Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локус WAXY как модельная система трансформации ячменя

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Локус WAXY как модельная система трансформации ячменя"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТШШ ИМЕНИ II.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи КОЧНОВА Наталья Павловна

УДК 575.113:577:633.16

ЛОМГС «ТАХТ КАК СДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ТРАНСФОРМАЦИИ ЯЧМЕНИ

03,00.15 - генетика

4 в I о р е ф в р а I

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук -

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и генетической иннеиерии растений Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук ' АНАНЬЕВ Е.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОШОНЯШ: доктор биологических наук и.М.АНДРИАНОВ кандидат биологических наук 0.А.0ГАРК0ВА

ВЕДУЩИЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Научно-исследовательский институт генетики а селекции промышленных микроорганизмов РАН ■

Бацита состоишься "_"_1994 года в_ часов

на заседании специализированного совета Д 002,49.01 при Институте общей генетики им.И.И.Вавилова РАН по адресу: Москва, В-333, ул.Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГей РАН.

Автореферат разослан "_"_1994 г.

Ученый секретарь специализированного'•совета, кандидат биологических наук

Г.Н.ПОЛУХИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. В решении проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных культур вазшую роль играет создание высококачественных сортов, устойчивых к патогенный микроорганизмам и экстремальным условиям окружающей среды, В связи с этим особую актуальность приобретает разработка принципиально новых, высокоэффективных методов селекции с использованием достижений современной генетики и биотехнологии, в частности методов генетической трансформации.

Разрао'отку методов введения экзогенной ДНК желательно 'вести с использованием легко тестируемых признаков, позволяющих отбирать трансформанты. Этому критерию отвечает признак, кодируемый локусом waxy (wx ). Это - один из ферментов, участвующих в синтезе крахмала, а, именно, уридинднфосфатглюкозилтрансфераза (УДФГ трансфераза). УДФГ трансфераза является ключевым ферментом в биосинтезе амилозы, откладываемой в ¡слетках эндосперма и пыльцевых зернах (Nelson, 1968,1978; Isai , 1974; Bewley et.al,1985), Нарушение биосинтеза амилозы в результате мутации по локусу wx легко тестировать с помощью окраски молекулярным йодом. Удобство данной модели состоит также в том, что анализ моает бить произведен не только на эндосперме семян, но и на пыльцевых зернах. Кроме того, в настоящее время локус wx клонирован (Shure et.al., 1983; Kioegen et.al, 1986; Ананьев и,др.,1986; Kohde et.al,I988), что позволяет использовать в качества донорной ДНК рекомбинант-ную плазииду, несущую полноразиерную последовательность этого гена ячменя. . '

К настоящему времени в области генетической трансформации растений достигнуты впечатляющие результаты, разработан ряд высокоэффективных методов введения экзогенной ДНК. Однако, большинство однодольных растений, включая и важные в практическом отношении виды семейства злаковых в большинстве случаев трудно трансформировать с поыовдыо традиционных методов (невозможно, эа редким исключением, инфицировать их агробактернями, пока еще не решены проблемы регенерации протопластов злаковых). Поэтому для введения чужеродных последовательностей в геном злаков часто используют два следующих метода: инъекция Д11К в ткани (Картель''«, др. ,1986; De la Репа, 1986) tf обработки пыльцы растворами экзогенной ДНК (otha., 1986;Martin et.al. , 1992; Чесноко», 1992). в"~

наших опытах по генетической трансформации ячменя мы применяли эти два метода.

При проведении экспериментов по введению экзогенной ДНК особое внимание следует уделить подбору сорта реципиента. Используя мутанты по локусу тех в качестве реципиентов, необходимо учитывать, что но данным ряда авторов ( Me Clintock, 1948,1958; Nelson 1968; Eriksson , 1969) этот локус в некоторых сортах кукурузы генетически нестабилен, кроме того является излюбленной мишенью мобильных генетических элементов. Поэтому при подборе.сорта-реципиента необходимо убедиться, что уровень спонтанных реверсий по локусу wx к норме относительно низок. В противном случае, при идентификации траногенивх растений можно ошибочно принять за трансформантов реверсию к норме.

При проведении опытов по генетической трансформации необходимо иметь представление о судьбе экзогенной ДНК, попадающей в растительные ткани и клетки, и, учитывая наличие сильной нуклеаз-boß активности, найти способ защиты вводимой ДНК.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в создании на основе локуса wx модельной системы трансформации ячменя. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

"'I. Оценить имеющиеся в нашем распоряжении ряд сортов ячменя ¡.¡утаитных по локусу wx по признаку стабильности этой мутации и подобрать сорт реципиент.

2. Разработать способ отбора трансформантов при введении в кутантные сорта клонированного гена ш ячменя. Введение ДНК провести методом адвекции и методом нанесения пыльцы, замоченной в растворах ДНК в момент опыления.

3. Проследить судьбу экзогенной ДНК при введении в растение (т.е.быстроту и степень разрушения ее под действие« растительных иуклеаз;. Определить способы ее защиты.

Научная новизна и практическая значимость работы. Кодифицированные нами существующие методики идентификации мутантов по wx с помощью окраски йодом пыльцевых зерен и разработанные методики окраски эндосперма позволяют использовать локус wx как простой и удобный паркер в опытах по генетической трансформации. Предложено в качестве реципиента использовать сорт violaceum мутантный v.o. wx . 1'азработан способ введения экзогенной ДН.с в ячмень с номоцьо лаицезнх трубок. Предложена искусственная питательная

с^еда для проращивания пыльцы ячменя. При использовании метода нанесения пыльцы с ДНК на рыльце пестика наблюдалось увеличение нормальных по wx зерен с частотой 1,1$.

Впервые у ячменя обнаружена высокая степень нестабильности по wx локусу. в изученных сортах японского происхождения частота реверсий составляла iCT2 - Ю-5. В Fg от скрещивания мутантов с нормой обнаружены мозаичные семена. На основе этих данных и данных рестршшюго анализа, выявившего мексортовце различия в структуре локуса, высказано предположение о наличии в области локуса мобильных генетических элементов, усиление нестабильности по локусу wx наблюдалось при воздействии различными видами экзогенной ДНК. Вероятно, перемещения мобилышх элементов,предполокитедьно находящихся внутри или в окружении локуса, приводящее к усилению нестабильности может быть индуцирование экзогенным генетический материалом. Показано, что локус wx мощно использовать как моле-кулярно-генетический маркер при гибридизации геномной ДНК различных сортов ячменя с клонированным геном wx как зондом.

Изучена нуклеазная активность ячменя с использованием оригинального метода - инкубации растительных тканей в растворе ДНК, Показано, что экзогенная ДНК при соприкосновении с растительным материалом разрушается в течении нескольких минут. Впервые пред-ложей универсальный агент, позволяющий защитить экзогенную ДЕК от воздействия растительных нуклеаз - протеиназа К.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, включая 20 рисунков и 7 таблиц, Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, заключения, выводов л списка литературы (127 литературных источников).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на У1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987); Всесоюзной конференция по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1983), на семинарах в лаборатории молекулярной генетики и генетической инненерии ЦОГен РАН, на рвсши-> ренноы межлабораторноы семинаре ИОГея РАН (Москва,1994).

. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. В работе был использован ряд сортов ячменя ( н. vulgare х. ) мутантных по локусу wx , выписанных из; Японии: Violaeeum, Masan Necked, Sumirá Mochi, Tpnezawa, DengomigJ

■а также copTOderbrücker европейского происхождения. Для ресгрикт-иого анализа локуса wx наряду с иутанаными были использованы нормальные сорта ячменя: Донецкий 4, Нутанс 970, Нутаас 45, Нутаис-4353, Океашт, фраидео. Геномная ДШС, использованная в опытах по изучению нуклеазной активности и'введению и ыутантпый сорт, выделялась из сорта Донецкий 4 (нормальный по wx ). Реципиентом в опытах по введению экзогенной ДНК.бил сорт vioiaceum мутантннй по wx . Скрещивания сортов ячменя проводили по стандартной методике. Растения выращивались в теплице ПОГон я на опытной поле Тимирязевской сельскохозяйственной академии.

Ген wx ячменя использованный в работе,был клонирован в лаборатории молекулярной генетики 'и генетической шшенории растений ИОГви РАН (Ананьев и др.,1936) из сорта нормального по wx с помоги последовательности кукурузного wx гена (shure et.al., 1983). Донорная ДШС представляет собой 5 т.гш. фрагмент гена wx ячменя,клонированный в плазыиду PBR 325 по EeoHi.

Анализ растений ячменя по признаку wx проводили ¡¡а цитологических препаратах пыльцевых зерен путем окрашивания видоизмененным раствором Люголп: "0,3$l t I5$KI + 2.5$ хлоральгидрат. При этой методе пыльца мутантов по wx окрашивалась в коричневый цвет, а нормальных по этому признаку - в сине-черный. Частоту реверсий признака wx определяли как соотношение пыльцы, имеющей сине-черную окраску к общему количеству пыльцевых зерен. Для оценки общего числа пильцзвих зерен было определено среднее число их,приходящееся на один пыльник,при подсчете на разграфленном стекле и в камере Горяева.

Для анализа эндосперма по признаку wx были получены тонкие поперечные срезы, которые окрашивались раствори,i Люголя и просматривались под ишсроскопом. Эндосперм нормальных форы ячменя имел при этом сипаю окраску, а у мутантов по wx коричневую. Для анализа эндосперма наии был также разработан метод дифференциального раскрашивания, основанный на той, что комплекс амилозы с йодои (у нормальных форм) более устойчив, чем комплекс.амилопекиина с Подом (у мутантов). Ирм этом методе анализа зерна с поперечным срезом эндосперма окрашивались 0,3¡S I + I5?KI + тритон X в течении 2,5 мин, а затеи раскрашивались путем промывания в нескольких • сиенах дистюшрованной воды. При этом эндосперм мутантов no.wx полностью'раскрашивался в течении 50-60 мин, в то время как эндб-

сперм нормальных сортов оставался синим. Этот метод был предварительно апробирован нами на смеси определенного количества семян нормальных и мутаитных nowx.

Выделение 7ШК. ДНК выделяли из 7 дневных этиолированных проростков по методу Шьюри { Shure et.al. , 1983).

Обработка ДНК рострпкционниии эядонуклоазами и электрофорез. Были использованы ферменты рестрикции Есощ и Bamui , полученные из НПО "Фермент" г.Вильнюс. Реакцию осуществляли в буфере, специфичном для данной группы ресгрпктаз. Продукты расщепления ДНК ферментами рестрикции анализировали с помощью горизонтального электрофореза в 0,0/5 гелях, в 'ГАК буфере(0,0 4 !.! трис ацетат 0,002 Н ЭДТА).

Перенос ДНК из агзрозного геля из нитр.оцеллюлозныо фильтры проводили по методу Саузерна, изложенного в руководстве Маниати-са и др. (198')-) с помощью специального прибора для переноса.

Мечоиие препарата ДШЦсоответсгвущего гену wx ячменя,проводили по методу Ригби ( HigM et.al. , 1977). В качестве моченного предшественника использовали ^Р (Таикент). Максимальная удельная активность в экспериментах достигала 2,5 х I07 нмцДшн. to.

Гибридизация ДНК, перенесенной на аитроцеллюлозные фильтры проводили по методу Саузерна (Иапнатис, I98'f).

Изучение нуилеазноП активности различных тканей ячменя и характеристика химических агентов в качестве ингибиторов нуклеаз. Была проанализирована луклваэная активность сухих зародышей,одно-и двухдневных проростков, эндосперма на стадии молочной спелости, пыльцы, а также эксудата эндогенного происхождения-капельки жидкости, выступающей на поверхности первого листа у пятидневных проростков. Перед опытом растительный материал подвергали стерилизация в 70,л этаноле. Для изучения нуклеазной активности различных частей и тканей семян ячменя использовали разработанный нами метод, .заключавшийся в'инкубировании растительного материала в растворах различных препаратов ДНК. К раствору ДНК добавлялись зародыши, проростки и другой анализируема!! растительный материал (йнкубациониал смесь в объеме 120 шел содеркала 0,05нкг/мкл renoMiiCii ДЛК либо такое и.е количество плазмидкой ДНК с геном wx, к которым добавлялось GO мг растительного материала). Через промежутки времени - несколько секунд, 5, 10, 20, 30 минут, I час, 2 часа отбирались пробы ДНК и анализировались методом алектрс^о-

рз.за в 0,6?в агарозном геле.

В 'качестве ингибиторов нуклеазной активности изучали действие SSC, ЭДТА, гистонов, протеиназы К. Метод, с помощью которого анализировали эффект ингибирования растительных нуклеаэ аналогичен описанному выше.

Проращивание пыльцы на искусственной питательиой среде. Среда для проращивания пыльцы ячменя была разработана нами на ¡основе модификаций сред для проращивания пыльцы растений других видов ( Pfahler et.al., 1982; Binelli, I985j Qian et.al., 1986; Le Chin fon et.al.,1985).

Инъекцию ДНК в развивающиеся зерновки и зародыши проводили специально собранным нами на базе шприца Haailton микроинъек-тором, где ДНК вводилась с помощью стеклянного капиляра с диаметром 45 мкы. ДНК инъекцировалась в стерильном виде с 1% ПЗГ 6000 и 0,05 мг/ил протеиназой К в специальном для протеиназы К буфере (0,01 м трио НИ рН 7,6, 0,005 м ЭДТА рН 8, 0,5% sds ). В каждую ' зерновку и зародыш введено 1-2 мкл ДНК в концентраций 0,5-1,0«кг/ «".Инъекцию производили в зерновки колосьев, которые затем доращивались на искусственной среде Кноппа. Из каждого зародыша, подвергавшегося инъекции плазмиды с геном wx , выделяли ДНК и ана** лавировали методом электрофореза.

Нанесение пыльцы с ДНК на рыльце пестика. Пыльцу из цветков ячменя в стадии первого дня цветения помещали в раствор, состоящий из искусственной питательной среды для проращивания пыльцы, ДНК (0,5мкг/ыкл^протеиназы К (0,07 мг/мл), инкубировали 10 мин при 24°С и наносил^ на рыльце пестика.

Статистическую обработку результатов опытов производили по критерию Фишера (Р) (Зайцев,1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЕДЕНШ

I. Действие локуса иге во время развития эндосперма и пыльцевых зерен. Наблюдения за действием локуск ш во время развития пыльцы покавзли, что пыльца начинает окрашиваться йодом в светло-кофейный цвет за 3-4 дня до начала цветения, но отличить рзвертапта (сине-черная окраска) от мутанта (коричневзя окраска) моено л:шь за 1-2 дня до начала цветения. Нами наблюдения также показали, что анализ по признаку wx на эндосперме следует провоз дать но 9-10 динь после цветения, когда становится возможно отличить нормальные и иутантные формы.

Следует отметить интересный факт. Амилопласты из эндосперма, ыутантнюс по ш сортов ячменя, имеют вид очень плотных,искореженных- заворачивающихся но краям диоков. в отличии от них в нормальном эндосперме все гранулы имеют четкую эллиптическую форму. Эта особенность крахмальных гранул моает быть использована для различения ыутан^ных и нормальных растений.

Проведенные нами исследования позволили сделать вывод об относительной простоте тестирования признака *гх , что позволяет использовать этот маркерный признак в опытах по генетической трансформации.

2. Исследование спонтанного мутагенеза по локусу шх . Возможный механизм его возникновения. Чтобы использовать признаку»* как маркерный в опытах по введении в геном чужеродных последовательностей, необходимо было продемонстрировать у реципиентного сорта низкий уровень спонтанного мутагенеза по этому локусу. .Учит частоты реверсий по признаку их был произведен на пыльцевых зернах мутантных по сортов ячменя. Общее количество пыльцы, приходящееся на один пыльник, при подсчете на разграфленном стекле и в камере Горяова принято за 1500. Нами было просмотрено в среднем по 100000 пыльцевых зерен форм японского происхожде- ' ния и приблизительно ЮООООи у сорта оаегЬгйскег.

Обращает на себя внимание высокий уровень обратных мутаций в сортах ячменя японского происхождения (табл.Х, рис.1).

Таблица I

Частота реверсии признака *»х у ячменя

Сорт : Йросыотрено | Количество "•'Частота

: пыльцевых зе- * ревертантов : реверсии

: рен • +----

У1о1аоеиш 366000 539 1,5хКГ5

Назад Иаскеа 1ЮООО 320 2,9x10""*

6иш1га МосЫ 148500 9? 6.5ХЮ"4

Хопега»а 90000 1598 ' 1,8хЮ"2

185000 19 1.Ш0"4

ОдегЪгйскег 846000 б 7,0x10"6

Особенно высока частота реверсий в сорте Гопеааша, Частота сий в сорте оаегЬгйскег соответствует данным, полученным другим;:' исследователями на европейских и американских сортах.

i

Рис. I. Пыльцевые зерна мутанта по wx (сорт ' Violaceum > окраска 0,3$Г +I5$a +25$ хдоральгпдрат. Ревертантное пыльцевое верно отмечено стрелкой.

Следует отметить, что большинство мутантпых пыльцевых зорен, хотя и ясно отличимых от основной массы, имело слабую светло голубую окраску. Интересно, что йак-Клииток ( Me Clintocis, Í952) так-ж.е наблюдала переходные варианты окраски пыльцевых зерен у кукурузы. В исследованиях, выполненных другими авторами (Amano et.al., 1965) на этой же группе растений,были такие обнаружены пыльцевые зерна по ф'енотипу проиез^уточные нормальным и нутантиьш по wx формам. Вероятно, пыльцевые зерна серо-голубого цвета, которые наблюдали ш, это - результат неполной реверсии-локуса. По литературным данным столь высокий уровень реверсий к норме стабильных му-тантон не отмечается ни в исследованиях, проведенных на кукурузе (Аиапо et.al., 1965; Eriksson et.al. , 1959; Biaachl et.al.,1965) (у кукурузы известны некоторые высокоиутао'илыше по wx сорта, описание Нак-Клинто^ ни в исследованиях, проведенных на ячмене ■ (De /¡ettaneourt et.al., 1977). В чистых мутантных по wx линиях уровень спонтанного мутагенеза составляет обычно 10"^ - 10"^ .

Наиболее вероятным объяснениеи наблюдаемых нами фактов нам кажется предположение, что в сортах японского происхождения мутации по локусу vx нестабильны. Некоторые косвенные данные под- . чмерздаки: это : исследования Б.йак-Клинток нестабильных мутантов у кукурузы выявили сходные с нашими данным!' частоты появления 'пыльцевых зерен wx+ ( Me Clintock ,1952); молекулпрно-генети-ч исследования различных мутантов по wx у кукурузы указы-.wr, что во всех случаях мутации вызываются.мобильники генетиче-.'i:;rjii элементам.!, принадлежащими к семейству Актнватор-Длсооциа- '

тор и В', одном случае к семейству Spm (Fcdoroff et.al., I98J} Shure et.al., 1983; Shwarfez, Д96Э; Spell et.al., 1988)

3. Наследование признака >ц в Pj.a Р^ "Р" скрещивании н.у-тантон по этому признаку друг с другой и мутантов с нормальными формами. Лсходп из предположения о то», что мутаинше по wx сорта ячменя японского пропехоздшпт, проанализированные нами, нестабильны, проведено исследование этих мутантов при скрещиваниях. Сравнительный анализ пыльцы гибридов Pj нейду различными мутант-иыии по wx сортами показал, что^ частота реверсий у гибридов лежит в пределах средних значений вовлеченных в скрещивание сортов.

Мы также исследовали гибрид иевду сортом мутшгсчни по wx и нормальным по этому признаку (табл.2).

Таблица 2

Наследование признака wx в Fg от скрещивания мутант-ного (violacetim) и нормального по wx (Путане 970) сортов ячменя (анализ эндосперма)

¿«й;;" """ I sir

-4 __________:-------------1 ~ ________ _

У 32 28

(20*) (61%) ' (I7J5) <

V

При окраске эндосперма Подом среди зерен Pg ог указанного скрсщи-вйиир, имеющих нормальный фенотип (635») и мутантиый фенотип (20;j) встречались зерна, имеющие мозаичную окраску эндосперма (17;;). Мы получили тонкие .поперечные срезы'мозаичных зерен. На многих из них после окрашивания Иодом под микроскопом из общем коричневом фоне были видны темные участки. На некоторых срезах видны все переходы окраски от светло-коричневой до темно-синей, Подобный характер наследования признака wx (большинство семян в Pg являются мозанч-нышОнаблюдали и японские исследователи (цит.по Eriksson ,1969).

И общ.п» случае иозаичноеть в проявлении какого-либо признака часто слу/пя* указаниаи im присутствие в геноме мобильных генетических алиментов (iJTO). Появление шаашеов с пашем исследовании, по-вид!1мо|у,'обусловлено тем, что иутантнае no wx линии ячменя нестабильны! что предполоыхельно указывает на присутствие в их геноме, вероятно, в локусе wx ЫГЭ. Для подтверждения этого предположения был произведен молакулярно-генотячоск: 1 (рсехрактяий) анализ локу-

са у различных сортов ячменя.

4. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов в оо'ласта гена их ячменя, ДЙК, выделенная ив различных сортов ячменя была фраг-ментирована двумя рестриктазами ЕсоЕ1 и Валш и гибредизована с клонированной ДНК гена тс ячменя, представляющей ЕсоЕ1 - ЕсоН! фрагмент размером 5 т.п. н. У всех проанализированных сортов были идентифицированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности оснований, комплементарные этому гену ячменя (рис.2). При использовании как одной, так и другой рестриктазы выявлялись различия мекду большинством форм, как мутаптных, так и нормальных по т. Различия наблюдались и по размеру, и по количеству фрагментов гибридизации. Японские сорта имели сходный образец распределения фрагментов рестрикции, что свидетельствует об общности их происхождения. •

1ИРЯ'" я^ФМ

~ ДО.

10.0 т.п.П.

Ф ;

| . ».г Ч» Ш **> . | 2.7 г. г.«.

1. г 3 4 5 6 7 8 9 10 11 /г /А /4 15

Рис.2. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов в области гена »X у ячменя 1-11 Ваа Н1, 12-15 ЕеоВ1. В качестве зонда' использовалась меченная -"Р ДНК ген£| юс ячменя. I. Путано 970 9. Вит1гв ЫосЫ

'2.-Донецкий 4 10. У1о1асеш1

3. оаегЬгискег II. ДНК Фага Я

., ЗвшаасЫ тосМтие! 12. ТзитаоЬ! тосМтие!

"5;.К»гап 15. ОйегЬгиске?

6. Вытопив! 14. К«ап ч»х+

7; оаегЪгнскёг 15. Кае ал Щскей

8» Ийва» Маскес!

Пр?1 сравнении рестрикциошшк фрагментов у сортов Нутанс 970, Йутанс '<353 и Нутанс 45 видно, что сорт Нутанс 970 имеет один фрагмент, который идентичен фрагменту сорта Нутанс 4353 (рис.3). Сорта Нутанс 45 и Нутанс 4353 являются родителями сорта Нутанс 970. Следовательно, можно утверждать, что сорт Нутанс 970 унаследовал первую хромосому, в которой локализован исследуемый ген у ячменя, или точнее область первой хромосомы с локусом от сорта Нутанс 4353. Это наблюдение открывает путь длп использования яокуса и»х как иолскулярно-генетйческого маркера гено'иа ячменя, в частности хромосома I, оценки генетического разнообразия по данным ПДРФ и, что немаловажно, идентификации источников (линий, сортов).

10.0 т.п. и. 8.8 т. пи.

5.0 т.п.н

I 2 3 А 5 6 Рис. 3. Полиморфизм длин рестршстпых фрагментов в области -гена wx у ячменя. I-б EcoHI. (все ). -

1. Донецкий 4 .4. Нутанс 970

2. Оксамыт 5. Нутанс 45

3. Франдео •• 6. Нутанс 4353

л

В обще» случае разиэр фрагментов рестрикции варьирует при • изменения расстояния мег„ду сайтами действия ;рестриктазы. В частности feTcj случается при увеличении числа сайтов, пли выпадении сайта $зстр:н«(ин, вызванном мутацией, или При изменениях в оран-гировко ДНК (инсср'цни, делецяи в гене). Сходни!! высокий уровень полиморфизма рзстр ;кшшнн'ых фрагментов обнаружен в области гена Wx У,- -гукуруэы ( Spell et.al,I9u:S) я гона алкогольдегидрогеназы

у втого ке вида растений ( Johns et.al., 1983), что, по мнении этих авторов, свидетельству«! о встраивании в эти локусы, либо рядом с ними МГЭ. Т.о. проведенный нами рестриктний анализ локу-са wx у ячменя выявил, существование межсортового различия в структуре локуса или окружающих его последовательностей ДНК. Эти результаты позволяют предположить, что природа этик изменений i/ожет бить связана с перемещающимися генетическими элементами.

Полученные данные о частоте ревертирования по локусу ^х в имеющихся в нашем распоряжении сортах ячменя, позволили нам прогости выбор сорта реципиента в опытах по генетической трансформации. Критерием для такого отбора служила относительно низкая частота обратного мутирования по этому локусу.

5. Судьба экзогенной ДНК при введении в иутаитную по тюкусу г.-, Форму' ячменя

5.1. Изучение пуклеазной активности ячменя, способ защиты j№ от действия нуклеаз. При введении в растение экзогенная ДНК испытывает действие растительных нуклеаз. Б нашем исследовании было установлено, что уке в точении первых нескольких секунд после помещения растительного материала различного вида в растворы как геномной ДНК ячменя, так и рекомбинантной плазииды с геном т?х , ДНК обоих видов подвергается расщеплению. При увеличении времени инкубации наблюдается все большая деградация ДНК (рис.4).

12 3 4 5

['¡■.с.4. Деградация экзогенной ДПа при инкубации с вародыиами

1 - контроль, плэзмидп с гепои wx '

2 - плазцлда с гон oil wx 5 минут инкубашш

3 - плззу.;дз с г зной wx

4 - и;ази-.да

с гслон пдазиияа с геном

IQ ¡мнут инкубации ХЬ и:глут инкуоадпн wx 50 Hituyi ишеубацц'?

Нци инкубации ДНИ с сухими зародышами и эндоспермом полная деградация ее наблюдалась через 15 мин, а с двухдневными проростками через 5 ши, еще более сильной нуклеазиоЛ активностью обладала зрелая пыльца, вызывающая полную деградацию экзогенной ДИК через 1-2 мин. папэлыса нидкости, выступающая на поверхности первого листа пятидневных проростков, такав вызывала быструю деградацию ДНК. входные с нашими данные о нуклеазной активности ячменя,но полученные совершенно другим методом,приводятся в работе Картеля (1976).

•Таким образом, по нашим данным,иеудача некоторых опытов по ьведеншо экзогенной ДИК в растение может быть связана с недооценкой такого важного фактора как нуклевзная активность. Следовательно, для успешной трансформации растении необходимо найти способ иигибирования ДНказ, видолязмых растительным материалом. Но данным литературы ДДиазы иигибируюся цитратныы буфером (Шапот, 1968; нартель и др.,1976), ЗДГЛ (Бердышов, I974;Hartin et.al., 1992), для этой цели часто используются гистоны (Тюленев и др., 1973; Еердышев, I97?;Guai3g - уо et а1Д983). ь наших исследованиях использование каждого из вышеуказанна агентов в качестве ингибиторов нуклеаз ячменя полокительного эффекта не дало (ЭДГА проявляла положительный эффект в концентрации 0,5 U).

Исключительно эффективным агентом, ликвидирующим нуклёаацую активность растений, по нашим данным, была протеииаза К. Протои-наза К проявляла свой эффект при предварительной обработке ею растительного материала. Более того, даке если одновременно с экзогенной ДНК добавлять к зародышам протеиназу К в концентрации всего 0,05 мг/мл, то ДШС полностью сохраняется (для ингибирова-пип нуклеазной активности пыльцевых зерен требовалась концентрация протеиназц 1С равная 0,07мг/мл'). '

Итак, предлонешшй нами агент - протеиназа К может использоваться как надеашй ингибитор нуклеаз в опытах по введению в геном чужеродных последовательностей ДНИ.

5.2. Введение ДНК с помощью инъекции. В наших опытах по инъекции ДНК в вародши было продемонстрироиано действие протеиназы К. Из зародыша, подвергнутого инъекции рекоыбинаптной плазмиди п геном wx , спустя некоторое время после инъекции, выделялась, ДНК и анализировалась методом электрофореза. Результаты опыта представлены на рис.5. ДНК, выделенная из зародшей, куда произведена инхзкция ДНК с протеииазой К спустя 15 кип и I час посла '

[

! У

1 г з 4

Рис.5. ДНК, выделанная из зародышей ячменя посде

илъешуш пяазмиды с геном их

1. Контроль. Пяазмида с геном .на

2. 15 мин' после инъекции (без протеиназы К);

3. 15 мин послс инъекции

(с нротештзоН К 0,05 иг/мл);

4. I час после инъекции

(о протеиназой К 0,05 иг/ид),

инъекции содержала ц та амиду с геном.«х

Нами била такие проведена серия опытов по инъекции ДНК в развивающиеся зерновки мухантиого сорта ( У1о1асешв) на стадда молочной спелости. На ранних стадиях эмбриогенеза эндосперм представляет собой симпластическии гвтерокариои, не имеющий обо^> лачек. Инъекции ДЕШ. в такой сьшгашст, вероятно, приведет к про-нишюьенню ДНК и ь клетки зародыша. Инъекции были сделаны в следующих вариантах: иньекция ДНК фага X ; инъекция геномной ДНК ячменя (сорт Донецкий 4 нормальный покос ){ инъекция рекоыбшшит-ноЦ плазмиды с клонированной ДНК гона их ячиеня.

Первые два препарата ДОК использовались как контроль на ,му.1'а~ генную активность экзогенной ДНК. Когда растения, выращенные р • :цршшъецированных зерен достигли стадии колошения, за 1-2 дир до цветеиия из г.акдого варианта опыта были взяты пыльники, которые были подвергнуты анализу по признаку «х.

При анализе пыльцевых зерен растений, не подвергавшихся ни-

каким вбздействиям (контрольный вариант) частота реверсий составляла 0,02% (табл.3).

: ' Таблица 3

Результаты инвенции ДНК в эндосперм ячменя мутантного по тех сорта У1о1асеиш . Анализ пыльцы

Варианты

Просмотрено пыльцевых зерен ,

Ревертан-тн

Частота реверсий,

в 7о

Превышение над контролем

Без воздействия

(контроль) 45000 10 0,02,

Механическое дейот-

вие(укол) 15000 10 0,06 3

Инъекция ДНК фага ■ А 30000 178 0,6 30

Инъекция геномной

ДНК Донецкого 4 30000 121 0,4 20

Инъекция ДНК ух 39000 210 0,5 25

При уколе иглой»эндосперм без инъекции частота реверсий возросла по сравнению с контролем в 3 раза и составила 0,06^. В аналогичном опыте Турбина (1974) на ячмене - в 10 раз. Инъекция ДНК фага А и геномной ДНК привела к более значительному возрастанию появления нормальных по их пыльцевых зорен (частоты реверсий 1 соответственно равны 0,67« и 0,4^) относительно контроля. Инъекция плазмидн с геном ух также привела к увеличению частоты появления ревертантных пыльцевых верен. Однако, эта частота была приблизительно такой К9 как и в других вариантах "опыта по инъекции (0,5%). Во всех вариантах опыта частоты реверсий, достоверно отличались от контроля. Достоверность различий оценивалась по критерию Фишера (Р = 288,0; 176,4; 271,8 при Р = 957«).

Специфического действия ДНК при инъекции в серии проведенных нами опытов не наблюдалось, и, вероятно, включения в генотип экзогенного генетического материала не происходило. Из литзратурн известно о влсгшии чужеродного генетического' материала на мутации в различных локусах (Гершензон, 1975; Моргун и др.,1986; Картель •л др. ,£986). Увеличение частоты реверсий по локусутгх при действии вс(ни видами экзогенной ДНК в нашем эксперименте говорит о том, по всей .вероятности, здесь имело место воздействие экзогенной ДНК па хромосомное гены (воздамо па мобильные элементы, находящиеся в локусе), что и привело к возрастанию нестабильности.

5.3. Нанесеиие пыльцы с ДНК на рнльце пестика. Проращивание пыльцы на пскусствонной питательной среде. Вторым методом, использованным нами для введения экзогенной ДНК, было нанесение пыльцы с да на рыльце пестика колосьев в момент цветения. Пыльца имеет плотнее оболочки и проникновение через них экзогенной ДНК маловероятно. Однако, при прорастании пильцы образуется пальцевая трубка, стошш которой, состоящие из каллозы и пектиновых веществ, имеют рыхлое сетчато-фнбрклляриое строение (Ноддубная-Арнольдп, 1976;Саае е^а!. , 1979), .что позволяет экзогенной ДНК проник-, путь через стенки внутрь.

В нашем эксперименте пыльца помещалась на разработанную нами искусственную питательную среду для проращивания, в которую добавлялось экзогенная ДНК, протеиназа 1С, инкубировалась а течении 5-10 шш при 24°С (аа это вреыя пальца ячменя начинала прорастать). Затем производилось нанесение пыльцы на рыльце пестика кастрированных колосьев. В 30$ случаев наблюдалось завязывание и созре-'вание зерен.

Искусственная питательная среда для проращивания пыльцы яч- ■ меня имела следующий состав:

Са ( Й03)2' 4 н20 - 600 мг/ л

ИфОц - 400 ыг/ л

кю3 - 200 мг/ л

н3во5 - 100 ИТ/ л

сахароза - 20 #

гиббереллин - 0,005 % рН = 6,0

Были поставлена три варианта опыта, в кавдом из которых использовались различные виды ДНК. Анализировался эндосперм созревших зерен. Результаты этого опыта представлены в табл.4.

Таблица 4

Результаты нанесения пыльцы с ДНК на рыльце пестика му-

тзнтного по «х сорта по1асет • Анализ эндосперма.

*

;цр0СМ01_. Гезертаяты_-Частота Шревыше-

Варпанты :рено зн-:эндоспе-:эндоснерпрсвзрсий,:иио над :доспер- :рм сине-пшел си-.; в р контролем

: мов__].го цвета:ние сект:.________

Без лоздействия (контроль)

Л!К (ига X

Гпношт Д11К ячменя Донш;;и го 4 ■

*х

9000 - .1 . 0,01 -

1048 I 3 0,3? 37

1092 - I С ,09 9

1448 2 14 1,10 110

В первых двух вариантах опыта (наносилась ДНК фага Л и геномная ДНК сорта Донецкого ¿Оотиечаотся увеличение частоты появления ревертантных пыльцевых зерен (частоты реверсий 0,37^6 и 0,09^ соответственно) по сравнению с частотой ревертантных пыльцевых зерен у растений без воздействия (контрольный вариант). По-видимому, здесь, как ,и в случае с инъекцией ДНК в эндоспоры имело место мутагенное я^йствие экзогенной ДНК.

В опыте, где использовалась векторная плаамида с клонированным геном их , наблюдается значительное (частота реверсий 1,1$ по сравнению с 0,01$ в контроле) увеличение появления ревертанто^. Среди ник большинство представляло из себя мозаики по проявление признака в эндосперме. В работе Ота (оъьа , 1986), где производилось нанесение геномной ДНК с пыльцой на рыльце пестика початков кукурузы, получены растения с признакам донориой ДНК с частотой от 0,1 до 1;6.

Таким образом, при нанесении пыльцы с экзогенной ДНК вектора, несущего последовательность м*х л оку с а на рыльце пестика реципи-ентных растений значительно увеличивается выход зерен с »гх+ фено -типом. Это возрастание частоты реверсий в несколько раз превышает выход ревергантов при обработке экзогенной ДНК фага Л (Р=4,б; Р=95$) и геномной ДНК, выделенной из сорта Донецкий 4 (Р = 13,7; Р = Различия результатов опыта, где в качестве донориой

ДНК использовалось плазыида с геном мпс и других вариантов опыта, оцененные по критерию уишзра, достоверны. Можно полагать,что это вызвано внедрением в геном сорта У1о1асеиш векторной ДНК. Хотя для утверждения, чт.о возросшая частота реверсий есть результат генетической трансформации необходимо дальнейшее молекулярно-гснетическое изучение ревертантов.

В и В О Д Ы

1. Предложена система генетической трансформации для ячменя. Рекомендуется в качестве репортерного гена в опытах по введению чуззродцых последовательностей использовать- клонированную копию локуса *гх . В качестве реципиента возможно использовать мутантный по игг сорт У1о1асеит.

2. Разработан применительно к ячмени метод введения экзогенной ДНК с использованием проращивания пыльцы на искусственной пйг тательной среде и нанесенной ее с ДНК на рыльце пестика. При ^ис? пользовании этого метода наблюдается увеличение.нораальнта по ** зерен, которое приблизительно в 100 раз превышает контроль (чарта-

- ТБ -

га wх* зерен эндосперма 1,1%).

3. При подборе реципиента следует учитывать, что многие сор-та,1!утацтные по wx,нестабильны, т.е. с высокой частотой дают ревертантов ,. Сорта ячменя японского происхождения имели частоту реверсий 10"^ - 10"^.

Нестабильное л мутаций по wx у некоторых сортов, вероятно, связана с наличием мобильны^: генетических элементов внутри, или в окружении локуса wx . Рестршстный анализ локуса выявил мен-сортовые различия в структуре локуса или окружающих его последовательностях ДНК.

5. При проведении генетической трансформации следует учитывать фактор Наличия сильной"нуклеазной активности различных растительных тканей. Наиболее эффективным методом ингибирования нуклеаз является применение протеиназы К,

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Банкиров H.H., Кочнова Н.П., Еочканов О,С., Филатов В.Д., Ананьев Е.В. Нестабильность локуса waxy у ячменя /н. vulgare /

и ее возможная молекулярная природа , Я Всес.симпоз,Молекулярные механизмы генетических процессов, Москва 3-6 февраля 1987г.-Тез. докл.-!>1.,198?.- 0.IÛ9-II0.

2. Поморцев A.A., Кочнова H.H. Обнаружение мозаичности по ряду биохимических и морфологических признаков эндосперма у ячме-йя: Всес.конф.по биотехнологии злаковых куйьтур,- ë-iû июня 198$г, Теа.докл,- Алма-Ата, 1988.- U.U.

3. кочнова II,П., Каванцев А.Г., Гендлер U.M., Ананьев К.В. Судьба экзогенной ДНК в растительной клетке: Всес.конф.по биотехнологии злаковых культур 8-10 июня 1988г.i Теа.докл,- Алма-Ата, 1988.- С.57.