Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитологические аспекты регенерации сортов ячменя

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Цитологические аспекты регенерации сортов ячменя"

РГо ОД

2 5 ДЕК

На правах рукописи

Ковалева Ольга Николаевна

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГЕНЕРАЦИИ СОРТОВ ЯЧМЕНЯ

Специальность 03.00.05 — ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в 1988—1994 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени Н.И. Вавилова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л.И. Орел

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Вишнякова М.А., кандидат биологических наук Бузовкина И.Г.

Ведущая организация: Ботанический институт им. Комарова

сои на заседании Диссертационного с .. _ , ,

научно-исследовательском инстшуте растениеводства имени Н.И. Вавилова по адресу: 19000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИР им. Н.И. Вавилова.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук, профессор

В.И. Буренин

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Зерновые злаки являются важнейшими сельскохозяйственными культурами й составляют основной продукт питания населения Земного шара.

Возрастающая потребность человечества в продуктах, питания требует существенного повышения урожайности сельскохозяйственных культур. В решении этой проблемы важнейшую роль играет создание высококачественных сортов, устойчивых к патогенным микроорганизмам и экстремальным условиям среды. В связи с этам особую актуальность приобретает разработка принципиально новых, высоко эффективных методов селекции с использованием новых достижений генетики и биотехнологии. Методы биотехнологии позволяют через растения-регенеранты получать нужные генотипы, сокращая селекционный процесс. Биотехнологические методы создания нового исходного материала для селекции (получение in vitro гаплоидов, сомаклональных вариантов, клеточная селекция на устойчивость к стрессовым факторам) могут иметь место лишь в тех случаях, когда обеспечивается стабильное получение массовых количеств регенерантов.

Высокая способность к образованию растений регенератов при культивировании является необходимым условием эффективного применения кал-лусных культур. Новообразование растений in vitro представляет собой сложный интегральный процесс и в значительной степени определяется генотипом и физиологическим состоянием экспланта (Бутенко Р.Г., 1964).

Ячмень является наиболее трудным среди культурных злаков объектом для получения стабильной регенерации растений in vitro и причины этих затруднений пока неизвестны.

Накопление данных об использовании незрелых зародышей, обеспечивающих высокую частоту регенерации, явилось важным этапом в решении проблемы регенерации в культуре тканей. Однако вопрос о фазе развития экспланта, обеспечивающей максимальный выход регенерантов сравнительно м&то изучен. Не известны надежные морфологические маркеры зародышей, позволяющие отбирать их на оптимальной для культивирования in vitro фазе развития.

Закономерности морфогенеза и изменчивости генома, выявленные для модельных объектов, таких как томаты, табак, картофель не могут быть применимы для ячменя. Поэтому, цитологическое изучение культуры клеток яч-

меня при длительном культивировании и характеристик экспланта, обладающего морфогенетической компетентностью является актуальным для решения этой проблемы.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований было: цитогенетическое изучение причин разного уровня регенерационной способности при длительном культивировании каллуса ячменя сортов Roland, Golden Promise и Bruce; изучение дифференциации зародыша у сортов Roland,Golden Promise и Bruce и поиск морфологического маркера для отбора компетентных к регенерации зародышей.

Это предполагало решение следующих задач: 1) Сравнить уровень регенерационной способности на диплоидном и гаплоидном уровнях у исследованных сортов ячменя. 2) Изучить характер распределение клеток по числу хромосом в каллусах и митотическую активность при длительном культивировании каллусов сортов ячменя. 3) Изучить уровень регенерации в первичном каллусной культуре, образованной из зародышей разного размера с разной степенью прозрачности. 4) Провести морфогистохимическое изучение зародышей различного размера для определения длительности периода их компетентности к морфогенетическим процессам в культуре in vitro.

Научная новизна. Впервые проведено изучение причин, обуславливающих разный уровень регенерации при длительном культивировании каллусов сортов ячменя, различающихся по регенерационной способности. Показано, что морфегенной способностью обладают каллусы, клеточные популяции которых являются гомогенными или слабо гетерогенными на 96% состоящие из клеток соответствующих кариотипу экспланта. Впервые проведено изучение дифференциации зародыша для определения фазы его развития оптимальный для получения морфогенного каллуса. Показано, что различие в длине вегетационного периода у сортов ячменя влияет на протяженность периода компетентности зародыша к регенерации.

Практическая значимость. Результаты поведенных исследований дают боле полное о цитогенетических процессах в каллусных культурах сортов ячменя различающихся по регенерационной способности. Полученные данные показывают, что образование морфогенного каллуса зависит от продолжительности вегетационного периода сортов ячменя. В результате изучения дифференциации зародышей выявлено, что определенная фаза дифференциации может быть использована, как маркер зародыша способного давать мор-фогенный каллус. Это позволяет, в дальнейшем, зная продолжительность ве-

гетационного периода сорта вовлекаемого в селекционный процесс отбирать для культивирования зародыша по морфологическим показателям компетентные к морфогенезу.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на «Международном симпозиуме клеточной и генной биотехнологии для зерновых злаков» (Алма-Ата, 1989), на симпозиуме «Актуальные проблемы цитогене-тики зерновых культур» (Таллин, 1989).

Структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и включает 18 микрофотографий, 5 рисунков, 7 таблиц, 6 приложений. Список литературы содержит 145 наименований из них 125 на иностранном языке.

Материал и методы. Объектом исследованием служила каллусная культура полученная от незрелых зародышей сортов Golden Promise, Roland и Bruce, различающихся по регенерационной способности.

Культура in vitro. Для получения диплоидных каллусных клонов использовали незрелые зародыши трех сортов ячменя размером 1,2—1,5 мм; для получения гаплоидных зародышей сорта ячменя скрещивали с диплоидным цитотипом Hordeum bulbosum (2n = 2х =14). Каллусы получали на питательной среде B5L с добавлением 2,4 дихлорфеноуксусной кислоты в концентрации 2 мг/л. Затем для получения растений регенерантов каллус переносили на свежую питательную среду B5L и выставляли на свет, через 3—4 недели меняли питательную среду.

Цитологическая методика. На 6—7 день культивирования от каллуса отделяли кусочки и фиксировали их в ацетоалкоголе (3:1) в течение ночи в холодильнике, затем окрашивали ацетокармином, добавляя 2—3 капли 2%-ного хлорного железа. Давленные препараты готовили в 45%-ной уксусной кислоте по общепринятой методике. Для каждого каллусного анализировали 10—20 препаратов, набирали около 100 и более делящихся клеток. Для характеристики сорта исследовали 7—10 клопов. Материал отбирали в 4-х - 5 пассажах. Активность роста каллуса определяли по митотическому индексу (МИ) равному отношению числа делящихся клеток к общему числу клеток. Изучение числа хромосом у растений регенерантов проводили на давленных препаратах кончиков корней по обще принятой методике. Подсчитывали 10 мета-фаз на растение.

Морфогистохимическая методика. Вычлененные зародыши измеряли и в соответствии с длиной распределяли в группы: 0,5—0,75 мм (I гр.), 0,8—1,25

мм (II гр.), 1,3— 1,5 мм (II гр. ), 1,6 —2,0 мм (IV гр.). В каждой группе суммарно набирали 300—400 зародышей. При вычленении у каждого из них записывали характеристики прозрачности: полностью прозрачный (1 класс), с непрозрачной зародышевой осью и в разной степени прозрачным щитком (2 класс), полностью непрозрачный (3 класс). Подсчитывали долю зародышей с указанными характеристиками в каждой из 4-х групп.

Морфогистохимическую дифференциацию зародышей изучали, используя зародыши разной степени прозрачности. Для этого зародыши окрашивали в 0,05% водном растворе толуидинового синего при pH 4,4 в течение 1—5 мин и заключали в 60% водный раствор глицирина. Окрашенные толуидиновым синим, препараты зародышей использовали для анатомического исследования. При окрашивании толоуидиновым синим ткани с интенсивным синтезом нуклеиновых кислот и белка окрашиваются в яркий голубо-зеленый цвет, в то время как ткани выполняющие защитные функции - в бледно-зеленый, а крахмальные зерна - в фиолетовый.

Реакцию на крахмал проводили с помощью JKJ.

Экспериментальные данные обрабатывали стандартными статистическими методами (Урбах, 1963). Доверительные границы найдены при помощи арксин-преобразования Фишера.

Результаты исследований и обсуждение.

Регенерация и причины потери регенерационной способности в пассируемом каллусе у сортов ячменя Roland. Golden Promise и Bruce.

Каллусообразование и регенерация in vitro. Особенности регенерации и причины ее потери изучали при культивировании каллусов, полученных от незрелых зародышей сортов Roland, Golden Promise и Bruce на диплоидном и гаплоидном уровнях.

По индукции каллусообразования в культуре незрелых зародышей на диплоидном уровне три сорта имели сходные показатели. В то же время они сильно различались по способности к регенерации растений. Сорт Golden Promise значительно превосходил сорта Roland и Bruce по этому признаку (110%, 67% и 16% соответственно) (табл. 1).

Таблица 1

Каллусообразоваше и регенерация в эмбриокультуре диплоидных сортов ячменя.

Экспланти- Образовалось калллусов % индукции каллуса Регнерация

Название сорта ровано зародышей кол-во ре-генерантов % регенерации % вП,

Roland 200 146 73 ±1,1 98 67 60

Golden Promise 170 149 87,6 ± 0,8 160 110 87

Bruce 210 148 70,4 ± 1,6 25 16,9 15

У сорта Golden Promise отмечен высокий уровень регенерации во втором и последующих пассажах.

В культуре незрелых гаплоидных зародышей наибольшей способностью к каллусогенезу обладал сорт Bruce (63%), а наименьшей - сорт Roland (33%) (табл. 2).

Таблица 2

Каллусогенез и регенерация в эмбриокультуре гаплоидных сортов ячменя

Название сорта Скрещивание с H.bulbosum L. Эксплант зародыша Образование каллуса % каллусогенеза Регенерация

опылено цветков завязалось семян ^ i количество реге-нерантов % регенерацион-ной способности вПь%

Roland 1057 850 524 175 33 56 32 80

Golden Promise 639 512 450 210 47 180 85.7 72

Bruce 1040 835 545 345 63 210 65 86

По способности к регенерации гаплоидные каллусы сортов Bruce и Golden Promise достоверно отличались от каллусов сорта Roland. У всех сортов регенераты в основном были получены в первом пассаже.

Цитогенетическая характеристика пассируемого каллуса исследуемых сортов ячменя.

Цитогенетическая характеристика каллуса, полученного от диплоидных незрелых зародышей.

сорт Roland

При эксплантации зародышей сорта Roland на питательную среду образовывался желтый, медленнорастущий, водянистый каллус, состоящий из ме-ристематических и паренхимных клеток. Основное количество растений реге-нерантов получено в первом пассаже. В первом пассаже каллус активно рос (МИ = 12,5 ± 0, 8), в третьем пассаже количество меристематических клеток и активность деления в них уменьшилось (МИ= 3,7 ± 0,7). В первом и втором пассажах выявлялись клоны, имеющие моногенную по числу хромосом клеточную популяцию и клоны, с небольшим количеством анэуплоадных, гаплоидных и полиплоидных клеток, но по числу диплоидных клеток не отличающиеся от моногенной клеточной популяции и обладающие регенерационной способностью, и клоны с гетерогенной клеточной популяцией не обла-дующие регенерационной способностью. Начиная со второго пассажа отмечалось увеличение гетерогенности клеточной популяции, приводящие к потере регенерационной способности. Быстрая потеря митотаческой активности приводила к старению каллуса, так что к четвертому пассажу большинство клонов состояло только из паренхимных клеток.

сорт Golden Promise

У сорта Golden Promise каллус характеризовался компактной узелковой структурой, активным ростом, был беловатого цвета и состоял из меристематических и паренхимных клеток. Растения-регенеранты образовывались как в первом пассаже, так и в последующих пассажах. В первом пассаже каллусные клоны активно росли (МИ= 28,7 ± 0,7). В третьем пассаже активность клеточного деления снизилась (МИ = 11,2 ± 0,85), но оставалась достаточно высокой. На протяжении пяти пассажей выявлялись клоны, имеющие по числу хромосом моногенную диплоидную клеточкою популяцию и слабо гетерогенную, обладающие морфогенной способностью и клоны с гетерогенной клеточной популяцией не обладающие регенерационной способностью. При длительном культивировании в каллусс наблюдалось увеличение числа полиплоидных клеток. Нами отмечено, что у данного сорта на протяжении культивирования клоны способны к элиминации клеток с иным числом хромосом и со-

хранению диплоидного набора, что приводило к сохранению морфогенного потенциала и повторной регенерации.

сорт Brace

Каллусные клоны сорта Bruce различались между собой по степени интенсивности роста и структуре каллуса. Среди полученных каллусов сорта Bruce можно выделить три типа: I - гладкий, водянистый, медленно растущий каллус желтоватого цвета; П - рыхлый каллус зернистой структуры белого цвета, быстро растущий; III - компактный, узелковый каллус белого цвета с активным ростом. Каллусы первого типа состояли в основном из клеток паренхимы с хорошо видимой оболочкой, вакуолизированной цитоплазмой. Часть клонов имели клетки паренхимы заполненные крахмалом у другой части клонов небольшие участки меристемной ткани закладывались внутри каллуса и были окружены клетками паренхимы. Зоны меристемы были небольшие и состояли в основном из диплоидных клеток, делящиеся клетки в них наблюдались редко. Растений регенерантов получить не удалось. Для каллус-ных клонов, относящихся ко второму типу, характерно наличие обширной зоны меристемы, формирующейся на поверхности каллуса. По числу хромосом популяция меристематических клеток гетерогенна. В первом пассаже наблюдались наряду с диплоидными, составляющими основную массу, анеуплоид-ные, тетраплоидные и гаплоидные клетки. Во втором пассаже наряду с указанными типами клеток появлялись октоплоидные. При распределении клеток по числу хромосом практически невозможно выделить модальный класс. Регенерации у этого типа каллусов не наблюдали. Каллусные клоны третьего типа характеризовались закладкой меристемы на поверхности каллуса. В первом пассаже каллус активно рос (МИ= 18,6 ± 0,8). В первом, втором и третьем пассаже выявлись клоны имевшие моногенную или почти моногенную по числу хромосом клеточную популяцию. Хотя нами отмечена регенерация только в первом пассаже наличие моногенной или почти моногенной клеточной популяции во втором и третьем пассажах свидетельствует о сохранении этим сортом потенции к морфогенезу. Гетерогенные клеточные популяции не обладали морфогенной способностью. В четвертом пассаже все популяции были гетерогенными и увеличение гетерогенности шло за счет увеличения числа полиплоидных клеток.

У каждого из трех сортов проанализировано число хромосом у 50 рас-тений-регенерантов. Все изученные растения были диплоидными, что свидетельствует о том, что тотипотентными свойствами у ячменя, в отличии от по-

липлоидных культурных растений, обладают как правило только цитогенети-чески сбалансированные клетки.

Изученные сорта различались и по митотической активности. Каллус-ные клоны сорта Golden Promise обладали высокой митотической активностью в первом пассаже и сохраняли ее до третьего пассажа. У сортов Roland и Bruce митотическая активность в первом пассаже была ниже и падала к третьему пассажу, так, что в четвертом пассаже они переходили в стадию старения и в дальнейшем к некрозу. Вероятно, сохранение митотической активности у copra Golden Promise обеспечивает способность каллуса к элиминации клеток с иным числом хромосом и сохранению способности к морфогенезу. Низкая митотическая активность сортов Roland и Bruce приводит к накоплению клеток с разными уровнями плоидности, увеличению гетерогенности клеточных поиуляций, потерей ими морфогенной потенции и быстрому старению.

Цитогенетическая характеристика гаплоидного каллуса сортов ячменя.

сорт Roland

Медленнорастущий каллус был желтоватого цвета, водянистой консистенции, состоящий из меристематических и паренхимных клеток. В первом пассаже клетки каллусов активно делились (МИ = 12,2 ± 0,6), а к третьему пассажу активность деления снижалась (МИ = 4,2 ± 0,5), что приводило к быстрому старению каллуса. В первом и втором пассаже по числу хромосом выявлялись клоны с моногенной клеточной популяцией, обладающие морфогенной способностью и клоны с гетерогенной клеточной популяцией не обладающие регенерационной способностью. В процессе культивирования происходило увеличение количества анэуплоидных и диплоидных клеток при модальном классе гаплоидных клеток. Основная масса растений-регенерантов была получена в первом пассаже, сорт Golden Promise

У данного сорта образовавшийся каллус был беловатого цвета, узелковый, плотной консистенции, с активным ростом и состоял из меристематических и паренхимных клеток. Каллусные клоны активно регенерировали (83,5%) давая растения-регенеранты как в первом, так и во втором пассажах. В первом пассаже в клетках клонов наблюдали активное деление (МИ = 24,6 ± 0,5). В третьем пассаже митотическая активность уменьшилась (МИ = 14,6 ± 0,4), но оставалась достаточно высокой. В первых двух пассажах по числу хромосом выделялись два типа клонов: клоны имевшие моногенную или поч-

ти моногенную клеточную популяцию и обладавшие морфогенной способностью и клоны имеющие гетерогенную клеточную популяцию и не образующие регенерантов. Начиная с третьего пассажа, происходило возрастание гетерогенности клеточных популяций за счет увеличения числа диплоидных клеток. В четвертом пассаже отмечен клон с модальным классом диплоидных клеток, сорт Bruce

Образовавшийся у сорта каллус был беловатого цвета, узелковый, плотной консистенции, с активным ростом и состоял из меристематических и паренхимных клеток. При культивировании гаплоидные каллусные клоны сохраняли достаточно высокую метотическую активность (в первом пассаже МИ = 29,7 ± 0,7; в третьем пассаже МИ = 13,2 ± 0,8). В первом и третьем пассажах по числу хромосом выделялись клоны имевшие моногенную или почти моногенную гаплоидную клеточную популяцию и обладавшие морфогенной способностью и клоны с гетерогенной клеточной популяцией. Среди гетерогенной клеточной популяцией наблюдали полиморфизм по распределению клеток с разным числом хромосом. Особо выделялись клоны 9, 14, 17 которые имели большое количество диплоидных клеток, чем другие клоны. В третьем пассаже число диплоидных клеток у них образовывало модальный класс. В четвертом пассаже почти все клоны переходили на диплоидный уровень. Каллусы этого сорта обладали высокой регенерационной способностью (65%). Основное количество регенерантов было получено в первом пассаже, но и в последующих пассажах также отмечалось появление регенерантов.

Для каждого из исследуемых сортов число хромосом проанализировано примерно на 50 растений-регеперантов. У сортов Roland и Golden Promise все растения были гаплоидными, только три растения сорта Bruce полученные в более поздних пассажах были диплоидными. Это свидетельствует в пользу того, что тотипотентными свойствами и у гаплоидов обладают цитогенетиче-ски сбалансированные клетки.

Как видно из наших данных в процессе культивирования гаплоидных зародышей ячменя сортов Roland, Golden Promise и Bruce полученные каллусы различались по морфологии, регенерационной способности, митотической активности и динамике изменчивости числа хромосом. Наивысшей регенерационной способностью обладал сорт Golden Promise.

Наши исследования показали, что морфогенной способностью обладали однородные по числу хромосом клеточные популяции и гетерогенные популяции в случае если они имели незначительное количество клеток с разными

кариотипами. Как видно из наших данных морфогенной способностью обладали гетерогенные клеточные популяции на 96% состоящие из клеток, карио-тип которых соответствовал кариотипу экспланта (табл. 3).

У двух сортов как у гаплоидных, так и у диплоидных зародышей ячменя при введении в культуру наблюдалось образовывайте одинакового по морфологии каллус.У сорта Roland это был водянистый медленно растущий каллус, у сорта Golden Promise - узелковый активно растущий. У сорта Bruce из гаплоидного зародыша образовывался только узелковый каллус с активным ростом. При культивировании диплоидного зародыша мы наблюдали образование трех типов каллуса, причем морфогенной способностью обладал только один тип каллуса - узелковый активно растущий. О неспособности к морфогенезу каллусов, меристематические зоны которых находятся внутри паренхимы уже указывалось в литературе (Гапоненко, 1987). Образование нескольких типов каллуса из диплоидного зародыша сорта Bruce, вероятно, связано с физиологическим состоянием зародыша во время его помещения на среду для образования каллуса. Сорт Bruce отличается от сортов Roland и Golden Promise по длительности вегетационного периода. Он относится к скороспелым сортам и имеет короткий период вегетации, в то время как сорта Roland и Golden Promise имеют длинный период вегетации. Возможно, длительность вегетационного периода также связана и со скоростью развития зародыша. Можно предположить, что сорта различающиеся по длительности вегетационного периода могут различаться и по степени развития зародыша, имеющего одинаковый размер. Этому вопросу посвящен следующий раздел нашей работы.

Морфоцитологическая характеристика зародышей ячменя сортов Roland. Golden Promise и Bruce.

Было проведено изучение дифференциации зародыша для определения оптимальной фазы его развития для получения морфогенного каллуса.

Зависимость регенерационной способности каллусов от морфологии зародыша.

У всех сортов ячменя наблюдалась общая тенденция снижения уровня регенерации у зародышей, достигших размера 1,3—1,5 мм (III груши). Для этой группы также отмечено резкое снижение доли прозрачных зародышей. Однако, у сорта Bruce падение уровня регенерации наблюдали у зародышей размером 0,8-1,25 мм (р<0,05).

Таблица 3

Распределение клеток по числу хромосом у регенерирующих каллусов сортов ячменя.

Сорт № кл. п, количество клеток, % пг количество клеток, % Пз количество клеток, % п4 количество клеток, %

а п 2п 4п всего а п 2п 4п всего а п 2п 4п всего а п 2а 1 4п всего

Golden Promise J Roland j 1 100* 110

2 100* 76

20 2,1 97,9* 99

10 100 85 3,7 96,3* 109

IS 100* 78

9 1,2 98,8 76 2,6 97,4* 98

9 100* 85 100 105 100 85 100* 50

12 100 108 100* 94

11 100* 95 100 100 100* 95

16 2,8 1,9 94,3 0,9 106 100 50 10 10 60 20 100 100* 50

19 100 50 100 85 100* 95

4 100* 85

3 100 112 100* 106

6 0,98 96,7* 2,94 102

Bruce 10 100* 98

IS 0,6 98,5* 0,9 100

а - анэуплоидные, п - гаплоидные клетки П - пассаж *- регенерация

У сорта Roland максималь-ный уровень регенерации наблюдали при размере зародыша 0,8—1,25 мм (р<0,05) в то время как у сорта Golden Promise высокий уровень регенерации отмечен у зародышей I и II групп (см. рис. 1).

Рис.1 Доля прозрачных зародышей и процент регенерации у зародышей ячменя разного размера.

размер зародышей в группах: I - 0,5—0,75 мм; II - 0,8—1,25 мм; III - 1,3—1,5 мм; IV- 1,6—2,0 мм

IV группа была представлена полностью непрозрачными зародышами, причем регнерационная способность отмечена только для зародышей сорта Golden Promise. У сорта Bruce только полностью прозрачные зародыши были способны к регенерации, в то время как у сортов Golden Promise и Roland компетентность к регенерации сохраняют также зародыши с непрозрачной осью и с разной степенью прозрачности щитка. Следовательно, изменения степени прозрачности зародышей, равно как и их размера не имеют однозначной причинной связи с изменением их морфогенетической компетентности и по этому не могут быть использованы в качестве визуальных маркеров при отборе зародышей, способных к регенерации в культуре in vitro.

Морфогистохимическая характеристика зародышей разной степени прозрачности.

Определение биохимической активности тканей зародыша проводилось у прозрачных, не полностью прозрачных и непрозрачных зародышей.

На раннем этапе дифференциации зародыши сорта Bruce характеризовались отсутствием или едва заметной дифференциацией оси. Однако, среди

II III IV размер зародышей

II III IV размер зародышей

прозрачных слабо дифференцированных зародышей встречались зародыши с выделяемой дугой кояеоптиля и различимой почечкой на верхнем и корневым апексом на нижнем полюсах. При окраске толуидиновым синим четко выделялась осевая часть, окрашенная в ярко голубо-зеленый цвет. К концу этой стадии сферическая форма колеоптиля растягивалась, уплощалась окраска становилась бледно-зеленого цвета. На стадии полупрозрачных зародышей сорта Bruce можно было различить апекс эпикотиля с двумя листовыми при-мордиями и корневой примордий. Колеориза составляла одно целое с суспен-зором и плотно примыкала к корневому чехлику зародышевого корешка, ко-леоптиль уплощался, ось зародыша окрашивалась в бледно-зеленый.

На стадии прозрачного зародыша у сорта Golden Promise осевая часть выделялась в виде относительно плотного однородного образования меристе-матических клеток. При окраске толуидиловым синим осевая часть окрашивалась в голубо-зеленый цвет. На стадии полупрозрачных зародышей у сорта Golden Promise просматривался только колеоптиль сферической формы плотно прижатый к зачатку побега, который окрашивался толуидиновым синим в ярко голубо-зеленый цвет. На последней фазе развития колеоптиль отодвигался диффиринцирующейся почечкой, становится дугообразным, в мезоко-тиле появились зачатки придаточных корней. У сорта Golden Promise встречались зародыши, колеоптили которых окрашивались толуидиновым синим в ярко голубо-зеленый, и зародыши, колеоптили которых окрашивались в бледно-зеленый независимо от дифференциации зародыша.

У прозрачного зародыша сорта Roland осевая часть выделялась в виде однородного образования меристематических клеток, колеоптиль имел сфе-роподобную форму. При окраске толуидиновым синим ось и колеоптиль окашивались ярко голубо-зеленым цветом. На стадии не полностью прозрачных зародышей у сорта Roland наблюдались зародыши со сферической формой колеоптиля, окрашивавшиеся толуидиновым синим в ярко голубо-зеленый цвет, и зародыши с уплощенным, дугообразным колеоптилем, дифференцирующейся точкой роста и зачатками боковых корешков, колеоптиль которых окрашивался в бледно-зеленый цвет. На стадии непрозрачного зародыша у сорта Roland хорошо различали апекс эпикотиля с листовыми при-мордиями и корневой примордий. При окраске толуидиновым синим у всех зародышей колеоптиль окрашивался в бледно-зеленый цвет (табл. 4).

Таблица 4

Показатели морфогистохимической дифференциации оси зародышей разной степени прозрачности.

Дифференциация верхнего полюса зародыша Дифференциация нижнего полюса зародыша Окраска кол оптиля толу диновым сип

1 Группа Сорта Дуга ! колеоптиля Начало формирования почечки Почечка с апиксом Корневой примордий Первичный корень с чехликом Голубо- 1 зеленая яркая 1 Зеленая

1 Bruce Roland Golden Promise + + - - - + + +

2 Bruce Roland Golden Promise + + + + + + + -+ + + + + + 4 4

3 Bruce Roland Golden Promise + + + + 4-+ + + + + + + + + + 4 4 4

+ 4- 4- + + +

1 - полностью прозрачные

2 - прозрачная ось и частично прозрачный щиток

3 - непрозрачные

Показано, что размер зародыша не может служить универсальным критерием его дифференцированности и использоваться для отбора зародышей компетентных к регенерации в культуре in vitro. Установлено, что независимо от скорости развития зародышей завершение дифференциации зародышевой оси сопряжено с изменением формы колеоптиля от сферической на полусферическую (уплощенную, дугообразную) и появлением окраски слабо зеленого цвета после окрашивания толуидином синим. Зародыши сортов различающихся по длительности вегетационного периода различаются и по длительности периода компетентности к морфогенезу в культуре in vitro. Протяженность периода компетентности зародышей к регенерации определяется временем необходимым для дифференциации зародышевой оси на органы. У скороспелого сорта Bruce она осуществляется с высокой скоростью и заканчивается при меньших размерах зародышей и большей их прозрачности по сравнению с сортами Roland Golden Promise.

Заключение

В результате проведенного нами исследования выявлены определенные тенденции и закономерности каллусных культур,полученных от незрелых зародышей ячменя сортов Roland, Golden Promise и Bruce. Изученные сорта различаются по морфологии каллуса, регенерационной способности, митоти-ческой активности и характеру распределения клеток по числу хромосом при культивировании. Наибольшей регенерационной способностью как на гаплоидном так и на диплоидном уровне обладает сорт Golden Promise.

Как на диплоидном, так и на гаплоидном уровне образование расте-ний-регенерантов у изученных сортов наблюдали главным образом в первом и втором пассажах. Изучение числа хромосом в клетках каллусов показало, что морфогенной способностью обладают каллусы, состоящие из гомогенной клеточной популяции или гетерогенной, которая на 96% состоит из клеток, имеющих число хромосом равное числу хромосом донора экспланта. Накопление анэуплоидных и полиплоидных клеток и снижение митотической активности приводит к потере регенерационной способности. Высокая миготи-ческая активность связана с элиминацией клеток с анэуплоидным и полиплоидным числом хромосом и способствует сохранению морфогенных свойств, что отмечено у сорта Golden Promise на диплоидном уровне.

С увеличением времени культивирования происходит процесс поли-плоидизации каллусных культур, причем в каллусах гаплоидного происхождения степень полиплоидии выше.

Период компетентности клеток зародышей к морфогенетическим процессам в культуре in vitro определяется отрезком времени, необходимым для завершения морфологической дифференциации зародышей в in vivo. Признаком незавершенности дифференциации зародышевой оси может служить сферическая форма колеоптиля и его способность окашиваться тоуидиновым синим в голубовато-зеленоватый цвет. Скорость морфологической дифференциации определяется генотипически, в частности у раннеспелого сорта Bruce дифференциация зародышей осуществлялась быстрее, чем у позднеспелых сортов Golden Promise и Roland.

Выводы

1. Сорта Roland, Golden Promise и Bruce различаются по морфологии каллуса, полученного от незрелых зародышей размером 1,2 -1,5 мм, регенерацион-

ной способности, митотическому индексу и характеру распределения клеток по числу хромосом при длительном культивировании. Высокий уровень регенерационной способности сорта Golden Promise связан со способностью его клонов к повторной регенерации при длительном культивировании.

2. Морфогенной способностью обладают как гомогенные клеточные популяции, так и гетерогенные, при условии что они состоят на 96% из клеток с числом хромосом соответствующем числу хромосом экспланта. Накопление анэуплоидных и полиплоидных клеток ведет к потере регенерационной способности.

3. Длительное сохранение митотической активности клеток каллуса сорта Golden Promise обуславливает его способность к элиминации анэуплоидных и полиплоидных клеток и сохранению морфогенетического потенциала.

4. Зародоши сортов Roland, Golden Promise и Bruce различаются по длительности периода компетентности к морфогенезу в культуре in vitro.

5. Маркером завершенности дифференциации зародышей ячменя и связанной с этим потерей их компетентности к регенерации является полусферическая (дугообразная) форма колеоптиля и слабо зеленая окраска его тканей толуидиновым синим.

6. Протяженность периода компетентности зародышей к регенерации определяется отрезком времени необходимым для дифференциации зародышевой оси на органы. У скороспелого сорта Bruce она осуществляется с высокой скоростью и заканчивается при меньших размерах зародыша и большей его прозрачности по сравнению с зародышами среднепозднеспе-лых сортов Roland и Golden Promise.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Ковалева О.Н., Дунаева С.Е. Кариотипическая характеристика пассируемого каллуса ячменя в связи с его регенерационной способностью // Бюл. ВИР. - 1987. - Вып. 170. - С.86—89.

2. Ковалева О.Н., Дунаева С.Е Цитогенетическая характеристика пассируемого каллуса полученного из диплоидных зародышей ячменя // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. - 1989. - Т. 124. - С.67-76.

3. Ковалева О.Н. Исследование изменчивости кариотипа ячменя при работе с культурой клеток // Третье совещание по кариологии. С.-Петербург - 1992. -С.65.

4. Ковалева О.Н. Цитогенетический анализ клонов полученных из незрелых зародышей ячменя сорта Bruce //Бюл. ВИР. - 1992. -Вып.218. - С.54—55.

5. Дунаева С.Е., Лукьянова М.В., Ковалева О.Н., Козырева О.Г. Регенерация растений из незрелого зародыша скороспелых и позднеспелых сортов ячменя. 1. Регенерация растений в первичном каллусе полученном от незрелого зародыша // Физиол. растений. - 2000. - Т.47. - №1. - С.48-51.

6. Дунаева С.Е., Ковалева О.Н., Голубева Е.А., Москалева Г.И., Козырева О.Г. Регенерация растений из незрелого зародыша скороспелых и позднеспелых сортов ячменя. 2. Морфологическая дифференциация зародышей как индикатор их компетентности к регенерации // Физиол. растений. -2000. - Т.47. -№1. - С.52—57.