Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния света на развитие пыльцы в условиях in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния света на развитие пыльцы в условиях in vitro"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

KG Чжихуа

УДК 581.331.2:581.143.6

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СВЕТА НА РАЗВИТИЕ ПЫЛЬЦЫ В УСЛОВИЯХ in vitro

( 03.00.12 - физиология растений )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 г.

Работа Елюлнена на кафедре физиологи:! растений биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

И.П. Ермаков

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

С.А. Гостимский - кандидат биологических наук Л.А. Кошель

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится "-27" МлХ 19ЭЗ г. в _ часов на

заседании Специализированного Совета К 053.05.14 при Московском Государственном университете имени №.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан пЛЬп ¿ЫФ&^Л 1993г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

0.Г.Полесская

пропускания фильтров измеряли на спектрофотометре СФ-16;

II вариант - белые люминесцентные лампы (ДЦЦ—80) в комбинации с оптическими стеклянными фильтрами (СС-5, СЗС-5 + 0C-I4, KC-I7).

В каждом опыте часть материала культивировали в темноте.

п

Температура поддерживалась на уровне 25".

Плотность квантового потока измеряли на высоте положения культивируемого объекта (бутонов или пыльников) с помощью датчика Quantum LI-1850 LI-COR, inc.

Условия культивирования бутонов. Питательная среда включала макро- и микросоли, тиамин и миоинозит по Линсмайеру и Скугу, сахарозу и кинетин (исследован диапазон

концентраций 0.01 - I ррт), рН 5.5 (Hicks, Sussex, 1970).

В предварительных - опытах по оптимизации условий культивирования бутонов использовали жидкие и агаризованные среды, варьировали концентрацию кинетика и продолжительность культивирования; бутоны эксплантировали на питательную среду на двух разных стадиях развития - накануне мейоза в пыльниках и на стадии образования тетрад микроспор.

В экспериментах по действию света на культуру бутонов бутоны росли на жидких средах на мостиках из фильтровальной бумаги; использовали среды с 0.1 ррт кинетина или без него; продолжительность культивирования бутонов составляла 10 дней; на питательную среду эксплантировали бутоны на стадии образования тетрад микроспор.

Условия культивирования пыльников. Для культивирования пыльников использовали жидкую среду, включающую соли, тиамин, миоинозит и 2% сахарозу (llitsch, IS74). По одному пыльнику из каждого бутона фиксировали для последующего цитологического

анализа. Продолжительность культивирования составляла от трех дней до шести недель.

Пыльники эксплантировали на питательную среду на стадии развития, близкой к митозу микроспоры, - по данным литературы эта стадия у табака оптимальна для индукции эмбриогенеза (Maheshwari et al., 1982).

Анализ материала. По окончании культивирования материал фиксировали в смеси этанола с уксусной кислотой в соотношении 3:1 и готовили препараты для цитологического анализа, который проводили с помощью светового микроскопа МБИ-15.

Для культуры бутонов наряду с этим измеряли линейные размеры отдельных органов развивающегося цветка - тычинок, пестика, чашелистиков, - и сравнивали с соответствующими величинами in vivo на разных стадиях развития.

Результаты обрабатывали статистически по общепринятым методикам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНМЕ I.Действие света на развитие пыльцы в культуре бутонов

При анализе культуры бутонов оценивали рост органов цветка и развитие микроспор и пыльцевых зерен в условиях освещения культур и в темноте.

Для освещения культуры бутонов использовали два

спектральных диапазона - с максимумом в синей (350-550нм) и

зеленой (480-580нм) областях спектра (I вариант освещения,

Материалы и метода). Плотность квантового потока в обоих

-? -Т

случаях составляла 20 мкЕ м с . Такой выбор спектральных

я

диапазонов был обусловлен предварительными данными, полученными на культуре пыльников, где синяя и зеленая области спектра по-разному влияли на эмбриогенез.

Было установлено, что в культуре бутонов действие света на изученные параметры в зеленом и синем диапазонах не различалось. Поэтому сравнивали "световые" культуры (в целом) с тешоЕЫМ контролем.

Влияние света на рост органов цветка in vitro Изучение роста отдельных органов цветка, начиная со стадии, соответствующей образованию тетрад микроспор, показало, что in vivo десяти дней достаточно для полного развития цветка и образования зрелой пыльцы. В культуре in vitro ростовые процессы были существенно ограничены

(Табл.1). Наряду с этим нарушалась относительная скорость роста отдельных органов ЦЕетка: тычинки и, собственно, пыльники практически не росли, длина пестика увеличивалась достоверно, но существенно меньше, чем in vivo, чашелистики росли наиболее заметно. Отношение длины пестика к длине тычинок in vitro было больше, чем in vivo: 1.39 - 1.45 и 0.93 I.I5, соответственно. Heberle-Bors (1982) наблюдал аналогичное изменение данного параметра - при индукции эмбриогенеза in vivo и рассматривал это явление как свидетельство феминизации цветка.

Наблюдаемые различия между процессами роста органов цветка in vitro и in vivo были обусловлены, собственно, изоляцией бутона от влияния растения. Свет и экзогенный кинетин практически не влияли на ростовые характеристики в культуре бутонов (Табл. I).

Таблица Г

Влияние света на рост органов цветка in vitro в культуре

бутонов, эксплантированных на питательную среду на стадии,

соответствующей образованию тетрад микроспор, и в условиях in

. i m vivo

Органы Условия 1П vltro на стадии

цветка

тетрад митоза

безкин. о.1ррм кин.

свет 12.6+0.1 13.0±0.1 9.2+0.1 13.6+0.2

Чашели- -

стики темновой 1+п 1 -ч+п 1 контроль * -3 •

свет 3.3±0.04 3.2±0.04- 2.8+0.04 7.1±0.2

Тычинки -

темновой „.„ , л,л контроль .5-2+0.Ол 3.2±0.04

свет 4.5±0.1 4.7±0.1 З.ЗЮ.1 8.2+0.1 Пестик -

темновой 4>4+0-1 4.4+0.1 контроль I

Влияние света на развитие шльцы в культуре бутонов При цитологическом анализе препаратов пыльников оценивалось содержание различных клеточных форм, характеризующих развитие микроспоры и пыльцевого зерна и пыльцевой эмбриогенез.

В пыльниках, которые развивались в культуре бутонов, наблюдались три процесса: а) образование нормальных пыльцевых

зерен, б) образование аномальных пыльцевых зерен - с двумя одинаковыми ядрами и многоклеточных (проэмбрио), и в) гибель значительной части клеток.

Было установлено, что на свету возрастает частота нормальных делений, равных делений и число многоклеточных пыльцевых зерен (Рис. I). Соответствующие отношения составляли: для нормальных пыльцевых зерен - I.16 (Р>0.95), для пыльцевых зерен с равными ядрами - 1.29 (Р>0.99), для многоклеточных пыльцевых зерен - 1.78 (Р>0.99). Присутствие в среде кинетина не влияло на эти процессы. Двухфакторный дисперсионный анализ не выявил значимых взаимодействий между светом и экзогенным кинетином.

Жизнеспособность микроспор в культуре бутонов была существенно ниже, чем в условиях in vivo. Присутствие кинетина и освещение культур не сказывалось на жизнеспособности микроспор.

Таким образом, полученные данные показывают относительную автономность процесса формирования пыльцевого зерна в культуре бутонов от экзогенного кинетина, что можно объяснить достаточным уровнем эндогенных гормонов, синтезируемых в органах цветка (Кине и др., 1991). Можно предположить, что вследствие изоляции бутона в условиях in vitro нарушаются коррелятивные взаимодействия органов в развивающемся цветке, что приводит к измененям в процессах развития микроспор и пыльцевых зерен - индуцируются равные деления и эмбриогенез -явления, отсутствующие в интактном бутоне. Свет в этой экспериментальной системе стимулирует деления - нормальные и эмбриогенные, его эффект не зависит от используемого спектрального диапазона.

П г

1—1 V

га I

lQin+lj

Рис I. Влияние света на деление микроспор и эмбриогенез в культуре бутонов:

I - образование нормальных пыльцевых зерен

II - образование пыльцевых зерен с двумя одинаковыми ядрам!

III - образование многоклеточных пыльцевых зерен

С - культуры освещали в синей или зеленой области спектр; Т - темноЕОй контроль

2. Действие света на развитие пыльцы в культуре пыльников

При анализе культуры пыльников оценивали соотношение различных клеточных форм, которые образовались в условиях освещения светом разного спектрального состава или в темноте. При этом учитывали микроспоры, пыльцевые зерна и эмбриоиды, оставшиеся в пыльниках и те, которые высыпались в питательную среду при раскрывании пыльников, - обычно это происходило после 10 дней культивирования. В длительных культурах могли образовываться растения-регенеранты.

Было обнаружено, что действие света в культуре пыльников зависит от продолжительности культивирования и от использованного спектрального диапазона. Были выявлены следующие эффекты: свет влиял на эмбриогенез, на развитие пыльцевого зерна и на деление микроспоры.

Влияние света на пыльцевой эмбриогенез

При массовом получензс: гаплоидов в культуре пыльников для повышения эффективности процесса в качестве стандаратной процедуры используют выдерхивание пыльников (или бутонов) при к::зк:та положительных; тег-поратурах в течение нескольких дней. Вопрос об оптимальном световом режиме для индуцированных таким образом пыльников в литературе не имеет однозначного решения. Поэтому, изучая действие света на культуру пыльников, мы использовали две схемы опытов.

I) Изучали действие света разного спектрального состава на культуры пыльников, предварительно индуцированных холодом. При этом использовался I вариант освещения с применением цветных люминесцентных ламп; ширина спектральных диапазонов составляла

-? -Т

для красной области - 600-700нм (ЮОмкЕ м с а), для зеленой -

480-580нм и сшей -360-550нм (20 мкЕ м-2с-1 К Наряду с этим

-? -Т

для освещения культур использовали белый свет (60 мкЕ м с ).

2) Изучали действие света на культуру интактных пыльников,

выделенных из свежесобранных бутонов. В этом случае ставилась

задача определить, можно ли, изменяя качество света,

индуцировать эмбриогенез в культуре пыльников. При этом

условия эксперимента были взяты более жесткие, и использовался

II вариант освещения, когда выделение спектральных диапазонов

осуществляли с помощью оптических фильтров - их ширина

составляла - в красной области 600-700нм, дальней красной -

более 670нм, синей - 370-500нм. В этом случае плотность

—9 -Т

квантовых штоков выравнивали до 5 мкЕ м с .

Бри изучении - -индуцированных холодом культур, продолжительность культивирования которых составляла 2-3 недели или 6 недель, было уставновлено, что ни один из использованных спектральных диапазонов не увеличивал выход эмбриогенеза по сравнению с темновым контролем.

На примере синей области спектра было показано, что в интервале 10 - 30 мкЕ м частота образования эмбриоидов при освещении была не выше, чем в темновом контроле.

Таким образом, анализ показал, что для массового получения гаплоидов в культуре пыльников с использованием индукции эмбриогенеза холодом оптимальным является культивирование в темноте.

Изучение культуры интактных пыльников подтвердило этот вывод (Рис. 2). При продолжительном культивировании (до 3 - 6 недель) свет (синяя и красная спектральные области) подавлял эмбриогенез по сравнению с темновым контролем.

12 Н

; т

Ф с

I /

17

,1

Н / ¿/

1

Дни

Рис 2. Влияние качества света на эмбриогенез в культуре

-? -Т

пыльников (5 мкЕ м с ): С ;; К - с:шяя и краснзл области спектра. Т - темновой контроль.

ДНК

Рис 3. Влияние света на отложение запасных веществ в пыльцевкц зернах (процент пыльцевых зерен с плотной цитоплазмой).

Влияние света на развитие пыльцевого зерна • в культуре пыльников

В то ке время свет способствовал нормальному процессу отложения запасных веществ в цитоплазме вегетативной клетки пыльцевого зерна. В трехнедельных культурах, которые освещались в красном или синем диапазоне, увеличивался, по сравнению с темновым контролем, процент зрелых пыльцевых зерен с заполненной цитоплазмой (Рис.3).

1Щ

! /! , -У.

\'0

17/.

Ук

¡у/..

уЛ /.■

/Л

//Л

* «а

? "1

// ! / ? ®

4 Г-3 \ (3=1 * * "1

I_! к

Г771 I«.'

О С

ИЗ т

ш

Рис 4. Влияние качества света на деление микроспор и индукцию эмбриогенеза в 3-дневных культурах пыльников (за I приняты значения соответствующих частот в темновом контроле).

I - образование нормальных пыльцевых зерен

II - образование пыльцевых зерен с двумя одинаковыми ядрами

III - образование многоклеточных пыльцевых зерен

Т - темновой контроль

С, К, Ш - синяя, красная, дальняя красная области спектра, соответственно, ( 5 мкЕ м-2с-1).

Влияние качества света на деление микроспоры и индукцию

эмбриогенеза

Эффекты света выявлялись уже после трех дней культивирования пыльников (Рис. 4). Освещение культур в красной области спектра стимулировало нормальные неравные деления микроспор и образование пыльцевых зерен; под влинием света синего диапазона снижался процент аномальных равных делений и формировалось меньше пыльцевых зерен с одинаковыми ядрами. В культуре, которая освещалась светом дальней красной области, возрастало число многоклеточных пыльцевых зерен.

Наблюдаемые эффекты не были связаны с изменением жизнеспособности клеток - процент погибших клеток был одинаковым в темновом контроле и при освещении культур во всех диапазонах.

Таким образом, при изучении культуры интактных пыльников было установлено, что свет (исключая дальнюю красную область) подавлял эмбриогенез и стимулировал нормальное развитие пыльцевого зерна. Вместе с тем было выявлено влияние качества света на деление микроспоры и индукцию эмбриогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

to не предполагали исследовать механизмы фотоморфогенеза, считая необходимым прежде с определенностью доказать сам факт действия света на развитие микроспоры и пыльцевого зерна in vitro и выявить активные спектральные области.

Результаты изучения развития пыльцы в культуре бутонов и изолированных пыльников в условиях освещения светом разного спектрального состава показали, что свет в условиях in vitro

влияет на деление микроспоры, формирование пыльцевого зерна и эмбриогенез. Эффект света был различным в этих двух экспериментальных системах.

В культуре бутонов свет увеличивал частоту делений микроспоры, как нормальны:'., так и эмбриогенных. Анализ показал, что в культуре бутонов в условиях изоляции от целого растения нарушаются закономерности роста органов цветка. При этом ростовые процессы in vitro достаточно автономны в отношении света и экзогенного кинетина. Развитие пыльцы в культуре бутонов, как и в культуре пыльников, могло идти по спорофитному пути с индукцией равных делений и образованием многоклеточных пыльцевых зерен. Можно предположить, что в изменении пути развития микроспоры решающую роль играет нарушение корреляционных- взаимодействий мевду органами развивающегося цветка. Таким образом, в культуре бутонов первым индуктором эмбриогенеза была изоляция бутонов; свет стимулировал деления и усиливал этот эффект.

Следует отметить, что культура бутонов характеризуется Зольшой вариабельностью физиологических параметров и относительно низким выходом эмбриогенеза. В целом, культура Зутонов не дает ощутимых преимуществ по сравнению с более тростой культурой пыльников.

При изучении культуры пыльников было выявлено действие :вета на процессы нормального формирования пыльцевого зерна и ia пыльцевой эмбриогенез. Освещение культур благоприятствовало юрмальному развитию пыльцы и подавляло эмбриогенез. Эффект сачества света обнаруживался на начальном этапе сультивирования пыльников. ПрелсгаЕляет интерес тот факт, что 5 красной области спектра увеличивалось число нормальных

делений микроспоры, а в дальней красной - образование многоклеточных пыльцевых зерен. Это определяет перспективы дальнейшего развития исследований в направлении анализа действия красного-дальнего красного света на индукцию эмбриогенеза в культуре пыльников и изолированных интактных микроспор.

Оценивая влияние света на развитие пыльцы in vitro в культуре бутонов и пыльников, следует учитывать вклад спорофита, но в то же время анализ полученных результатов и данных литературы позволяет предположить, что наблюдаемые эффекты могут быть связаны и с непосредственным действием света на микроспоры, пыльцевые зерна и эмбриоида. Таким образом, первые систематические исследования влияния света на развитие микроспоры in. vitro показали, ■ что разные этапы гаплоидного спорофитного морфогенеза отличаются различной чувствительностью к этому физическому фактору. Значение этих фактов и механизмы процессов нуждаются в постановке специальных опытов.

ВЫВОДЫ

1. В культуре бутонов табака, изолированных на стадии тетрад микроспор, реализуются, как и в культуре пыльников, два пути развития пыльцевого зерна: формирование мужского гаметофита и пыльцевой эмбриогенез с индукцией равных делений микроспоры и образованием многоклеточных пыльцевых зерен.

2. Индукция эмбриогенеза в культуре бутонов происходила в условиях нарушения коррелятивных взаимодействий между органами

развивающегося цветка, что проявлялось в изменении относительной скорости роста отдельных органов и существенном его ограничении. Свет и кинетин слабо влияли на ростовые процессы.

3. Свет в культуре бутонов стимулировал деления микроспор, как нормальные, так и эмбриогенные. Эффект света не зависел от его качества (синяя или зеленая область спектра) и присутствия в среде кинетина.

4. В культуре пыльников свет влиял на тип деления микроспор и индукцию эмбриогенеза: в 3-дневных культурах освещение в красной области спектра стимулировало нормальные деления, в дальней красной - образование многоклеточных пыльцевых зерен; в сшей - снижало частоту равных делений.

5. При продолжительном культивировании пыльников (3 недели) выявлялось действие света на отложение запасных веществ в пыльцевых зернах и на развитие эмбриоидов: красная и синяя области способствовали отложению запасных веществ в цитоплазме вегетативной клетки, развитию эмбриоида свет (любого спектрального диапазона) - мешал, число эмбриоидов было максимальным в темноте.

6. Наблюдаемые эффекты света в культуре бутонов и пыльников не были связаны с изменением жизнеспособности микроспор.

7. Развитие пыльцевого зерна In vitro зависит от условий освещения культуры: в культуре бутонов свет ускоряет переход от микроспоры к пыльцевому зерну, в культуре пыльников -влияет на тип деления микроспоры к развитие пыльцевого зерна и эмбриоида.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Матвеева Н.П., Юй Чкихуа, Ермаков И.П. Влияние качества света на андрогенез в культуре пыльников таОака//Вестн. МГУ. Сер.16, Биология. -1992. -N4. -С.39-42.

2. Yermakov I.P., Matveyeva N.P., Yu Chihua. Light quality effects on Ktcotiana tabacum pollen development in vitro//Plant Reprod. Biol.: Pollen, ovules and seeds. - XII Int. Congress on Sexual Plant Reproduction. - Ohio, Columbus, 1992. -P.77-78.