 Ж 0*

35 Ж 22 35 Ж 0*

50 м 35 50 м 4*

50 м 48 50 м 0*

50 м 0 50 м 1*

Достоверное отличие от зон высокого риска атеросклероза по количеству инфицированных эндотелиальных клеток, р < 0,05

В сосудах с признаками атеросклероза инфицированные эндотелиальные клетки были обнаружены как в макроскопически-нормальных, так и в пораженных участках. Но количество инфицированных эндотелиальных клеток, найденных в этих участках существенно различалось. Частота встречаемости инфицированных эндотелиальных клеток была наибольшей в жировых полосах и наименьшей в бляшках (Таблица 3).

Таблица 3. Инфицированные ЦМВ эндотелиальные клетки в аортах

с признаками атеросклероза (изучено 12 сосудов).

Нормальные участки Жировые полосы Липофиброзные бляшки

Возраст Пол Кол-во Возраст Пол Кол-во Возраст Пол Кол-во

инф.ЭК инф.ЭК инф.ЭК

29 М 3* 29 М 4 45 ж 2*

29 М 0* 29 М 0 45 ж 0+

33 М 5* 33 М 26 45 ж 0+

40 М 0* 40 М 20 50 М 3+

43 М 0* 43 м 0 50 М 0+

70 Ж 9* 47 м 0 50 М 0+

70 Ж 0* 70 Ж 5 50 М 0+

70 Ж 0* 70 Ж 31 55 м 0+

45 Ж 3* 45 ж 0 55 М 0+

45 Ж 0* 45 ж 0 55 м 0+

55 М 0* 55 м 2 57 м 0+

55 М 0* 55 М 0 57 м 0+

55 М 0* 57 М 35 58 м 5+

57 М 0* 57 м 9 58 м 0+

57 М 0* 58 М 11 65 м 0+

58 М 5* 58 М 3 65 м 0+

58 М 0* 65 М 5 65 м 0+

"■достоверное отличие от жировых полос по количеству инфицированных клеток, р < 0,05

+ достоверное отличие от жировых полос по количеству инфицированных клеток, р < 0,01

Таким образом, анализируя большие площади эндотелиального монослоя на препаратах ИЭА мы обнаружили, что инфицированные эндотелиальные клетки распределяются неравномерно как в макроскопически-нормальных, так и в пораженных аортах. В нормальных сосудах инфицированные клетки сосредоточены в зонах высокого риска атеросклероза, а в пораженных аортах - в участках ранних атеросклеротических поражений (жировые полосы). Поздние атеросклеротические поражения (бляшки), как правило, лишены инфицированных эндотелиальных клеток. Далее мы попытались ответить на вопрос, способны ли инфицированные эндотелиальные клетки экспрессировать сверхранний вирусный антиген в аорте in situ.

Сверхранний антиген ЦМВ в эндотелиальных клетках аорты in situ.

Для того чтобы выяснить, способны ли инфицированные эндотелиальные клетки экспрессировать сверхранний антиген ЦМВ в интактном сосуде, мы провели иммуноцитохимическое окрашивание препаратов ИЭА, используя метод импрегнации клеточных границ для

визуализации эндотелиального слоя. Были проанализированы те участки аорты, в которых при помощи гибридизации in situ было обнаружено максимальное количество инфицированных эндотелиальных клеток, а именно - зоны высокого риска развития атеросклероза в макроскопически-нормальных сосудах и жировые полосы - в пораженных. Как и при окрашивании эндотелия аорты в культуре, в клетках интактного эндотелиального слоя вирусный антиген был обнаружен в виде скоплений гранул. Докрашивание препаратов гематоксилином показало, что антиген-позитивные гранулы расположены в цитоплазме, а не в ядре эндотелиальных клеток. На препаратах ИЭА площадью 5 мм2 обычно содержалось не более 5 клеток, экспрессирующих сверхранний вирусный антиген. Сравнивая макроскопически-нормальные сосуды и сосуды, содержащие атеросклеротические поражения, мы обнаружили, что в последних частота встречаемости инфицированных клеток, экспрессирующих сверхранний вирусный антиген, достоверно выше (Таблица 4).

Таблица 4. Наличие эндотелиальных клеток, содержащих сверхранта! антиген ЦМВ, в макроскопически-нормальных и пораженных аортах.

Макроскопически-нормальные аорты Пораженные аорты

Номер Возраст Пол Кол-во Номер Возраст Пол Кол-во

сосуда фрагментов с сосуда фрагментов с

инф. ЭК инф. ЭК

1 39 М 0(9) 5 31 М 0(5)*

2 42 М 0(7) 6 40 М 3(9)*

j 43 М 0(8) 7 51 М 2 (6)*

4 47 М 3(7) 8 57 М 7(10)*

9 70 М 3 (9)*

* достоверное отличие от макроскопически-нормальных сосудов по количеству фрагментов, содержащих инфицированные эндотелиальные клетки, р < 0,05.

Суммарные результаты изучения эндотелия аорты в культуре и на препаратах ИЭА при помощи гибридизации in situ или иммуноцитохимического окрашивания вирусного антигена представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Наличие эндотелиалъных клеток, содержащих геном или антиген ЦМВ, в макроскопически-нормальных аортах и в аортах с признаками атеросклероза.

Макроскопически-нормальные Сосуды с признаками атеросклероза

сосуды

Геном ЦМВ Антиген ЦМВ Геном ЦМВ Антиген ЦМВ

Возраст Пол Инф. ЭК Возраст Пол Инф. ЭК Возраст Пол Инф. ЭК Возраст Пол Инф. ЭК

16 Ж + 22 Ж — 29 М + 25 М +

21 Ж + 39 М - 33 М + 31 м +

35 Ж + 42 М — 33 ж + 40 м —

42 М 4- 43 М — 35 ж + 45 ж +

44 ж - 47 М + 40 М + 51 м +

50 М + 41 М + 57 м +

50 М - 42 М + 70 м +

62 М + 43 М -

45 Ж +

45 Ж +

47 М -

50 М +

55 М +

57 М +

58 м +

65 м +

70 ж +

73 м +

Как следует из Таблицы 5, эндотелиальные клетки, содержащие геном ЦМВ, присутствуют в подавляющем большинстве как макроскопически-нормальных сосудов, так и сосудов с признаками атеросклероза. Однако, эндотелиальные клетки, содержащие вирусный антиген значительно чаще были найдены в сосудах с атеросклеротическими поражениями. Полученные результаты заставляют предполагать, что инфицированные клетки макроскопически-нормальных сосудов, в отличие от пораженных сосудов, не экспрессируют сверхранний вирусный антиген. Для того чтобы проверить это предположение, мы предприняли исследование частоты встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих вирусный антиген, на парафиновых срезах одного и того же сосуда.

Сравнительный анализ частоты встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих сверхранний антиген ЦМВ. в эндотелии аорты человека.

Чтобы оценить количественное соотношение между инфицированными эндотелиальнымн клетками, экспрессирующими и неэкспрессирующими вирусный антиген, в одном и том же сосуде, мы изучили частот}' встречаемости клеток, содержащих геном ЦМВ, и частоту встречаемости клеток, содержащих вирусный антиген, в залитых в парафин кусочках сосудистой стенки. Для этого были использованы фрагменты стенки 9 аорт, на препаратах интактного эндотелия которых ранее мы обнаружили вирусный геном. Срезы каждого залитого в парафин образца сосудистой стенки случайным образом распределяли на две группы, одну из которых использовали для проведения гибридизации in situ, а вторую - для иммуноцитохимического окрашивания сверхраннего вирусного антигена.

Исследуя парафиновые срезы макроскопически-нормальных сосудов, мы нашли вирусный геном в клетках люминальной поверхности фрагментов из зон высокого риска атеросклероза, но ни в одном из этих фрагментов мы не обнаружили клетки, содержащие вирусный антиген (Таблица 6).

Таблица 6. Наличие инфицированных эпдотелиалъных клеток в зонах

Возраст Пол Геном ЦМВ Антиген ЦМВ

Кол-во срезов с инф. ЭК (общее число срезов)

21 Ж 3(10) 0(20)

35 Ж 5(10) 0(30)

50 М 1(20) 0 (40)

2 9(40) 0 (90)*

* Достоверное отличие от результатов гибридизации in situ по количеств}' срезов, содержащих инфицированные клетки (р < 0,05).

Клетки, содержащие сверхранний антиген, были найдены только на люминальной поверхности пораженных сосудов. Характер окрашивания сверхраннего антигена ЦМВ на парафиновых срезах в клетках, расположенных на люминальной поверхности аорты, был тот же, что и при использовании культивируемых эндотелиальных клеток или препаратов ИЭА, а именно, - в этих клетках были видны окрашенные гранулы. Следует отметить, что на случайных срезах жировых полос инфицированные клетки встречались гораздо реже, чем в зонах высокого риска атеросклероза нормальных сосудов, что соответствует результатам, полученным при изучении препаратов ИЭА (сравните Таблицы 2 и 3). При этом, вирусный антиген был обнаружен в клетках люминальной поверхности пораженных сосудов с такой же частотой, как и вирусный геном (Таблица 7).

Таблица 7. Наличие инфицированных эндотелиапьных клеток на срезах

пораженных аорт.

Возраст Пол Геном ЦМВ Антиген ЦМВ

Кол-во срезов с инф. ЭК (общее число срезов)

29 М 0 (20) 0(20)

33 М 0 (20) 2 (20)

70 М 3(30) 0 (30)

45 Ж 2 (20) 3(20)

55 М 0 (20) 0 (20)

57 м 0 (20) 0 (20)

Таким образом, в макроскопически-нормальных сосудах эндотелиальные клетки, содержащие вирусный геном, встречаются достоверно чаще, чем клетки, содержащие вирусный антиген, тогда как в пораженных сосудах вероятность различия в частоте встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих вирусный антиген, ничтожно мала. Полученные результаты показывают, что подавляющее большинство инфицированных эндотелиальных клеток макроскопически-нормальных сосудов не содержит сверхранний вирусный антиген, по крайней мере, в том количестве, которое может быть обнаружено с помощью иммуноцитохимического окрашивания. По-видимому, цитомегаловирусная инфекция в эндотелии макроскопически-нормальных сосудов находится в большинстве случаев в латентном состоянии и включение экспрессии гена ¡е-1 ЦМВ в этих клетках (реактивация инфекции) сопровождает развитие атеросклероза аорты. Так как мы нашли вирусный антиген в эндотелии по крайней мере одного нормального сосу да, можно предполагать, что реактивация латентной инфекции в эндотелиальных клетках может быть самым ранним изменением в сосудистой стенке в ходе атерогенеза.

Далее мы охарактеризовали частоту встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих вирусный антиген, в субэндотелиалъной интиме и в медии макроскопически-нормальных и пораженных аорт человека.

Сравнительный анализ частоты встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, и клеток, содержащих сверхранний антиген ЦМВ. в субэндотелиальной интиме и медии аорты человека При изучении парафиновых срезов стенки аорты инфицированные клетки были обнаружены в толще интимы и в медии как макроскопически-нормальных, так и пораженных сосудов.

В макроскопически-нормальных сосудах с помощью гибридизации ш я/и геном ЦМВ был обнаружен в одиночных клетках, расположенных

случайным образом в субэндотелиалъной интиме и в медии. В толще интимы мы находили примерно одну инфицированную клетку на 10 срезов, а в медии - одну клетку на 2 - 3 среза. Частота встречаемости инфицированных клеток была одинакова в участках нормальных сосудов, различающихся по степени риска атеросклероза. Хотя вирусный геном был обнаружен в субэндотелиальной интиме и в медии подавляющего большинства фрагментов макроскопически-нормальных сосудов, мы не нашли клетки, содержащие сверхранний вирусный антиген, в этих же фрагментах сосудистой стенки, используя метод иммуноцитохимического окрашивания (Таблица 8).

Таблица 8. Геном и сверхранний антиген ЦМВ в клетках субэндотелиальной интимы и медии макроскопически-нормальных аорт._

Возраст Пол Геном ЦМВ Антиген ЦМВ

Локализация Число срезов с инф. Локализация Число срезов с инф.

инф. клеток клетками (общее инф. клеток клетками (общее

интима / медия число срезов) интима / медия число срезов)

21 Ж + / + 4(20) -/- 0(30)

35 Ж + / + 9(30) 0(40)

50 М + / + 8(30) 0(30)

21 (80) 0(100)*

* Достоверное отличие от результатов гибридизации ¡п .ъш по количеству срезов, содержащих инфицированные клетки (р < 0,02).

В пораженных сосудах как и в макроскопически-нормальных сосудах при помощи гибридизации in situ были найдены одиночные инфицированные клетки, расположенные случайным образом в интиме и медии. Причем частота встречаемости одиночных инфицированных клеток была одинаковой в участках, различающихся по степени атеросклеротического поражения. В отличие от макроскопически-нормальных сосудов, в пораженных сосудах с помощью гибридизации in situ помимо одиночных инфицированных клеток были найдены также кластеры инфицированных клеток, располагающиеся в медии. Иммуноцитохимическое окрашивание срезов тех же фрагментов пораженных сосудов показало, что клетки в составе кластеров содержат сверхранний вирусный антиген в клеточном ядре. Одиночные антиген-позитивные клетки не были обнаружены (Таблица 9).

Таблица 9. Геном и сверхранний антиген ЦМВ в клетках субзнОотелиачыюй интимы и медии пораженных аорт._

Возраст Пол Геном ЦМВ Антиген ЦМВ

Локализация Число срезов с ииф. Локализация Число срезов с инф.

ииф. клеток1 клетками (общее инф. клеток1 клетками (общее

интима 1 медия число срезов) ингима медия число срезов)

33 М -/ + 3(10) -/- 0 (20)

70 Ж + / + 4(20) -/- 0 (20)

45 ж (+/+) 8(40) (+/+) 9(60)

55 м (+/+) 10 (20) (+/+) 4(30)

57 м (+/+) 15 (30) (+/+) 6(40)

Скобками обозначены кластеры инфицированных клеток

Интересно, что кластеры антиген-позитивных клеток были найдены в ранних атеросклеротических поражениях (макроскопически-нормальные участки с сильным утолщением интимы и жировые полосы), но не обнаружены в липофиброзных бляшках тех же сосудов (Таблица 10).

Таблица 10. Сверхранний антиген ЦМВ в клетках субэндотелиальной интимы и медии аорты в участках с ранними атеросклеротическими поражениями и в липофиброзных бляшках._

Возраст Пол Ранние атеросклеротические поражения Число срезов с инф. клетками (общее число срезов) Липофиброзные бляшки Число срезов с инф. клетками (общее число срезов)

45 ж 9(50) 0 (40)

55 М 4(30) 0 (40)

57 М 6(30) 0(30)

Е 19 (110)* 0(110)

* Достоверное отличие от липофиброзных бляшек по количеству срезов, содержащих инфицированные клетки (р < 0,05).

Полненные результаты показывают, что подавляющее большинство инфицированных клеток в субэндотелиальной интиме и медии макроскопически-нормальных сосудов не содержит сверхранний вирусный антиген, по крайней мерс, в том количестве, которое может быть обнаружено с помощью иммуноцитохимичсского окрашивания. Наши данные, таким образом, позволяют предполагать взаимосвязь между появлением в толще сосудистой стенки кластеров инфицированных клеток, экспрессирующих вирусные белки, и развитием атеросклероза. Тот факт, что сверхранний антиген ЦМВ локализован в ядре инфицированных клеток, формирующих кластеры в стснкс аорты, говорит о том. что в этих клетках

огут быть экспрессированы также ранние и, возможно, поздние ирусные гены. Не исключено, что формирование кластеров антиген-озитивных клеток является результатом появления продуцирующей вирус летки (клеток) в данном участке сосудистой стенки. Так как мы нашли ластеры клеток, содержащих вирусный антиген, только в пораженных эсудах, вновь становится актуальным вопрос о том, связано ли развитие геросклеротических поражений с распространением инфекции в граниченных зонах сосудистой стенки.

Заключение

Результаты, представленные в настоящей работе, согласуются с ипотезой о том, что реактивация латентного вируса в стенке артерий опровождает формирование атеросклеротических поражений. Наши анные позволяют предположить, что накопление продуктов гена ¡е-1 ЦМВ эндотелиальных клетках может быть самым ранним изменением в осудистой стенке в ходе атерогенеза. Можно предполагать далее, что акопление сверхраннего антигена ЦМВ в эндотелиальных клетках и юрмирование в глубоких слоях стенки артерии кластеров антиген-озитивных клеток сопровождают ранние стадии атеросклероза, но эти )акторы инактивируются в ходе роста бляшки. Необходимы дальнейшие [сследования, чтобы ответить на вопрос о том, связан ли процесс юрмирования атеросклеротической бляшки с развитием иммунной оспалительной реакции, направленной на уничтожение очага реактивации ирусной инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Инфицированные цитомегаловирусом эндотелиальные клетки присутствуют в аорте подавляющего большинства взрослых людей независимо от возраста и степени развития атеросклероза.

2. Как в макроскопически-нормальных, так и в пораженных аортах инфицированные эндотелиальные клетки распределены неравномерно. В макроскопически-нормальных аортах инфицированные эндотелиальные клетки сосредоточены в участках, прилегающих к ответвлениям межреберных артерий, а в пораженных аортах - на поверхности жировых полос. Подавляющее большинство атеросклеротических бляшек не содержат инфицированных эндотелиальных клеток.

3. В большинстве макроскопически-нормальных аорт инфицированные эндотелиальные клетки не содержат сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1) в количестве достаточном для обнаружения с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Однако в подавляющем большинстве пораженных аорт присутствуют эндотелиальные клетки, содержащие сверхранний вирусный антиген.

4. В макроскопически-нормаЛьных и в пораженных аортах, содержащих инфицированные эндотелиальные клетки, одиночные инфицированные клетки также присутствуют в субэндотелиальной интиме и в медии. Эти клетки распределяются равномерно в стенке аорты независимо от степени атеросклеротического поражения сосуда. В медии пораженных сосудов помимо одиночный .инфицированных клеток присутствуют компактные кластеры инфицированных клеток.

5. Как в макроскопически-нормальных аортах, так и в аортах с атеросклеротическими поражениями, одиночные инфицированные клетки, находящиеся в субэндотелиальной интиме и медии, не содержат сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1) в количестве достаточном для обнаружения с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Только клетки, располагающиеся в виде кластеров в медии пораженных сосудов, содержат сверхранний антиген ЦМВ в клеточном ядре.

6. Кластеры клеток, экспрессирующих сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1), находятся в медии макроскопически-нормальных участков и жировых полосах пораженных сосудов, однако подавляющее большинство атеросклеротических бляшек лишены инфицированных клеток, содержащих продукты гена ¡е-1 в количестве достаточном для определения иммуноцитохимическим методом.

7. Предполагается, что ранние этапы атерогенеза сопровождаются запуском синтеза сверхраннего вирусного антигена в инфицированных клетках эндотелия и формированием кластеров антиген-позитивных клеток в глубоких слоях стенки сосуда, но развитие атеросклеротической бляшки идет на фоне подавления очагов реактивации вирусной инфекции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Smirnov V.N., Bystrevskaya V.B., Pampou S.Yu., Chazov E.I., Melnick J.L., DeBakey M.E. Cytomegalovirus infection of human aortic endothelium. Atherosclerosis, 1997, 134, p283.

2. Пампу С.Ю., Быстревская В.Б., Смирнов B.H., Мелник Дж.Л., Дебекки М.Е. и Чазов Е.И. Цитомегаловирус в эндотелии аорты человека. «Ангиология и сосудистая хирургия», 1999, 5, стр. 137-150.

3. Пампу С.Ю., Быстревская В.Б., Смирнов В.Н., Мелник Дж.Л., Дебекки М.Е. и Чазов Е.И. Сверхранний антиген цитомегаловируса в клетках различных слоев аорты человека, «Кардиология», 1999 (статья прошла рецензирование и находится в печати).

4. Pampou S.Yu., Gnedoy S.N., Bystrevskaya V.B., Smirnov V.N., Chazov E.I., Melnick J.L., DeBakey M.E. Cytomegalovirus genome and the immediate-early antigen in different layers of human aorta, "Virchows Archiv", 1999 (статья прошла рецензирование и находится в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пампу, Сергей Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атеросклероз. Современные представления об атерогенезе

1.1. Атеросклероз и его клинические проявления

1.2. Краткая характеристика атеросклеротических поражений

1.3. Представления о патогенезе атеросклероза

2. Цитомегаловирус человека

2.1. Общая характеристика

2.2. Цитомегаловирусная инфекция в клеточных культурах

2.3. Цитомегаловирусная инфекция в организме человека

2.4. Взаимодействие ЦМВ и иммунной системы хозяина

2.4.1. Иммунный ответ на цитомегаловирусную инфекцию

2.4.2. Как ЦМВ удается избегать иммунной атаки?

3. Вирусная гипотеза атеросклероза

3.1. Возникновение вирусной гипотезы. Сведения, полученные в 23 экспериментах с животными

3.2. Геном ЦМВ в стенке магистральных артерий человека

3.3. Цитомегаловирусная инфекция и ускоренный атеросклероз

3.4. Связан ли патогенез атеросклероза с реактивацией латентной 28 цитомегаловирусной инфекции?

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитомегаловирусная инфекция в аорте человека: распределение инфицированных клеток в сосудистой стенке в норме и при атеросклерозе"

Цитомегаловирусная инфекция чрезвычайно широко распространена в человеческой популяции и в последнее время привлекает внимание исследователей не только как источник тяжелых осложнений у пациентов с ослабленным иммунитетом, но и как один из возможных факторов атерогенеза. Развитие атеросклероза, как показывают результаты эпидемиологических исследований, сопровождается повышением уровня нейтрализующих вирус антител. Поскольку у людей без клинических признаков инфекции геном цитомегаловируса присутствует в артериальной стенке, сложилось представление, что развитие атеросклероза может быть связано с частичной или полной реактивацией латентной инфекции в стенке сосуда. К настоящему времени накопилось достаточно много данных, косвенно подтверждающих это предположение, однако прямые доказательства до сих пор отсутствуют. Остается открытым вопрос о возможности активации полного цикла вирусной инфекции в сосудистой стенке, так как попытки выделить инфекционный вирус из артериальной ткани не привели к успеху. Возможность активации экспрессии части вирусных генов в ходе атерогенеза также остается под вопросом. Белки, кодируемые ранними генами цитомегаловируса, были обнаружены в клетках стенки сосудов, содержащих атеросклеротические поражения, однако уровень экспрессии вирусного генома в инфицированных клетках макроскопически-нормальных сосудов остается неизвестным.

Одним из важнейших аспектов проблемы атерогенеза является вопрос о механизме первичного повреждения сосудистой стенки при наличии системных нарушений обмена веществ в организме. Представители различных научных школ и направлений едины во мнении, что начальные этапы развития атеросклеротической бляшки скорее всего связаны с нарушением функций эндотелиального барьера. Природа предполагаемого повреждения эндотелия в ходе атерогенеза все еще неясна, и в этой связи чрезвычайно важно понять инфицирует ли цитомегаловирус клетки эндотелия артерий человека и каков уровень экспрессии вирусного генома в этих клетках в норме и при атеросклерозе.

Таким образом, чтобы понять значение цитомегаловирусной инфекции в патогенезе атеросклероза необходимо выяснить, какие клетки составляют резервуар вирусной инфекции в макроскопически-нормальных сосудах, и изменяется ли уровень экспрессии вирусного генома в этих клетках в ходе атерогенеза. Чтобы определить, является ли цитомегаловирусная инфекция латентной или активной целесообразно оценивать экспрессию сверхранних вирусных антигенов, которые синтезируются первыми в ходе инфекционного цикла вируса и являются критически необходимыми для экспрессии последующих вирусных белков. До настоящего времени сравнительный анализ макроскопически-нормальных и пораженных сосудов по количеству инфицированных клеток, содержащих и несодержащих (латентная инфекция) сверхранние белки цитомегаловируса, не проводился. В целях проверки предположения о реактивации латентной цитомегаловирусной инфекции в ходе атерогенеза мы изучили частоту встречаемости клеток, содержащих вирусный геном, в эндотелиальном слое и в глубоких слоях стенки аорты человека и проанализировали, какая часть инфицированных клеток содержит сверхранний вирусный антиген в макроскопически-нормальных и пораженных сосудах.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Пампу, Сергей Юрьевич

выводы

1. Инфицированные цитомегаловирусом эндотелиальные клетки присутствуют в аорте подавляющего большинства взрослых людей независимо от возраста и степени развития атеросклероза.

2. Как в макроскопически-нормальных, так и в пораженных аортах инфицированные эндотелиальные клетки распределены неравномерно. В макроскопически-нормальных аортах инфицированные эндотелиальные клетки сосредоточены в участках, прилегающих к ответвлениям межреберных артерий, а в пораженных аортах - на поверхности жировых полос. Подавляющее большинство атеросклеротических бляшек не содержат инфицированных эндотелиальных клеток.

3. В большинстве макроскопически-нормальных аорт инфицированные эндотелиальные клетки не содержат сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1) в количестве достаточном для обнаружения с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Однако в подавляющем большинстве пораженных аорт присутствуют эндотелиальные клетки, содержащие сверхранний вирусный антиген.

4. В макроскопически-нормальных и в пораженных аортах, содержащих инфицированные эндотелиальные клетки, одиночные инфицированные клетки также присутствуют в субэндотелиальной интиме и в медии. Эти клетки распределяются равномерно в стенке аорты независимо от степени атеросклеротического поражения сосуда. В медии пораженных сосудов помимо одиночных инфицированных клеток присутствуют компактные кластеры инфицированных клеток.

5. Как в макроскопически-нормальных аортах, так и в аортах с атеросклеротическими поражениями, одиночные инфицированные клетки, находящиеся в субэндотелиальной интиме и медии, не содержат сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1) в количестве достаточном для обнаружения с помощью иммуноцитохимического окрашивания.

107

Только клетки, располагающиеся в виде кластеров в медии пораженных сосудов, содержат сверхранний антиген ЦМВ в клеточном ядре. 6. Кластеры клеток, экспрессирующих сверхранний антиген ЦМВ (1Е-1), находятся в медии макроскопически-нормальных участков и жировых полосах пораженных сосудов, однако подавляющее большинство атеросклеротических бляшек лишены инфицированных клеток, содержащих продукты гена г'е-7 в количестве достаточном для определения иммуноцитохимическим методом.

Предполагается, что ранние этапы атерогенеза сопровождаются запуском синтеза сверхраннего вирусного антигена в инфицированных клетках эндотелия и формированием кластеров антиген-позитивных клеток в глубоких слоях стенки сосуда, но развитие атеросклеротической бляшки идет на фоне подавления очагов реактивации вирусной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, представленные в настоящей работе, согласуются с идеей о том, что реактивация латентного вируса в стенке артерий сопровождает формирование атеросклеротических поражений. Наши данные позволяют предположить, что включение экспрессии гена ге-1 в инфицированных эндотелиальных клетках может быть самым ранним изменением в сосудистой стенке в ходе атерогенеза. Исходя из наших результатов, можно предполагать, что накопление сверхраннего антигена ЦМВ в эндотелиальных клетках и формирование в глубоких слоях стенки артерии кластеров клеток, содержащих вирусный антиген, сопровождают ранние стадии атеросклероза, но эти факторы инактивируются в ходе роста бляшки. Можно надеяться, таким образом, что дальнейшая информация о закономерностях экспрессии генома ЦМВ в клетках сосудистой стенки позволит получить более ясное понимание роли иммунологических факторов в этиологии и патогенезе атеросклероза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пампу, Сергей Юрьевич, Москва

1. Аничков НН (1965): Основные сведения об атеросклерозе артерий // в кн. Заболевания артерий, М., Знание, 1965, стр. 9-17

2. Мясников AJI (1956): Классификация атеросклероза // в кн. Атеросклероз и коронарная недостаточность, п.ред. Аничкова НН, Мясникова AJI, М., Медгиз, 1956,стр. 105-115

3. Репин ВС (1992): Атеросклероз // в кн. Болезни сердца и сосудов в 4 т., п.ред. Чазова ЕИ, М., Медицина, 1992, Т. 2, стр. 136-155

4. Adam Е, Melnick JL, Probtsfield JL, Petrie BL, Burek J, Bailey KR, McCollum CH, DeBakey ME (1987): High levels of cytomegalovirus antibody in patients requiring vascular surgery for atherosclerosis // Lancet, ii, p. 291-293

5. Albrecht T, Cavallo T, Cole NL, Graves К (1980): Cytomegalovirus: development and progression of cytopathic effects in human cell culture // Lab Invest, v. 42, p. 1-7

6. Alford CA, Britt WJ (1985): Cytomegalovirus // Virology (eds. Fields BN, Knipe DM, Chanrock RM, Hirsh MS, Melnick JL, Monath TP, Roizman B), Raven, NY, p. 629 660

7. Augsburger JJ, Henry RY (1978): Retinal aneurysms in adult cytomegalovirus retinitis // Am J Ophthalmol, v. 86, p. 794-797

8. Bancroft GJ, Shellam GR, Chalmer JE (1981): Genetic influences on the augmentation of natural killer (NK) cells during murine cytomegalovirus infection: correlation with patterns of resistance // J Immunol, v. 126, p. 988-994

9. Barnes PD, Grundy JE (1992): Down-regulation of the class I HLA heterodimer and beta 2-microglobulin on the surface of cells infected with cytomegalovirus // J Gen Virol, v. 73, p. 2395-2403

10. Beck S; Barrell BG (1988): Human cytomegalovirus encodes a glycoprotein homologous to MHC class-1 antigens // Nature, v. 331, p. 269-272

11. Beninga J, Kropff B, Mach M (1995): Comparative analysis of fourteen individual human cytomegalovirus proteins for helper T cell response // J Gen Virol, v. 76, p. 153-160

12. Benditt EP (1974): Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaques and some implications // Circulation, v. 50, p. 650-652

13. Berencsi K, Endresz V, Klurfeld D, Kari L, Kritchevsky D, Gonczol E (1998): Early atherosclerotic plaques in the aorta following cytomegalovirus infection of mice // Cell Adhes Commun, v. 5, p. 39-47

14. Beschorner WE, Hutchins GM, Burns WH, Saral R, Tutschka PJ, Santos GW (1980): Cytomegalovirus pneumonia in bone marrow transplant recipients: miliary and diffuse patterns // Am Rev Respir Dis, v. 122, p. 107-114

15. Borysiewicz LK, Morris S, Page JD, Sissons JG (1983): Human cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes: requirements for in vitro generation and specificity // Eur J Immunol, v. 13, p. 804-809

16. Brigati DJ, Myerson D, Leary JJ, Spalholz B, Travis SZ, Fong CKY, Hsiung GD, Ward DC (1983): Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin embedded tissue sections using biotin labelled hybridization probes // Virology, v. 126, p. 32-50

17. Browne H, Smith G, Beck S, Minson T (1990): A complex between the MHC class I homologue encoded by human cytomegalovirus and beta 2 microglobulin // Nature, v. 347, p. 770-772

18. Bukowski JF, Woda BA, Welsh RM (1984): Pathogenesis of murine cytomegalovirus infection in natural killer cell-depleted mice // J Virol, v. 52, p. 119-128

19. Bulkley BIT, Hutchins GM (1977): Accelerated "atherosclerosis". A morphologic study of 97 saphenous vein coronary artery bypass grafts // Circulation, v. 55, p.163-169

20. Burch GE, Harb JM, Hiramoto Y, Shewey L (1973): Viral infection of the aorta of man associated with early atherosclerotic changes // Am Heart J, v. 86, p. 523-534

21. Burch GE (1974): Viruses and atherosclerosis // Am Heart J, v. 87, p. 407-412

22. Burger DR, Ford D, Vetto RM, Hamblin A, Goldstein A, Hubbard M, Dumonde DC (1981): Endothelial cell presentation of antigen to human T cells // Hum Immunol, v. 3, p. 209-230

23. Carew TE, Pittman RC, Marchand ER, Steinberg D (1984): Measurement in vivo of irreversible degradation of low density lipoprotein in the rabbit aorta. Predominance of intimal degradation // Arteriosclerosis, v. 4, p. 214-224

24. Chaudhuri AR, St Jeor S, Maciejewski JP (1999): Apoptosis induced by human cytomegalovirus infection can be enhanced by cytokines to limit the spread of virus // Exp Hematol, 1999, v. 27, p. 1194-1203

25. Chee M (1991): The HCMV genome project: what has been learned and what can be expected in the future // Transplant Proc, v. 23 (Suppl 3), p. 174-180

26. Cornhill JF, Herderick EE, Stary HC (1990): Topography of human aortic sudanophilic lesions // Monogr Atheroscler, v. 15, p. 13-27

27. Cotton RE, Wartman WB (1961): Endothelial patterns in human arteries // Archives of Pathology, v. 71, p. 3-24

28. Davies MJ, Bland JM, Hangartner JR, Angelini A, Thomas AC (1989): Factors influencing the presence or absence of acute coronary artery thrombi in sudden ischaemic death // Eur Heart J, v. 10, p. 203-208

29. Davignon J-L, Clement D, Alriquet J, Michelson S, Davrinche C (1995): Analysis of the proliferative T cell response to human cytomegalovirus major immediate-early protein (IE1): phenotype, frequency and variability // Scand J Immunol, v. 41, p. 247-255

30. Einhorn L, Ost A (1984): Cytomegalovirus infection of human blood cells // J Infect Dis, v. 149, p. 207-214

31. Fabricant CG, Hajjar DP, Minick CR, Fabricant J (1981): Herpesvirus infection enhances cholesterol and cholesteryl ester accumulation in cultured arterial smooth muscle cells // Am J Pathol, v. 105, p. 176-184

32. Faggiotto A, Ross R (1984): Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. II. Fatty streak conversion to fibrous plaque // Arteriosclerosis, v. 4, p. 341-356

33. Feldman DL, Hoff HF, Gerrity RG (1984): Immunohistochemical localization of apoprotein B in aortas from hyperlipemic swine. Preferential accumulation in lesion-prone areas // Arch Pathol Lab Med, v. 108, p. 817-822

34. Fish KN, Britt W, Nelson JA (1996): A novel mechanism for persistence of human cytomegalovirus in macrophages // J Virol, v. 70, p.1855-1862

35. Fish KN, Depto AS, Moses AV, Britt W, Nelson JA (1995): Growth kinetics of human cytomegalovirus are altered in monocyte-derived macrophages // J Virol, v. 69, p. 37373743

36. Fortunato EA, Spector DH (1998): P53 and RPA are sequestered in viral replication centers in the nuclei of cells infected with human cytomegalovirus // J Virol, v. 72, p. 2033-2039

37. Foucar E, Mukai K, Foucar K, Sutherland DE, Van Buren CT (1981): Colon ulceration in lethal cytomegalovirus infection // Am J Clin Pathol, v. 76, p. 788-801

38. Garnett HM (1979): Fusion of cytomegalovirus infected fibroblasts to form multinucleate giant cells // J Med Virol, v. 3, p. 271-274

39. Gerrity RG (1981): The role of the monocyte in atherogenesis: II. Migration of foam cells from atherosclerotic lesions // Am J Pathol, v. 103, p. 191-200

40. Gibson W (1981): Immediate-early proteins of human cytomegalovirus strains AD 169, Davis, and Towne differ in electrophoretic mobility // Virology, v. 112, p. 350-354

41. Goldstein JL, Brown MS (1984): Progress in understanding the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol //J Lipid Res, v. 25, p. 1450-1461

42. Grattan MT, Moreno-Cabral CE, Starnes VA, Oyer PE, Stinson EB, Shumway NE (1989): Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis // J Am Med Assoc, v. 261, p. 3561-3566

43. Grefte JM, van der Giessen M, Blom N, The TH, van Son WJ (1991): Circulating cytomegalovirus-infected endothelial cells after renal transplantation: possible clue to pathophysiology? // Transplant Proc, v. 27, p. 939-942

44. Grefte A, van der Giessen M, van Son W, The TH (1993): Circulating cytomegalovirus (CMV)-infected endothelial cells in patients with an active CMY infection // J Infect Dis, v. 167, p. 270-277

45. Griffiths P, Baboonian C, Ashby D (1985): The demographic characteristics of pregnant women infected with cytomegalovirus // Int J Epidemiol, v. 14, p. 447-452

46. Grundy JE, McKeating JA, Griffiths PD (1987a): Cytomegalovirus strain AD 169 binds beta 2 microglobulin in vitro after release from cells // J Gen Virol, v. 68, p. 777-784

47. Gyorkey F, Melnick JL, Guinn GA, Gyorkey P, DeBakey ME (1984): Herpesviridae in the endothelial and smooth muscle cells of the proximal aorta in arteriosclerotic patients // Exp Mol Pathol, v. 40, p. 328-339

48. Farber I, Wutzler P, Sprossig M, Schweizer H (1979): Determination of antibodies against cytomegalovirus-induced early antigens by using rabbit lung fibroblasts. Brief report // Arch Virol, v. 62, p. 273-276

49. Hansson GK, Holm J, Jonasson L (1989): Detection of activated T lymphocytes in the human atherosclerotic plaque // Am J Pathol, v. 135, p. 169-175

50. Hendrix MG, Dormans PH, Kitslaar P, Bosman F, Bruggeman CA (1989): The presence of cytomegalovirus nucleic acids in arterial walls of atherosclerotic and nonatherosclerotic patients//Am J Pathol, v. 134, p. 1151-1157

51. Hendrix MG, Salimans MMM, van Boven CPA, Bruggeman CA (1990): High prevalence of latently present cytomegalovirus in arterial walls of patients suffering from grade III atherosclerosis // Am J Pathol, v. 136, p. 23-28

52. Hendrix RM, Wagenaar M, Slobbe RL, Bruggeman CA (1997): Widespread presence of cytomegalovirus DNA in tissues of healthy trauma victims // J Clin Pathol, v. 50, p. 59-63

53. Holman RL, McGill HC, Strong JP, Geer JC (1958): The natural history of atherosclerosis: the early aortic lesions as seen in New Orleans in the middle of the 20th century // Am J Pathol, v. 34, p. 209-235

54. Houle S, Roach MR (1981): Flow studies in a rigid model of an aorto-renal junction. A case for high shear as a cause of the localization of sudanophilic lesions in rabbits // Atherosclerosis, v. 40, p. 231-244

55. Huang ES (1975): Human cytomegalovirus. III. Virus-induced DNA polymerase // J Virol, v. 16, p. 298-310

56. Ibanez CE, Schrier R, Ghazal P, Wiley C, Nelson JA (1991): Human cytomegalovirus productively infects primary differentiated macrophages // J Virol, v. 65, p. 6581-6588

57. Ishii T, Malcom GT, Osaka T (1990): Variations with age and serum cholesterol level in the topographic distribution of macroscopic aortic atherosclerotic lesions as assessed by image analysis methods // Mol Pathol, v. 3, p. 713-719

58. Jonjic S, del Val M, Keil GM, Reddehase MJ, Koszinowski UH (1988): A nonstructural viral protein expressed by a recombinant vaccinia virus protects against lethal cytomegalovirus infection // J Virol, v. 62, p. 1653-1658

59. Jordan MC, Rousseau W, Stewart JA, Noble GR, Chin TD (1973): Spontaneous cytomegalovirus mononucleosis. Clinical and laboratory observations in nine cases // Ann Intern Med, v. 79, p. 153-160

60. Kane RC, Rousseau WE, Noble GR, Tegtmeier GE, Wulff H, Herndon HB, ChinTD, Bayer WL (1975): Cytomegalovirus infection in a volunteer blood donor population // Infect Immun, v. 11, p. 719-723

61. Kapasi K, Rice GP (1988): Cytomegalovirus infection of peripheral blood mononuclear cells: effects on interleukin-1 and -2 production and responsiveness // J Virol, v. 62, p. 3603-3607

62. Klemola E, Kaariainen L (1965): Cytomegalovirus as a possible cause of a disease resembling infectious mononucleosis // Br Med J, N 5470, p. 1099-1102

63. Koszinowski UH, Reddehase MJ, Del Val M (1992): Principles of cytomegalovirus antigen presentation in vitro and in vivo // Semin Immunol, v. 4, p. 71-79

64. Koszinowski UH, Reddehase MJ, Keil GM, Volkmer H, Jonjic S, Messerle M, del Val M, Mutter W, Munch K, Buhler B (1987): Molecular analysis of herpesviral gene products recognized by protective cytolytic T lymphocytes // Immunol Lett, v. 16, p. 185-192

65. Kovacs A, Weber ML, Burns LJ, Jacob HS, Vercellotti GM (1996): Cytoplasmic sequestration of p53 in cytomegalovirus-infected human endothelial cells // Am J Pathol, v. 149, p. 1531-1539.

66. Landini MP, La Placa M (1991): Humoral immune response to human cytomegalovirus proteins: a brief review // Comp Immunol Microbiol Infect Dis, v. 14, p.97-105

67. Lathey JL, Spector SA (1991): Unrestricted replication of human cytomegalovirus in hydrocortisone-treated macrophages // J Virol, v. 65, p. 6371-6375

68. Lazzarotto T, Boccuni MC, Dal Monte P, Ripalti A, Landini MP (1991): Antigenic variation of cytomegalovirus isolates recovered from infected children // Microbiologica, v. 14, p. 241-251

69. Libby P, Egan D, Skarlatos S (1997): Roles of infectious agents in atherosclerosis and restenosis: an assessment of the evidence and need for future research // Circulation, v. 96, p. 4095-4103

70. Loebe M, Schuler S, Zais O, Warnecke H, Fleck E, Hetzer R (1990): Role of cytomegalovirus infection in the development of coronary artery disease in the transplanted heart // J Heart Transplant, v. 9, p. 707-711

71. Lowry RW, Adam E, Hu C, Kleiman NS, Cocanougher B, Windsor N, Bitar JN, Melnick JL, Young JB (1994): What are the implications of cardiac infection with cytomegalovirus before heart transplantation?// J Heart Lung Transplant, v. 13, p. 122-128

72. Mach M, Stamminger T, Jahn G (1989): Human cytomegalovirus: recent aspects from molecular biology // J Gen Virol, v. 70, p. 3117-3146

73. Malone CL, Vesole DH, Stinski MF (1990): Transactivation of a human cytomegalovirus early promoter by gene products from the immediate-early gene IE2 and augmentation by IE1: mutational analysis of the viral proteins // J Virol, v. 64, p. 1498-1506

74. McDonald K, Rector TS, Braulin EA, Kubo SH, Olivari MT (1989): Association of coronary artery disease in cardiac transplant recipients with cytomegalovirus infection // Am J Cardiol, v. 64, p. 359-362

75. McKeating JA, Griffiths PD, Grundy JE (1987): Cytomegalovirus in urine specimens has host beta 2 microglobulin bound to the viral envelope: a mechanism of evading the host immune response? // J Gen Virol, v. 68, p. 785-792

76. Melnick JL, Dreesman GR, McCollum CH, Petrie BL, Burek J, DeBakey ME (1983): Cytomegalovirus antigen within human arterial smooth muscle cells // Lancet, ii, p. 644647

77. Melnick JL, Adam E, DeBakey ME (1993): Cytomegalovirus and atherosclerosis // Eur Heart J, v. 14 (Suppl K), p. 30-38

78. Melnick JL, Hu C, Burek J, Adam E, DeBakey ME (1994): Cytomegalovirus DNA in arterial walls of patients with atherosclerosis // J Med Virol, v. 42, p. 170-174.

79. Michelson-Fiske S, Horodniceanu F, Guillon JC (1977): Immediate early antigens in human cytomegalovirus infected cells // Nature, v. 270, p. 615-617

80. Minick CR, Fabricant CG, Fabricant J, Litrenta MM (1979): Atheroarteriosclerosis induced by infection with a herpesvirus // Am J Pathol, v. 96, p. 673-706

81. Mocarski ES, Stinski MF (1979): Persistence of the cytomegalovirus genome in human cells//J Virol, v. 31, p. 761-775

82. Mombouli JV, Vanhoutte PM (1999): Endothelial dysfunction: from physiology to therapy // J Mol Cell Cardiol, v. 31, p. 61-74

83. Muhlemann K, Miller RK, Metlay L, Menegus MA (1992): Cytomegalovirus infection of the human placenta: an immunocytochemical study // Hum Pathol, v. 23, p. 1234-1237

84. Newby AC, Zaltsman AB (1999): Fibrous cap formation or destruction—the critical importance of vascular smooth muscle cell proliferation, migration and matrix formation // Cardiovasc Res, 1999, v. 41, p. 345-360

85. Otto SM, Sullivan-Tailyour G, Malone CL, Stinski MF (1988): Subcellular localization of the major immediate-early protein (IE1) of human cytomegalovirus at early times after infection. // Virology, v. 162, p. 478-482

86. Palinski W, Rosenfeld ME, Yla-Herttuala S, Gurtner GC, Socher SS, Butler SW, Parthasarathy S, Carew TE, Steinberg D, Witztum JL (1989): Low density lipoproteinundergoes oxidative modification in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 86, p. 13721376

87. Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth (PDAY) Research Group (1993): Natural history of aortic and coronary atherosclerotic lesions in youth. Findings from the PDAY Study // Arterioscler Thromb, v. 13, p. 1291-1298

88. Paya CV, Hermans PE, Wiesner REI, Ludwig J, Smith TF, Rakela J, Krom RA (1989): Cytomegalovirus hepatitis in liver transplantation: prospective analysis of 93 consecutive orthotopic liver transplantations // J Infect Dis, v. 160, p. 752-758

89. Peterslund NA (1991): Herpesvirus infection: an overview of the clinical manifestation // Scand J Infect, v. 78, Suppl., p. 15-20

90. Poole JCF, Sanders AG, Florey HW (1958): The regeneration of aortic endothelium // J Pathol Bacteriol, v. 75, p. 133-143

91. Quinn MT, Parthasarathy S, Fong LG, Steinberg D (1987): Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 84, p. 29952998

92. Quinnan GV, Manischewitz JE, Ennis FA (1978): Cytotoxic T lymphocyte response to murine cytomegalovirus infection//Nature, v. 273, p. 541-543

93. Quinnan GV, Manischewitz JE (1979): The role of natural killer cells and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity during murine cytomegalovirus infection // J Exp Med, v. 150, p. 1549-1554

94. Reyburn HT, Mandelboim O, Vales-Gomez M, Davis DM, Pazmany L, Strominger JL (1997): The class I MHC homologue of human cytomegalovirus inhibits attack by natural killer cells //Nature, v. 386, p. 514-517

95. Rice GP, Schrier RD, Oldstone MB (1984): Cytomegalovirus infects human lymphocytes and monocytes: virus expression is restricted to immediate-early gene products // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 81, p. 6134-6138

96. Taylor DO, Ibrahim ITM, Tolman DR, Hess ML (1991): Accelerated coronary atherosclerosis in cardiac transplantation // Transplant Rev, v. 5, p. 165-174

97. Taylor-Wiedeman J, Sissons JP, Borysiewicz LK, Sinclair JH (1991): Monocytes are a major site of human cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells // J Gen Virol, v. 72, p. 2059-2064

98. Taylor-Wiedeman J, Sissons JP, Sinclair JH (1994): Induction of endogenous cytomegalovirus gene expression after differentiation of monocytes from healthy carriers //J Virol, v. 68, p. 1597-1604

99. Thyberg J, Nilsson J, Palmberg L, Sjolund M (1985): Adult human arterial smooth muscle cells in primary culture. Modulation from contractile to synthetic phenotype // Cell Tissue Res, v. 239, p. 69-74

100. Tokunaga O, Fan JL, Watanabe T (1989): Atherosclerosis- and age-related multinucleated variant endothelial cells in primary culture from human aorta // Am J Pathol, v. 135, p. 967-976

101. Toorkey CB, Carrigan DR (1989): Immunohistochemical detection of an immediate early antigen of human cytomegalovirus in normal tissues // J Infect Dis, v. 160, p.741-751

102. Tumilowicz JJ, Gawlik ME, Powell BB, Trentin JJ (1985): Replication of cytomegalovirus in human arterial smooth muscle cells // J Virol, v. 56, p. 839-845

103. Vyalov S, Langille BL, Gotlieb AI (1996): Decreased blood flow rate disrupts endothelial repair in vivo // Am J Pathol, v. 149, p. 2107-2118

104. Waldman WJ, Sneddon JM, Stephens RE, Roberts WH (1989): Enhanced endothelial cytopathogenicity induced by a cytomegalovirus strain propagated in endothelial cells // J Med Virol, v. 28, p.223-230

105. Waldman WJ, Roberts WH, Davis DH, Williams MY, Sedmak DD, Stephens RE (1991): Preservation of natural endothelial cytopathogenicity of cytomegalovirus by propagation in endothelial cells // Arch Virol, v. 117, p. 143-164

106. Waldman WJ, Adams PW, Orosz CG, Sedmak DD (1992): T lymphocyte activation by cytomegalovirus-infected, allogeneic cultured human endothelial cells // Transplantation, v. 54, p. 887-896

107. Waldman WJ, Knight DA, Huang EH, Sedmak DD (1995): Bi-directional transmission of infectious cytomegalovirus between monocytes and vascular endothelial cells: an in vitro model // J Infect Dis, v. 171, p. 263-272

108. Waldman WJ, Knight DA, Huang EH (1998): An in vitro model of T cell activation by autologous cytomegalovirus (CMV)-infected human adult endothelial cells: contribution of CMV-enhanced endothelial ICAM-1 // J Immunol, v. 160, p. 3143-3151

109. Wathen MW, Stinski MF (1982): Temporal patterns of human cytomegalovirus transcription: mapping the viral RNAs synthesized at immediate early, early, and late times after infection // J Virol, v. 41, p. 462-477

110. Weber B, Hamann A, Ritt B, Rabenau H, Braun W, Doerr HW (1992): Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects // Clin Investig, v. 70, p. 503-507

111. Wick G, Schett G, Amberger A, Kleindienst R, Xu Q (1995): Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? // Immunology Today, v. 16, p. 27-33

112. Winston DJ, Pollard RB, Ho WG, Gallagher JG, Rasmussen LE, Huang SN, Lin CH, Gossett TG, Merigan TC, Gale RP (1982): Cytomegalovirus immune plasma in bone marrow transplant recipients // Ann Intern Med, v. 97, p. 11-18

113. Wright HP (1972): Mitosis patterns in aortic endothelium // Atherosclerosis, v. 15, p. 93100

114. Yamada T, Fan J, Shimokama T, Tokunaga O, Watanabe T (1992): Induction of fatty streak-like lesions in vitro using a culture model system simulating arterial intima // Am J Pathol, v. 141, p. 1435-1444

115. Yamashiroya HM, Ghosh L, Yang R, Robertson AL (1988): Herpesviridae in the coronary arteries and aorta of young trauma victims // Am J Pathol, v. 130, p. 71-79

116. Yamashita Y, Shimokata K, Mizuno S, Yamaguchi H, Nishiyama Y (1993): Down-regulation of the surface expression of class I MHC antigens by human cytomegalovirus // Virology, v. 193, p. 727-736

117. Zhou YF, Leon MB, Waclawiw MA, Popma JJ, Yu ZX, Finkel T, Epstein SE (1996): Association between prior cytomegalovirus infection and the risk of restenosis after coronary atherectomy // N Engl J Med, v. 335, p. 624-630

118. Я выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Виктории Борисовне Быстревской за неизменный интерес к моей работе, множество полезных советов и практическую помощь в проведении работы и подготовке ее к защите.

119. Хочу поблагодарить также Сергея Николаевича Гнедого (ИМГ РАН) за любезно предоставленные праймеры.

120. Очень признателен за помощь Наталье Евгеньевне Макаровой (Институт Вирусологии РАН).

121. Особая благодарность Виталию Николаевичу Сироткину за содействие в получении срочного аутопсийного материала.

122. Хочу также поблагодарить Елену Евгеньевну Балашову и Татьяну Михайловну Виноградову, которые помогали мне методическими советами и участвовали в обсуждении результатов работы.