Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ"



МОСКОВСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 581.1.035

ТИВАРИ ШАРАД

МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ

(03.00.12 — физиология растений)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 198(1

МОСКОВСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК-581.1.035.

ТИВАРИ ШАРАД

МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ

(03. 00. 12—физиология растений)

■ Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук"

" • Д^ьт;1 аЕ иа-л |

'.1иу*!л>: ЬоСлястт-. ; - ! ¡»„«ксвсячС Л1:деил '

; I: .'<:.{ ■ »»¡'.с.; , л:: • •• и. 1

1 а. "З-лм.;'!!:»"!*'. ;

Москва, 1983

Работа выполнена нл кафедре физиологии и биохимии растений Казахского государственного университета им. С. М. Кирова.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор И. Р. Рахимбаев

Официальные оппонент,ы:

академик ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор В. С. Шевелуха

^баиЗодат биологических наук, 3. В. Шамина

Ведущее учреждение: Московский.государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « ъ» оч '1989 г.

в часов на заседании Специализированного Совета Д 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул. 49, сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « +*» 0Ь 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, канд. бпол. наук, доцент

О Б ШЛЯ ХЛРЛ КТир И СТИ КЛ РАБОТЫ

А кту а л ь н о с т ь п р'сб л е'м ы,'Успехи'физиологии растений в области 'культуры клеток 'и тканей' (Бутенко 1904,: 1975)- способствовали становлению' биотехнологии и применению ее подходов '¡и методов :в )pacтeíШeвoдcfвe н селекции. Одним 'из' биотехнологических ' подходов является генетическое улучшение растений и ускорение селекционного" процесса с:'помощью гаплоидной 'технологии (СиИа-. ■|Ма11е8Ь*ап 1964,' 1966;М(сН ., 1969/ 1971; ^5ипс!ег1ап(1 ' 1973, 1976)

Во многих лабораториях мира проводятся 'интенсив' пые Исследования, направленные на 'дальнейшее • совер-1иен{;твЬваНие методакультуры'пыльинков,'так-как^вы-\Ход'гаплоИдных: растении все еще весьма низок. Главной 'ирйчиной неполной 'реализации 'аидрогенеза : 1п уКго следует-считать "недостаток -знаний о закономерностях " морфогенеза в культурег тканей ■ мужского гаметофита. При этом! в ряду других" проблем' наиболее - актуальной является познание механизмов «переключения» мнкро-; спор с гаметофнтного" на спорофитныи !путь развития и » реализация программы"' морфогенеза вплоть до< регенерации гаплоидного организма.

-Ц е л и ' и '3 а'д;а!ч и раб о т ы/Основными целыми данного' исследования' явились: 1) в теоретическом ^аспекте— выяснение'некоторых 'закономерностей 'морфогенеза^' культуре -'пыльников ■»"изолированных 'микроспор' ячменя;; 2) в'прикладном-'аспекте — поиск-возможностей совершенствования приемов получения 'андроге-нетическнх гаплоидов (дигаплоидов)-'ЯЧмеНя.

•Для- достижения указанных'иёлей необходимо - было решить*"следующие задачи:; 1) 0!биаружнть генотипьГяч-

меня с высокой андрогенетической способностью для пх включения в селекционные программы, как доноров признака «регенерация гаплоидов»; 2) изучить особенности ранних стадий пролиферации микроспориальных клеток и закономерности формирования апдрогенетических структур; 3) исследовать гистологическое строение и ци-тогенетический статус различных типов апдрогенетических структур в связи с их морфогениыми потенциями; 4) повысить эффективность гаплоидной технологии на основе улучшения состава питательных^сред и обеспечения продолжительной регенерации '-^гаплоидов •*" (днгап-лоидов) при длительном культивировании каллусов

• андрогенного происхождения; 5) отработать процедуры . получения споропластов н эндоспориальных .многоклеточных образований как возможных экспериментальных

• объектов для генетической трансформации. \ "

Научная новизна. Показано,/что тотипотёнт-

- ность микроспор in vitro реализуется с помощью различных путей деления. В зависимости, от этого' .наб: людается многовариантность ' морфогенетических ' процессов, приводящих к формированию разных; типов .анд-рогенных структур.

-< . Установлено, что морфогенез в культуре пыльников.и

- изолированных микроспор является дискретным, многоэтапным процессом (микроспора-калдус-глобула-про-эмбрионд-эмбрионд-корепь и/ или побег-растение). При этом программа морфогенеза может реализоваться как частично — до какого-либо этапа; или\же полностью — вплоть до регенерации гаплоидного -(или иной плоиднос-ти) -организма. „ , ; "

П рак тнческаяценност ь. - Выявлены сорта и линии ячменя (Черниговский 5, Днепровский 435, К 20505 ФРГ), обладающие высокой способностью к регенерации гаплоидов. Указанные генотипы^ рекомендуется -., включать в программы гибридизации для,передачи признака «формирование; андрогенных структур* и регенерация растений», другим сортам и линиям,* с которыми предстоит проводить селекционную работу с помощью гаплоидной технологии. '

Для культивирования пыльников и изолированных, .микроспор ячменя наиболее пригодной является ^ пита-!' тельная среда N6 с учетом наших модификаций. Повы-

шение концентрации ауксина в среде (6 мг/л 2,4-Д) благоприятствует формированию андрогениых. структур. Применение мальтозы (90.мг/л) в качестве трофического и осмотического фактора приводит к усилению регенерации зеленых > растений. ^Лучшим гелеобразующим компонентом питательной среды является ячменный крахмал (80 г/л) . ■'■■.- " Л; ' ' л

Рекультивирование андрогениых структур может позволять получать каллусные ткани:с высокими мор-фогенетическимн потенциями, обеспечивающими регенерацию растений в течение .продолжительного периода времени.- '■• . " , " '- '

А п р о б а ц и я р а б о т ы.1'Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988), ,11 Всесоюзной конференции по регуляторам, роста и развития растении (Киев,.-'1588), Международном-снмпозиуме^по биологии культивируемых клеток, и, биотехнологии . (Новосибирск, 1988)'%-По тем'егдиссертации опубликовано 7 работ!.,'. '

'¡С т р у кту р'а'л н. о бъ е м" рча б от ы.."Диссертация состо}Гг;из 9-ти глав/в которых^приведены: обзор:литературы, материалы ;и: методы, а. также ¡основные результаты и их обсуждение, выводы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит ,16 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками.'Спнсок литературы включает 191 источник.. ' - ,...',.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ,, Г-

'r-.fi -

В-!Экспернментах по изучению-влияния-генотипа на регенерацию-испытано 20 сортовой 7 стабильных<гнбрид-ных линий иэ;коллекции КазНИИ земледелия* Для культивирования-- пыльников использовали агаризованиые (7,5 г/л) питательные среды: 1) N6 - с 1,5' мг/л 2,4'Д,-0,5-мг/л;Кинетнна, 2,0'мг/л глицина и 90 г/л ■ сахарозы, 100 мг/л •инозита; 2) Мвч с 1 мг/л;ИУК-,!1 мг/л- БАП-и ■ 60 г/л сахарозы; 3) В1ауйе5 с 0,25'мг/л 2,4-Д, 90'г/л са-, харозы.-

Колосья изолировали на;ранней рдноядерной.стадии'. развития микроспор. Основания изолированных колосьев; погружали в воду и хранили в холодильнике.-Как нами; .установлено, оптимальным является режим предварительной обработки холодом при + 7°С в течение 6—10 дней. "

При изучении влияния 2,4-Д на андрогенез, культивирование пыльников'проводили на среде N6 с добавле: нием 0,5 мг/л кинетика, 2 мг/л глшшна, 100 мг/л инозита, 90 г/л сахарозы, 7,5 г/л агара и 2,4-Д в разных концентрациях (2,0; 4,0; 6,0 мг/л). Для культивирования микроспор использовали такую же среду N6 с 1000 мг/л инозита, но без агара. Жидкую среду прекондиционпро-вали с колосьями.

При испытании гелеобразующих веществ использовали N6 с 0,5 мг/л кинетнна, 2 мг/л 2,4-Д, 100 мг/л инозита, 90 г/л сахарозы. В эту среду добавляли: агар— 7 г/л, или агарозу — 5 г/л, или ячменный крахмал — 80 г/л. 4 .

6 I

Испытаны сахароз«'); глюкоза -»¿мальтоза (каждая, ü концентраций 90 мг/л). При ;*этом'йиспользсвали" N6 .с

2-мг/л*2,4-Д, 0,5 мг/л кииетцна, {IООО..' мг/л •' инозита,'''200 мг/л. глутамина.1 'Опыт,-1 : ПыльннкТ) - продолжали культивировать в жидкой среде до'образрвания "каллусов:« эм-бриондов. Опыт. П:В процессе; культивирования через

3—4 дня 60—70% микроспор выходят в среду in situ Все пыльники и их; обломки удаляли, а .микроспоры .продолжали культйвирЬваУ у;Опыт П-а: Пыльники и ихгобломки переносили, из жидкой" среды (опыт 11) на агаризованную среду-N6 Опыт III. Микроспоры механически изолировали от пыльников и культивировали на жидкой среде. , *. . i ' •

В экспериментах*.по длительному ^культивированию, апдрогенпые структуры (каллусы, <; глобулы и эмбриои-ды) переносили, на каллусообразующую - среду MS : , с 2,0 .мг/л 2,4-Д, 20 ,г/л - сахарозы,,100,мг/л ''дрожжевого экстракта,.8 г/л arap<i..Полуденные'каллусьГкультивировали "втеченйе 8 месяцев.1 Нерез каждый "месяц из каллусов-вычленяли эмбриогеиные'зоны и их переносили на среду МЗгДля регёнерапии .ч?(2 мг/л ;БЛП,д2 .мг/л; ПУК). Оставшуюся Участь .кйллусов рекультивировали -.-на'-кал-лусообразуюшей среде. .........

Для регенерации Грастений из: аидрогенных структур использовали среду-МБ с pH 5,6;" Для{эмбриоидов —-• 1/2 концентрации'минеральных солей;по MS с 15:г/л саха-розы;'!8т/л агара? Для глобул:среда MS с 0,4 мг/л ИУК, ,0,4шг/л;БЛП, 20 г/л^сахарозы* 7,5 г/л агара: Для андро-генных каллусов-— среда MS'c;2;mг/л 2,4-Д, 20 г/л-саха-розы, 7,5: г/л агара.:,.В тех случаях," когда не происходило спонтанного :ризо*генеза, использовали среду MS с*:1 мг/л ИУК, 10 г/л сахарозы, 7"г/лагара": Культивирование*проводили . при;.16-часовом ..фотопериоде.* и температуре 22,+. 2äC;-;,RacTeHHH-pereHepaHTH '^выращивали в водной культуре;на\;1/2дсредеЖнопа4Послед ^достижения• фазы кушёниярастенйя пересаживал!!. в грунт. ... _;'.'■.

Для хромоебмного анализа , использовали временные препараты, приготбвленныег^из'^мерйстекитическйх зон культивируемых; каллусов; и; корешков .г'.растений-рсг'сне-рантов;;,B-качестве,красителя'использовали водный раствор фуксн^сернйстои кислоты. Для получения монослоя клеток и хромосомных пластинок "применяли цитазу —

смесь ферментов вплочкопои железы улиток. Окраск\ постоянных микротомных препаратов проводили' реактивом Шиффа с подкраской гемотоксилином и алциано-вым синим. Все экспериментальные данные статистически обработаны по общепринятым методикам. "

ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА АНДРОГЕНЕЗ IN VITRO • • •

Пыльники изученных нами генотипов ячменя заметно отличаются между собой по их отзывчивости'к андрогенезу in vitro . У таких генотипов, как Черниговский "5, Днепровский 220, Одесский 111, Донецкий 8' некоторая часть пыльников проявляет отзывчивость'к андрогенезу на всех трех питательных средах. Между тем, имеются генотипы (Ушкын, К 6917, Унумли Арпа, К 26/80-49), у которых ни один пыльник не -был ... отзывчивым к андрогенезу, ни на одной нз испытанных сред. Это свидетельствует о том, что проявление андрогенетической" активности зависит от генотипа. - -j '. Тем не менее, имеет значение также и состав питательной среды. Среда N6 оказалась наиболее, благот приятной ¡для большинства генотипов. Особенно это заметно на примере таких генотипов,, как Днепровский 435, Черниговский 5 и К 20505, у которых соответственно 15,64%;; 10,45%7,89% пыльников были" отзывчивыми к андрогенезу .¡именно на .среде N6 . Некоторые генотипы реагировали на"культивирование пыльников только на какой-либо'одной среде. Так, пыльники у.; К"3/80-47 проявляли отзывчивость к андрогенезу на среде N6(4,76%);'* у Динат —только на среде MS (5,03%) и у Га'ухар — только на.среде Блейдза (3,71 %). •..;V Различные пыльники даже у одного;и'того же- гёио-типа 'отличаются между,'"собой" по степени отзывчивости к андрогенезу. Например, среди культивируемых, пыль-

Никои сорта Черниговский 5. обнаруживаются. пылышкИ, способные к образованию от 1 до 18 эмбриоидов ii каллусов. Следует учитывать не только общёе количество пыльников, образующих каллусы и эмбриоиды, но.и способность отдельного пыльника формировать эти .андро-гепные структуры, т. е. частоту' возникновения каллусов и эмбриоидов. Окончательное суждение об андрогенети-ческом потенциале.можно составить на основе регенерации растений, особенно зеленых растений. Наиболее высокий процент регенераиии зеленых растений из всего количества каллусов и эмбриоидов наблюдался у сле-• лпошнх генотипов'!» 20505 ФРГ ПЯ.8%V. Днепровский ,435 (18,1%)К 24/80-101 (17.6%), Черниговский 5 ПК 9%). Высокая способность к пегенеранни зеленых растении у сортов Черниговский 5; и Днепровский 435 обусловлена тем, что V этих генотипов образуется большое количество андрогенных структур. ' :

АНДРОГЕНЕЗ IN VITRO ОТ Д^ИКРОСПОРЫ ДО РАСТЕНИЯ

На начальных этппах "'.культивирования микроспор происходит «переключение» с гаметофитного на. споро-фнтный путь развития. Нами обнаружены различные варианты деления микроспор in vitro . , которые согласуются с исследованиями Sunderland Evans ; (1980). А-путь: образуются вегетативная (В) и генеративная (Г) клетки. Б-путь: возникают .идентичные клетки в резуль: тате «равного» деления. АВ-путь: делится только В клетка. АГ-путь: делится только Г клетка. АВГ-п\'ть: делится как В, так и Г кЛетки. АС-путь: слияние В и Г клеток. БС-путь: слияние идентичных «равных» клеток.

Результаты изучения развития микроспор по различным путям в культуре пыльников приведены в табл. I. В результате деления микроспор возникают, эндоспорпаль-пые многоклеточные образования (ЭСМО) с 2, 3, 4 и более клетками. Из ЭСМО образуются разные типы андрогенных структур (каллусы,глобулы, эмбриоиды).'

'.Таблица 1

2 ,див ~5 дней 7 дней . - • ; ,10 дней, . 15 дней'

7- Одноклеточная, . ¿Г 1,46 у;. 17,82 , :,Л,16 р:. И,63.г--_G, 12 •• >28,12j, í 2,95 _ • ',6,86. ••i;5.32 г. ,2,09

Двухклеточиая . •' '* ,: . , t" г,. .,.,'. ■ г,. - - ■> » ', h¡ ** 4*v

í/^B+r : • l ¿ Í-V^.CG- 60,99 У: 40,96 ^'55,01У 11,24 r 2,25"» »0,63 1,1G2,20 „. 0,60

.рав1шс'(Б) f'r f. "¿V.,4.74.~'13,50 - 6,03 ir 9,18 £[.3,29; 511,497 r"l,61 y 2,83 " У 0,71 < 2,60

Трехклеточная.*' ' " ».• . Г . 5- i ,'¿ т ' • .»•„ - •• ••' •

•1В+2Г-'* : " т " '' Г - — " 20,44'11,81? .2,56 7,21' . 1,19 2,01 V 0,14 - '0,39

' "21Й-1Г-- ' i. "r^y ' — ••• 0,07 ,0,18 1 ? 0,49 - - — — 5 — !

rравные-(Bj";--. {• t - ~ ~ -Г - . yM8' ; " 1.99 -0,25 ,

■Г, г i.--'- ■ - - >" Ц С ' ..." . " , ■ .УУ--... -

—' :— . - 0,48 У 0,64' ~ 0.09' .0,21 — — ,- 0,02 .

"равньГс (Б), .. . r' - . -f; £ —; ; 0,37- Л,64"5, 0,28. .3,06 ^1,79 ,

Пятиклеточная • ■ ... < x " '.*' . , • ; :

1В+4Г £ • У '• —'.... — —. ~ ' —-■• ' 0,55 .р.— • — — - —. , —

inl,r " • • — : - — "" " 1,55 - 0,66 — 1,34 0,21 ' 0,28

нТпазтчичие - - — - 0,18 - . 0,77 1,94 . 0,2». 0,80

Л1ногоме1отиие ' - - - - 0,09: .1,26 У:0,71- 0,99^3,86;

Дегенерирующие ■ 21,14 • : 7,69 29,34. 11,69 .а 73,49 47,97,. 89,60 79,72 87,4_5ч;87,31"

иаблюдЬ.10сьП°? ; ' 523 "1807 1360 * 1677 г. 1094 с'2262^1423 2683 1410 '4351

d ; г ■ ■к'й.,-:...' ^ '•¿sf-'Ji1? ''■-■'•У * *' '10.

Чешрехклеточная: 2В+2Г. "■

Рис. 1: Этапы морфогенеза в культуре.пылышкоз ячменя.

1 — эндоспориальное ^ многоклеточное . образование. (ЭСМО); 2 — первичный каллус," связанный'с' тапет'умом;'. 3-первичныЛ каллус свободно расположенный ^ в ' пыльцевой" камере;/ Л—рацняя".глобулай »5 — поздняя глобула: 6. 7— эмбриоиды, образовавшиеся из первичных калл>соп, связанных с тапетумом;{8—промэнбриоиды-на поздних глобулах.

Формирован^: андрбге'шшх;''«^ 'ногогироисхожденин показано'на рис. I.''Начальным этапом является возникновение ЭСМО и его превращение в первичный'каллус!'внутри ныльцевой: камеры;0 Причем/ первичные каллусы, ¡располагаются по-разному,—^.находятся в связанном с.танетумом или; в свободном состоянии. По-видимому,;они., произошли,'.соответственно, вфе-

ЗулЬтате деления исходных Микроспор с, аналогично» локализацией в археспорангнн. При культивировании пыльников; микроспоры, прикрепленные ктаи ету м упр ет ер -, невают асимметричные деления. Затем образуется 1 первичный каллус, „из которого5 непосредственно могут! возникать эмбриоиды. С'другой стороны, те исходные микроспоры, > которые не связаны с тапетумом " и распола-* гаются свободно, претерпевают симметричные деления. .Затем образуется первичный каллус!» далее—-глобула. Глобулы иногда могутС-.« дифференцироваться, <лревра-щаясь-в эмбриоиды. Однако, зкач11тельное^их<количе-ствб продолжает разрастаться.;Прн этом в их~ централь-¿ной части;обнаруживаются пустоты, тогда как нерифе-•,рииная;часть состоит из", плотных клеточных: образова-ннн.;На таких глобулах* формируются? проэмбрнонды, а ■•затем — «вторичные» эмбриоиды. Морфогенные .каллу-Гсы могут образоваться непосредственно "из первичного каллуса, а также в результате дедифференцнашш глобул и эмбриоидов. * ' ; - - , •»,. ..-„ .

«При > культивировании изолированных -¿микроспор также .возникают ЭСМО, "а затем— колония клеток, из которой образуется каллус или эмбрноид?' Регенерация растений как в культуре пыльников*|так и!в культуре изолированных микроспор, происходит непосредственно из эмбриоидов, а также путем органогенеза —из морфо;. генных каллусов. - / ^ : : 5 г

ДЕЙСТВИЕ 2,4-Д НА МОРФОГЕНЕЗ ;

. В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

. Ул И ИЗОЛ ИРОВАННЫХ МИКРОСПОР

, ; - . ■ _ - , , - - ^ » -»

Результаты'изучения влияния:2,4-Д на формирование андрогенных структур и регенерацию растении приведены на рисунке 2. Общей закономерностью является повышение-количества андрогенных •: структур с возрастанием ¿концентрации 2,4-Д в пнтательнойГсреде. " Одна-гко, .что касается регенерации зеленых растений п'расчете па00 пыльников, то достоверных различий между концентрациями 2,4-Д не наблюдалось.

4-5

■II

Д-435

rli.

-

ll-

' fll

50

a

0 "

■ ас = 30

1 . * м

'E л " С

2 10 s .«

•I 0

u о -

CL

0 30

01

IT ■

. 5 . . .

J 20

10

il 0LidJ du

Концентрация 2,4-Д (мг/п) :t

Ч-5

В

■i

Д-435 "

* 6 '

I'm-. Z Влияние 2,4-Д ,na "форииропашю 'широгслних структур J (A) - и регенерацию раепчмш (П) „ кулмуре. „илышмш Р » 4 микроспор [7J

и ¿1

В целом, возрастание йндрогенного.потенциала плд воздействием высоких концентраций 2,4-Д имело место • как в. случае культивирования пыльников, так^при культивировании изолированных микроспор." Тем'^не менее," метод культуры микроспор* оказался более эффективным по сравнению с методом í культуры пыльников.

" .. ■ л . í-о■■

При культивировании пыльников в присутствии 6 мг/л

2,4-Д сформировались примерно одинаковые количества эмбриондов и каллусов, тогда как.при культивировании микроспор образовалось в 6 раз больше каллусов !yfcop-

* • ~ . . I y . f « - . - -г.

та Черниговский 5чг а 10 раз больше каллусов-у, сорта

•-.■г * ■ - ■ -V « i . ;■ 2i „ .■ —

Днепровский 435, чем-эмбриондов. В целом; повышение концентрации 2,4-Д приводит к усилению каллусообра-зования. • -i .]; - • • > . ' : ' , ;

^ Цитологический'"анализ показал, что при действии

- ' , _ . - ' • 1 -Jк-"**. „ ' - '.«.л "i __ 'J : '

2,4-Д происходит регенерация растении разной - плонд-ности (п, 2п, 4п и анеуплоиды). Однако, количество растений с той или иной нлоидностЬк) мало зависело'от кои* « • ' , 5 О -

центрации 2,4-Д. <". ; ; Л .j - i

$ í .'"Г■ '

I | ■ . ' ^ -""I * -Х-У- -

ВЛИЯНИЕ ГЕЛЕОБРЛЗУЮЩИХ1

КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ НЛ РЕГЕНЕРАЦИЮ -i

• - ЗЕЛЕНЫХ РАСТЕНИЙ?В КУЛЬТУРЕ ! , ,

■ пыльников 51 } ' '

■ ■ : ' - ' • • • 1 i f ' ' - ' ' .Полученные результаты представленье»на рис. 3.

, Крахмал-оказывает.'благопрнятно*е *действ*не"^нам})орми-

рование:андрогениых структур;по!сравнешпо с агаром и

агарозой. . , . '.Гг .1 .:

И

Черниговский 5

-Днепровский 435

10

■ --.'V

и" й й*

I?

Всего Зеленые

■ ., , "5 . ' растений растении

>ис. «*£ Влияние гелеобрззугощнх компонентов < »а формирование »,. андрогеиних структур (ЛС) и регенерацию растении и ку.и.-туре гшлышкоп ячменя. .,, : ■

■ ' . и Щ агар.{~|агароза,

ал. ■

, В культуре пьгльгткоп;злакоп7и, особенно ячмбня, регенерация^ альбиносных^ 5япляетсяотрицатель-: ным признаком!;11римечаТельно;£что"'на среде.с крахмалом удается повысить регенерацию* зеленых 'растений. Так; .»на • крахмальной;средё;нз1ш^ ¿Черни-

говский 5 удалось получить- 24,1 /¡(^зеленых растений,' а V сорта Днепровский 435— 11 ;б%:|В |то же время ¡на" среде' с агаром: выход зеленых растен1|й:состапил:у' сорта Чер-; миговский 5 —только'4^0%,"а-у сорта.Щнепровский 435-—-всего лишь 5Благоприятное "действие 'крахмала на регенерацию ¿зелены%\расрЙ1пТ|/однозТ1ачно^ объяснить'" трудно.- Можно^ полагать;; ;Что;кра.хмал^Шжет;абсорбиро-' ' вать-' различные". йнгибиторны^'субстанцйй,1 ¿{ выделяемые . в среду, тканями;пыльника;и тем ■самым ■ предотвратить их негативное"-действие^на-развитие пластид.];^;; 'С/

% На-крахмальной"среде.об^^ ных структур и? 11роисходйт''более ^частая,-регенерац]1Я из них,'; чем !на-среде с агаром '¡или- агарозой.>,.Положитель-" ный эффект крахмала" может заклю^1атьЫ"в том; ,что этот, полисахарид*,выступает; не:только "как-гелеобразуюший компонент среды,^по наслужит - источником .^мальтозы-и. других сахароп. . .' - с/

/ , * 1 С?"4- 'С

ВЛИЯНИЕ САХАРОЙ НА МОРФОГЕНЕЗ^

В КУЛЬТ У Р Е' ИЗОЛИРОВАННЫ X М И К Р О СП О Р Ч

• Установлено, что включение мальтозы в состав среды вместо |са'харозы;снособствует^Дбразова1П1Ю генных структур й;регенерацйи растений'(особенно 'зеленых) п{жГкультишфованин-микроспорД(р*ис^4)ЛПричем, „сорт,Черниговский =5, оказался"V болеехдотзывчивым на ^енствне мальтозы й друп1х1сахаров*,лчем сорт Днепров-. ский.435во всех" трех"*- опытах!-; (I? 11,' 111) Так, у сорта Черниговский' 5^образова%сь: от: ,91 :~до ¿157;андрогеиных структур'в®расчете на'ДОО пыльников/ тогда; как у сорта Днепровский 435^- от'ЗО до .46: М^тьтоза >хилнвает так-: же~и регенерацию''по сравнению с другими сахарами. Ре-; генерационная способность^врасчете.,на100 пыльников' у сорта^Чёрниговскйи5на.средё1*с- мальтозой составляет 72—100 ;расте%и;.Г;;при^

сорта Днепровский 435.'также.наблюдает"ся;,-попы1иенпе регенерационпоп способности/хотя н несколько .\iciibiJicii

¿тепени 2Й растений), но при этом 75—92% растений оказались зелеными.

Рис. 1а. . Влияние сахсров на обрпование андрогешшх структур (Л) и регенерацию растений (Г>) в культуре микроспор ячменя: Черниговский 5• (Ч-5), Днепровский 43Г> (Д-1ЛГ>). -Л1,'И, Ш-меюдм. '

сахароза,

глюкоза,

мальтоза.

.Количество зеленых растений на 100пыльников >

О» VI

/•■' о • - О

— • м ы ..

а ' : о" о о о о

.с. о , а

£ "* Бг

I "1

ы : сл >

-I-г—-1-1

:■'.**'--------{ г.

_ - - I

!—| .' у

шш

Количество зеленых растений на 100 растений

а сз

и р

"Н 5

■ , , Рис. 5. Культура пыльников и изолированных микроспор .'о на жидкой среде. - ь

1 — колония клеток, первичного каллуса в культуре изолировании* .микроспор; 2 —каллусы ;И, эмбрионды в.. культуре изолированных микроспор (опыт.ПП^З — каллусы н эмбриоидц в,культуре пыльников. ' " (опыт 11); 4 — рёгенерацгя нз андрогенных структур. «•»»"•»: • .. 1 • : " ! ■

" В'опыте II-а/.когда на твердой среде культивировались пыльники, пересаженные -тудашз жидкой среды, продолжается образование андрогенных структур и регенерация растений. Сочетание методов II и П-а позволяет культивировать .как ,изолированныег,;микроспоры, так и пыльники из: одного'образиа.-Это расширяет возможности для лучшего проявления.отзывчивости микроспор к андрогенезу (рис;<5). Процедура культивирования пыльников'и изолированных микроспор:на жидкой среде N6 с добавлением мальтозы может способствовать повышению регенерации зеленых растений и использоваться; в- гаплоидной технологии применительно к ячменю.'■

ДЛИТЕЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Ь МОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ

И ИХ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

... После первого месяца культивирования каллусов полученных из андрогенных структур, проводили их ка-рнологический анализ для выявления возможных источ пиков плоидности. Обнаружены каллусы, состоящие исключительно из клеток с одинарным набором.хромосом (п = 7). Источниками таких каллусов безусловно ; являются1 гаплоидные клетки микроспор.Некоторые: кап-лусы содержат большое количество диплоидных и тет-|)анлоидных клеток и незначительное количество клеток других плоидностей; Диплоидные "и полиплоидные ^клетки .могут возникнуть в результате слияния клеток .па ранних этапах деления микроспор. Это явлепне'может обсуждаться'также с точки зрения эндомитоза или эн-.доредубликашш. •

Большинство типов каллусов характеризуются широкой цитогенетической гетерогенностью.. Обнаружены как гаплоидные. так и дн-, три-, тетраплоидные, а также, различной .степени анеуплоидные. клетки, с!; хромосомными числами 'от,8 до 30. В первый месяц культивирования более 50% каллусов; образовавшихся пз;Эмбриои-дов и' глобул,' проявляют высокую -рёгенерацнонну'ю способность", которая постепенно, снижается по мере куль-тивнровання. Каллусы; образовавшиеся из диплоидного источника, более способны к регенерации! (68%), чем из гаплоидного (33%) и/гетраплопдно'го (24%) источни-

- Морфогенетичсскне потенции длительно культивируемых каллусов отражены на рис. 6. Оказалось, что мор-фогенетнческая способность, преобладающего большинг , ства типов каллусов весьма высока в первые 2 месяца культивирования. Растения регенерировавшие после 2-х месяцев культивирования.разных типов каллусов, имеют в основном "."диплоидный (дигаплондный) набор хромоСОМ (2п = 2х 14) .. ¡.V

' В* данном эксперименте цитологический анализ про-воднлея на 140 растениях, полученных'из каллусов. Из них 70% оказались диганлоидамн. Это очень существен-

Каллус, образовавшийся из андрогенных л эмбриоид о глобулы □ каллус

Каллус, образовавшийся из андрогенных ▲ гаплоид , • диплоид ■ тетраплоид

. .1.. 2 3 4 5 - 6 7 8 Время культивирования мес.

0. Рсгснерашюнная способность длительно культивируемых каллусов, образовавшихся из различных андрогенных структур разной шюидностн, - 21

пын ..факт,- .ибо .создается'-возможность, для* получении удвоенных гаплоидов без колхнцнпирования. . , *.> ^ ; Если . в .случае, регенерации из длительно культиви.-. руемых каллусов.-- :образуется. больше /гетраплоидных (10 %) и .анеуллондных (13,6%) л растений^,то' при 2 реге-, пералии'- иепос^едств^нноДиз''андроген'ных;структур ; "образуется 7,8% ;'.тётраплоид6в"йгл1Ш1ь-.3%5Уанеуплоидов.-Следовательно, длите-тьное I. культивцрр'ваниё -ка.тлусов приводит К; расширению ;цитогенетической^ ■.гетерогеннос-тн.^Такие^каллусы^^могут , служить . экспериментальной системой для * получения "'растений '".е .; разнообразными признаками в течение.продолжительного периода^ вре-•мени. , / / ~

: • - - -..... ■ , ..-""...-.г.- ... «<*- * ^ -,,. . ; ■ .

« V ^ -, ' <* - "»1 г

П ЕРСГ1ЕКТИВАОДИКЕОСПОРЛ- КАК ОБЪЕКТ: 'ЛгД'Д Я~ ГЕН ЕТ И Ч ЕС КО Й Т Р А Н С Ф О РМ А Ц И И Г.

' На;иаш. взгляд,, удачными объектами -для„эксперн-ментов 'по'1^га могут - оказаться

споропласты (протопласты"из м11кроспор). 'Для получе-• пия»споропластов'сячменя использовали/-, ранниеСмнкро-споры н- двухклеточньш' пыльцевые зерна.- Из пыльников микроспоры выделяли*^механическим способом.! Изолированные'микроспорь^'иик^ Ыбс:13% . маншгтом с добавлением 1 разных' фе"рментных| смесей: *Л-дрёйсел аза -2%Б-лрёйсёл аз'а::"' 2 %;+мацерозим»Ц%-+• Ч-целлюлоза 2%. Микроспоры:из од1юго;иыльника'(около. 2500 штук) > обрабатывали ,.-1;.мл .той^или.;,;ииой;:фер--меитной смеси.*: Инкубировалина свету * в .тёчение|4-х часов \ npir 25°С- (первый; час " на' качалке"^80 циклов в минуту) . или выдерживали в;темноте , .в течение: 12-ти .часов:.:^Фильтровали через~;канроновую -сетку;(64мкм) и промывали средой N6--с.-10% ". маннитом.. ,с- помощью, центрифугирования/^.• --

. Установлено, _чточу большинства* микроспор частично разрущается^оболочкаТ^

•ил асты£ ».При > ;1и1куб11рований;> ^микроспор -ч» ''фермёнтной смеси>Л\'вЫх6дО спбропластов-® составил-Г, 2 %'.;«: Лучший результат получен при использовании смеси Б, увеличивающий- выход споропластов до 2%. 'Эти.споропласты сохраняют ;" жизнеспособность 'до 2—3 дней. -При

культивировании споропластов;формирования-клеточной стенкп; не наблюдалось. Нами продолжаются t эксперименты^ по сохранению жизнеспособности и. индукции деления."

Другой системой ~ для., генетической трансформации, могут'*служить;8-мй 16-ти, клеточные; эндоспориальные, образования, возникающие на ранних этапах андр'оге-неза in vitro . ЭСМО Имеет ряд преимуществ:. BO:iiepT , вых, они. имеют тонкую клеточную.стенку, что облегчает процедуру * микрринъекции;. во-вторых, возрастает вероятность регенерации >.нз ннх.трансгенных растений, т. к., они обладаю'т;высоким морфогениым, потенциалом..

Начаты эксперименты' по , изучению возможностей, использования указанных систем для переноса* генов.с . помощью методов микроипъекции, н.электропорацни. По предварительным данным,., чужеродный генетический» материал внедряется, в,.мнкроспориальные .клетки,'...'Что касается заключительных этапов,, приводящих к. perene-, рации.трансформированных растений, то. для.этого, мо-;. гут быть /использованы, результаты, исследования, морфогенеза Ъ^культуре нзолированных.мнкроснор. . "

J - выводы

1; Андрогенез ячменя In ,vitro осуществляется-па ocho- ' ве; «переключения» компетентных .микроспор с¡ гамето-фитного;на.спорофитный:путь развития. Детерминация ¡ микроспор -, происходит? по ? какому-либо из вариантов^ деления >(А, Б, В, Г, С) с формированием эндоспоризль-; ного многоклеточного образования^ (ЭСМО). Промежуточным этапом между ЭСМО и андрогеннымн . структурами является первичный каллус. Глобула формируется из первичного: каллуса, не прикрепленного к тапетуму. Эмбриоид формируется из глобулы или, непосредственно из первичного каллуса, связанного с тапетумом. Это свидетельствует о том, что начальные этапы морфогенеза зависят от положения исходных микроспор в ар-хеспорангни. t

2. В результате испытания 27-мн генотипов яуменя выявлены сорта и линии, обладающие высокой способ. 1юстью к андрогеиезу in vitro (Днепровский 435, Черниговский 5, К 20505). Указанные генотипы рекоменду-

етсй Использовать в. гаплоидной .технологии в качеству доноров признаков «образование андрогенных" структур'4 н регенерация растений»;

3. Оптимальной для культуры' пыльников и изолированных микроспор ячменя является питательная сре-" да' N6. Повышение концентрации, ауксина в этой среде (4—6 мг/л! 2,4-Д вместо 2 мг/л) "увеличивает количество андрогенных 1 структур и, вследствие этого,г растейнй-регенёрантов. • ; - С*,' / "• *''..'.''-■■--■.''"'л*.' ;

4.Применение ячменного крахмала в качестве геле-', образующего компонента в культуре пыльников и добав- , ление мальтозы в жидкую*среду N6 для культивирования изолированных микроспор благоприятствует образования "андрогенных структур ^регенерации зеленых растений*''''^', = И/.''.:.':" V."/

С 5. Прп культивировании/' пыльников * в жидкой; среде N6' 'некоторая часть; микроспор выходит Чп'вКи *'. Изолированные микроспоры продолжают ' культивироваться в жидкой среде, а пыльники с оставшимися вннх' прикрепленными; микроспорами перёп'осятся' на' твёрдую среду.: Такая процедура дает возможность регенерировать растения как в культуре'изолированных микроспор,'" так и в культуре пыльников и повышает эффективность

гапло!1Дпой технологии. Vа г ''

- 6., Путем ; субкультивированйя различных андроген-пых структур „ получены .каллусы,; которые., в = течение. 5—6 месяцев .сохраняют способность к морфогенезу. Такая система позволяет длительное время осуществлять .. регенерацию спонтанных дигаплопдов и растений других уровней илондности.'; . . . : ■..' , ? ,1 :; г

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ : ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Тивари Ш. Регенерация растений в культуре пылышков ячменя. ;//Деп. в КазНИИНТИ. — .V« 2003. — 04.03.88. — с. 15.

2. Тивари Ш., Колумбаева С., Искакова К., Сариев Б. Развитие микроспор в культуре пыльников ячменя. //Тезнсы Всесоюзн. конфер. по биотехнологии злаковых культур. — Ллма-Лта, 1988,— с. 37. 1 , ■ '

3. Тивари Ш. Морфогенез в культуре изолированных микро- • спор ячменя. //Труды конфер. мол. учен, и спец. КазГУ. — Алма-Ата, 1988, —с. 62.

4. Тивари Ш. Культура пыльников ячменя: регенерация растений из морфогенных структур и длительно культивируемых каллусов. //Тезисы докладов Всесоюзн. конфер. по биотехнологии злаковых культур. — Алма-Ата, 1988, — с. 39.

5. Тивари Ш., Искакова К. Влияние генотипа и питательных сред на регенерацию гаплоидных растений в культуре пылышкоп ячменя.' //Тезнсы докладов Международной конференции по бноло гни культивируемых клеток н биотехнологии. — Новосибирск, 1988, —с. 215.,

6. Рахнмбаев И,, Тивари Ш. Морфогенез в культуре изолированных микроспор ячменя. //Тезисы докладов Международной кои. ферепцни по биологии культивируемых клеток и биотехнологии.— Новосибирск, 1988,— с. 213.

7. Тивари Ш., Рахимбаев И. Действие 2,4-Д на морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя. //Труды Всесоюзн. конфер. по регуляторам роста и развитию растений. — Киев. 1988. '

Подписано в печать 4. 11. 88 г. Формат «>N<81 1/32. Ооъем 1,75 п. - . ' УГ 14773. Тираж 100. Зак. 10.

А-Лта. Тип. лаб. Кирова, 136.