Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Цитологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Цитологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз"

На правах рукописи

Филипьев Михаил Михайлович

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛОЖИТЕЛЬНО РЕАГИРУЮЩЕГО В СЕРОДИАГНОСТИКЕ НА ЛЕЙКОЗ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

005538803

Благовещенск-2 013

005538803

Работа выполнена на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Научный руководитель Донкова Наталья Владимировна - доктор

ветеринарных наук, профессор, заведующая кафедрой анатомии, патологической анатомии и хирургии ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (г. Красноярск)

Официальные оппоненты: Кухаренко Наталья Степановна — доктор

ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»; кафедра патологии, морфологии и физиологии факультета ветеринарной медицины и зоотехнии, профессор (г. Благовещенск)

Огородникова Татьяна Леонидовна -

кандидат биологических наук, ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия»; кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии, ассистент (г. Благовещенск)

Ведущая организация Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» по адресу: 675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86. Тел.: (416-2) 52-32-06, тел/факс: (416-2) 52-62-80.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»

Автореферат разослан « <9- » 2013 г.

/Г-

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Самусенко Ольга Леонидовна

и У

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что в процессе жизнедеятельности образуются продукты распада, возникающие в результате диссимиляции белков, которые являются вредными для организма. Они выделяются за пределы организма системой мочевыделения, основным элементом которой являются почки.

Наиболее важная функция почек заключается в обеспечении постоянства основных физико-химических свойств организма; почки рехулируют водный обмен, осмотическое давление, ионный состав и кислотно-щелочное равновесие плазмы (Витворт Дж.А., 2000; Линева А., 2003; Авылов Ч.К., Кунаков A.A., 2006). В структуре заболеваний внутренних органов крупного рогатого скота поражение почек составляет 5-7%.

Нарушение функции почек, особенно при системных заболеваниях, таких как лейкоз, приводит к изменению гомеостаза организма, поражение не возникает до распространения опухолевых клеток по сосудистой системе и развития органных сдвигов, связанных с опухолевыми разрастаниями, при этом клиническое проявление заболевания отсутствует. Поражение почек при лейкозе проявляется в виде как отдельных очагов, так и диффузной пролиферации, которая приводит к почечной недостаточности с развитием анурии (Кудряшов A.A., Петров Н.И., 1999; Смирнов П.Н., Храмцов В.В., Смирнова В.В., Разумовская В.В., 2000; Ермаков С.П., 2001; Lin J., Markowitz G.S., Valen A.M. et al., 2001; D'Agati V.D., Jennette J.C., Silva F.G., 2005).

Гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота при лейкозе изучены недостаточно, что и послужило предметом нашего исследования.

Цель исследования — изучить гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз.

Задачи исследования:

1) установить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, больного лейкозом;

2) изучить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС;

3) установить гистологические и гистохимические особенности почек коров, отрицательно реагирующих в серодиагностике на лейкоз;

4) провести сравнительный морфометрический анализ почечных структур здоровых (РИД-), положительно реагирующих в серодиагностике (РИД+) и гематологически больных лейкозом коров.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследование почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз в условиях Красноярского края. Проведен сравнительный анализ

микроструктуры почек у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров, включающий исследование клубочкового и канальцевого аппарата нефронов. Установлены частота возникновения и характер морфологических изменений в почках у коров с серопозитивной реакцией на лейкоз.

Теоретическая и практическая значимость. Данная работа является фрагментом темы «Микроструктурные изменения паренхиматозных органов у животных в норме и при патологии» направления научно-исследовательской работы кафедры «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. Результаты исследований дополняют и углубляют существующие данные по микроструктуре почек у крупного рогатого скота в норме, инфицированных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом животных, что может служить основой для оценки уровня морфофункциональных изменений и дифференциальной диагностики патологии почек.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедрах: «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета; «Анатомия и физиология животных» Сельскохозяйственного института Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова; «Анатомия, физиология и патологическая физиология животных» Иркутской государственной сельскохозяйственной академии, - а также в Красноярском научно-исследовательском институте животноводства Россельхозакадемии.

Апробация работы. Основные материалы исследований доложены на: Всероссийской очно-заочной научно-практической и научно-методической конференции с международным участием «Инновации в научно-практической деятельности» (Красноярск, 2010, 2011); третьей Красноярской региональной научно-практической конференции «Животные как часть экосистемы» (Красноярск, 2010); научной интернет-конференции «Актуальные проблемы ветеринарии» (Новосибирск, Омск, Красноярск, Барнаул, 2012); Международной научно-практической конференции «Наука: опыт, проблемы, перспективы развития» (Красноярск, 2012,2013).

Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно.

Публикации. По результатам научных исследований опубликовано восемь печатных работ, в том числе две - в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Почки коров имеют гистологические и гистохимические особенности у здоровых, инфицированных BJIKPC и больных лейкозом коров.

2. Микроструктура почек гематологически больных лейкозом коров характеризуется лимфоидной инфильтрацией всех почечных структур.

3. Почки коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЛКРС, но без изменений в лейкограмме, имеют микроструюурные признаки, свойственные для дегенеративно-дистрофических, воспалительных и некротических процессов.

4. Почечные структуры больных лейкозом, инфицированных ВЛКРС и здоровых коров имеют достоверные морфометрические различия.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает в себя 189 источников, в том числе 60 иностранных. Работа содержит 5 таблиц, 44 рисунка, из них 3 диаграммы, 33 микрофотографии и 8 макрофотографий, 1 схему.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал и методы исследования

2.1.1 Объект и материалы исследований. Исследования и обработка экспериментального материала проведены в течение 2009-2013 гг. на кафедре «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Красноярского государственного аграрного университета, в ЗАО «Агрофирма Маяк» Сухобузимского района, хозяйстве «Захаровская заимка» Енисейского района Красноярского края и убойном пункте Уярского мясокомбината и отделе «Ветеринарная медицина» Красноярского НИИ животноводства Россельхозакадемии.

Объектом исследования явился крупный рогатый скот черно-пестрой голштинизированной породы в возрасте от четырех до девяти лет, возраст животных определяли по журналам учета поголовья.

Материалом для исследования послужили правая и левая почки (nephros dexstra et sinistra), цельная кровь, сыворотка крови, а также информационные материалы службы по ветеринарному надзору Красноярского края и отдела экономического анализа и прогнозирования Министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края.

Для решения поставленных задач было сформировано три группы животных: первая группа - больные лейкозом коровы (положительно реагирующие в серодиагностике на лейкоз и гематологически положительные); вторая группа - инфицированные ВЛКРС коровы (положительно реагирующие

в серодиагностике на лейкоз, но гематологически отрицательные); третья группа - здоровые коровы (отрицательно реагирующие в серодиагностике на лейкоз). Схема формирования опытных групп животных представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Схема формирования опытных групп животных

Группа Животные Реакция иммунной диффузии Гематологические исследования Количество исследованных животных

1 Больные лейкозом РИД+ Гем+ 15

2 Инфицированные ВЛКРС РИД+ Гем- - 25

3 Здоровые РИД- Гем- 20

Итого исследовано: 60

2.1.2 Методы исследований. Основными методами исследования являлись: цитологические, гистологические, гистохимические, гематологические, морфометрические и биостатистические. Уровень инфицированности ВЛКРС и заболеваемости лейкозом животных определяли по данным информационных материалов службы по ветеринарному надзору Красноярского края и отдела экономического анализа и прогнозирования Министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края, а также журналов ветеринарной отчетности ЗАО «Агрофирма Маяк».

Общая структура исследований представлена на рисунке 1.

Морфологические методы. Морфологические методы включали гистологические, гистохимические и цитологические методы исследования.

Для гистологического исследования отбирали левую и правую почку, кусочки вырезали на границе коркового и мозгового вещества, размеры иссекаемых кусочков не превышали 0,5 см х 0,5 см, фиксировали не менее 12 часов в 10%-м растворе нейтрального формалина и жидкости Буэна, промывали под проточной водой, обезвоживали путем проведения через батарею спиртов возрастающей крепости и уплотняли в парафине. Срезы толщиной 5-7 мкм изготавливали на санных микротомах «МС-2» и «Техном».

Для получения обзорных препаратов гистологические срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином, коллагеновые волокна соединительной ткани выявляли по методу Ван-Гизон и по методу Маллори. При применении метода Ван-Гизон коллагеновые волокна окрашивались в красный цвет, клеточные ядра - в темно-коричневый или фиолетово-черный, цитоплазма и мышечная ткань - в темно-желтый цвет. При использовании смеси Маллори коллагеновые волокна окрашивались в темно-синий цвет (Меркулов Г.А., 1969).

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛОЖИТЕЛЬНО РЕАГИРУЮЩЕГО В СЕРОДИАГНОСТИКЕ НА ЛЕЙКОЗ

И

31

Установить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатог о скота, больного лейкозом

ж:

Изучить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС

Установить гистологические и гистохимические особенности почек коров, отрицательно реагирующих в серодиагностике на лейкоз

Провести сравнительный морфометрический анализ почечных структур здоровых (РИД-), положительно реагирующих в

серодиагностике(РИД+) и гематологически больных коров

-Ь

х

Объект исследования: крупный рогатый скот в возрасте от четырех до восьми лет

+ I I Г

Материал для исследования: цельпая кровь, сыворотка крови, левая и правая почка, статистическая отчетность по уровню инфицированное™ ВЛКРС и заболеваемости лейкозом в Красноярском крае

I ---

X

т

Морфологические методы

Морфометрические методы

Гематологические методы

Гистологические методы

1 1

т

1

Гистохимические методы

г л

§ 1

I 9 £•8 А Э к д 3 §

I

Цитологические методы

■

л

Окраска изков крови Г та о с С и

г С

V У

Биостатистические методы

г

ё | §. а

в4 5 и о

о и 2 ц

ч о а о,

.2 £ 2 о

С ■§ « и

X

ч_

Рекомендации к использованию научных положений

к ё

и <

5

о

е-

Рисунок 1 - Общая схема исследований

Гистохимические методы включали исследования на углеводсодержа-щие биополимеры и нуклеиновые кислоты. Углеводсодержащие биополимеры выявляли реактивом Шиффа при предварительном окислении препаратов пе-риодатом натрия по методу A.J1. Шабадаша в сочетании с энзиматическим контролем - срезы выдерживали в растворе амилазы слюны при t +37°С в течение одного часа (Кононский А.И., 1976). За гликоген принимали ШИК-позитивные вещества, ферментирующиеся амилазой слюны. ШИК-позитивный материал, устойчивый к ферментированию амилазой, относили к нейтральным гликопро-теидам. Гликоген окрашивался в интенсивный фиолетово-вишневый цвет, му-коиды и гликопротеиды - в красноватый.

ДНК-содержащие структуры выявляли окраской метиловым зеленым с пиронином по Браше (Кононский А.И., 1976). При этом структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красный цвет, ядерный хроматин в зеленый, сине-зеленый или пурпурно-зеленый. Контрольные препараты, обработанные рибо-нуклеазой, не окрашиваются пиронином, ДНК хроматина выявляют в виде частиц зеленого цвета или зелено-синих образований.

Для получения обзорных цитологических препаратов мазки крови изготавливали на обезжиренных предметных стеклах, окрашивали по Паппенгей-му, комбинированному методу, сочетающему в себе предварительное окрашивание-фиксацию метиленовым синим по Май-Грюнвальду с окончательным докрашиванием в азур Н-эозине по Романовскому. Подсчет различных форм лейкоцитов и выведение лейкограммы проводили методом Филлипченко. При окраске по Паппенгейму хорошо дифференцируется как ядро, так и зернистость лейкоцитов (Карпуть И.М., 1986).

Гематологические методы включали качественный и количественный анализ лейкоцитов. У животных отбирали пробы крови из яремной вены. Цельную кровь, полученную при добавлении антикоагулянта, подвергали морфологическому анализу на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии Красноярского государственного аграрного университета. Для подсчета количества лейкоцитов пробы цельной крови разводили в жидкости Тюрка и далее исследовали в камере Горяева, производя подсчет лейкоцитов в 100 больших квадратах. Серологические исследования сыворотки крови на ВЛКРС в реакции иммунодиффузии (РИД) проведены в КГБУ "Краевая ветеринарная лаборатория" (г. Красноярск, ул. Дудинская, 5г). Результаты исследований оценивали согласно «Методическим рекомендациям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота» от 23.08.2000 г. № 13-7-2/2130.

Морфометрические методы. Морфометрические исследования почечных структур проводили на продольных и поперечных срезах, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, под световыми микроскопами марок Мик-Мед-5, MS 100 (Austria), при увеличении в 100, 400, 1000 раз. Микрофотосъемку производили Digital Camera Cam V 200, совмещенной с компьютером посредством кабеля USB. Полученные изображения обрабатывали с использова-

нием программного обеспечения Bio Vision 2005; коррекцию микрофотографий проводили с помощью программного комплекса Biographica Cito 2.0.

Толщину почечных структур измеряли с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х (ГОСТ 15150-69). Измерения проводили не менее чем в 8-10 произвольно отобранных срезах с различных стекол. Данные морфометрии протоколировались.

Площадь почечных телец, сосудистых клубочков и извитых канальцев вычисляли по формуле вычисления площади эллипса

S--4 '

где а - длина эллипса; р - ширина эллипса.

Биостатистические методы. Полученные в ходе проведенных экспериментальных исследований данные обработаны с учетом учебных рекомендаций по биометрии (Глотов Н.В. с соавт., 1982; Лакин Г.Ф., 1990; Автандилов Г.Г., 1990; Математические методы в биологии, 2004).

Оценку достоверности различий проводили методом вариационной статистки с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (Р<0,05). Статистическую обработку полученных данных проводили на ПК с помощью прикладных программ Microsoft Office Exel 2007.

Термины и обозначения, приводимые в тексте, даны в соответствии с Международной Ветеринарной Анатомической номенклатурой (Nomina Anatómica Veterinaria, 2013).

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Анализ заболеваемости гемобластозами крупного рогатого скота в хозяйствах Красноярского края

Проведенный анализ данных статистической отчетности показал, что в Красноярском крае уровень инфицированное™ ВЛКРС за период с 2008 по 2011 год составил около 2%. В среднем за год выявляется до 0,6 % больных лейкозом животных. По состоянию на 01.12.2011 диагноз установлен в 48 хозяйствах края (положительный результат серологического и гематологического исследований), наложены ограничения в 31 хозяйстве. Наиболее неблагополучная ситуация по ВЛКРС складывается в Емельяновском, Енисейском, Ерма-ковском, Болынемуртинском, Балахтинском, Курагинском, Назаровском, Бого-тольском, Каратузском, Тюхтетском, Саянском и Рыбинском, а также в Сухо-бузимском районе.

Нами установлено, что в ЗАО «Агрофирма Маяк» Сухобузимского района Красноярского края уровень инфицированности крупного рогатого скота в 2008 г. составил 34,3%; в 2009 г. - 26,5%; в 2010 г. - 37,4%; в 2011 г. - 36,7%,

то есть ежегодно треть исследованного поголовья положительно реагирует в серодиагностике на лейкоз (рис. 2).

При этом уровень гематологически больных животных за исследованный период вырос более чем в 2,5 раза и составил по годам: в 2008г. - 0,7%; в 2009г. - 0,8%; в 2010г. - 1,1%; в 2011г. - 1,8% (рис. 3).

2008 2009 2010 2011 2Ю8 2009 2(ш 2(Щ

Рис. 2. Динамика РИД-позитивных Рис. 3. Динамика гемопозитивных

животных, % животных, %

Таким образом, согласно результатам серологической диагностики, уровень инфицированных ВЖРС животных в ЗАО «Агрофирма Маяк» в среднем составляет 33,7%, из них положительные результаты гематологических исследований выявлены у 1,1%, что вдвое превышает средний уровень заболеваемости лейкозом по Красноярскому краю.

2.2.2 Качественный и количественный состав лейкоцитов крови коров, положительно реагирующих в серодиагностике на лейкоз

Нами установлено, что количество лейкоцитов крови у больных коров (первая группа) достоверно превышает количество лейкоцитов у здоровых животных (третья группа) в 2,5 раза (Р<0,001), при этом количество лимфоцитов у больных лейкозом животных превышает их количество у здоровых животных в 3,36 раза (Р<0,001).

Животные с серопозитивной реакцией на лейкоз, но не имеющие достоверных различий по уровню лейкоцитов и лимфоцитов по сравнению с животными с серонегативной реакцией (здоровые животные), отнесены во вторую группу (инфицированные животные). Количество лейкоцитов в их крови составило 8,21±0,71х109/ л, а лимфоцитов 5,14±0,6х109/ л соответственно (табл. 2).

Таблица 2 - Уровень лейкоцитов и лимфоцитов в крови коров

Группа Животные Лейкоциты, 109/л Лимфоциты, 10"/л Серологические и гематологические реакции

1 Больные лейкозом 18,12+2,3* 14,36±2,5* Рид+ Гем+

2 Инфицированные ВЛКРС 8,21+0,71 5Д4±0,6 Рид+ Гем-

3 Здоровые 7,20±1,0 4,28±0,8 Рид-Гем-

Примечание: уровень достоверности различий по отношению к третьей группе (здоровым животным) * - Р<0,001.

При определении качественного состава лейкоцитов (подсчет лейко-граммы) на мазках крови установлено, что количество лимфоцитов у больных лейкозом животных (первая группа) достигает 80%, у инфицированных ВЛКРС - 62,5%, а у здоровых 59,5% (рис. 3). При цитологическом исследовании мазков крови коров, окрашенных по Паппенгейму, в одном поле зрения обнаруживали большое количество агранулярных лейкоцитов - лимфоцитов, из них наиболее часто встречаются клетки больших и средних размеров, а также поврежденные клетки. Высокий уровень лейкоцитов (18,12±2,3х109/л), обусловленный большим содержанием лимфоцитов (14,36±2,5х109/л), а также их морфологические особенности позволили отнести этих животных к гематологически больным. Абсолютное количество и цитология гранулоцитов и моноцитов в мазках крови больных и здоровых животных существенных отличий не имели.

У большей части животных (98,9%), положительно реагирующих в РИД на ВЛКРС, достоверных отличий в уровне лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови по сравнению со здоровыми животными не выявили, их количество находится в пределах физиологической нормы (рис. 4).

Рис. 4. Качественный состав лейкоцитов крови коров, %: А - больные; Б - инфицированные; В - здоровые

Таким образом, из числа инфицированных ВЛКРС коров, выявленных в РИД, количество гематологически больных составило 1,1%. Уровень лейкоци-

11

тов у больных животных в среднем выше, чем у клинически здоровых, в 2,5 раза (Р<0,001), при этом количество лимфоцитов достоверно превышает контрольные значения более чем втрое. У 98,9 % коров, серопозитивных в РИД на BJIKPC, достоверной разницы в качественном и количественном составе лейкоцитов периферической крови по сравнению с контролем не установлено.

2.2.3 Гистологические и гистохимические особенности почек коров, больных лейкозом

При визуальном осмотре правой и левой почек животных с положительным результатом серологических и гематологических исследований выявлено: макроскопически органы плотной консистенции, красно-бурого цвета, борозды хорошо выражены, капсула не сращена с паренхимой, легко снимается; на разрезе края органа смыкаются, в целом не имеют существенных отличий от почек здоровых животных.

При изучении микроструктуры почек гематологически больных коров (первая группа) установлена инфильтрация лимфоидными клетками всех почечных структур. Лимфоидные скопления клеток обнаруживаются как в мозговом, так и корковом веществе (рис. 5). Но наиболее крупные очаги лимфоидной инфильтрации наблюдаются в корковом веществе почек. В почках здоровых коров (третья группа) интерстициальная ткань содержит небольшое количество клеток лимфоидно-гистиоцитарного ряда (рис. 6).

Рис. 5. Почка коровы Рис. б. Почка коровы

(РИД+; Гем+). (РИД-; Гем-).

Окраска: гематоксилин и эозин, Окраска: гематоксилин и эозин,

об. 4х. об. 4х. ^ - лимфоидная инфильтрация

Лимфоидный инфильтрат в почках гематологически больных коров представлен скоплением клеток полигональной формы с крупным гомогенно-базофильным ядром и узким слабобазофильным ободком цитоплазмы (рис. 7). По степени выраженности лимфоидная инфильтрация стромы почечной ткани могла быть незначительной и значительной, диффузной и очаговой.

Полиморфные лимфоидные клетки в строме почек коркового слоя сосредоточены преимущественно периваскулярно и вокруг капсул почечных те-

лец. Инфильтраты сдавливают часть проксимальных и дистальных канальцев и сам сосудистый клубочек, в ряде случаев весьма значительно (рис. 8).

Рис. 7. Почка коровы (РИД+; Гем+). Окраска: гематоксилин и эозин, об. ЮОх.

t - лимфоидные клетки в просвете канальца

Рис. 8. Почка коровы (РИД+; Гем+). Окраска: гематоксилин и эозин, об. 40х.

Т - инфильтрация капсулы сосудистого клубочка лимфоидными клетками

На препаратах, окрашенных по Браше, хорошо различима клеточная структура очагового инфильтрата (рис. 9). Установлено, что инфильтраты образованы лимфоидными клетками, состоящими в основном из средних, малых, а в единичных случаях из крупных лимфоцитов; их ядра разнообразной формы, в некоторых хроматин рыхлый светло-зеленого цвета, часть клеток имеет гипер-хромное метиленовофильное (темно-зеленое) окрашивание ядра, в одной трети случаев встречаются клетки с ядрами неправильной формы с неравномерно спирализованным хроматином в виде хаотичных глыбок в ядре (рис. 10).

Рис. 9. Почка коровы Рис. 10. Почка коровы

(РИД+; Гем+). Окраска: по Браше, (РИД+; Гем+). Окраска: по Браше, , об. 10х. об. 40х. Лимфоциты:

Т - очаговая инфильтрация А - с рыхлым хроматином в ядре;

Б - с гиперхромным ядром; В - с неравномерно спирализованным ядерным хроматином В извитых канальцах проксимального и дистального отделов нефронов отмечаются дистрофические изменения эпителия, которые проявляются в набухании и отделении эпителиальных клеток от базальных мембран и друг от дру-

13

га, что особенно хорошо выявляется ШИК-реакцией (рис. 11). У серонегатив-ных и гематологически отрицательных животных таких изменений не выявлено (рис. 12).

Рис. 11. Почка коровы (РИД+; Гем+). Окраска: ШИК-реакция, об. 40х. отслоение эпителиальных клеток от базальной мембраны

Рис. 12. Почка коровы (РИД-; Гем-). Окраска: ШИК-реакция, об. 40х

Таким образом, у коров, положительно реагирующих в серодиагностике на лейкоз (РИД+) и с высоким содержанием лимфоцитов в периферической крови (Гем+), макроскопических изменений (с поверхности и на разрезе) в структуре почек не выявляется. При микроструктурном анализе, включающем гистологические и гистохимические исследования, определяются характерные для лимфоидного лейкоза признаки: обильная инфильтрация лимфоидными клетками всех структур почек (сосудистых клубочков, извитых канальцев, кровеносных сосудов) и дистрофические изменения в эпителии извитых канальцев нефронов.

2.2.4 Гистологические и гистохимические особенности почек коров, инфицированных ВЛКРС

При морфологическом осмотре почек крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС с положительной реакцией иммунодиффузии на лейкоз, но гематологически отрицательного, установлено, что почки имеют плотную консистенцию, не однородны по цвету (от темно-желтого до красно-бурого), борозды выражены, соединительнотканная капсула легко снимается, на разрезе хорошо различимы зоны коркового и мозгового вещества.

На гистологических препаратах в большинстве случаев характерных для лейкоза пролиферации лимфоидных элементов в почечной ткани не выявлено. При окраске гематоксилином и эозином (рис. 13) и по Маллори (рис. 14) почечные тельца сохраняют структуру и границы, в них можно различить капсулу и сосудистый клубочек; проксимальные и дистальные извитые канальцы без видимых микроструктурных изменений; интерстициальная ткань содержит небольшое количество клеток лимфоидно-гистиоцитарного ряда.

Рис. 13. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: гематоксилин и эозин, об. 10х

Рис. 14. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: по Маллори, об. 10х

В некоторых образцах почек в межканальцевой соединительной ткани обнаруживали множественные или единичные скопления клеток (клеточный инфильтрат) (рис. 15). При детальном изучении клеточного состава инфильтрата не обнаруживали опухолевых клеток (лимфоидного ряда), свойственных при поражении лейкозом паренхиматозных органов. На препарате (рис. 16) хорошо виден инфильтрат, клетки которого имеют полиморфную структуру и представлены преимущественно нейтрофилами, эозинофилами и лимфоцитами, гистиоцитами, что характерно для воспалительного инфильтрата, который существенно отличается от лимфоидной инфильтрации, типичной для лейкоза крупного рогатого скота.

Рис. 15. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: по Маллори, об. 40х. f - клеточный инфильтрат

Рис. 16. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: гематоксилин и эозин,

об. 40х. А - эозинофил; Б - нейтрофил; В - лимфоциты

При гистохимическом исследовании почек по Браше на некоторых препаратах обнаруживали пиронинофильные клетки (рис. 17), что свидетельствует об активации синтеза РНК. В почках серонегативных животных подобные скопления клеток не выявлялись (рис. 18). Пиронинофильные клетки по структуре

напоминают плазмоциты, эти клетки не типичны для лимфоидного лейкоза, при котором РНК редуплицируется в ДНК и сопровождается метиленофилией.

В извитых канальцах проксимального и дистального отделов нефронов выявляли дистрофические изменения эпителиоцитов (рис. 19), что сопровождалось набуханием и отделением нефроцитов от базальных мембран и друг от друга, пикнозом ядер, но выражены эти изменения гораздо меньше, чем у больных лейкозом животных (рис. 20).

Рис. 20. Почка коровы (РИД+; Гем+). Окраска: ШИК-реакция, об. 40х. t - отделение нефроцитов от базальных мембран

Рис. 19. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: ШИК-реакция, об. 40х. Т - дистрофия нефроцитов

Рис. 17. Почка коровы (РИД+; Гем-). Окраска: по Браше, об. 40х. t - пиронинофильные клетки

Рис. 18. Почка коровы (РИД-; Гем-). Окраска: по Браше, об. 10х

Таким образом, в почках коров с положительной реакцией имуннодиф-фузии на лейкоз, но отрицательным гематологическим исследованием характерных для ВЛКРС лимфоидных инфильтратов не выявлено. Основными микроструктурными особенностями почек коров, положительно реагирующих в серодиагностике на лейкоз, явились дегенеративно-дистрофические, воспалительные и некротические изменения, что свидетельствует о неопухолевом ге-

незе данных повреждений, причинами которых могли быть различные факторы, в том числе и неинфекционной природы, однако животные были признаны инфицированными ВЖРС и выбракованы.

2.2.5 Морфометричеекий анализ почечных структур здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров

Нами установлены достоверные различия морфометрических показателей почечных структур больных лейкозом, инфицированных ВЛКРС и здоровых коров.

Согласно данным морфометрического анализа, размеры почечных телец у коров, больных лейкозом, превышают таковые у здоровых животных: по длине - на 17 % (Р<0,001), по ширине - на 31 % (Р<0,001) (табл. 3) и площади - на 53 % (Р<0,001) (табл. 4). Размеры сосудистых клубочков у больных больше, чем у здоровых: по длине - на 19 % (Р<0,001), по ширине - на 34 % (Р<0,001) (табл. 3), по площади - на 58 % (Р<0,001) (табл. 4). Объем почечной капсулы у больных животных больше, чем у здоровых, на 38% (Р<0,05) (табл. 4). Такие изменения обусловлены обширной инфильтрацией лимфоидными клетками всех почечных структур и являются компенсаторно-приспособительной реакцией на прогрессирующий опухолевый процесс.

Таблица 3 - Линейные размеры почечного тельца и сосудистого клубочка, мкм

Группа Почечное тельце Сосудистый клубочек Серологические и гематологические реакции

Длина Ширина Длина Ширина

1 201,3±23,5** 158,5±24,0** 173,5±19,4** 141,2±21,5** РИД+, Гем+

2 194,0±27,1* 143,4±17,8* 163,9±19,0* 124,1±18,9* РИД+, Гем-

3 172,б±27,5 120,3±29,4 145,6±33,3 105,5±25,7 РИД-, Гем-

Примечание: уровень достоверности различий по отношению к третей группе: * -Р<0,05; **-Р<0,001.

У животных, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЛКРС, но с отрицательными гематологическими исследованиями, размеры почечных телец превышают таковые у здоровых животных: по длине - на 12 % (Р<0,05), по ширине - на 19 % (Р<0,05) (табл. 3), по общей площади - на 32 % (Р<0,05) (табл. 4). Размеры сосудистого клубочка соответственно превышают: по длине -на 12 % (Р<0,05), по ширине - на 17 % (Р<0,05) (табл. 3), по площади - на 32 % (Р<0,05) (табл. 4). Площадь почечной капсулы инфицированных животных превышает таковую у здоровых на 33 % (Р<0,05).

Таблица 4 - Площадь почечного тельца, сосудистого клубочка

и почечной капсулы, мкм

Группа Площадь почечного тельца Площадь сосудистого клубочка Площадь почечной капсулы Серологические и гематологические реакции

1 25466,1*6386,0" 19475,1*4359,2** 5991,0*3787,7* РИД+, Гем+

2 21932,6*5705,1* 16190,4*4129,6* 5751,3*2885,8* РИД+, Гем-

3 16574,5±6409,5 12264,4±4577,8 4310,1*2509,3 РИД-, Гем-

Примечание: уровень достоверности различий по отношению к третьей группе: * - Р<0,05; * * - Р<0,001.

Морфометрические данные канальцевого аппарата представлены В таблице 5. В почках коров, положительно реагирующих в серогностике на лейкоз, наружный диаметр проксимальных канальцев меньше на 9% (Р<0,05), чем у здоровых животных, а внутренний диаметр и площадь самого канальца больше на 22% (Р<0,05) и на 24% (Р<0,05) соответственно.

Таблица 5 - Морфометрические показатели различных отделов нефрона

Проксимальный отдел Дистальный отдел Серологические и гематологические реакции

Группа Наружный диаметр, мкм Внутренний диаметр, мкм Площадь, мкм2 Наружный диаметр, мкм Внутренний диаметр, мкм Площадь, мкм2

1 53,50*0,6** 46,1*7,3** 259,6*27,2** 19,2*0,9** 15,8*1,7** 43,3*12,5* РИД+, Гем+

2 43,20*1,1* 30,1*7,6* 279,2*63,4* 18,4*0,8* 14,7*1,2* 42,7±9,2** РИД+, Гем-

3 39,00*0,7 24,5*3,3 371,4*56,6 17,9*0,7 13,5*1,5 62,9*11,0 РИД-, Гем-

Примечание: уровень достоверности различий по отношению к третей группе: * - Р<0,05; * * - Р<0,001.

Площадь дистальных канальцев почек инфицированных животных на 32% (Р<0,001) меньше таковой у здоровых животных, при этом наружный диаметр дистальных канальцев меньше на 15% (Р<0,05), а внутренний диаметр, напротив, больше на 8% (Р<0,05).

У больных лейкозом коров наружный диаметр проксимальных отделов нефрона на 48% меньше, чем у здоровых животных (Р<0,001), а внутренний диаметр, напротив, превышает таковой на 88%(Р<0,001). При этом площадь самого канальца на 30% меньше, чем у здоровых животных (Р<0,001).

Наружный диаметр дистальных канальцев больных животных меньше на 22% (Р<0,001), чем у здоровых, внутренний диаметр больше на 17% (Р<0,001), а площадь на 31% (Р<0,001) меньше таковой у здоровых животных.

Выявленные различия в размерах проксимальных и дистальных отделов нефронов больных животных обусловлены значительным сдавливанием почечных структур лимфоидным инфильтратом и развивающимися дистрофическими и некротическими процессами в нефроцитах.

Выводы

1. Почки больных лейкозом коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЖРС, с уровнем лейкоцитов в периферической крови

и лимфоцитов 14,36±2,5х109/л имеют характерные гистологические, гистохимические и цитологические особенности на всех уровнях микроструктуры органа.

2. В почках коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЖРС (РИД+) и с высоким содержанием лимфоцитов в периферической крови (Гем+), макроскопических изменений (с поверхности и на разрезе) в структуре органа не выявляется. При гистологическом исследовании определяются характерные для лимфоидного лейкоза признаки: обильная инфильтрация лимфоид-ными клетками всех структур почек (сосудистых клубочков, извитых канальцев, кровеносных сосудов), а также дистрофические и некротические изменения эпителия, преимущественно извитых канальцев нефронов.

3. Лимфоидный инфильтрат в почках гематологически больных коров представлен полиморфными метиленофильными лимфоидными клетками, локализующимися преимущественно периваскулярно и вокруг капсул почечных телец, сдавливая почечные канальцы и сосудистые клубочки. На препаратах, окрашенных Шифф-йодной кислотой, определяется дистрофия эпителиоцитов проксимальных отделов нефронов с частичной деструкцией щеточной каймы.

4. В почках коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЖРС (РИД+) и с уровнем лейкоцитов 8,21±0,71х109/л и лимфоцитов 5,14±0,6х10 /л (Тем-), характерных для лейкоза лимфоидных инфильтратов в почечной ткани не обнаруживается. Гистохимически выявляется инфильтрация пиронинофильными клетками, не типичными для лимфоидного лейкоза. Шик-реакция обнаруживает частичную деструкцию щеточной каймы в проксимальных отделах нефронов и утолщение базальной мембраны по всему длиннику канальцев, что свойственно для дегенеративно-дистрофических, воспалительных и некротических процессов.

5. В почечных структурах больных лейкозом, инфицированных ВЖРС и здоровых коров имеются достоверные морфометрические различия в размерах почечных телец, их капсул, сосудистых клубочков, проксимальных и дис-тальных отделов нефронов,

что обусловлено значительным сдавливанием почечных структур лимфоидным инфильтратом и развивающимися дистрофическими и некротическими процессами в нефроцитах.

6. Цитологический, гистологический и гистохимический анализ почек позволяет идентифицировать микроструктурные изменения различного генеза и верифицировать диагноз у коров, положительно реагирующих в серологической реакции на лейкоз.

Практические рекомендации

Результаты исследований цитологических и гистохимических особенностей почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз, могут быть использованы:

- при написании соответствующих разделов учебных и справочных пособий и руководств по патологической анатомии и гистологии сельскохозяйственных животных;

- в учебном процессе на ветеринарных, зооинженерных и биологических факультетах высших и средних учебных заведений;

- в научно-исследовательских институтах, занимающихся выяснением и разработкой методов диагностики и борьбы с ВЛКРС;

- для формирования общей картины развития и течения патологических процессов в паренхиматозных органах при лейкозе крупного рогатого скота.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в ведущих научных журналах РФ, рекомендованных ВАК

РФ:

1. Люто А.А., Филипьев М.М., Донкова Н.В. Морфология клеток крови коров с серопозитивной и гемосомнительной реакцией на лейкоз // Вестник КрасГАУ. - 2012. - № 10.-С. 144-148.

2. Филипьев М.М., Донкова Н.В. Гистологические изменения почек коров, инфицированных ВЛКРС // Вестник КрасГАУ. - 2012. - № И. - С. 140144.

Статьи и тезисы докладов в других изданиях:

3. Филипьев М.М., Донкова Н.В. Поражение почек при рециркуляции иммунных комплексов и методы их идентификации // Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития: мат-лы Всерос. очн.-заочн. науч.-практ. и науч.-метод. конф. с междунар. участием. Ч. 2. Инновации в на-уч.-практ. деятельности / Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2010. -С. 244-246.

4. Филипьев М.М., Донкова Н.В. Особенности строения суперфици-альных и юкстамедуллярных нефронов крупного рогатого скота // Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития: мат-лы Всерос. очн.-заочн. науч.-практ. и науч.-метод. конф. с междунар. участием. 4.2. Инновации в науч.-практ. деятельности / Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2011.-С. 311-314.

5. Люто А.А., Филипьев М.М., Донкова Н.В. Принципы микроструктурной диагностики гемобластозов // Животные как часть экосистемы: мат-лы 3-й Краснояр. регион, науч.-практ. конф. (11-12 октября 2010). - Красноярск: ГУНБ Красноярского края, 2011. - С. 51-53.

6. Филипьев М.М., Донкова Н.В. Гистологические изменения почек коров, инфицированных ВЛКРС // Наука и образование: опыт, проблемы, пер-

спективы развития: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. Ч.П. Наука: опыт, проблемы, перспективы развития / Краснояр. гос. аграр.ун-т. - Красноярск, 2012.- С. 319-320.

7. Донкова Н.В., Люто А.А., Филипьев М.М. Особенности морфологии крови коров, инфицированных ВЛКРС // Наука и образование: опыт, проблемы, перспективы развития: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. Ч.П. Наука: опыт, проблемы, перспективы развития / Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2012.-С. 310-311.

8. Филипьев М.М., Донкова Н.В. Микроструктура почек коров, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии на лейкоз // Наука и образование: опыт, проблемы, перспективы развития: мат-лы междунар. науч.-практ. конф. Ч.Н. Наука: опыт, проблемы, перспективы развития / Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2013. - С. 287-289.

Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г. Подписано в печать 7.11.2013. Формат 60x84/16 Бумага тип. № 1. Печать - ризограф. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 841 Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, Красноярск, ул. Ленина, 117

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Филипьев, Михаил Михайлович, Благовещенск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

04201451557 Филипьев Михаил Михайлович

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛОЖИТЕЛЬНО РЕАГИРУЮЩЕГО В СЕРОДИАГНОСТИКЕ НА ЛЕЙКОЗ

06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и

морфология животных

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Донкова Наталья Владимировна

На п

рукописи

Красноярск 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение................................................................................................................................................................4

1. Обзор литературы..................................................................................................................................9

1.1 Морфофизиология почек млекопитающих........................................................9

1.2 Проблема лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации......................................................................................................................................13

1.3 Этиология и патогенез лейкоза крупного рогатого скота......................14

1.4 Патоморфология лимфоидного лейкоза................................................................18

1.5 Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота......................21

2. Собственные исследования 33

2.1 Материал и методы исследований..........................................................................................33

2.1.1 Объект и материал исследований......................................................................................33

2.1.2 Методы исследований..............................................................................................................34

2.2 Результаты исследований..........................................................................................................39

2.2.1 Анализ заболеваемости гемобластозами крупного рогатого скота в хозяйствах Красноярского края....................................................................39

2.2.2 Качественный и количественный состав лейкоцитов крови коров, положительно реагирующих в серодиагностике на лейкоз......................................................................................................................................................42

2.2.3 Гистологические и гистохимические особенности почек, больных лейкозом коров....................................................................................................47

2.2.4 Гистологические и гистохимические особенности почек коров, инфицированных ВЛКРС....................................................................................................65

2.2.5 Морфометрический анализ почечных структур здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров............................78

3. Обсуждение результатов исследований............................................................................83

Выводы................................................................................... 91

Практические рекомендации........................................................ 93

Библиографический список......................................................... 94

1 ч

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лейкозы относятся к заболеваниям опухолевой природы, основным признаком которых является злокачественное разрастание клеток кроветворной ткани в паренхиматозных органах, в том числе и почках. Среди них вирусный лейкоз крупного рогатого скота (ВЛКРС) причиняет существенный экономический ущерб сельскому хозяйству. Это заболевание довольно часто регистрируется во многих странах мира (Гулюкин, М.И., Васин, A.B., Замараева, Н.В., 1990; Галлеев, Р.Ф., Хусаинов, Р.Ф., 2009).

На территории Российской Федерации в структуре инфекционной патологии животных занимает ведущее место, что выдвигает проблему опухолевого роста в число наиболее сложных задач не только в ветеринарии, но и медицины (Кудрявцева, Т.П., 1981; Симонян, Г.А., 1995; Петров, Н.И., 1999; Сторожилова, Т.П., 2002; Разумовская, В.В., 2004; Храмцов, В.В., Амироков, М.А. 2008; Симонян, Г.А. 2011).

Лейкозы и другие злокачественные заболевания кроветворной ткани, объединяемые в группу гемобластозов - одна из самых острых и актуальных проблем современной онкологии. Так как все еще не решен вопрос прижизненной диагностики, что позволило бы предотвратить значительные прямые потери от опухолевидных форм лейкоза. Существующие методы диагностики (РИД, гематологический) не в состоянии обнаружить всех инфицированных животных по причине отсутствия либо низкого уровня антител (Кузнецова, А.П., Смирнов, В.П., 1998; Гулюкин, М.И., 2002).

Серологические тесты могут дать также неоднозначный результат на ранних стадиях заболевания животных, которые, например, персистентно инфицированы вирусом диареи КРС, что обусловлено снижением синтеза lg Gl, а также в случае обнаружения инфекции у телят с колостральным иммунитетом, родившихся от BLV-инфицированных коров (Makino, S., Jir: German, J., 1974; Miller, J.M., Van der Maaten, M.J., 1976; Miller, L.D., Miller,

J.M., Van der Maaten, M.J., Schmerr, M.J.F., 1985; Kettmann, R., Burny, A., Callebaut, I. et al., 1994; Ballagi-Pordany, A., Klintevall, K., Merza, M., et al., 1994). Кроме того, при иммунологической диагностике возникают ложные положительные результаты. Иногда они обусловлены высоким содержанием иммуноглобулинов в сыворотке крови некоторых животных, что может быть связано с различными патологиями (хроническим артритом или травматическим перитонитом и др.). Неспецифическая реакция наблюдается в сыворотке крови вакцинированных животных, что также связано с высоким содержанием lg G (Klintevall, К., Berg, A., Svedlund, G., et al., 1993; Szczotka, M., 2012).

Нет полной ясности в отношении путей передачи возбудителя болезни и формирования механизма устойчивости к этому заболеванию. Повсеместно растет число больных лейкозом людей, особенно детей, а также сельскохозяйственных и домашних животных. Болезнь протекает очень тяжело и, до недавнего времени, считалась неизлечимой. Сейчас появились обнадеживающие результаты при лечении новыми комплексными методами, включающими иммунотерапию. У животных на первый план выходит профилактика лейкозов (Бурба, Л.Г., Вахилов, А.Ф., Горбатов, В.А., 1988; Галеев, Р.Ф., 2003; Горбатенко, С.К., Цимбал, B.I., Клочко, О.В., Зданевич, Н.В., 2003).

По частоте поражения некроветворных органов почки поражаются в 2035% случаев. Нарушение функции почек особенно при системных заболеваниях, таких как гемобластоз, приводит к изменению гемостаза организма, поражение почек не возникает до распространения опухолевых клеток по сосудистой системе и развитии органных сдвигов, связанных с опухолевыми разрастаниями, клинические проявления заболевания отсутствуют. Для всех форм лейкоза типичными считают очаги в различных органах, в том числе и в почках. Изменения почек происходят в виде образования отдельных очагов или диффузной пролиферации, которая

приводит к почечной недостаточности с развитием анурии (Косяненко, И.И., 1968; Доронин, H.H., Бусол, В.А., Субаев, Г.Х., 1976; Смирнова, В.В. Кудрявцева, Т.П., 1980 Малашко, В.В., 1998; Кудряшов, A.A., Петров, Н.И., 1999; Lin, J., Markowitz, G.S., Valeri, A.M., et al. 2001; D'Agati, V.D., Jennette, J.C., Silva, F.G., 2005).

Гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота при лейкозе изучены недостаточно, что и послужило предметом нашего исследования.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие

задачи:

1. Установить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, больных лейкозом.

2. Изучить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, инфицированных ВЛКРС.

3. Установить гистологические и гистохимические особенности почек коров, отрицательно реагирующих в серодиагностике на лейкоз.

4. Провести сравнительный морфометрический анализ почечных структур здоровых (РИД-), положительно реагирующих в серодиагностике (РИД+) и гематологически больных лейкозом коров.

Научная новизна исследований. В работе впервые проведено комплексное гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследование почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз в условиях Красноярского края. Проведен сравнительный анализ микроструктуры почек у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров, включающий исследование клубочкового и

канальцевого аппарата нефронов. Установлена частота возникновения и характер морфологических изменений в почках у коров с серопозитивной реакцией на лейкоз.

Теоретическая и практическая значимость. Данная работа является фрагментом темы: «Микроструктурные изменения паренхиматозных органов у животных в норме и при патологии» направления научно-исследовательской работы кафедры «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. Результаты исследований дополняют и углубляют существующие данные по микроструктуре почек у крупного рогатого скота в норме, инфицированных и гематологически больных лейкозом животных, что может служить основой для оценки уровня морфофункциональных изменений и дифференциальной диагностики патологии почек.

Результаты исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедрах: «Анатомии, патологической анатомии и хирургии» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета; «Анатомии и физиологии животных» Сельскохозяйственного института Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова; «Анатомии, физиологии и патологической физиологии животных» Иркутской государственной сельскохозяйственной академии, а также в Красноярском научно-исследовательском институте животноводства Россельхозакадемии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Почки коров имеют гистологические и гистохимические особенности у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров.

2. Микроструктура почек, гематологически больных лейкозом коров, характеризуется лимфоидной инфильтрацией всех почечных структур.

3. Почки коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЛКРС, но без изменений в лейкограмме, имеют микроструктурные признаки, свойственные для дегенеративно-дистрофических, воспалительных и некротических процессов.

4. Почечные структуры, больных лейкозом, инфицированных ВЛКРС и здоровых коров имеются достоверные морфометрические различия.

Апробация работы. Основные материалы исследований доложены на: Всероссийской очно-заочной научно-практической и научно-методической конференции с международным участием «Инновации в научно-практической деятельности» (Красноярск, 2010, 2011); третьей Красноярской региональной научно-практической конференции «Животные как часть экосистемы» (Красноярск, 2010); научной интернет-конференции «Актуальные проблемы ветеринарии» (Новосибирск, Омск, Красноярск, Барнаул, 2012); Международной научно-практической конференции «Наука: опыт, проблемы, перспективы развития» (Красноярск, 2012, 2013).

Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно.

Публикации. По результатам научных исследований опубликовано восемь печатных работ, в том числе две - в ведущих научных изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает в себя 189 источника, в том числе 60 иностранных. Работа содержит, 5 таблиц, 1 схему, 44 рисунков, из них 3 диаграммы, 33 микрофотографий и 8 макрофотографии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Морфофизиология почек млекопитающих

Почки являются одним из наиболее полифункциональных органов, вся деятельность которых направлена на жизненно важные функции, влияющие на состояние обмена веществ в организме животного (Наточин, Ю.В., 1982). Основной функцией этого органа является выведение из организма азотистых шлаков. Не менее важна роль почек в поддержании баланса жидкости и электролитов, регуляции артериального давления, кислотно-щелочного гомеостаза. Почка также функционирует как эндокринный орган, секретируя гормоны и другие биологические вещества (эритропоэтин, ренин, простагландины, активную форму витамина ДЗ) (Багров, Я.Ю., 1972; Наточин, Ю.В., 2000).

Почки участвуют в осмо-, волюмо- и ионной регуляции, в поддержании кислотно-щелочного равновесия; они осуществляют экскреторную функцию и служат важным инкреторным органом (Чораян, О.Г., 1984; Наточин, Ю.В., 1999; Павлюченко, Ю.А., 2003). Все эти разнообразные функции обеспечиваются несколькими процессами, протекающих в паренхиме органа -ультрафильтрацией в клубочках, реабсорбцией, тубулярной экскрецией и синтезом новых соединений (Наточин, Ю.В., 1980; 1982; 1999).

Почки крупного рогатого скота являются бороздчатыми многососочковыми (мультипапиллярными) - отдельные почки срастаются своими центральными участками. На поверхности такой почки явно заметны дольки, разделенные бороздками; на разрезе видны многочисленные ходы, а последние уже образуют общий мочеточник, располагаются асимметрично относительно позвоночного столба. Краниальный конец правой почки достигает плоскости 12-го грудного позвонка, а каудальный - 2-3-го поясничного. Левая почка в области 2-5-го поясничного позвонка.

Интенсивность роста отмечена на протяжении первых двух лет жизни. У крупного рогатого скота вес почек достигает 1-1,4 кг, причем левая почка короче, но тяжелее шире и толще правой. Изменения объемов почек, площадей их сагиттального распила прямопропорциональны абсолютной массе органа.

На разрезе каждой почки выделяют корковую, или мочеотделительную, мозговую, или мочеотводящую и промежуточную зоны, где расположены артерии. Корковая зона расположена на периферии, она темно-красного цвета; на поверхности разреза видны почечные тельца в виде точек, расположенных радиально. Ряды телец отделяются друг от друга полосками мозговых лучей. Корковая зона вдается в мозговую зону между пирамидами последней, в ней происходит отделение продуктов азотистого обмена из крови, тоесть образование мочи. Мозговая зона более светлая, расположена в центре почки, разделена на почечные пирамиды. Основания этих пирамид направлены к периферии, из них выходят в корковую зону мозговые лучи. Вершины пирамид образуют почечные сосочки, которые могут сливаться в один. В мозговой зоне моча по мочеотводящим канальцам проводится в почечную лоханку. Объем корковой зоны у взрослого крупного рогатого скота преобладает над мозговой, увеличиваясь с возрастом примерно с 32,1% до 59,8%. Однако у старых животных мозговая зона занимает больший объем, что сказывается на работе почек (Тиняков, Г.Г., 1967; Бирих, В.К., Удовин, Г.М., 1972; Малашко, В.В., 1998; Ермакова, С.П., 2001; Павлюченко, Ю.А., 2003).

Структурно-функциональной единицей почки является нефрон, состоит из почечного тельца вместе с извитыми и прямыми канальцами. Число нефронов в почках представителей различных классов животных неодинаково. Согласно С.П. Ермакова (2001), количество нефронов зависит от величины и вида животного. У крупного рогатого скота их насчитывается около 8 млн., у овец и свиней - 1,5 млн., U. Bargmann (1978) сообщает, что в каждой из почек человека содержится 1,2-1,3 млн нефронов, по данным Н. Smith, в обеих почках собаки содержится до 816 тыс. нефронов, а у крысы - до 62 тыс. нефронов,

причем, в правой почке у них нефронов больше чем в левой, тогда как у крупного рогатого скота корковое вещество левой почки состоит из большего количества нефронов. Длина нефрона крупного рогатого скота колеблется от 18 до 80 мм, а всех нефронов от 100 до 150 км. Общая фильтрационная площадь нефронов составляет 1-2 м2 (Ермаков, С.П., 2001; Р£а11ег, 1982).

Нефроны условно подразделяют (в зависимости от места расположения) на корковые (80%) и мозговые (20%). В корковом веществе различают поверхностные, интракортикальные (супефициальные) нефроны, а в мозговом юкстамедуллярные нефроны, их почечные тельца расположены в центральных и периферических частях долек, а петля нефрона, как правило, опускается в мозговое вещество. У крупного рогатого скота форма почечных телец в основном округло-эллипсовидная, причем поверхностные почечные тельца крупнее (Ермаков, С.П., 2001; Павлюченко, Ю.А., 2003).

Нефрон имеет капсулу клубочка, в которой различают наружный листок, представляющий собой однослойный плоский эпителий, и внутренний листок, состоящий из подоцитов (эпителиальных клеток). Эпителий наружного листка капсулы переходит в эпителий проксимального отдела нефрона, который имеет вид извитого и короткого канальца с наружным диаметром 60 мкм. Стенки их выстланы кубическим каемчатым (щеточным) эпителием, клетки которого осуществляют реабсорбцию, т.е. обратное всасывание в кровь из первичной мочи ряда содержащихся в ней веществ - белков,